CN101445817A

CN101445817A - 一种提高l-谷氨酸发酵过程糖酸转化率和产率的方法

Info

Publication number: CN101445817A
Application number: CNA2008101544515A
Authority: CN
Inventors: 陈宁; 宋翔; 徐庆阳; 谢希贤; 刘淑云
Original assignee: Tianjin University of Science and Technology
Current assignee: Tianjin University of Science and Technology
Priority date: 2008-12-25
Filing date: 2008-12-25
Publication date: 2009-06-03

Abstract

一种提高L－谷氨酸发酵过程糖酸转化率和产率的方法。本发明涉及一种发酵法制备L－谷氨酸的改进方法。本发明根据调整细胞代谢流分配的原理，采用在培养基中添加柠檬酸或其盐、苹果酸或其盐的方法，来有效提高L－谷氨酸发酵过程糖酸转化率和产率。

Description

一种提高L-谷氨酸发酵过程糖酸转化率和产率的方法

【技术领域】：本发明涉及一种提高L-谷氨酸发酵过程糖酸转化率和产率的方法，属于发酵法生产氨基酸的技术领域。

【背景技术】：谷氨酸棒杆菌、黄色短杆菌等是工业发酵生产谷氨酸的常用菌株。在谷氨酸生产菌生物合成的代谢途径已经清楚的前提下，理论上通过计算可以得出L-谷氨酸生产的得率在0.817gL-谷氨酸/g葡萄糖，而目前实际得率仅有约0.50-0.58gL-谷氨酸/g葡萄糖，较理论值有较大的差距，所以仍具有很大的研究空间。但是，提高糖酸转化率相对于提高产率而言却有相当大的难度。

近年来，代谢工程领域的研究结果表明，在谷氨酸生产菌中，糖酵解途径(EMP)相对于三羧酸循环(TCA)过量，即EMP通量超出了TCA代谢的能力，造成碳“溢流”以及过量ATP的合成。那么，连接EMP和TCA的丙酮酸会发生积累，并且会通过其他途径进行代谢以缓解持续的“溢流”。因此，过量碳的溢流会导致有机酸和其他物质的生成。在谷氨酸棒杆菌中，分析葡萄糖在胞内的代谢途径，明显可以看到产物L-谷氨酸的生物合成过程中，HMP途径所提供的能量是十分重要的，这样代谢流在EMP、TCA和HMP之间的合理分配就成为提高L-谷氨酸产率和糖酸转化率的前提。

【发明内容】：本发明采用在培养基中添加一定量的柠檬酸或其盐、苹果酸或其盐的方法来提高谷氨酸生产菌L-谷氨酸发酵过程糖酸转化率和产率。

柠檬酸或柠檬酸盐可以抑制丙酮酸激酶的活性，减少丙酮酸的积累，造成磷酸烯醇式丙酮酸的积累。磷酸烯醇式丙酮酸是EMP途径限速酶磷酸果糖激酶的抑制剂，所以磷酸烯醇式丙酮酸的积累降低了磷酸果糖激酶的活性，从而降低了EMP途径的通量，缓解了EMP和TCA之间的代谢溢流。同时，葡萄糖总通量没有变化，所以更多的葡萄糖进入HMP途径生成了L-谷氨酸合成所必需的能量，相应的提高了L-谷氨酸的糖酸转化率和产率。

苹果酸作为乙醛酸循环的终产物，对催化乙醛酸循环第一步反应的异柠檬酸裂解酶有一定的反馈抑制作用，故其适量添加可使一部分乙醛酸循环的代谢流向着继续TCA循环的方向发生迁移，使异柠檬酸更多的生成α-KG，进而更多的生成L-谷氨酸，而非合成乙醛酸和琥珀酸。同时，添加苹果酸可以增加HMP途径代谢流量，减弱EMP途径代谢流量。而EMP途径向HMP途径发生的代谢流迁移，使HMP途径的流量增加，从而增加了作为L-谷氨酸合成中心代谢途径中关键反应所需还原力的NADPH的量，进而使更多的代谢流流向L-谷氨酸。此外，苹果酸作为TCA循环的主要产物之一，其添加会对作为TCA循环限速酶的柠檬酸合成酶的活性产生一定抑制作用，从而限制TCA循环代谢流量过多，减少CO₂的生成，进而避免了碳架的大量浪费。

此方法在不增加额外设备和人力投入的情况下，实现了整个发酵周期的缩短和L-谷氨酸产量和转化率的大幅提高，适合于工业化生产。

本发明的目的是通过如下技术方案实现的：

本发明提供的一种提高L-谷氨酸发酵过程糖酸转化率和产率的方法，其特征是：在发酵培养基中添加柠檬酸或其盐、苹果酸或其盐，使其在培养基中的浓度均为0.01～10g/L，优选0.05～5g/L，更优选0.1～3g/L。其中所说的柠檬酸盐为柠檬酸钠或柠檬酸钾，苹果酸盐为苹果酸钠或苹果酸钾。

本发明根据调整代谢流分配的原理提出了适用于提高谷氨酸生产菌L-谷氨酸发酵过程中糖酸转化率和产率的方法，它通过降低丙酮酸激酶和磷酸果糖激酶的活力，减弱糖酵解途径通量，降低有机酸的合成，缓解EMP和TCA之间的代谢溢流，使更多的葡萄糖进入HM途径生成了L-谷氨酸合成所必需的能量，从而在糖耗相同的基础上，合成较多的L-谷氨酸，即提高了糖酸转化率。

【具体实施方式】：

下面通过实施例对本发明作进一步的说明，所举之例并不限制本发明的保护范围：

实施例1：

采用的菌株为谷氨酸棒杆菌或钝齿棒杆菌；培养基为在现有普遍采用的发酵培养基[葡萄糖8％、甘蔗糖蜜0.1％、玉米浆0.4％、MgSO₄·7H₂O 0.15％、Na₂HPO₄·12H₂O 0.2％、KCl 0.1％、MnSO₄ 0.0001％、FeSO₄ 0.0001％、V_B10.00001％]中添加0.1g/L柠檬酸钠；培养方法：将菌种接入种子培养基[葡萄糖2.5％、玉米浆3％、K₂HPO₄·3H₂O 0.2％、MgSO₄·7H₂O 0.1％、尿素0.025％]中，接种量为5％；在32℃、pH为7.0和溶氧为20％条件下于5L自动控制发酵罐中培养6h至对数期，按10％的接种量接入含有发酵培养基的5L自动控制发酵罐中，控制发酵液温度采用顺序提温模式：0～5h为34℃，5～10h为35℃，10～18h为36℃，18～26h为37℃，26～32h为38℃，通入适当空气，调节适当搅拌转速，采用分阶段供氧模式控制溶氧：0～10h为20％，10～32h为5％，通过自动流加氨水控制pH在7.0～7.2，通过流加适量泡敌消泡，并通过流加浓度为800g/L的葡萄糖溶液将残糖控制在1.0％，发酵至32h停止。放罐时，L-谷氨酸的产量为150.0g/L，糖酸转化率为60.0％，分别比对照实验(L-谷氨酸产量为130.0g/L，糖酸转化率为50.0％)提高了15.4％和20.0％。

实施例2：

采用的菌株为谷氨酸棒杆菌或钝齿棒杆菌；培养基为在现有普遍采用的发酵培养基(同实施例1)中添加3.0g/L柠檬酸钠；培养方法同实施例1。放罐时，L-谷氨酸的产量为156.0g/L，糖酸转化率为62.0％，分别比对照实验(L-谷氨酸产量为130.0g/L，糖酸转化率为50.0％)提高了20.0％和24.0％。

实施例3：

采用的菌株为黄色短杆菌或天津短杆菌；培养基为在现有普遍采用的发酵培养基(同实施例1)中添加0.10g/L苹果酸；培养方法同实施例1。放罐时，L-谷氨酸的产量为152.0g/L，糖酸转化率为61.0％，分别比对照实验(L-谷氨酸产量为130.0g/L，糖酸转化率为50.0％)提高了16.9％和22.0％。

实施例4：

采用的菌株为黄色短杆菌或天津短杆菌；培养基为在现有普遍采用的发酵培养基(同实施例1)中添加3.0g/L苹果酸；培养方法同实施例1。放罐时，L-谷氨酸的产量为155.0g/L，糖酸转化率为64.0％，分别比对照实验(L-谷氨酸产量为130.0g/L，糖酸转化率为50.0％)提高了19.2％和28.0％。

Claims

1.一种提高L-谷氨酸发酵过程糖酸转化率和产率的方法，其主要步骤为：采用谷氨酸棒杆菌、黄色短杆菌等谷氨酸生产菌经发酵获得L-谷氨酸，其特征在于，在培养基中添加柠檬酸或其盐、苹果酸或其盐，使其在培养基中的浓度均为0.01～10g/L。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征是：其中所说的柠檬酸或其盐的浓度为0.05～5g/L。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征是：其中所说的柠檬酸或其盐的浓度为0.1～3g/L。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征是：其中所说的苹果酸或其盐的浓度为0.05～5g/L。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征是：其中所说的苹果酸或其盐的浓度为0.1～3g/L。

6.根据权利要求1～5所述的任意一种方法，其特征是：其中所说的柠檬酸盐为柠檬酸钠或柠檬酸钾。

7.根据权利要求1～5所述的任意一种方法，其特征是：其中所说的苹果酸盐为苹果酸钠或苹果酸钾。