CN102864089A - 一种热纤梭菌高密度培养的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于微生物发酵工程领域，具体是一种热纤梭菌高密度培养的方法。其特征是以GS-2培养基为初始培养基，通过多元数理统计方法优化发酵培养基，快速高效的提高热纤梭菌的菌体浓度。本发明的优点在于提供了一种快速获取热纤梭菌大量菌体浓度的发酵培养基，为后续生产转化纤维素为生物乙醇效率特别高的纤维小体做铺垫。本发明所得热纤梭菌的菌体密度比初始培养基提高6～9倍，瓶装条件下OD600达到8.85，发酵罐中OD600达到12.7。
Description
技术领域
本发明涉及微生物发酵工程领域，具体是热纤梭菌高密度培养的方法。
背景技术
随着全球能源和环境危机的加剧，寻求替代能源已成为许多国家的研究热点，这其中清洁，可再生的生物能源是替代能源研究的重要方面，而生物乙醇是最有发展前景的液体生物能源之一，然而目前生物乙醇还主要来自糖类和淀粉发酵，面对世界人口的急剧膨胀和粮食短缺，用粮食生产酒精的发展将受到诸多限制(王丹，林建强等，2002)。
纤维素是地球上最丰富的可再生资源，但只有极少数被有效利用，绝大部分被作为废物弃置在环境中，反而造成一定的环境污染，比如城市垃圾。所以用纤维素物料生产新型生物燃料，因为具有重大战略意义而引起世界各国的广泛重视(闻志强，姜薇，2010)。但是木质纤维素由于极其复杂的结构，导致其降解十分困难(Christian Weber & Alexander Farwicket.al，2010)。嗜热厌氧的热纤梭菌(Clostridium thermocellum)因能直接将纤维素转化为乙醇而吸引了众多研究者的注意力，该菌可从每摩尔葡萄糖对等物中产生出高达1mol的乙醇，有学者研究指出，热纤梭菌是将纤维素直接转化为乙醇的最有效菌之一(Lynd.et al，2002)。研究表明(Lamedr，1984)，热纤梭菌中广泛存在的纤维小体(cellulosome)是其能够直接把纤维素转化为乙醇的关键所在，因为纤维小体具有类似核糖体的大分子结构，能协调、有序、高效地降解纤维素。
虽然当前广泛使用的纤维素酶主要由木霉，青酶和曲霉等真菌产生和生产，然而真菌生产的纤维素酶主要是酸性纤维素酶，而细菌和放线菌产生的纤维素酶往往具有耐碱耐热等独特优点，其应用将大有前景。细菌的纤维素酶即以纤维小体的形式存在(黄俊，陈东，黄日波，2011)。
热纤梭菌是一种高温、厌氧、纤维素降解菌，能在60℃下快速生长，并产生大量的纤维小体分解纤维素、半纤维素为纤维二糖、木糖、木聚二糖等。其本身也能利用分解产生的小分子物质生产乙醇、乙酸、乳酸、CO2和H2。然而热纤梭菌存在乙醇产量低和乙醇耐受性差等突出缺点，强烈抑制了纤维小体的高效表达。同时高能耗的前处理过程和纤维素酶本身高昂的价格极大的制约了纤维素生物质能源的利用，所以如果能有效提高纤维小体的表达水平，将对于降低纤维素酶的成本，以及进一步降低纤维素生物质的利用成本具有重要意义。热纤梭菌的高密度培养可能是实现该目的的方法之一。
高密度发酵是快速获取菌体及其主要代谢物的主要方法，也是商业化生产的前提条件，对于提高发酵工业中的生产强度，降低生产成本具有重要意义(陈保立，王世立等，2009)，然而热纤梭菌的高密度培养还未见报道，本发明将填补此方面的空白。
发明内容
本发明开发了热纤梭菌高密度培养的工艺。所要解决的技术问题可以通过以下方案来实现：
本发明以纤维素质生物质二糖降解物，如纤维二糖或木聚二糖为原料，发酵法直接高密度培养，主要包括以下步骤：
1.发酵种子液的制备。种子液培养基为GS-2：KH2PO4 1.5g/L，K2HPO4(anhydrous)2.9g/L，氮源2.1g/L，MgCl2·6H2O 1.0g/L，CaCl2·2H2O 150mg/L，FeSO4·6H2O 1.25mg/L，Cysteinehydrochloride 1.0g/L，Resazurin 2.0mg/L，碳源5.0g/L，Morpholinopropane sulfonicacid(MOPS)10.0g/L，Yeast extract 6.0g/L，Sodium citrate·2H2O 3.0g/L配制发酵培养基，初始pH为7.4。
2.高密度发酵培养基配方：KH2PO4 1.2g/L，K2HPO4(anhydrous)6.0g/L，氮源5.0g/L，MgCl2·6H2O 2.49g/L，CaCl2·2H2O 150mg/L，FeSO4·6H2O 1.25mg/L，Cysteine hydrochloride2.0g/L，Resazurin 2.0mg/L，碳源20.0g/L，Morpholinopropane sulfonic acid(MOPS)10.0g/L，Yeast extract 12.0g/L，Sodium citrate·2H2O 0.752g/L配制发酵培养基，并灭菌。其中，碳源为纤维素质生物质，氮源为有机或无机氮源；灭菌前调节pH为8.0；若需扩大底物浓度，则仍应保持碳氮比为5∶1。
3.接种。将培养好的种子液按一定比例接入厌氧瓶或发酵罐中。
4.培养。温度60℃，厌氧，罐或瓶压为-0.1MPa～0.1MPa，间歇性或低速搅拌。高底物浓度(碳源浓度大于15g/L)发酵时应控制pH恒定为7.0左右。发酵方式可采用分批，补料分批，连续或半连续等。
5.经24h-48h后菌体浓度达到最大，瓶装条件下OD600达到8.85，发酵罐中OD600达到12.7。
按照以上步骤，热纤梭菌高密度培养是本技术领域的技术人员能够实现的。本发明具有显著优势：厌氧条件可省去发酵过程中通入氧气或压缩空气所需的昂贵能源消耗；高温发酵不易发生污染，可减少冷却用水，这些都将进一步降低热纤梭菌高密度培养的生产成本。
附图说明
无
具体实施方式
实施例1：100ml厌氧瓶发酵
1.用1mL注射器取100μL C.thermocellum JYT01的甘油管菌种，接种于装有5mL种子培养基的厌氧瓶中，60℃恒温培养，活化菌种。
2.将活化好的C.thermocellum JYT01菌液3mL接种于50mL种子培养基中，60℃，恒温培养箱中培养24小时，得到一级种子液。
3.按配方“KH2PO4 1.0g/L，K2HPO4(anhydrous)6.0g/L，urea 5.0g/L，MgCl2·6H2O 2.49g/L，CaCl2·2H2O 135mg/L，FeSO4·6H2O 5.0mg/L，Cysteine hydrochloride 2.0g/L，Resazurin 2.0mg/L，cellobiose 20.0g/L，Morpholinopropane sulfonic acid(MOPS)10.0g/L，Yeast extract 10.0g/L，Sodium citrate·2H2O 0.752g/L”配制发酵培养基，调整初始pH为8.0。分装培养基100mL于300ml厌氧瓶中，不断通入氮气排净瓶内空气，并用聚丁酯塞密封，以保证瓶内厌氧环境。115℃，15min湿热灭菌。其中，钙、镁、铁盐分别配成100X母液于灭菌后加入。
4.约24h后菌体浓度达到最大，停止培养获得发酵液中OD600为8.85.
实施例2：5L发酵罐发酵
1.按照实施例1所述方法制备C.thermocellum JYT01一级种子液200ml，并计算接种量为1∶10，发酵液总体积为2L时各自所需体积。
2.按配方“KH2PO4 1.0g/L，K2HPO4(anhydrous)6g/L，urea 17.8g/L，MgCl2·6H2O2.49g/L，CaCl2·2H2O 135mg/L，FeSO4·6H2O 5mg/L，Cysteine hydrochloride 2.0g/L，Resazurin 2.0mg/L，cellobiose 30.0g/L，Yeast extract 12.0g/L，Sodium citrate·2H2O 0.752g/L”配制发酵培养基(钙、镁、铁盐母液灭菌后加入)，115℃，15min湿热灭菌。
3.灭菌结束后，不断向发酵罐中通入氮气，以去除培养基及发酵罐内的氧气。待培养基由淡蓝色或粉红色(刃天青的颜色)变回其自身的颜色后，调节培养基pH恒定为7.0，罐温60℃，同时接入所需体积的JYT01一级种子液，停止通气，80rpm搅拌发酵。
4.约48h后碳源被全部消耗，发酵液中菌体浓度达12.7(OD600)。
以上是结合具体实施例子对本发明所做的进一步描述。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
参考文献
陈保立，王世立和韩金榜(2009)，重组大肠杆菌高密度培养的研究进展。中国生物制品学杂志，22(11)：1156-1159.
Christian Weber & Alexander Farwick et.al(2010).Trends and challenges in the microbial production of lignocellulosicbioalcohol fuels.Appl Microbiol Biotechnol 87：1303-1315.
Lamed R，setter E，Bayer EA(1983).Characterization of acellulose binding，cellulase containing complex in Clostridiumthermocellum.J Bacteriol，156：828-836.
Lynd LR(1996).Overview and evaluation of fuel ethanol from cellulosic biomass：technology，economics，theenvironment and policy.Annu Rev Energy Environ 21：403-465.
Lynd，L.R.，P.J.Weimer，et al.(2002).″Microbial cellulose utilization：fundamentals and biotechnology.″Microbiol.Mol.Biol.Rev.66(3)：506-577.
王丹，林建强，曲音波，等(2002).直接生物转化纤维素类资源生产燃料乙醇的研究进展.山东农业大学学 报(自然科学版)，33(4)：525-529.
闻志强，姜薇，林建平，等(2010).产纤维小体细菌厌氧降解纤维素制乙醇的研究进展.微生物学通报，37(5)：732-737.
Claims (7)
1.一种热纤梭菌高密度培养的方法，其特征是以GS-2培养基为初始培养基，通过高温，厌氧发酵，在反应器中实现热纤梭菌的高密度培养。主要包括以下步骤：
1)菌种
热纤梭菌(Clostridium thermocellum)JYT01
2)培养基的制备
种子液培养基为：KH2PO4 1.5g/L，K2HPO4(anhydrous)2.9g/L，氮源2.1g/L，MgCl2·6H2O 1.0g/L，CaCl2·2H2O 150mg/L，FeSO4·6H2O 1.25mg/L，Cysteine hydrochloride1.0g/L，Resazurin 2.0mg/L，碳源5.0g/L，Morpholinopropane sulfonic acid(MOPS)10.0g/L，Yeast extract 6.0g/L，Sodium citrate·2H2O 3.0g/L配制发酵培养基，初始pH为7.4。高密度发酵培养基配方：KH2PO4 1.2g/L，K2HPO4(anhydrous)6.0g/L，氮源5.0g/L，MgCl2·6H2O 2.49g/L，CaCl2·2H2O 150mg/L，FeSO4·6H2O 1.25mg/L，Cysteine hydrochloride2.0g/L，Resazurin 2.0mg/L，碳源20.0g/L，Morpholinopropane sulfonic acid(MOPS)10.0g/L，Yeast extract 12.0g/L，Sodium citrate·2H2O 0.752g/L配制发酵培养基，并灭菌。灭菌前调节pH为8.0。
3)接种
将培养好的种子液按1∶20-1∶60(V∶V)比例接入厌氧瓶或发酵罐中。
4)培养
温度50-70℃，厌氧，罐或瓶压为-0.1MPa～0.1MPa，搅拌转速为60-100rpm。高底物浓度(碳源浓度大于15g/L)发酵时应控制pH为6.0-8.0。培养时间为12h-48h。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征是所用菌株为热纤梭菌(Clostridium thermocellum)JYT01以及在它们基础上进行的任何突变株。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征是所述优选发酵条件为：厌氧，温度为60-65℃，罐或瓶压为-0.1MPa～0.1MPa，接种量为1∶40-1∶50(V/V)，高底物浓度(碳源浓度大于15g/L)上罐发酵时，需控制pH恒定为6.5-8.0，搅拌转速为70-80rpm，发酵时间为24h-48h。
4.根据权利要求1所述的方法，碳源为纤维素质生物质，氮源为有机或无机氮源；当增加碳源浓度时，应保持碳氮比为5.5∶1-5∶1。
5.根据权利要求1所述的培养基，其特征是所述碳源为纤维二糖，木聚二糖中之一或它们的任何组合。
6.根据权利要求1所述的培养基，其特征是所述氮源为有机氮源，包括酵母粉，尿素、玉米浆、生物素中之一或它们的任何组合。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征是所述发酵的方式分批发酵，补料-分批发酵，连续发酵或半连续发酵。
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