CN106947793A - 一种麸酸的发酵提取工艺 - Google Patents

Abstract

本发明属于微生物技术领域，公开了一种麸酸的发酵提取工艺，其包括如下步骤：谷氨酸棒杆菌发酵制备发酵液，发酵过程中添加曲拉通X‑100和氯化钠，并且调整温度和压强；分离麸酸料液，蒸发浓缩，然后等电提取麸酸。本发明通过添加曲拉通X‑100以及氯化钠结合温度压强的改变，实现谷氨酸棒杆菌培养与透性化处理的耦合，提高了产量。

Description

一种麸酸的发酵提取工艺

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种麸酸的发酵提取工艺。

背景技术

麸酸又名麸氨酸、谷氨酸（英文名称 glutamic acide），化学名称为α-氨基戊二酸（α-amino-pentadicarboxylic acide）。谷氨酸有左旋体、右旋体和外消旋体。左旋体，即L-谷氨酸，统称为谷氨酸。是一种酸性氨基酸，分子中有两个羧基，鳞片状或粉末状晶体，呈微酸性，无毒。微溶于冷水，易溶于热水，几乎不溶于乙醚、丙酮及冷醋酸中，也不溶于乙醇和甲醇。在200℃时升华，247℃-249℃分解。L-谷氨酸的用途广泛，其钠盐有特殊的鲜味用作食品的鲜味剂，分子式为C5H9O4。

谷氨酸棒杆菌是微生物工业发酵生产麸酸的主要菌株。人们一直通过各种方法改造菌株以提高氨基酸的产量，早期应用最广泛的为各种条件下的诱变育种，而随着氨基酸生物代谢途径的揭秘，有目的的在分子水平上对代谢途径进行改造也渐渐显露其优势，另外，中游的发酵条件优化过程以及下游的回收净化过程也是一个重点。但是，对于氨基酸分泌过程的研究，却起步较晚，而且人们一直把注意力集中在细胞膜氨基酸的转运蛋白上。申请人前期主要研究培养基组分以及菌株配伍方面对麸酸发酵效率的影响，取得了一定的效果，参见专利技术“一种新的谷氨酸生产方法”以及“一种谷氨酸高产酸工艺”。

由于菌体细胞壁及细胞膜的屏障作用限制了底物及产物在细胞内外的交换。而细胞透性化技术可以在不破坏细胞整体有机体系的情况下改变细胞膜的通透性，从而克服细胞膜的渗透屏障，降低胞外物质的传质阻力，使胞内酶在稳定的细胞内环境中发挥作用，从而提高其稳定性和催化效率。在不破坏细胞整体内部有机系统的前提下改变细胞膜的通透性。细胞通透性改变因不同的微生物类型而有所不同，即使对于同一类型的微生物，也会由于细胞壁、膜的组成和结构不同而有很大差别。有研究报道，谷氨酸棒杆菌是一类特殊的革兰氏阳性菌，它的细胞壁中含有一种特殊的脂肪酸——分枝菌酸。一部分分枝菌酸与与阿拉伯糖酯化，形成固定的分枝菌酸，另一部分与海藻糖相连，形成游离的分枝菌酸。分枝菌酸的存在大大降低了细胞壁的通透性。现在人们已经逐渐认识到分枝菌酸对氨基酸分泌的重要性。研究分枝菌酸结构特点，对改造这些菌株的通透性具有重要意义。现有技术一些添加剂的使用，如青霉素和吐温添加以干扰细胞壁的合成从而增加氨基酸产量的做法，取得了一定效果。但是添加抗生素容易导致产品中有残留，造成污染。因此，通过合理方法有效改善细胞壁和细胞膜对底物的传质阻力来提高氨基酸的产量具有重要意义。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明提供了一种麸酸的发酵提取工艺。

本发明是通过如下方案来实现的：

一种麸酸的发酵提取工艺，其包括如下步骤：谷氨酸棒杆菌发酵制备发酵液，发酵过程中添加曲拉通X-100和氯化钠，并且调整温度和压强；分离麸酸料液，蒸发浓缩，然后等电提取麸酸。

具体地，所述工艺包括如下步骤：

1）将谷氨酸棒杆菌种子液按照8-10％接种量接种到发酵罐，发酵时间为48小时；其中第0-46小时，控制温度为32℃，常压，在第37小时，添加曲拉通X-100；第47-48小时，控制温度为38-40℃，压强为3-5个大气压，其中，在第43小时，添加氯化钠；发酵过程中，通过流加氨水控制pH在7.1；并将残糖控制在不低于1.0wt％，发酵至48小时停止，得发酵液；

2）将发酵液利用高速碟片分离机将将麸酸料液和菌体蛋白分离；高速碟片机的转速为4000-5000rpm，时间为3min；

3）将麸酸料液进行蒸发浓缩，然后采用连续流加硫酸对麸酸进行等电沉降提取麸酸。

优选地，所述发酵罐中的发酵培养基为，按照质量百分比：葡萄糖6-8%，酵母膏4-7%，玉米浆2-3%，尿素0.05-0.08%，硫酸亚铁0.02-0.03%，硫酸镁0.02-0.03%，磷酸二氢钾0.01-0.02%，VB1 0.01-0.02%，pH 7.1。

优选地，所述曲拉通X-100得添加量为1-2μg/ml。

优选地，所述氯化钠的添加量为10-20μg/ml。

本发明取得的有益效果主要包括但是并不限于以下几个方面：

本发明通过提高培养温度，可增加分子扩散的速度；增加压力对细胞的挤压作用增强,辅助以适当浓度的盐溶液来改变菌体细胞的渗透压，细胞表面发生轻微变形,细胞膜的通透性增加；培养过程后期加入曲拉通X-100，干扰细胞壁的合成，改善菌体细胞壁和细胞膜对催化反应中底物和产物的传质限制，同时调整合适的浓度，避免终浓度过低，达不到透性化改造的目的，终浓度过高则可能导致细胞死亡或生长停滞；本发明通过添加曲拉通X-100以及氯化钠结合温度压强的改变，实现谷氨酸棒杆菌培养与透性化处理的耦合，可以在不需要对培养好的细胞进行后续透性化处理的情况下减小菌体细胞壁和细胞膜对底物和产物的传质限制，避免后续透性化处理细胞的步骤及相关设备运转的投入，为提高麸酸产量提供了一个简便方法。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本申请中的技术方案，下面将结合本申请具体实施例，对本发明进行更加清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。

实施例1

一种麸酸的发酵提取工艺，其包括如下步骤：

将谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13032种子液（1×10⁸cfu/ml）以8％接种量接种到发酵罐，发酵时间为48小时，其中0-46小时，控制温度为32℃，常压，其中，在第37小时，添加曲拉通X-100（Triton X-100），添加量为1μg/ml；第47-48小时，控制温度为38℃，压强为5个大气压，其中，在第43小时，添加氯化钠，添加量为10μg/ml；发酵过程中，通过自动流加氨水控制pH在7.1；并通过流加浓度为100g/L的葡萄糖溶液将残糖控制在不低于1.0％，发酵至48h停止，得发酵液；

其中发酵培养基为（质量百分比）：葡萄糖6-8%，酵母膏4-7%，玉米浆2-3%，尿素0.05-0.08%，硫酸亚铁0.02-0.03%，硫酸镁0.02-0.03%，磷酸二氢钾0.01-0.02%，VB1 0.01-0.02%，pH 7.1；

利用高速碟片分离机将麸酸料液和菌体蛋白分离；高速碟片机的转速为4000rpm，时间为3min；

将麸酸料液进行蒸发浓缩，然后采用连续流加硫酸对麸酸进行等电沉降提取麸酸。

实施例2

一种麸酸的发酵提取工艺，其包括如下步骤：

将谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13032种子液（1×10⁸cfu/ml）以10％接种量接种到发酵罐，发酵时间为48小时，其中0-46小时，控制温度为32℃，常压，其中，在第37小时，添加曲拉通X-100（Triton X-100），添加量为2μg/ml；第47-48小时，控制温度为40℃，压强为3个大气压，其中，在第43小时，添加氯化钠，添加量为20μg/ml；发酵过程中，通过自动流加氨水控制pH在7.1；并通过流加浓度为100g/L的葡萄糖溶液将残糖控制在不低于1.0％，发酵至48h停止，得发酵液；

其中发酵培养基为（质量百分比）：葡萄糖6-8%，酵母膏4-7%，玉米浆2-3%，尿素0.05-0.08%，硫酸亚铁0.02-0.03%，硫酸镁0.02-0.03%，磷酸二氢钾0.01-0.02%，VB1 0.01-0.02%，pH 7.1；

利用高速碟片分离机将将麸酸料液和菌体蛋白分离；高速碟片机的转速为5000rpm，时间为3min；

将麸酸料液进行蒸发浓缩，然后采用连续流加硫酸对麸酸进行等电沉降提取麸酸。

实施例3

各因素对麸酸发酵产量的影响：

设置对照组，其中，对照组1：不改变温度和压强，其余同实施例1；对照组2：不添加曲拉通X-100和氯化钠，其余同实施例1；试验组为实施例1。各组别发酵液中麸酸产量见表1：

表1

组别	对照组1	对照组2	试验组
				麸酸产量（g/L）	103.4	112.9	136.7

实施例4

温度和压强改变对细胞壁中分枝菌酸的影响：

分枝菌酸的提取方法根据参考文献J.Biol.Chem, 2004, 279:44847-44857，然后采用薄层层析色谱（TLC）检测分枝菌酸的含量；以不采用温度和压强进行处理的菌作为对照组，通过检测，本发明实施例1菌株细胞壁中结合型分枝菌酸的含量减少了29%，实施例2菌株细胞壁中结合型分枝菌酸的含量减少了31%；可见，当温度提高时可以影响并调节分枝菌酸与磷脂的组成；适当增加压强，可以改变分枝菌酸的状态，减少结合型分枝菌酸的比例；细胞壁中分枝菌酸的降低，提高了细胞壁中通透性。

实施例5

一、压强梯度试验：针对发酵第47-48小时，选择1-10大气压进行测试，其余实验流程同实施例1，具体发酵结果见表2：

表2

大气压强度	1	2	3	5	7	10
							麸酸产量（g/L）	113.7	121.4	134.9	136.7	126.5	93.5

结论：适当强度的压强可以提高麸酸产量，压强过大时，可能会导致菌株活力降低或者死亡，从而导致产酸量下降。

温度梯度试验：针对发酵第47-48小时，选择32-42℃进行测试，其余实验流程同实施例2，具体发酵结果见表3：

表3

温度℃	32	34	36	38	40	42
							麸酸产量（g/L）	117.7	121.9	125.4	139.4	141.3	128.6

结论：适当提高温度可以增加细胞壁的透过性，从而提高麸酸产量，温度过高时，可能会导致菌株活力降低或者死亡，从而导致产酸量下降。

以上列举的仅是本发明的最佳具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (5)

1.一种麸酸的发酵提取工艺，其包括如下步骤：谷氨酸棒杆菌发酵制备发酵液，发酵过程中添加曲拉通X-100和氯化钠，并且调整温度和压强；分离麸酸料液，蒸发浓缩，然后等电提取麸酸。

2.根据权利要求1所述的工艺，其特征在于，所述工艺包括如下步骤：

1）将谷氨酸棒杆菌种子液按照8-10％接种量接种到发酵罐，发酵时间为48小时，得到发酵液；其中第0-46小时，控制温度为32℃，常压，在第37小时，添加曲拉通X-100；第47-48小时，控制温度为38-40℃，压强为3-5个大气；其中，在第43小时，添加氯化钠；发酵过程中，通过流加氨水控制pH在7.1，并将残糖控制在不低于1.0wt％；

2）利用高速碟片分离机将发酵液的麸酸料液和菌体蛋白分离；高速碟片机的转速为4000-5000rpm，时间为3min；

3）将麸酸料液进行蒸发浓缩，然后采用连续流加硫酸进行等电沉降提取麸酸。

3.根据权利要求2所述的工艺，其特征在于，所述发酵罐中的发酵培养基为，按照质量百分比：葡萄糖6-8%，酵母膏4-7%，玉米浆2-3%，尿素0.05-0.08%，硫酸亚铁0.02-0.03%，硫酸镁0.02-0.03%，磷酸二氢钾0.01-0.02%，VB₁ 0.01-0.02%，pH 7.1。

4.根据权利要求2所述的工艺，其特征在于，所述曲拉通X-100的添加量为1-2μg/ml。

5.根据权利要求2所述的工艺，其特征在于，所述氯化钠的添加量为10-20μg/ml。