CN109337852A

CN109337852A - 一种重组克雷伯氏杆菌在生产1,3-丙二醇中的应用

Info

Publication number: CN109337852A
Application number: CN201811336104.4A
Authority: CN
Inventors: 诸葛斌; 谢梦梦; 滕宇; 陆信曜; 宗红
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2018-11-12
Filing date: 2018-11-12
Publication date: 2019-02-15
Anticipated expiration: 2038-11-12
Also published as: CN109337852B

Abstract

本发明公开了一种重组克雷伯氏杆菌在生产1,3‑丙二醇中的应用，具体公开了在克雷伯氏杆菌中异源表达铜绿假单胞菌中mexF基因以提高1,3‑丙二醇产量的方法和应用，属于基因工程技术领域。本发明应用基因工程方法，将带有铜绿假单胞菌中mexF基因的质粒转入到克雷伯氏杆菌中，增强克雷伯氏杆菌对短链醇的转运效率，从而提高1,3‑丙二醇的产量。重组菌在5L发酵罐中补料分批发酵，1,3‑丙二醇产量高达74g/L。此方法成功改善了克雷伯氏杆菌对1,3‑丙二醇的转运能力，为提高1,3‑丙二醇产量提供了新方法，也为选育1,3‑丙二醇高产菌株提供了新思路。

Description

一种重组克雷伯氏杆菌在生产1,3-丙二醇中的应用

技术领域

本发明涉及一种重组克雷伯氏杆菌在生产1,3-丙二醇中的应用，具体涉及在克雷伯氏杆菌中异源表达铜绿假单胞菌中mexF基因以提高1,3-丙二醇产量的方法和应用，属于基因工程技术领域。

背景技术

1,3-丙二醇是国际上公认的六大石化新产品之一，在纺织、塑料及食品包装等方面具有广阔的应用前景，其主要功能是作为合成聚酯、聚醚和聚亚氨酯的单体，它和对苯二甲酸聚合而成的聚对苯二甲酸丙二醇酯(PTT)是合成新型优质聚酯材料的前体物质。

1,3-丙二醇的生产方法有化学合成法和生物转化法。生物转化法生产1,3-丙二醇具有显著的优点，成为当前的研究热点。用于生产1,3-丙二醇的菌株均为细菌，主要有克雷伯氏杆菌、弗氏柠檬菌、成团肠杆菌、短乳杆菌、布氏乳杆菌、丁酸梭状芽孢杆菌和巴斯德梭菌等，它们只能利用甘油而不能由糖类等廉价碳源直接产生1,3-丙二醇。其中克雷伯氏杆菌具有相对较高的底物转化率和生产强度，因而得到了较多关注。

1,3-丙二醇在克雷伯氏杆菌中合成，是生长偶联的代谢产物，克雷伯氏杆菌的生物量的提高有利于1,3-丙二醇的积累。而现有的对克雷伯氏杆菌改造策略往往造成生物量的下降或略微提高，也不能提高对底物的耐受。因此，提供一种产量和生物量提高的1,3-丙二醇的制备方法，对于1,3-丙二醇的生产应用具有重要的意义。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种重组克雷伯氏杆菌，其特征在于，是将来源于铜绿假单胞菌(Pseudomonadaceae Aeruginosa)的外排泵蛋白基因mexF连接到过表达载体上，将连接产物转入克雷伯氏杆菌(Klebsiella Peneumoniae)中得到的。

在本发明的一种实施方式中，所述外排泵蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述外排泵蛋白基因mexF的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在本发明的一种实施方式中，所述过表达载体是在pET-28a载体中引入了序列如SEQ ID NO.3所示的tac启动子。

在本发明的一种实施方式中，所述过表达载体的构建方法为：用EcoRI和BamHI双酶切pET28a和序列如SEQ ID NO.3所示的tac启动子，酶切后，PCR连接得到过表达载体pEtac-28a(+)。

本发明的第二个目的是提供一种上述的重组克雷伯氏杆菌的构建方法，所述方法包括：

1)从铜绿假单胞菌基因组中克隆外排泵蛋白基因mexF，其核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示；

2)将mexF基因与上述的过表达载体pEtac-28a相连，并将连接产物转化到Klebsiella Peneumoniae中。

在本发明的一种实施方式中，所述转化采用的是电击转化法。

本发明的第三个目的是提供上述的重组克雷伯氏杆菌在生产1,3-丙二醇中的应用。

在本发明的一种实施方式中，所述应用是以甘油为底物，以重组克雷伯氏杆菌为生物催化剂，采用分批补料的方式进行全细胞转化。

在本发明的一种实施方式中，所述应用包括将菌液以4％接种量接种到5L发酵罐中，厌氧，补料分批发酵重组克雷伯氏杆菌，流加甘油，使其保持在15-30g/L，37℃，150rpm，发酵48h。

本发明应用基因工程手段，将带有铜绿假单胞菌中mexF基因的过表达载体转入到克雷伯氏杆菌中，从而增加菌体对1,3-丙二醇的转运效率，提高克雷伯氏杆菌中1,3-丙二醇的产量。重组菌经5L发酵罐补料分批发酵，1,3-丙二醇产量高达74g/L。此发明成功提高了1,3-丙二醇的产量和菌体生物量，为选育1,3-丙二醇高产菌株提供了崭新的思路。

附图说明

图1：野生型克雷伯氏杆菌摇瓶发酵代谢产物分析。

图2：过表达铜绿假单胞菌来源的mexF基因的重组克雷伯氏杆菌补料分批发酵代谢产物分析。

图3：过表达铜绿假单胞菌来源的mexB基因的重组克雷伯氏杆菌补料分批发酵代谢产物分析。

图4：过表达内源的acrF基因的重组克雷伯氏杆菌补料分批发酵代谢产物分析。

具体实施方式

(一)培养基

5L发酵罐(g·L^-1)：甘油20，酵母膏8，葡萄糖6，MgSO₄ 2，(NH₄)₂SO₄ 2，KH₂PO₄ 7.5，FeSO₄·7H₂O 0.005，VB₁₂ 0.015，微量元素溶液0.1mL·L^-1，使用10mol·L^-1KOH调pH值至8.5。

微量元素溶液(g·L^-1)：Na₂MoO₄·2H₂O 0.35，CoCl₂·6H₂O 2，NiCl₂·6H₂O 0.25，H₃BO₃ 0.6，MnCl₂·4H₂O 1，CuCl₂ 0.2，ZnCl₂ 0.7。

50mL摇瓶培养基(g·L^-1)：甘油40，酵母膏8，葡萄糖6，MgSO₄ 2，(NH₄)₂SO₄ 2，KH₂PO₄7.5，FeSO₄·7H₂O 0.005，VB₁₂ 0.015，微量元素溶液0.1mL·L^-1，使用10mol·L^-1KOH调pH值至8.5。

(二)发酵产物检测方法

生物量测定：细胞干重(DCW)根据分光光度计测量OD₆₀₀值与干重对应关系公式1OD₆₀₀＝0.36g·L^-1。

产物测定：利用HPLC法检测发酵产物中1,3-PDO、2,3-BDO、乙酸、甘油、琥珀酸及乳酸的浓度，紫外与示差折光检测器检测，所用交换柱类型为有机酸离子交换柱，工作柱温：60℃；配制流动相浓度：5mmol·L^-1H₂SO₄；设定检测流速：0.6mL·min^-1。

实施例1重组克雷伯氏杆菌的制备

根据铜绿假单胞菌基因组序列获得mexF基因序列，扩增该片段。所用引物为：mexF-F(序列信息如SEQ ID No.4所示)和mexF-R(序列信息如SEQ ID No.5所示)。

反应体系如下(50μL)：25μL Prime STAR Max Premix(2×)，上下游引物各15pmol，150ng模板，加双蒸水至50μL(引物为上海生工生物工程有限公司合成，其余购自TaKaRa公司)，扩增反应条件如下：98℃，10s；55℃，15s，72℃，1kb/min，30个循环。

将得到的PCR扩增产物进行电泳验证，验证成功后采用UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒(上海生工生物工程有限公司)进行割胶回收。

回收程序按照试剂盒说明书进行：用刀片割出目标条带放入1.5mL的离心管，加结合缓冲液，置于55℃水浴加热10min，每2min混匀一次；胶完全融化后转移至套在收集管内的UNIQ-10柱中，室温放置2min；8000rpm，离心1min；倒掉收集管中的废液，加入500μL冲洗液，8000rpm室温离心1min，将该步骤重复一次；倒掉收集管中的废液，将UNIQ-10柱放入同一个收集管中，12000rpm离心15s；将UNIQ-10柱放入一根新的1.5mL的离心管中，在柱子膜中央滴加50μL的双蒸水，室温放置3min；12000rpm离心1min，离心管中的液体即为回收的DNA片段。

购买商业化pET-28a，人工合成序列信息如SEQ ID NO.3所示的tac启动子。用EcoRI和BamHI双酶切pET28a质粒和PCR的tac启动子片段，通过酶切连接进行pEtac-28a(+)表达载体的构建，将构建好的过表达载体用XhoI和Sal I双酶切，反应体系如下(50μL)：5μLQucikCut Buffer(10×)，1μL XhoI，1μL Sal I，30μL pEtac-28a(+)质粒片段，加双蒸水至50μL(酶购自TaKaRa公司)。反应条件如下：37℃，3h。酶切完后采用Cycle-Pure Kit(200)柱回收试剂盒(上海生工生物工程有限公司)进行回收。回收程序按照试剂盒说明：酶切产物放入1.5mL的离心管，加250mLCP buffer，轻轻离心1min；转移到收集管中的吸附柱中，室温放置2min；10000rpm，离心2min；产物重新收集到吸附柱，10000rpm，离心2min；倒掉收集管中的废液，加入700μL DNA Wash Buffer，10000rpm室温离心1min，将该步骤重复一次；倒掉收集管中的废液，将吸附柱柱放入同一个收集管中，10000rpm离心15s；将吸附柱放入新的1.5mL的离心管中，打开盖子，65℃，静置10min；在柱子膜中央滴加50μL的双蒸水，室温放置3min；8000rpm离心1min，离心管中的液体即为酶切回收的pEtac-28a(+)片段。

回收的mexF目标片段双酶切后连接pEtac-28a(+)表达载体，使用T4连接酶(购自TaKaRa公司)按照说明书完成连接工作，并将连接产物转化大肠杆菌，收集平板上菌体，提取质粒(质粒抽提试剂盒购自上海生工生物工程有限公司)，并转化克雷伯氏杆菌。

转化方法采用电击转化法。步骤如下：挑取单菌落接种于LB液体培养基中，37℃，150rpm培养10-16h活化，活化后的种子液按2％的接种量转接到50mL的LB培养基中，培养至OD₆₀₀值约为0.4-0.6左右。将菌夜放入冰中放置15-20min，然后4℃，8000rpm离心收集菌体，弃去上清液。用预冷的10％甘油洗涤菌体2-3次(每次离心后放冰上静止5min)。弃尽上清，加入2-3mL的10％预冷甘油重悬菌体，并转入已灭菌的1，5mL的离心管中，每管100μL用于电转化。加入待转化的质粒5μL，冰上放置10-15min。1mm的电转杯在超净工作台中烘干，并放入冰中冷却20min。

将混有质粒的感受态细胞加入电转杯中，2500V电压下，电击5ms左右，电击完成后加入1mL的LB培养基混匀后吸出全部菌液，37℃后培养1h，然后涂布于相应的卡那霉素抗性平板上，获得具有mexF基因的重组克雷伯氏杆菌，37℃，150rpm培养8h。

实施例2发酵表达铜绿假单胞菌来源的mexF基因的重组克雷伯氏杆菌

将菌液以4％接种量接种到5L发酵罐中，厌氧，补料分批发酵，流加甘油使其保持在15-30g/L，37℃，150rpm，发酵48h。不定时取样通过分光光度计测OD₆₀₀及通过HPLC测发酵产物。如图2所示，过表达铜绿假单胞菌mexF的基因重组菌在5L发酵罐中补料分批发酵，1,3-丙二醇产量高达74g/L。相较于野生型(见图1)，1,3-丙二醇产量提高了约37％，最高生物量提高了22.7％。

通过实施例2证实，在重组克雷伯氏杆菌中过表达铜绿假单胞菌基因mexF，可以增强克雷伯氏杆菌生产1,3-丙二醇能力。

对比例1铜绿假单胞菌来源的外排泵蛋白基因mexB在重组克雷伯氏杆菌中过表达

以铜绿假单胞菌基因组DNA为模板，设计引物进行PCR扩增获得铜绿假单胞菌来源的外排泵蛋白基因mexB基因片段(NCBI Gene ID:877852)。

其余步骤与实施例1和实施例2中一致，所得到的过表达铜绿假单胞菌来源的外排泵蛋白基因mexB基因的重组克雷伯氏杆菌在5L发酵罐中发酵时菌株的最高生物量减少了22.1％，1,3-PDO产量相比于野生型略有下降，如图3所示。

对比例2克雷伯氏杆菌来源的外排泵蛋白基因acrF在克雷伯氏杆菌中过表达

以克雷伯氏杆菌基因组DNA为模板，设计引物进行PCR扩增获得克雷伯氏杆菌来源的外排泵蛋白基因acrF序列片段，序列信息如SEQ ID NO.10所示。

其余步骤与实施例1和实施例2中一致，所得到的过表达克雷伯氏杆菌来源的外排泵蛋白基因acrF基因的重组克雷伯氏杆菌，在5L发酵罐中发酵生产时，1,3-PDO产量达到65g/L，但最高生物量相比于野生型降低了11.0％，如图4所示。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种重组克雷伯氏杆菌在生产1，3-丙二醇中的应用

<160> 10

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 3189

<212> DNA

<213> Pseudomonadaceae Aeruginosa

<400> 1

atgaatttct cccaattctt catccagcgg ccgatcttcg ccgcggtgct gtcgctgctg 60

atcctgatcg gcggcgccat ctccctgttc cagctaccca tcagcgagta cccggaagtg 120

gtgccgccga ccgtcgtggt ccgcgccaac ttccccggtg ccaacccgaa agtcatcggc 180

gaaaccgtcg cctctcccct ggagcaggcg atcaccgggg tggagaacat gctctacatg 240

tcctcccagt cgacctccga cggcaagctg accctgacca tcaccttcgc cctcggcacc 300

gacctggaca acgcccaggt acaggtgcag aaccgcgtca cccggaccga gccgaagctg 360

ccggaagaag tgacccggct cggcatcacc gtcgacaagg cctcgcccga cctgaccatg 420

gtcgtgcacc tgacctcgcc ggataaccgc tacgacatgc tctacctgtc gaactacgcg 480

gtgctcaacg tgaaggacga actggcccgc ctcgacggcg tcggcgacgt ccagctgttc 540

ggcctcggcg actattccct gcgcgtctgg ctggacccga acaaggtcgc ctcgcgcaac 600

ctcaccgcca ccgacgtggt caacgccatc cgcgagcaga accgccaggt cgccgccggc 660

accctgggcg caccgccggc gccgagcgcc accagcttcc agctgtcgat caacacccag 720

ggccgcctgg tcaacgagga agagttcgag aacatcatca tccgcaccgg cgccaacggc 780

gagatcaccc gcctgcgcga catcgcccgg gtcgagctgg gctccagcca gtacgccctg 840

cgctcgctgc tgaacaacaa gccggcggtg gcgatcccga tcttccagcg tcccggctcg 900

aacgccatcg agatctccaa cctggtgcgg gagaaaatgg ccgagctgaa gcagagcttc 960

ccgcagggca tggactactc catcgtctac gacccgacca ttttcgtccg cggctccatc 1020

gaggcggtgg tgcacaccct gttcgaagcc ctggtgctgg tggtgctggt ggtgatcctg 1080

ttcctgcaga cctggcgcgc ctcgatcatc cccctggccg cggtgccggt gtcgctgatc 1140

ggcaccttcg cggtgatgca catgctcggc ttctcgctca acgcgctgtc gctgttcggc 1200

ctggtgctgg cgatcggcat cgtggtcgac gacgccatcg tggtggtgga gaacgtcgag 1260

cgcaatatcg gcctcggcct caagccggtg gaagccacca agcgcgccat gcgcgaggtg 1320

accgggccga tcatcgccac ggcgctggtg ctctgcgcgg tgttcatccc gaccgcgttc 1380

atctccggcc tcaccgggca gttctaccgc cagttcgccc tgaccatcgc gatctccacg 1440

gtgatctcgg cgttcaactc gctgaccctg tcgccggcgc tggcggcggt cctgctcaag 1500

ggccaccacg agccgaagga ccgcttctcg gtattcctcg acaagctcct cggcggctgg 1560

ctgttccgtc cgttcaaccg cttcttcgac cgcgccagcc atggctacgt cggcacggtg 1620

aaccgggtcc tgcgcggcag ctcgatcgcc ctgctggtct acggcgggct gatggtgctg 1680

acctacttcg gcttctccag cacgccgacc ggtttcgtcc cgcagcagga caagcagtac 1740

cttgtggcct tcgcccagtt gcccgacgcg gccagcctgg accgtaccga ggcggtgatc 1800

aagcagatgt ccgagatcgc cctggcgcag cccggcgtgg ccgactcggt ggccttcccc 1860

ggcctgtcga tcaacggctt caccaacagc ccgaacagcg gcatcgtgtt caccccgctg 1920

aagccgttcg acgagcgcaa ggacccgagc cagtcggccg gcgccatcgc cgccgcgctg 1980

aacgccaagt acgccgacat ccaggacgcc tacatcgcga tcttcccgcc gccgccggta 2040

caggggctgg ggaccatcgg cggcttccgc ctgcagatcg aggaccgtgg caaccagggc 2100

tacgaggagc tgttcaagca gacccagaac atcatcgcca aggcccgtgc gctgcctgag 2160

ctggaaccca gctcggtgtt ctccagctac caggtcaacg tgccgcagat cgacgccgac 2220

atcgaccgcg agaaggccaa gacccacggc gtggcgatca gcgacatctt cgacaccctg 2280

caggtctacc tcggctcgct gtacgccaac gacttcaacc gcttcggccg tacctaccag 2340

gtcaatgtcc aggccgagca gcagttccgc ctcgaacccg agcagatcgg ccagctgaag 2400

gtgcgcaaca accttggcga gatggtcccg ctggcgtcct tcatcaaggt cagcgacacc 2460

tccggcccgg accgcgtgat gcactacaac ggcttcatca ccgccgaact gaacggcgcc 2520

ccggccgccg gctacagctc cggccaggcg caggcggcga tcgagaagct gctgaaggag 2580

gaactgccca acggcatgac ctacgagtgg accgagctga cctaccagca gatcctcgcc 2640

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gcccagtacg agagctggag cctgccgctg gcggtgatcc tgatcgtgcc gatgaccctg 2760

ctgtcggcga tcaccggggt gatcctggcc ggcagcgaca acaacatctt tacccagatc 2820

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cgcctgcggc cgatcctgat gacgtccatc gccttcatca tgggcgtggt gcccctggtg 3000

atctccaccg gcgccggcgc cgagatgcgt cacgcgatgg gcgtggcggt gttctccggg 3060

atgatcgggg tgaccttctt cggcctgctg ctgacgccgg tgttctacgt cctcatccgc 3120

cgcttcgtgg aaaaccgcga agcgcgccgc gccgccaacg acaaaggcct gccagaggtg 3180

catgcatga 3189

<210> 2

<211> 1062

<212> PRT

<213> Pseudomonadaceae Aeruginosa

<400> 2

Met Asn Phe Ser Gln Phe Phe Ile Gln Arg Pro Ile Phe Ala Ala Val

1 5 10 15

Leu Ser Leu Leu Ile Leu Ile Gly Gly Ala Ile Ser Leu Phe Gln Leu

20 25 30

Pro Ile Ser Glu Tyr Pro Glu Val Val Pro Pro Thr Val Val Val Arg

35 40 45

Ala Asn Phe Pro Gly Ala Asn Pro Lys Val Ile Gly Glu Thr Val Ala

50 55 60

Ser Pro Leu Glu Gln Ala Ile Thr Gly Val Glu Asn Met Leu Tyr Met

65 70 75 80

Ser Ser Gln Ser Thr Ser Asp Gly Lys Leu Thr Leu Thr Ile Thr Phe

85 90 95

Ala Leu Gly Thr Asp Leu Asp Asn Ala Gln Val Gln Val Gln Asn Arg

100 105 110

Val Thr Arg Thr Glu Pro Lys Leu Pro Glu Glu Val Thr Arg Leu Gly

115 120 125

Ile Thr Val Asp Lys Ala Ser Pro Asp Leu Thr Met Val Val His Leu

130 135 140

Thr Ser Pro Asp Asn Arg Tyr Asp Met Leu Tyr Leu Ser Asn Tyr Ala

145 150 155 160

Val Leu Asn Val Lys Asp Glu Leu Ala Arg Leu Asp Gly Val Gly Asp

165 170 175

Val Gln Leu Phe Gly Leu Gly Asp Tyr Ser Leu Arg Val Trp Leu Asp

180 185 190

Pro Asn Lys Val Ala Ser Arg Asn Leu Thr Ala Thr Asp Val Val Asn

195 200 205

Ala Ile Arg Glu Gln Asn Arg Gln Val Ala Ala Gly Thr Leu Gly Ala

210 215 220

Pro Pro Ala Pro Ser Ala Thr Ser Phe Gln Leu Ser Ile Asn Thr Gln

225 230 235 240

Gly Arg Leu Val Asn Glu Glu Glu Phe Glu Asn Ile Ile Ile Arg Thr

245 250 255

Gly Ala Asn Gly Glu Ile Thr Arg Leu Arg Asp Ile Ala Arg Val Glu

260 265 270

Leu Gly Ser Ser Gln Tyr Ala Leu Arg Ser Leu Leu Asn Asn Lys Pro

275 280 285

Ala Val Ala Ile Pro Ile Phe Gln Arg Pro Gly Ser Asn Ala Ile Glu

290 295 300

Ile Ser Asn Leu Val Arg Glu Lys Met Ala Glu Leu Lys Gln Ser Phe

305 310 315 320

Pro Gln Gly Met Asp Tyr Ser Ile Val Tyr Asp Pro Thr Ile Phe Val

325 330 335

Arg Gly Ser Ile Glu Ala Val Val His Thr Leu Phe Glu Ala Leu Val

340 345 350

Leu Val Val Leu Val Val Ile Leu Phe Leu Gln Thr Trp Arg Ala Ser

355 360 365

Ile Ile Pro Leu Ala Ala Val Pro Val Ser Leu Ile Gly Thr Phe Ala

370 375 380

Val Met His Met Leu Gly Phe Ser Leu Asn Ala Leu Ser Leu Phe Gly

385 390 395 400

Leu Val Leu Ala Ile Gly Ile Val Val Asp Asp Ala Ile Val Val Val

405 410 415

Glu Asn Val Glu Arg Asn Ile Gly Leu Gly Leu Lys Pro Val Glu Ala

420 425 430

Thr Lys Arg Ala Met Arg Glu Val Thr Gly Pro Ile Ile Ala Thr Ala

435 440 445

Leu Val Leu Cys Ala Val Phe Ile Pro Thr Ala Phe Ile Ser Gly Leu

450 455 460

Thr Gly Gln Phe Tyr Arg Gln Phe Ala Leu Thr Ile Ala Ile Ser Thr

465 470 475 480

Val Ile Ser Ala Phe Asn Ser Leu Thr Leu Ser Pro Ala Leu Ala Ala

485 490 495

Val Leu Leu Lys Gly His His Glu Pro Lys Asp Arg Phe Ser Val Phe

500 505 510

Leu Asp Lys Leu Leu Gly Gly Trp Leu Phe Arg Pro Phe Asn Arg Phe

515 520 525

Phe Asp Arg Ala Ser His Gly Tyr Val Gly Thr Val Asn Arg Val Leu

530 535 540

Arg Gly Ser Ser Ile Ala Leu Leu Val Tyr Gly Gly Leu Met Val Leu

545 550 555 560

Thr Tyr Phe Gly Phe Ser Ser Thr Pro Thr Gly Phe Val Pro Gln Gln

565 570 575

Asp Lys Gln Tyr Leu Val Ala Phe Ala Gln Leu Pro Asp Ala Ala Ser

580 585 590

Leu Asp Arg Thr Glu Ala Val Ile Lys Gln Met Ser Glu Ile Ala Leu

595 600 605

Ala Gln Pro Gly Val Ala Asp Ser Val Ala Phe Pro Gly Leu Ser Ile

610 615 620

Asn Gly Phe Thr Asn Ser Pro Asn Ser Gly Ile Val Phe Thr Pro Leu

625 630 635 640

Lys Pro Phe Asp Glu Arg Lys Asp Pro Ser Gln Ser Ala Gly Ala Ile

645 650 655

Ala Ala Ala Leu Asn Ala Lys Tyr Ala Asp Ile Gln Asp Ala Tyr Ile

660 665 670

Ala Ile Phe Pro Pro Pro Pro Val Gln Gly Leu Gly Thr Ile Gly Gly

675 680 685

Phe Arg Leu Gln Ile Glu Asp Arg Gly Asn Gln Gly Tyr Glu Glu Leu

690 695 700

Phe Lys Gln Thr Gln Asn Ile Ile Ala Lys Ala Arg Ala Leu Pro Glu

705 710 715 720

Leu Glu Pro Ser Ser Val Phe Ser Ser Tyr Gln Val Asn Val Pro Gln

725 730 735

Ile Asp Ala Asp Ile Asp Arg Glu Lys Ala Lys Thr His Gly Val Ala

740 745 750

Ile Ser Asp Ile Phe Asp Thr Leu Gln Val Tyr Leu Gly Ser Leu Tyr

755 760 765

Ala Asn Asp Phe Asn Arg Phe Gly Arg Thr Tyr Gln Val Asn Val Gln

770 775 780

Ala Glu Gln Gln Phe Arg Leu Glu Pro Glu Gln Ile Gly Gln Leu Lys

785 790 795 800

Val Arg Asn Asn Leu Gly Glu Met Val Pro Leu Ala Ser Phe Ile Lys

805 810 815

Val Ser Asp Thr Ser Gly Pro Asp Arg Val Met His Tyr Asn Gly Phe

820 825 830

Ile Thr Ala Glu Leu Asn Gly Ala Pro Ala Ala Gly Tyr Ser Ser Gly

835 840 845

Gln Ala Gln Ala Ala Ile Glu Lys Leu Leu Lys Glu Glu Leu Pro Asn

850 855 860

Gly Met Thr Tyr Glu Trp Thr Glu Leu Thr Tyr Gln Gln Ile Leu Ala

865 870 875 880

Gly Asn Thr Ala Leu Phe Val Phe Pro Leu Cys Val Leu Leu Ala Phe

885 890 895

Leu Val Leu Ala Ala Gln Tyr Glu Ser Trp Ser Leu Pro Leu Ala Val

900 905 910

Ile Leu Ile Val Pro Met Thr Leu Leu Ser Ala Ile Thr Gly Val Ile

915 920 925

Leu Ala Gly Ser Asp Asn Asn Ile Phe Thr Gln Ile Gly Leu Ile Val

930 935 940

Leu Val Gly Leu Ala Cys Lys Asn Ala Ile Leu Ile Val Glu Phe Ala

945 950 955 960

Lys Asp Lys Gln Glu Glu Gly Met Asp Arg Val Ala Ala Val Leu Glu

965 970 975

Ala Cys Arg Leu Arg Leu Arg Pro Ile Leu Met Thr Ser Ile Ala Phe

980 985 990

Ile Met Gly Val Val Pro Leu Val Ile Ser Thr Gly Ala Gly Ala Glu

995 1000 1005

Met Arg His Ala Met Gly Val Ala Val Phe Ser Gly Met Ile Gly

1010 1015 1020

Val Thr Phe Phe Gly Leu Leu Leu Thr Pro Val Phe Tyr Val Leu

1025 1030 1035

Ile Arg Arg Phe Val Glu Asn Arg Glu Ala Arg Arg Ala Ala Asn

1040 1045 1050

Asp Lys Gly Leu Pro Glu Val His Ala

1055 1060

<210> 3

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

ttgacaatta atcatcggct cgtataatg 29

<210> 4

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

ccggaattca tgaatttctc ccaattcttc atcc 34

<210> 5

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

cccaagcttt catgcatgca cctctgg 27

<210> 6

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 6

ccggaattca tgtcgaagtt tttcattgat aggc 34

<210> 7

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 7

cccaagcttt cattgcccct tttcggc 27

<210> 8

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 8

ccggaattca tgtctaagtt ttttatccat cgac 34

<210> 9

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 9

ccgctcgagt tattcagcgt gccgggta 28

<210> 10

<211> 3111

<212> DNA

<213> Klebsiella Peneumoniae

<400> 10

atgtctaagt tttttattca tcgaccggtc ttcgcctggg tgctggccat cattatgatg 60

attgccggcg gcctggccat tctgcagctg ccgatagctc agtacccgac aatcgcccct 120

cctgcggtag cgatctccgc cacctacccc ggtgcagatg cccagaccgt gcaggatacg 180

gtcacccagg ttatcgagca gaacatgaac ggcatcgaca atctgatgta tatgtcgtcg 240

accagcgact ctgccggttc ggtaaccatt acgctcacct ttaaatcggg taccgatccc 300

gatattgccc aggttcaggt gcaaaacaaa ctgcagctgg ccacgccgct gctgccccag 360

gaagtacagc agcaggggat tagcgtcgag aaatccagta gcagcttcct gttggtcgcc 420

ggctttatct ctgataaccc gaccaccacc caggacgata tctctgacta tgtcgcctcc 480

aatgtcaaag atcctattag ccgcctcaac ggcgtgggcg atgtgcagct gttcggcgcg 540

caatacgcca tgcgcgtctg gctggatggc aacctgctga ataaatacaa cctgacgccg 600

gtggacgtca tcaatgcgct gcaggtccag aacgatcaga tcgccgcggg tcagctcggc 660

ggtacgccag cgctgaaagg ccaacagttg aacgcgtcaa tcatcgctca gacgcggctc 720

aaagatccgc aggagtttgg caaggtcacg ctgcgggtca atgccgatgg ctctgtcgtc 780

catctgaaag acgtcgcccg cattgagctg gggggagaga actataacgt tgtcgccaga 840

attaacggta aacctgcctc tggtctgggt attaagcttg cgaccggcgc caacgccctg 900

gataccgcca ccgcgattaa agcgaagctg gccgagctgc agccctactt ccctcagggg 960

atgaaggtgg tttatccgta tgatacgacc cctttcgtca aaatctccat tcacgaagtg 1020

gtcaaaacgc tttttgaagc aattattctc gtctttcttg tcatgtatct gttcctgcag 1080

aacatgcgcg caacgctcat tccaaccatt gccgtacccg tggtgctgtt gggaaccttc 1140

gcggtattgt cgatgtttgg ctactccatc aacacgctga caatgtttgg catggtgttg 1200

gcgataggtc tgctggtcga tgacgctatc gtagtagtgg aaaacgtcga acgtgtgatg 1260

gttgaggaga agctctcgcc aaaagaagcg acggaaaaat ctatgtcgca gatccaggga 1320

gcgctggtgg gtatcgccat ggtgctctcc gcagtatttg tcccgatggc ctttttcggc 1380

ggctcaaccg gcgcgattta tcgtcagttt tcaatcacca tcgtctccgc catggcgctc 1440

tccgtgctgg ttgcgctggt actgactccg gcgctctgcg ccacgttgtt gaagccagcc 1500

tcagctgaac accatgagaa aaaaggattt ttcggctggt ttaacgcccg cttcgaccgg 1560

agcgttaacc actataccaa cagcgtcagc ggtattttac gtggaactgg ccgttatctg 1620

gtgatctacc tgctgatcgt cgtggggatg gccgtgctgt tcatgcgctt gcccacgtcc 1680

tttctgcccg acgaagacca gggcgtcttc ctgaccatga tccagctacc gtccggtgct 1740

acccaggagc gcacgcagaa ggtcctggat acggtgacag actactacct gcataacgag 1800

aaggccaacg tcgaaagcgt ctttaccgtt aacggcttca gcttcagcgg ccagggacaa 1860

aactccggta tggcgtttgt cagcctgaag ccctgggaag cacgcagcgg cgataaaaac 1920

agcgtggagt ccatcatcaa gcgggccacc gtagccttta gccagatcaa agacgccatg 1980

gttttcccgt tcaacatgcc agccattatt gagctgggta ccgccaccgg cttcgacttt 2040

gaactgatcg accagggcgg actcggtcat accgctctga cccaggcgcg caatcaactg 2100

ctgggcatgg tgaaacagca tccggatcag ctggttcggg tacgccctaa tgggctggaa 2160

gatacccctc agttcaaact ggatgtcgat caggaaaaag cgcaggcgct gggcgtatcg 2220

ctctccgata tcaatgaaac gatatcagcc gcgctgggcg gatactacgt caatgacttt 2280

attgaccgcg gccgcgtgaa aaaagtgtac gttcaggctg atgcccactt ccgtatgctg 2340

ccgagcgaca ttaacaacat gtatgttcgt agcgccaacg gcgaaatggt gccgttctcc 2400

gcctttgtca cttcacgctg gatatatggc tcgccgcgcc tggagcgcta caacgggttg 2460

ccatctatgg agatcctcgg tgaagcttcg ccaggcaaaa gtaccgggga agccatggcg 2520

ctgatggaaa cgctggccag taaactgccg agcggcatcg gttatgactg gaccgggatg 2580

tcttaccagg aacggctctc cggcaaccag gcgcctgcgc tctatgccat ctcgctgatc 2640

gtcgtcttcc tgtgtctggc ggcgctgtat gagagctggt cgatcccctt ctcagtcatg 2700

ttagtggttc cgctgggggt cattggcgcg ctgttagccg ccacgctgcg tgggctgaat 2760

aatgacgttt acttccaggt cggactcttg accacgatcg gtttgtcggc caagaatgcg 2820

atcctgatcg tcgagttcgc caaggatctg atggagaaag aagggaaagg gatcattgag 2880

gccacgctgg aggcatcgcg gatgcgcctg cggcctattc tgatgacctc tctggccttt 2940

attctcgggg tcatgccgct ggtgattagc catggtgccg gcagcggggc gcagaatgcg 3000

gttggcaccg gcgtgatggg cgggatgctg accgcgacgc tgctggcgat cttctttgtt 3060

ccggtgttct ttgtggtcgt tagacgacgc tttacccggc acgctgaata a 3111

Claims

1.一种重组克雷伯氏杆菌，其特征在于，是将来源于铜绿假单胞菌(PseudomonadaceaeAeruginosa)的外排泵蛋白基因mexF连接到过表达载体pEtac-28a上，将连接产物转入克雷伯氏杆菌(Klebsiella Peneumoniae)中得到的。

2.根据权利要求1所述的重组克雷伯氏杆菌，其特征在于，所述外排泵蛋白基因mexF的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

3.根据权利要求1或2所述的重组克雷伯氏杆菌，其特征在于，所述过表达载体pEtac-28a是在pET-28a载体中引入了序列如SEQ ID NO.3所示的tac启动子。

4.根据权利要求3所述的重组克雷伯氏杆菌，其特征在于，所述过表达载体pEtac-28a的构建方法为：用EcoRI和BamHI双酶切pET28a和序列如SEQ ID NO.3所示的tac启动子，酶切后，PCR连接得到过表达载体pEtac-28a(+)。

5.权利要求1-4任一所述的重组克雷伯氏杆菌的构建方法，其特征在于，所述方法包括：

(1)从铜绿假单胞菌基因组中克隆外排泵蛋白基因mexF，其核苷酸序列如序列表SEQID NO.1所示；

(2)将mexF基因与权利要求4中的过表达载体pEtac-28a相连，并将连接产物转化到Klebsiella Peneumoniae中。

6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，所述转化采用的是电击转化法。

7.权利要求1-4任一所述的重组克雷伯氏杆菌在生产1,3-丙二醇中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述应用是以甘油为底物，以重组克雷伯氏杆菌为生物催化剂，采用分批补料的方式进行全细胞转化。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述应用包括将菌液以4％接种量接种到5L发酵罐中，厌氧，补料分批发酵重组克雷伯氏杆菌，流加甘油，使其保持在15-30g/L，37℃，150rpm，发酵48h。

10.权利要求1-4任一所述的重组克雷伯氏杆菌在纺织、塑料及食品包装领域的应用。