CN103088081A - 一种补加生物素的生产谷氨酸的发酵方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种补加生物素的生产谷氨酸的发酵方法，步骤包括：以生物素缺陷型菌株为生产菌株，控制发酵培养基中初始生物素的含量，在发酵过程中补加青霉素和生物素。本发明发酵方法在发酵过程的中后期添加青霉素和生物素，可以克服“亚适量”工艺发酵后期生物素贫乏的问题，保证了培养基中含有充足的生物素提供菌体的生长和代谢，大大提高了菌体的谷氨酸的合成速度，相较于现有的谷氨酸亚适量发酵工艺，单位菌体的产酸速率提高了10%以上，大大缩短了发酵周期，降低了生产成本。
Description
技术领域
本发明属于生物发酵工程技术领域，涉及谷氨酸的生产，尤其是一种补加生物素的生产谷氨酸的发酵方法。
背景技术
目前，国内大多数的谷氨酸生产企业采用生物素缺陷型菌株，采用生物素“亚适量”或者“超亚适量”的发酵工艺。但是，这两种发酵工艺都要求控制发酵培养基中生物素的含量，不能超过限量水平，从而导致发酵中后期发酵培养基中生物素严重缺乏，菌体活力和产酸速率受限。可见，“亚适量”或者“超亚适量”谷氨酸发酵工艺存在生物素贫乏的问题，是不利于提高发酵产酸速率的。国外很多企业采用高生物素添加青霉素流加糖发酵工艺，在初始发酵培养基中加入大量的生物素，但是必须严格控制好添加青霉素的时间与浓度，否则会严重影响正常产酸。因此，操作要求苛刻，很难把握，国内企业很少采用此方法。
谷氨酸发酵菌株是生物素缺陷型菌株，不能自身合成生物素。生物素作为丙酮酸羧化酶的辅酶，催化丙酮酸羧化生成草酞乙酸，并促使草酰琥珀酸转化为α-酮戊二酸，并进而转化为谷氨酸。当生物素过量时，由于细胞内有大量的磷脂质，使细胞壁、细胞膜增厚，不利于谷氨酸的分泌，造成产酸率下降，影响发酵生产的经济效益。只有在生物素限量的情况下，菌体生长与产酸才趋于平衡。但是，在生物素限量的情况下，发酵中后期发酵培养基中生物素消耗殆尽，菌体缺乏生物素，导致谷氨酸合成中的关键反应（即丙酮酸羧化生成草酰乙酸）中的丙酮酸羧化酶活力减弱，进而导致谷氨酸发酵速率降低。青霉素可以在菌体生长繁殖时阻抑胞壁合成，增加细胞膜通透性，促使细胞内的谷氨酸外漏和积累，因此允许培养基中有大量的生物素存在。
通过检索，发现三篇与本专利申请相关的专利公开文献：
1、一种谷氨酸的生产方法（CN101440386），涉及一种谷氨酸的生产方法，包括一级种培养，二级种培养，三级种培养和发酵罐发酵，其特征是：上述二级种培养、三级种培养和发酵罐发酵的底料中均添加有生物素，且采用大种量接种和在发酵过程中流加糖技术。本发明工艺方法独特，相较于现有技术而言产酸和转化率提高，生产周期短，生产成本低，谷氨酸产量高，且节电节水，原料用量少。
2、基于pH的反馈补料生产谷氨酸的方法（CN1982467），该方法在好氧发酵时，按照发酵液中葡萄糖消耗量和氨消耗量之间的比例关系配制葡萄糖和氨的混合溶液，通过向发酵液中加入葡萄糖和氨的混合溶液来控制发酵液的pH在6.5～7.5之间，使之既不产生葡萄糖抑制，也不构成限制，至将预先配制的葡萄糖和氨的混合溶液耗尽时停止。该方法利用pH值反馈控制补料，简化了生产工艺，在不增加额外设备的情况下提高了谷氨酸的产量和转化率，适合于工业化生产。
3、玉米浸泡水用于生物素亚适量发酵工艺生产谷氨酸的方法（CN102154397A），公开了一种玉米浸泡水用于生物素亚适量发酵工艺生产谷氨酸的方法，其创新性在于，用玉米浸泡水代替生物素亚适量发酵工艺中的玉米浆制备发酵培养基，发酵生产谷氨酸。该工艺技术操作方便，节水节能，有利于降低谷氨酸的发酵成本，适于在生产中全面推广。本发明不仅可节省配料用的一次水，也大大节省玉米浸泡水进一步蒸发浓缩所消耗的能源，解决了利用玉米浸泡水生产玉米浆(粉)所造成的环境污染和能源消耗问题，同时其产酸率和糖酸转化率也有所提高。
通过对比，本发明专利申请与上述专利公开文献存在本质的不同。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提出一种操作简单、控制方便，能有效解决发酵中后期生物素匮乏，有效提高产酸速率，降低生产成本的谷氨酸生产方法。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
一种补加生物素的生产谷氨酸的发酵方法，步骤包括：以生物素缺陷型菌株为生产菌株，控制发酵培养基中初始生物素的含量，在发酵过程中补加青霉素和生物素。
而且，所述的发酵方法，其特征在于：步骤如下：
(1)将OD值为0.9~1.2的生物素缺陷型菌株的种子培养液按种子培养液：发酵培养基的体积比为0.05~0.2：1的比例接入发酵培养基中，发酵培养基中初始生物素含量为5μg/L~65μg/L；发酵温度控制在32~40℃；补充氮源至pH为6.5~7.5，控制通气量为0.1~0.5vvm；
(2)在发酵培养至6~24h的期间先补加青霉素，然后补加生物素；发酵培养至8~14h后，补加葡萄糖至发酵液中终质量浓度为10~140g/L；
(3)继续发酵培养至26~32h后发酵结束，即得谷氨酸。
而且，所述种子培养液的活化方法如下：
(1)从斜面上接生物素缺陷型菌株于种子培养基中，30~35℃振荡培养6~10h，OD值为0.6~1.0，得菌株活化液；
(2)将菌株活化液按体积比为0.05~0.2：1的比例接入种子培养基中，30~35℃振荡培养6~10h，得种子培养液；
其中，所述种子培养基为：葡萄糖 20~35g/L，玉米浆 10~20g/L，糖蜜5~15 g/L，MgSO4·7H2O 0.5~0.9g/L，KCl 1.0~1.5g/L，MnSO4 0.00025~0.0015g/L，VB1 0.0001~0.0005g/L，Na2HPO4 1.5~2.5g/L，纯生物素0~30μg/L。
而且，所述步骤⑵中补加青霉素为在发酵培养至6~24h的期间一次添加青霉素，使发酵培养基中青霉素含量为4~25个单位/毫升。
而且，所述步骤⑵中补加青霉素为在发酵培养6~24h的期间2~4次添加青霉素，每次使发酵培养基中青霉素含量为4~25个单位/毫升。
而且，所述步骤⑵中补加生物素为在发酵培养6~24h的期间一次补加生物素，使发酵培养基中生物素含量达到50~500 μg/L。
而且，所述步骤⑵中补加生物素为在发酵培养6~24h的期间连续补加生物素，使发酵培养基中生物素含量为3~30 μg/L。
而且，所述步骤⑴中氮源为氨水或液氨；所述碳源为葡萄糖。
而且，所述生物素来源于玉米浆、菌体蛋白、糖蜜、质量含量大于95%的纯生物素中的一种或两种以上的混合物。
而且，所述发酵培养基为：葡萄糖 120~150g/L，玉米浆 1.0~2.5g/L，糖蜜0.5~1.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.5~0.9g/L，KCl 1.5~2.5g/L，MnSO40.003~0.006g/L，VB1 0.0005~0.0008g/L，Na2HPO4 1.5~3.5g/L，纯生物素0~20μg/L，消泡剂 0.2~0.4g/L；
其中，玉米浆中玉米浆固形物含量的质量分数为30-50%，生物素质量含量为600~800μg/L；糖蜜中糖蜜固形物含量的质量分数为30-60%，生物素质量含量为2000~3000μg/L。
本发明取得的优点和积极效果是：
1、本发明发酵方法在发酵过程的中后期添加青霉素和生物素，可以克服“亚适量”工艺发酵后期生物素贫乏的问题，保证了培养基中含有充足的生物素以提供菌体的生长和代谢，大大提高了菌体的谷氨酸的合成速度，相较于现有的谷氨酸亚适量发酵工艺，单位菌体的产酸速率提高了10%以上，大大缩短了发酵周期，降低了生产成本。
2、本发明发酵方法利用了生物素“亚适量”的工艺特点，在发酵初始培养基中控制生物素的添加量，保证了菌体具有良好的细胞通透性，有利于谷氨酸分泌，方法操作简单、控制方便。
3、本发明发酵方法由于青霉素和生物素是在菌体具备良好的通透性后才添加的，而且生物素是在青霉素补加后才添加的，因此添加时间和添加量容易控制，操作简单，非常适合于工业化生产应用。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。
下述实施实例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本发明的生产谷氨酸的发酵方法以生物素缺陷型菌株为生产菌株，在发酵初期控制培养基初始生物素含量，进行“亚适量”培养，待菌体从生长型转变为产酸型后，补加青霉素和生物素，提高了菌体的产酸能力。
本发明中所使用的微生物菌株为生物素缺陷型的谷氨酸棒状杆菌S9114(Corynebacterium glutamicum S9114)。
本发明中所使用的生物素来源于玉米浆、菌体蛋白、糖蜜、纯生物素（质量含量大于95%）中的一种或两种以上的混合物。
本发明中所使用的玉米浆中玉米浆固形物含量的质量分数为30~50%，生物素质量含量为600~800μg/L；糖蜜中糖蜜固形物含量的质量分数为30~60%，生物素质量含量为2000~3000μg/L。
实施例1：
本实施例中所使用的培养基有三种：
⑴种子培养基：葡萄糖 26g/L，玉米浆 10g/L，糖蜜5g/L，MgSO4·7H2O 0.9g/L，KCl 1.2g/L，MnSO4 0.00025g/L，VB1 0.0002g/L，Na2HPO4 1.5g/L，纯生物素0μg/L，pH为7.0，120℃灭菌20分钟；
⑵发酵培养基：葡萄糖 130g/L，玉米浆2.5g/L，糖蜜1.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，KCl 2.5g/L，MnSO4 0.006g/L，VB1 0.0005g/L，Na2HPO4 3.5g/L，纯生物素14μg/L，泡敌0.3g/L，pH为7.0，115℃灭菌20分钟；
⑶补加糖液：补加糖液为葡萄糖的质量浓度为600 g/L的葡萄糖液，115℃灭菌20分钟。
一种补加生物素的生产谷氨酸的发酵方法，步骤如下：
(1)将一环斜面培养基上的生物素缺陷型谷氨酸棒状杆菌S9114接入己灭菌的装有250ml种子培养基的1L的三角瓶内，32℃振荡培养8h，得菌株活化液（OD值为0.6~1.0），置于4℃冰箱内冷藏备用；将活化后的生物素缺陷型菌株S9114的菌株活化液按活化液：种子培养基的体积比为0.05~0.2：1的比例接入种子培养基中，30~35℃振荡培养6~10h，得种子培养液（OD值为0.9~1.2）；
(2)将500ml种子培养液接入5L发酵培养基中，发酵初始发酵培养基中生物素含量为20.4μg/L，发酵温度控制在32~40℃；采用连续流加质量分数为28%的氨水的方式补充氮源至发酵液的pH为6.5~7.5；根据发酵过程中菌体需氧量，控制通气量为0.1~0.5vvm；控制发酵转速为300~600rpm，进行发酵培养；
(3)发酵培养至9.5小时后，加入120000单位青霉素（青霉素浓度为160 万单位/ml）；在加入青霉素半小时后，加入1L 补加糖液和2mg生物素（生物素浓度为0.1g/L）；
(4)发酵培养至28小时后发酵结束，发酵得到谷氨酸。
经检测，发酵产谷氨酸水平为107.8g/L，谷氨酸最大比生成速率为0.054h-1。
实施例2：
本实施例中所使用的培养基有三种：
（1）种子培养基：葡萄糖35g/L，玉米浆11g/L，糖蜜5g/L，MgSO4·7H2O 0.6g/L，KCl 1.0g/L，MnSO4 0.00025g/L，VB1 0.0001g/L，Na2HPO4 2.5g/L，纯生物素0μg/L，pH为7.0，120℃灭菌20分钟。
（2）发酵培养基：葡萄糖 130g/L，玉米浆2.5g/L，糖蜜1.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，KCl 2.5g/L，MnSO40.003g/L，VB1 0.0005g/L，Na2HPO4 3.5g/L，纯生物素24μg/L，泡敌0.3g/L，pH为7.0，115℃灭菌20分钟。
（3）补加糖：补加糖液为葡萄糖的质量浓度为600 g/L的葡萄糖液，115℃灭菌20分钟。
一种补加生物素的生产谷氨酸的发酵方法，步骤如下：
(1)将一环斜面培养基上的生物素缺陷型谷氨酸棒状杆菌S9114接入己灭菌的装有250ml种子培养基的1L的三角瓶内，32℃振8h，得菌株活化液（OD值为0.6~1.0），置于4℃冰箱冷藏备用；将活化后的生物素缺陷型菌株S9114的菌株活化液按活化液：种子培养基的体积比为0.05~0.2：1的比例接入种子培养基中，30~35℃振荡培养6~10h，得种子培养液菌株活化液（OD值为0.9~1.2）；
(2)将500ml种子培养液接入5L发酵培养基中，发酵初始发酵培养基中生物素含量为30.4μg/L，发酵温度控制在32~40℃；采用连续流加质量分数为28%的氨水的方式补充氮源至发酵液的pH为6.5~7.5；根据发酵过程中菌体需氧量，控制通气量为0.1~0.5vvm；控制发酵转速为300~600rpm，进行发酵培养；
(3)发酵培养12小时后，加入60000单位青霉素（青霉素浓度为160 万单位/ml）；在加入青霉素后，以100ml/h流速补加含有2mg生物素的1L 补加糖液，发酵培养至24小时；
其中，在发酵培养至18小时和24小时时，再分别补加26000单位青霉素（青霉素浓度为160 万单位/ml）；
(4)发酵培养至28小时后发酵结束，发酵得到谷氨酸。
经检测，发酵产谷氨酸水平为11.1g/L，谷氨酸最大比生成速率为0.057h-1。
实施例3：
本实施例中所使用的培养基有三种：
（1）种子培养基：葡萄糖 20g/L，玉米浆13g/L，糖蜜5g/L，MgSO4·7H2O 0.7g/L，KCl 1.0g/L，MnSO4 0.00025g/L，VB1 0.0001g/L，Na2HPO4 1.5g/L，纯生物素0μg/L，pH为7.0，120℃灭菌20分钟。
（2）发酵培养基：葡萄糖 130g/L，玉米浆2.5g/L，糖蜜1.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，KCl 2.5g/L，MnSO40.003g/L，VB1 0.0005g/L，Na2HPO4 3.5g/L，纯生物素24μg/L，泡敌0.3g/L，pH为7.0，115℃灭菌20分钟。
（3）补加糖：补加糖液为葡萄糖的质量浓度为600 g/L的葡萄糖液，115℃灭菌20分钟。
一种补加生物素的生产谷氨酸的发酵方法，步骤如下：
(1)将一环斜面培养基上的生物素缺陷型谷氨酸棒状杆菌S9114接入己灭菌的装有250ml种子培养基的1L三角瓶内，32℃振荡培养8h，得菌株活化液（OD值为0.6~1.0）；将活化后的生物素缺陷型菌株S9114的菌株活化液按活化液：种子培养基的体积比为0.05~0.2：1的比例接入种子培养基中，30~35℃振荡培养6~10h，得种子培养液（OD值为0.9~1.2）；
(2)将500ml种子培养液接入5L发酵培养基中，发酵初始发酵培养基中生物素含量为30.4μg/L，发酵温度控制在32~40℃；采用连续流加质量分数为28%的氨水的方式补充氮源至发酵液的6.5~7.5；根据发酵过程中菌体需氧量，控制通气量为0.1~0.5vvm；控制发酵转速为300~600rpm，进行发酵培养；
(3)发酵培养至12小时时，加入80000单位青霉素（青霉素浓度为160万单位/ml）；在加入青霉素后，以100ml/h流速补加含有0.6mg生物素的1L 补加糖液至发酵培养至24小时；
(4)继续发酵培养至28小时后发酵结束，发酵得到谷氨酸。
经检测，发酵产谷氨酸水平为10.5g/L，谷氨酸最大比生成速率为0.057h-1。
实施例4：
二级种子罐：3m3通用式发酵罐。
发酵罐：20m3通用式发酵罐。
一种补加生物素的生产谷氨酸的发酵方法，步骤如下：
(1)一级种子的培养：配种子培养基（葡萄糖 20g/L，玉米浆 13g/L，糖蜜5g/L，MgSO4·7H2O 0.7g/L，KCl 1.0g/L，MnSO4 0.00025g/L，VB1 0.0001g/L，Na2HPO4 1.5g/L，纯生物素0μg/L），pH为7.0，120℃灭菌20分钟；待冷却至35℃后，将一环斜面培养基上的生物素缺陷型谷氨酸棒状杆菌S9114接入己灭菌的装有250ml种子培养基的1L的三角瓶内，32℃振荡培养8h，得一级种子（OD值为0.6~1.0）；
(2)二级种子培养：配种子培养基（葡萄糖35g/L，玉米浆20g/L，糖蜜5 g/L，MgSO4·7H2O 0.9g/L，KCl 1.5g/L，MnSO4 0.00025g/L，VB1 0.0001g/L，Na2HPO4 1.5g/L，纯生物素0μg/L，）1.8m3，pH为7.0，120℃灭菌8分钟，待冷却至35℃后，按照8%-12%的接种量接入一级种子进行培养，培养温度33-35℃，培养时间7-9小时，通风比0.25~0.35vvm，OD值达到0.9~1.2后接入发酵罐中；
(3)发酵罐发酵：发酵培养基（葡萄糖 130g/L，玉米浆 1.2g/L，糖蜜1.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，KCl 1.5g/L，MnSO4 0.004g/L，VB1 0.0005g/L，Na2HPO4 3.0g/L，纯生物素13μg/L，泡敌0.3g/L7 m3，120℃灭菌8分钟，发酵初始发酵培养基中生物素含量为19.8μg/L，待冷却至35℃后，按照20%-25%的接种量接入二级种子培养液进行发酵培养，发酵温度控制在32~40℃；采用连续流加液氨的方式补充氮源至发酵液的pH为6.5~7.5；根据发酵过程中菌体需氧量，控制通气量为0.1~0.5vvm；控制发酵转速为100~200rpm；
(4)发酵培养至12小时时，加入1.12亿单位青霉素（青霉素浓度为160万单位/ml）；加入青霉素后，继续流加1.8 m3含有0.84g生物素的500 g/L浓缩糖液至发酵培养24小时；
(5)继续发酵培养至30小时后发酵结束，发酵得到谷氨酸。
经检测，发酵产谷氨酸水平为12.0g/L，谷氨酸最大比生成速率为0.063h-1。
实施例5：
二级种子罐：3m3通用式发酵罐。
发酵罐：20m3通用式发酵罐。
一种补加生物素的生产谷氨酸的发酵方法，步骤如下：
(1)一级种子的培养：配种子培养基（葡萄糖 20g/L，玉米浆 13g/L，糖蜜5g/L，MgSO4·7H2O 0.7g/L，KCl 1.0g/L，MnSO4 0.00025g/L，VB1 0.0001g/L，Na2HPO4 1.5g/L，纯生物素0μg/L），pH为7.0，120℃灭菌20分钟，待冷却至35℃后，将一环斜面培养基上的生物素缺陷型谷氨酸棒状杆菌S9114接入己灭菌的装有250ml种子培养基的1L的三角瓶内，32℃震荡培养8h，得一级种子（OD值为0.6~1.0）；
(2)二级种子培养：配种子培养基（葡萄糖35g/L，玉米浆20g/L，糖蜜5 g/L，MgSO4·7H2O 0.9g/L，KCl 1.5g/L，MnSO4 0.00025g/L，VB1 0.0001g/L，Na2HPO4 1.5g/L，纯生物素0μg/L，）1.8m3，pH为7.0，120℃灭菌8分钟，待冷却至35℃后，按照8%-12%的接种量接入一级种子进行培养。培养温度33-35℃，培养时间7-9小时，通风比0.25~0.35 vvm，OD值达到0.9~1.2后接入发酵罐中；
(3)发酵罐发酵：发酵培养基（葡萄糖 130g/L，玉米浆 1.2g/L，糖蜜1.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，KCl 1.5g/L，MnSO4 0.004g/L，VB1 0.0005g/L，Na2HPO4 3.0g/L，纯生物素23μg/L，泡敌0.3g/L）7m3，120℃灭菌8分钟，发酵初始发酵培养基中生物素含量为29.8μg/L，待冷却至35℃后，按照20%-25%的接种量接入二级种子培养液进行发酵培养，发酵温度控制在32~40℃；采用连续流加液氨的方式补充氮源至发酵液的pH为6.5~7.5；根据发酵过程中菌体需氧量，控制通气量为0.1~0.5vvm；控制发酵转速为100~200rpm；
(4)发酵培养至12小时时，加入0.84亿单位青霉素（青霉素浓度为160万单位/ml）；加入青霉素后，继续流加2.25 m3含有2.3g生物素的400 g/L浓缩糖液至发酵培养24小时；
其中，在发酵培养至18小时和24小时时，再分别补加0.36亿单位青霉素；
(5)继续发酵培养至32小时后发酵结束，发酵得到谷氨酸。
经检测，发酵产谷氨水平为11.2g/L，谷氨酸最大比生成速率为0.061h-1。
Claims (10)
1.一种补加生物素的生产谷氨酸的发酵方法，其特征在于：步骤包括：以生物素缺陷型菌株为生产菌株，控制发酵培养基中初始生物素的含量，在发酵过程中补加青霉素和生物素。
2.根据权利要求1所述的发酵方法，其特征在于：步骤如下：
(1)将OD值为0.9~1.2的生物素缺陷型菌株的种子培养液按种子培养液：发酵培养基的体积比为0.05~0.2：1的比例接入发酵培养基中，发酵培养基中初始生物素含量为5μg/L~65μg/L；发酵温度控制在32~40℃；补充氮源至pH为6.5~7.5，控制通气量为0.1~0.5vvm；
(2)在发酵培养至6~24h的期间先补加青霉素，然后补加生物素；发酵培养至8~14h后，补加葡萄糖至发酵液中终质量浓度为10~140g/L；
(3)继续发酵培养至26~32h后发酵结束，即得谷氨酸。
3.根据权利要求2所述的发酵方法，其特征在于：所述种子培养液的活化方法如下：
(1)从斜面上接生物素缺陷型菌株于种子培养基中，30~35℃振荡培养6~10h，OD值为0.6~1.0，得菌株活化液；
(2)将菌株活化液按体积比为0.05~0.2：1的比例接入种子培养基中，30~35℃振荡培养6~10h，得种子培养液；
其中，所述种子培养基为：葡萄糖 20~35g/L，玉米浆 10~20g/L，糖蜜5~15 g/L，MgSO4·7H2O 0.5~0.9g/L，KCl 1.0~1.5g/L，MnSO4 0.00025~0.0015g/L，VB1 0.0001~0.0005g/L，Na2HPO4 1.5~2.5g/L，纯生物素0~30μg/L。
4.根据权利要求2所述的发酵方法，其特征在于：所述步骤⑵中补加青霉素为在发酵培养至6~24h的期间一次添加青霉素，使发酵培养基中青霉素含量为4~25个单位/毫升。
5.根据权利要求2所述的发酵方法，其特征在于：所述步骤⑵中补加青霉素为在发酵培养6~24h的期间2~4次添加青霉素，每次使发酵培养基中青霉素含量为4~25个单位/毫升。
6.根据权利要求2所述的发酵方法，其特征在于：所述步骤⑵中补加生物素为在发酵培养6~24h的期间一次补加生物素，使发酵培养基中生物素含量达到50~500 μg/L。
7.根据权利要求2所述的发酵方法，其特征在于：所述步骤⑵中补加生物素为在发酵培养6~24h的期间连续补加生物素，使发酵培养基中生物素含量为3~30 μg/L。
8.根据权利要求2所述的发酵方法，其特征在于：所述步骤⑴中氮源为氨水或液氨；所述碳源为葡萄糖。
9.根据权利要求1至8任一项所述的发酵方法，其特征在于：所述生物素来源于玉米浆、菌体蛋白、糖蜜、质量含量大于95%的纯生物素中的一种或两种以上的混合物。
10.根据权利要求2至8任一项所述的发酵方法，其特征在于：所述发酵培养基为：葡萄糖 120~150g/L，玉米浆 1.0~2.5g/L，糖蜜0.5~1.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5~0.9g/L，KCl 1.5~2.5g/L，MnSO40.003~0.006g/L，VB1 0.0005~0.0008g/L，Na2HPO4 1.5~3.5g/L，纯生物素0~20μg/L，消泡剂 0.2~0.4g/L；
其中，玉米浆中玉米浆固形物含量的质量分数为30-50%，生物素质量含量为600~800μg/L；糖蜜中糖蜜固形物含量的质量分数为30-60%，生物素质量含量为2000~3000μg/L。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
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| CB02 | Change of applicant information |
Inventor after: Tong Yi Inventor after: Yu Jianliang Inventor after: Geng Xingshan Inventor after: Wang Xiaojian Inventor after: He Yuming Inventor after: Wang Xiaoli Inventor after: Bai Changsheng Inventor before: Yu Jianliang Inventor before: Geng Xingshan Inventor before: Wang Xiaojian Inventor before: He Yuming Inventor before: Wang Xiaoli Inventor before: Bai Changsheng |
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| CB03 | Change of inventor or designer information | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20141203 |
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| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |