RU2815942C1 - Полинуклеотид, обладающий промоторной активностью, и применение полинуклеотида для получения аминокислоты - Google Patents
Полинуклеотид, обладающий промоторной активностью, и применение полинуклеотида для получения аминокислоты Download PDFInfo
- Publication number
- RU2815942C1 RU2815942C1 RU2023105957A RU2023105957A RU2815942C1 RU 2815942 C1 RU2815942 C1 RU 2815942C1 RU 2023105957 A RU2023105957 A RU 2023105957A RU 2023105957 A RU2023105957 A RU 2023105957A RU 2815942 C1 RU2815942 C1 RU 2815942C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- polynucleotide
- gene
- derivatives
- amino acid
- ddh
- Prior art date
Links
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 title claims abstract description 78
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 title claims abstract description 78
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 title claims abstract description 78
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 title claims abstract description 75
- 230000000694 effects Effects 0.000 title claims abstract description 73
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 97
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 57
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims abstract description 32
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims abstract description 32
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 31
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims abstract description 29
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 27
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 claims abstract description 25
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 111
- 241000186226 Corynebacterium glutamicum Species 0.000 claims description 73
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 claims description 73
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 73
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 claims description 67
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 49
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 49
- 235000019766 L-Lysine Nutrition 0.000 claims description 44
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims description 35
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 34
- 108010056578 diaminopimelate dehydrogenase Proteins 0.000 claims description 34
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 28
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 28
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 28
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims description 27
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 23
- 235000018977 lysine Nutrition 0.000 claims description 23
- 241000186216 Corynebacterium Species 0.000 claims description 13
- JJMDCOVWQOJGCB-UHFFFAOYSA-N 5-aminopentanoic acid Chemical compound [NH3+]CCCCC([O-])=O JJMDCOVWQOJGCB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 claims description 12
- 241001485655 Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 Species 0.000 claims description 11
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 11
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 claims description 11
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 claims description 11
- 235000006109 methionine Nutrition 0.000 claims description 11
- 229960002898 threonine Drugs 0.000 claims description 11
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 claims description 10
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 claims description 10
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 235000014705 isoleucine Nutrition 0.000 claims description 9
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 7
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 claims description 7
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- RTBFRGCFXZNCOE-UHFFFAOYSA-N 1-methylsulfonylpiperidin-4-one Chemical compound CS(=O)(=O)N1CCC(=O)CC1 RTBFRGCFXZNCOE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 claims description 6
- 241000186146 Brevibacterium Species 0.000 claims description 6
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 6
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 6
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 claims description 6
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 6
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 claims description 6
- JFCQEDHGNNZCLN-UHFFFAOYSA-N anhydrous glutaric acid Natural products OC(=O)CCCC(O)=O JFCQEDHGNNZCLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 235000009697 arginine Nutrition 0.000 claims description 6
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 claims description 6
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 claims description 6
- KJOMYNHMBRNCNY-UHFFFAOYSA-N pentane-1,1-diamine Chemical compound CCCCC(N)N KJOMYNHMBRNCNY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 5
- ZGXJTSGNIOSYLO-UHFFFAOYSA-N 88755TAZ87 Chemical compound NCC(=O)CCC(O)=O ZGXJTSGNIOSYLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 claims description 5
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 claims description 5
- PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N Hydroxyproline Chemical compound O[C@H]1CN[C@H](C(O)=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N 0.000 claims description 5
- AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N L-Ornithine Chemical compound NCCC[C@H](N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 5
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 5
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 5
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 claims description 5
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 claims description 5
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 5
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims description 5
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 claims description 5
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims description 5
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 5
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 241001467578 Microbacterium Species 0.000 claims description 5
- AHLPHDHHMVZTML-UHFFFAOYSA-N Orn-delta-NH2 Natural products NCCCC(N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- UTJLXEIPEHZYQJ-UHFFFAOYSA-N Ornithine Natural products OC(=O)C(C)CCCN UTJLXEIPEHZYQJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 229960002749 aminolevulinic acid Drugs 0.000 claims description 5
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 claims description 5
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 claims description 5
- PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N dl-hydroxyproline Natural products OC1C[NH2+]C(C([O-])=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 claims description 5
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 claims description 5
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 229960002591 hydroxyproline Drugs 0.000 claims description 5
- 235000005772 leucine Nutrition 0.000 claims description 5
- 229960003104 ornithine Drugs 0.000 claims description 5
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 235000004400 serine Nutrition 0.000 claims description 5
- FGMPLJWBKKVCDB-UHFFFAOYSA-N trans-L-hydroxy-proline Natural products ON1CCCC1C(O)=O FGMPLJWBKKVCDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 239000004474 valine Substances 0.000 claims description 5
- 235000014393 valine Nutrition 0.000 claims description 5
- 241000807905 Corynebacterium glutamicum ATCC 14067 Species 0.000 claims description 4
- 102000003939 Membrane transport proteins Human genes 0.000 claims description 3
- 108090000301 Membrane transport proteins Proteins 0.000 claims description 3
- 230000009061 membrane transport Effects 0.000 claims description 3
- 108091032955 Bacterial small RNA Proteins 0.000 claims description 2
- 108020004566 Transfer RNA Proteins 0.000 claims description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 3
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 abstract 1
- 101150057904 ddh gene Proteins 0.000 description 83
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 63
- 101150109073 ldhD gene Proteins 0.000 description 51
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 47
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 24
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 17
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 15
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 15
- GMKMEZVLHJARHF-UHFFFAOYSA-N 2,6-diaminopimelic acid Chemical group OC(=O)C(N)CCCC(N)C(O)=O GMKMEZVLHJARHF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 13
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 12
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 12
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 11
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 10
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 10
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 10
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 10
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 9
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 9
- 108010055400 Aspartate kinase Proteins 0.000 description 8
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 8
- GMKMEZVLHJARHF-SYDPRGILSA-N meso-2,6-diaminopimelic acid Chemical compound [O-]C(=O)[C@@H]([NH3+])CCC[C@@H]([NH3+])C([O-])=O GMKMEZVLHJARHF-SYDPRGILSA-N 0.000 description 8
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 7
- DVLFYONBTKHTER-UHFFFAOYSA-N 3-(N-morpholino)propanesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)CCCN1CCOCC1 DVLFYONBTKHTER-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 6
- 108010053763 Pyruvate Carboxylase Proteins 0.000 description 6
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 6
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 6
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 6
- 230000008569 process Effects 0.000 description 6
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 6
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 6
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 6
- 108020004652 Aspartate-Semialdehyde Dehydrogenase Proteins 0.000 description 5
- 239000007993 MOPS buffer Substances 0.000 description 5
- FCXZBWSIAGGPCB-YFKPBYRVSA-N O-acetyl-L-homoserine Chemical compound CC(=O)OCC[C@H]([NH3+])C([O-])=O FCXZBWSIAGGPCB-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 5
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 5
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 5
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 5
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 5
- AIUDWMLXCFRVDR-UHFFFAOYSA-N dimethyl 2-(3-ethyl-3-methylpentyl)propanedioate Chemical compound CCC(C)(CC)CCC(C(=O)OC)C(=O)OC AIUDWMLXCFRVDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 5
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 5
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 5
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 5
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 5
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 5
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 5
- 108010054624 red fluorescent protein Proteins 0.000 description 5
- 108010073086 succinyl-CoA-tetrahydrodipicolinate N-succinyltransferase Proteins 0.000 description 5
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 5
- VBNGJYNPUFWTKX-UHFFFAOYSA-N 10,10-diamino-1,6-dioxacyclotridecane-2,5,7,13-tetrone Chemical compound NC1(CCC(=O)OC(CCC(=O)OC(CC1)=O)=O)N VBNGJYNPUFWTKX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 4
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 4
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 4
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 4
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 4
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 4
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 4
- 102100039895 Pyruvate carboxylase, mitochondrial Human genes 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 229930003451 Vitamin B1 Natural products 0.000 description 4
- 235000010633 broth Nutrition 0.000 description 4
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 4
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 4
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 4
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 4
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 4
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 4
- 229960003495 thiamine Drugs 0.000 description 4
- DPJRMOMPQZCRJU-UHFFFAOYSA-M thiamine hydrochloride Chemical compound Cl.[Cl-].CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N DPJRMOMPQZCRJU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 235000010374 vitamin B1 Nutrition 0.000 description 4
- 239000011691 vitamin B1 Substances 0.000 description 4
- 108091000044 4-hydroxy-tetrahydrodipicolinate synthase Proteins 0.000 description 3
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 3
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000001253 Protein Kinase Human genes 0.000 description 3
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N Succinic acid Natural products OC(=O)CCC(O)=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010009197 Succinyldiaminopimelate transaminase Proteins 0.000 description 3
- 102000014701 Transketolase Human genes 0.000 description 3
- 108010043652 Transketolase Proteins 0.000 description 3
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- KDYFGRWQOYBRFD-NUQCWPJISA-N butanedioic acid Chemical compound O[14C](=O)CC[14C](O)=O KDYFGRWQOYBRFD-NUQCWPJISA-N 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 3
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 3
- 230000006870 function Effects 0.000 description 3
- 102000006602 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 3
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 3
- XKUKSGPZAADMRA-UHFFFAOYSA-N glycyl-glycyl-glycine Chemical compound NCC(=O)NCC(=O)NCC(O)=O XKUKSGPZAADMRA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 3
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 3
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 3
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 3
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- 208000031448 Genomic Instability Diseases 0.000 description 2
- 108010064711 Homoserine dehydrogenase Proteins 0.000 description 2
- 108090000856 Lyases Proteins 0.000 description 2
- 102000004317 Lyases Human genes 0.000 description 2
- 108010048581 Lysine decarboxylase Proteins 0.000 description 2
- 241000829100 Macaca mulatta polyomavirus 1 Species 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 2
- 108090000340 Transaminases Proteins 0.000 description 2
- 102000003929 Transaminases Human genes 0.000 description 2
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- 101150107204 asd gene Proteins 0.000 description 2
- 230000006696 biosynthetic metabolic pathway Effects 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 101150011371 dapA gene Proteins 0.000 description 2
- 101150073654 dapB gene Proteins 0.000 description 2
- 101150064923 dapD gene Proteins 0.000 description 2
- 101150000582 dapE gene Proteins 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 2
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 108091006104 gene-regulatory proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000034356 gene-regulatory proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010067216 glycyl-glycyl-glycine Proteins 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 2
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 2
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 2
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 2
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 238000012269 metabolic engineering Methods 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 2
- UQDJGEHQDNVPGU-UHFFFAOYSA-N serine phosphoethanolamine Chemical compound [NH3+]CCOP([O-])(=O)OCC([NH3+])C([O-])=O UQDJGEHQDNVPGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- WPLOVIFNBMNBPD-ATHMIXSHSA-N subtilin Chemical compound CC1SCC(NC2=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C(C)CC)C(=O)NC(=C)C(=O)NC(CCCCN)C(O)=O)CSC(C)C2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C1NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C1NC(=O)C(=C/C)/NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)CNC(=O)C(NC(=O)C(NC(=O)C2NC(=O)CNC(=O)C3CCCN3C(=O)C(NC(=O)C3NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(=C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(CCCCN)NC(=O)C(N)CC=4C5=CC=CC=C5NC=4)CSC3)C(C)SC2)C(C)C)C(C)SC1)CC1=CC=CC=C1 WPLOVIFNBMNBPD-ATHMIXSHSA-N 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 230000005026 transcription initiation Effects 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- 101710082233 2,4-diaminopentanoate dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 2-amino-4,6-dichloropyrimidine-5-carbaldehyde Chemical group NC1=NC(Cl)=C(C=O)C(Cl)=N1 GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 108020001657 6-phosphogluconate dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 102000004567 6-phosphogluconate dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 108010092060 Acetate kinase Proteins 0.000 description 1
- 108010013043 Acetylesterase Proteins 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 244000153158 Ammi visnaga Species 0.000 description 1
- 235000010585 Ammi visnaga Nutrition 0.000 description 1
- 101100062433 Arabidopsis thaliana DHDPS1 gene Proteins 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 101710092096 Diaminopimelate decarboxylase Proteins 0.000 description 1
- 108030003594 Diaminopimelate decarboxylases Proteins 0.000 description 1
- 108010001625 Diaminopimelate epimerase Proteins 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 108091029865 Exogenous DNA Proteins 0.000 description 1
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-M Formate Chemical compound [O-]C=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000700662 Fowlpox virus Species 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 150000008575 L-amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 229930182844 L-isoleucine Natural products 0.000 description 1
- 102000003855 L-lactate dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 108700023483 L-lactate dehydrogenases Proteins 0.000 description 1
- 101710155796 Malate:quinone oxidoreductase Proteins 0.000 description 1
- 101710141619 Meso-diaminopimelate D-dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- BAWFJGJZGIEFAR-NNYOXOHSSA-N NAD zwitterion Chemical compound NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@H]2[C@@H]([C@H](O)[C@@H](COP([O-])(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 BAWFJGJZGIEFAR-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 1
- 101100276922 Nostoc sp. (strain PCC 7120 / SAG 25.82 / UTEX 2576) dapF2 gene Proteins 0.000 description 1
- 108700027408 O-acetylhomoserine (thiol)-lyase Proteins 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 108700023175 Phosphate acetyltransferases Proteins 0.000 description 1
- 108091000041 Phosphoenolpyruvate Carboxylase Proteins 0.000 description 1
- 108010022181 Phosphopyruvate Hydratase Proteins 0.000 description 1
- 102000012288 Phosphopyruvate Hydratase Human genes 0.000 description 1
- 108010042687 Pyruvate Oxidase Proteins 0.000 description 1
- 230000006819 RNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 108090001066 Racemases and epimerases Proteins 0.000 description 1
- YMTLKLXDFCSCNX-BYPYZUCNSA-N Ser-Gly-Gly Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)NCC(O)=O YMTLKLXDFCSCNX-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 101100116197 Streptomyces lavendulae dcsC gene Proteins 0.000 description 1
- 108010056371 Succinyl-diaminopimelate desuccinylase Proteins 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 101150024271 TKT gene Proteins 0.000 description 1
- 102100033451 Thyroid hormone receptor beta Human genes 0.000 description 1
- 108700009124 Transcription Initiation Site Proteins 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 1
- 241000319304 [Brevibacterium] flavum Species 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 101150006213 ackA gene Proteins 0.000 description 1
- 101150014383 adhE gene Proteins 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- ZHWLPDIRXJCEJY-UHFFFAOYSA-N alpha-hydroxyglycine Chemical compound NC(O)C(O)=O ZHWLPDIRXJCEJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 101150008667 cadA gene Proteins 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 1
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 1
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 1
- 101150009649 dapC gene Proteins 0.000 description 1
- 101150062988 dapF gene Proteins 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- CETRZFQIITUQQL-UHFFFAOYSA-N dmso dimethylsulfoxide Chemical compound CS(C)=O.CS(C)=O CETRZFQIITUQQL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 101150107963 eno gene Proteins 0.000 description 1
- 238000003912 environmental pollution Methods 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000002073 fluorescence micrograph Methods 0.000 description 1
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 1
- 101150077334 focA gene Proteins 0.000 description 1
- 108010008221 formate C-acetyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 101150073818 gap gene Proteins 0.000 description 1
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 1
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 1
- 108010001064 glycyl-glycyl-glycyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 101150014950 gnd gene Proteins 0.000 description 1
- 101150063051 hom gene Proteins 0.000 description 1
- 108010071598 homoserine kinase Proteins 0.000 description 1
- 101150095957 ilvA gene Proteins 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000012212 insulator Substances 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 101150041134 ldcC gene Proteins 0.000 description 1
- 101150041530 ldha gene Proteins 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 101150033534 lysA gene Proteins 0.000 description 1
- 101150035025 lysC gene Proteins 0.000 description 1
- 101150044424 lysE gene Proteins 0.000 description 1
- 230000028744 lysogeny Effects 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 101150094267 mqo gene Proteins 0.000 description 1
- 229950006238 nadide Drugs 0.000 description 1
- 229930027945 nicotinamide-adenine dinucleotide Natural products 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 101150111581 pflB gene Proteins 0.000 description 1
- 101150000475 pntAB gene Proteins 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 230000001124 posttranscriptional effect Effects 0.000 description 1
- 101150060030 poxB gene Proteins 0.000 description 1
- 101150023641 ppc gene Proteins 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 101150108780 pta gene Proteins 0.000 description 1
- 101150096049 pyc gene Proteins 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000009711 regulatory function Effects 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 230000003584 silencer Effects 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 101150014006 thrA gene Proteins 0.000 description 1
- 101150072448 thrB gene Proteins 0.000 description 1
- 108091008023 transcriptional regulators Proteins 0.000 description 1
- 238000011222 transcriptome analysis Methods 0.000 description 1
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 150000003722 vitamin derivatives Chemical class 0.000 description 1
Abstract
Группа изобретений относится к области молекулярной биологии и биоинженерии. Предложены полинуклеотид, обладающий промоторной активностью, экспрессионная транскрипционная кассета, рекомбинантный вектор экспрессии и рекомбинантная клетка-хозяин, а также способ повышения экспрессии целевого гена, способ получения аминокислот. Полинуклеотид, обладающий промоторной активностью, является мутантом полинуклеотида, имеющего последовательность, представленную в SEQ ID NO: 9. Промоторная активность мутанта значительно повышена, тем самым способствуя стабильной и эффективной экспрессии целевого гена при сохранении стабильности генома. 7 н. и 5 з.п. ф-лы, 2 ил., 6 табл., 3 пр.
Description
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
[0001] Настоящее изобретение относится к области молекулярной биологии и биоинженерии и, в частности, относится к полинуклеотиду, обладающему промоторной активностью, экспрессионной транскрипционной кассете, рекомбинантному вектору экспрессии и рекомбинантной клетке-хозяину, содержащей полинуклеотид, обладающий промоторной активностью, а также к способу повышения экспрессии целевого гена, способу получения белков и способу получения аминокислот.
ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
[0002] Лизин, химическое название которого 2,6-диаминопимеловая кислота, является незаменимой аминокислотой для животных и человека. Он может способствовать развитию человека, повышать иммунитет и улучшать функцию центральной нервной системы. Существует три химических оптических изомера лизина: L-форма (левовращающая), D-форма (правовращающая) и DL-форма (рацемическая форма), среди которых только L-форма биологически пригодна для использования, а лизином обычно называют L-лизин.
[0003] L-лизин является одной из 20 распространенных аминокислот, которые составляют белки. L-лизин является основной аминокислотой, как гистидин и аргинин. Поскольку организмы человека и животных не могут синтезировать L-лизин самостоятельно, L-лизин может быть получен только из пищи, поэтому является одной из восьми незаменимых аминокислот. Содержание L-лизина в основных зерновых продуктах питания человека низкое, и его дефицит вызывает метаболические и функциональные нарушения белка, отрицательно влияющие на рост, и может быть разрушен во время обработки, таким образом, известен как первая ограничивающая аминокислота, которая играет очень важную роль в медицине, здравоохранении, пищевой, кормовой и косметической промышленности.
[0004] До сих пор существует три основных метода промышленного производства L-лизина: протеолиз, химический синтез и микробная ферментация. Среди них микробная ферментация является наиболее широко используемым методом промышленного производства L-лизина из-за его преимуществ, таких как низкая себестоимость производства, высокая интенсивность производства, высокая специфичность и низкое загрязнение окружающей среды. Corynebacterium и Escherichia широко используются в промышленном производстве L-лизина. Обычно используемая Escherichia представляет собой, например, Escherichia coli, и обычно используемая Corynebacterium включает Corynebacterium glutamicum рода Corynebacterium, Brevibacterium flavum рода Brevibacterium, Brevibacterium lactofermentus и некоторые виды рода Arthrobacterium и некоторые виды рода Microbacterium.
[0005] Среди микроорганизмов и растений, которые, как известно, имеют пути биосинтеза L-лизина, пути биосинтеза L-лизина можно классифицировать как два различных пути, т.е. путь альфа-аминогликолевой кислоты (AAA) и путь диаминопимелата (DAP). Путь диаминопимелата (DAP) является частью пути синтеза аминокислот семейства аспарагиновых кислот. Используя аспарагиновую кислоту в качестве субстрата, путь DAP включает путь сукцинилазы, путь ацетилазы и путь трансаминазы, которые синтезируют мезо-диаминопимеловую кислоту, и путь дегидрогеназы, который непосредственно синтезирует рацемическую диаминопимеловую кислоту без прохождения мезо-диаминопимеловую кислоту.
[0006] Corynebacterium glutamicum является важным промышленным микроорганизмом, и его преимущество заключается в его способности к ферментативному производству аминокислот в промышленном масштабе. Corynebacterium glutamicum использует путь дегидрогеназы для синтеза L-лизина с шестью ферментами, катализирующими реакцию, то есть аспартаткиназой (AK, кодируемая геном lysC), аспартат полуальдегид дегидрогеназой (ASADH, кодируемая геном asd), дигидродипиколинатсинтазой (DHDPS, кодируемая геном dapA), дигидродипиколинатредуктазой (DHDPR, кодируемая геном dapB), диаминопимелатдегидрогеназой (DAPDH, кодируемая геном ddh) и диаминопимелатдекарбоксилазой (DAPDC, кодируемая геном lysA). Процесс синтеза L-лизина с помощью Corynebacterium glutamicum с использованием пути сукцинилазы также включает четыре фермента, которые синтезируют мезодиаминопимеловую кислоту: тетрагидродипиколинатсукцинилазу (кодируемую геном dapD), N-сукцинилдиаминопимелатаминотрансферазу (кодируемую геном dapC), сукцинилдиаминопимелатдеацилазу (кодируемую геном dapE) и диаминопимелатэпимеразу (кодируемую геном dapF). Как хорошо известно, повышение экспрессии одного или более генов в пути синтеза L-лизина может эффективно увеличивать выход L-лизина.
[0007] Литературный источник 1 раскрывает бактерии Corynebacterium, которые имеют, помимо по меньшей мере одной копии, присутствующие в природном сайте (локусе) открытой рамки считывания (ORF), гена или аллеля, который кодирует синтез белка или РНК, в каждом случае вторую, необязательно третью или четвертую копию этой открытой рамки считывания (ORF), гена или аллеля, в каждом случае второй, необязательно третий или четвертый сайт в форме интеграции в хромосому. Бактерии Corynebacterium в таком способе могут улучшить уровень экспрессии генов за счет увеличения количества копий генов, тем самым увеличивая выход аминокислот, продуцируемых бактериями Corynebacterium. Однако увеличение числа копий генов снизит стабильность генома штамма, поэтому не может гарантировать стабильную и эффективную продукцию L-лизина.
[0008] Литературный источник 2 раскрывает способ получения L-лизина путем культивирования Escherichia coli со способностью продуцировать L-лизин в среде, из которой собирают L-лизин, причем Escherichia coli модифицировали для снижения активности или активностей одного или более ферментов в пути синтеза мезо α,ε-диаминопимеловой кислоты, например, 2,3,4,5-тетрагидропиридин-2,6-дикарбоксилата N-сукцинилтрансферазы, сукцинилдиаминопимелаттрансаминазы, сукцинилдиаминопимелатдесукцинилазы и диаминопимелатэпимеразы, а Escherichia coli вводили с геном, кодирующим диаминопимелатдегидрогеназу. Данный способ требует повышения экспрессии диаминопимелатдегидрогеназы при одновременном ингибировании ферментной активности пути синтеза мезо α,ε-диаминопимелиновой кислоты, что связано с проблемами сложного операционного процесса, высокой стоимостью и невозможностью эффективного получения L-лизина.
[0009] Литературный источник 3 раскрывает молекулу нуклеиновой кислоты, которая функционально лигирована геном, кодирующим диаминопимелатдегидрогеназу, и что активность диаминопимелатдегидрогеназы может быть увеличена, чтобы тем самым увеличить выход L-лизина штамма. Хотя в настоящем документе молекула нуклеиновой кислоты обладает более высокой активностью по сравнению с промотором дикого типа, неизвестно, существует ли молекула нуклеиновой кислоты с более высокой промоторной активностью. Как хорошо известно специалистам в данной области техники, чем выше активность диаминопимелатдегидрогеназы, тем более она благоприятна для производства лизина. Следовательно, разработка промотора с более высокой активностью будет полезна для повышения экспрессии диаминопимелатдегидрогеназы, тем самым обладая большим потенциалом для промышленного применения.
[0010] Литературные источники:
[0011] Литературный источник 1: CN1748031A.
[0012] Литературный источник 2: CN101765659A.
[0013] Литературный источник 3: CN101939432A.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0014] Техническая проблема
[0015] Учитывая техническую проблему, существующую в уровне техники, например, бактерии Corynebacterium, которые увеличивают выход за счет увеличения количества копий генов, имеют плохую стабильность генома, штамм, имеющий производственный потенциал L-лизина, имеет дефекты сложного процесса трансформации и неспособность стабильно и эффективно продуцировать L-лизин. В настоящем изобретении предложен полинуклеотид, обладающий промоторной активностью, значительно улучшенной по сравнению с промотором гена ddh дикого типа. Путем функционального лигирования полинуклеотида, обладающего промоторной активностью, с целевым геном, интенсивность экспрессии целевого гена может быть улучшена при сохранении стабильности генома.
[0016] Решение проблемы
[0017] (1) Полинуклеотид, обладающий промоторной активностью, где полинуклеотид выбран из группы, представленной в любом из следующих (i)-(ii):
[0018] (i) мутант полинуклеотида, имеющего последовательность, представленную SEQ ID NO: 9, содержащий мутированный нуклеотид в одном или более положениях в позициях 292-300 последовательности, представленной в SEQ ID NO: 9;
[0019] (ii) полинуклеотид, обладающий по меньшей мере 90%-й, необязательно по меньшей мере 95%-й, предпочтительно по меньшей мере 97%-й, более предпочтительно по меньшей мере 98%-й и наиболее предпочтительно по меньшей мере 99%-й идентичностью последовательности по сравнению с последовательностью, указанной в (i), и не содержащий последовательность, представленную в SEQ ID NO: 9;
[0020] где мутант обладает более высокой промоторной активностью, чем полинуклеотид, имеющий последовательность, представленную в SEQ ID NO: 9;
[0021] и нуклеотидная последовательность мутанта в позициях 292-300 последовательности, представленной в SEQ ID NO: 9, не выбрана из ATGCATTGT.
[0022] (2) Полинуклеотид, обладающий промоторной активностью, по (1), где мутант обладает повышенной промоторной активностью в 18 или более раз по сравнению с промоторной активностью полинуклеотида, имеющего последовательность, представленную в SEQ ID NO: 9.
[0023] (3) Полинуклеотид, обладающий промоторной активностью, по (1) или (2), где мутант содержит мутированные нуклеотиды в 4, 5, 6, 7, 8 или 9 положениях в позициях 292-300 последовательности, представленной в SEQ ID NO: 9; предпочтительно, мутант содержит мутированные нуклеотиды в 6, 7, 8 или 9 положениях в позициях 292-300 последовательности, представленной в SEQ ID NO: 9.
[0024] Полинуклеотид, обладающий промоторной активностью, по любому из (1)-(3), где нуклеотидная последовательность в позициях 292-300 полинуклеотида, обладающего промоторной активностью, выбрана из любой из следующих групп:
[0025] (a) ACAAAAGGT;
[0026] (b) TCTTCATCT;
[0027] (c) GGAAAGTAT;
[0028] (d) TTATTATAT;
[0029] (e) TAATCCTCT;
[0030] (f) TCAATTTAT;
[0031] (g) GCGCAATCT;
[0032] (h) CAGTTCCGT;
[0033] (i) AAGTTTTAT;
[0034] (g) TAAATGTAT;
[0035] (k) GGATTGTAT;
[0036] (l) CAAACTCAT;
[0037] (m) TACAAATCT;
[0038] (n) TATCAGTCT;
[0039] (o) CGAGGATAT;
[0040] (p) CCTTGTTAT.
[0041] (5) Экспрессионная транскрипционная кассета, содержащая полинуклеотид, обладающий промоторной активностью по любому из (1)-(4); необязательно, экспрессионная транскрипционная кассета дополнительно содержит ген, кодирующий белок, функционально лигирован с полинуклеотидом, обладающим промоторной активностью.
[0042] (6) Рекомбинантный вектор экспрессии, содержащий полинуклеотид, обладающий промоторной активностью по любому из (1)-(4), или экспрессионную транскрипционную кассету по (5).
[0043] (7) Рекомбинантная клетка-хозяин, содержащая экспрессионную транскрипционную кассету по (5) или рекомбинантный вектор экспрессии по (6).
[0044] (8) Рекомбинантная клетка-хозяин по (7), которая относится к роду Corynebacterium, роду Brevibacterium, роду Arthrobacterium, роду Microbacterium или роду Escherichia; предпочтительно, клетка-хозяин представляет собой Corynebacterium glutamicum; более предпочтительно, клетка-хозяин представляет собой Corynebacterium glutamicum ATCC 13032, Corynebacterium glutamicum ATCC 13869, Corynebacterium glutamicum ATCC 14067 или их производные штаммы.
[0045] (9) Применение полинуклеотида, обладающего промоторной активностью по любому из (1)-(4), экспрессионной транскрипционной кассеты по (5), рекомбинантного вектора экспрессии по (6) или рекомбинантной клетки-хозяина по любому из (7)-(8) при получении реагента или набора для повышения уровня транскрипции гена.
[0046] (10) Применение рекомбинантного вектора экспрессии по (6) или рекомбинантной клетки-хозяина по любому из (7)-(8) при получении белка или получении аминокислоты и ее производных; необязательно, аминокислота и ее производные выбраны из одной или комбинации двух или более из следующего: пролина, гидроксипролина, лизина, глутаминовой кислоты, аргинина, орнитина, глутамина, треонина, глицина, аланина, валина, лейцина, изолейцина, серина, цистеина, метионина, аспарагиновой кислоты, аспарагина гистидина, фенилаланинв, тирозинв, триптофанв, 5-аминолевулиновой кислоты или производные любой из вышеуказанных аминокислот;
[0047] предпочтительно, белок представляет собой фермент, участвующий в синтезе аминокислот; предпочтительно, фермент, участвующий в синтезе аминокислот, представляет собой диаминопимелатдегидрогеназу;
[0048] предпочтительно аминокислота включает L-лизин и его производные, где производные включают по меньшей мере одно из пентандиамина, 5-аминопентановой кислоты и глутаровой кислоты.
[0049] (11) Способ повышения экспрессии целевого гена, включающий стадию функционального лигирования полинуклеотида, обладающего промоторной активностью по любому из (1)-(4), с целевой РНК или целевым геном; причем необязательно целевая РНК содержит по меньшей мере одну из тРНК (транспортная РНК) и мРНК (малая РНК), а целевой ген включает по меньшей мере один из гена, кодирующего белок, связанный с синтезом целевого продукта, гена, кодирующего белок-регулятор экспрессии гена и гена, кодирующего белок, связанный с мембранным транспортом.
[0050] (12) Способ получения белка, где экспрессионная транскрипционная кассета по (5), рекомбинантный вектор экспрессии по (6) или рекомбинантная клетка-хозяин по любому из (7)-(8) выбрана для экспрессии белка; необязательно белок представляет собой белок, связанный с синтезом целевого продукта, белок, связанный с мембранным транспортом, или белок-регулятор экспрессии гена; необязательно белок представляет собой фермент, участвующий в синтезе L-лизина; необязательно ферменты участвующие в синтезе L-лизина включают одну или более аспартаткиназу, аспартатполуальдегиддегидрогеназу, аспартат-аммоний-лиазу, дигидродипиколинатсинтазу, дигидродипиколинатредуктазу, сукцинилдиаминопимелатаминотрансферазу, тетрагидродипиколинатсукцинилазу, сукцинилдиаминопимелатдеацилазу, эпимеразу диаминопимелиновой кислоты, деацилазу диаминопимелиновой кислоты, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназу, транспортный белок лизина, транскетолазу, диаминопимелатдегидрогеназу и карбоксилазу пирувата; предпочтительно белок представляет собой диаминопимелатдегидрогеназу.
[0051] (13) Способ получения аминокислоты и ее производных, где экспрессионная транскрипционная кассета по (5), рекомбинантный вектор экспрессии по (6) или рекомбинантная клетка-хозяин по любому из (7)-(8) выбрана для экспрессии фермента, участвующего в синтезе аминокислоты и ее производных, и фермент, участвующий в синтезе аминокислоты и ее производных, использовали для получения аминокислоты и ее производных; необязательно, аминокислота и ее производные выбраны из одной или комбинации двух или более из: пролина, гидроксипролина, лизина, глутаминовой кислоты, аргинина, орнитина, глутамина, треонина, глицина, аланина, валина, лейцина, изолейцина, серина, цистеина, метионина, аспарагиновой кислоты, аспарагина, гистидина, фенилаланина, тирозина, триптофана, 5-аминолевулиновой кислоты или производных любой из вышеуказанных аминокислот;
[0052] предпочтительно аминокислота включает L-лизин и его производные, где производные включают по меньшей мере один одно пентандиамина, 5-аминопентановой кислоты и глутаровой кислоты;
[0053] предпочтительно фермент, участвующий в синтезе аминокислоты, представляет собой диаминопимелатдегидрогеназу.
[0054] Эффекты
[0055] В одном варианте осуществления настоящего изобретения предложен полинуклеотид, обладающий промоторной активностью, который является мутантом промотора гена диаминопимелатдегидрогеназы (гена ddh) со значительно улучшенной промоторной активностью. По сравнению с промотором гена ddh дикого типа, мутант обладает значительно улучшенной промоторной активностью, и функциональное лигирование его с целевым геном способно значительно улучшить интенсивность экспрессии целевого гена без разрушения стабильности генома, и целевой ген может быть стабильно и эффективно экспрессирован, и может быть реализована стабильная и эффективная продукция последующих продуктов.
[0056] В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к экспрессионной транскрипционной кассете, рекомбинантному вектору экспрессии и рекомбинантной клетке-хозяину, которые содержат вышеупомянутый полинуклеотид, обладающий промоторной активностью. В экспрессионной транскрипционной кассете, рекомбинантном векторе экспрессии и рекомбинантной клетке-хозяине полинуклеотид, обладающий промоторной активностью, функционально лигирован с геном, кодирующим белок, интенсивность экспрессии гена, кодирующего белок, может быть улучшена.
[0057] В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу получения аминокислоты, которая может усиливать экспрессию фермента для синтеза аминокислоты с использованием вышеупомянутого полинуклеотида, обладающего промоторной активностью, а затем аминокислота может быть получена стабильно и эффективно. При его использовании в производстве L-лизина может быть получен стабильный и высокопродуктивный L-лизин.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
[0058] На фиг. 1 показана схематическая диаграмма плазмид pEC-XK99E-Pddh-rfp.
[0059] На фиг. 2 показан результат флуоресценции, отображающий мутированные клоны, выращенные на культуральной чашке, а положение, отмеченное стрелкой на фигуре, указывает на отдельный клон, демонстрирующий высокоинтенсивную красную флуоресценцию.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0060] Определения
[0061] При использовании в комбинации с термином «содержащий» в формуле изобретения и/или описании, термины в единственном числе могут относиться к «одному» или относиться к «одному или более», «по меньшей мере одному» и «одному или более чем одному».
[0062] Как используется в формуле изобретения и описании, термин «содержать», «иметь/имеет», «включать» или «состоять» предназначен для включения или неограниченного использования и не исключает дополнительные или неуказанные элементы или стадии способа.
[0063] В настоящем документе термин «приблизительно» означает, что значение включает стандартное отклонение ошибки устройства или способа, используемого для измерения значения.
[0064] Применимо к содержанию, раскрытому в настоящем документе, что термин «или» определяется только как альтернативы и «и/или», но термин «или», используемый в настоящем документе, относится к «и/или», если явно не указано иное, является просто альтернативой или взаимным исключением между альтернативами.
[0065] Выбранный/необязательный/предпочтительный «числовой диапазон» при использовании в формуле изобретения или описании включает не только числовые конечные точки на обоих концах диапазона, но и все натуральные числа, охватываемые между предыдущими числовыми конечными точками в отношении этих числовых конечных точек.
[0066] В настоящем описании термин «полинуклеотид» относится к полимеру, состоящему из нуклеотидов. Полинуклеотид может быть в форме отдельного фрагмента или компонента более крупной структуры нуклеотидной последовательности, и он получен из нуклеотидной последовательности, отделенной по меньшей мере один раз по количеству или концентрации, и может быть распознан, обработан и восстановлен из последовательности и ее компонентных нуклеотидных последовательностей стандартными методами молекулярной биологии (например, с использованием вектора клонирования). Когда нуклеотидная последовательность представлена последовательностью ДНК (т.е. A, T, G, C), она также включает последовательность РНК (т.е. A, U, G, C), где «U» заменяет «T». Другими словами, «полинуклеотид» относится к нуклеотидному полимеру, который был удален из других нуклеотидов (отдельного фрагмента или целого фрагмента), или может быть составной частью или компонентом более крупной нуклеотидной структуры, такой как вектор экспрессии или полицистронная последовательность. Полинуклеотид включает последовательности ДНК, РНК и кДНК (комплементарная ДНК).
[0067] В настоящем описании термин «мутация» относится к нуклеотиду, который содержит мутации в одном или более (например, нескольких) положениях полинуклеотида и поддерживает промоторную активность полинуклеотида. В настоящем описании мутация (содержащая замену, вставку и/или делецию), в частности, относится к замене, что означает замену нуклеотида, занимающего положение с другим нуклеотидом. Делеция относится к удалению нуклеотида, занимающего определенное положение. Вставка относится к добавлению нуклеотида, прилегающего к нуклеотиду, занимающему положение, и непосредственно за ним.
[0068] В некоторых конкретных вариантах осуществления "мутация" в настоящем описании содержит нуклеотиды, замещенные в одном или более позициях 292-300 последовательности, представленной в SEQ ID NO: 9, и не содержит нуклеотид, замещенный ATGCATTGT в позициях 292-300 последовательности, представленной в SEQ ID NO: 9. Мутанты с нуклеотидами, замещенными в указанных положениях, обладают более высокой промоторной активностью, чем полинуклеотид с последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 9.
[0069] Например, «мутация» в настоящем описании включает нуклеотиды, замещенные в 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или 9 положениях в позициях 292-300 последовательности, представленной в SEQ ID NO: 9. В некоторых конкретных вариантах осуществления изобретения "мутация" в настоящем описании включает нуклеотиды, содержащие мутации в 4, 5, 6, 7, 8 или 9 положениях в позициях 292-300 последовательности, представленной в SEQ ID NO: 9, предпочтительно нуклеотиды, включающие мутации в 6, 7, 8 или 9 положениях в позициях 292-300 последовательности, представленной в SEQ ID NO: 9. Мутанты с нуклеотидами, замещенными в указанных положениях, обладают более высокой промоторной активностью, чем мутанты с нуклеотидами, замещенными в других положениях.
[0070] В настоящем описании термин «идентичность последовательности» и «процент идентичности» относятся к проценту нуклеотидов или аминокислот, которые являются одинаковыми (т.е. идентичными) между двумя или более полинуклеотидами или полипептидами. Идентичность последовательности между двумя или более полинуклеотидами или полипептидами может быть определена путем выравнивания нуклеотидных или аминокислотных последовательностей полинуклеотидов или полипептидов, оценки количества положений, в которых нуклеотидные или аминокислотные остатки идентичны в выровненных полинуклеотидах или полипептидах, и сравнения количества этих положений с количеством положений, в которых нуклеотидные или аминокислотные остатки отличаются в выровненных полинуклеотидах или полипептидах. Полинуклеотиды могут быть различными в одном положении, например, путем содержания другого нуклеотида (т.е. замены или мутации) или делеции нуклеотида (т.е. вставки нуклеотида или делеции нуклеотида в одном или двух полинуклеотидах). Полипептиды могут быть различными в одном положении, например, путем содержания другой аминокислоты (т.е. замены или мутации) или делеции аминокислоты (т.е. вставки аминокислоты или делеции аминокислоты в одном или двух полипептидах). Идентичность последовательности может быть рассчитана путем деления количества положений, в которых нуклеотидные или аминокислотные остатки идентичны, на общее количество нуклеотидных или аминокислотных остатков в полинуклеотиде или полипептиде. Например, процент идентичности можно рассчитать путем деления количества положений, в которых нуклеотидные или аминокислотные остатки идентичны, на общее количество нуклеотидных или аминокислотных остатков в полинуклеотиде или полипептиде и умножения результата на 100.
[0071] В некоторых конкретных вариантах осуществления изобретения полинуклеотид, обладающий промоторной активностью, содержит последовательности, обладающие по меньшей мере 90%-й, 91%-й, 92%-й, 93%-й, 94%-й, 95%-й, 96%-й, 97%-й, 98%-й, 99%-й и 100%-й идентичностью последовательности по сравнению с мутантом полинуклеотида, как указано в SEQ ID NO: 9. В настоящем описании наличие определенного процента идентичности последовательности означает, что у мутанта полинуклеотида, имеющего последовательность, представленную в SEQ ID NO: 9, имеется мутированная последовательность, которая может поддерживать или улучшать активность транскрипции мутанта.
[0072] В настоящем описании термин «промотор» относится к молекуле нуклеиновой кислоты, которая обычно расположена выше от кодирующей последовательности целевого гена, обеспечивая сайт распознавания РНК-полимеразы, и расположена выше в направлении 5’сайта инициации транскрипции иРНК. Это нетранслируемая последовательность нуклеиновой кислоты, с которой связывается РНК-полимераза и которая инициирует транскрипцию целевого гена. В синтезе рибонуклеиновой кислоты (РНК) промотор может взаимодействовать с факторами транскрипции и регулировать транскрипцию гена и контролировать время инициации и степень экспрессии гена (транскрипция), и он содержит коровую область промотора и регуляторную область, функционирует как «свитч» («switch»), определяет активность гена, а затем контролирует, какой тип белка начинает продуцировать клетка.
[0073] В настоящем описании термин «промоторная коровая область» относится к последовательности нуклеиновой кислоты, расположенной в промоторной области прокариот, и именно область коровой последовательности играет роль промотора, главным образом, включая область -35, область -10 и область между областью -35 и областью -10, и сайт инициации транскрипции, причем область -35 является сайтом распознавания РНК-полимеразы, а область -10 является сайтом связывания РНК-полимеразы.
[0074] В некоторых конкретных вариантах осуществления полинуклеотид, обладающий промоторной активностью по настоящему изобретению, может быть использован для инициирования экспрессии генов, кодирующих белок. В некоторых других вариантах осуществления полинуклеотид, обладающий промоторной активностью по настоящему изобретению, может быть использован для инициирования экспрессии некодирующих генов.
[0075] В настоящем описании термин «экспрессия» включает любую стадию, включающую продукцию РНК и продукцию белка, включая, но не ограничиваясь этим, транскрипцию, посттранскрипционную модификацию, трансляцию, посттрансляционную модификацию и секрецию.
[0076] В настоящем описании термин «ген, кодирующий белок» относится к молекуле ДНК, способной направлять синтез белка по определенным правилам, и процесс, посредством которого ген, кодирующий белок, направляющий синтез белка, обычно включает процесс транскрипции с использованием двухцепочечной ДНК в качестве матрицы и трансляцию с использованием иРНК в качестве матрицы. Ген, кодирующий белок, содержит последовательность CDS (кодирующая последовательность), направляющую продукцию иРНК, кодирующей белок. Ген, кодирующий белок, включает, но не ограничиваясь этим, гены, используемые для кодирования ферментов, участвующих в синтезе аминокислот. В некоторых вариантах осуществления ген, кодирующий белок, относится к кодированию фермента, участвующего в синтезе L-лизина. Фермент, участвующий в синтезе L-лизина, включает один или комбинацию двух или более из: аспартаткиназы, аспартатполуальдегиддегидрогеназы, аспартат-аммоний-лиазы, дигидродипиколинатсинтазу, дигидродипиколинатредуктазу, сукцинилдиаминопимелатаминотрансферазы, тетрагидродипиколинатсукцинилазы, сукцинилдиаминопимелатдеацилазы, эпимеразы диаминопимелиновой кислоты, деацилазы диаминопимелиновой кислоты, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы, транспортного белка лизина и транскетолазы, диаминопимелатдегидрогеназы и карбоксилазы пирувата. Полинуклеотид, обладающий промоторной активностью согласно настоящему изобретению, подходит для регулирования экспрессии целевого гена и осуществления эффективной продукции целевого продукта.
[0077] В настоящем описании термин «экспрессионная транскрипционная кассета» относится к виду экспрессионного элемента, содержащего регуляторный элемент транскрипции и целевой ген, и использует регуляторный элемент транскрипции для регулирования экспрессии целевого гена. В настоящем изобретении регуляторный элемент транскрипции содержит промотор и может дополнительно содержать такие элементы, как энхансер, сайленсер, инсулятор. В настоящем описании целевой ген конкретно представляет собой ген, кодирующий белок. «Функциональное лигирование» целевого гена с полинуклеотидом означает, что полинуклеотид, обладающий промоторной активностью, функционально лигируется с целевым геном для инициирования и опосредования транскрипции целевого гена, и функциональное лигирование может быть любым из способов, описанных специалистами в данной области техники.
[0078] В настоящем описании термин «вектор» относится к конструкции ДНК, содержащей последовательность ДНК, функционально лигированную с подходящими регуляторными последовательностями, для экспрессии целевого гена в подходящем хозяине. «Рекомбинантный вектор экспрессии» относится к структуре ДНК, используемой для экспрессии, например, полинуклеотида, кодирующего желаемый полипептид. Рекомбинантный вектор экспрессии может включать, например, i) набор генетических элементов, которые имеют регуляторные функции экспрессии генов, такие как промоторы и энхансеры; ii) структуру или кодирующую последовательность, транскрибируемую в иРНК и транслируемую в белок; и iii) субъединицы транскрипции, которые соответствующим образом транскрибировали и транслировали начальную и стоп-последовательности. Рекомбинантный вектор экспрессии сконструирован любым подходящим способом. Свойство вектора не критично, и может быть использован любой вектор, включая плазмиды, вирусы, фаги и транспозоны. Возможные векторы для применения в настоящем изобретении включают, но не ограничиваясь этим, хромосомные, нехромосомные и синтетические последовательности ДНК, такие как бактериальные плазмиды, фаговая ДНК, дрожжевые плазмиды и векторы, полученные из комбинаций плазмид и фаговой ДНК, и ДНК из вирусов, таких как вирус осповакцины, аденовирус, вирус оспы птиц, бакуловирус, SV40 (вирус обезьян 40) и вирус псевдорабиса и т.д.
[0079] Например, вектор, рассматриваемый в настоящем изобретении, представляет собой плазмиду pEC-XK99E-Pddh-rfp для характеризации интенсивности промотора гена ddh, сконструированную на основе плазмиды pEC-XK99E-rfp[1], и карта плазмиды pEC-XK99E-Pddh-rfp является такой, как показано на фиг. 1. На фиг. 1 Pddh представляет собой промотор гена ddh; ddh представляет собой ген диаминопимелатдегидрогеназы дикого типа; линкер представляет собой линкерный пептид, расположенный между геном ddh и белком rfp; rfp представляет собой красный флуоресцентный белок (RFP); Kan представляет собой устойчивый к канамицину. После трансформации в подходящего хозяина pEC-XK99E-Pddh-rfp может реплицироваться и функционировать независимо от генома хозяина или в некоторых случаях интегрироваться в геном клетки-хозяина как таковой.
[0080] В настоящем изобретении термин «клетка-хозяин» относится к любому типу клеток, которые легко трансформируются, трансфицируются, трансдуцируются и т.д., с элементом инициации транскрипции или вектором экспрессии, содержащим полинуклеотид по настоящему изобретению. Термин «рекомбинантная клетка-хозяин» охватывает клетку-хозяина, которая отличается от родительской клетки после введения элемента инициации транскрипции или рекомбинантного вектора экспрессии, и рекомбинантная клетка-хозяин специфически реализуется путем трансформации.
[0081] В настоящем описании термин «трансформация» имеет значение, в целом понятное специалистам в данной области техники, то есть способ введения экзогенной ДНК в хозяина. Способ трансформации включает любой способ введения нуклеиновой кислоты в клетку, включая, но не ограничиваясь этим, электропорацию, осаждение фосфатом кальция (CaPO4), осаждение хлоридом кальция (CaCl2), микроинъекцию, способ с применением полиэтиленгликоля (PEG), способ с применением DEAE-декстрана (DEAE - диэтиламиноэтил), катионный липосомный метод и метод DMSO-ацетата лития (DMSO - диметилсульфоксид).
[0082] Клетка-хозяин по настоящему изобретению может представлять собой прокариотическую клетку или эукариотическую клетку, если она представляет собой клетку, в которую может быть введен полинуклеотид, обладающий промоторной активностью по настоящему изобретению. В одном варианте осуществления клетка-хозяин относится к прокариотической клетке. В частности, клетка-хозяин получена из микроорганизма, подходящего для получения аминокислот путем ферментации, такого как род Corynebacterium, род Brevibacterium, род Arthrobacterium, род Microbacterium или род Escherichia. Предпочтительно клетка-хозяин представляет собой Corynebacterium glutamicum из рода Corynebacterium. Среди них Corynebacterium glutamicum может представлять собой Corynebacterium glutamicum ATCC 13032, Corynebacterium glutamicum ATCC 13869, Corynebacterium glutamicum ATCC 14067 или их производные штаммы.
[0083] В настоящем изобретении культивирование клетки-хозяина может быть осуществлено в соответствии с общепринятыми способами в данной области техники, включая, но не ограничиваясь этим, культивирование на планшете, культивирование со встряхиванием, периодическое культивирование, непрерывное культивирование и культивирование с подпиткой и т.д., и различные условия культивирования, такие как температура, время и значение рН культуральной среды, могут быть соответствующим образом скорректированы в соответствии с фактическими ситуациями.
[0084] Если не указано иное, все технические и научные термины в настоящем описании имеют те же значения, которые обычно понимаются специалистами в данной области техники, к которой относится настоящее изобретение.
[0085] Мутант промотора гена диаминопимелатдегидрогеназы
[0086] В настоящем изобретении используется промоторная последовательность гена диаминопимелатдегидрогеназы дикого типа (ddh) для мутации коровой промоторной последовательности гена ddh и для получения мутантов промотора гена диаминопимелатдегидрогеназы. Промоторная последовательность гена диаминопимелатдегидрогеназы является такой, как представлено в SEQ ID NO: 9, и мутанты промотора гена диаминопимелатдегидрогеназы содержат мутированные нуклеотиды в одном или более положениях в позициях 292-300 последовательности, представленной в SEQ ID NO: 9, и нуклеотидные последовательности мутантов в позициях 290-300 последовательности, представленной в SEQ ID NO: 9, не выбраны из ATGCATTGT.
[0087] Было обнаружено, что мутанты промотора гена диаминопимелатдегидрогеназы представляют собой полинуклеотид, обладающий промоторной активностью, и мутанты промотора гена диаминопимелатдегидрогеназы обладают улучшенной промоторной активностью по сравнению с промотором гена диаминопимелатдегидрогеназы, имеющим последовательность, представленную в SEQ ID NO: 9.
[0088] В некоторых конкретных вариантах осуществления изобретения полинуклеотид, обладающий промоторной активностью, имеет по меньшей мере 90%-ю, 91%-ю, 92%-ю, 93%-ю, 94%-ю, 95%-ю, 96%-ю, 97%-ю, 98%-ю, 99%-ю, 100%-ю идентичность последовательности (включая все диапазоны и проценты между этими значениями) по сравнению с мутированной последовательностью промотора гена диаминопимелатдегидрогеназы и не включает последовательность, представленную в SEQ ID NO: 9.
[0089] В некоторых конкретных вариантах осуществления изобретения полинуклеотид, обладающий промоторной активностью, содержит мутированные нуклеотиды в 4, 5, 6, 7, 8 или 9 положениях в позициях 292-300 последовательности, представленной в SEQ ID NO: 9, и обладает промоторной активностью выше, чем у последовательности, представленной в SEQ ID NO: 9, предпочтительно мутированные нуклеотиды в 6, 7, 8 или 9 положениях в позициях 292-300 последовательности, представленной в SEQ ID NO: 9.
[0090] В некоторых конкретных вариантах осуществления изобретения нуклеотидная последовательность позиций 292-300 полинуклеотида, обладающего промоторной активностью, выбрана из любой из следующих групп: (a) ACAAAAGGT; (b) TCTTCATCT; (c) GGAAAGTAT; (d) TTATTATAT; (e) TAATCCTCT; (f) TCAATTTAT; (g) GCGCAATCT; (h) CAGTTCCGT; (i) AAGTTTTAT; (g) TAAATGTAT; (k) GGATTGTAT; (l) CAAACTCAT; (m) TACAAATCT; (n) TATCAGTCT; (o) CGAGGATAT; (p) CCTTGTTAT. Полинуклеотид, обладающий промоторной активностью, содержит последовательности, представленные в любой из SEQ ID NO: 10-25. По сравнению с промотором гена диаминопимелатдегидрогеназы, имеющим последовательность, представленную в SEQ ID NO: 9, мутанты обладают промоторной активностью, повышенной 18 или более раз, предпочтительно 19 или более раз, предпочтительно 20 или более раз, предпочтительно 22 или более раз, предпочтительно 23 или более раз, предпочтительно 24 или более раз, предпочтительно 25 или более раз, предпочтительно 26 или более раз, более предпочтительно 27 или более раз, более предпочтительно 28 или более раз, более предпочтительно 30 или более и более предпочтительно 31 или более раз.
[0091] Построение рекомбинантного вектора экспрессии
[0092] В некоторых конкретных вариантах осуществления сначала конструировали рекомбинантный вектор, содержащий промотор гена диаминопимелатдегидрогеназы, а затем подвергали мутации коровую промоторную область гена ddh с получением рекомбинантного вектора экспрессии, содержащего полинуклеотид, обладающий промоторной активностью.
[0093] Для конструирования рекомбинантного вектора праймеры ddh-F и ddh-R конструировали по опубликованной геномной информации Corynebacterium glutamicum, а геном Corynebacterium glutamicum подвергали PCR-амплификации (PCR - полимеразная цепная реакция) с ddh-F и ddh-R для получения промоторной последовательности гена ddh.
[0094] Праймеры pEC-F и pEC-R сконструированы с использованием информации о плазмиде pEC-XK99E-rfp[1]. С плазмидой pEC-XK99E-rfp в качестве матрицы праймеры pEC-F и PEC-R используют для выполнения амплификации для получения фрагментов ДНК скелета pEC-XK99E, линкерных пептидов и красного флуоресцентного белка.
[0095] Амплифицированные фрагменты, полученные из праймеров ddh-F и ddh-R, и амплифицированные фрагменты, полученные из праймеров pEC-F и pEC-R, рекомбинантно лигированы с получением рекомбинантного экспрессионного вектора, связанного с полинуклеотидом, обладающим промоторной активностью (т.е. мутированной последовательностью промотора гена ddh).
[0096] Специфическим источником Corynebacterium glutamicum является Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 (Gene ID: 2830649).
[0097] Процесс получения аминокислот
[0098] (1) В настоящем изобретении полинуклеотид, обладающий промоторной активностью, функционально лигировали с кодирующим геном фермента, участвующего в синтезе аминокислот, для получения рекомбинантного вектора экспрессии, способного синтезировать фермент, участвующий в синтезе аминокислот, и рекомбинантный вектор экспрессии использовали для трансформации клетки-хозяина с получением рекомбинантной клетки-хозяина.
[0099] (2) Рекомбинантная клетка-хозяин подвергается ферментативному культивированию, и аминокислоты собирали из рекомбинантной клетки-хозяина или культуральных бульонов рекомбинантной клетки-хозяина для завершения процесса производства аминокислот.
[00100] В указанном способе получения, поскольку полинуклеотид обладает улучшенной промоторной активностью, в рекомбинантной клетке-хозяине повышается транскрипционная активность кодирующего гена фермента, участвующего в синтезе аминокислот, и повышается уровень экспрессии фермента, участвующего в синтезе аминокислот, тем самым значительно повышается выход аминокислот.
[00101] Что касается полученных аминокислот, то аминокислоты включают L-лизин и его производные. Необязательно, аминокислота выбрана из одной или комбинации двух или более из следующих: пролина, гидроксипролина, лизина, глутаминовой кислоты, аргинина, орнитина, глутамина, треонина, глицина, аланина, валина, лейцина, изолейцина, серина, цистеина, метионина, аспарагиновой кислоты, аспарагина, гистидина, фенилаланина, тирозина, триптофана, 5-аминолевулиновой кислоты или производного любой из вышеуказанных аминокислот. Предпочтительно, производные включают по меньшей мере одно из пентандиамина, 5-аминопентановой кислоты и глутаровой кислоты.
[00102] Что касается фермента, участвующего в синтезе аминокислот, фермент, участвующий в синтезе аминокислот, представляет собой фермент, участвующий в синтезе L-лизина; предпочтительно фермент, участвующий в синтезе аминокислот, представляет собой диаминопимелатдегидрогеназу. Полинуклеотид, обладающий промоторной активностью, может значительно повышать транскрипционную активность диаминопимелатдегидрогеназы и значительно повышать уровень экспрессии диаминопимелатдегидрогеназы.
[00103] В некоторых вариантах осуществления клетка-хозяин в настоящем описании может представлять собой штамм любого типа, обладающий способностью продуцировать целевой продукт, включая штаммы дикого типа и рекомбинантные штаммы. Например, клетка-хозяин получена из микроорганизмов, подходящих для ферментативной продукции целевого продукта, такого как аминокислота и ее производные, например, Enterobacterium, Corynebacterium, Brevibacterium, Arthrobacterium, Microbacterium и т.д.
[00104] В некоторых предпочтительных вариантах осуществления клетка-хозяин представляет собой Enterobacterium или Corynebacterium, более предпочтительно Corynebacterium glutamicum, включая, но не ограничиваясь этим, Corynebacterium glutamicum ATCC 13032, Corynebacterium glutamicum ATCC 13869, Corynebacterium glutamicum B253, Corynebacterium glutamicum ATCC 14067 и производные штаммы, продуцирующие L-аминокислоты, полученные из вышеуказанных штаммов.
[00105] В некоторых конкретных вариантах осуществления клетка-хозяин представляет собой Corynebacterium glutamicum, важный штамм для продуцирования L-лизина. После модификации Corynebacterium glutamicum с использованием полинуклеотида, экспрессионная транскрипционная кассета или рекомбинантного вектора экспрессии, обладающего промоторной активностью, уровень экспрессии фермента, участвующего в синтезе L-лизина в Corynebacterium glutamicum, значительно увеличивается, в частности, уровень экспрессии диаминопимелатдегидрогеназы значительно увеличивается, что приводит к гораздо более высокой способности к ферментативной продукции L-лизина в Corynebacterium glutamicum.
[00106] В некоторых конкретных вариантах осуществления рекомбинантная клетка-хозяин представляет собой Corynebacterium glutamicum, модифицированную следующим образом: 1) мутированная кодирующая последовательность T311I вводится в кодирующий ген аспартаткиназы в Corynebacterium glutamicum; 2) коровая область из позиций 279-317 промотора гена пируваткарбоксилазы в Corynebacterium glutamicum представляет собой CGGGCCTTTGAAGACATTATTAGATTATTATTATTATTATTAG; 3) полинуклеотид, обладающий промоторной активностью, функционально лигируется с геном, кодирующим диаминопимелатдегидрогеназу, а затем вводится в Corynebacterium glutamicum. Corynebacterium glutamicum, модифицированный вышеуказанным способом, представляет собой высокопродуктивный штамм L-лизина.
[00107] В частности, кодирующие гены аспартаткиназы, пируваткарбоксилазы и диаминопимелатдегидрогеназы могут быть выделены и вставлены в экспрессионный вектор для продуцирования трансформации, где в клетке-хозяине вектор экспрессии может реплицироваться и экспрессировать ферменты независимо от клетки-хозяина или в некоторых случаях интегрироваться в геном клетки-хозяина. В данной области техники известны способы манипулирования микроорганизмами, как описано в таких публикациях, как Current Protocols in Molecular Biology (Online ISBN: 9780471142720, John Wiley и Sons, Inc.), Microbial Metabolic Engineering: Methods and Protocols (Qiong Cheng Ed., Springer) и Systems Metabolic Engineering: Methods and Protocols (Hal S.Alper Ed.,Springer).
[00108] В некоторых других вариантах осуществления клетка-хозяин может также представлять собой другие виды штаммов, продуцирующих аминокислоты. «Штамм, продуцирующий аминокислоты» в настоящем описании относится к штамму, который может продуцировать аминокислоты и накапливать аминокислоты, когда бактерии культивируют в культуральной среде, или секретировать аминокислоты в культуральную среду, то есть штамм, который может получать внеклеточные свободные аминокислоты. Например, это может быть природный штамм, продуцирующий аминокислоты, или модифицированный штамм, продуцирующий аминокислоты, полученный путем генетической модификации.
[00109] В качестве примера, клетка-хозяин представляет собой лизин-продуцирующую клетку-хозяина. В некоторых вариантах осуществления лизин-продуцирующая клетка-хозяин может содержать, но не ограничиваясь этим, один или более генов, выбранных из следующих, которые ослаблены или снижены в экспрессии:
[00110] a. ген adhE, кодирующий этанолдегидрогеназу;
[00111] b. ген ackA, кодирующий ацетаткиназу;
[00112] c. ген pta, кодирующий фосфат ацетилтрансферазу;
[00113] d. ген ldhA, кодирующий лактатдегидрогеназу;
[00114] e. ген focA, кодирующий транспортер формиата;
[00115] f. ген pflB, кодирующий пируватформиат-лиазу;
[00116] g. ген poxB, кодирующий пируват-оксидазу;
[00117] h. ген thrA, кодирующий бифункциональный фермент аспартаткиназы I/гомосериндегидрогеназы I;
[00118] i. ген thrB, кодирующий гомосеринкиназу;
[00119] j. ген ldcC, кодирующий лизиндекарбоксилазу; и
[00120] h. ген cadA, кодирующий лизиндекарбоксилазу.
[00121] В некоторых вариантах осуществления лизин-продуцирующая клетка-хозяин может содержать, но не ограничиваясь этим, один или более генов, выбранных из следующих, которые повышены или сверхэкспрессированы:
[00122] a. ген dapA, кодирующий дигидродипиридинсинтазу, которая ослабляет ингибирование лизина по типу обратной связи;
[00123] b. ген dapB, кодирующий дигидродипиколинатредуктазу;
[00124] c. ген ddh, кодирующий диаминопимелатдегидрогеназу;
[00125] d. dapD, кодирующий тетрагидродипиколинатсукцинилазу, и dapE, кодирующий сукцинилдиаминопимелатдеацилазу;
[00126] e. ген asd, кодирующий аспартат-семиальдегиддегидрогеназу;
[00127] f. ген ppc, кодирующий фосфоенолпируваткарбоксилазу;
[00128] g. ген pntAB, кодирующий никотинамидадениндинуклеотидтрансгидрогеназу;
[00129] i. ген lysE, кодирующий транспортный белок лизина.
[00130] В качестве примера, клетка-хозяин представляет собой клетку-хозяина, продуцирующую треонин. В некоторых вариантах осуществления треонин-продуцирующая клетка-хозяин представляет собой штамм, который экспрессирует ген LysC аспартаткиназы, который ослабляет ингибирование обратной связи на основе Corynebacterium glutamicum ATCC 13032. В некоторых других вариантах осуществления изобретения клетка-хозяин, продуцирующая треонин, также может представлять собой другие штаммы, обладающие способностью продуцировать треонин.
[00131] В некоторых вариантах осуществления лизин-продуцирующая клетка-хозяин может содержать, но не ограничиваясь этим, один или более генов, выбранных из следующих, которые повышены или сверхэкспрессированы:
[00132] a. ген thrABC, кодирующий треониновый оперон;
[00133] b. ген hom, кодирующий гомосериндегидрогеназу, который ослабляет ингибирование обратной связи;
[00134] c. ген gap, кодирующий глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназу;
[00135] d. ген pyc, кодирующий пируваткарбоксилазу;
[00136] e. ген mqo, кодирующий малат:хинон-оксидоредуктазу;
[00137] f. ген tkt, кодирующий транскетолазу;
[00138] g. ген gnd, кодирующий 6-фосфоглюконатдегидрогеназу;
[00139] h. ген thrE, кодирующий экспортер треонина;
[00140] i. ген eno, кодирующий енолазу.
[00141] В качестве примера, клетка-хозяин представляет собой изолейцин-продуцирующую клетку-хозяина. В некоторых вариантах осуществления данного изобретения изолейцин-продуцирующая клетка-хозяин представляет собой штамм, который продуцирует L-изолейцин путем замены аминокислоты в позиции 323 гена ilvA L-треониндегидратазы на аланин. В некоторых других вариантах осуществления изобретения клетка-хозяин, продуцирующая изолейцин, может также представлять собой другие типы штаммов, обладающих способностью продуцировать изолейцин.
[00142] В качестве примера, клетка-хозяин представляет собой O-ацетилгомосерин-продуцирующую клетку-хозяина. В некоторых вариантах осуществления O-ацетилгомосерин-продуцирующая клетка-хозяин представляет собой штамм, который продуцирует O-ацетилгомосерин путем инактивации O-ацетилгомосерин (тиол)-лиазы. В некоторых других вариантах осуществления клетка-хозяин, продуцирующая O-ацетилгомосерин, также может представлять собой другие типы штаммов, обладающих способностью продуцировать O-ацетилгомосерин.
[00143] В качестве примера, клетка-хозяин представляет собой продуцирующую метионин клетку-хозяина. В некоторых вариантах осуществления данного изобретения продуцирующая метионин клетка-хозяин представляет собой штамм, который продуцирует метионин путем инактивации регуляторов транскрипции метионина и цистеина. В некоторых других вариантах осуществления данного изобретения продуцирующая метионин клетка-хозяин может также представлять собой другие типы штаммов, обладающих способностью продуцировать метионин.
[00144] В некоторых конкретных вариантах осуществления условия культивирования рекомбинантных клеток-хозяев являются следующими: сначала Corynebacterium glutamicum инокулировали в жидкую среду TSB (триптон-соевый бульон) и культивировали в течение 8 часов, а культуру инокулировали в виде семян в 24-луночный планшет с 800 мкл ферментационной среды/лунку и, при начальной OD (оптическая плотность), контролируемой как около 0,1, культивировали при 30°С в течение 17 часов при скорости вращения встряхивателя планшетов 800 об/мин.
[00145] Ингредиенты жидкой среды TSB следующие: глюкоза, 5 г/л; дрожжевой порошок, 5 г/л; соевый пептон, 9 г/л; мочевина, 3 г/л; янтарная кислота, 0,5 г/л; K2HPO4 3H2O, 1 г/л; MgSO4·7H2O, 0,1 г/л; биотин, 0,01мг/л; витамин B1,0,1 мг/л; MOPS (3-морфолинопропансульфоновая кислота), 20 г/л.
[00146] Ингредиенты ферментационной среды следующие: глюкоза, 80 г/л; дрожжевой порошок, 1 г/л; соевый пептон, 1 г/л; NaCl, 1 г/л; сульфат аммония, 1 г/л; мочевина, 10 г/л; K2HPO4 3H2O, 1 г/л; MgSO4·7H2O, 0,45г/л; FeSO4·7H2O, 0,05г/л; биотин, 0,4 мг/л; витамин B1, 0,1 мг/л; MOPS, 40 г/л; начальный pH 7,2.
[00147] В некоторых конкретных вариантах осуществления аминокислоты могут быть выделены из рекомбинантных клеток-хозяев или культуральных бульонов рекомбинантных клеток способами, обычно используемыми в данной области техники, включая, но не ограничиваясь этим, фильтрацию, анионообменную хроматографию, кристаллизацию и HPLC (высокоэффективная жидкостная хроматография).
[00148] Примеры
[00149] Другие объекты, признаки и преимущества настоящего изобретения будут очевидны из нижеследующего подробного описания изобретения. Однако следует понимать, что подробное описание и конкретные примеры (хотя и с указанием конкретных вариантов осуществления настоящего изобретения) приведены только для пояснения, поскольку различные вариации и модификации в рамках сущности и объема настоящего изобретения станут очевидными для специалистов в данной области техники после прочтения подробного описания.
[00150] Экспериментальные методы и способы, используемые в примерах, являются обычными техническими методами, если не указано иное. Например, экспериментальные методы, для которых конкретные условия не указаны в следующих примерах, обычно соответствуют обычным условиям, таким как те, которые описаны в Molecular Cloning: Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989), Sambrook и др., или предложены производителями. Если не указано иное, материалы и реагенты, используемые в примерах, могут быть получены через официальные коммерческие каналы.
[00151] Пример 1. Конструирование плазмиды для характеризации интенсивности промотора гена ddh Corynebacterium glutamicum
[00152] Чтобы охарактеризовать интенсивность промотора гена ddh Corynebacterium glutamicum, в настоящем примере сначала сконструировали вектор для характеризации, лигирующий промотор гена ddh и фрагмент гена ddh на основе скелета плазмиды pEC-XK99E, а ген ddh, линкерный пептид и ген красного флуоресцентного белка (rfp) экспрессировали с использованием промотора гена ddh. Подробная информация приводится ниже.
[00153] (1) Праймеры ddh-F и ddh-R были сконструированы в соответствии с опубликованной последовательностью генома Corynebacterium glutamicum ATCC13032 (Gene ID: 2830649) и информацией об аннотации гена ddh, используя геном ATCC 13032 в качестве матрицы, промотор гена ddh и фрагмент гена ddh были получены с помощью PCR-амплификации. Нуклеотидная последовательность амплифицированного фрагмента представлена в SEQ ID NO: 34.
[00154] (2) Фрагменты ДНК скелета плазмиды pEC-XK99E, линкерного пептида и гена красного флуоресцентного белка амплифицировали с использованием плазмиды PEC-XK99E-rfp в качестве матрицы и pEC-F и pEC-R в качестве праймеров. Нуклеотидная последовательность амплифицированного фрагмента представлена в SEQ ID NO: 35.
[00155] Амплифицированный фрагмент генома Corynebacterium glutamicum ATCC13032 и амплифицированный фрагмент плазмиды pEC-XK99E-rfp клонировали и лигировали с помощью набора для одношагового клонирования Vazyme с получением вектора для характеризации pEC-XK99E-Pddh-rfp, из которого карта плазмид показана на фиг. 1. Последовательности праймеров, используемых выше, показаны в Таблице 1, а информация о последовательности линкерного пептида показана в Таблице 2.
| Таблица 1 | ||
| Праймеры | Нуклеотидная последовательность | Номер последовательности |
| ddh-F | CCTGATGCGGTATTTTCTCCGTGCGTGGCGAGTTTTACAAAG | SEQ ID NO: 1 |
| ddh-R | GACGTCGCGTGCGATCAGATC | SEQ ID NO: 2 |
| pEC-F | ATCTGATCGCACGCGACGTCGGCGGTGGCTCTGGAGGTGGTGGGTCCGGCGGTGGCTCTGCTTCCTCCGAAGACGTTATCAAAG | SEQ ID NO: 3 |
| pEC-R | GGAGAAAATACCGCATCAGGC | SEQ ID NO: 4 |
| Таблица 2 | ||
| Аминокислотная последовательность | Нуклеотидная последовательность, кодирующая линкерный пептид | |
| Линкерный пептид | GGGSGGGGSGGGS (SEQ ID NO: 36) | GGCGGTGGCTCTGGAGGTGGTGGGTCCGGCGGTGGCTCT (SEQ ID NO: 37) |
[00156] Пример 2. Скрининг и характеризация интенсивности мутантов промотора гена ddh Corynebacterium glutamicum
[00157] (1) Конструирование мутантной библиотеки промотора гена ddh Corynebacterium glutamicum
[00158] В настоящем примере коровая область
промотора гена ddh Corynebacterium glutamicum была мутирована, при этом подчеркнутые части представляют собой основные последовательности области -35 и области -10 промотора, соответственно. В настоящем примере мутацию
проводили в соответствующем положении вышеуказанной коровой области, два фрагмента плазмиды амплифицировали с использованием ddh-M1, ddh-M2, ddh-M3 и ddh-M4 праймеров, соответственно, и клонировали и лигировали с помощью одношагового набора для клонирования Vazyme. Все полученные клоны собирали и плазмиды экстрагировали с получением библиотеки мутированного промотора гена ddh. Для сравнения с мутированными промоторами ddh, уже опубликованными в предшествующем уровне техники, авторы изобретения сконструировали такой же мутированный промотор ddh, как описано в литературном источнике 3 (CN101939432A), на основе плазмиды pEC-XK99E-Pddh-rfp. В частности, последовательность коровой промоторной области представляет собой , где подчеркнутая часть представляет собой мутированные сайты, описанные в литературном источнике 3. Corynebacterium glutamicum ATCC13032 трансформировали вышеуказанной библиотекой, мутированной pEC-XK99E-Pddh-x-rfp в уровне техники и контрольной pEC-XK99E-Pddh-rfp дикого типа, полученным в Примере 1, соответственно, и нанесли на планшет TSB. Планшет, на котором выращивали сотни клонов, был визуализирован с помощью флуоресценции с помощью системы флуоресцентной визуализации, и мутанты с улучшенной интенсивностью экспрессии были предварительно скринированы в соответствии с яркостью флуоресценции клонов. На фиг. 2 показана флуоресцентное изображение мутированных клонов, выращенных на культуральном планшете, в которой положение со стрелкой представляет собой индивидуальный клон, демонстрирующий высокую интенсивность красной флуоресценции. Ингредиенты (г/л) среды планшета TSB являются следующими: глюкоза, 5 г/л; дрожжевой порошок, 5 г/л; соевый пептон, 9 г/л; мочевина, 3 г/л; янтарная кислота, 0,5 г/л; K2HPO4·3H2O, 1 г/л; MgSO4·7H2O, 0,1 г/л; биотин, 0,01мг/л; витамин B1, 0,1 мг/л; MOPS, 20 г/л; порошок агара, 15 г/л. В настоящем примере было предварительно скринировано более 10 000 клонов, и было получено около 20 мутантов со значительно повышенной интенсивностью флуоресценции. Последовательности используемых выше праймеров показаны в Таблице 3.
| Таблица 3 | ||
| Праймеры | Нуклеотидная последовательность | Номер последовательности |
| ddh-M1 | CCCTGAATCATCATCTAAGTNNNNNNNNNGGTAAGCTCGACCAGGACAGTG | SEQ ID NO: 5 |
| ddh-M2 | AACCTTCCATACGAACTTTGAAACG | SEQ ID NO: 6 |
| ddh-M3 | CAAAGTTCGTATGGAAGGTTCCG | SEQ ID NO: 7 |
| ddh-M4 | ACTTAGATGATGATTCAGGGAC | SEQ ID NO: 8 |
[00159] (2) Характеризация интенсивности библиотеки мутированного промотора гена ddh Corynebacterium glutamicum
[00160] Все мутанты с повышенной интенсивностью флуоресценции, наблюдаемой на вышеуказанных планшетах, культивировали в 96-луночном планшете для характеризации интенсивности промоторов. Ингредиенты (г/л) жидкой среды TSB следующие: глюкоза, 5 г/л; дрожжевой порошок, 5 г/л; соевый пептон, 9 г/л; мочевина, 3 г/л; янтарная кислота, 0,5 г/л; K2HPO4·3H2O, 1 г/л; MgSO4·7H2O, 0,1 г/л; биотин, 0,01 мг/л; витамин B1, 0,1 мг/л; MOPS, 20 г/л. Штаммы, полученные в результате скрининга, контроля дикого типа и контроля предшествующего уровня техники, инокулировали зубочистками в 96-луночный планшет, содержащий 200 мкл жидкой культуральной среды TSB в каждой лунке, с тремя параллельными штаммами для каждого штамма. При скорости вращения встряхивателя планшета 800 об/мин после культивирования при 30°С в течение 24 часов определяли интенсивности флуоресценции штаммов и секвенировали штаммы с улучшенной интенсивностью флуоресценции по сравнению с контролем дикого типа. Некоторые мутированные промоторы имели одинаковую последовательность, и, наконец, были успешно получены 16 различных мутированных промоторов со значительно улучшенной интенсивностью экспрессии, и результаты показаны в Таблице 4, в которой промоторы, полученные в настоящем описании, последовательно пронумерованы от Pddh-1 до Pddh-16. Активности промоторов от Pddh-1 до Pddh-16 была увеличена примерно в 18-31 раз, обеспечивая обильное количество элементов для модификации экспрессии генов, таких как ddh и т.д.
[00161] Интенсивность флуоресценции мутированного промотора ddh (Pddh-x) литературного источника 3 была обнаружена вышеуказанным способом, и результат показан в таблице 4. Активность Pddh-x была увеличена только в 15 раз по сравнению с промотором дикого типа, и интенсивность экспрессии промотора по настоящему изобретению была улучшена на 15-101% по сравнению с активностью промотора, описанного в предшествующем уровне техники, и, следовательно, это является существенным прогрессом.
| Таблица 4 | |||
| № промотора | Интенсивность флуоресценции (RFU/OD600) | Последовательность мутированной области промотора | Номер последовательности полной последовательности промотора |
| Дикий тип | 609 | ATGCATCTC | SEQ ID NO: 9 |
| Pddh-1 | 11134 | ACAAAAGGT | SEQ ID NO: 10 |
| Pddh-2 | 11215 | TCTTCATCT | SEQ ID NO: 11 |
| Pddh-3 | 11247 | GGAAAGTAT | SEQ ID NO: 12 |
| Pddh-4 | 11264 | TTATTATAT | SEQ ID NO: 13 |
| Pddh-5 | 11366 | TAATCCTCT | SEQ ID NO: 14 |
| Pddh-6 | 11367 | TCAATTTAT | SEQ ID NO: 15 |
| Pddh-7 | 11421 | GCGCAATCT | SEQ ID NO: 16 |
| Pddh-8 | 11557 | CAGTTCCGT | SEQ ID NO: 17 |
| Pddh-9 | 11792 | AAGTTTTAT | SEQ ID NO: 18 |
| Pddh-10 | 11808 | TAAATGTAT | SEQ ID NO: 19 |
| Pddh-11 | 11853 | GGATTGTAT | SEQ ID NO: 20 |
| Pddh-12 | 12396 | CAAACTCAT | SEQ ID NO: 21 |
| Pddh-13 | 12923 | TACAAATCT | SEQ ID NO: 22 |
| Pddh-14 | 13799 | TATCAGTCT | SEQ ID NO: 23 |
| Pddh-15 | 13860 | CGAGGATAT | SEQ ID NO: 24 |
| Pddh-16 | 19417 | CCTTGTTAT | SEQ ID NO: 25 |
| Pddh-x | 9669 | ATGCATTGT | SEQ ID NO: 38 |
[00162] Пример 3. Применение мутированных промоторов гена ddh Corynebacterium glutamicum в продукции лизина
[00163] (1) Конструирование рекомбинантных векторов мутированного промотора гена ddh Corynebacterium glutamicum
[00164] Согласно заявленной последовательности генома Corynebacterium glutamicum ATCC13032, расположенные до и после гомологичные плечи мутированных промоторов Pddh-1, Pddh-10 и Pddh-16 подвергали PCR-амплификации с использованием генома ATCC13032 в качестве матрицы и с использованием ddh-UF/ddh-UR и ddh-DF1/ddh-DR, ddh-UF/ddh-UR и ddh-DF10/ddh-DR, ddh-UF/ddh-UR и ddh-DF16/ddh-DR в качестве праймеров, соответственно; тем временем, скелет pK18mobsacB (GenBank: FJ437239.1) усиливали с использованием pK18-1/2 в качестве праймеров. Вышеуказанные две группы фрагментов PCR были выделены, а затем лигированы с помощью набора для одношагового клонирования Vazyme, и были получены рекомбинантные векторы pK18-Pddh-1, pK18-Pddh-10 и pK18-Pddh-16 с мутированными промоторами, соответственно. Последовательности используемых выше праймеров перечислены в Таблице 5.
| Таблица 5 | ||
| Праймеры | Нуклеотидная последовательность | Номер последовательности |
| ddh-UF | CAGGAAACAGCTATGACATGTTCCAGCCATCGCCAAATAAG | SEQ ID NO: 26 |
| ddh-UR | ACTTAGATGATGATTCAGGGAC | SEQ ID NO: 27 |
| ddh-DF1 | CCCTGAATCATCATCTAAGTACAAAAGGTGGTAAGCTCGACCAGGACAGTG | SEQ ID NO: 28 |
| ddh-DF10 | CCCTGAATCATCATCTAAGTTAAATGTATGGTAAGCTCGACCAGGACAGTG | SEQ ID NO: 29 |
| ddh-DF16 | CCCTGAATCATCATCTAAGTCCTTGTTATGGTAAGCTCGACCAGGACAGTG | SEQ ID NO: 30 |
| ddh-DR | TGTAAAACGACGGCCAGTGCTGTACTGGACTGCCTTTTGAACG | SEQ ID NO: 31 |
| pK18-1 | GCACTGGCCGTCGTTTTAC | SEQ ID NO: 32 |
| pK18-2 | CATGTCATAGCTGTTTCCTGTGTG | SEQ ID NO: 33 |
[00165] (2) Конструирование мутированного промотора гена ddh штамма, продуцирующего лизин Corynebacterium glutamicum
[00166] Лизин-продуцирующий штамм Corynebacterium glutamicum SCgL37 (штамм, в котором мутированная кодирующая последовательность T311I (основание, мутированное из ACC в ATC), введена в кодирующий ген аспартаткиназы в Corynebacterium glutamicum ATCC13032, и коровая область в позициях 279-317 промотора гена пируваткарбоксилазы мутирована в CGGGCCTTTGATGAGAGAGACATTATATATATATATATATATATATATAG) была трансформирована рекомбинантными векторами pK18-Pddh-1, pK18-Pddh-10 и pK18-Pddh-16, сконструированными выше, и нанесены на твердую среду LBHIS, содержащую 5 г/глюкозу и 25 мкг/мл канамицина, и культивирована при 30°C для получения первого рекомбинантного превращения. Правильные первичные рекомбинантные трансформанты инокулировали в среду LB (лизогенный бульон), содержащую 5 г/л глюкозы, культивировали в течение ночи и разводили и покрывали на планшетах с твердой средой LB, к которым добавляли 100 г/л сахарозы, соответственно, для проведения скрининга, и получали штаммы SCgL38, SCgL39 и SCgL40 с мутантным по промотору ddh, были получены соответственно.
[00167] (3) Оценка продуцирующей способности L-лизина мутированного промотора гена ddh штаммов, продуцирующих лизин Corynebacterium glutamicum
[00168] Чтобы проверить влияние мутации промотора ddh в Corynebacterium glutamicum на продукцию L-лизина, были проведены ферментационные тесты на штаммах SCgL37, SCgL38, SCgL39 и SCgL40 соответственно. Ингредиенты ферментационной среды следующие: глюкоза, 80 г/л; дрожжевой порошок, 1 г/л; соевый пептон, 1 г/л; NaCl, 1 г/л; сульфат аммония, 1 г/л; мочевина, 10 г/л; K2HPO4·3H2O, 1 г/л; MgSO4·7H2O, 0,45г/л; FeSO4·7H2O, 0,05 г/л; биотина, 0,4 мг/л; витамин B1, 0,1 мг/л; MOPS, 40 г/л; исходный pH 7,2. Во-первых, штаммы инокулировали в жидкую среду TSB для культивирования в течение 8 часов, и культуры инокулировали в виде семян в 24-луночный планшет, содержащий 800 мкл ферментационной среды в каждой лунке. Начальную OD600 контролировали при около 0,1, и культивирование проводили при 30°С в течение 17 часов при скорости вращения встряхивателя планшета 800 об/мин с тремя параллельными штаммами для каждого штамма. После ферментации измеряли выход L-лизина и потребление глюкозы и рассчитывали скорость превращения глюкозы из глюкозы в L-лизин. Результаты показаны в Таблице 6, которая показывает, что штаммы с мутированными промоторами ddh имели повышенный выход лизина и повышенную скорость конверсии глюкоза-кислота, и увеличение было более значительным с увеличением интенсивности промотора. Приведенные выше результаты показывают, что мутанты с повышенной интенсивностью экспрессии промотора ddh могут быть применены к продукции L-лизина.
| Таблица 6 | ||
| Штаммы | Выход лизина (г/л) | Степень конверсии (%) |
| SCgL37 | 2,97±0,06 | 5,41±0,04 |
| SCgL38 | 3,47±0,21 | 6,47±0,57 |
| SCgL39 | 3,53±0,21 | 7,05±1,09 |
| SCgL40 | 3,60±0,36 | 7,49±1,26 |
[00169] Поскольку синтез последующих продуктов L-лизина полностью зависит от стадий реакции, катализируемых диаминопимелатдегидрогеназой, выход последующих продуктов также может быть увеличен путем повышения экспрессии гена ddh мутантами промотора гена ddh по настоящему изобретению. Таким образом, техническое решение, представленное в настоящем описании, также может быть использовано для получения последующих продуктов L-лизина, таких как пентандиамин, 5-аминовалеровая кислота, глутаровая кислота и т.д.
[00170] Все технические признаки, раскрытые в данном описании, могут комбинироваться любым способом. Каждый признак, раскрытый в этом описании, также может быть заменен другим признаком, имеющим такую же, равную или аналогичную функцию. Следовательно, если не указано иное, каждый признак, раскрытый в настоящем документе, является просто примером ряда равных или схожих признаков.
[00171] Кроме того, в соответствии с вышеприведенным описанием настоящего изобретения специалисты в данной области техники могут легко понять ключевые признаки настоящего изобретения, и в настоящее изобретение могут быть внесены многие модификации для адаптации к различным целям и условиям использования без отступления от сущности и объема настоящего изобретения, и поэтому такие модификации также подпадают под объем прилагаемой формулы изобретения.
Литературный источник:
[1] Wang, YC и др. Screening efficient constitutive promoters in Corynebacterium glutamicum based on time-series transcriptome analysis. Chinese Journal of Biotechnology, 2018, 34(11):1760 - 1771.
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> ТЯНЬЦЗИНЬ ИНСТИТЬЮТ ОФ ИНДАСТРИАЛ БАЙОТЕКНОЛОДЖИ, ЧАЙНИЗ
ЭКЭДЕМИ ОФ САЙЕНСИЗ
<120> ПОЛИНУКЛЕОТИД, ОБЛАДАЮЩИЙ ПРОМОТОРНОЙ АКТИВНОСТЬЮ,
И ПРИМЕНЕНИЕ ПОЛИНУКЛЕОТИДА ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ АМИНОКИСЛОТЫ
<130> 6A17-2073508IB
<150> CN202010838604.9
<151> 2020-08-19
<160> 38
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 42
<212> ДНК
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 1
cctgatgcgg tattttctcc gtgcgtggcg agttttacaa ag 42
<210> 2
<211> 21
<212> ДНК
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 2
gacgtcgcgt gcgatcagat c 21
<210> 3
<211> 84
<212> ДНК
<213> Плазмида
<400> 3
atctgatcgc acgcgacgtc ggcggtggct ctggaggtgg tgggtccggc ggtggctctg 60
cttcctccga agacgttatc aaag 86
<210> 4
<211> 21
<212> ДНК
<213> Плазмида
<400> 4
ggagaaaata ccgcatcagg c 21
<210> 5
<211> 51
<212> ДНК
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 5
ccctgaatca tcatctaagt nnnnnnnnng gtaagctcga ccaggacagt g 51
<210> 6
<211> 25
<212> ДНК
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 6
aaccttccat acgaactttg aaacg 25
<210> 7
<211> 23
<212> ДНК
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 7
caaagttcgt atggaaggtt ccg 23
<210> 8
<211> 22
<212> ДНК
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 8
acttagatga tgattcaggg ac 22
<210> 9
<211> 351
<212> ДНК
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 9
gtgcgtggcg agttttacaa agaaccccac atcatcaatg cctaaatggc gggtattttc 60
atccaaaccc aaccgcgcat cattccaatg ctgatccacc ccatccggat aaaccaccat 120
gaacggcaac ggatcaaaag tcctgttggt gaagctgcgc cccacagatc ctgactgctg 180
ggagccatga aaatagatca gcgcatccgt ggtggaacca aaaggctcaa caatacgaaa 240
cgttcgcttt cggtcctgat gaaagagatg tccctgaatc atcatctaag tatgcatctc 300
ggtaagctcg accaggacag tgccaccaca attttggagg attacaagaa c 361
<210> 10
<211> 351
<212> ДНК
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 10
gtgcgtggcg agttttacaa agaaccccac atcatcaatg cctaaatggc gggtattttc 60
atccaaaccc aaccgcgcat cattccaatg ctgatccacc ccatccggat aaaccaccat 120
gaacggcaac ggatcaaaag tcctgttggt gaagctgcgc cccacagatc ctgactgctg 180
ggagccatga aaatagatca gcgcatccgt ggtggaacca aaaggctcaa caatacgaaa 240
cgttcgcttt cggtcctgat gaaagagatg tccctgaatc atcatctaag tacaaaaggt 300
ggtaagctcg accaggacag tgccaccaca attttggagg attacaagaa c 361
<210> 11
<211> 351
<212> ДНК
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 11
gtgcgtggcg agttttacaa agaaccccac atcatcaatg cctaaatggc gggtattttc 60
atccaaaccc aaccgcgcat cattccaatg ctgatccacc ccatccggat aaaccaccat 120
gaacggcaac ggatcaaaag tcctgttggt gaagctgcgc cccacagatc ctgactgctg 180
ggagccatga aaatagatca gcgcatccgt ggtggaacca aaaggctcaa caatacgaaa 240
cgttcgcttt cggtcctgat gaaagagatg tccctgaatc atcatctaag ttcttcatct 300
ggtaagctcg accaggacag tgccaccaca attttggagg attacaagaa c 361
<210> 12
<211> 351
<212> ДНК
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 12
gtgcgtggcg agttttacaa agaaccccac atcatcaatg cctaaatggc gggtattttc 60
atccaaaccc aaccgcgcat cattccaatg ctgatccacc ccatccggat aaaccaccat 120
gaacggcaac ggatcaaaag tcctgttggt gaagctgcgc cccacagatc ctgactgctg 180
ggagccatga aaatagatca gcgcatccgt ggtggaacca aaaggctcaa caatacgaaa 240
cgttcgcttt cggtcctgat gaaagagatg tccctgaatc atcatctaag tggaaagtat 300
ggtaagctcg accaggacag tgccaccaca attttggagg attacaagaa c 361
<210> 13
<211> 351
<212> ДНК
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 13
gtgcgtggcg agttttacaa agaaccccac atcatcaatg cctaaatggc gggtattttc 60
atccaaaccc aaccgcgcat cattccaatg ctgatccacc ccatccggat aaaccaccat 120
gaacggcaac ggatcaaaag tcctgttggt gaagctgcgc cccacagatc ctgactgctg 180
ggagccatga aaatagatca gcgcatccgt ggtggaacca aaaggctcaa caatacgaaa 240
cgttcgcttt cggtcctgat gaaagagatg tccctgaatc atcatctaag tttattatat 300
ggtaagctcg accaggacag tgccaccaca attttggagg attacaagaa c 361
<210> 14
<211> 351
<212> ДНК
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 14
gtgcgtggcg agttttacaa agaaccccac atcatcaatg cctaaatggc gggtattttc 60
atccaaaccc aaccgcgcat cattccaatg ctgatccacc ccatccggat aaaccaccat 120
gaacggcaac ggatcaaaag tcctgttggt gaagctgcgc cccacagatc ctgactgctg 180
ggagccatga aaatagatca gcgcatccgt ggtggaacca aaaggctcaa caatacgaaa 240
cgttcgcttt cggtcctgat gaaagagatg tccctgaatc atcatctaag ttaatcctct 300
ggtaagctcg accaggacag tgccaccaca attttggagg attacaagaa c 361
<210> 15
<211> 351
<212> ДНК
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 15
gtgcgtggcg agttttacaa agaaccccac atcatcaatg cctaaatggc gggtattttc 60
atccaaaccc aaccgcgcat cattccaatg ctgatccacc ccatccggat aaaccaccat 120
gaacggcaac ggatcaaaag tcctgttggt gaagctgcgc cccacagatc ctgactgctg 180
ggagccatga aaatagatca gcgcatccgt ggtggaacca aaaggctcaa caatacgaaa 240
cgttcgcttt cggtcctgat gaaagagatg tccctgaatc atcatctaag ttcaatttat 300
ggtaagctcg accaggacag tgccaccaca attttggagg attacaagaa c 361
<210> 16
<211> 351
<212> ДНК
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 16
gtgcgtggcg agttttacaa agaaccccac atcatcaatg cctaaatggc gggtattttc 60
atccaaaccc aaccgcgcat cattccaatg ctgatccacc ccatccggat aaaccaccat 120
gaacggcaac ggatcaaaag tcctgttggt gaagctgcgc cccacagatc ctgactgctg 180
ggagccatga aaatagatca gcgcatccgt ggtggaacca aaaggctcaa caatacgaaa 240
cgttcgcttt cggtcctgat gaaagagatg tccctgaatc atcatctaag tgcgcaatct 300
ggtaagctcg accaggacag tgccaccaca attttggagg attacaagaa c 361
<210> 17
<211> 351
<212> ДНК
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 17
gtgcgtggcg agttttacaa agaaccccac atcatcaatg cctaaatggc gggtattttc 60
atccaaaccc aaccgcgcat cattccaatg ctgatccacc ccatccggat aaaccaccat 120
gaacggcaac ggatcaaaag tcctgttggt gaagctgcgc cccacagatc ctgactgctg 180
ggagccatga aaatagatca gcgcatccgt ggtggaacca aaaggctcaa caatacgaaa 240
cgttcgcttt cggtcctgat gaaagagatg tccctgaatc atcatctaag tcagttccgt 300
ggtaagctcg accaggacag tgccaccaca attttggagg attacaagaa c 361
<210> 18
<211> 351
<212> ДНК
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 18
gtgcgtggcg agttttacaa agaaccccac atcatcaatg cctaaatggc gggtattttc 60
atccaaaccc aaccgcgcat cattccaatg ctgatccacc ccatccggat aaaccaccat 120
gaacggcaac ggatcaaaag tcctgttggt gaagctgcgc cccacagatc ctgactgctg 180
ggagccatga aaatagatca gcgcatccgt ggtggaacca aaaggctcaa caatacgaaa 240
cgttcgcttt cggtcctgat gaaagagatg tccctgaatc atcatctaag taagttttat 300
ggtaagctcg accaggacag tgccaccaca attttggagg attacaagaa c 361
<210> 19
<211> 351
<212> ДНК
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 19
gtgcgtggcg agttttacaa agaaccccac atcatcaatg cctaaatggc gggtattttc 60
atccaaaccc aaccgcgcat cattccaatg ctgatccacc ccatccggat aaaccaccat 120
gaacggcaac ggatcaaaag tcctgttggt gaagctgcgc cccacagatc ctgactgctg 180
ggagccatga aaatagatca gcgcatccgt ggtggaacca aaaggctcaa caatacgaaa 240
cgttcgcttt cggtcctgat gaaagagatg tccctgaatc atcatctaag ttaaatgtat 300
ggtaagctcg accaggacag tgccaccaca attttggagg attacaagaa c 361
<210> 20
<211> 351
<212> ДНК
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 20
gtgcgtggcg agttttacaa agaaccccac atcatcaatg cctaaatggc gggtattttc 60
atccaaaccc aaccgcgcat cattccaatg ctgatccacc ccatccggat aaaccaccat 120
gaacggcaac ggatcaaaag tcctgttggt gaagctgcgc cccacagatc ctgactgctg 180
ggagccatga aaatagatca gcgcatccgt ggtggaacca aaaggctcaa caatacgaaa 240
cgttcgcttt cggtcctgat gaaagagatg tccctgaatc atcatctaag tggattgtat 300
ggtaagctcg accaggacag tgccaccaca attttggagg attacaagaa c 361
<210> 21
<211> 351
<212> ДНК
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 21
gtgcgtggcg agttttacaa agaaccccac atcatcaatg cctaaatggc gggtattttc 60
atccaaaccc aaccgcgcat cattccaatg ctgatccacc ccatccggat aaaccaccat 120
gaacggcaac ggatcaaaag tcctgttggt gaagctgcgc cccacagatc ctgactgctg 180
ggagccatga aaatagatca gcgcatccgt ggtggaacca aaaggctcaa caatacgaaa 240
cgttcgcttt cggtcctgat gaaagagatg tccctgaatc atcatctaag tcaaactcat 300
ggtaagctcg accaggacag tgccaccaca attttggagg attacaagaa c 361
<210> 22
<211> 351
<212> ДНК
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 22
gtgcgtggcg agttttacaa agaaccccac atcatcaatg cctaaatggc gggtattttc 60
atccaaaccc aaccgcgcat cattccaatg ctgatccacc ccatccggat aaaccaccat 120
gaacggcaac ggatcaaaag tcctgttggt gaagctgcgc cccacagatc ctgactgctg 180
ggagccatga aaatagatca gcgcatccgt ggtggaacca aaaggctcaa caatacgaaa 240
cgttcgcttt cggtcctgat gaaagagatg tccctgaatc atcatctaag ttacaaatct 300
ggtaagctcg accaggacag tgccaccaca attttggagg attacaagaa c 361
<210> 23
<211> 351
<212> ДНК
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 23
gtgcgtggcg agttttacaa agaaccccac atcatcaatg cctaaatggc gggtattttc 60
atccaaaccc aaccgcgcat cattccaatg ctgatccacc ccatccggat aaaccaccat 120
gaacggcaac ggatcaaaag tcctgttggt gaagctgcgc cccacagatc ctgactgctg 180
ggagccatga aaatagatca gcgcatccgt ggtggaacca aaaggctcaa caatacgaaa 240
cgttcgcttt cggtcctgat gaaagagatg tccctgaatc atcatctaag ttatcagtct 300
ggtaagctcg accaggacag tgccaccaca attttggagg attacaagaa c 361
<210> 24
<211> 351
<212> ДНК
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 24
gtgcgtggcg agttttacaa agaaccccac atcatcaatg cctaaatggc gggtattttc 60
atccaaaccc aaccgcgcat cattccaatg ctgatccacc ccatccggat aaaccaccat 120
gaacggcaac ggatcaaaag tcctgttggt gaagctgcgc cccacagatc ctgactgctg 180
ggagccatga aaatagatca gcgcatccgt ggtggaacca aaaggctcaa caatacgaaa 240
cgttcgcttt cggtcctgat gaaagagatg tccctgaatc atcatctaag tcgaggatat 300
ggtaagctcg accaggacag tgccaccaca attttggagg attacaagaa c 361
<210> 25
<211> 351
<212> ДНК
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 25
gtgcgtggcg agttttacaa agaaccccac atcatcaatg cctaaatggc gggtattttc 60
atccaaaccc aaccgcgcat cattccaatg ctgatccacc ccatccggat aaaccaccat 120
gaacggcaac ggatcaaaag tcctgttggt gaagctgcgc cccacagatc ctgactgctg 180
ggagccatga aaatagatca gcgcatccgt ggtggaacca aaaggctcaa caatacgaaa 240
cgttcgcttt cggtcctgat gaaagagatg tccctgaatc atcatctaag tccttgttat 300
ggtaagctcg accaggacag tgccaccaca attttggagg attacaagaa c 361
<210> 26
<211> 41
<212> ДНК
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 26
caggaaacag ctatgacatg ttccagccat cgccaaataa g 41
<210> 27
<211> 22
<212> ДНК
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 27
acttagatga tgattcaggg ac 22
<210> 28
<211> 51
<212> ДНК
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 28
ccctgaatca tcatctaagt acaaaaggtg gtaagctcga ccaggacagt g 51
<210> 29
<211> 51
<212> ДНК
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 29
ccctgaatca tcatctaagt taaatgtatg gtaagctcga ccaggacagt g 51
<210> 30
<211> 51
<212> ДНК
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 30
ccctgaatca tcatctaagt ccttgttatg gtaagctcga ccaggacagt g 51
<210> 31
<211> 43
<212> ДНК
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 31
tgtaaaacga cggccagtgc tgtactggac tgccttttga acg 43
<210> 32
<211> 19
<212> ДНК
<213> Плазмида
<400> 32
gcactggccg tcgttttac 19
<210> 33
<211> 24
<212> ДНК
<213> Плазмида
<400> 33
catgtcatag ctgtttcctg tgtg 24
<210> 34
<211> 1331
<212> ДНК
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 34
cctgatgcgg tattttctcc gtgcgtggcg agttttacaa agaaccccac atcatcaatg 60
cctaaatggc gggtattttc atccaaaccc aaccgcgcat cattccaatg ctgatccacc 120
ccatccggat aaaccaccat gaacggcaac ggatcaaaag tcctgttggt gaagctgcgc 180
cccacagatc ctgactgctg ggagccatga aaatagatca gcgcatccgt ggtggaacca 240
aaaggctcaa caatacgaaa cgttcgcttt cggtcctgat gaaagagatg tccctgaatc 300
atcatctaag tatgcatctc ggtaagctcg accaggacag tgccaccaca attttggagg 360
attacaagaa catgaccaac atccgcgtag ctatcgtggg ctacggaaac ctgggacgca 420
gcgtcgaaaa gcttattgcc aagcagcccg acatggacct tgtaggaatc ttctcgcgcc 480
gggccaccct cgacacaaag acgccagtct ttgatgtcgc cgacgtggac aagcacgccg 540
acgacgtgga cgtgctgttc ctgtgcatgg gctccgccac cgacatccct gagcaggcac 600
caaagttcgc gcagttcgcc tgcaccgtag acacctacga caaccaccgc gacatcccac 660
gccaccgcca ggtcatgaac gaagccgcca ccgcagccgg caacgttgca ctggtctcta 720
ccggctggga tccaggaatg ttctccatca accgcgtcta cgcagcggca gtcttagccg 780
agcaccagca gcacaccttc tggggcccag gtttgtcaca gggccactcc gatgctttgc 840
gacgcatccc tggcgttcaa aaggcagtcc agtacaccct cccatccgaa gacgccctgg 900
aaaaggcccg ccgcggcgaa gccggcgacc ttaccggaaa gcaaacccac aagcgccaat 960
gcttcgtggt tgccgacgcg gccgatcacg agcgcatcga aaacgacatc cgcaccatgc 1020
ctgattactt cgttggctac gaagtcgaag tcaacttcat cgacgaagca accttcgact 1080
ccgagcacac cggcatgcca cacggtggcc acgtgattac caccggcgac accggtggct 1140
tcaaccacac cgtggaatac atcctcaagc tggaccgaaa cccagatttc accgcttcct 1200
cacagatcgc tttcggtcgc gcagctcacc gcatgaagca gcagggccaa agcggagctt 1260
tcaccgtcct cgaagttgct ccatacctgc tctccccaga gaacttggac gatctgatcg 1320
cacgcgacgt c 1331
<210> 35
<211> 5938
<212> ДНК
<213> Плазмида
<400> 35
atctgatcgc acgcgacgtc ggcggtggct ctggaggtgg tgggtccggc ggtggctctg 60
cttcctccga agacgttatc aaagagttca tgcgtttcaa agttcgtatg gaaggttccg 120
ttaacggtca cgagttcgaa atcgaaggtg aaggtgaagg tcgtccgtac gaaggtaccc 180
agaccgctaa actgaaagtt accaaaggtg gtccgctgcc gttcgcttgg gacatcctgt 240
ccccgcagtt ccagtacggt tccaaagctt acgttaaaca cccggctgac atcccggact 300
acctgaaact gtccttcccg gaaggtttca aatgggaacg tgttatgaac ttcgaagacg 360
gtggtgttgt taccgttacc caggactcct ccctgcaaga cggtgagttc atctacaaag 420
ttaaactgcg tggtaccaac ttcccgtccg acggtccggt tatgcagaaa aaaaccatgg 480
gttgggaagc ttccaccgaa cgtatgtacc cggaagacgg tgctctgaaa ggtgaaatca 540
aaatgcgtct gaaactgaaa gacggtggtc actacgacgc tgaagttaaa accacctaca 600
tggctaaaaa accggttcag ctgccgggtg cttacaaaac cgacatcaaa ctggacatca 660
cctcccacaa cgaagactac accatcgttg aacagtacga acgtgctgaa ggtcgtcact 720
ccaccggtgc ttaactgcag gcatgcaagc ttggctgttt tggcggatga gagaagattt 780
tcagcctgat acagattaaa tcagaacgca gaagcggtct gataaaacag aatttgcctg 840
gcggcagtag cgcggtggtc ccacctgacc ccatgccgaa ctcagaagtg aaacgccgta 900
gcgccgatgg tagtgtgggg tctccccatg cgagagtagg gaactgccag gcatcaaata 960
aaacgaaagg ctcagtcgaa agactgggcc tttcgtttta tctgttgttt gtcggtgaac 1020
gctctcctga gtaggacaaa tccgccggga gcggatttga acgttgcgaa gcaacggccc 1080
ggagggtggc gggcaggacg cccgccataa actgccaggc atcaaattaa gcagaaggcc 1140
atcctgacgg atggcctttt tgcgtttcta caaactcttt ttgtttattt ttctaaatac 1200
attcaaatat gtatccgctc atgaattaat tccgctagat gacgtgcggc ttcgacctcc 1260
tgggcgtggc gcttgttggc gcgctcgcgg ctggctgcgg cacgacacgc gtctgagcag 1320
tattttgcgc gccgtcctcg tgggtcaggc cggggtggga tcaggccacc gcagtaggcg 1380
cagctgatgc gatcctccac tactgcgcgt cctcctggcg ctgccgagca cgcagctcgt 1440
cggccagctc ttcaaggtcg gccacaagcg tttctaggtc gctcgcggca cttgcccagt 1500
cgcgtgatgc tggcgcgtct gtcgtatcga gggcgcggaa aaatccgatc accgttttta 1560
aatcgacggc ggcatcgagt gcgtcggact ccagcgcgac atcggagaga tccaccgctg 1620
atgcttcagg ccagttttgg tacttcgtcg tgaaggtcat gacaccatta taacgaacgt 1680
tcgttaaaaa ttctagcccc aattctgata atttcttccg gcactcctgc gaaaacctgc 1740
gagacttctt gcccagaaaa aacgccaagc gcagcggtta ccgcactttt tttccaggtg 1800
atttcaccct gaccagcgaa gcggcacttt agtgcatgag gtgtgcccct ggtttcccct 1860
ctttggaggg ttcaacccaa aaaagcacac aagcaaaaat gaaaatcatc atgagcaagt 1920
tggtgcgaag cagcaacgcg ctagctccaa aaaggtctcc aggatctcga ggagattttt 1980
gagggggagg gagtcgagga agagccagag cagaaggcgg ggaaccgttc tctgccgaca 2040
gcgtgagccc cccttaaaaa tcaggccggg gaggaaccgg ggagggatca gagctaggag 2100
cgagacaccc taaagggggg gaaccgtttt ctgctgacgg tgtttcgttt attagttttc 2160
agcccgtgga tagcggaggg tgagggcaag tgagagccag agcaaggacg ggacccctaa 2220
aggggggaac cgttttctgc tgacggtgtt tcgtttatta gttttcagcc cgtggacggc 2280
cgcgtttagc ttccattcca agtgcctttc tgacttgttg gatgcgcctt tcactgacac 2340
ctagttcgcc tgcaagctca cgagtcgagg gatcagcaac cgattgagaa cgggcatcca 2400
ggatcgcagt tttgacgcga agttcgagca actcgcctgt catttctcgg cgtttgtttg 2460
cttccgctaa tcgctgtcgc gtctcctgcg catacttact ttctgggtca gcccatctgc 2520
gtgcattcga tgtagctgcg ccccgtcgcc ccatcgtcgc tagagctttc cgccctcggc 2580
tgctctgcgt ttccacccga cgagcaggga cgactggctg gcctttagcc acgtagccgc 2640
gcacacgacg cgccatcgtc aggcgatcac gcatggcggg aagatccggc tcccggccgt 2700
ctgcaccgac cgcctgggca acgttgtacg ccacttcata cgcgtcgatg atcttggcat 2760
cttttaggcg ctcaccagca gctttgagct ggtatcccac ggtcaacgcg tggcgaaacg 2820
cggtctcgtc gcgcgctcgc tctggatttg tccagagcac tcgcacgccg tcgatcaggt 2880
cgccggacgc gtccagggcg ctcggcaggc tcgcgtccaa aatcgctagc gccttggctt 2940
ctgcggtggc gcgttgtgcc gcttcaatgc gggcgcgtcc gctggaaaag tcctgctcaa 3000
tgtacttttt cggcttctgt gatccggtca tcgttcgagc aatctccatt aggtcggcca 3060
gccgatccac acgatcatgc tggcagtgcc atttataggc tgtcggatcg tctgagacgt 3120
gcagcggcca ccggctcagc ctatgcgaaa aagcctggtc agcgccgaaa acacgagtca 3180
tttcttccgt cgttgcagcc agcaggcgca tatttgggct ggttttacct gctgcggcat 3240
acaccgggtc aatgagccag atgagctggc atttcccgct cagcggattc acgccgatcc 3300
aagccggcgc tttttctagg cgtgcccatt tctctaaaat cgcgtagacc tgcgggttta 3360
cgtgctcaat cttcccgccg gcctggtggc tgggcacatc gatgtcaagc acgatcaccg 3420
cggcatgttg cgcgtgcgtc agcgcaacgt actggcaccg cgtcagcgct tttgagccag 3480
cccggtagag ctttggttgg gtttcgccgg tatccgggtt tttaatccag gcgctcgcga 3540
aatctcttgt cttgctgccc tggaagcttt cgcgtcccag gtgagcgagc agttcgcggc 3600
gatcttctgc cgtccagccg cgtgagccgc agcgcatagc ttcggggtgg gtgtcgaaca 3660
gatcggcgga caatttccac gcgctagctg tgactgtgtc ctgcggatcg gctagagtca 3720
tgtcttgagt gctttctccc agctgatgac tgggggttag ccgacgccct gtgagttccc 3780
gctcacgggg cgttcaactt tttcaggtat ttgtgcagct tatcgtgttt tcttcgtaaa 3840
tgaacgctta actaccttgt taaacgtggc aaataggcag gattgatggg gatctagctt 3900
cacgctgccg caagcactca gggcgcaagg gctgctaaag gaagcggaac acgtagaaag 3960
ccagtccgca gaaacggtgc tgaccccgga tgaatgtcag ctactgggct atctggacaa 4020
gggaaaacgc aagcgcaaag agaaagcagg tagcttgcag tgggcttaca tggcgatagc 4080
tagactgggc ggttttatgg acagcaagcg aaccggaatt gccagctggg gcgccctctg 4140
gtaaggttgg gaagccctgc aaagtaaact ggatggcttt cttgccgcca aggatctgat 4200
ggcgcagggg atcaagatct gatcaagaga caggatgagg atcgtttcgc atgattgaac 4260
aagatggatt gcacgcaggt tctccggccg cttgggtgga gaggctattc ggctatgact 4320
gggcacaaca gacaatcggc tgctctgatg ccgccgtgtt ccggctgtca gcgcaggggc 4380
gcccggttct ttttgtcaag accgacctgt ccggtgccct gaatgaactc caagacgagg 4440
cagcgcggct atcgtggctg gccacgacgg gcgttccttg cgcagctgtg ctcgacgttg 4500
tcactgaagc gggaagggac tggctgctat tgggcgaagt gccggggcag gatctcctgt 4560
catctcacct tgctcctgcc gagaaagtat ccatcatggc tgatgcaatg cggcggctgc 4620
atacgcttga tccggctacc tgcccattcg accaccaagc gaaacatcgc atcgagcgag 4680
cacgtactcg gatggaagcc ggtcttgtcg atcaggatga tctggacgaa gagcatcagg 4740
ggctcgcgcc agccgaactg ttcgccaggc tcaaggcgcg gatgcccgac ggcgaggatc 4800
tcgtcgtgac ccatggcgat gcctgcttgc cgaatatcat ggtggaaaat ggccgctttt 4860
ctggattcat cgactgtggc cggctgggtg tggcggaccg ctatcaggac atagcgttgg 4920
ctacccgtga tattgctgaa gagcttggcg gcgaatgggc tgaccgcttc ctcgtgcttt 4980
acggtatcgc cgctcccgat tcgcagcgca tcgccttcta tcgccttctt gacgagttct 5040
tctgagcggg actctggggt tcgcggaatc atgaccaaaa tcccttaacg tgagttttcg 5100
ttccactgag cgtcagaccc cgtagaaaag atcaaaggat cttcttgaga tccttttttt 5160
ctgcgcgtaa tctgctgctt gcaaacaaaa aaaccaccgc taccagcggt ggtttgtttg 5220
ccggatcaag agctaccaac tctttttccg aaggtaactg gcttcagcag agcgcagata 5280
ccaaatactg tccttctagt gtagccgtag ttaggccacc acttcaagaa ctctgtagca 5340
ccgcctacat acctcgctct gctaatcctg ttaccagtgg ctgctgccag tggcgataag 5400
tcgtgtctta ccgggttgga ctcaagacga tagttaccgg ataaggcgca gcggtcgggc 5460
tgaacggggg gttcgtgcac acagcccagc ttggagcgaa cgacctacac cgaactgaga 5520
tacctacagc gtgagctatg agaaagcgcc acgcttcccg aagggagaaa ggcggacagg 5580
tatccggtaa gcggcagggt cggaacagga gagcgcacga gggagcttcc agggggaaac 5640
gcctggtatc tttatagtcc tgtcgggttt cgccacctct gacttgagcg tcgatttttg 5700
tgatgctcgt caggggggcg gagcctatgg aaaaacgcca gcaacgcggc ctttttacgg 5760
ttcctggcct tttgctggcc ttttgctcac atgttctttc ctgcgttatc ccctgattct 5820
gtggataacc gtattaccgc ctttgagtga gctgataccg ctcgccgcag ccgaacgacc 5880
gagcgcagcg agtcagtgag cgaggaagcg gaagagcgcc tgatgcggta ttttctcc 6134
<210> 36
<211> 13
<212> ПРТ
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 36
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 37
<211> 39
<212> ДНК
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 37
ggcggtggct ctggaggtgg tgggtccggc ggtggctct 39
<210> 38
<211> 351
<212> ДНК
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 38
gtgcgtggcg agttttacaa agaaccccac atcatcaatg cctaaatggc gggtattttc 60
atccaaaccc aaccgcgcat cattccaatg ctgatccacc ccatccggat aaaccaccat 120
gaacggcaac ggatcaaaag tcctgttggt gaagctgcgc cccacagatc ctgactgctg 180
ggagccatga aaatagatca gcgcatccgt ggtggaacca aaaggctcaa caatacgaaa 240
cgttcgcttt cggtcctgat gaaagagatg tccctgaatc atcatctaag tatgcattgt 300
ggtaagctcg accaggacag tgccaccaca attttggagg attacaagaa c 351
<---
Claims (32)
1. Полинуклеотид, обладающий промоторной активностью, где полинуклеотид представляет собой мутант полинуклеотида, имеющего последовательность, представленную в SEQ ID NO: 9, причем мутант имеет в позициях 292-300 последовательности, представленной в SEQ ID NO: 9, нуклеотидную последовательность, выбранную из любой из следующих групп:
(a) ACAAAAGGT;
(b) TCTTCATCT;
(c) GGAAAGTAT;
(d) TTATTATAT;
(e) TAATCCTCT;
(f) TCAATTTAT;
(g) GCGCAATCT;
(h) CAGTTCCGT;
(i) AAGTTTTAT;
(g) TAAATGTAT;
(k) GGATTGTAT;
(l) CAAACTCAT;
(m) TACAAATCT;
(n) TATCAGTCT;
(o) CGAGGATAT;
(p) CCTTGTTAT.
2. Полинуклеотид, обладающий промоторной активностью, по п. 1, где мутант обладает повышенной промоторной активностью в 18 или более раз по сравнению с полинуклеотидом, имеющим последовательность, представленную в SEQ ID NO: 9.
3. Экспрессионная транскрипционная кассета, содержащая полинуклеотид, обладающий промоторной активностью, по любому из пп. 1, 2.
4. Экспрессионная транскрипционная кассета по п. 3, которая дополнительно содержит ген, кодирующий белок, который функционально лигирован с полинуклеотидом, обладающим промоторной активностью.
5. Экспрессионная транскрипционная кассета по п. 4, где белок представляет собой фермент, участвующий в синтезе аминокислоты и ее производных.
6. Рекомбинантный вектор экспрессии, содержащий полинуклеотид, обладающий промоторной активностью, по любому из пп. 1, 2, или экспрессионную транскрипционную кассету по любому из пп. 3-5.
7. Рекомбинантный вектор экспрессии по п. 6, содержащий экспрессионную транскрипционную кассету по п. 5.
8. Рекомбинантная клетка-хозяин для продуцирования аминокислоты и ее производных, содержащая экспрессионную транскрипционную кассету по п. 5 или рекомбинантный вектор экспрессии по п. 7.
9. Рекомбинантная клетка-хозяин по п. 8, которая относится к роду Corynebacterium, роду Brevibacterium, роду Arthrobacterium, роду Microbacterium или роду Escherichia; предпочтительно, клетка-хозяин представляет собой Corynebacterium glutamicum; более предпочтительно, клетка-хозяин представляет собой Corynebacterium glutamicum ATCC 13032, Corynebacterium glutamicum ATCC 13869, Corynebacterium glutamicum ATCC 14067 или их производные штаммы.
10. Применение рекомбинантного вектора экспрессии по п. 7 или рекомбинантной клетки-хозяина по любому из пп. 8, 9 при получении аминокислоты и ее производных;
необязательно аминокислота и ее производные выбраны из одного или комбинации двух или более из следующего: пролина, гидроксипролина, лизина, глутаминовой кислоты, аргинина, орнитина, глутамина, треонина, глицина, аланина, валина, лейцина, изолейцина, серина, цистеина, метионина, аспарагиновой кислоты, аспарагина, гистидина, фенилаланина, тирозина, триптофана, 5-аминолевулиновой кислоты или производных любой из вышеуказанных аминокислот;
предпочтительно аминокислота включает L-лизин и его производные, где производные включают по меньшей мере одно из пентандиамина, 5-аминопентановой кислоты и глутаровой кислоты.
11. Способ повышения экспрессии целевого гена, включающий стадию функционального лигирования полинуклеотида, обладающего промоторной активностью, по любому из пп. 1, 2, с целевой РНК или целевым геном; причем необязательно целевая РНК содержит по меньшей мере одну из тРНК (транспортная РНК) и мРНК (малая РНК), а целевой ген содержит по меньшей мере один из гена, кодирующего белок, связанный с синтезом целевого продукта, гена, кодирующего белок-регулятор экспрессии гена, и гена, кодирующего белок, связанный с мембранным транспортом.
12. Способ получения аминокислоты и ее производных, включающий осуществление экспрессии фермента, участвующего в синтезе аминокислоты и ее производных, при помощи экспрессионной транскрипционной кассеты по п. 5, рекомбинантного вектора экспрессии по п. 7 или рекомбинантной клетки-хозяина по любому из пп. 8, 9, и использование фермента, участвующего в синтезе аминокислоты и ее производных, для получения аминокислоты и ее производных; необязательно аминокислота и ее производные выбраны из одного или комбинации двух или более из: пролина, гидроксипролина, лизина, глутаминовой кислоты, аргинина, орнитина, глутамина, треонина, глицина, аланина, валина, лейцина, изолейцина, серина, цистеина, метионина, аспарагиновой кислоты, аспарагина, гистидина, фенилаланина, тирозина, триптофана, 5-аминолевулиновой кислоты или производных любой из вышеуказанных аминокислот;
предпочтительно аминокислота включает L-лизин и его производные, где производные включают по меньшей мере один из пентандиамина, 5-аминопентановой кислоты и глутаровой кислоты;
предпочтительно фермент, участвующий в синтезе аминокислоты, представляет собой диаминопимелатдегидрогеназу.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202010838604.9 | 2020-08-19 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2815942C1 true RU2815942C1 (ru) | 2024-03-25 |
Family
ID=
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2125608C1 (ru) * | 1995-12-28 | 1999-01-27 | Общество с ограниченной ответственностью фирма "ЦЕОЛИТ" | Способ получения l-лизина |
| RU2204605C2 (ru) * | 1993-12-08 | 2003-05-20 | Адзиномото Ко., Инк. | Ферментационный способ получения l-лизина |
| JP2009261262A (ja) * | 2008-04-22 | 2009-11-12 | Toray Ind Inc | Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチド、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよびｄ−乳酸の製造方法 |
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2204605C2 (ru) * | 1993-12-08 | 2003-05-20 | Адзиномото Ко., Инк. | Ферментационный способ получения l-лизина |
| RU2125608C1 (ru) * | 1995-12-28 | 1999-01-27 | Общество с ограниченной ответственностью фирма "ЦЕОЛИТ" | Способ получения l-лизина |
| JP2009261262A (ja) * | 2008-04-22 | 2009-11-12 | Toray Ind Inc | Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチド、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよびｄ−乳酸の製造方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| DONG X., ZHAO Y., HU J., LI Y., WANG X. Attenuating l-lysine production by deletion of ddh and lysE and their effect on l-threonine and l-isoleucine production in Corynebacterium glutamicum. Enzyme Microb Technol. 2016 Nov; 93-94, p.70-78. doi: 10.1016/j.enzmictec.2016.07.013. BOYLE-VAVRA S., DE JONGE B.L., EBERT C.C., DAUM R.S. Cloning of the staphylococcus aureus ddh gene encoding nad+-dependent d-lactate dehydrogenase and insertional inactivation in a glycopeptide-resistant isolate. J. bacteriol. 1997 NOV; 179(21), p.6756-6763. DOI: 10.1128/JB.179.21.6756-6763.1997. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN113201536B (zh) | 具有启动子活性的多核苷酸及其在生产氨基酸中的应用 | |
| JP2020524492A (ja) | Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ由来のプロモーターおよび補助遺伝子発現の制御におけるその使用 | |
| CN112695036B (zh) | 一种天冬氨酸激酶基因表达调控序列及其应用 | |
| US8187842B2 (en) | Altered glyoxylate shunt for improved production of aspartate-derived amino acids and chemicals | |
| CN103975069A (zh) | 通过使用AlkB烷烃1-单加氧酶氧化烷烃的方法 | |
| EP4183880A1 (en) | Mutant of glutamate dehydrogenase gene promoter and application thereof | |
| US10501503B2 (en) | Modified membrane permeability | |
| US20230272366A1 (en) | Mutant of Pyruvate Carboxylase Gene Promoter and Use Thereof | |
| RU2815942C1 (ru) | Полинуклеотид, обладающий промоторной активностью, и применение полинуклеотида для получения аминокислоты | |
| EP4092040A1 (en) | Microorganism that produces lysine and method for producing lysine | |
| US20230332116A1 (en) | Polypeptide with aspartate kinase activity and use thereof in production of amino acid | |
| CN112442475B (zh) | 一种l-谷氨酸生产菌株及其构建方法与应用 | |
| RU2812048C1 (ru) | Мутант промотора гена пируваткарбоксилазы и его применение | |
| RU2812048C9 (ru) | Мутант промотора гена пируваткарбоксилазы и его применение | |
| US20240084314A1 (en) | Mdh gene-based polynucleotide having promoter activity and use thereof | |
| RU2797843C1 (ru) | Микроорганизм, продуцирующий лизин, и способ продуцирования лизина | |
| CN1607246A (zh) | 生产l－型苏氨酸的方法 | |
| CN108866091B (zh) | 提高沼泽红假单胞菌角鲨烯含量用质粒及制备和使用方法 | |
| CN115490761B (zh) | 基于赖氨酸外排蛋白构建的重组微生物及生产赖氨酸的方法 | |
| WO2022257757A1 (zh) | 基于dapB基因的具有启动子活性的多核苷酸及其用途 | |
| KR100531672B1 (ko) | 표적 유전자 증폭을 위한 젠타마이신 내성 유전자를포함하는 코리네박테리움 벡터, 숙주세포 내의 표적유전자 파괴에 이용될 수 있는 벡터 및 이들 2종의 벡터를이용하여 형질전환된 숙주 세포를 선발하는 방법 | |
| CN106834333B (zh) | 一种能高效表达中性蛋白酶的质粒、其构建方法及其应用 | |
| CN114717233A (zh) | 一种双sgRNA结合RecET系统敲除盐单胞菌DNA大片段的方法 | |
| CN115506035A (zh) | 启动子突变体文库的构建方法及启动子突变体文库 | |
| CN115746110A (zh) | 一种转录调控因子LysG的突变体及其应用 |