CN102311979A

CN102311979A - 添加还原性糖促进生物合成1，3-丙二醇的方法

Info

Publication number: CN102311979A
Application number: CN2010102220046A
Authority: CN
Inventors: 金平; 王领民; 师文静; 李晓姝; 王崇辉
Original assignee: China Petroleum and Chemical Corp; Sinopec Fushun Research Institute of Petroleum and Petrochemicals
Current assignee: China Petroleum and Chemical Corp; Sinopec Fushun Research Institute of Petroleum and Petrochemicals
Priority date: 2010-07-07
Filing date: 2010-07-07
Publication date: 2012-01-11
Anticipated expiration: 2030-07-07
Also published as: CN102311979B

Abstract

本发明涉及一种添加还原性糖促进生物合成1，3-丙二醇的方法，包括如下内容：制备用于1，3-丙二醇的发酵培养基，以甘油为发酵底物，在发酵培养基中接入肺炎克雷伯氏杆菌种子培养液，进行厌氧发酵或微氧发酵合成1，3-丙二醇，在发酵过程中，引入在发酵体系浓度为1～50g/L的还原性糖。本发明根据木糖、甘露糖和鼠李糖等在菌体内的代谢途径产生大量还原当量的特点，利用了更多的还原当量的存在能促进1，3-丙二醇生物合成的原理，在发酵培养基中加入适量还原性糖，增加还原当量，提高1，3-丙二醇的合成浓度和转化率。本发明操作简单，提高了生物利用率，降低了发酵成本，适合工业化生产。

Description

添加还原性糖促进生物合成1,3-丙二醇的方法

技术领域

本发明涉及一种微生物发酵法合成1，3-丙二醇的方法，特别是采用甘油为底物微生物发酵生产1，3-丙二醇的方法。

背景技术

1，3-丙二醇(PDO)是一种重要的化工和医药中间体原料，可作为有机溶剂应用于油墨、印染、乳化剂、抗冻剂等。PDO最主要的用途，是合成新型聚酯高分子材料聚对苯二甲酸丙二酯(PTT)的单体。PTT是目前国际上公认的六大石化新产品之一。与聚对苯二甲酸乙二酯(PET)、聚对苯二甲酸丁二酯(PBT)和尼龙等比较，PTT具有良好的印染特性、富有弹性、抗紫外线、静电性能好、可生物降解并再生利用等多种优良特性，因此PTT在纺织服装业、地毯装饰业、工程塑料等众多领域有着十分广阔的应用前景。据估计，目前仅我国每年就需求PDO上百万吨，而且在未来十年我国对PDO的需求量还将继续增大。PTT生产的关键在于单体原料PDO的来源，其生产成本直接影响着PTT的工业化生产和应用规模。

1，3-丙二醇的生产方法主要有化学合成法和微生物发酵法。化学合成法目前仅有国外DuPont和Shell公司以及国内的少数几家单位在进行小规模工业化生产。技术路线分别是德国Degussa公司的丙烯醛合成法专利技术和Shell公司开发的环氧乙烷合成法，并用于聚合生产PTT。为了垄断市场，这两家跨国公司不对外销售用于PTT生产的PDO，而只向客户销售PTT切片及其下游产品。同时，化学合成法存在设备投资大、工艺要求严格、操作条件苛刻、有毒副产物多、产品提取难度大、三废处理成本高以及生产原料依赖于不可再生的石油资源等问题，导致PTT材料及其原料产品PDO的价格一直居高不下，制约其进一步的发展。而微生物发酵法生产PDO，以可再生资源——碳水化合物为原料，具有操作简便、反应条件相对温和、副产物少、污染少且容易处理以及成本低廉等优点，引起了国内外相关企业和研究单位的高度重视，将具有广泛的应用前景和开发潜力。

随着近年生物能源产业的蓬勃发展，导致其最大副产物甘油的价格急剧下降，因此利用甘油为原料生物合成1，3-丙二醇的方法逐渐成为研究的重点。目前利用甘油转化成1，3-丙二醇的微生物主要为兼性厌氧微生物，可以采用厌氧条件，也可以采用微氧条件。其中，肺炎克雷伯氏杆菌、费氏柠檬酸菌和丁酸梭状芽孢杆菌是转化率较高的三种菌，对底物和产物也具备良好的耐受性。以肺炎克雷伯氏杆菌为例，1，3-丙二醇的生物合成途径主要分为氧化和还原途径。氧化途径主要包括以下步骤：①甘油经甘油脱氢酶(GDH)催化，生成2-羟基丙酮(DHA)，此酶为厌氧酶，以NAD+为辅酶；②DHA在ATP及2-羟基丙酮激酶的作用下，生成磷酸二羟基丙酮(DHAP)；③DHAP进一步代谢生成丙酮酸，然后通过乙酰CoA进入三羧酸循环或生成其它小分子醇、酸等代谢产物。氧化途径生成生物能ATP和还原当量NADH₂，并伴随着微生物细胞的生长。还原途径主要有2步酶反应：①甘油脱水酶(GDHt)在辅酶B12存在下将甘油转化为中间产物3-羟基丙醛(3-HPA)；②在NADH₂存在下，3-HPA在1，3-丙二醇氧化还原酶(PDOR)催化下生成1，3-丙二醇。还原途径消耗氧化途径生成的过量NADH₂，使微生物细胞内的还原物质达到平衡。如CN01117282.7公开了一种微生物微氧发酵生产1，3-丙二醇的方法，CN01138769.6公开了一种好氧发酵生产甘油、厌氧发酵生产1，3-丙二醇的方法等。

在发酵底物中添加某种物质，以促进生产1，3-丙二醇的发酵过程在本领域中进行了较多的研究，如“现代化工”2002，22(6)：32-35页张健等介绍了一种采用添加葡萄糖作为辅低物在厌氧条件下发酵生产1，3丙二醇；CN1446919A公开了一种采用外加维生素C或维生素E促进1，3-丙二醇的生产； CN200510011917.2公开了一种添加反丁烯二酸促进微生物合成1，3-丙二醇的方法；CN200810022643.0公开了一种向发酵液中添加能改善细胞通透性的抗生素，增加发酵产率的方法。不同的添加物质对微生物发酵过程均具有一定的促进作用，但微生物发酵过程的产物浓度、生长周期长和甘油转化率等方面均可以进一步提高。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供一种合成1，3-丙二醇的方法，本发明方法具有操作简单，提高1，3-丙二醇的合成浓度和底物转化率，降低发酵成本，提高经济效益等优点。

本发明添加还原性糖促进生物合成1，3-丙二醇的方法包括如下内容：制备用于1，3-丙二醇的发酵培养基，以甘油为发酵底物，在发酵培养基中接入肺炎克雷伯氏杆菌种子培养液，进行厌氧或微氧发酵合成1，3-丙二醇，在发酵过程中，引入在发酵体系浓度为1～50g/L优选为4～20g/L的还原性糖，还原性糖为木糖、甘露糖和鼠李糖中的一种或几种。

本发明方法中，微生物发酵过程引入的还原性糖可以在发酵培养基中一次引入，优选在发酵培养基中和发酵过程中分别引入，最优选在发酵进行1～15小时后引入发酵体系中。

本发明方法中，可以在发酵培养基中加入少量葡萄糖，以促进微生物菌体的生长，葡萄糖的加入量为在发酵培养基中的浓度为1～10g/L。

本发明方法中，微生物发酵过程的条件和方法可以采用本领域常规的方法，如采用补料发酵方式或连续发酵方式等，优选为补料发酵方式，发酵条件为厌氧发酵条件或微氧发酵条件(空气0.25～0.5vvm)，发酵温度为35℃～37℃，在搅拌条件下进行发酵。发酵培养基中含有微生物发酵过程所需的营养物质，如N、P、K、Mg、Fe、Co等，同时在发酵过程中可以根据需要补充微生物营养物质。发酵过程优选控制发酵液中甘油浓度维持在20g/L～25g/L。

研究表明，在以甘油为底物，采用肺炎克雷伯氏杆菌发酵生产1，3-丙二醇的过程中，引入葡萄糖可以促进菌体生长，但菌体生长过程本身对生产1，3-丙二醇没有明显的促进作用，菌体代谢葡萄糖的过程构成了对甘油代谢过程的抑制，葡萄糖对发酵的促进作用主要贡献在于提高了菌体数量，减少了甘油的消耗。而对于木糖、甘露糖和鼠李糖等还原性糖来说，对肺炎克雷伯氏杆菌生长的促进作用没有葡萄糖的效果好，而且，浓度一定浓度的还原性糖对肺炎克雷伯氏杆菌的生长还有抑制作用。但经过深入研究表明，木糖、甘露糖和鼠李糖等还原性糖在肺炎克雷伯氏杆菌代谢途径产生并积累了大量还原当量，利用更多的还原当量来加速甘油还原途径的进行，进一步促进了1，3-丙二醇的生物合成，提高了1，3-丙二醇的合成浓度和转化率，这是在甘油发酵底物中加入葡萄糖所不具有的功能的效果。也就是说，在1，3-丙二醇生产过程中，木糖、甘露糖和鼠李糖的代谢途径与甘油的代谢途径相互促进，产生了综合的技术效果。

由于上述还原性糖的代谢过程与甘油的代谢过程相互促进，同时由于上述还原性糖的价格较高，因此优选在发酵过程的初期或发酵培养基中不加或少加上述还原性糖，以减少在菌体快速生长期对还原性糖的过多消耗，可以减少生产成本，同时充分发挥还原性糖代谢途径与甘油代谢途径结合的优势。因为葡萄糖的价格低廉，因此在菌体快速生长期可以适量添加葡萄糖，供菌体生长，将葡萄糖和上述还原性糖的各自功能有机结合，在促进1，3-丙二醇生产的同时，可以有效降低生产成本。

具体实施方式

下面通过具体实施例进一步说明本发明的方案和效果。

实施例1添加木糖增加还原当量于摇瓶中发酵

菌种：肺炎克雷伯氏杆菌(Klebsiella pneumoiae)由抚顺石油化工研究院筛选，保藏于中国微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，编号为0798。LB固体培养基：每升体积培养基含有蛋白胨10.0g/L，酵母膏5.0g/L，NaCl10.0g/L，pH 7.0。

种子培养基：酵母膏5.0g/L，麦芽糖3.0g/L，蛋白胨5.0g/L，NaCl 5.0g/L，pH 7.0。

发酵培养基：酵母膏5.0g/L，K₂HPO₄·3H₂O 10g/L，KH₂PO₄ 2g/L，NH₄Cl 1g/L，NaCl 0.5g/L，MgSO₄·7H₂O 0.1g/L，FeCl₃·6H₂O 30mg/L，CoCl₂·6H₂O5mg/L，VitaminB₁₂(维生素B₁₂) 5mg/L，glycerol(甘油)30g/L，pH 7.0，还原性糖(木糖、甘露糖、鼠李糖等)浓度为0～20g/L。

发酵过程：

步骤1：菌种活化

由菌种保藏的甘油管中挑取一环Klebsiella pneumonia接入LB液体培养基活化12h后，再挑取一环菌苔接入固体LB平板，37℃培养12h后置4℃冰箱保藏。

步骤2：种子培养

种子在250mL三角瓶中进行，装液量为100mL，从步骤1的LB固体平板上挑取一单菌落于预先灭菌多的装有100mL种子培养基的250mL三角瓶中，37℃，140rpm，培养10h，使菌体OD₆₀₀达到2～4左右。

步骤3：在250mL摇瓶内微氧发酵合成1，3-丙二醇

在装有发酵培养基100mL(木糖含量为8g/L)的250mL的摇瓶中，菌种接种量为2％(体积)，37℃，140rpm，培养时间30h。所有摇瓶均为窄口瓶，塞子为橡皮塞。中间每隔5h取样，每次取样体积为4mL，测定的项目有菌体浓度、底物甘油浓度、1，3-丙二醇的合成浓度及其他主要副产物的浓度。

本发酵周期30h，共进行三组发酵实验：木糖添加组、葡萄糖添加组、空白组。甘油初始浓度均为30g/L。

实验序号1为仅使用甘油为发酵底物的对比实验。

实验序号2为使用甘油和葡萄糖为发酵底物的对比实验，其中葡萄糖浓度为8g/L。

实验序号3为使用甘油和木糖为发酵底物的实验，其中木糖浓度为8g/L。

实验序号4以甘油为起始发酵底物的实验，发酵进行5小时后，加入占发酵底物浓度4g/L的木糖。

实验序号5为甘油和葡萄糖为起始发酵底物的实验，其中葡萄糖浓度为3g/L，发酵进行6小时后加入占发酵底物浓度为3g/L的木糖。

实验序号6为甘油和葡萄糖为起始发酵底物的实验，其中葡萄糖浓度为2g/L，发酵进行6小时后加入占发酵底物浓度为2g/L的木糖，发酵再进行6小时后加入占发酵底物浓度为2g/L的木糖。

表1实施例1实验结果

从表一可看出，木糖添加组中的对菌体浓度的增加效果虽然不及葡萄糖，但产物1，3-丙二醇的合成浓度变化明显，木糖添加组中的1，3-丙二醇的含量为11.085g/L，比起空白组(1，3-丙二醇浓度为8.585g/L)提高了29.12％，甘油转化率提高了29.13％；比起葡萄糖添加组的，1，3-丙二醇浓度提高了80.74％。实验表明添加木糖后1，3-丙二醇生物合成效果显著。同时，采用优化的木糖添加方式，可以进一步促进1，3-丙二醇的生产，同时由于木糖的用量可以明显减少而有利于降低操作费用。

实施例2添加木糖增加还原当量于7升发酵罐中发酵

在发酵过程中，将种子液接入7升发酵罐中，装液量为4升。发酵培养基含有葡萄糖浓度为5g/L，接种量为5％，微氧发酵(0.25vvm空气)，37℃，300rpm。其余条件参照实施例1。每隔6h取样，测定的项目有菌体浓度、底物甘油浓度、1，3-丙二醇的合成浓度及其他主要副产物的浓度。

实验序号1为发酵6小时后每6小时加木糖，每次加入木糖使发酵体系含木糖4g/L。

实验序号2为发酵6小时后每6小时加葡萄糖，每次加入葡萄糖使发酵体系含葡萄糖4g/L。

实验结果

实验本次发酵周期40h，在37h时1，3-丙二醇的浓度达到最高，表2是37时底物及发酵产物分布情况。

表2实施例2发酵结果

从表二可看出木糖添加组的甘油浓度较添加葡萄糖组提高了10.01g/L，转化率提高了20％。

实施例3在发酵培养基中添加甘露糖

在装有发酵培养基100mL(甘露糖含量为10g/L)的250mL的摇瓶中，接种量为2％，37℃，140，培养时间30h。所有摇瓶均为窄口瓶，塞子为橡皮塞。中间每隔5h取样，每次取样体积为4mL，测定的项目有菌体浓度、底物甘油及甘露糖浓度、1，3-丙二醇的合成浓度及其他主要副产物的浓度。菌株活化、种子培养均参照实施例1。实验结果见表3。

实施例4在发酵培养基中添加甘露醇

在装有发酵培养基100mL(鼠李糖含量为10g/L)的250mL的摇瓶中，接种量为2％，37℃，140，培养时间30h。所有摇瓶均为窄口瓶，塞子为橡皮塞。中间每隔5h取样，每次取样体积为4mL，测定的项目有菌体浓度、底物甘油及甘露糖浓度、1，3-丙二醇的合成浓度及其他主要副产物的浓度。菌株活化、种子培养均参照实施例1。实验结果见表3。

实施例5在发酵培养基中添加木糖和鼠李糖

在装有发酵培养基100mL(木糖浓度为5g/L，鼠李糖浓度为5g/L)的250mL的摇瓶中，接种量为2％，37℃，140，培养时间30h。所有摇瓶均为窄口瓶，塞子为橡皮塞。中间每隔5h取样，每次取样体积为4mL，测定的项目有菌体浓度、底物甘油及甘露糖浓度、1，3-丙二醇的合成浓度及其他主要副产物的浓度。菌株活化、种子培养均参照实施例1。实验主要结果见表3。

表3实施例3～5发酵结果

实验结果显示添加适量还原糖后，1，3-丙二醇合成浓度都明显提高，通过不同还原糖组合还能发挥不同的优势。

Claims

1.一种添加还原性糖促进生物合成1，3-丙二醇的方法，包括如下内容：制备用于1，3-丙二醇的发酵培养基，以甘油为发酵底物，在发酵培养基中接入肺炎克雷伯氏杆菌种子培养液，进行厌氧发酵或微氧发酵合成1，3-丙二醇，其特征在于：在发酵过程中，引入在发酵体系浓度为1～50g/L的还原性糖，还原性糖为木糖、甘露糖和鼠李糖中的一种或几种。

2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：还原性糖在发酵体系中的浓度为4～20g/L。

3.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：微生物发酵过程引入的还原性糖在发酵培养基中一次引入，或者在发酵培养基中和发酵过程中分别引入。

4.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：微生物发酵过程引入的还原性糖为在发酵进行1～15小时后引入发酵体系中。

5.按照权利要求1、3或4所述的方法，其特征在于：在发酵培养基中加入少量葡萄糖，以促进微生物菌体的生长，葡萄糖的加入量为在发酵培养基中的浓度为1～10g/L。

6.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：微生物发酵过程采用补料发酵方式或连续发酵方式，发酵条件为厌氧发酵条件或微氧发酵条件，发酵温度为35℃～37℃。

7.按照权利要求1或6所述的方法，其特征在于：微氧发酵时空气通入量为0.25vvm～0.5vvm。