CN116656755A - 培养基灭菌方法及其在l-氨基酸发酵生产中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种培养基灭菌方法及其在L‑氨基酸发酵生产中的应用。具体为一种培养基低pH高渗透压方式灭菌方法,采用该方式可有效灭菌,同时降低培养基中L‑赖氨酸和L‑精氨酸的损失。采用这种灭菌方式,可用于L‑苏氨酸、L‑谷氨酸,L‑赖氨酸发酵,L‑谷氨酸产量提高2.6g/L,转化率提高1.2%,L‑赖氨酸产量提高3.8g/L,转化率提高1.5%。L‑苏氨酸发酵过程中,培养基采用该方式灭菌,并在发酵控制中使用5%氢氧化钡作为发酵pH辅助调节剂,控制游离铵根离子浓度低于0.06%,该工艺提高了菌体的生长,L‑苏氨酸产量提高5.6%,转化率提高3.8%。
Description
技术领域
本发明涉及微生物发酵技术领域,具体地说,涉及一种培养基灭菌方法及其在L-氨基酸发酵生产中的应用。
背景技术
L-苏氨酸、L-赖氨酸是人体必需氨基酸之一,也是畜牧、家禽、鱼类生长的必需氨基酸之一,均为四大饲料添加氨基酸,在生物良好发育和健康成长中起到重要作用。L-谷氨酸是生产味精的前体物质。目前L-苏氨酸、L-赖氨酸、L-谷氨酸主要采用工业微生物发酵的方法进行生产,过程包括:制备培养基,制作种子,待种子生长至一定阶段,一定OD时,接入发酵培养,过程中补加各种所需物料如葡萄糖、液氨、通风、磷酸、有机氮源、维生素等以保持细菌的发酵活性,发酵结束后进行L-苏氨酸提取和精制。
传统的灭菌方式为高温121℃,pH7.0,灭菌20min,L-赖氨酸和L-精氨酸有很大损失,而且在L-氨基酸特别是L-苏氨酸发酵过程中,高浓度游离铵限制了细菌特别是大肠杆菌的生长和L-苏氨酸产量。
发明内容
本发明的目的是提供一种培养基灭菌方法及其在L-氨基酸发酵生产中的应用。
本发明另一的目的是提供L-苏氨酸、L-赖氨酸、L-谷氨酸的发酵生产方法。
为了实现本发明目的,本发明采用一种高温低pH,高渗透压的灭菌方式,该方式温度115℃-121℃,时间10-20min,可有效解决营养损失大特别是L-精氨酸和L-赖氨酸损失问题、同时保证灭菌效率,可用于L-苏氨酸、L-谷氨酸,L-赖氨酸发酵,提高产量;同时,采用氢氧化钡流加控制游离铵,提高菌体的活性,提高氨基酸产量。
第一方面,本发明提供一种培养基灭菌方法,将配制好的培养基的渗透压调至800-1200osmol/kg(优选用水调节渗透压),并控制pH为1-4(优选使用稀硫酸调节pH),然后在115℃-121℃条件下灭菌10-20min。
所述培养基由玉米浆、豆粕水解液、葡萄糖和无机盐,加水配制而成。
本方法尤其适合含有复合氮源的培养基的灭菌工艺。
优选地,将配制好的培养基的渗透压调至1000osmol/kg,并控制pH为2,然后在118℃条件下灭菌15min。
所述培养基包括但不限于L-苏氨酸种子培养基、L-苏氨酸发酵培养基、L-赖氨酸种子培养基、L-赖氨酸发酵培养基、L-谷氨酸种子培养基和L-谷氨酸发酵培养基,各培养基配方如下:
L-苏氨酸种子培养基:玉米浆10-20g/L,豆粕水解液3-7g/L,葡萄糖20g/L,MgSO4·7H2O 0.5g/L,KH2PO4 2g/L。
L-苏氨酸发酵培养基:玉米浆3-7g/L,豆粕水解液3-7g/L,葡萄糖40g/L4.0%,MgSO4·7H2O 0.5g/L,KH2PO4 2g/L。
L-赖氨酸种子培养基:葡萄糖60g/L,(NH4)2SO4 25g/L,KH2PO4 2.0g/L,MgSO4·7H2O 1.0g/L,玉米浆15-25g/L,豆粕水解液5-15g/L,FeSO4·7H2O 10mg/L、MnSO4·H2O10mg/L。
L-赖氨酸发酵培养基:葡萄糖40g/L,(NH4)2SO4 25g/L,KH2PO4 2.0g/L,MgSO4·7H2O 1.0g/L,玉米浆5-15g/L,豆粕水解液5-15g/L,FeSO4·7H2O 10mg/L、MnSO4·H2O 10mg/L。
L-谷氨酸种子培养基:葡萄糖40g/L,玉米浆25-35g/L,豆粕水解液10-20g/L,K2HPO4 1g/L,MgSO4·7H2O 1.2g/L,VB1 100μg/L,生物素200μg/L,FeSO4·7H2O 5mg/L、MnSO4·H2O 5mg/L,琥珀酸1.5g/L。
L-谷氨酸发酵培养基:葡萄糖50g/L,玉米浆50-70g/L,豆粕水解液20-40g/L,K2HPO4 3g/L,MgSO4·7H2O 1.5g/L,VB1 200μg/L,生物素300μg/L,FeSO4·7H2O 10mg/L,MnSO4·H2O 10mg/L,琥珀酸3g/L。
第二方面,本发明提供按照所述灭菌方法得到的培养基在L-氨基酸发酵生产中的应用。
第三方面,本发明提供一种L-苏氨酸的发酵生产方法,包括以下步骤:
(1)将L-苏氨酸种子培养基按照权利要求1-3任一项所述方法灭菌后加入种子罐中,装液量20L/50L,接入种子液200mL;培养条件:通气量0.8vvm,转速300rpm,控制pH7.0,温度37℃,溶氧20%;种子生长至OD600=20时停止培养;
其中,所述种子液中产L-苏氨酸菌种的浓度为OD600=20;优选地,产L-苏氨酸菌种为大肠杆菌MHZ-0216-5(菌株MHZ-0216-5可参见CN113846132A);
(2)将L-苏氨酸发酵培养基按照权利要求3所述方法灭菌后加入发酵罐中,装液量16.5L/50L,取种子罐中的种子3.5L接入发酵罐中;发酵条件:0.5-0.8vvm,300-700rpm,控制pH7.0,温度37℃,溶氧20%,发酵周期30h;
(3)待发酵液中残糖量为0.05-0.15g/L开始流加碳源,并以25%的氨水作为流加氮源控制pH,同时使用氢氧化钡、氢氧化钠或氢氧化钾溶液作为pH辅助调节剂;具体地,以50%的葡萄糖溶液作为流加碳源;以25%的氨水作为流加氮源,同时结合1-5%氢氧化钡、氢氧化钠或氢氧化钾溶液控制发酵过程的pH7.0;发酵过程中发酵液中葡萄糖的浓度控制在0.05-0.15g/L,游离铵浓度控制在0.06%以下。
进一步地,步骤(3)中氢氧化钡、氢氧化钠或氢氧化钾溶液的添加量为发酵液体积的0.5-5%,优选1%。
第四方面,本发明提供一种L-赖氨酸的发酵生产方法,包括以下步骤:
(1)将L-赖氨酸种子培养基按照权利要求3所述方法灭菌后加入种子罐中,装液量20L/50L,接入种子液200mL;培养条件:通气量0.8vvm,转速300rpm,控制pH7.0,温度37℃,溶氧20%;种子生长至OD600=20时停止培养;
其中,所述种子液中产L-赖氨酸菌种的浓度为OD600=20;优选地,产L-赖氨酸菌种为保藏编号为CGMCC No.22648的大肠埃希氏菌(Escherichia coli)MHZ-0914;
(2)将L-赖氨酸发酵培养基按照权利要求1-3任一项所述方法灭菌后加入发酵罐中,装液量16.5L/50L,取种子罐中的种子3.5L接入发酵罐中;发酵条件:通气量0.5-0.8vvm,300-700rpm,控制pH7.0,温度37℃,溶氧30%,发酵周期36h;
(3)待发酵液中残糖量为0.05-0.15g/L开始流加碳源,具体地,以50%的葡萄糖溶液作为流加碳源,以25%的氨水作为流加氮源同时控制发酵过程的pH7.0;发酵过程中发酵液中葡萄糖的浓度控制在0.05-0.15g/L。
大肠埃希氏菌(Escherichia coli)MHZ-0914现已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号,中国科学院微生物研究所,邮编100101,保藏编号CGMCC No.22648,保藏日期2021年6月1日。
第五方面,本发明提供一种L-谷氨酸的发酵生产方法,包括以下步骤:
(1)将L-谷氨酸种子培养基按照权利要求3所述方法灭菌后加入种子罐中,装液量20L/50L,接入种子液3.5L;培养条件:通气量0.8vvm,转速300rpm,控制pH7.0,温度32℃,溶氧20%;种子生长至OD562=50时停止培养;
其中,所述种子液中产L-谷氨酸菌种的浓度为OD562=50;优选地,产L-谷氨酸菌种为谷氨酸棒杆菌MHZ-0112-8(菌株MHZ-0112-8可参见CN105695383B);
(2)将L-谷氨酸发酵培养基按照权利要求1-3任一项所述方法灭菌后加入发酵罐中,装液量16.5L/50L,取种子罐中的种子3.5L接入发酵罐中;发酵条件:初始培养温度32℃,待培养至发酵液OD562达到40以上时升温至37℃,24h后升温至39℃,调节通气量0.5-0.8vvm、转速300-700rpm和罐压0.05MPa,控制过程溶氧20%以上;
(3)待发酵液中残糖量为0.05-0.15g/L开始流加碳源,具体地,以50%的葡萄糖溶液作为流加碳源,以25%的氨水作为流加氮源同时控制发酵过程的pH7.0;发酵过程中发酵液中葡萄糖的浓度控制在0.05-0.15g/L。
借由上述技术方案,本发明至少具有下列优点及有益效果:
本发明提供一种培养基低pH高渗透压方式灭菌方法,采用该方式可有效灭菌,同时降低培养基中L-赖氨酸和L-精氨酸的损失。采用这种灭菌方式,可用于L-苏氨酸、L-谷氨酸,L-赖氨酸发酵,L-谷氨酸产量提高2.6g/L,转化率提高1.2%,L-赖氨酸产量提高3.8g/L,转化率提高1.5%。L-苏氨酸发酵过程中,培养基采用该方式灭菌,并在发酵控制中使用5%氢氧化钡作为发酵pH辅助调节剂,控制游离铵根离子浓度低于0.06%,该工艺提高了菌体的生长,L-苏氨酸产量提高5.6%,转化率提高3.8%。
附图说明
图1为本发明较佳实施例中无菌平板划线培养结果;其中,左为新灭菌方式0h、15h、30h、45h无菌LB培养基平板,37℃培养24h以上,无杂菌斑出现;右为新灭菌方式60h、75h、90h、100h无菌LB培养基平板,37℃培养24h以上,无杂菌斑出现。
图2为本发明较佳实施例中L-苏基酸种子培养对比。
图3为本发明较佳实施例中L-苏基酸发酵对比。
图4为本发明较佳实施例中L-赖基酸种子培养对比。
图5为本发明较佳实施例中L-赖基酸发酵对比。
图6为本发明较佳实施例中L-谷基酸种子培养对比。
图7为本发明较佳实施例中L-谷基酸发酵对比。
具体实施方式
本发明提供一种微生物培养基灭菌方式,在一定pH、温度、渗透压下灭菌,有效灭菌并降低L-赖氨酸和L-精氨酸的损失,用于L-氨基酸发酵,可提高L-氨基酸产量和转化率。
本发明提供一种L-氨基酸过程调节pH方式,调节pH依靠流加1-5%氢氧化物进行,该方式可以控制其游离铵浓度0.06%以下。
进一步地,将种子中无机盐、玉米浆、水解液混溶,混合液渗透压达到800-1200osmol/kg,采用稀硫酸调节pH控制在1-4之间,优选pH2.0、渗透压调节至1000osmol/kg。
进一步地,发酵过程辅助控制pH所用氢氧化物,可以为氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钡,浓度1-5%,优选5%,氢氧化物添加量为发酵液体积的0.5-5%,优选1%。
该控制方法可用在L-氨基酸发酵中,特别是用在L-苏氨酸发酵中。
所述灭菌方式用于L-苏氨酸,L-赖氨酸,L-谷氨酸发酵,可提高L-苏氨酸,L-赖氨酸,L-谷氨酸产量和转化率。
本发明提供一种L-苏氨酸发酵调节pH的方式,该方式结合液氨或氨水,流加氢氧化钡溶液调节pH,该方式可以控制L-苏氨酸发酵液游离铵浓度0.06%以下。可以提高微生物活性,提高产酸和转化率。
以下实施例用于说明本发明,但不用来限制本发明的范围。若未特别指明,实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段,所用原料均为市售商品。
实施例1培养基灭菌方法
L-苏氨酸种子培养基:玉米浆15g/L,豆粕水解液5g/L,葡萄糖20g/L,MgSO4·7H2O0.5g/L,KH2PO4 2g/L。
L-苏氨酸发酵培养基:玉米浆5g/L,豆粕水解液5g/L,葡萄糖40g/L,MgSO4·7H2O0.5g/L,KH2PO4 2g/L。
L-赖氨酸种子培养基:葡萄糖60g/L,(NH4)2SO4 25g/L,KH2PO4 2.0g/L,MgSO4·7H2O 1.0g/L,玉米浆20g/L,豆粕水解液10g/L,FeSO4·7H2O 10mg/L、MnSO4·H2O 10mg/L。
L-赖氨酸发酵培养基:葡萄糖40g/L,(NH4)2SO4 25g/L,KH2PO4 2.0g/L,MgSO4·7H2O 1.0g/L,玉米浆10g/L,豆粕水解液10g/L,FeSO4·7H2O 10mg/L、MnSO4·H2O 10mg/L。
L-谷氨酸种子培养基:葡萄糖40g/L,玉米浆30g/L,豆粕水解液15g/L,K2HPO4 1g/L,MgSO4·7H2O 1.2g/L,VB1 100μg/L,生物素200μg/L,FeSO4·7H2O 5mg/L、MnSO4·H2O5mg/L,琥珀酸1.5g/L。
L-谷氨酸发酵培养基:葡萄糖50g/L,玉米浆60g/L,豆粕水解液30g/L,K2HPO4 3g/L,MgSO4·7H2O 1.5g/L,VB1 200μg/L,生物素300μg/L,FeSO4·7H2O 10mg/L,MnSO4·H2O10mg/L,琥珀酸3g/L。
用稀硫酸调节种子培养基和发酵培养基pH 2.0,加水调节渗透压1000osmol/kg,高压灭菌锅灭菌,温度118℃,时间15min。灭菌操作完毕后,加入无菌的种子培养基于发酵罐中,并加无菌水至16.5L。
从表1可以看出,本发明的灭菌方式,可降低培养基中L-赖氨酸和L-精氨酸的损失。
表1灭菌方式比较
注:常规灭菌方法为:121℃,pH7.0,灭菌20min。
采用本发明灭菌方法,将培养基接入发酵罐中空培,每15h取无菌样,100h发酵罐溶氧不下降,平板没有细菌生长(图1)。
苏氨酸种子培养基损失精氨酸降低9%,赖氨酸降低17.2%;
苏氨酸发酵培养基损失精氨酸降低15.4%,赖氨酸降低0%;
谷氨酸种子培养基损失精氨酸降低7.4%,赖氨酸降低11.5%;
谷氨酸发酵培养基损失精氨酸降低10.8%,赖氨酸降低12.3%;
赖氨酸种子培养基损失精氨酸降低11.1%,赖氨酸降低9.2%;
赖氨酸发酵培养基损失精氨酸降低10.3%,赖氨酸降低12.1%。
实施例2L-苏氨酸发酵生产方法
将已经灭菌的L-苏氨酸种子培养基加入无菌的种子罐50L中,加水调节种子培养基初定容至20L,接入种子液200mL。培养条件:通气量0.8vvm,转速300rpm,培养pH7.0,温度37℃,溶氧20%。种子生长至OD600 10时停止培养。
其中,所述种子液中产L-苏氨酸菌种的浓度为OD600=20;所用菌种为大肠杆菌MHZ-0216-5。
将已经灭菌的L-苏氨酸发酵培养基接入无菌的发酵罐50L中,加入无菌水定容16.5L;取种子罐中种子液3.5L接入发酵罐中。发酵过程控制条件:0.5-0.8vvm,300-700rpm,罐压0.07MPa,pH7.0,温度37℃,溶氧20%,发酵周期30h。
待发酵液中残糖量为0.1g/L开始流加碳源,氮源氨水作为pH调节剂控制pH7.0,配置50%的葡萄糖溶液作为流加碳源,利用25%的氨水作为流加氮源,灭菌的5%氢氧化钡/氢氧化钠作为pH辅助调节剂,发酵过程控制pH7.0,该方式可以控制其游离铵浓度0.06%以下。发酵过程中发酵液中葡萄糖的浓度控制在0.1g/L左右。
使用SBA生物传感仪测定葡萄糖含量,凯氏定氮仪测定游离铵含量,HPLC测定L-苏氨酸含量。
表2发酵结果表明,常规灭菌方式L-苏氨酸产量111.1g/L,转化率55.1%,新灭菌方式产量114.6g/L,转化率56.8%,氢氧化钠控制过程pH产量112.7g/L,转化率55.8%,氢氧化钡控制过程pH产量114.5g/L,转化率56.9%,新灭菌方式+氢氧化钡控制发酵过程pH产量116.7g/L,转化率58.9%,新灭菌方式+氢氧化钡控制发酵过程pH比常规方式L-苏氨酸高5.6g/L,转化率高3.8%,游离铵从0.07-0.1g/L降低至0.04-0.05g/L,细菌生长得到了改善(图2和图3)。
表2 L-苏氨酸发酵液游离铵根离子、L-苏氨酸检测和转化率计算
实施例3L-赖氨酸发酵生产方法
将已经灭菌的L-赖氨酸种子培养基加入无菌的种子罐50L中,加水调节种子初定容至16.5L,接入种子液200mL。培养条件:通气量0.8vvm,转速300rpm,培养pH7.0,温度37℃,溶氧20%。种子生长至OD600 20时停止培养。
其中,所述种子液中产L-赖氨酸菌种的浓度为OD600=20;所用菌种为保藏编号CGMCC No.22648的大肠杆菌。
将已经灭菌的L-赖氨酸发酵培养基接入无菌的发酵罐中50L,加入无菌水定容16.5L;取种子罐中种子液3.5L接入发酵罐中。
发酵培养:初始培养温度37℃,调节风量0.5-0.8vvm、转速300-700rpm和罐压0.07MPa,控制过程溶氧20%以上。配置50%的葡萄糖溶液作为碳源,利用25%的氨水作为氮源和pH调节剂,发酵过程控制pH7.0,温度37℃,溶氧30%,发酵周期36h。发酵过程中发酵液中葡萄糖的浓度控制在0.1g/L左右,游离铵浓度控制在0.06%以下。
使用SBA生物传感仪测定葡萄糖含量,凯氏定氮仪测定游离铵含量,HPLC测定L-赖氨酸含量。新灭菌方式放罐发酵液中L-赖氨酸196.3g/L,糖酸转化率70.1%,产酸较对比常规发酵L-赖氨酸产量192.5g/L提高了3.8%,转化率较常规发酵L-赖氨酸68.6%提高了1.5%,细菌生长得到了改善(表3,图4和图5)。
表3发酵液L-赖氨酸检测和转化率计算
常规发酵 | 本发明新灭菌方式 | |
L-赖氨酸 | 192.5g/L | 196.3g/L |
转化率 | 68.6% | 70.1% |
实施例4L-谷氨酸发酵生产方法
将已经灭菌的L-谷氨酸种子培养基加入无菌的种子罐50L中,加水调节种子初定容至20L,接入种子液200mL。培养条件:通气量0.8vvm,转速300rpm,培养pH7.0,温度32℃,溶氧20%。种子生长至OD562 50时停止培养。
其中,所述种子液中产L-谷氨酸菌种的浓度为OD562=50;所用菌种为谷氨酸棒杆菌MHZ-0112-8。
将已经灭菌的L-谷氨酸发酵培养基接入无菌的发酵罐中,加入无菌水定容16.5L;取种子罐中种子液3.5L接入发酵罐中50L,发酵培养:初始培养温度32℃,培养至发酵液OD562达到40以上后升温至37℃,24h后升温至39℃,调节通风量0.5-0.8vvm、转速300-700rpm和罐压0.05MPa,控制过程溶氧20%以上。配置50%的葡萄糖溶液作为碳源,利用25%的氨水作为氮源并作为pH控制手段,调节pH7.0。发酵周期32h。发酵过程中发酵液中葡萄糖的浓度控制在0.1g/L左右,游离铵浓度控制在0.06%以下。
使用SBA生物传感仪测定葡萄糖含量,HPLC测定L-谷氨酸含量。新培养基灭菌方式放罐发酵液中L-谷氨酸205.7g/L,糖酸转化率67.5%,产酸常规发酵L-谷氨酸203.1g/L提高了2.6%,转化率较常规发酵L-谷氨酸66.3%提高了1.2%,细菌生长得到了改善(表4,图6和图7)。
表4发酵液L-谷氨酸检测和转化率计算
常规发酵 | 新灭菌方式 | |
L-谷氨酸 | 203.1g/L | 205.7g/L |
转化率 | 66.3% | 67.5% |
虽然,上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述,但在本发明基础上,可以对之做一些修改或改进,这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此,在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进,均属于本发明要求保护的范围。
Claims (8)
1.培养基灭菌方法,其特征在于,将配制好的培养基的渗透压调至800-1200osmol/kg,并控制pH为1-4,然后在115℃-121℃条件下灭菌10-20min;
所述培养基由玉米浆、豆粕水解液、葡萄糖和无机盐,加水配制而成。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,将配制好的培养基的渗透压调至1000osmol/kg,并控制pH为2,然后在118℃条件下灭菌15min。
3.根据权利要求1或2所述的方法,其特征在于,所述培养基包括L-苏氨酸种子培养基、L-苏氨酸发酵培养基、L-赖氨酸种子培养基、L-赖氨酸发酵培养基、L-谷氨酸种子培养基和L-谷氨酸发酵培养基,各培养基配方如下:
L-苏氨酸种子培养基:玉米浆10-20g/L,豆粕水解液3-7g/L,葡萄糖20g/L,MgSO4·7H2O0.5g/L,KH2PO4 2g/L;
L-苏氨酸发酵培养基:玉米浆3-7g/L,豆粕水解液3-7g/L,葡萄糖40g/L,MgSO4·7H2O0.5g/L,KH2PO4 2g/L;
L-赖氨酸种子培养基:葡萄糖60g/L,(NH4)2SO4 25g/L,KH2PO4 2.0g/L,MgSO4·7H2O1.0g/L,玉米浆15-25g/L,豆粕水解液5-15g/L,FeSO4·7H2O 10mg/L、MnSO4·H2O 10mg/L;
L-赖氨酸发酵培养基:葡萄糖40g/L,(NH4)2SO4 25g/L,KH2PO4 2.0g/L,MgSO4·7H2O1.0g/L,玉米浆5-15g/L,豆粕水解液5-15g/L,FeSO4·7H2O 10mg/L、MnSO4·H2O 10mg/L;
L-谷氨酸种子培养基:葡萄糖40g/L,玉米浆25-35g/L,豆粕水解液10-20g/L,K2HPO41g/L,MgSO4·7H2O 1.2g/L,VB1 100μg/L,生物素200μg/L,FeSO4·7H2O 5mg/L、MnSO4·H2O5mg/L,琥珀酸1.5g/L;
L-谷氨酸发酵培养基:葡萄糖50g/L,玉米浆50-70g/L,豆粕水解液20-40g/L,K2HPO43g/L,MgSO4·7H2O 1.5g/L,VB1 200μg/L,生物素300μg/L,FeSO4·7H2O 10mg/L,MnSO4·H2O10mg/L,琥珀酸3g/L。
4.权利要求1-3任一项所述方法得到的培养基在L-氨基酸发酵生产中的应用。
5.L-苏氨酸的发酵生产方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)将L-苏氨酸种子培养基按照权利要求1-3任一项所述方法灭菌后加入种子罐中,装液量20L/50L,接入种子液200mL;培养条件:通气量0.8vvm,转速300rpm,控制pH7.0,温度37℃,溶氧20%;种子生长至OD600=20时停止培养;
其中,所述种子液中产L-苏氨酸菌种的浓度为OD600=20;优选地,产L-苏氨酸菌种为大肠杆菌MHZ-0216-5;
(2)将L-苏氨酸发酵培养基按照权利要求3所述方法灭菌后加入发酵罐中,装液量16.5L/50L,取种子罐中的种子3.5L接入发酵罐中;发酵条件:0.5-0.8vvm,300-700rpm,控制pH7.0,温度37℃,溶氧20%,发酵周期30h;
(3)待发酵液中残糖量为0.05-0.15g/L开始流加碳源,并以25%的氨水作为流加氮源控制pH,同时使用氢氧化钡、氢氧化钠或氢氧化钾溶液作为pH辅助调节剂;具体地,以50%的葡萄糖溶液作为流加碳源;以25%的氨水作为流加氮源,同时结合1-5%氢氧化钡、氢氧化钠或氢氧化钾溶液控制发酵过程的pH7.0;发酵过程中发酵液中葡萄糖的浓度控制在0.05-0.15g/L,游离铵浓度控制在0.06%以下。
6.根据权利要求5所述的方法,其特征在于,步骤(3)中氢氧化钡、氢氧化钠或氢氧化钾溶液的添加量为发酵液体积的0.5-5%,优选1%。
7.L-赖氨酸的发酵生产方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)将L-赖氨酸种子培养基按照权利要求3所述方法灭菌后加入种子罐中,装液量20L/50L,接入种子液200mL;培养条件:通气量0.8vvm,转速300rpm,控制pH7.0,温度37℃,溶氧20%;种子生长至OD600=20时停止培养;
其中,所述种子液中产L-赖氨酸菌种的浓度为OD600=20;优选地,产L-赖氨酸菌种为保藏编号为CGMCC No.22648的大肠埃希氏菌(Escherichia coli);
(2)将L-赖氨酸发酵培养基按照权利要求1-3任一项所述方法灭菌后加入发酵罐中,装液量16.5L/50L,取种子罐中的种子3.5L接入发酵罐中;发酵条件:通气量0.5-0.8vvm,300-700rpm,控制pH7.0,温度37℃,溶氧30%,发酵周期36h;
(3)待发酵液中残糖量为0.05-0.15g/L开始流加碳源,具体地,以50%的葡萄糖溶液作为流加碳源,以25%的氨水作为流加氮源同时控制发酵过程的pH7.0;发酵过程中发酵液中葡萄糖的浓度控制在0.05-0.15g/L。
8.L-谷氨酸的发酵生产方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)将L-谷氨酸种子培养基按照权利要求3所述方法灭菌后加入种子罐中,装液量20L/50L,接入种子液3.5L;培养条件:通气量0.8vvm,转速300rpm,控制pH7.0,温度32℃,溶氧20%;种子生长至OD562=50时停止培养;
其中,所述种子液中产L-谷氨酸菌种的浓度为OD562=50;优选地,产L-谷氨酸菌种为谷氨酸棒杆菌MHZ-0112-8;
(2)将L-谷氨酸发酵培养基按照权利要求1-3任一项所述方法灭菌后加入发酵罐中,装液量16.5L/50L,取种子罐中的种子3.5L接入发酵罐中;发酵条件:初始培养温度32℃,待培养至发酵液OD562达到40以上时升温至37℃,24h后升温至39℃,调节通气量0.5-0.8vvm、转速300-700rpm和罐压0.05MPa,控制过程溶氧20%以上;
(3)待发酵液中残糖量为0.05-0.15g/L开始流加碳源,具体地,以50%的葡萄糖溶液作为流加碳源,以25%的氨水作为流加氮源同时控制发酵过程的pH7.0;发酵过程中发酵液中葡萄糖的浓度控制在0.05-0.15g/L。
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