CN101851656A - 一种生产纤维素乙醇的方法 - Google Patents

Abstract

一种生产纤维素乙醇的方法：a)将厌氧纤维素降解菌和乙醇厌氧杆菌接种于种子液培养基中，厌氧条件下50-70℃进行活化；b)将活化后的厌氧纤维素降解菌液接种于碳源为微晶纤维素的种子液培养基中，将乙醇厌氧杆菌液接种于碳源为葡萄糖的种子液培养基中，培养得到种子液；c)种子液接种于发酵培养基中，厌氧条件下，培养温度50-70℃，培养时压力为-0.1MPa～0.1MPa，发酵时pH为6.5-8.0，发酵至纤维素降解。本发明所得乙醇转化率为33％--36％。本发明同时进行纤维素降解和乙醇转化，节约能耗，降低了纤维素乙醇的生产成本，有利于推动低碳经济的发展和生物质能源替代化石燃料的进程。

Description

一种生产纤维素乙醇的方法

技术领域

本发明属于微生物发酵工程领域，具体地涉及一种生产纤维素乙醇的方法。

背景技术

能源是人类赖以生存和持续发展的重要物质基础。而常规化石能源的储量极其有限，全球已探明的石油、天然气和煤炭储量将分别在今后40、60和100年左右耗尽。同时，利用化石能源所造成的环境污染和气候变化对人类生存和发展也提出了严峻挑战。这使得开发新型、清洁、可再生的新能源变得非常必要和紧迫。生物质能源作为新兴能源之一，据估计，在未来40年将占全球总能耗的40％。燃料乙醇是生物质能源中最容易实现产业化的品种之一，它作为一种新型的清洁能源，是正在使用的汽车燃料的理想替代品。目前，通过发酵玉米淀粉、甘蔗汁等已经实现第一代燃料乙醇产业化。然而，随着我国人口不断增加，粮食危机日益加剧，利用玉米淀粉、甘蔗汁等生产燃料乙醇势必将会严重影响粮食和饲料供给。纤维素是地球上最廉价、最丰富的可再生资源之一，应用纤维素作为原料可以有效地避免乙醇生产和人类粮食供给的矛盾。同时，由于纤维素也是太阳能的转化载体之一，生产和利用纤维素乙醇，并不会引起环境中CO₂总量的增加。因此，纤维素生物质已成为大规模燃料乙醇生产中极具吸引力的原料。对我国而言，发展不与人争粮、不与粮争地，环境友好的纤维素乙醇有利于低碳经济的发展，有助于推动生物质能源替代化石燃料的进程。

利用纤维素生产燃料乙醇，其最大的瓶颈在于生产成本过高。由纤维素到乙醇的转化目前有四种策略可以实现：分步水解和发酵(SeparateHydrolysis and Fermentation，SHF)、同步糖化与发酵(SimultaneousSaccharification and Fermentation，SSF)、同步糖化与共酵解(SimultaneousSaccharification and Co-Fermentation，SSCF)和联合生物加工(ConsolidatedBioProcessing，CBP)。对于SHF、SSF和SSCF，其成本主要在于纤维素酶的生产或购买、纤维素原料的预处理、预处理物的糖化水解三个方面([Lynd，L.R.，Weimer，P.J.，van Zyl，W.H.，Pretorius，I.S.2002.Microbialcellulose utilization：fundamentals and biotechnology.Microbiol.Mol.Biol.Rev.66，506-577.]、[Xu，Q.，Singh，A.，Himmel，M.E.2009.Perspectivesand new directions for the production of bioethanol using consolidatedbioprocessing of lignocellulose.Curr.Opin.Biotechnol.20，364-371.])。联合生物加工(CBP)将纤维素酶生产、水解糖化和戊糖己糖共发酵整合在同一反应器内由同一微生物或微生物群落完成([Lynd，L.R.，van Zyl，W.H.，McBride，J.E.，Laser，M.2005.Consolidated bioprocessing of cellulosicbiomass：an update.Curr.Opin.Biotechnol.16，577-583.]、[Lynd，L.R.，Weimer，P.J.，van Zyl，W.H.，Pretorius，I.S.2002.Microbial celluloseutilization：fundamentals and biotechnology.Microbiol.Mol.Biol.Rev.66，506-577.])。其减少了工艺步骤；降低了工艺的复杂性；不需要为纤维素酶的生产或购买投入资金，因此可以大幅度降低生产成本，被公认为是最理想的纤维素乙醇生产路线([Cardona，C.A.，Sanchez，O.J.2007.Fuelethanol production：Process design trends and integration opportunities.Bioresource Technology 98，2415-2457.]、[Gray，K.A.，Zhao，L.，Emptage，M.2006.Bioethanol.Curr Opin Chem Biol 10，141-146.])。2009年，美国专利US2009/0068714A1报道了一种可将纤维素直接转化为乙醇的革兰氏阴性细菌，其可以分解城市垃圾、甘蔗渣、木屑、纤维素废弃物等多种物质，一步反应后，乙醇转化率能达到理论产率的90％左右。除此之外，却再没有一种能满足所有CBP工艺要求的天然微生物菌株被报道。近年来，国内外围绕着能适应CBP工艺要求的菌株的选育，遗传改造等方面进行了大量研究，主要包括改造纤维素酶产生菌使其能发酵糖高产乙醇、改造乙醇产生菌使其获得降解纤维素和共发酵多种水解糖的能力两种策略。Clostridium thermocellum([Heap，J.T.，Kuehne，S.A.，Ehsaan，M.，Cartman，S.T.，Cooksley，C.M.，Scott，J.C.，Minton，N.P.2010.The ClosTron：Mutagenesis in Clostridium refined and streamlined.Journal ofMicrobiological Methods 80，49-55.])、Saccharomyces cerevisiae([van Zyl，W.H.，Lynd，L.R.，den Haan，R.，McBride，J.E.2007.Consolidatedbioprocessing for bioethanol production using Saccharomyces cerevisiae.AdvBiochem Eng Biotechnol 108，205-235.])、Candida mycoderma、Pichiapastoris、Zymomonas mobilis([Rogers，P.L.，Jeon，Y.J.，Lee，K.J.，Lawford，H.G.2007.Zymomonas mobilis for fuel ethanol and higher value products.Adv Biochem Eng Biotechnol 108，263-288.])、Escherichia col([Dien，B.S.，Cotta，M.A.，Jeffries，T.W.2003.bacteria engineerd for fuel ethanolproduction：current status.Applied Microbiology and Biotechnology 63.])、Klebsiella oxytoca([Jarboe，L.R.，Shanmugam，K.T.，Ingram，L.O.2009.Ethanol.in：Encyclopedia of Microbiology，(Ed.)S.Moselio，Academic Press.Oxford，pp.295-304.])、Trichoderma reese([Xu，Q.，Singh，A.，Himmel，M.E.2009.Perspectives and new directions for the production of bioethanol usingconsolidated bioprocessing of lignocellulose.Curr.Opin.Biotechnol.20，364-371.])等菌都在不同程度上受到了研究。其中，较成功的例子是Shaw等([Shaw，A.J.，Podkaminer，K.K.，Desai，S.G.，Bardsley，J.S.，Rogers，S.R.，Thorne，P.G.，Hogsett，D.A.，Lynd，L.R.2008.Metabolic engineering of athermophilic bacterium to produce ethanol at high yield.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.])采用基因工程技术敲除了Thermoanaerobacterium saccharolyticum中的乙酸激酶、磷酸乙酰转移酶和乳酸脱氢酶基因，调整了代谢流向，极大地减少了乙酸、乳酸等副产物，使菌株的产乙醇能力大大提高。重组后的菌株共发酵葡萄糖、木糖、甘露糖、阿拉伯糖等，可获得37g/L乙醇。这一方法成功地提高了Thermoanaerobacterium saccharolyticum的产乙醇能力，但是其仍以糖类为底物，要利用它转化纤维素为乙醇，仍需要为纤维素的水解糖化投入大量的成本，此种方法并不能完全解决纤维素乙醇生产成本高的难题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种生产纤维素乙醇的方法，以改善公知技术中存在的缺陷。

为实现上述目的，本发明提供的生产纤维素乙醇的方法，主要包括以下步骤：

a)将厌氧纤维素降解菌和乙醇厌氧杆菌接种于种子液培养基中，厌氧条件下50-70℃进行活化；

种子液培养基为：KH₂PO₄ 0.5-3g/L，K₂HPO₄ 1-4g/L，氮源1-3g/L，MgCl₂·6H₂O 0.5-2g/L，CaCl₂·2H₂O 100-200mg/L，FeSO₄·6H₂O 0.5-2mg/L，Cysteine hydrochloride 0.5-2g/L，刃天青1-3mg/L，碳源4-6g/L，Morpholinopropane sulfonic acid 6-15g/L，酵母浸出物4-7g/L，Sodiumcitrate·2H₂O 1.5-3.5g/L；

b)将活化后的厌氧纤维素降解菌液接种于碳源为微晶纤维素的种子液培养基中，将乙醇厌氧杆菌液接种于碳源为葡萄糖的种子液培养基中，培养得到种子液；

c)种子液接种于发酵培养基中，厌氧条件下，培养温度50-70℃，培养时压力为-0.1MPa～0.1MPa，发酵时pH为6.5-8.0，发酵至纤维素降解。

所述的方法中，氮源为尿素、黄豆饼粉、花生饼粉、玉米浆、硫酸铵、氯化铵、硝酸铵、碳酸铵、碳酸氢铵、磷酸二氢铵、磷酸氢二铵中的一种或任何几种的组合。

所述的方法中，碳源为葡萄糖、微晶纤维素、稻草、玉米秸秆、麦秆、莎草、甘蔗渣、木屑的预处理物中的一种或任何几种的组合。

所述的方法中，碳源浓度大于15g/L，碳氮摩尔比为4-6∶1。

所述的方法中，所用厌氧纤维素降解菌包括热纤梭菌(Clostridiumthermocellum)、嗜热解糖梭菌(Clostridium thermosaccharolyticum)、布氏嗜热厌氧杆菌(Thermoanaerobacterium brockii)、嗜热厌氧解木聚糖杆菌(Thermoanaerobacterium xylanolyticum)和嗜热厌氧解多糖杆菌(Thermoanaerobacterium polysaccharolyticum)，以及在它们基础上进行的任何突变株；

所用产乙醇厌氧杆菌包括嗜热厌氧乙醇杆菌(Thermoanaerobacterethanolicus)、麻氏嗜热厌氧杆菌(Thermoanaerobacterium mathranii)、嗜热厌氧糖化杆菌(Thermoanaerobacterium saccharolyticum)和意大利嗜热厌氧杆菌(Thermoanaerobacter italicus)，以及在它们基础上进行的任何突变株。

所述的方法中，厌氧纤维素降解菌和乙醇厌氧杆菌的接种体积比为10∶1-1∶3。

所述的方法中，发酵培养中的菌种接种量体积比为1∶10～1∶50。

所述的方法中，种子液培养基中碳源浓度大于15g/L时，控制pH为6.8-7.2。

所述的方法中，发酵采用分批发酵、补料-分批发酵、连续发酵或半连续发酵的方式。

所述的方法中，发酵时采用间歇性或低速搅拌。

本发明突破了传统的单一菌种发酵，采用本身具有较强纤维素降解能力的高温厌氧纤维素降解菌和有较强乙醇转化能力的高温产乙醇厌氧杆菌进行混合培养。利用高温厌氧纤维素降解菌产生的纤维素酶和半纤维素酶降解纤维素、半纤维素得到纤维二塘、纤维糊精、木糖、木聚二糖等可发酵成分，同时由高温产乙醇厌氧杆菌将还原糖直接转化为乙醇。高温纤维素降解菌与高温产乙醇厌氧杆菌二者互利共生，相互促进，直接发酵纤维素糖醇转化率可达理论值的71％。自然界中菌种众多，到底哪种组合最优呢？经过我们探索，以高温纤维素降解菌与高温产乙醇厌氧杆菌混合发酵的纤维素乙醇生产模式，采用本发明中列举的高温细菌，是目前为止最优的组合。

具体实施方式

本发明开发了一条直接转化纤维素生物质为燃料乙醇的工艺。所要解决的技术问题可以通过以下方案来实现：

高温纤维素降解菌是一类厌氧纤维素降解菌，其能在60℃左右快速生长，并产生大量的纤维小体分解纤维素、半纤维素为纤维二塘、木糖、木聚二糖等。其本身也能利用分解产生的小分子物质生产乙醇、乙酸、乳酸、CO₂和H₂。本发明所采用的高温纤维素降解菌为能耐受3％乙醇、抗逆性能强的布氏嗜热厌氧杆菌(Thermoanaerobacterium brockii)菌株。高温产乙醇厌氧杆菌能与高温纤维素降解菌混合培养，其最大的特点在于可以同时利用纤维素降解菌分解纤维素产生的己糖和戊糖转化为乙醇，副产物为乙酸、乳酸、CO₂和H₂。本发明采用的高温产乙醇厌氧杆菌为能耐受6％乙醇、抗逆性能强的麻氏嗜热厌氧杆菌(Thermoanaerobacterium mathranii)菌株。布氏嗜热厌氧杆菌与麻氏嗜热厌氧杆菌共同培养、高温厌氧发酵，可省去发酵过程中通入氧气或压缩空气所需的昂贵消耗；高温发酵不易发生污染，可减少冷却用水，还有助于乙醇的回收提取；二者的细胞得率都很低，有利于总转化率的提高。这些都将进一步降低纤维素乙醇的生产成本。

本发明以纤维素生物质为原料，如微晶纤维素或稻草、玉米秸秆、麦秆、莎草、甘蔗渣，木屑等的预处理物为原料，发酵法直接生产乙醇，主要包括以下步骤：

1)发酵种子液的制备。种子液培养基以尿素为氮源，布氏嗜热厌氧杆菌以5g/L微晶纤维素为碳源，麻氏嗜热厌氧杆菌以5g/L葡萄糖为碳源，其余成分与2中发酵培养基配方相同。

2)按配方：KH₂PO₄ 1.5g/L，K₂HPO₄(anhydrous)2.9g/L，氮源2.1g/L，MgCl₂·6H₂O 1.0g/L，CaCl₂·2H₂O 150mg/L，FeSO₄·6H₂O 1.25mg/L，Cysteinehydrochloride 1.0g/L，刃天青2.0mg/L，碳源5.0g/L，Morpholinopropanesulfonic acid(MOPS)10.0g/L(恒定pH时可不添加)，酵母浸出物6.0g/L，Sodium citrate·2H₂O 3.0g/L配制发酵培养基，并灭菌。其中，碳源为纤维素质生物质，氮源为有机或无机氮源；灭菌前调节pH为7.6；若需扩大底物浓度，则仍应保持碳氮比为5∶1。

3)接种：将培养好的种子液按一定比例接入厌氧瓶或发酵罐中。

4)培养：温度60℃，厌氧，罐或瓶压为-0.1MPa～0.1MPa，间歇性或低速搅拌。高底物浓度(碳源浓度大于15g/L)发酵时应控制pH恒定为7.0左右。发酵方式可采用分批，补料分批，连续或半连续等。

按照以上步骤，发酵纤维素质生物质生产乙醇是本技术领域的技术人员能够实现的。本发明开发的直接转化纤维素质生物质为乙醇的工艺，基于CBP工艺思路，突破了传统的单菌纯种培养，采用高温纤维素降解菌与高温产乙醇厌氧杆菌混合发酵，分别同时进行纤维素降解和乙醇转化，进一步降低了燃料乙醇的生产成本。

具体实施方式

以下的实施例可以使本专业技术领域的技术人员更全面的了解本发明，但不以任何方式限制本发明。

实施例1：100ml厌氧瓶发酵

1)用1ml注射器各取100μl布氏嗜热厌氧杆菌(Thermoanaerobacteriumbrockii)菌和麻氏嗜热厌氧杆菌(Thermoanaerobacterium mathranii)的甘油管菌种，接种于装有5ml种子培养基(按配方KH₂PO₄ 1.5g/L，K₂HPO₄(anhydrous)2.9g/L，urea 2.1g/L，MgCl₂·6H₂O 1.0g/L，CaCl₂·2H₂O 150mg/L，FeSO₄·6H₂O 1.25mg/L，Cysteine hydrochloride 1.0g/L，刃天青2.0mg/L，microcrystalline cellulose 5.0g/L，Morpholinopropane sulfonic acid 10.0g/L，Yeast extract 6.0g/L，Sodium citrate·2H₂O 3.0g/L，pH为7.6)的厌氧瓶中，60℃恒温培养，活化菌种。

2)将活化好的布氏嗜热厌氧杆菌液3ml和麻氏嗜热厌氧杆菌液1ml分别接种于30ml种子培养基中，60℃，恒温培养箱中培养24-48小时，得到一级种子液。

3)按配方[KH₂PO₄ 1.5g/L，K₂HPO₄(anhydrous)2.9g/L，urea 2.1g/L，MgCl₂·6H₂O 1.0g/L，CaCl₂·2H₂O 150mg/L，FeSO₄·6H₂O 1.25mg/L，Cysteinehydrochloride 1.0g/L，刃天青2.0mg/L，microcrystalline cellulose 5.0g/L，Morpholinopropane sulfonic acid 10.0g/L，Yeast extract 6.0g/L，Sodiumcitrate·2H₂O 3.0g/L]配制发酵培养基，调整初始pH为7.6。分装培养基100ml于250ml厌氧瓶中，不断通入氮气，并用聚丁酯塞密封，以保证瓶内厌氧环境。115℃，15min湿热灭菌。其中，钙、镁、铁盐分别配成100X母液于灭菌后加入。

4)测定布氏嗜热厌氧杆菌和麻氏嗜热厌氧杆菌一级种子液的A₆₀₀，计算总体积10ml下布氏嗜热厌氧杆菌与麻氏嗜热厌氧杆菌A₆₀₀比为3∶1时的体积。按计算所得的结果接种布氏嗜热厌氧杆菌和麻氏嗜热厌氧杆菌于100ml发酵培养基中，60℃恒温培养。

5)约36h后纤维素被完全降解，停止培养获得发酵液中乙醇浓度为1.7g/L，糖醇转化率33.8％。

实施例2：5L发酵罐发酵

1)按照实施例1所述方法制备布氏嗜热厌氧杆菌一级种子液200ml，麻氏嗜热厌氧杆菌一级种子液100ml，并计算接种量为1∶10，发酵液总体积为2L时各自所需体积。

2)按配方[KH₂PO₄ 1.5g/L，K₂HPO₄(anhydrous)2.9g/L，urea 17.8g/L，MgCl₂·6H₂O 1.0g/L，CaCl₂·2H₂O 150mg/L，FeSO₄·6H₂O 1.25mg/L，Cysteinehydrochloride 1.0g/L，刃天青2.0mg/L，microcrystalline cellulose 80g/L，Yeast extract 6.0g/L，Sodium citrate·2H₂O 3.0g/L]配制发酵培养基(钙、镁、铁盐母液灭菌后加入)，115℃，15min湿热灭菌。

3)灭菌结束后，不断向发酵罐中通入氮气，以去除培养基及发酵罐内的氧气。待培养基由淡蓝色或粉红色(刃天青的颜色)变成无色后，调节培养基pH恒定为7.0，罐温60℃，同时接入所需体积的#143菌和#146菌一级种子液，停止通气，80rpm搅拌发酵。

4)约168h后纤维素被全部消耗，发酵液中乙醇浓度达21.7g/L，转化率达36.17％，为理论值的71％。

以上是结合具体实施例子对本发明所做的进一步描述。本领域技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (10)

1.一种生产纤维素乙醇的方法，主要包括以下步骤：

a)将厌氧纤维素降解菌和乙醇厌氧杆菌接种于种子液培养基中，厌氧条件下50-70℃进行活化；

种子液培养基为：KH₂PO₄0.5-3g/L，K₂HPO₄1-4g/L，氮源1-3g/L，MgCl₂·6H₂O 0.5-2g/L，CaCl₂·2H₂O 100-200mg/L，FeSO₄·6H₂O 0.5-2mg/L，Cysteine hydrochloride 0.5-2g/L，刃天青1-3mg/L，碳源4-6g/L，Morpholinopropane sulfonic acid 6-15g/L，酵母浸出物4-7g/L，Sodiumcitrate·2H₂O 1.5-3.5g/L；

b)将活化后的厌氧纤维素降解菌液接种于碳源为微晶纤维素的种子液培养基中，将乙醇厌氧杆菌液接种于碳源为葡萄糖的种子液培养基中，培养得到种子液；

c)种子液接种于发酵培养基中，厌氧条件下，培养温度50-70℃，培养时压力为-0.1MPa～0.1MPa，发酵时pH为6.5-8.0，发酵至纤维素降解。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，氮源为尿素、黄豆饼粉、花生饼粉、玉米浆、硫酸铵、氯化铵、硝酸铵、碳酸铵、碳酸氢铵、磷酸二氢铵、磷酸氢二铵中的一种或任何几种的组合。

3.根据权利要求1所述的方法，其中，碳源为葡萄糖、微晶纤维素、稻草、玉米秸秆、麦秆、莎草、甘蔗渣、木屑的预处理物中的一种或任何几种的组合。

4.根据权利要求1所述的方法，其中，碳源浓度大于15g/L，碳氮摩尔比为4-6∶1。

5.根据权利要求1所述的方法，其中，所用厌氧纤维素降解菌包括热纤梭菌(Clostridium thermocellum)、嗜热解糖梭菌(Clostridiumthermosaccharolyticum)、布氏嗜热厌氧杆菌(Thermoanaerobacteriumbrockii)、嗜热厌氧解木聚糖杆菌(Thermoanaerobacterium xylanolyticum)和嗜热厌氧解多糖杆菌(Thermoanaerobacterium polysaccharolyticum)，以及在它们基础上进行的任何突变株；

所用产乙醇厌氧杆菌包括嗜热厌氧乙醇杆菌(Thermoanaerobacterethanolicus)、麻氏嗜热厌氧杆菌(Thermoanaerobacterium mathranii)、嗜热厌氧糖化杆菌(Thermoanaerobacterium saccharolyticum)和意大利嗜热厌氧杆菌(Thermoanaerobacter italicus)，以及在它们基础上进行的任何突变株。

6.根据权利要求1或5所述的方法，其中，厌氧纤维素降解菌和乙醇厌氧杆菌的接种体积比为10∶1-1∶3。

7.根据权利要求1所述的方法，其中，发酵培养中的菌种接种量体积比为1∶10～1∶50。

8.根据权利要求1所述的方法，其中，种子液培养基中碳源浓度大于15g/L时，控制pH为6.8-7.2。

9.根据权利要求1所述的方法，其中，发酵采用分批发酵、补料-分批发酵、连续发酵或半连续发酵的方式。

10.根据权利要求1所述的方法，其中，发酵时采用间歇性或低速搅拌。