CN110904167A - L-苏氨酸发酵过程优化方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于氨基酸发酵技术领域，公开了L‑苏氨酸发酵过程优化方法，其包括如下步骤：将L‑苏氨酸生产菌株种子液按照1‑2%的接种量接入到含有发酵培养基的发酵罐中进行发酵，温度35‑37℃，搅拌转速为300‑500rpm，通过通气和搅拌控制溶氧量为15‑20%，以泡敌消泡，发酵时间为36h，停止发酵，收集发酵液。本发明通过优化发酵方法，提高了L‑苏氨酸产量。

Description

L-苏氨酸发酵过程优化方法

技术领域

本发明属于氨基酸发酵技术领域，涉及L-苏氨酸发酵过程优化方法。

背景技术

L-苏氨酸的分子式为C₄H₉NO₃，相对分子量119.12。L-苏氨酸为白色结晶或结晶粉末，是一种极性氨基酸，味微甜。253℃熔化并分解。高温下溶于水，25℃溶解度为20.5g/100ml，不溶于乙醇、乙醚和氯仿。比旋光度为27.6°-29°，等电点PI5.64。我国苏氨酸产业发展较晚，在上世纪90年代以前国内基本没有生产，在90年代以后才开始生产。近年来，国内外市场对苏氨酸的需求逐年强劲增长，全球苏氨酸市场近几年以每年20%多的增长率高速增长，亚洲、北美等地区的需求也快速增长。需求的旺盛拉动了生产，1993年，全世界苏氨酸产量不足4000吨，1996年为5000吨，1999年猛增至2.5万吨，2002年4万吨，到2005年产量已接近7万吨，比10年前增长了15倍多。

经过十年的发展，到20世纪末产量也未能突破200吨，苏氨酸属于工业化发酵的产品之一，据有关统计，1993年全世界苏氨酸产量仅4000t，1999年增长至2.5万t，2002年超过4万t，目前已经超过20万t。苏氨酸发展之迅速体现了其在氨基酸发酵领域的重要性。每年以20%的增幅递增，为提高饲料行业的产品品质，苏氨酸的添加量还会进一步增加。产品的主要市场也是医药行业，主要用于各种氨基酸输液。目前，全世界主要的苏氨酸生产企业为日本味之素公司、德国德固赛公司、美国ADM公司、日本协和发酵工业公司等，这几大公司的产量占全球份额的90%左右，产能达到10万吨左右，而国内苏氨酸生产处于发展阶段，截至2014年初，国内生产厂家有8至9家，苏氨酸大部分供应国内需求，而且部分公司有向国外出口氨基酸，苏氨酸的生产无论从技术指标、成本指标、产品质量上来讲，国内生产水平还是与国外存在一定差距，产品价格总体比国外价格略高。近两年，随着生产厂家的增多，苏氨酸生产日益趋于平稳增长，逐渐减小了与国外厂家的差距。

随着赖氨酸和蛋氨酸合成品在配合饲料中的广泛应用，它逐渐成为影响畜禽生产性能的主要限制性因素，尤其是在低蛋白日粮中添加赖氨酸后，苏氨酸成为育成猪的第一限制性氨基酸。如果饲料中不添加苏氨酸，对苏氨酸的需求就只能依赖于蛋白质原料，而蛋白质原料中不仅含有苏氨酸，还含有其他必需和非必需氨基酸，使用蛋白质原料而不使用苏氨酸调节氨基酸平衡导致的结果是，饲料的氨基酸平衡无法得到尽可能多地改善，饲料的配方成本就无法进一步降低。可以说，苏氨酸是改善氨基酸平衡必须迈过的一道槛儿，是所有配方无法回避的瓶颈性质问题。苏氨酸在机体内的代谢途径和其他氨基酸不同，是唯一不经过脱氢酶作用和转氨基作用，而是通过苏氨酸脱水酶(TDH)和苏氨酸脱酶(TDG)以及醛缩酶催化而转变为其他物质的氨基酸。途径主要有3条：通过醛缩酶代谢为甘氨酸和乙醛；通过TDG代谢为氨基丙酸、甘氨酸、乙酰COA；通过TDH代谢为丙酸和α-氨基丁酸。

苏氨酸生产中大部分是以玉米浆及糖蜜作为发酵氮源，苏氨酸发酵菌体通过膜过滤后直接进行苏氨酸提取，发酵副产物菌体蛋白通过絮凝沉淀板框过滤后，直接作为廉价菌体蛋白销售，产品附加值较低。菌体蛋白直接用来制作饲料，结合行业现状，安琪酵母利用啤酒酵母、面包酵母等生产酵母膏、酵母粉、酵母抽提物、蛋白胨等高附加值产品，酵母粉售价较高，利润较大。申请人之前的专利技术对苏氨酸发酵进行了较多的研究，包括培养基和发酵过程的优化；现有技术“L-苏氨酸工业生产发酵条件优化研究，卢伟宁，生物学杂志2010年” 对工业生产发酵条件进行了优化，试验以高产L-苏氨酸菌E.coli THR6作为出发菌株, 结合实际工业生产条件对发酵各条件进行了一系列优化研究, 结果表明：添加0.2%的工业级生长促进剂，以复合糖代替葡萄糖为初糖，并控制初糖浓度在60g/L，除生长高峰期外，发酵过程中溶解氧(DO)控制在10% - 20%之间；发酵时间为40h，最终发酵放罐湿菌体在45g/L左右，L-苏氨酸含量可达100g/L左右。

发明内容

在现有技术的基础上，为了提高苏氨酸的发酵效率，本发明继续对发酵过程进行优化，提供了L-苏氨酸发酵过程优化方法。

本发明是通过如下技术方案来实现的：

L-苏氨酸发酵过程优化方法，其包括如下步骤：

将L-苏氨酸生产菌株种子液按照1-2%的接种量接入到含有发酵培养基的发酵罐中进行发酵，温度35-37℃，搅拌转速为300-500rpm，通过通气和搅拌控制溶氧量为15-20%，以泡敌消泡，发酵时间为36h，停止发酵，收集发酵液。

进一步地，所述方法包括如下步骤：

通过流加50%（蔗糖50g加水定溶至100ml即为50%溶液）的蔗糖溶液控制含糖量为2-3%，直至发酵结束。

进一步地，所述方法包括如下步骤：通过流加20-30%的氨水控制pH为7.0，直至发酵结束。

进一步地，所述方法包括如下步骤：发酵至20h左右，于每升发酵液中以2-3ml/h的流速往发酵罐中补料流加双氧水，直至发酵结束。

进一步地，所述方法包括如下步骤：发酵至20h左右，于每升发酵液中以10-20ml/h的流速往发酵罐中补料流加含有琥珀酸和柠檬酸钠的混合水溶液，直至发酵结束。

进一步地，所述方法包括如下步骤：在发酵至30h左右，往发酵罐中一次性添加壳聚糖，控制壳聚糖的浓度为40-60mg/L。

进一步地，所述发酵培养基组分为：

蔗糖60g/L，葡萄糖30g/L，玉米浆20g/L，硫酸铵5g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，七水硫酸镁0.1g/L，七水硫酸亚铁 10mg/L，一水硫酸锰10mg/L，V_B1 2mg/L，V_H 50μg/L。

优选地，所述混合水溶液中，琥珀酸和柠檬酸钠的浓度均为50g/L。

本发明取得的有益效果主要包括以下几个方面：

由于菌株发酵10h左右苏氨酸开始大量积累，发酵至20h左右，随着苏氨酸和副产物的增加，反馈抑制较为明显；选择此时来优化代谢合成途径较为合适。

合成苏氨酸过程中并不直接经过三羧酸循环, 而是由草酰乙酸进入天冬氨酸族代谢, 最终生成苏氨酸, 通过流加柠檬酸钠能够对柠檬酸脱氢酶产生一定的抑制作用，适当削弱三羧酸循环，能够减少副产物的生成及能量的损失，从而对于提高苏氨酸产率有积极意义；

乙醛酸循环消耗大量的ATP及造成碳源的浪费，通过流加琥珀酸对异柠檬酸裂解酶具有抑制作用，从而对减少进入乙醛酸循环代谢流量，苏氨酸产率增加；

本发明采用在发酵中后期，通过流加双氧水，通气供氧相结合，提高了氧气的传质速率，一定的添加浓度和添加方式可以提高发酵体系的细胞密度和代谢效率。

发酵后期，添加一定量的壳聚糖，壳聚糖上的氨基与菌株细胞壁中带负电荷的磷壁酸或脂多糖结合，并螯合金属阳离子,进而改变细胞壁的通透性，促进苏氨酸从胞内分泌到胞外，从而提高了发酵液中苏氨酸的产量。

附图说明

图1：双氧水添加量发酵液中L-苏氨酸产量的影响；

图2：琥珀酸和柠檬酸钠对苏氨酸产量的影响；

图3：琥珀酸和柠檬酸钠对糖酸转化率的影响；

图4：壳聚糖对发酵液中L-苏氨酸产量的影响。

具体实施方式

本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的产品及方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的产品及方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明进行详细说明。

实施例1

L-苏氨酸发酵过程优化方法，其包括如下步骤：

步骤1）制备发酵培养基：蔗糖60g/L，葡萄糖30g/L，玉米浆20g/L，硫酸铵5g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，七水硫酸镁0.1g/L，七水硫酸亚铁 10mg/L，一水硫酸锰10mg/L，V_B1 2mg/L，V_H 50μg/L。

步骤2）发酵：将L-苏氨酸生产菌株（以大肠杆菌工程菌TRFC为例）种子液按照1.5%的接种量接入到含有发酵培养基的发酵罐中进行发酵，接种密度OD₆₀₀为0.4，温度36℃，搅拌转速为300-500rpm，通过通气和搅拌控制溶氧量为20%，以泡敌消泡，发酵时间为36h，停止发酵，收集发酵液；

发酵过程中需要流加补料液，具体如下：

1）通过流加50%（蔗糖50g加水定溶至100ml即为50%溶液）的蔗糖溶液控制含糖量为3%，直至发酵结束；

2）通过流加20%的氨水控制pH为7.0，直至发酵结束；

3）在发酵至20h左右，于每升发酵液中以2ml/h的流速往发酵罐中补料流加双氧水，直至发酵结束；

4）在发酵至20h左右，于每升发酵液中以15ml/h的流速往发酵罐中补料流加琥珀酸和柠檬酸钠的混合水溶液，直至发酵结束；所述混合水溶液中，琥珀酸和柠檬酸钠的浓度均为50g/L；

5）在发酵至30h左右，往发酵罐中一次性添加壳聚糖，控制壳聚糖的浓度为40mg/L。

实施例2

L-苏氨酸发酵过程优化方法，其包括如下步骤：

步骤1）制备发酵培养基：蔗糖60g/L，葡萄糖30g/L，玉米浆20g/L，硫酸铵5g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，七水硫酸镁0.1g/L，七水硫酸亚铁 10mg/L，一水硫酸锰10mg/L，V_B1 2mg/L，V_H 50μg/L。

步骤2）发酵：将L-苏氨酸生产菌株（以大肠杆菌工程菌TRFC为例）种子液按照2%的接种量接入到含有发酵培养基的发酵罐中进行发酵，接种密度OD₆₀₀为0.5，温度36℃，搅拌转速为300-500rpm，通过通气和搅拌控制溶氧量为15%，以泡敌消泡，发酵时间为36h，停止发酵，收集发酵液；

发酵过程中需要流加补料液，具体如下：

1）通过流加50%的蔗糖溶液控制含糖量为2.5%，直至发酵结束；

2）通过流加25%的氨水控制pH为7.0，直至发酵结束；

3）在发酵至20h左右，于每升发酵液中以3ml/h的流速往发酵罐中补料流加双氧水，直至发酵结束；

4）在发酵至20h左右，于每升发酵液中以10ml/h的流速往发酵罐中补料流加琥珀酸和柠檬酸钠的混合水溶液，直至发酵结束；所述混合水溶液中，琥珀酸和柠檬酸钠的浓度均为50g/L；

5）在发酵至30h左右，往发酵罐中一次性添加壳聚糖，控制壳聚糖的浓度为60mg/L。

比较例

L-苏氨酸发酵过程优化方法，其包括如下步骤：

步骤1）制备发酵培养基：蔗糖60g/L，葡萄糖30g/L，玉米浆20g/L，硫酸铵5g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，七水硫酸镁0.1g/L，七水硫酸亚铁 10mg/L，一水硫酸锰10mg/L，V_B1 2mg/L，V_H 50μg/L。

步骤2）发酵：将L-苏氨酸生产菌株（以大肠杆菌工程菌TRFC为例）种子液按照1.5%的接种量接入到含有发酵培养基的发酵罐中进行发酵，接种密度OD₆₀₀为0.4，温度36℃，搅拌转速为300-500rpm，通过通气和搅拌控制溶氧量为20%，以泡敌消泡，发酵时间为36h，停止发酵，收集发酵液；

发酵过程中需要流加补料液，具体如下：

1）通过流加50%（蔗糖50g加水定溶至100ml即为50%溶液）的蔗糖溶液控制含糖量为3%，直至发酵结束；

2）通过流加20%的氨水控制pH为7.0，直至发酵结束。

实施例3

各因素对发酵液中苏氨酸产量和糖酸转化率的影响。

1、在比较例的基础上，验证双氧水对发酵的影响， 设置每升发酵液中双氧水的添加流速为：0,1，2，3，4,5，单位ml/h，如图1所示，随后双氧水流速的增加，苏氨酸产量有所提升，低于2ml/h时，苏氨酸产量提升更快，糖酸转化率影响不大（附图未显示），流速为2ml/h时，苏氨酸产量接近峰值，继续提高双氧水的流速，对苏氨酸影响不大。可能原因是，双氧水对菌体的增殖存在积极作用，从而导致苏氨酸产量提高，而对糖酸转化率没有较大的影响。

2、选择双氧水流加速率为2ml/h，验证琥珀酸和柠檬酸钠对发酵效率的影响。设置三组平行实验，分别为琥珀酸组，柠檬酸钠组，以及琥珀酸+柠檬酸钠组，流加速率设置为1,5,10,15,20,25,30,单位为ml/h，如图2所示，纵向来看，琥珀酸+柠檬酸钠组对苏氨酸产量的提升最大，明显高于琥珀酸组和柠檬酸钠组，横向来看，选择10-20ml/h的流加速率对苏氨酸产量有大幅度的提高，继续增加流加量，对苏氨酸产量影响不大；如图3所示，在流加速率为15ml/h时，琥珀酸+柠檬酸钠组的糖酸转化率最高，可达到46.8%，高于琥珀酸组45.1%以及柠檬酸钠组45.9%。琥珀酸和柠檬酸钠通过削弱不利于L-苏氨酸合成的途径，促进代谢流流向苏氨酸途径，提高了糖酸转化率，进而提升了发酵液中苏氨酸的产量。

3、选择双氧水流加速率为2ml/h，琥珀酸和柠檬酸钠混合水溶液的流加速率为15ml/L，验证壳聚糖对苏氨酸产量的影响。发酵后期，苏氨酸在胞内大量积累，形成反馈抑制，此时，需要改变细胞通透性，以提高分泌效率，壳聚糖的浓度为10,20,40,60,80,100，单位为mg/L，如图4所示，壳聚糖浓度较低时，与苏氨酸产量呈正相关，但是，当壳聚糖浓度过大时，苏氨酸的产量有所降低，过大量的壳聚糖会对菌株产生明显的抑制，菌株活性较低，从而导致产酸量相应降低。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例公开如上，然而，并非用以限定本发明,任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当然会利用揭示的技术内容作出些许更动或修饰，成为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。

Claims (8)

1.L-苏氨酸发酵过程优化方法，其包括如下步骤：

将L-苏氨酸生产菌种子液按照1-2%的接种量接入到含有发酵培养基的发酵罐中进行发酵，温度35-37℃，搅拌转速为300-500rpm，通过通气和搅拌控制溶氧量为15-20%，以泡敌消泡，发酵时间为36h，停止发酵，收集发酵液。

2.根据权利要求 1所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

通过流加50%的蔗糖溶液控制含糖量为2-3%，直至发酵结束。

3.根据权利要求 1所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：通过流加20-30%的氨水控制pH为7.0，直至发酵结束。

4.根据权利要求 1所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：发酵至20h左右，于每升发酵液中以2-3ml/h的流速往发酵罐中补料流加双氧水，直至发酵结束。

5.根据权利要求 1所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：发酵至20h左右，于每升发酵液中以10-20ml/h的流速往发酵罐中补料流加含有琥珀酸和柠檬酸钠的混合水溶液，直至发酵结束。

6.根据权利要求 1所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：在发酵至30h左右，往发酵罐中一次性添加壳聚糖，控制壳聚糖的浓度为40-60mg/L。

7.根据权利要求 1所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基组分为：

蔗糖60g/L，葡萄糖30g/L，玉米浆20g/L，硫酸铵5g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，七水硫酸镁0.1g/L，七水硫酸亚铁 10mg/L，一水硫酸锰10mg/L，V_B1 2mg/L，V_H 50μg/L。

8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述混合水溶液中，琥珀酸和柠檬酸钠的浓度均为50g/L。

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