CN113930465A - 一种苏氨酸发酵代谢调控工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明属于氨基酸生产技术领域，公开了一种苏氨酸发酵代谢调控工艺，其包括如下步骤：往发酵罐中补料流加琥珀酸、柠檬酸钠、甘露醇以及α‑酮戊二酸的混合水溶液。本发明在现有研究的基础上，通过改进菌体细胞对氧的摄入效率，来提高苏氨酸的产量，为工业化推广生产打下基础。
Description
技术领域
本发明属于氨基酸生产技术领域，具体涉及一种苏氨酸发酵代谢调控工艺。
背景技术
苏氨酸属于脂肪族氨基酸，是八种必需氨基酸之一。L-苏氨酸在促进人体生长发育以及维持正常的生理功能中发挥着重要的作用，因此广泛应用于食品药品等领域。由于当前食品较大的生产量和广泛的流通区域的影响，食品中的营养成分容易受到破坏并造成部分损失，因此营养添加剂在食品行业具有重要的作用。其中，苏氨酸作为一种氨基酸类添加剂，能够有效丰富营养成分，并提高食品的抗氧化性。同时，苏氨酸与葡萄糖的共热也起到了良好的增香作用。其次，苏氨酸也是畜禽类必需氨基酸。与甲硫氨酸、赖氨酸和色氨酸并称为四大氨基酸类饲料添加剂。在畜禽饲料中加入苏氨酸，能够有效丰富饲料中的氨基酸种类，提高氮利用率，促进蛋白质的合成，降低饲料生产成本。研究表明，苏氨酸的添加能够有效提高和维持畜禽的采食量和免疫能力，调节动物脂肪代谢。此外，氨基酸在医学领域也有着很大的需求量。苏氨酸是人体内合成多种生物成分的重要前体，同时具有提高免疫的能力，因此它作为氨基酸大输液的成分之一，广泛用于手术前后及多种疾病的辅助治疗。另外，苏氨酸铁盐还是一种广泛应用的抗贫血药。
目前，苏氨酸的生产方法主要有发酵法、蛋白质水解法和化学合成法三种，其中微生物发酵法已经成为生产苏氨酸的主流方法。L-苏氨酸的主要生产菌株有大肠杆菌、谷氨酸棒状杆菌以及粘质沙雷氏菌等。另外，由于大肠杆菌具有容易培养，发酵时间短，遗传背景清晰等优点，截至目前为止，大肠杆菌已经成为发酵工业上用于生产 L-苏氨酸的最主要的菌种之一。
申请人对苏氨酸发酵作了大量研究。例如专利技术“CN110904167A”公开了L-苏氨酸发酵过程优化方法，其包括如下步骤：步骤1）制备发酵培养基：蔗糖60g/L，葡萄糖30g/L，玉米浆20g/L，硫酸铵5g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，七水硫酸镁0.1g/L，七水硫酸亚铁 10mg/L，一水硫酸锰10mg/L，VB1 2mg/L，VH 50μg/L。步骤2）发酵：将L-苏氨酸生产菌株（以大肠杆菌工程菌TRFC为例）种子液按照1.5%的接种量接入到含有发酵培养基的发酵罐中进行发酵，接种密度OD600为0.4，温度36℃，搅拌转速为300-500rpm，通过通气和搅拌控制溶氧量为20%，以泡敌消泡，发酵时间为36h，停止发酵，收集发酵液；发酵过程中需要流加补料液，具体如下：1）通过流加50%（蔗糖50g加水定溶至100ml即为50%溶液）的蔗糖溶液控制含糖量为3%，直至发酵结束；2）通过流加20%的氨水控制pH为7.0，直至发酵结束；3）在发酵至20h左右，于每升发酵液中以2ml/h的流速往发酵罐中补料流加双氧水，直至发酵结束；4）在发酵至20h左右，于每升发酵液中以15ml/h的流速往发酵罐中补料流加琥珀酸和柠檬酸钠的混合水溶液，直至发酵结束；所述混合水溶液中，琥珀酸和柠檬酸钠的浓度均为50g/L；5）在发酵至30h左右，往发酵罐中一次性添加壳聚糖，控制壳聚糖的浓度为40mg/L。经过检测，上述发酵液中苏氨酸的含量接近120g/L。在上述专利技术的基础上，申请人继续进行改进优化，旨在进一步提升苏氨酸发酵产量。
氧的供应量和利用率对维持细菌活力以及产酸能力尤为重要。苏氨酸前体物草酰乙酸主要由对氧浓度要求高的 TCA循环和磷酸烯醇丙酮酸羧化反应提供，充分供氧，可使菌体呼吸充足，将有利于提高产酸和糖酸转化。在发酵过程中，需要改善发酵过程中的供氧矛盾，才能大幅度提高产物的产量。解决微生物发酵过程中的氧气供求矛盾为实现高密度发酵培养提供了良好途径。靠调节转速和通气量来保持整个发酵过程中稳定的溶氧，简单有效，但是随着发酵时间的增加，溶氧环境以及菌体对氧的吸收利用变差，无法通过搅拌和通风等常规手段来维持和提升菌体对氧的利用率。
发明内容
为了克服现有技术存在的缺陷，本发明提出了一种苏氨酸发酵代谢调控工艺。
为了实现上述目的，本发明是通过如下技术方案来实现的：
一种苏氨酸发酵代谢调控工艺，其包括如下步骤：往发酵罐中补料流加琥珀酸、柠檬酸钠、甘露醇以及α-酮戊二酸的混合水溶液。
进一步地，所述琥珀酸和柠檬酸钠的浓度均为50g/L。
进一步地，所述甘露醇的浓度为5-20g/L。
进一步地，所述α-酮戊二酸的浓度为20-30g/L。
更进一步地，所述甘露醇的浓度为15g/L。
更进一步地，，所述α-酮戊二酸的浓度为25g/L。
优选地，所述混合水溶液按照每升发酵液中以15ml/h的速率流加。
优选地，所述混合水溶液在发酵至20h开始流加，直至发酵结束。
优选地，所述苏氨酸发酵使用的菌株是大肠杆菌。
更优选地，所述大肠杆菌使用的发酵培养基为：蔗糖60g/L，葡萄糖30g/L，玉米浆20g/L，硫酸铵5g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，七水硫酸镁0.1g/L，七水硫酸亚铁 10mg/L，一水硫酸锰10mg/L，VB1 2mg/L，VH 50μg/L。
本发明研究的出发点以及取得的有益效果主要包括但是并不限于以下几个方面：
发酵中后期，添加甘露醇能够提高细胞对氧的利用效率，可能原因是适当浓度的甘露醇能够刺激大肠杆菌氧结合蛋白的表达，提高对环境中氧的摄入，将氧进行转运直至代谢，进而提升苏氨酸的生产效率。流加适当浓度的α-酮戊二酸能够调节蛋白代谢，提高菌体细胞的生长速率，有利于提高苏氨酸的产量。本发明在现有研究的基础上，通过改进菌体细胞对氧的摄入效率，来提高苏氨酸的产量，为工业化推广生产打下基础。
附图说明
图1：甘露醇对发酵液中苏氨酸含量的影响；
图2：α-酮戊二酸对发酵液中苏氨酸含量的影响。
具体实施方式
本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的产品及方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的产品及方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明进行详细说明。
实施例1
一种苏氨酸发酵代谢调控工艺，其包括如下步骤：步骤1）制备发酵培养基：蔗糖60g/L，葡萄糖30g/L，玉米浆20g/L，硫酸铵5g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，七水硫酸镁0.1g/L，七水硫酸亚铁 10mg/L，一水硫酸锰10mg/L，VB1 2mg/L，VH 50μg/L。步骤2）发酵：将L-苏氨酸生产菌株（以大肠杆菌工程菌TRFC为例）种子液按照1.5%的接种量接入到含有发酵培养基的发酵罐中进行发酵，接种密度OD600为0.4，温度36℃，搅拌转速为300rpm，通过通气和搅拌控制溶氧量为20%，以泡敌消泡，发酵时间为36h，停止发酵，收集发酵液；发酵过程中需要流加补料液，具体如下：1）通过流加50%（蔗糖50g加水定溶至100ml即为50%溶液）的蔗糖溶液控制含糖量为3%，直至发酵结束；2）通过流加20%的氨水控制pH为7.0，直至发酵结束；3）在发酵至20h左右，于每升发酵液中以2ml/h的流速往发酵罐中补料流加双氧水，直至发酵结束；4）在发酵至20h左右，于每升发酵液中以15ml/h的流速往发酵罐中补料流加琥珀酸、柠檬酸钠、甘露醇以及α-酮戊二酸的混合水溶液，直至发酵结束；所述混合水溶液中，琥珀酸和柠檬酸钠的浓度均为50g/L，甘露醇的浓度为15g/L，α-酮戊二酸的浓度为25g/L；5）在发酵至30h左右，往发酵罐中一次性添加壳聚糖，控制壳聚糖的浓度为40mg/L。
对比例1
一种苏氨酸发酵代谢调控工艺，其包括如下步骤：步骤1）制备发酵培养基：蔗糖60g/L，葡萄糖30g/L，玉米浆20g/L，硫酸铵5g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，七水硫酸镁0.1g/L，七水硫酸亚铁 10mg/L，一水硫酸锰10mg/L，VB1 2mg/L，VH 50μg/L。步骤2）发酵：将L-苏氨酸生产菌株（以大肠杆菌工程菌TRFC为例）种子液按照1.5%的接种量接入到含有发酵培养基的发酵罐中进行发酵，接种密度OD600为0.4，温度36℃，搅拌转速为300rpm，通过通气和搅拌控制溶氧量为20%，以泡敌消泡，发酵时间为36h，停止发酵，收集发酵液；发酵过程中需要流加补料液，具体如下：1）通过流加50%（蔗糖50g加水定溶至100ml即为50%溶液）的蔗糖溶液控制含糖量为3%，直至发酵结束；2）通过流加20%的氨水控制pH为7.0，直至发酵结束；3）在发酵至20h左右，于每升发酵液中以2ml/h的流速往发酵罐中补料流加双氧水，直至发酵结束；4）在发酵至20h左右，于每升发酵液中以15ml/h的流速往发酵罐中补料流加琥珀酸、柠檬酸钠的混合水溶液，直至发酵结束；所述混合水溶液中，琥珀酸和柠檬酸钠的浓度均为50g/L；5）在发酵至30h左右，往发酵罐中一次性添加壳聚糖，控制壳聚糖的浓度为40mg/L。
实施例2
在对比例1的基础上，进行改进，旨在提高苏氨酸的发酵产量。
1.设置混合水溶液中，甘露醇的浓度为0，5，10，15，20，25，30，单位为g/L，如图1所示，随着甘露醇浓度的添加，发酵液中苏氨酸含量也随之增加，当甘露醇浓度达到15g/L时，苏氨酸含量接近峰值，继续增加甘露醇浓度，对苏氨酸产量影响不大。因此，选择甘露醇的浓度为15g/L。
2.选择甘露醇的添加浓度为15g/L，设置α-酮戊二酸的浓度为0，5，10，15，20，25，30，单位为g/L，如图2所示，低浓度添加量（0-10g/L）对发酵液中苏氨酸含量影响较小，当α-酮戊二酸的浓度增加到20g/L时，苏氨酸含量有明显的提高，较不添加提高了2.2%，当α-酮戊二酸的浓度增加到25g/L时，苏氨酸含量达到峰值。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例公开如上，然而，并非用以限定本发明,任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当然会利用揭示的技术内容作出些许更动或修饰，成为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。
Claims (10)
1.一种苏氨酸发酵代谢调控工艺，其包括如下步骤：往发酵罐中补料流加琥珀酸、柠檬酸钠、甘露醇以及α-酮戊二酸的混合水溶液。
2.根据权利要求1所述的工艺，其特征在于，所述琥珀酸和柠檬酸钠的浓度均为50g/L。
3.根据权利要求1所述的工艺，其特征在于，所述甘露醇的浓度为5-20g/L。
4.根据权利要求1所述的工艺，其特征在于，所述α-酮戊二酸的浓度为20-30g/L。
5.根据权利要求3所述的工艺，其特征在于，所述甘露醇的浓度为15g/L。
6.根据权利要求4所述的工艺，其特征在于，所述α-酮戊二酸的浓度为25g/L。
7.根据权利要求1-6任其一所述的工艺，其特征在于，所述混合水溶液按照每升发酵液中以15ml/h的速率流加。
8.根据权利要求1-6任其一所述的工艺，其特征在于，所述混合水溶液在发酵至20h开始流加，直至发酵结束。
9.根据权利要求1-6任其一所述的工艺，其特征在于，所述苏氨酸发酵使用的菌株是大肠杆菌。
10.根据权利要求9所述的工艺，其特征在于，所述大肠杆菌使用的发酵培养基为：蔗糖60g/L，葡萄糖30g/L，玉米浆20g/L，硫酸铵5g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，七水硫酸镁0.1g/L，七水硫酸亚铁 10mg/L，一水硫酸锰10mg/L，VB1 2mg/L，VH 50μg/L。
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| FR1221274A (fr) * | 1958-03-10 | 1960-06-01 | Pfizer & Co C | Perfectionnements apportés aux procédés de préparation de l-thréonine par fermentation |
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