CN112080448A - 一种菌发酵生产海藻糖酶的培养基及方法 - Google Patents

一种菌发酵生产海藻糖酶的培养基及方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及了一种菌发酵生产酶的培养基及培养方法，更具体地，涉及一种玫瑰色微球菌发酵生产海藻糖酶的培养基及培养方法。所述发酵培养基的组成成分为海藻糖、酵母浸粉、KCL、KH2PO4和VB1，培养基pH为5.6～7.5，发酵所使用的菌种为通过平板划线分离法分离纯化后的玫瑰色微球菌，先将所述玫瑰色微球菌接种于液体培养基，制得发酵种子液；再将发酵种子液接种于发酵培养基中，所得发酵液经过离心超滤制得粗酶液。通过本方法发酵得到的海藻糖酶具有更高的酶活性，在工业和医学应用中具有广阔的前景。

Description

一种菌发酵生产海藻糖酶的培养基及方法
技术领域
本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一种菌发酵生产海藻糖酶的培 养基及方法。
背景技术
玫瑰色微球菌是革兰氏阳性菌，为较大球状菌，直径0.5-3.5um，其特征是 可以向几个平面分裂，形成规则或是不规则的立方堆，没有休眠期，好氧或兼 性厌氧，可用作海藻糖酶产生菌种。
海藻糖酶于1893年首先在黑曲霉中发现，是一种专一性催化海藻糖水解的 酶，属于葡萄糖苷酶的一种，广泛存在于昆虫、哺乳动物、微生物和植物中， 对海藻糖有特异作用，能将海藻糖水解成2个分子的葡萄糖单糖。葡萄糖是生物 体内新陈代谢不可缺少的营养物质，在食品、发酵工业上都可直接使用；微生 物的生长需要合适的碳氮比，葡萄糖作为微生物的碳源，是发酵培养基的主料， 如抗生素、维生素、氨基酸、酶制剂等都需大量使用葡萄糖，同时也可用作微 生物多聚糖和有机溶剂的原料；目前结晶葡萄糖主要用于食品行业，随着生活 水平的提高和食品行业科技的不断发展，葡萄糖的应用越加广泛。
目前海藻糖酶的来源匮乏，主要来源于昆虫、植物、酵母等生物，但现阶 段与其相关的文献报道都较为少见，因海藻糖酶能专一将海藻糖转化成两分子 的葡萄糖，使其在工业和医学都具有非常可观的使用前景；在糖加工工业中， 通常使用酶法生产高纯度麦芽糖，但在此过程中会产生少量海藻糖，降低了麦 芽糖的纯度，因海藻糖是非还原糖，所以加入海藻糖酶将其转化成两分子的葡 萄糖既能提高麦芽糖的纯度，又能充分利用海藻糖节约原料，所以研究海藻糖 酶酶活能提升此转化过程中海藻糖的利用率，提高葡萄糖的产量，对糖工业中 葡萄糖、麦芽糖的生产十分具有实用价值。
发明内容
本发明的目的在于提供一种菌发酵生产海藻糖酶的培养基及方法。为实现 上述目的，本发明首先提供一种菌发酵生产海藻糖酶的培养基，所述的培养基 含有：海藻糖25～40g/L、酵母浸粉8～15g/L、KCL0.2～0.4g/L、KH2PO40.25～0.5g/L、 VB10.1～0.3g/L，培养基起始pH为5.6～7.5。
进一步优选的，所使用的菌种需通过平板划线分离法进行分离纯化。
进一步优选的，所述发酵培养基组分为海藻糖30g/L、酵母浸粉8g/L、 KCL0.35g/L、VB10.15g/L，pH7.5，以海藻糖作为碳源加入培养基中不仅可以满 足玫瑰色微球菌生长的营养需求，还能进一步诱导玫瑰色微球菌发酵产生海藻 糖酶，使菌丝生长速度加快，增强了玫瑰色微球菌在培养过程中应对环境胁迫 的能力，酶活显著提高。
其次，本发明还提供一种菌发酵生产海藻糖酶的方法，海藻糖所述方法包 含以下步骤：
(1)采用菌种为玫瑰色微球菌，先将所述玫瑰色微球菌接种于液体培养基， 制得发酵种子液；
(2)将制得的发酵种子液接种于如权利要求1所述的培养基中，于35～38℃、 150～200rpm条件下培养25～40h得到发酵液；
(3)离心后取上清液，在25～30℃，0.1mpa的条件下超滤得到粗酶液，采 用3，5-二硝基水杨酸(DNS)比色法测定产生的海藻糖酶的酶活。
进一步优选的，所述步骤(1)中液体培养基为自然pH，并加入抗生素去 除杂菌。
进一步优选的，所述步骤(2)中种子液接种量为3％(v/v)，在36℃、180rpm 条件下培养35h。
进一步优选的，所述步骤(3)中上清液在4℃、4000rpm离心10min得到， 超滤膜截留分子量为10Kda。
采用本发明优化后的培养基以及方法，能使玫瑰色微球菌发酵产出更多海 藻糖酶，酶活能达到20U/ml以上；且实验周期较短，条件简易可控。
具体实施方式
本发明用下列实施例来进一步说明本发明，但本发明的保护范围并不限于 下列实施例，本发明还可通过不同的实施方式加以实现或运用，本领域普通技 术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明 保护的范围。
(1)基础培养基的配制：取海藻糖30g/L、酵母浸粉10g/L、KCL0.3g/L、 KH2PO40.3g/L、VB10.2g/L，自然pH，1.0mpa下灭菌25min，降至室温后加入已 用无菌水配制好的抗生素进行预处理去除其他杂菌。
(2)发酵种子液的制备：将通过平板划线法分离纯化后的玫瑰色微球菌 (ATCC9815)接种于(1)中的基础培养基，在摇床中30℃，200rpm富集培养 48h后制得种子液。
(3)发酵液的制作：将(2)中的种子液3％(v/v)接种于发酵培养基中， 培养基含有海藻糖25～40g/L、酵母浸粉8～15g/L、KCL0.2～0.4g/L、 KH2PO40.25～0.5g/L、VB10.1～0.3g/L，培养基起始pH为5.6～7.5，于35～38℃、 150～200rpm条件下培养25～40h得到发酵液。
(4)酶液的制备：取(3)中所得发酵液以4℃、4000rpm离心10min，得 到的上清液在25～30℃，0.1mpa的条件下通过截留分子量为10Kda的超滤膜， 制得粗酶液，保存待用。
(5)酶活的测定：
采用3，5-二硝基水杨酸(DNS)比色法测定产生的葡萄糖的含量，方法如 下：取105℃干燥至恒重的分析纯的海藻糖配制成5％的水溶液作为酶活待测底 物；取2支试管,分别为实验组和对照组，前者加入2mL酶液和2mL底物溶液， 后者加入2mL酶液和2mLpH6.5的PBS缓冲液；37℃反应15min，再各加入3mL 的DNS试剂，沸水浴5min终止反应，置于冰水混合物中冰浴2min，冷却后用 水补足到10mL；取反应后的混合液在540nm处测定其吸光度值。
酶活定义：在上述实验条件下，每分钟产生1μmol还原糖所需的酶量为1 个海藻糖酶活力单位(U)。
DNS试剂的配制：将含有182g酒石酸钾钠的500mL热水溶液中加入 6.3gDNS和262mL2mol/LNaOH，再加入5g苯酚和5gNaHSO3，搅拌溶解，待 冷却后加水定容至1000mL，将配制好的DNS试剂贮于棕色瓶中避光保存，放 置7～10天备用。
(6)制作标准曲线：分别准确称取葡萄糖标准液(1mg/mL)0、0.1、0.3、 0.5、0.7、0.9、1.0mL，加入蒸馏水补足至1mL，分别加入2mlDNS试剂，沸水 浴5min终止反应，置于冰水混合物中冰浴2min，用水补足到10mL，在540nm 处测定其吸光度值。
实施例1
单因素实验确定培养基最优成分
(1)基础培养基的配制：取海藻糖30g/L、酵母浸粉10g/L、KCL0.3g/L、 KH2PO40.3g/L、VB10.2g/L，自然pH，1.0mpa下灭菌25min，降至室温后加入已 用无菌水配制好的抗生素进行预处理去除其他杂菌。
(2)发酵种子液的制备：将通过平板划线法分离纯化后的菌种接种于(1) 中的基础培养基，在摇床中30℃，200rpm富集培养48h后制得种子液。
(3)发酵液的制作：将(2)中的种子液3％(v/v)接种于发酵培养基中， 培养基含有海藻糖25～40g/L、酵母浸粉8～15g/L、KCL0.2～0.4g/L、 KH2PO40.25～0.5g/L、VB10.1～0.3g/L，培养基起始pH为5.6～7.5，于35～38℃、 150～200rpm条件下培养25～40h得到发酵液。
(4)酶液的制备：取(3)中所得发酵液以4℃、4000rpm离心10min，得 到的上清液在25～30℃，0.1mpa的条件下通过截留分子量为10Kda的超滤膜， 制得粗酶液，保存待用。
(5)酶活的测定：
采用3，5-二硝基水杨酸(DNS)比色法测定产生的葡萄糖的含量，方法如 下：取105℃干燥至恒重的分析纯的海藻糖配制成5％的水溶液作为酶活待测底 物；取2支试管,分别为实验组和对照组，前者加入2mL酶液和2mL底物溶液， 后者加入2mL酶液和2mLpH6.5的PBS缓冲液；37℃反应15min，再各加入3mL 的DNS试剂，沸水浴5min终止反应，置于冰水混合物中冰浴2min，冷却后用 水补足到10mL；取反应后的混合液在540nm处测定其吸光度值。
(6)不同碳源、氮源、金属离子、维生素对产海藻糖酶的影响
(a)不同碳源对产海藻糖酶的影响，在含有酵母浸粉10g/L、KCL0.3g/L、KH2PO40.3g/L、VB10.2g/L、起始pH为7.0的培养基中分别添加30g/L的海藻糖、 蔗糖、麦芽糖、果糖、乳糖、可溶性淀粉，灭菌后将(2)中的种子液3％(v/v) 接种于培养基中，于35℃、200rpm条件下培养35h得到发酵液，后续如步骤(4)、 (5)处理测定酶活，重复实验三次取平均值，结果见表1。
(b)不同氮源对产海藻糖酶的影响，在含有海藻糖30g/L、KCL0.3g/L、KH2PO40.3g/L、VB10.2g/L、起始pH为7.0的培养基中分别添加10g/L的酵母浸 粉、蛋白胨、甘氨酸、(NH4)2HPO4、NaNO3、NH4NO3，灭菌后将(2)中的 种子液3％(v/v)接种于培养基中，于35℃、200rpm条件下培养35h得到发酵 液，后续如步骤(4)、(5)处理测定酶活，重复实验三次取平均值，结果见表2。
(c)不同金属离子对产海藻糖酶的影响，在含有海藻糖30g/L、 KH2PO40.3g/L、VB10.2g/L、起始pH为7.0的培养基中分别添加0.3g/L的 FeCl3·6H2O、NaCl、MgSO4、CaCl2、MnCl2·4H2O、KCl，灭菌后将(2)中的 种子液3％(v/v)接种于培养基中，于35℃、200rpm条件下培养35h得到发酵 液，后续如步骤(4)、(5)处理测定酶活，重复实验三次取平均值，结果见表3。
(d)不同维生素对产海藻糖酶的影响，在含有海藻糖30g/L、酵母浸粉10g/L、KCL0.3g/L、KH2PO40.3g/L、起始pH为7.0的培养基中分别添加0.2g/L的VB1、 VB2、VB4、VB6、VC、VE，灭菌后将(2)中的种子液3％(v/v)接种于培养 基中，于35℃、200rpm条件下培养35h得到发酵液，后续如步骤(4)、(5)处 理测定酶活，重复实验三次取平均值，结果见表4。
表1不同碳源对产海藻糖酶的影响
序号 碳源 平均酶活(U/mL)
1 海藻糖 16.47
2 蔗糖 6.29
3 麦芽糖 12.23
4 果糖 11.85
5 乳糖 9.15
6 可溶性淀粉 13.66
表2不同氮源对产海藻糖酶的影响
序号 氮源 平均酶活(U/mL)
1 蛋白胨 14.56
2 酵母浸粉 15.83
3 甘氨酸 12.01
4 NaNO<sub>3</sub> 4.97
5 NH<sub>4</sub>NO<sub>3</sub> 5.36
6 (NH4)<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub> 11.58
表3不同金属离子对产海藻糖酶的影响
序号 金属离子 平均酶活(U/mL)
1 Fe<sup>3+</sup> 8.09
2 Mg<sup>2+</sup> 15.07
3 Mn<sup>2+</sup> 10.86
4 Ca<sup>2+</sup> 6.97
5 K<sup>+</sup> 15.36
6 Na<sup>+</sup> 9.48
表4不同维生素对产海藻糖酶的影响
序号 维生素 平均酶活(U/mL)
1 VB<sub>1</sub> 16.35
2 VB<sub>2</sub> 12.31
3 VB<sub>4</sub> 10.77
4 VB<sub>6</sub> 9.78
5 VC 5.63
6 VE 12.39
从表中可以得出最佳的培养基成分为海藻糖、酵母浸粉、KCL、KH2PO4、 VB1，接下来的正交实验将以此作为发酵培养基的组成成分。
实施例2
正交实验确定最优培养基
从单因素实验已经确定的培养基组成成分的基础上，改变各成分的含量以 及培养基起始pH，配制不同的培养基，方法同实施例1中步骤(3)，见表5； 灭菌后将(2)中的种子液3％(v/v)接种于培养基中，于35℃、200rpm条件 下培养35h得到发酵液，后续如步骤(4)、(5)处理测定酶活，见表6；选取正 交实验最优结果和其产酶量最高的实验组号，进行验证实验，实验方法同实施 例1，见表7。
表5玫瑰色微球菌产海藻糖酶五因素四水平(45)正交试验设计
水平 A B C D E
1 海藻糖25 酵母浸8粉 0.2 0.1 6.0
2 30 10 0.25 0.15 6.5
3 35 12 0.3 0.2 7.0
4 40 14 0.35 0.25 7.5
表6玫瑰色微球菌产海藻糖酶五因素四水平(45)正交设计实验结果
组合 A B C D E 实验结果
1 1 1 1 1 1 11.36
2 1 2 2 2 2 12.72
3 1 3 3 3 3 9.88
4 1 4 4 4 4 13.97
5 2 1 2 3 4 17.48
6 2 2 1 4 3 16.34
7 2 3 4 1 2 16.25
8 2 4 3 2 1 18.03
9 3 1 3 4 2 10.37
10 3 2 4 3 1 9.52
11 3 3 1 2 4 15.84
12 3 4 2 1 3 12.67
13 4 1 4 2 3 16.44
14 4 2 3 1 4 10.42
15 4 3 2 4 1 11.57
16 4 4 1 3 2 9.53
Ij 11.982 13.913 13.268 12.675 12.620
IIj 17.025 12.250 13.610 15.758 12.217
IIIj 12.100 13.385 12.175 11.602 13.832
IVj 11.990 13.550 14.045 13.063 14.428
R 5.043 1.663 1.870 4.156 2.211
注:Ij为各因素水平1的酶活之和，IIj为各因素水平2的酶活之和，IIIj为各 因素水平3的酶活之和，IVj为各因素水平4的酶活之和，R为极差。
表7培养基优化验证试验
项目 酶活(U/mL)
对照(A2B1C3D2E4) 18.46
最优(A2B1C4D2E4) 19.87
通过分析正交试验的结果得到的最优因素组合为A2B1C4D2E4，即海藻糖 30g/L、酵母浸粉8g/L、KCL0.35g/L、VB10.15g/L，pH7.5，且试验结果与验证 试验相符合；表6中五个因素的极差值R分别为碳源(5.043)、氮源(1.663)、金 属离子(1.870)、维生素(4.156)和pH(2.211)，表明碳源、氮源、金属离子、维生 素和pH的变化与玫瑰色微球菌产海藻糖酶培养基相关，尤其是碳源和维生素的 变化对该菌产酶的影响较大，氮源对产酶的影响较小。
实施例3
正交实验确定最优培养条件
在从正交实验确定的最优培养基的基础上，通过设定不同接种量、培养温 度、转速、培养时间进行培养，见表8；然后按实施例1步骤(4)、(5)处理测 定酶活，见表9。
表8玫瑰色微球菌产海藻糖酶四因子三水平(34)正交试验设计
Figure BDA0002680061470000091
表9玫瑰色微球菌产海藻糖酶四因子三水平(34)正交设计实验结果
组合 A B C D 实验结果
1 1 1 1 1 16.42
2 1 2 2 2 19.29
3 1 3 3 3 13.28
4 2 1 2 3 17.55
5 2 2 3 1 16.79
6 2 3 1 2 20.16
7 3 1 3 2 16.43
8 3 2 1 3 15.89
9 3 3 2 1 17.63
Ij 16.330 16.800 17.490 16.947
IIj 18.167 17.323 18.157 18.627
IIIj 16.650 17.023 15.500 15.573
R 1.837 0.523 2.657 3.054
注:Ij为各因素水平1的酶活之和，IIj为各因素水平2的酶活之和，IIIj为各因 素水平3的酶活之和，R为极差。
通过分析正交试验的结果得到的最优因素组合为A2B2C2D2，其相应的条 件为以3％(v/v)接种量、36℃、180rpm、35h进行培养；同时由表9中四个因 素的极差值R可知，培养条件中，培养时间(3.054)对产酶影响最大，相对而言， 转速对产酶的效果作用最小。
实施例4
玫瑰色微球菌产海藻糖酶发酵方法
(1)基础培养基的配制：取海藻糖30g/L、酵母浸粉10g/L、KCL0.3g/L、 KH2PO40.3g/L、VB10.2g/L，自然pH，1.0mpa下灭菌25min，降至室温后加入已 用无菌水配制好的抗生素进行预处理去除其他杂菌。
(2)发酵种子液的制备：将分离纯化后的纯菌种接种于(1)中的基础培 养基，在摇床中30℃，200rpm富集培养48h后制得种子液。
(3)发酵液的制作：将(2)中的种子液接种于发酵培养基中，培养基组 分和培养条件均按照优化正交实验得到的最优进行操作：即配制海藻糖30g/L、 酵母浸粉8g/L、KCL0.35g/L、VB10.15g/L，pH7.5的培养基，以3％(v/v)接种 量将种子液接种于培养基中，于36℃、180rpm条件下培养35h得到发酵液。
(4)酶液的制备：取(3)中所得发酵液以4℃、4000rpm离心10min，得 到的上清液在25～30℃，0.1mpa的条件下通过截留分子量为10Kda的超滤膜， 制得粗酶液，保存待用。
上述发酵产生的海藻糖酶酶活能达到23.17U/mL，该实施例表明本发明所采 用的发酵培养基以及发酵工艺具有增加酶产量提高酶活的优点。
实施例5
玫瑰色微球菌产海藻糖酶酶学性质研究
(1)最适反应温度和温度稳定性研究方法如下：
最适反应温度：用pH6.5、50mmol/L磷酸缓冲液和酶液(实施例4方法制 备所得)以体积比1：1混合，分别在30、35、40、45、50、55℃等温度下测定 海藻糖酶酶活，以最高酶活的反应温度作为最适反应温度。
温度稳定性：将酶液在不同温度中(30、35、40、45、50、55℃)热处理 30min后置于冰上冷却，按照标准酶活测定方法在37℃测定海藻糖酶剩余酶活， 以未经处理酶液的酶活作为对照。
结果显示该海藻糖酶的最适反应温度为45℃，在35～50℃范围内相对酶活 可达到70％以上，在35～45℃内内热稳定性较高，残余酶活可保持在80％以上， 但随着温度的升高，达到45℃以上时热稳定性明显下降(图1)。
(2)最适反应pH和pH稳定性
最适反应pH：配制BR缓冲液，向其中加入不同体积的NaOH(浓度为 0.2mol/L)组成pH1.81～11.92的缓冲溶液；5％海藻糖底物溶液以该缓冲液作为 溶液稀释，酶液(同上)与该缓冲液1：1进行稀释；在37℃条件下，于不同缓 冲液体系下(pH4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8)标准酶活测定方法进行酶 活检测，以最高酶活的反应pH作为最适反应pH。
pH稳定性：将酶液置于不同pH缓冲液环境中并于冰上放置1h，然后在标 准条件下进行酶活检测，以未经处理酶液的酶活作为对照。
结果显示该海藻糖酶的最适反应pH为5，在酸性条件下具有较高活性，在 pH4.0～6.0范围内相对酶活可达到80％以上，在酸性条件下稳定性较好，在 pH4～6.5范围内残余酶活可保持在80％以上(图2)。
由此可见通过该方法制备所得的海藻糖酶酶活更高，在35～45℃条件下都具 有较高的酶活，而且在酸性条件下稳定性较好，能够充分适用于工业生产。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明所举的较佳实施例，不能以此来限 定本发明的权利范围，本领域的技术人员在此基础上所作的修改和等同变化， 仍在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种菌发酵生产海藻糖酶的培养基，其特征在于，所述的培养基含有：海藻糖25～40g/L、酵母浸粉8～15g/L、KCL0.2～0.4g/L、KH2PO40.25～0.5g/L、VB10.1～0.3g/L，培养基起始pH为5.6～7.5。
2.根据权利要求1所述的一种菌发酵生产海藻糖酶的培养基，其特征在于，所使用的菌种需通过平板划线分离法进行分离纯化。
3.根据权利要求1所述的一种菌发酵生产海藻糖酶的培养基，其特征在于,培养基组分为海藻糖30g/L、酵母浸粉8g/L、KCL0.35g/L、VB10.15g/L，pH7.5。
4.一种菌发酵生产海藻糖酶的方法，其特征在于，所述方法包含以下步骤：
(1)采用菌种为玫瑰色微球菌，先将所述玫瑰色微球菌接种于液体培养基，制得发酵种子液；
(2)将制得的发酵种子液接种于如权利要求1所述的培养基中，于35～38℃、150～200rpm条件下培养25～40h得到发酵液；
(3)离心后取上清液，在25～30℃，0.1mpa的条件下超滤得到粗酶液，采用3，5-二硝基水杨酸(DNS)比色法测定产生的海藻糖酶的酶活。
5.根据权利要求4所述的一种菌发酵生产海藻糖酶的方法，其特征在于，所述步骤(1)中液体培养基为自然pH，并加入抗生素去除杂菌。
6.根据权利要求4所述的一种菌发酵生产海藻糖酶的方法，其特征在于，所述步骤(2)中种子液接种量为3％(v/v)，在36℃、180rpm条件下培养35h。
7.根据权利要求4所述的一种菌发酵生产海藻糖酶的方法，其特征在于，所述步骤(3)中上清液在4℃、4000rpm离心10min得到，超滤膜截留分子量为10Kda。
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