KR100531672B1 - 표적 유전자 증폭을 위한 젠타마이신 내성 유전자를포함하는 코리네박테리움 벡터, 숙주세포 내의 표적유전자 파괴에 이용될 수 있는 벡터 및 이들 2종의 벡터를이용하여 형질전환된 숙주 세포를 선발하는 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 코리네박테리움 글루타미쿰 및 대장균에서 복제되며, 젠타마이신 내성 유전자를 갖는 셔틀 벡터를 제공한다. 또한, 본 발명은 대장균에서 복제되고, 젠타마이신 내성 유전자, 하나이상의 클로닝 부위 및 바실러스 서브틸러스 레반수크라제 유전자 sacB를 갖는 벡터를 제공한다. 본 발명의 벡터는 숙주세포의 표적 유전자를 파괴하는데 유용하게 사용될 수 있다.

Description

표적 유전자 증폭을 위한 젠타마이신 내성 유전자를 포함하는 코리네박테리움 벡터, 숙주세포 내의 표적 유전자 파괴에 이용될 수 있는 벡터 및 이들 2종의 벡터를 이용하여 형질전환된 숙주 세포를 선발하는 방법{A Corynebacterium vector containing Gentamicin resistant gene for target gene amplification, a vector for disrupting a target gene in a host cell and method for selecting the transformed host cell using the above vectors}

본 발명은 젠타마이신 내성 유전자를 포함하는 대장균-코리네박테리움 셔틀벡터를 제공하며, 또한 젠타마이신 내성 유전자를 포함하며 숙주세포의 표적유전자 파괴에 이용될 수 있는 벡터, 이들 벡터를 이용한 후 젠타마이신을 이용하여 형질전환된 숙주세포를 선별하는 방법을 제공한다.

코리네박테리움은 글루타메이트, 라이신과 같은 아미노산 및 이노신산과 같은 퓨린 계열의 핵산의 생산균주로서 널리 알려져 있는 그람 양성 세균이다.

최근 이러한 아미노산 또는 핵산을 효율적으로 생산하는 코리네박테리움 균주를 육종하고자 하는 연구가 진행되고 있다. 이러한 육종 방법에는 재조합 DNA 기술을 이용하는 유전공학적 방법이 포함된다. 이러한 유전공학적 방법은 외래 유전자를 숙주세포에 도입하거나 숙주세포내의 유전자를 조작하는데 사용되는 벡터 시스템이 필수적으로 요구되고 있다. 종래 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum)에서 사용될 수 있는 벡터 시스템의 예로서는, pCG1 (일본특허공보 제57-134500호), pCG2 (일본특허공보 제58-35197호), pCG4 (일본특허공보 제57-183799호), pAM330과 pAM286 (일본특허공보 제58-67699호) 및 pHM1519 (일본특허공보 제58-77895호) 등이 보고된 바 있다. 그러나, 상기 플라스미드는 적절한 선별마커로 작용하는 유전자를 가지고 있지 않았다.

이러한 단점을 보완하기 위하여 적절한 항생제 내성 유전자를 선별마커로 포함하고 있는 플라스미드 벡터들이 개발된 바 있다. 항생제 내성 유전자를 포함하는 벡터에는 예를 들면, 상기 pCG4 유래의 벡터로서 스트렙토마이신과 스펙티노마이신 내성 유전자 포함하고 있는 pCG11과 pCB101, 대장균 유래의 테트라싸이클린과 카나마이신 내성 유전자 포함하고 있는 pCE54, 대장균 유래의 클로람페니콜 내성 유전자 포함하고 있는 pAJ43과 pAJ655, 스타필로코커스 유래의 카나마이신 내성 유전자 포함하고 있는 pAJ440과 pAJ3148, 및 카나마이신 내성 유전자 포함하고 있는 pECCG122 (KFCC 10696)가 개시된 바 있다.

또한, 이들 항생제 내성 유전자 외에 코리네박테리움에서 게놈상의 유전자를 파괴 또는 교체하기 위한 벡터로써 바실러스 서브틸러스 (Bacillus subtilus)의 레반수크라제(levansucrase) 유전자 (sacB)를 포함하는 벡터, 예를 들면 pK*mobsacB가 알려진 바 있다(Gene,145(1994) 69-73). pK*mobsacB는 대장균에서 복제가 가능하며 mob 유전자를 통하여 대장균으로부터 코리네박테리움으로 이종접합(transconjugation)에 의하여 전달될 수 있는 벡터이다. 상기 벡터는 카나마이신 내성 유전자를 선별마커로 가지고 있고, sacB 유전자를 포함하고 있다. SacB 유전자는 그람 음성 세균과 일부의 그람 양성 세균에서 자당 감수성 (sucrose-sensitivity)를 부여한다. 따라서, 상기 sacB 유전자는 pK*mobsacB와 같은 벡터를 코리네박테리움에 도입하여 1차 상동 재조합을 유발시킨 다음 항생제 마커를 이용하여 선발하고, 선발된 균주를 자당을 포함하는 배지에서 2차적으로 선발함으로써 항생제 내성 유전자가 2차 상동 재조합에 의하여 제거된 균주를 선발하는데 유용하게 이용된다.

그러나, 종래 보고된 바에 의하면 코리네박테리움에서 선별마커로서 이용하고 있는 항생제의 종류는 카나마이신 (Kanamycin), 스펙티노마이신 (Spectinomycin), 스트렙토마이신 (Sterptomycin), 클로람페니콜 (Chloramphenicol), 및 테트라싸이클린 (Tetracyclin) 등으로 젠타마이신을 이용한 예는 없었다.

본 발명의 목적은 젠타마이신 내성 유전자를 포함하는 대장균-코리네박테리움 셔틀 벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 젠타마이신 내성 유전자를 포함하고, sacB 유전자를 포함하는 벡터를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명은 상기 벡터를 이용하여 숙주세포 내의 표적 유전자가 증폭되어 있는 숙주세포를 선별하는 방법을 제공한다.

본 발명의 또다른 목적은 상기 벡터를 이용하여 숙주세포 내의 표적 유전자가 파괴 또는 치환된 숙주세포를 선발하는 방법을 제공한다.

본 발명은 코리네박테리움 글루타미쿰 및 대장균에서 복제되며, 젠타마이신 내성 유전자를 갖는 셔틀 벡터를 제공한다.

본 발명에 있어서, 젠타마이신 내성 유전자는 예를 들면, pBRINT-Gm 벡터 유래의 젠타마이신 아세틸트란스퍼라제 유전자 (aacC1)인 것일 수 있다.

본 발명에 있어서, pBRINT-Gm 벡터 유래의 다중클로닝부위(MCS)를 더 포함하는 것일 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터는 pECCG122 (KFCC 10696) 벡터 유래의 코리네박테리움 글루타미쿰 및 대장균 오리진을 더 포함하는 것일 수 있다. 상기 pECCG122 (KFCC 10696)는 한국특허 공개 제1992-0000933호에 개시되어 있으며, 상기 개시의 내용은 본 명세서에 원용에 의하여 그 전체로서 포함되어진다. 바람직하게는, 본 발명의 벡터는 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열을 갖는 셔틀 벡터 pEGm (KCCM-10533)이다.

본 발명의 셔틀 벡터의 제조의 일 예를 설명하면, 다음과 같다.

먼저, pBRINT-Gm 벡터를 Eag I으로 소화하여 젠타마이신 내성 유전자(aacC1)와 다중클로닝부위(MCS)를 포함하는 880 bp DNA 단편을 얻는다. 다음으로, pECCG122 (KFCC 10696)을 EcoRV로 절단하여 얻어지는 서열과 평활말단 연결함으로써, 젠타마이신 내성 유전자를 갖는 셔틀 벡터 pEGm를 제조할 수 있다. 이러한 pEGm 벡터는 젠타마이신 내성 유전자를 포함하고 있기 때문에, 외래 유전자가 삽입된 pEGm 벡터를 사용함으로써 숙주 세포에서 외래 유전자를 증폭하는데 유용하다.

본 발명은 또한, 대장균에서 복제되고, 젠타마이신 내성 유전자, 하나이상의 클로닝 부위 및 바실러스 서브틸러스 레반수크라제 유전자 sacB를 갖는 벡터를 제공한다.

본 발명에 있어서, 젠타마이신 내성 유전자는 예를 들면, pBRINT-Gm 벡터 유래의 젠타마이신 아세틸트란스퍼라제 유전자(aacC1)인 것일 수 있다.

본 발명에 있어서, "클로닝 부위"는 외래 유전자를 삽입할 수 있는 제한효소 인지 및/또는 절단 부위를 말하는 것으로, 임의의 제한 효소 부위가 될 수 있다. 상기 클로닝 부위는 바람직하게는, 다중클로닝부위(MCS)이고, 더 바람직하게는, pBRINT-Gm 벡터 유래의 다중클로닝부위(MCS)이다.

본 발명에 있어서, 상기 레반수크라제 유전자 sacB는 예를 들면, 바실러스 서브틸러스 마버그 168 (Bacillus subtilus Marburg 168)로부터 유래된 것일 수 있다. 바람직하게는, 상기 레반수크라제 유전자 sacB는 서브틸러스 마버그 168 (Bacillus subtilus Marburg 168)의 게놈 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 1과 서열번호 2의 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 사용한 PCR에 의하여 증폭되는 것이다. 이러한 레반수크라제 유전자 sacB는 그람-음성 및 일부의 그람-양성 세균에서 있어서 자당-감수성을 부여한다. 따라서, 상기 sacB 유전자를 포함하는 숙주세포는 자당을 포함하는 배지에서는 성장할 수 없다. 이러한 sacB 유전자의 특성은 항생제 마커를 사용하지 않고 표적 유전자를 파괴하는데 이용될 수 있다. 통상적으로 숙주세포 내의 표적 유전자를 재조합하는 과정은, 항생제 내성 마커를 포함하는 상동 재조합용 벡터를 숙주세포에 도입하고, 상기 벡터가 도입된 세포를 항생제 마커를 포함하는 배지에서 배양하여 항생제 마커에 내성을 갖는 숙주세포를 선발하는 단계를 포함한다. 그러나, 이 방법에 의하면 숙주세포는 항생제 내성 마커를 포함하고 있기 때문에 환경에 해로울 수 있으며, 추가의 외래 유전자를 포함하고 있기 때문에 발효 과정에서 세포에 부담을 가할 수 있다. 따라서, 상동 재조합이 도입된 숙주세포에서 상기 항생제 마커를 제거할 필요가 있는데, 이를 위하여 sacB 유전자가 이용된다. 즉, 상동 재조합용 벡터에 상기 sacB 유전자를 함께 도입하는 경우, 상동 재조합이 도입된 숙주세포를 1차적으로 항생제 마커로서 선발한 다음에, 2차적으로 자당을 포함하는 배지에서 배양하여, 2차적으로 재조합이 일어나 자당에 대한 민감성을 상실한 숙주세포를 선발할 수 있다.

본 발명에 있어서, 가장 바람직하게는, 상기 벡터는 서열번호 4의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 벡터 pBSG (KCCM-10532)이다.

본 발명의 대장균에서 복제되고, 젠타마이신 내성 유전자, 하나이상의 클로닝 부위 및 바실러스 서브틸러스 레반수크라제 유전자 sacB를 갖는 상기 벡터의 제조의 일예를 설명하면, 다음과 같다.

먼저, pBR322 벡터를 AhdI과 NdeI로 소화시켜, 대장균 오리진을 포함하는 1066 bp DNA 단편을 얻는다. 다음으로, pBRINT-Gm 벡터를 Eag I으로 소화하여 젠타마이신 내성 유전자(aacC1)와 다중클로닝부위(MCS)를 포함하는 880 bp DNA 단편을 얻는다. 상기 1066 bp DNA 단편과 880 bp DNA 단편을 연결함으로써, 젠타마이신 내성 유전자, 다중클로닝부위(MCS), 및 대장균 오리진을 포함하는 pBG를 제조한다. 서열번호 1과 2의 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 사용하고, 바실러스 서브틸러스 마버그168 (Bacillus subtilus Marburg 168)의 게놈을 주형으로 한 PCR을 수행함으로써 레반수크라제 sacB 유전자 DNA 단편을 얻고, 이를 상기 pBG를 SapI으로 처리한 다음, 클레나우 단편으로 처리하여 평활화하여 평활단편 연결함으로써, pBSG를 얻는다.

본 발명은 또한, 대장균에서 복제되고, 젠타마이신 내성 유전자, 하나이상의 클로닝 부위 및 바실러스 서브틸러스 레반수크라제 유전자 sacB를 갖는 본 발명의 상기 벡터에 숙주 세포내의 표적 유전자와 상동 재조합을 일으킬 수 있는 서열을 도입하여 상동재조합 벡터를 제조하는 단계;

상기 상동재조합 벡터를 숙주 세포에 도입하고 젠타마이신이 함유된 배지에서 배양하여 상기 상동재조합 벡터가 도입된 숙수 세포를 선발하는 단계; 및

상기 선발된 세포를 자당이 함유된 배지에서 배양하여 표적 유전자가 파괴 또는 치환된 숙주 세포를 선발하는 단계를 포함하는, 표적 유전자가 파괴 또는 치환된 숙주 세포를 선발하는 방법을 제공한다.

본 발명의 방법에 있어서, 숙주세포는 예를 들면, 에스케리키아 (Escherichia), 브레비박테리움 (Brevibacterium), 코리네박테리움 (Corynebacterium), 세라티아 (Serattia) 및 프로비덴시아 (Providentia) 속으로 이루어진 속의 군으로부터 선택되는 미생물인 것일 수 있다. 바람직하게는, 상기 숙주세포는 대장균 (Escherichia coli) 또는 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum)이다.

종래 상동 재조합 과정은 당업계에 잘 알려져 있다. 이러한 과정은 숙주 세포 내의 표적 유전자와 외래 유전자가 일정한 서열 상동을 갖는 경우, 상기 서열들 간에 서열의 교환이 일어나는 현상을 말한다. 이러한 경우, 상동 재조합되는 서열 중의 하나의 서열은 완전한 동일성을 갖는 것일 수도 있으나, 일부의 서열에서 상동성을 갖지 않는 경우에는 재조합 결과, 돌연변이가 유발될 수 있다. 본 발명에서 숙주 세포내의 표적 유전자와 상동 재조합을 일으킬 수 있는 상기 서열은 바람직하게는, 표적 유전자 내의 일부 서열이 제거되어 있는 것이다. 이러한 서열을 사용함으로써, 상동 재조합 결과, 활성이 없는 유전자를 도입시킬 수 있다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.

실시예

실시예 1 : 젠타마이신 내성 유전자를 갖는 셔틀 벡터 pEGm의 제조

본 실시예에서는 대장균에서 상용화되어 있는 젠타마이신 내성 유전자, 즉 젠타마이신 아세틸트란스퍼라제 유전자 aacC1을 포함하고, 코리네박테리움에서 복제 가능한 대장균-코리네박테리움 셔틀 벡터를 제조하였다. 다음으로, 상기 셔틀벡터가 코리네박테리움에서도 정상적으로 발현을 하는지 여부를 확인하고, 젠타마이신을 이용하여 형질전환체를 선별하는 경우 최적 선별 농도를 결정하였다.

먼저, 대장균에서 이용되는 pBRINT 벡터 시리즈(Gene, 172(1996) 65-69) 중 젠타마이신 내성 유전자, aacC1을 포함하고 있는 pBRINT-Gm 벡터를 제한효소 EagI (New England Biolab.; 이하 NEB)로 소화시켜 젠타마이신 내성 유전자(aacC1)와 다중클로닝부위(MCS)를 포함하는 880 bp DNA 단편을 얻었다. 얻어진 상기 880 bp DNA 단편에 클레나우 단편(klenow fragment) (NEB) 1 유니트를 1x NEB EcoPol 버퍼, 33μM dNTP에서 25 ℃에서 15분 동안 처리하여 평활말단화하였다. 이를 EcoRV (NEB)로 절단한 다음, 알칼리 포스파타제 (alkaline phosphatase)로 처리하여 말단의 인산기가 제거된 pECCG 122(KFCC 10696)와 연결하여 pEGm을 제조하였다. 상기 pEGm을 대장균 DH5α에 형질전환한 후 젠타마이신 10 mg/L가 함유된 LB 배지에서 선별하여, 젠타마이신 내성 유전자, aacC1가 삽입되었음을 확인하였다.

상기와 같이 제작된 pEGm 셔틀 벡터를 이용하여 코리네박테리움 글루타미쿰 (C.glutamicum) 야생주 ATCC 13032 균주에 Appl.Microbiol.Biotechnol.(1999) 52:541-545에 개시된 바와 같은 형질전환법을 이용하여 형질전환시켰다. 다음으로, 얻어진 pEGm으로 형질전환된 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032 균주를 카나마이신 또는 젠타마이신이 함유된 선별배지에서 배양하고, 그로부터 얻어지는 형질전환체의 개수를 비교함으로써 형질전환체를 선별할 수 있는 적절한 젠타마이신 농도를 결정하였다. 상기 선별용으로 사용된 선별배지는 표 1에 나타내었고, 상기 배지 중의 카나마이신 또는 젠타마이신 농도에 대하여 형성된 혈질전환체의 수는 표 2에 나타내었다.

표 1. 코리네박테리움의 형질전환체 선별배지

조 성	농 도
자당(sucrose)	20g/L
폴리펩톤	10g/L
이스트 익스트렉트	5g/L
암모늄 설페이트	5g/L
우레아	1.5g/L
포타슘 디히드로겐포스페이트	4g/L
디포타슘 히드로겐포스페이트	8g/L
마그네슘 설페이트	0.5g/L
d-비오틴	100㎍/L
티아민	1mg/L
브레인하트 인퓨전(Brain Heart Infusion)	18.5 g/L
소르비톨	91 g/L
박토-아가	10g/L

표 2. pEGm 형질전환체 선별 농도 비교

	Km 25mg/L	Gm* 2mg/L	Gm 4mg/L	Gm 6mg/L	Gm 8mg/L
C.glutamicum ATCC 13032	-	-	-	-	-
C.glutamicum ATCC 13032 (pEGm)	+++++	++++	+++	++	+

* Gm : 젠타마이신, Km : 카나마이신

표 2에 나타낸 바와 같이, pEGm 벡터를 코리네박테리움에 삽입할 경우의 젠타마이신에 의한 선별 가능 농도는 2 mg/L 이상으로 확인되었으며, 젠타마이신의 농도가 높아질수록 pEGm의 형질전환 효율이 감소함을 알 수 있었다. 이와 같은 결과로부터, 코리네박테리움에서의 젠타마이신 선별 농도는 2 mg/L이 적절한 것으로 판단하였다.

본 실시예에서 제조된 젠타마이신 내성을 갖는 셔틀 벡터 pEGm은 대장균 DH5α(pEGm)로 부다페스트 조약하의 국제기탁기관인 한국미생물보존센터에 2003년 11월 28일에 기탁하였다(수탁번호 : KCCM-10533).

실시예 2 : 젠타마이신 내성을 갖는 유전자를 포함하는 상동재조합용 벡터(pBSG)의 제조

실시예 1에서 제작된 젠타마이신 내성 유전자, aacC1를 포함하는 벡터로 형질전환된 코리네박테리움을 젠타마이신을 이용하여 선별하는 것이 가능함을 확인하였다. 본 실시예에서는 이를 바탕으로 젠타마이신 내성 유전자를 포함하고, 숙주세포 중의 표적 유전자를 파괴할 수 있는 벡터를 제작하였다.

먼저, 코리네박테리움에서는 복제가 되지 않으며 대장균에서만 복제가 될 수 있도록 대장균 벡터, pBR322 (NCBI GenBank J01749)를 제한효소 AhdI과 NdeI (NEB)로 처리하여, 대장균 오리진 부위를 포함하는 1066 bp DNA 단편을 얻었다. 다음으로, 대장균에서 이용되는 pBRINT 벡터 시리즈 (Gene, 172(1996) 65-69) 중 젠타마이신 내성 유전자, aacC1을 포함하고 있는 pBRINT-Gm 벡터를 제한효소 EagI (NEB)로 소화시켜 젠타마이신 내성 유전자, aacC1과 다중클로닝부위(MCS)를 포함하는 880 bp DNA 단편을 얻었다. 얻어진 상기 880 bp DNA 단편에 클레나우 단편(klenow fragment) (NEB) 1 유니트를 1x NEB EcoPol 버퍼, 33μM dNTP에서 25 ℃에서 15분 동안 처리하여 평활말단화하였다. 대장균 오리진을 포함하는 상기 1066 bp DNA 단편과 젠타마이신 내성 유전자(aacC1)와 다중클로닝부위를 포함하는 880 bp DNA 단편을 연결하여 pBG 벡터를 제작하였다. pBG 벡터으로 대장균을 형질전환하고, 젠타마이신 10 mg/L를 포함한 LB 배지에서 형질전환체를 선별하여, pBG 벡터로부터 aaaC1 유전자가 발현됨을 확인할 수 있었다.

다음으로, 바실러스 서브틸러스 마버그 168 (Baccilus subtilis Marburg168) 게놈 DNA을 주형으로 하고, 서열번호 1 및 2를 프라이머로 한 PCR 반응을 통하여 sacB 유전자(1.9Kb)를 증폭하였다. PCR 조건은 HL PCR-premix (바이오니아 사), 10 pmoles sacB 프라이머와 주형 DNA 20ng을 혼합한 후 95 ℃에서 5 분 동안 변성 과정을 거친 후, 95 ℃에서 30초 동안 변성, 50 ℃에서 30초 동안 어닐링, 72 ℃에서 2분 동안 연장의 과정을 30회 반복하여 수행되었다 (GeneAmpR PCR system 2700 : Applied Biosystems 사). 증폭된 sacB 유전자 1.9 kb의 말단부위를 클레나우 효소 처리를 통하여 평활말단으로 만든 다음, 이를 제한효소 SapI으로 처리 후 클레나우 효소 처리하고, 알칼리 포스파타제로 37℃에서 1시간 동안 반응을 거쳐 탈인산화된 pBG 벡터에 연결시켜 플라스미드 pBSG를 얻었다. 이를 포함한 대장균 DH5α(pBSG)를 부다페스트 조약하의 국제기탁기관인 한국 미생물 보존 센터 2003년 11월 28일에 기탁하였다 (수탁번호 : KCCM-10532).

본 실시예에서 제작된 pBSG 벡터는 코리네박테리움을 포함한, 여러 숙주세포에서 표적 유전자를 파괴하거나 치환하는데 유용하게 사용될 수 있다. 즉, 변형된 표적 유전자가 도입된 상기 pBSG를 숙주세포에 도입한 다음, 상기 벡터가 도입된 세포를 젠타마이신을 약 2 mg/L의 농도로 포함하는 배지에서 선별함으로써, 상기 표적 유전자가 파괴된 숙주 세포를 선별한다. 다음으로, 자당을 포함하는 배지에서 상기 숙주세포를 배양함으로써, 자당에 대하여 내성을 갖는 숙주세포를 추가로 선별하여 2차 상동 재조합이 일어나 항생제 마커가 불활성화된 숙주세포를 선별하는데 사용될 수 있다.

본 발명의 대장균-코리네박테리움 셔틀 벡터 (pEGm)에 의하면, 대장균과 코리네박테리움에 모두 복제되고, 젠타마이신 내성을 가지고 있기 때문에 코리네박테리움에서 표적 유전자를 증폭하는데 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명의 젠타마이신 내성 유전자 및 sacB 유전자를 포함하는 벡터 (pBSG)에 의하면, 숙주세포 내의 표적 유전자를 파괴 또는 치환하는데 유용하게 이용될 수 있다.

또한, 본 발명의 재조합 유전자로 형질전환된 숙주세포를 선별하는 방법하는 방법에 의하면, 젠타마이신을 이용하여 개량된 균주를 선별할 수 있다.

또한, 본 발명의 표적 유전자가 파괴 또는 치환된 숙주 세포를 선발하는 방법에 의하면, 기존에 알려진 항생제가 아닌 젠타마이신을 선별마커로 일차 형질전환된 숙주세포를 선별하고, 이차적으로 상기 젠타마이신 내성 유전자가 2차적 교차에 의하여 불활성화된 균주를 자당 내성을 이용하여 선별할 수 있다.

도 1은 본 발명의 pEGm 벡터의 작제 과정을 도시한 도면이다.

도 2는 본 발명의 pBSG 벡터의 작제 과정을 도시한 도면이다.

<110> CJ Corporation <120> A Corynebacterium vector containing Gentamicin resistant gene for target gene amplification, a vector for disrupting a target gene in a host cell and method for selecting the transformed host cell using the above vectors <130> PN052458 <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer : sacB-F <400> 1 gatccttttt aacccatcac atat 24 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer : sacB-R <400> 2 tcgtgatggc aggttgggcg tcgc 24 <210> 3 <211> 6012 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pEGm shuttle vector <400> 3 ttccggctgg ctggtttatt gctgataaat ctggagccgg tgagcgtggg tctcgcggta 60 tcattgcagc actggggcca gatggtaagc cctcccgtat cgtagttatc tacacgacgg 120 ggagtcaggc aactatggat gaacgaaata gacagatcgc tgagataggt gcctcactga 180 ttaagcattg gtaactgtca gaccaagttt actcatatat actttagatt gatttaaaac 240 ttcattttta atttaaaagg atctaggtga agatcctttt tgataatctc atgaccaaaa 300 tcccttaacg tgagttttcg 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ctgaggtctg cctcgtgaag aaggtgttgc 1200 tgactcatac caggcctgaa tcgccccatc atccagccag aaagtgaggg agccacggtt 1260 gatgagagct ttgttgtagg tggaccagtt ggtgattttg aacttttgct ttgccacgga 1320 acggtctgcg ttgtcgggaa gatgcgtgat ctgatccttc aactcagcaa aagttcgatt 1380 tattcaacaa agccacgttg tgtctcaaaa tctctgatgt tacattgcac aagataaaaa 1440 tatatcatca tgaacaataa aactgtctgc ttacataaac agtaatacaa ggggtgttat 1500 gagccatatt caacgggaaa cgtcttgctc gaggccgcga ttaaattcca acatggatgc 1560 tgatttatat gggtataaat gggctcgcga taatgtcggg caatcaggtg cgacaatcta 1620 tcgattgtat gggaagcccg atgcgccaga gttgtttctg aaacatggca aaggtagcgt 1680 tgccaatgat gttacagatg agatggtcag actaaactgg ctgacggaat ttatgcctct 1740 tccgaccatc aagcatttta tccgtactcc tgatgatgca tggttactca ccactgcgat 1800 ccccgggaaa acagcattcc aggtattaga agaatatcct gattcaggtg aaaatattgt 1860 tgatgcgctg gcagtgttcc tgcgccggtt gcattcgatt cctgtttgta attgtccttt 1920 taacagcgat cgcgtatttc gtctcgctca ggcgcaatca cgaatgaata acggtttggt 1980 tgatgcgagt gattttgatg acgagcgtaa tggctggcct gttgaacaag tctggaaaga 2040 aatgcataag cttttgccat tctcaccgga ttcagtcgtc actcatggtg atttctcact 2100 tgataacctt atttttgacg aggggaaatt aataggttgt attgatgttg gacgagtcgg 2160 aatcgcagac cgataccagg atcttgccat cctatggaac tgcctcggtg agttttctcc 2220 ttcattacag aaacggcttt ttcaaaaata tggtattgat aatcctgata tgaataaatt 2280 gcagtttcat ttgatgctcg atgagttttt ctaatcagaa ttggttaatt ggttgtaaca 2340 ctggcagagc attacgctga cttgacggga cggcggcttt gttgaataaa tcgaactttt 2400 gctgagttga aggatcagat cacgcatctt cccgacaacg cagaccgttc cgtggcaaag 2460 caaaagttca aaatcaccaa ctggtccacc tacaacaaag ctctcatcaa ccgtggctcc 2520 ctcactttct ggctggatga tggggcgatt caggcctggt atgagtcagc aacaccttct 2580 tcacgaggca gacctcagcg ctcaaagatg caggggtaaa agctaaccgc atctttaccg 2640 acaaggcatc cggcagttca acagatcggg aagggctgga tttgctgagg atgaaggtgg 2700 aggaaggtga tgtcattctg gtgaagaagc tcgaccgtct tggccgcgac accgccgaca 2760 tgatccaact gataaaagag tttgatgctc agggtgtagc ggttcggttt attgacgacg 2820 ggatcagtac cgacggtgat atggggcaaa tggtgcaatt aaccctcact aaagggaaca 2880 aaagctgggt accgggcccc ccctcgaggt cgacggtatc gataagcttg atggaagccg 2940 atctcggctt gaacgaattg ttaggtggcg gtacttgggt cgatatcaaa gtgcatcact 3000 tcttcccgta tgcccaactt tgtatagaga gccactgcgg gatcgtcacc gtaatctgct 3060 tgcacgtaga tcacataagc accaagcgcg ttggcctcat gcttgaggag attgatgagc 3120 gcggtggcaa tgccctgcct ccggtgctcg ccggagactg cgagatcata gatatagatc 3180 tcactacgcg gctgctcaaa cctgggcaga acgtaagccg cgagagcgcc aacaaccgct 3240 tcttggtcga aggcagcaag cgcgatgaat gtcttactac ggagcaagtt cccgaggtaa 3300 tcggagtccg gctgatgttg ggagtaggtg gctacgtctc cgaactcacg accgaaaaga 3360 tcaagagcag cccgcatgga tttgacttgg tcagggccga gcctacatgt gcgaatgatg 3420 cccatacttg agccacctaa ctttgtttta gggcgactgc cctgctgcgt aacatcgttg 3480 ctgctgcgta acatcgttgc tgctccataa catcaaacat cgacccacgg cgtaacgcgc 3540 ttgctgcttg gatgcccgag gcatagactg tacaaaaaaa cagtcataac aagccatgaa 3600 aaccgccact gcgccgttac caccgctgcg ttcggtcaag gttctggacc agttgcgtga 3660 gcgcatacgc tacttgcatt acagtttacg aaccgaacag gcttatgtcg acgcgtcctc 3720 ggtaccgggc cccccctcga ggtcgacggt atcgataagc ttgatatcga attcctgcag 3780 cccgggggat ccactagttc tagagcatcg aattcctgca gcccggggga tccactagtt 3840 ctagagcggc cgccaccgcg gtggagctcc aattcgccct atagtgagtc gtattacgca 3900 tcctgtcggc tgtggcacag gctgaacgcc ggaggatcag tactgcggcg tcgctgatcg 3960 ccctcgcgac gttgtgcggg tggcttgtcc ctgagggcgc tgcgacagat agctaaaaat 4020 ctgcgtcagg atcgccgtag agcgcgcgtc gcgtcgattg gaggcttccc ctttggttga 4080 cggtcttcaa tcgctctacg gcgatcctga cgcttttttg ttgcgtaccg tcgatcgtgg 4140 cgcggtgccc gcaggcatga caaacatcgt aaatgccgcg tttcgtgtgg ccgtggccgc 4200 ccaggacgtg tcagcgccgc caccacctgc accgaatcgg cagcagcgtc gcgcgtcgaa 4260 aaagcgcaca ggcggcaaga agcgataagc tgcacgaata cctgaaaaat gttgaacgcc 4320 ccgtgagcgg taactcacag ggcgtcggct aacccccagt ccaaacctgg gagaaagcgc 4380 tcaaaaatga ctctagcgga ttcacgagac attgacacac cggcctggaa attttccgct 4440 gatctgttcg acacccatcc cgagctcgcg ctgcgatcac gtggctggac gagcgaagac 4500 cgccgcgaat tcctcgctca cctgggcaga gaaaatttcc agggcagcaa gacccgcgac 4560 ttcgccagcg cttggatcaa agacccggac acgggagaaa cacagccgaa gttataccga 4620 gttggttcaa aatcgcttgc ccggtgccag tatgttgctc tgacgcacgc gcagcacgca 4680 gccgtgcttg tcctggacat tgatgtgccg agccaccagg ccggcgggaa aatcgagcac 4740 gtaaaccccg aggtctacgc gattttggag cgctgggcac gcctggaaaa agcgccagct 4800 tggatcggcg tgaatccact gagcgggaaa tgccagctca tctggctcat tgatccggtg 4860 tatgccgcag caggcatgag cagcccgaat atgcgcctgc tggctgcaac gaccgaggaa 4920 atgacccgcg ttttcggcgc tgaccaggct ttttcacata ggctgagccg gtggccactg 4980 cacgtctccg acgatcccac cgcgtaccgc tggcatgccc agcacaatcg cgtggatcgc 5040 ctagctgatc ttatggaggt tgctcgcatg atctcaggca cagaaaaacc taaaaaacgc 5100 tatgagcagg agttttctag cggacgggca cgtatcgaag cggcaagaaa agccactgcg 5160 gaagcaaaag cacttgccac gcttgaagca agcctgccga gcgccgctga agcgtctgga 5220 gagctgatcg acggcgtccg tgtcctctgg actgctccag ggcgtgccgc ccgtgatgag 5280 acggcttttc gccacgcttt gactgtggga taccagttaa aagcggctgg tgagcgccta 5340 aaagacacca agatcatcga cgcctacgag cgtgcctaca ccgtcgctca ggcggtcgga 5400 gcagacggcc gtgagcctga tctgccgccg atgcgtgacc gccagacgat ggcgcgacgt 5460 gtgcgcggct acgtcgctaa aggccagcca gtcgtccctg ctcgtcagac agagacgcag 5520 agcagccgag ggcgaaaagc tctggccact atgggaagac gtggcggtaa aaaggccgca 5580 gaacgctgga aagacccaaa cagtgagtac gcccgagcac agcgagaaaa actagctaag 5640 tccagtcaac gacaagctag gaaagctaaa ggaaatcgct tgaccattgc aggttggttt 5700 atgactgttg agggagagac tggctcgtgg cgacaatcaa tgaagctatg tctgaattta 5760 gcgtgtcacg tcagaccgtg aatagagcac ttaagtctgc gggcattgaa cttccacgag 5820 gacgccgtaa agcttcccag taaatgtgcc atctcgtagg cagaaaacgg ttccccccgt 5880 aggggtctct ctcttggcct cctttctagg tcgggctgat tgctcttgaa gctctctagg 5940 ggggctcaca ccataggcag ataacggttc cccaccggct cacctcgtaa gcgcacaagg 6000 actgctccca aa 6012 <210> 4 <211> 4135 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pBSG vector <400> 4 ggagtcaggc aactatggat gaacgaaata gacagatcgc tgagataggt gcctcactga 60 ttaagcattg gtaactgtca gaccaagttt actcatatat actttagatt gatttaaaac 120 ttcattttta atttaaaagg atctaggtga agatcctttt tgataatctc atgaccaaaa 180 tcccttaacg tgagttttcg ttccactgag cgtcagaccc cgtagaaaag atcaaaggat 240 cttcttgaga tccttttttt ctgcgcgtaa tctgctgctt gcaaacaaaa aaaccaccgc 300 taccagcggt ggtttgtttg ccggatcaag agctaccaac tctttttccg aaggtaactg 360 gcttcagcag agcgcagata ccaaatactg tccttctagt gtagccgtag ttaggccacc 420 acttcaagaa ctctgtagca ccgcctacat acctcgctct gctaatcctg ttaccagtgg 480 ctgctgccag tggcgataag tcgtgtctta ccgggttgga ctcaagacga tagttaccgg 540 ataaggcgca gcggtcgggc tgaacggggg gttcgtgcac acagcccagc ttggagcgaa 600 cgacctacac cgaactgaga tacctacagc gtgagctatg agaaagcgcc acgcttcccg 660 aagggagaaa ggcggacagg tatccggtaa gcggcagggt cggaacagga gagcgcacga 720 gggagcttcc agggggaaac gcctggtatc tttatagtcc tgtcgggttt cgccacctct 780 gacttgagcg tcgatttttg tgatgctcgt caggggggcg gagcctatgg aaaaacgcca 840 gcaacgcggc ctttttacgg ttcctggcct tttgctggcc ttttgctcac atgttctttc 900 ctgcgttatc ccctgattct gtggataacc gtattaccgc ctttgagtga gctgataccg 960 ctcgccgcag ccgaacgacc gagcgcagcg agtcagtgag cgaggaagct cgtgctttac 1020 ggtatcgccg ctcccgattc gcagcgcatc gccttctatc gccttcttga cgagttcttc 1080 tgagcgggac tctggggttc gcgaaatgac cgaccaagcg acgcccaacc tgccatcacg 1140 agatcctttt taacccatca catatacctg ccgttcacta ttatttagtg aaatgagata 1200 ttatgatatt ttctgaattg tgattaaaaa ggcaacttta tgcccatgca acagaaacta 1260 taaaaaatac agagaatgaa aagaaacaga tagatttttt agttctttag gcccgtagtc 1320 tgcaaatcct tttatgattt tctatcaaac aaaagaggaa aatagaccag ttgcaatcca 1380 aacgagagtc taatagaatg aggtcgaaaa gtaaatcgcg cgggtttgtt actgataaag 1440 caggcaagac ctaaaatgtg taaagggcaa agtgtatact ttggcgtcac cccttacata 1500 ttttaggtct ttttttattg tgcgtaacta acttgccatc ttcaaacagg agggctggaa 1560 gaagcagacc gctaacacag tacataaaaa aggagacatg aacgatgaac atcaaaaagt 1620 ttgcaaaaca agcaacagta ttaaccttta ctaccgcact gctggcagga ggcgcaactc 1680 aagcgtttgc gaaagaaacg aaccaaaagc catataagga aacatacggc atttcccata 1740 ttacacgcca tgatatgctg caaatccctg aacagcaaaa aaatgaaaaa tatcaagttc 1800 ctgaattcga ttcgtccaca attaaaaata tctcttctgc aaaaggcctg gacgtttggg 1860 acagctggcc attacaaaac gctgacggca ctgtcgcaaa ctatcacggc taccacatcg 1920 tctttgcatt agccggagat cctaaaaatg cggatgacac atcgatttac atgttctatc 1980 aaaaagtcgg cgaaacttct attgacagct ggaaaaacgc tggccgcgtc tttaaagaca 2040 gcgacaaatt cgatgcaaat gattctatcc taaaagacca aacacaagaa tggtcaggtt 2100 cagccacatt tacatctgac ggaaaaatcc gtttattcta cactgatttc tccggtaaac 2160 attacggcaa acaaacactg acaactgcac aagttaacgt atcagcatca gacagctctt 2220 tgaacatcaa cggtgtagag gattataaat caatctttga cggtgacgga aaaacgtatc 2280 aaaatgtaca gcagttcatc gatgaaggca actacagctc aggcgacaac catacgctga 2340 gagatcctca ctacgtagaa gataaaggcc acaaatactt agtatttgaa gcaaacactg 2400 gaactgaaga tggctaccaa ggcgaagaat ctttatttaa caaagcatac tatggcaaaa 2460 gcacatcatt cttccgtcaa gaaagtcaaa aacttctgca aagcgataaa aaacgcacgg 2520 ctgagttagc aaacggcgct ctcggtatga ttgagctaaa cgatgattac acactgaaaa 2580 aagtgatgaa accgctgatt gcatctaaca cagtaacaga tgaaattgaa cgcgcgaacg 2640 tctttaaaat gaacggcaaa tggtacctgt tcactgactc ccgcggatca aaaatgacga 2700 ttgacggcat tacgtctaac gatatttaca tgcttggtta tgtttctaat tctttaactg 2760 gcccatacaa gccgctgaac aaaactggcc ttgtgttaaa aatggatctt gatcctaacg 2820 atgtaacctt tacttactca cacttcgctg tacctcaagc gaaaggaaac aatgtcgtga 2880 ttacaagcta tatgacaaac agaggattct acgcagacaa acaatcaacg tttgcgccaa 2940 gcttcctgct gaacatcaaa ggcaagaaaa catctgttgt caaagacagc atccttgaac 3000 aaggacaatt aacagttaac aaataaaaac gcaaaagaaa atgccgatat cctattggca 3060 ttttctttta tttcttatca acataaaggt gaatcccata tgaactatat aaaagcaggc 3120 aaatggctaa ccgtattcct aaccttttcg aaatgaccga ccaagcgacg cccaacctgc 3180 catcacgaag cggaagagcg cctgatgcgg tattttctcc ttacgcatct gtgcggtatt 3240 tcacaccgca taggccgctc tagaactagt ggatcccccg ggctgcagga attcgatatc 3300 aagcttatcg ataccgtcga cctcgagggg gggcccggta ccgaggacgc gtcgacataa 3360 gcctgttcgg ttcgtaaact gtaatgcaag tagcgtatgc gctcacgcaa ctggtccaga 3420 accttgaccg aacgcagcgg tggtaacggc gcagtggcgg ttttcatggc ttgttatgac 3480 tgtttttttg tacagtctat gcctcgggca tccaagcagc aagcgcgtta cgccgtgggt 3540 cgatgtttga tgttatggag cagcaacgat gttacgcagc agcaacgatg ttacgcagca 3600 gggcagtcgc cctaaaacaa agttaggtgg ctcaagtatg ggcatcattc gcacatgtag 3660 gctcggccct gaccaagtca aatccatgcg ggctgctctt gatcttttcg gtcgtgagtt 3720 cggagacgta gccacctact cccaacatca gccggactcc gattacctcg ggaacttgct 3780 ccgtagtaag acattcatcg cgcttgctgc cttcgaccaa gaagcggttg ttggcgctct 3840 cgcggcttac gttctgccca ggtttgagca gccgcgtagt gagatctata tctatgatct 3900 cgcagtctcc ggcgagcacc ggaggcaggg cattgccacc gcgctcatca atctcctcaa 3960 gcatgaggcc aacgcgcttg gtgcttatgt gatctacgtg caagcagatt acggtgacga 4020 tcccgcagtg gctctctata caaagttggg catacgggaa gaagtgatgc actttgatat 4080 cgacccaagt accgccacct aacaattcgt tcaagccgag atcggcttcc cggcc 4135

Claims (16)

1. 대장균 (Escherichia coli) 및 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum)에서 복제되며, 젠타마이신 내성 유전자를 갖는 셔틀 벡터로서, 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열을 갖는 셔틀 벡터 pEGm (KCCM-10533).
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6. 재조합 유전자가 삽입된 제1항에 따른 벡터로 숙주세포를 형질전환하는 단계; 및

   상기 형질전환된 숙주세포를 젠타마이신을 포함하는 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 재조합 유전자로 형질전환된 숙주세포를 선별하는 방법.
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