CN112442475A - 一种l-谷氨酸生产菌株及其构建方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种L‑谷氨酸生产菌株及其构建方法与应用，所述L‑谷氨酸生产菌株通过基因敲除实现细胞壁和细胞膜的双转型控制，获得具有缺陷的谷氨酸棒杆菌，进而解决生物素亚适量菌株在发酵后期出现的菌体活力下降等问题，采用“双开关”发酵生产L‑谷氨酸，通过交替控制D‑谷氨酸和生物素两个转型“开关”，达到菌体快速转型和提高菌体发酵后期菌体活力的效果。

Description

一种L-谷氨酸生产菌株及其构建方法与应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其是一种L-谷氨酸生产菌株及其构建方法与应用。

背景技术

L-谷氨酸，又名α-氨基戊二酸，是一种酸性氨基酸，是世界上最大的氨基酸产品，其既可以缓解肝毒，治疗肝昏迷症，又是制取味精、食品添加剂、化妆品等产品的前体物质，因此被广泛应用于食品、医药、化工和饲料行业，目前谷氨酸年产量近200多万吨，各种产品出口50多个国家，产值近200亿，市场潜力巨大，前景广阔。目前L-谷氨酸大规模工业化生产的方法是微生物发酵法，其中发酵最常利用的菌株为生物素亚适量型菌株，其具有产酸稳定、提取收率高、发酵周期短、不易染菌、放罐体积小和经济效益好等优点，但是随着近几年温度敏感型菌株的出现，生物素亚适量菌株在产酸量和糖酸转化率等方面劣势明显，因此，如何提高生物素亚适量型菌株的产酸量和糖酸转化率成了生物素亚适量型菌株发酵生产L-谷氨酸的研究重点。

谷氨酸棒杆菌是一种革兰氏阳性菌，其细胞壁的主要组成成分为肽聚糖，它是由线性糖链经短肽交联形成的多聚体。糖链由N-乙酰葡萄糖胺和N-乙酰胞壁酸通过β-1,4糖苷键交替连接而成，短肽通常由4-5个氨基酸组成，连接在N-乙酰胞壁酸上形成四肽尾，而D-谷氨酸是四肽尾的重要组成成分。

目前生物素亚适量型菌株发酵采用的方法是在发酵液中限量添加生物素，使得菌体在翻倍的过程中，由于生物素亚适量无法形成完整的细胞膜从而加强L-谷氨酸的分泌。但是，另一方面由于生物素是三羧酸循环中关键酶的辅酶，生物素的限量使得菌体在发酵后期活力下降，进而产酸能力也出现下降。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种L-谷氨酸生产菌株。

本发明所要解决的技术问题在于提供上述L-谷氨酸生产菌株的构建方法。

本发明所要解决的技术问题在于提供上述L-谷氨酸生产菌株的应用。

为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：

一种L-谷氨酸生产菌株，是由下述方法得到的：敲除谷氨酸棒杆菌GDK-9（购自天津科技大学代谢工程研究室）基因组中的cgl2509基因，获得基因敲除菌株谷氨酸棒杆菌GDK-9∆cgl2509，其中所述基因cgl2509序列为SEQ ID NO.1。

上述L-谷氨酸生产菌株的构建方法，具体步骤如下：

（1）同源性片段cgl2509F和cgl2509R的制备：以谷氨酸棒杆菌GDK-9菌体（购自天津科技大学）的DNA为模板，使用扩增引物cgl2509F F1和cgl2509F F2进行PCR扩增 cgl2509F片段，使用扩增引物cgl2509R R1和cgl2509R R2进行PCR扩增 cgl2509R片段（其中cgl2509FF1和cgl2509R R2的5’端分别加入限制性内切酶XbaⅠ和HindⅢ的线性载体同源序列，其中，限制性内切酶XbaⅠ线性载体同源序列为TCTAGA，限制性内切酶HindⅢ的线性载体同源序列为AAGCTT，cgl2509F F2和cgl2509R R1有22bp的重叠区域），同时对扩增后的cgl2509F片段和cgl2509R片段进行回收；所述引物cgl2509F F1、cgl2509F F2、cgl2509R R1和cgl2509RR2的序列依次为序列表SEQ ID NO.2-5所示序列；

（2）重叠PCR：用扩增出的上下游同源臂作为模板，以cgl2509F F1和cgl2509R R2作为引物，进行重叠PCR，获得cgl2509中间缺失的重叠片段∆cgl2509；

（3）重组质粒的构建：对质粒p K18mobsac B（序列见序列表SEQ ID NO.6所示序列）用XbaⅠ和HindⅢ进行双酶切线性化，然后将重叠片段∆cgl2509与线性化后的pK18mobsacB进行连接，构成重组质粒p K18mobsac B∆cgl2509，然后将重组质粒化转至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，涂布于0.05μg/mL（kan50）浓度的卡那霉素抗性平板，进行验证，筛选出携带质粒的单菌落；摇管培养，并提取出重组质粒pK18mobsacb∆cgl2509；

（4）将提出的重组质粒pK18mobsacb∆cgl2509电转到谷氨酸棒杆菌GDK-9的感受态菌株中并涂布于0.01μg/mL（kan10）浓度的卡那霉素抗性平板，32℃培养24小时；挑选单菌落进行PCR，琼脂糖凝胶电泳检验PCR片段长度是1700-1750左右为发生单交换的单菌落，同时将挑选出的菌株用体积分数为20%的甘油保藏；

（5）将发生单交换的单菌落接入摇管，32℃培养，分别在2h、4h、6h接50μL培养液涂布于含有10%蔗糖的BHI平板；挑选单菌落进行pcr，并将单菌落对点于含有10%蔗糖的BHI平板和含0.01μg/mL（kan10）浓度的卡那霉素抗性的BHI平板，挑选能在含有10%蔗糖的BHI平板上生长而不能在卡那霉素抗性的BHI平板上生长的单菌落，对其进行琼脂糖凝胶电泳检验，PCR片段长度是1300为发生双交换的单菌落，同时将挑选出的菌株用体积分数为20%的甘油保藏，此时获得的菌株即为谷氨酸棒杆菌GDK-9∆cgl2509。

上述L-谷氨酸生产菌株在发酵生产L-谷氨酸方面的应用。

优选的，上述L-谷氨酸生产菌株的应用，具体发酵生产方法如下：

（1）菌株活化：将谷氨酸棒杆菌GDK-9∆cgl2509从-80℃冰箱中取出，接种于斜面培养基上，传代两次，得到活化菌株；所述斜面培养基为：蛋白胨5 g/L，牛肉膏10 g/L，酵母粉4g/L，玉米浆干粉25 mL/L，KH₂PO₄1 g/L，MgSO₄0.2 g/L，NaCl1 g/L，琼脂粉25 g/L，甲硫氨酸0.2 g/L，pH=6.8-7.0；

（2）制备种子液：用无菌水将斜面上的菌株洗脱，全部接种到含有种子培养基的种子罐中，发酵控制条件：温度控制在34 ℃，溶氧控制在30-50%，pH通过氨水控制在6.8-7.2；所述种子培养基为：葡萄糖35 g/L，玉米浆干粉15 g/L，豆浓22 ml/L，K₂HPO₄·3H₂O 3g/L，MgSO₄·7H₂O 1 g/L，蛋氨酸0.5 g/L，苏氨酸 1 g/L，丁二酸1 g/L，FeSO₄·7H₂O 5 mg/L，MnSO₄·H₂O 5 mg/L，VB₁ 0.5 mg/L，VB₃ 0.5 mg/L，VB₅ 0.5 mg/L，VB₁₂ 0.5 mg/L，氯化胆碱0.1 g/L，甜菜碱0.1 g/L，D-谷氨酸 2g/L；

（3）发酵：当种子液的OD₆₀₀达到20时，将种子液按20%的接种量接种到含有发酵培养基的发酵罐中，当发酵罐中的OD₆₀₀值达到20-40时开始流加玉米浆，流加玉米浆浓度为0.5-1.5 g/L；发酵控制条件：初始温度控制在34℃，每4 h升温0.5℃，升温至37℃停止；溶氧通过转速和通风控制在30-50%；pH通过流加氨水控制在6.8-7.2；所述发酵培养基：MnSO₄·H₂O10 mg/L，MgSO₄·7H₂O 1.8 g/L，FeSO₄·7H₂O 5 mg/L，Na₂HPO₄·12H₂O 3.5 g/L，KCl 1.8g/L，VB₁ 0.5 mg/L，VB₃ 0.5 mg/L，VB₅ 0.5 mg/L，VB₁₂ 0.5 mg/L，糖蜜1.2 g/L，玉米浆干粉2.5 g/L，豆粕水解液15 ml/L，氯化胆碱0.1 g/L，甜菜碱0.1 g/L，D-谷氨酸 2g/L。

有益效果：

上述L-谷氨酸生产菌株通过基因敲除实现细胞壁和细胞膜的双转型控制，获得具有缺陷的谷氨酸棒杆菌，进而解决生物素亚适量菌株在发酵后期出现的菌体活力下降等问题，采用“双开关”发酵生产L-谷氨酸，通过交替控制D-谷氨酸和生物素两个转型“开关”，达到菌体快速转型和提高菌体发酵后期菌体活力的效果。具体体现在：

（1）D-谷氨酸是细胞壁肽聚糖四肽尾的重要组成成分，通过敲除cgl2509基因，使得菌体丧失合成D-谷氨酸的能力，进而使得菌体无法形成结构紧密的细胞壁，成为细胞壁缺陷细胞，从而加强细胞膜的通透性，为谷氨酸棒杆菌提供另一种转型方式。

（2）“双开关”发酵控制的实现途径，主要是在发酵开始时限量添加生物素，同时适量添加D-谷氨酸，当生物素耗尽时，菌体细胞膜缺陷开始第一次转型，菌体的剩余生长会继续利用D-谷氨酸，同时完成转型；当D-谷氨酸耗尽时，菌体继续进行剩余生长，这时由于细胞壁缺陷而引起的第二次转型就开始了，当菌体完成第二次转型时，向发酵液中添加一定量的玉米浆，由于玉米浆中含有生物素，因此菌体由于生物素亚适量添加而导致的缺陷细胞膜会逐渐修复，第一次转型丧失，但因为此时D-谷氨酸缺陷带来的第二次转型已经完成，因此菌体能继续分泌谷氨酸。同时，由于玉米浆的添加导致发酵液中生物素含量的上升，进而加强了菌体的三羧酸循环，提高了菌体活力，进一步加强了菌体的产酸能力，最终，实现了L-谷氨酸的高产。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明所述技术方案作进一步的说明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。

实施例1

敲除谷氨酸棒杆菌GDK-9（购自天津科技大学代谢工程研究室）基因组中的cgl2509基因，获得基因敲除菌株GDK-9∆cgl2509，所述基因cgl2509的序列为序列表SEQ ID NO.1所示序列：

（1）同源性片段cgl2509F和cgl2509R的制备：以谷氨酸棒杆菌GDK-9菌体的DNA为模板，使用扩增引物cgl2509F F1和cgl2509F F2进行PCR扩增 cgl2509F片段，使用扩增引物cgl2509R R1和cgl2509R R2进行PCR扩增 cgl2509R片段（其中cgl2509F F1和cgl2509R R2的5’端分别加入限制性内切酶XbaⅠ和HindⅢ的线性载体同源序列，其中，限制性内切酶XbaⅠ线性载体同源序列为TCTAGA，限制性内切酶HindⅢ的线性载体同源序列为AAGCTT，cgl2509F F2和cgl2509R R1有22bp的重叠区域），同时对扩增后的cgl2509F片段和cgl2509R片段进行回收；所述引物cgl2509F F1、cgl2509F F2、cgl2509R R1和cgl2509R R2的序列依次为序列表SEQ ID NO.2-5所示序列；

（2）重叠PCR：用扩增出的上下游同源臂作为模板，以cgl2509F F1和cgl2509R R2作为引物，进行重叠PCR，获得cgl2509中间缺失的重叠片段∆cgl2509；

（3）重组质粒的构建：对质粒pK18mobsacB（序列见序列表SEQ ID NO.6所示序列）用限制性内切酶XbaⅠ和HindⅢ进行双酶切线性化，然后将重叠片段∆cgl2509与线性化后的pK18mobsacB进行连接，构成重组质粒pK18mobsacb∆cgl2509；然后将重组质粒化转至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，涂布于0.05μg/mL（kan50）浓度的卡那霉素抗性平板，进行验证，筛选出携带质粒的单菌落；摇管培养，并提取出重组质粒pK18mobsacb∆cgl2509；

（4）将提出的重组质粒pK18mobsacb∆cgl2509电转到谷氨酸棒杆菌GDK-9的感受态菌株中并涂布于0.01μg/mL（kan10）浓度的卡那霉素抗性平板，32℃培养24小时；挑选单菌落进行PCR，琼脂糖凝胶电泳检验PCR片段长度是1700-1750为发生单交换的单菌落，同时将挑选出的菌株用体积分数为20%的甘油保藏；

（5）将发生单交换的单菌落接入摇管，32℃培养，分别在2h，4h，6h接50μL培养液涂布于含有10%蔗糖的BHI平板。挑选单菌落进行pcr，并将单菌落对点于含有10%蔗糖的BHI平板和含0.01μg/mL（kan10）浓度的卡那霉素抗性的BHI平板，挑选能在含有10%蔗糖的BHI平板上生长而不能在卡那霉素抗性的BHI平板上生长的单菌落，对其进行琼脂糖凝胶电泳检验，PCR片段长度是1300为发生双交换的单菌落，同时将挑选出的菌株用体积分数为20%的甘油保藏，此时获得的菌株即为谷氨酸棒杆菌GDK-9∆cgl2509。

实施例2

利用构建的菌株GDK-9∆cgl2509采用“双开关”发酵技术进行L-谷氨酸发酵。

（1）菌株活化：将谷氨酸棒杆菌GDK-9∆cgl2509从-80℃冰箱中取出，接种于斜面培养基上，传代两次，得到活化菌株；所述斜面培养基为蛋白胨5 g/L，牛肉膏10 g/L，酵母粉4 g/L，玉米浆干粉25 mL/L，KH₂PO₄1 g/L，MgSO₄0.2 g/L，NaCl1 g/L，琼脂粉25 g/L，甲硫氨酸0.2 g/L，pH=6.8-7.0；

（2）制备种子液：用无菌水将斜面上的菌株洗脱，全部接种到含有种子培养基的种子罐中；发酵控制条件：温度控制在34 ℃，溶氧控制在30-50%，pH通过氨水控制在6.8-7.2；所述种子培养基为：葡萄糖35 g/L，玉米浆干粉15 g/L，豆浓22 ml/L，K₂HPO₄·3H₂O 3g/L，MgSO₄·7H₂O 1 g/L，蛋氨酸0.5 g/L，苏氨酸 1 g/L，丁二酸1 g/L，FeSO₄·7H₂O 5 mg/L，MnSO₄·H₂O 5 mg/L，VB₁ 0.5 mg/L，VB₃ 0.5 mg/L，VB₅ 0.5 mg/L，VB₁₂ 0.5 mg/L，氯化胆碱0.1 g/L，甜菜碱0.1 g/L，D-谷氨酸 2g/L；

（3）发酵：当种子液的OD₆₀₀达到20时，将种子液按20%的接种量接种到含有发酵培养基的发酵罐中，当发酵罐中的OD₆₀₀达到30时开始以0.1 r/min的速率流加1g/L的玉米浆；发酵控制条件：初始温度控制在34℃，每4 h升温0.5℃，升温至37℃停止；溶氧通过转速和通风控制在30-50%；pH通过流加氨水控制在6.8-7.2；所述发酵培养基：MnSO₄·H₂O 10 mg/L，MgSO₄·7H₂O 1.8 g/L，FeSO₄·7H₂O 5 mg/L，Na₂HPO₄·12H₂O 3.5 g/L，KCl 1.8 g/L，VB₁0.5 mg/L，VB₃ 0.5 mg/L，VB₅ 0.5 mg/L，VB₁₂ 0.5 mg/L，糖蜜1.2 g/L，玉米浆干粉2.5 g/L，豆粕水解液15 ml/L，氯化胆碱0.1 g/L，甜菜碱0.1 g/L，D-谷氨酸 2g/L。

实施例3

参照实施例2，不同之处在于当发酵罐中的OD₆₀₀达到20时开始流加玉米浆。

实施例4

参照实施例2，不同之处在于当发酵罐中的OD₆₀₀达到40时开始流加玉米浆。

实施例5

参照实施例2，不同之处在于流加的玉米浆浓度为0.5 g/L。

实施例6

参照实施例2，不同之处在于流加的玉米浆浓度为1.5 g/L

实施例7

参照实施例2，不同之处在于所使用的菌株为出发菌株GDK-9，采用常规生物素亚适量发酵工艺，即发酵过程中不流加玉米浆，仅通过生物素亚适量来控制菌株转型。

上述实施例2-7中生物量、L-谷氨酸产量和转型时间见表1。

表1实施例生物量、L-谷氨酸产量和转型时间对比指标

	生物量（OD<sub>600</sub>）	L-谷氨酸产量（g/L）	转型时间（h）
				实施例2	48	168	3
实施例3	43	153	5
				实施例4	47	162	4
实施例5	40	163	3
				实施例6	46	165	3
实施例7	39	159	4

由表1可知，通过对实施例2、实施例3和实施例4的对比分析发现，当OD₆₀₀在30左右开始流加玉米浆时，效果最好。玉米浆流加开始时间太早，第一次转型还没有完成，此时流加的玉米浆带来的生物素会使菌体细胞膜完善，进而使得第一次转型失败，大大延后了菌体的转型；玉米浆流加时间太晚，后续弥补的生物素对于菌体活力的提升不明显。从实施例2、实施例5和实施例6的数据可以看出，随着玉米浆浓度的提高，菌体的OD₆₀₀和产酸量先升高后降低，出现这种现象是因为如果玉米浆浓度太低，则不足以提高菌体活力；反之玉米浆浓度太高，过高的营养物质和渗透压反而会降低菌体活力，从而影响菌体生长和产酸。实施例2与实施例7，即本发明所用菌株和发酵方法与传统发酵方法，这两种方法的数据对比分析可以得出本发明在生物量OD₆₀₀和L-谷氨酸产量方面分别达到了48和168 g/L，提高了23%和5.6%，转型时间提前了1个小时。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 天津科技大学

<120> 一种L-谷氨酸生产菌株及其构建方法与应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 857

<212> DNA

<213> gene

<220>

<221> gene

<222> (1)..(857)

<400> 1

atgatggcaa ccgtgactga tttcagtgga tctatgattg aacgccccgt gccaggtgct 60

gatgcgccga ttggaatttt tgattctgga gttggcggat taaccgtagc tcgcacaatc 120

atcgatcaat tgccacatga atcagttatt tatatcggtg tgatactgcc aatggccctt 180

atggtccgtt gcctatcgct aaggtccgtg agcacgccat ccgcattgcc gatgagttgg 240

tggaacgcgg atgcaagatg attgtcattg cctgcaacac tgcgtccgct gcgtttctcc 300

gagatgcccg tgaacgatac agtgtgccag tcgtggaagt tattcttccc gcagtaaggc 360

gtgcggtggc atccacccgc aatggcaaag tgggcgtgat cggcacagtg ggaaccatta 420

actccggtgc gtaccaggat cttttctctg caagcccctc cattgtggtc aacgcagtgg 480

catgcccacg gtttgtggat ttcgtggaac gcggaattac cagcggcagg cagatcctca 540

acattgcgca ggattattta gagcctttgc aagcagaagg ggtggacacc ctcgtgcttg 600

gatgcaccca ctatccactg ctttccggtg tcattcagtt ggcaatgggg gaccacgtaa 660

gtttggtctc tagcgcggaa gaaactgcga aagacgtgct gagaattttg agccagcaag 720

atcttttagc cgatccggac atgcatcctg agccaagtta tagctttgaa tcaacaggcg 780

atccggaaat ctttgcgcaa ttaagccgcc gattccttgg accaattgtt tcccaagtga 840

gacaaaacga gggataa 857

<210> 2

<211> 43

<212> DNA

<213> primer

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(43)

<400> 2

ggtacccggg gatcctctag aatcaaccca atgagactgc ctt 43

<210> 3

<211> 39

<212> DNA

<213> primer

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(39)

<400> 3

cccccattgc caactgaatg cgataggcaa cggaccata 39

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> primer

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(19)

<400> 4

attcagttgg caatggggg 19

<210> 5

<211> 43

<212> DNA

<213> primer

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(43)

<400> 5

acgacggcca gtgccaagct tctacccctt ccctttcaga ggt 43

<210> 6

<211> 5719

<212> DNA

<213> plasmid

<220>

<221> old_sequence

<222> (1)..(5719)

<400> 6

tgccgcaagc actcagggcg caagggctgc taaaggaagc ggaacacgta gaaagccagt 60

ccgcagaaac ggtgctgacc ccggatgaat gtcagctact gggctatctg gacaagggaa 120

aacgcaagcg caaagagaaa gcaggtagct tgcagtgggc ttacatggcg atagctagac 180

tgggcggttt tatggacagc aagcgaaccg gaattgccag ctggggcgcc ctctggtaag 240

gttgggaagc cctgcaaagt aaactggatg gctttcttgc cgccaaggat ctgatggcgc 300

aggggatcaa gatctgatca agagacagga tgaggatcgt ttcgcatgat tgaacaagat 360

ggattgcacg caggttctcc ggccgcttgg gtggagaggc tattcggcta tgactgggca 420

caacagacaa tcggctgctc tgatgccgcc gtgttccggc tgtcagcgca ggggcgcccg 480

gttctttttg tcaagaccga cctgtccggt gccctgaatg aactccaaga cgaggcagcg 540

cggctatcgt ggctggccac gacgggcgtt ccttgcgcag ctgtgctcga cgttgtcact 600

gaagcgggaa gggactggct gctattgggc gaagtgccgg ggcaggatct cctgtcatct 660

caccttgctc ctgccgagaa agtatccatc atggctgatg caatgcggcg gctgcatacg 720

cttgatccgg ctacctgccc attcgaccac caagcgaaac atcgcatcga gcgagcacgt 780

actcggatgg aagccggtct tgtcgatcag gatgatctgg acgaagagca tcaggggctc 840

gcgccagccg aactgttcgc caggctcaag gcgcggatgc ccgacggcga ggatctcgtc 900

gtgacccatg gcgatgcctg cttgccgaat atcatggtgg aaaatggccg cttttctgga 960

ttcatcgact gtggccggct gggtgtggcg gaccgctatc aggacatagc gttggctacc 1020

cgtgatattg ctgaagagct tggcggcgaa tgggctgacc gcttcctcgt gctttacggt 1080

atcgccgctc ccgattcgca gcgcatcgcc ttctatcgcc ttcttgacga gttcttctga 1140

gcgggactct ggggttcgct agaggatcga tcctttttaa cccatcacat atacctgccg 1200

ttcactatta tttagtgaaa tgagatatta tgatattttc tgaattgtga ttaaaaaggc 1260

aactttatgc ccatgcaaca gaaactataa aaaatacaga gaatgaaaag aaacagatag 1320

attttttagt tctttaggcc cgtagtctgc aaatcctttt atgattttct atcaaacaaa 1380

agaggaaaat agaccagttg caatccaaac gagagtctaa tagaatgagg tcgaaaagta 1440

aatcgcgcgg gtttgttact gataaagcag gcaagaccta aaatgtgtaa agggcaaagt 1500

gtatactttg gcgtcacccc ttacatattt taggtctttt tttattgtgc gtaactaact 1560

tgccatcttc aaacaggagg gctggaagaa gcagaccgct aacacagtac ataaaaaagg 1620

agacatgaac gatgaacatc aaaaagtttg caaaacaagc aacagtatta acctttacta 1680

ccgcactgct ggcaggaggc gcaactcaag cgtttgcgaa agaaacgaac caaaagccat 1740

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agcaaaaaaa tgaaaaatat caagtttctg aatttgattc gtccacaatt aaaaatatct 1860

cttctgcaaa aggcctggac gtttgggaca gctggccatt acaaaacgct gacggcactg 1920

tcgcaaacta tcacggctac cacatcgtct ttgcattagc cggagatcct aaaaatgcgg 1980

atgacacatc gatttacatg ttctatcaaa aagtcggcga aacttctatt gacagctgga 2040

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tattctacac tgatttctcc ggtaaacatt acggcaaaca aacactgaca actgcacaag 2220

ttaacgtatc agcatcagac agctctttga acatcaacgg tgtagaggat tataaatcaa 2280

tctttgacgg tgacggaaaa acgtatcaaa atgtacagca gttcatcgat gaaggcaact 2340

acagctcagg cgacaaccat acgctgagag atcctcacta cgtagaagat aaaggccaca 2400

aatacttagt atttgaagca aacactggaa ctgaagatgg ctaccaaggc gaagaatctt 2460

tatttaacaa agcatactat ggcaaaagca catcattctt ccgtcaagaa agtcaaaaac 2520

ttctgcaaag cgataaaaaa cgcacggctg agttagcaaa cggcgctctc ggtatgattg 2580

agctaaacga tgattacaca ctgaaaaaag tgatgaaacc gctgattgca tctaacacag 2640

taacagatga aattgaacgc gcgaacgtct ttaaaatgaa cggcaaatgg tacctgttca 2700

ctgactcccg cggatcaaaa atgacgattg acggcattac gtctaacgat atttacatgc 2760

ttggttatgt ttctaattct ttaactggcc catacaagcc gctgaacaaa actggccttg 2820

tgttaaaaat ggatcttgat cctaacgatg taacctttac ttactcacac ttcgctgtac 2880

ctcaagcgaa aggaaacaat gtcgtgatta caagctatat gacaaacaga ggattctacg 2940

cagacaaaca atcaacgttt gcgccgagct tcctgctgaa catcaaaggc aagaaaacat 3000

ctgttgtcaa agacagcatc cttgaacaag gacaattaac agttaacaaa taaaaacgca 3060

aaagaaaatg ccgatgggta ccgagcgaaa tgaccgacca agcgacgccc aacctgccat 3120

cacgagattt cgattccacc gccgccttct atgaaaggtt gggcttcgga atcgttttcc 3180

gggacgccct cgcggacgtg ctcatagtcc acgacgcccg tgattttgta gccctggccg 3240

acggccagca ggtaggccga caggctcatg ccggccgccg ccgccttttc ctcaatcgct 3300

cttcgttcgt ctggaaggca gtacaccttg ataggtgggc tgcccttcct ggttggcttg 3360

gtttcatcag ccatccgctt gccctcatct gttacgccgg cggtagccgg ccagcctcgc 3420

agagcaggat tcccgttgag caccgccagg tgcgaataag ggacagtgaa gaaggaacac 3480

ccgctcgcgg gtgggcctac ttcacctatc ctgcccggct gacgccgttg gatacaccaa 3540

ggaaagtcta cacgaaccct ttggcaaaat cctgtatatc gtgcgaaaaa ggatggatat 3600

accgaaaaaa tcgctataat gaccccgaag cagggttatg cagcggaaaa gcgctgcttc 3660

cctgctgttt tgtggaatat ctaccgactg gaaacaggca aatgcaggaa attactgaac 3720

tgaggggaca ggcgagagac gatgccaaag agctcctgaa aatctcgata actcaaaaaa 3780

tacgcccggt agtgatctta tttcattatg gtgaaagttg gaacctctta cgtgccgatc 3840

aacgtctcat tttcgccaaa agttggccca gggcttcccg gtatcaacag ggacaccagg 3900

atttatttat tctgcgaagt gatcttccgt cacaggtatt tattcggcgc aaagtgcgtc 3960

gggtgatgct gccaacttac tgatttagtg tatgatggtg tttttgaggt gctccagtgg 4020

cttctgtttc tatcagctcc tgaaaatctc gataactcaa aaaatacgcc cggtagtgat 4080

cttatttcat tatggtgaaa gttggaacct cttacgtgcc gatcaacgtc tcattttcgc 4140

caaaagttgg cccagggctt cccggtatca acagggacac caggatttat ttattctgcg 4200

aagtgatctt ccgtcacagg tatttattcg gcgcaaagtg cgtcgggtga tgctgccaac 4260

ttactgattt agtgtatgat ggtgtttttg aggtgctcca gtggcttctg tttctatcag 4320

ggctggatga tcctccagcg cggggatctc atgctggagt tcttcgccca ccccaaaagg 4380

atctaggtga agatcctttt tgataatctc atgaccaaaa tcccttaacg tgagttttcg 4440

ttccactgag cgtcagaccc cgtagaaaag atcaaaggat cttcttgaga tccttttttt 4500

ctgcgcgtaa tctgctgctt gcaaacaaaa aaaccaccgc taccagcggt ggtttgtttg 4560

ccggatcaag agctaccaac tctttttccg aaggtaactg gcttcagcag agcgcagata 4620

ccaaatactg ttcttctagt gtagccgtag ttaggccacc acttcaagaa ctctgtagca 4680

ccgcctacat acctcgctct gctaatcctg ttaccagtgg ctgctgccag tggcgataag 4740

tcgtgtctta ccgggttgga ctcaagacga tagttaccgg ataaggcgca gcggtcgggc 4800

tgaacggggg gttcgtgcac acagcccagc ttggagcgaa cgacctacac cgaactgaga 4860

tacctacagc gtgagctatg agaaagcgcc acgcttcccg aagggagaaa ggcggacagg 4920

tatccggtaa gcggcagggt cggaacagga gagcgcacga gggagcttcc agggggaaac 4980

gcctggtatc tttatagtcc tgtcgggttt cgccacctct gacttgagcg tcgatttttg 5040

tgatgctcgt caggggggcg gagcctatgg aaaaacgcca gcaacgcggc ctttttacgg 5100

ttcctggcct tttgctggcc ttttgctcac atgttctttc ctgcgttatc ccctgattct 5160

gtggataacc gtattaccgc ctttgagtga gctgataccg ctcgccgcag ccgaacgacc 5220

gagcgcagcg agtcagtgag cgaggaagcg gaagagcgcc caatacgcaa accgcctctc 5280

cccgcgcgtt ggccgattca ttaatgcagc tggcacgaca ggtttcccga ctggaaagcg 5340

ggcagtgagc gcaacgcaat taatgtgagt tagctcactc attaggcacc ccaggcttta 5400

cactttatgc ttccggctcg tatgttgtgt ggaattgtga gcggataaca atttcacaca 5460

ggaaacagct atgacatgat tacgaattcg agctcggtac ccggggatcc tctagagtcg 5520

acctgcaggc atgcaagctt ggcactggcc gtcgttttac aacgtcgtga ctgggaaaac 5580

cctggcgtta cccaacttaa tcgccttgca gcacatcccc ctttcgccag ctggcgtaat 5640

agcgaagagg cccgcaccga tcgcccttcc caacagttgc gcagcctgaa tggcgaatgg 5700

cgataagcta gcttcacgc 5719

Claims (4)

1.一种L-谷氨酸生产菌株，是由下述方法得到的：敲除谷氨酸棒杆菌GDK-9基因组中的cgl2509基因，获得基因敲除菌株谷氨酸棒杆菌GDK-9∆cgl2509，其中所述基因cgl2509序列为SEQ ID NO.1。

2.权利要求1所述L-谷氨酸生产菌株的构建方法，其特征在于：具体步骤如下：

（1）同源性片段cgl2509F和cgl2509R的制备：以谷氨酸棒杆菌GDK-9菌体的DNA为模板，使用扩增引物cgl2509F F1和cgl2509F F2进行PCR扩增 cgl2509F片段，使用扩增引物cgl2509R R1和cgl2509R R2进行PCR扩增 cgl2509R片段，其中cgl2509F F1和cgl2509R R2的5’端分别加入限制性内切酶XbaⅠ和HindⅢ的线性载体同源序列，其中，限制性内切酶XbaⅠ线性载体同源序列为TCTAGA，限制性内切酶HindⅢ的线性载体同源序列为AAGCTT，同时对扩增后的cgl2509F片段和cgl2509R片段进行回收；所述引物cgl2509F F1、cgl2509F F2、cgl2509R R1和cgl2509R R2的序列依次为序列表SEQ ID NO.2-5所示序列；

（2）重叠PCR：用扩增出的上下游同源臂作为模板，以cgl2509F F1和cgl2509R R2作为引物，进行重叠PCR，获得cgl2509中间缺失的重叠片段∆cgl2509；

（3）重组质粒的构建：对质粒p K18mobsac B用XbaⅠ和HindⅢ进行双酶切线性化，所述质粒p K18mobsac B序列为序列表SEQ ID NO.6所示序列，然后将重叠片段∆cgl2509与线性化后的pK18mobsacB进行连接，构成重组质粒pK18mobsac B∆cgl2509，然后将重组质粒化转至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，涂布于0.05μg/mL浓度的卡那霉素抗性平板，进行验证，筛选出携带质粒的单菌落；摇管培养，并提取出重组质粒pK18mobsacb∆cgl2509；

（4）将提出的重组质粒pK18mobsacb∆cgl2509电转到谷氨酸棒杆菌GDK-9的感受态菌株中并涂布于0.01μg/mL浓度的卡那霉素抗性平板，32℃培养24小时；挑选单菌落进行PCR，琼脂糖凝胶电泳检验PCR片段长度是1700-1750左右为发生单交换的单菌落，同时将挑选出的菌株用体积分数为20%的甘油保藏；

（5）将发生单交换的单菌落接入摇管，32℃培养，分别在2h、4h、6h接50μL培养液涂布于含有10%蔗糖的BHI平板；挑选单菌落进行pcr，并将单菌落对点于含有10%蔗糖的BHI平板和含0.01μg/mL浓度的卡那霉素抗性的BHI平板，挑选能在含有10%蔗糖的BHI平板上生长而不能在卡那霉素抗性的BHI平板上生长的单菌落，对其进行琼脂糖凝胶电泳检验，PCR片段长度是1300为发生双交换的单菌落，同时将挑选出的菌株用体积分数为20%的甘油保藏，此时获得的菌株即为谷氨酸棒杆菌GDK-9∆cgl2509。

3.权利要求1所述L-谷氨酸生产菌株在发酵生产L-谷氨酸方面的应用。

4.根据权利要求3所述的L-谷氨酸生产菌株的应用，其特征在于：具体发酵生产方法如下：

（1）菌株活化：将谷氨酸棒杆菌GDK-9∆cgl2509从-80℃冰箱中取出，接种于斜面培养基上，传代两次，得到活化菌株；所述斜面培养基为：蛋白胨5 g/L，牛肉膏10 g/L，酵母粉4g/L，玉米浆干粉25 mL/L，KH₂PO₄1 g/L，MgSO₄0.2 g/L，NaCl1 g/L，琼脂粉25 g/L，甲硫氨酸0.2 g/L，pH=6.8-7.0；

（2）制备种子液：用无菌水将斜面上的菌株洗脱，全部接种到含有种子培养基的种子罐中，发酵控制条件：温度控制在34 ℃，溶氧控制在30-50%，pH通过氨水控制在6.8-7.2；所述种子培养基为：葡萄糖35 g/L，玉米浆干粉15 g/L，豆浓22 ml/L，K₂HPO₄·3H₂O 3g/L，MgSO₄·7H₂O 1 g/L，蛋氨酸0.5 g/L，苏氨酸 1 g/L，丁二酸1 g/L，FeSO₄·7H₂O 5 mg/L，MnSO₄·H₂O 5 mg/L，VB₁ 0.5 mg/L，VB₃ 0.5 mg/L，VB₅ 0.5 mg/L，VB₁₂ 0.5 mg/L，氯化胆碱0.1 g/L，甜菜碱0.1 g/L，D-谷氨酸 2g/L；

（3）发酵：当种子液的OD₆₀₀达到20时，将种子液按20%的接种量接种到含有发酵培养基的发酵罐中，当发酵罐中的OD₆₀₀值达到20-40时开始流加玉米浆，流加玉米浆浓度为0.5-1.5 g/L；发酵控制条件：初始温度控制在34℃，每4 h升温0.5℃，升温至37℃停止；溶氧通过转速和通风控制在30-50%；pH通过流加氨水控制在6.8-7.2；所述发酵培养基：MnSO₄·H₂O10 mg/L，MgSO₄·7H₂O 1.8 g/L，FeSO₄·7H₂O 5 mg/L，Na₂HPO₄·12H₂O 3.5 g/L，KCl 1.8g/L，VB₁ 0.5 mg/L，VB₃ 0.5 mg/L，VB₅ 0.5 mg/L，VB₁₂ 0.5 mg/L，糖蜜1.2 g/L，玉米浆干粉2.5 g/L，豆粕水解液15 ml/L，氯化胆碱0.1 g/L，甜菜碱0.1 g/L，D-谷氨酸 2g/L。