CN101323863A - 一种提高微生物发酵生产1,3-丙二醇浓度的方法 - Google Patents
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Abstract
一种提高微生物发酵生产1，3－丙二醇浓度的方法特别涉及添加抗生素，减少营养物质及代谢产物出入细胞的传递阻力，有效促进细胞生长和提高微生物发酵生产1，3－丙二醇浓度的方法，其工艺过程为：在发酵培养液中接入二级种子培养液，同时向发酵液中添加能改善细胞通透性的抗生素，添加抗生素改变细胞通透性，减少营养物质及代谢产物出入细胞的传递阻力，从而促进菌体的生长和生产能力，提高产物1，3－丙二醇浓度；并且还促使微生物将代谢产物分泌至胞外，降低代谢产物在细胞内的积累，利于消除产物、副产物抑制，特别是减少1，3－丙二醇对细胞生长和细胞催化活性的抑制，最终将发酵产物1，3－丙二醇浓度提高10％~70％。该工艺过程简便，生产成本低。
Description
技术领域
本发明是一种微生物发酵制备1，3-丙二醇的方法，特别涉及添加抗生素，减少营养物质及代谢产物出入细胞的传递阻力，有效促进细胞生长和提高微生物发酵生产1，3-丙二醇浓度的方法，属于1，3-丙二醇的代谢合成技术领域。
背景技术
1，3-丙二醇(1，3-propanediol，简称1，3-PD)在常温下是一种无色或淡黄色粘稠液体。1，3-丙二醇与对苯二甲酸反应，聚合成聚酯纤维聚对苯二甲酸丙二醇酯(PTT)，是目前合成纤维新品种开发的热点。1，3-丙二醇的化学结构式为HOCH2CH2CH2OH，由于其具有奇数碳，且双官能团位于两端，它能够和其他物质聚合形成连续的亚甲基链，所得聚合物具有良好的伸缩性和回复性。
近年来，应用微生物代谢甘油合成1，3-丙二醇的研究得到了广泛的关注，微生物发酵法生产1，3-丙二醇以其原料易得、可利用再生资源、对环境友好展示了其美好的发展前景。我国已把大力发展1，3-丙二醇等单体原料列入《生物产业发展“十一五”规划》，明确提出在以丙二醇、乙二醇、丁二醇等生物基多元醇聚酯纤维的技术开发和产业化方面进行重点突破，立足自主研发和创新，积极推进以生物质工程技术为核心的绿色生态纤维及材料的发展，实现我国纤工业的产业升级。
微生物发酵法生产1，3-丙二醇一般以甘油为底物，为了获得高浓度1，3-丙二醇，人们对于发酵底物以及发酵工艺进行了大量的研究和探讨。在发酵过程中，加入的物质和产生的副产物都会细胞代谢过程产生影响。1，3-丙二醇最终浓度的高低主要取决于细胞对底物、产物及副产物的耐受程度及代谢的酶活性；在1，3-丙二醇发酵过程中，细胞的生长与代谢受到底物和多种产物的抑制作用(Biebl 1991；Zeng，et al.1994；Colin，et al.2000)。为了提高1，3-丙二醇产量和底物转化率，必须克服底物甘油、产物1，3-丙二醇和其它副产物对细胞生长的抑制作用。
[1]Biebl H.Glycerol fermentation to 1，3-propanedoil by Clostridium butyricum：Measurement of product inhibition by use of a pH-auxostat.Appl MicrobiolBiotectnol 1991，35：701～705
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王娅君等和陈宏文等各自研究了不同底物对细胞内代谢甘油产生1，3-丙二醇三种关键酶活的影响以及发酵中的酶活变化，为培养基优化和营养物质的流加提供了帮助。蒋洁等认为，在发酵初始培养基中加入微量的乙酸能够提高1，3-丙二醇的产量，但乙酸的添加会影响菌体生长。赵红英等针对底物抑制现象，提出了菌种驯化和流加甘油发酵两种解决途径，结果表明采用经驯化培养获得的耐底物抑制菌株菌株发酵，并控制甘油流加，可将最终1，3-丙二醇浓度和转化率分别提高到53.0％和27.0％。
[4]王娅君，赵莉，徐佳杰等，克雷伯氏肺炎杆菌生产1，3-丙二醇代谢途径中的酶活变化，华东理工大学学报：自然科学版2007，34(4)：481-484.
[5]陈宏文，王蔚，方柏山等，克雷伯杆菌生产1，3-丙二醇关键酶发酵条件研究，高校化学工程学报2004，18(5)：621-627.
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[7]赵红英，张健，刘宏娟等，1，3-丙二醇发酵过程中底物抑制及其对策的研究，现代化工2002，22(7)：34-38.
细胞的通透性直接影响物质的吸收和代谢产物的分泌，从而影响到细胞内代谢的变化。细胞通透性的调节是微生物代谢调节的重要方式，外界物质的吸收或代谢产物的分泌都需经细胞膜的运输，此外，细胞壁与细胞膜间还具有周质空间，含有蛋白酶、核酸酶和运送物质的结合蛋白等，如果细胞壁与细胞膜发生障碍，则胞内合成代谢物不能分泌出来，影响发酵产物收获，或胞外营养物不能进入胞内，也影响细胞生长和产物合成，使产量下降。
从文献中已知抗生素能有效地强化生物合成是与提高细胞透性有关(李柏林1997；张和春2002；邹祥2005；刘俊红2006)。当加入作用细菌细胞壁合成的抗生素(青霉素，头孢菌素，杆菌肽，D-环丝氨酸)，加入影响细胞膜功能的抗生素(多粘菌素B，制霉菌素，两性霉素，缬氨霉素)，可减少营养物质及代谢产物出入细胞的传递阻力，解除细胞透性对物质吸收和代谢产物分泌的障碍，解决发酵产物、副产物对微生物细胞生长和催化活性的抑制。因此，在微生物发酵过程中添加抗生素对增加终产物浓度，提高生产效率，缩短反应周期，降低生产成本，具有重要的现实意义。
[8]李柏林，储炬，李友荣等，胞壁合成对庆大霉素生物合成的影响，中国抗生素杂志1997，22(4)：246-249.
[9]张和春，范卫民，张元兴等，调节细胞通透性促进天蓝色链霉菌蓝色素生物合成。应用与环境生物学报2002，8(5)：540～543.
[10]邹祥，廖志华，周小里等，重组大肠杆菌产户胡萝卜素的发酵条件食品与生物技术学报2005，24(3)：72-75.
[11]刘俊红，刘顺谊，殷志敏，乳糖诱导大肠杆菌中重组谷氨酰胺合成酶的表达.南京师大学报(自然科学版)2006，29(3)：66-70.
微生物代谢合成过程中，细胞质膜和细胞壁的结构影响物质的进出，当控制物理、化学条件改进物质的进出速率，都有可能造成代谢产物的过量生产。本发明在1，3-丙二醇发酵过程中，采用添加抗生素减少营养物质及代谢产物出入细胞的传递阻力，一方面加快物质传递运输，增加胞内胞外的物质平衡，从而提高提高细菌的生长和生产能力，继而提高产物1，3-丙二醇浓度；另一方面促使微生物代谢产物易于分泌至胞外，利于消除产物、副产物抑制，特别是减少1，3-丙二醇对细胞生长和细胞催化活性的抑制，从而有利于1，3-丙二醇合成，有效提高微生物发酵生产1，3-丙二醇浓度。
发明内容
技术问题：本发明的目的在于提供一种通过添加抗生素减少营养物质及代谢产物出入细胞的传递阻力，一方面加快物质传递运输，增加胞内胞外的物质平衡，从而提高细菌的生长和生产能力，提高产物1，3-丙二醇浓度；另一方面促使微生物代谢产物易于分泌至胞外，利于消除产物、副产物抑制，特别是减少1，3-丙二醇对细胞生长和细胞催化活性的抑制，从而有利于1，3-丙二醇代谢合成，有效提高微生物发酵生产1，3-丙二醇浓度的方法。
技术方案：本发明的目的是提供一种有效提高微生物发酵生产1，3-丙二醇浓度方法，所涉及到的发酵菌种可以是克雷伯氏菌、弗氏柠檬菌、丁酸梭状芽孢杆菌。
本发明利用添加抗生素减少营养物质及代谢产物出入细胞的传递阻力，加快物质传递运输的能力，促进细胞生长和产物合成；解决产物、副产物对细胞生长和细胞催化活性的抑制，提高发酵产物1，3-丙二醇浓度，其工艺过程为：
a.二级种子液制备：取新鲜固体斜面菌种，接种于摇瓶种子培养基中，30℃～35℃摇床，150rpm培养12～24h，再接种到摇瓶种子培养基中，30℃～35℃培养10～16h，制成二级种子培养液备用，
b.发酵培养：20～80g/L工业甘油做碳源，装液量40％～75％，以体积比3％～15％的接种量将二级种子培养液接到其中，温度34℃～38℃，pH 6.2～7.5，150～400rpm培养20～40h；中间间隔取样测细胞浓度和产物1，3-丙二醇浓度，在发酵培养0～24小时，加入不同浓度、不同种类的抗生素，抗生素加入的方式是一次性加入、分批加入或流加，
发酵生产1，3-丙二醇的菌种包括：克雷伯氏菌、弗氏柠檬菌、丁酸梭状芽孢杆菌中的一种。
以克雷伯氏菌发酵生产1，3-丙二醇，接种量10％，温度34～37℃，转速150～400rpm，间歇式培养、补料分批式培养20～40h。
发酵生产1，3-丙二醇过程中添加的抗生素为抑制细胞壁合成的青霉素、头孢菌素、杆菌肽、D-环丝氨酸、影响细胞膜功能的多粘菌素B、制霉菌素、两性霉素、缬氨霉素中的一种。
发酵生产1，3-丙二醇过程中，在发酵培养0-24小时添加抗生素，抗生素加入的方式是一次性加入、分批加入或流加，浓度范围0.001～10g/L。
有益效果：本发明提供了简便有效经济的发酵工艺，解决发酵终产物产量低以及发酵过程产物、副产物对细胞生长和细胞催化活性的抑制，减少营养物质及代谢产物出入细胞的传递阻力，最终将发酵产物1，3-丙二醇浓度提高了10％～70％，代谢过程控制简单，操作方便，易于实现工业化应用。
具体实施方式
菌种：克雷伯肺炎杆菌(K.pneumoniae)
固体斜面培养基：牛肉膏3g/L，MgSO4·7H2O 0.2g/L，蛋白胨5g/L，NaCl 10g/L，琼脂20g/L，甘油20g/L。
摇瓶种子培养基：酵母膏2g/L，MgSO4·7H2O 0.2g/L，柠檬酸0.42g/L，K2HPO41.6g/L，K2HPO4 3.4g/L，NH4Cl 3.0g/L，甘油30g/L，CaCl2 0.5g/L。
发酵培养基：甘油20～80g/L，K2HPO4·3H2O 1.36g/L，NH4Cl 3.0g/L，酵母膏2.0g/L，MgSO4·7H2O 0.2g/L，CaCl2 2.0铁溶液1mL/L，无机离子溶液2mL/L，VB12溶液1mL/L，钴溶液1mL/L。无机离子含：CuCl2，H3BO3，MnCl2，Na2MoO4，NiCl2，ZnSO4，微量元素含量约在0.01～50mg/L。
摇瓶二级种子液制备：取新鲜固体斜面菌种，接种于摇瓶种子培养基中，30℃～35℃摇床，150rpm培养12～24h，再接种到摇瓶种子培养基中，30℃～35℃培养10～16h，制成二级种子培养液备用。
分批发酵培养：20～80g/L工业甘油做碳源，装液量40％～75％，以体积比3％～15％的接种量将二级种子培养液接到其中，温度34℃～38℃，pH 6.2～7.5，150～400rpm培养20～40h；中间间隔取样测细胞浓度和产物1，3-丙二醇浓度。在发酵培养0～24小时，加入不同浓度、不同种类的抗生素，间隔取样测细胞浓度和产物1，3-丙二醇浓度。
添加的抗生素是，浓度范围0.001～10g/L。
抗生素加入的方式是一次性加入、分批加入或流加。
实施例一
菌种：克雷伯肺炎杆菌(K.pneumoniae)
400ml含45g/L工业甘油的发酵培养基置于1L摇瓶中，接入体积40ml二级种子液，温度37℃，摇床180rpm培养。在发酵8h分别加入氨苄青霉素，使发酵液中氨苄青霉素的含量分别为0～500mg/L。每隔一段时间取样一次，分光光度计比浊法测量细胞浓度，波长650nm，细胞浓度即菌体量表示为OD；气相色谱分析l，3-丙二醇的浓度。24小时结束发酵。
表1氨苄青霉素添加量对1，3-丙二醇产出影响
实施例一研究了在发酵甘油生产1，3-丙二醇工艺中，添加氨苄青霉素，浓度从0～500mg/L范围内，不同氨苄青霉素浓度对克雷伯肺炎杆菌生长和1，3-丙二醇产量的影响。从发酵24h的菌体生长和1，3-丙二醇生产情况(见表1)来看，加入氨苄青霉素对菌体生长和产物合成有促进作用，适宜浓度氨苄青霉素有助于提高1，3-丙二醇产量，当添加量为200mg/L时，1，3-丙二醇产量提高了27.6％，转化率提高了43.4％。
分析以上结果的原因，添加氨苄青霉素的发酵培养工艺，氨苄青霉素作为抗生素，对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌都有一定的作用，其机理为：抑制细菌细胞壁的合成，与细胞膜相互作用而影响膜的渗透性。在微生物发酵过程中加入适当浓度的氨苄青霉素可以改变细胞的通透性而不致于杀死细菌，从而可加快物质传递运输，增加胞内胞外的物质平衡，从而提高提高细菌的生长和生产能力，提高产物1，3-丙二醇浓度。但是随着氨苄青霉素浓度的提高，氨苄青霉素对微生物生长也表现出一定的毒害作用，菌体生长受抑。
实施例二：
400ml含45g/L工业甘油的发酵培养基置于lL摇瓶中，接入体积40ml二级种子液，温度37℃，摇床180rpm培养。分别在4h、8h、12h、16h及20h加入200mg/L氨苄青霉素并且调节其pH值。两个平行样取平均值，实验结果如下(表2)。
表2氨苄青霉素加入时间的对1，3-丙二醇产量影响
从上表可知，在发酵不同时期加入氨苄青霉素对1，3-丙二醇的产出有较大影响，在发酵前期与中期添加氨苄青霉素，对1，3-丙二醇的生物合成不利，原因在于菌体在这个时期尚未到达生长稳定期，大部分增殖细胞胞壁合成不完全甚至整个胞壁合成受阻，导致菌体无法正常代谢增殖。在发酵中后期16小时添加氨苄青霉素，1，3-丙二醇产量提高了34.8％。所以在不影响细胞正常生长的条件下，添加氨苄青霉素提高了细胞的通透性，加大了细胞分泌1，3-丙二醇的能力。过晚加入青霉素，作用不大。
工业发酵生产1，3-丙二醇，主要是肠道细菌，细胞生长产生荚膜，并覆盖在细胞表面，造成胞壁与质膜通透性差。添加抗生素改变细胞的通透性，减少营养物质及代谢产物出入细胞的传递阻力，对代谢产物的合成有显著促进作用，此外细胞通透性的增加可有效地解除产物对自身的反馈抑制，这为提高1，3-丙二醇的产量提供了保障。
对比抗生素添加后克雷伯肺炎杆菌细胞形态变化，发现抗生索添加后细胞荚膜消失，细胞从小的短杆形变成非正常的伸长和膨大，随着菌龄增加其受抑制作用逐渐减弱，非正常伸长和膨大的细胞数量减少。当青霉素添加量过大时，大部分增殖细胞胞壁合成不完全甚至整个胞壁合成受阻，导致菌体无法正常代谢增殖。因此当菌体处于稳定期，加入适当浓度的青霉素，改善细胞通透性，可促进1，3-丙二醇分泌，部分解除产物抑制。
实施例三：
5L发酵罐，装液量3.8L，接入200ml二级种子液。控制温度37℃，用4mol/L的NaOH调节pH维持在6.8～7.0，搅拌速率在300r/min～450r/min，通气量在0.4vvm～2.8vvm，流加甘油使浓度稳定在20g/L～30g/L，分别在12h、15h、18h、21h添加氨苄青霉素，每次加入50mg/L，中间每隔4h取样，测生物量、甘油浓度和产物1，3-丙二醇浓度。发酵30小时，与不添加氨苄青霉素相比，1，3-丙二醇浓度提高了43.7％。
通过上述实验可以证明，在甘油发酵生产1，3-丙二醇代谢途径中，通过添加抗生素增加细胞的通透性，可有效促进细胞生长，提高发酵终产物1，3-丙二醇浓度工艺简便经济。
Claims (5)
1、一种提高微生物发酵生产1，3-丙二醇浓度的方法，其特征在于利用添加抗生素减少营养物质及代谢产物出入细胞的传递阻力，加快物质传递运输的能力，促进细胞生长和产物合成；解决产物、副产物对细胞生长和细胞催化活性的抑制，提高发酵产物1，3-丙二醇浓度，其工艺过程为：
a.二级种子液制备：取新鲜固体斜面菌种，接种于摇瓶种子培养基中，30℃～35℃摇床，150rpm培养12～24h，再接种到摇瓶种子培养基中，30℃～35℃培养10～16h，制成二级种子培养液备用，
b.发酵培养：20～80g/L工业甘油做碳源，装液量40％～75％，以体积比3％～15％的接种量将二级种子培养液接到其中，温度34℃～38℃，pH 6.2～7.5，150～400rpm培养20～40h；中间间隔取样测细胞浓度和产物1，3-丙二醇浓度，在发酵培养0～24小时，加入不同浓度、不同种类的抗生素，抗生素加入的方式是一次性加入、分批加入或流加。
2、根据权利要求1所述的提高微生物发酵生产1，3-丙二醇浓度的方法，其特征在于发酵生产1，3-丙二醇的菌种包括：克雷伯氏菌、弗氏柠檬菌、丁酸梭状芽孢杆菌中的一种。
3、根据权利要求2所述的提高微生物发酵生产1，3-丙二醇浓度的方法，其特征在于以克雷伯氏菌发酵生产1，3-丙二醇，接种量10％，温度34～37℃，转速150～400rpm，间歇式培养、补料分批式培养20～40h。
4、根据权利要求1所述的提高微生物发酵生产1，3-丙二醇浓度的方法，其特征在于发酵生产1，3-丙二醇过程中添加的抗生素为抑制细胞壁合成的青霉素类、头孢菌素类、杆菌肽、D-环丝氨酸、影响细胞膜功能的多粘菌素B、制霉菌素、两性霉素、缬氨霉素中的一种。
5、根据权利要求4所述的提高微生物发酵生产1，3-丙二醇浓度的方法，其特征在于发酵生产1，3-丙二醇过程中，在发酵培养0-24小时添加抗生素，抗生素加入的方式是一次性加入、分批加入或流加，浓度范围0.001～10g/L。
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