KR20140032057A

KR20140032057A - 글리세롤 탈수 반응 산물의 생산 능력이 향상된 재조합 미생물 및 그 용도

Info

Publication number: KR20140032057A
Application number: KR1020120098179A
Authority: KR
Inventors: 정원석; 강진호; 최인석
Original assignee: 삼성전자주식회사
Priority date: 2012-09-05
Filing date: 2012-09-05
Publication date: 2014-03-14

Abstract

염색체 상의 글리세롤 카이네이즈 유전자(glpK)가 불활성화된 재조합 미생물, 상기 재조합 미생물을 유효성분으로 포함하는 글리세롤로부터 글리세롤 탈수 반응 산물을 제조하기 위한 조성물 및 상기 재조합 미생물을 이용하여 글리세롤로부터 글리세롤 탈수 반응 산물을 제조하는 방법이 제공된다.

Description

글리세롤 탈수 반응 산물의 생산 능력이 향상된 재조합 미생물 및 그 용도{Recombinant microorganism having improved productivity of glycerol dehydration product and use thereof}

본 발명은 염색체 상의 글리세롤 카이네이즈 유전자(glpK)가 불활성화된 재조합 미생물, 상기 재조합 미생물을 유효성분으로 포함하는 글리세롤로부터 글리세롤 탈수 반응 산물을 제조하기 위한 조성물 및 상기 재조합 미생물을 이용하여 글리세롤로부터 글리세롤 탈수 반응 산물을 제조하는 방법에 관한 것이다.

최근 세계 인구 증가와 산업 발달에 의하여 화석원료자원 사용량이 급격히 증가하고 있으며, 온실가스 배출에 의한 지구 온난화와 폐기물에 의한 환경오염의 심각성이 전 세계적으로 대두되고 있다. 전지구적 차원에서 화석원료자원이 재생되기 위해서는 수백만 년의 시간이 걸리기 때문에 가격의 급격한 상승과 석유 기반 산업에 의한 지구 온난화 문제가 대두되면서 바이오 기반 연료 및 화학 산업이 각광을 받고 있다. 현재 다양한 화학물질들이 바이오 기반 산업을 통하여 생산되고 있으며, 그 종류는 정밀화학제품에서부터 에탄올과 같은 연료에 이르기까지 다양하다. 이들 화학물질들은 다양한 탄소원들로부터 합성되는데 대표적인 탄소원으로는 포도당, 젖당, 글리세롤, 갈락토오스, 말토오스, 자일로스 등을 들 수 있다. 그 중 글리세롤은 유기화학에서 가장 다양한 용도로 이용되는 물질 중의 하나로 매일 이용되는 다양한 생활 필수품용 화합물 합성에 일차 재료로 활용되고 있다. 최근 바이오디젤의 대량 생산으로 인하여 부산물인 글리세롤의 생산이 급증하였고, 바이오디젤 10억 갤런당 77억 파운드의 글리세롤이 생산되고 있다. 앞으로 바이오디젤의 시장 수요가 증가하면서 부산물인 글리세롤의 생성량도 급격하게 증가할 것으로 예측된다. 따라서, 글리세롤을 다양한 유용 화학물질의 생산 원료로 활용하면 경제적 및 환경적 측면에서 유리할 수 있다.

글리세롤을 활용하여 생산할 수 있는 물질로 3-하이드록시프로피온산(3-hydroxypropionic acid; 3-HP)과 1,3-프로판디올(1,3-propanediol; 1,3-PDO)이 알려져 있으며, 이들은 모두 글리세롤 탈수효소의 산물이다.

1,3-프로판디올(1,3-PDO)은 섬유용으로 사용되는 폴리트리메틸렌 테레프탈레이트 (polytrimethylene terephthalate, PTT)를 구성하는 단량체이며, 윤활제 및 용매로도 사용되고 있다. 최근 대사공학기술을 이용하여 대장균(E. coli)에서 포도당으로부터 1,3-프로판디올을 생산하는 기술이 개발된 바 있으나, 곡물가격이 계속 상승되고 있어 포도당에 의존하는 생산방법은 향후 식량활용이나 경제성 확보 관점에서 어려움이 예상된다.

또한, 3-하이드록시프로피온산(3-hydroxypropionic acid: 3-HP)은 젖산, 숙신산과 더불어 바이오매스 유래의 3대 플랫폼 화학원료로 주목을 받고 있는 물질로서, 글리세롤과 같은 재생 가능한 자원으로부터 생산된다. 3-HP는 광학적으로 활성이 있는 물질의 합성을 위하여 중요한 역할을 하는 2개의 작용기를 가지고 있는데, 이는 화학산업에서 3-HP가 중요한 전구체로 각광을 받게 하는 요소이다. 3-HP를 전구체로 하여 합성되는 핵심 화합물로는 1,3-프로판디올 (1,3-propanediol, MW 79.09), 아크릴산 (acrylic acid, MW 72.06), 메틸아크릴레이트 (methyl acrylate, MW 86.09), 아크릴아미드 (acrylamide, MW 71.08), 말론산 (malonic acid, 104.06), 아크릴로니트릴 (acrylonitrile, MW 53.06) 등이 있다 (도 1 참조). ?

도 1에 나타낸 바와 같이, 3-HP는 생물학적으로 두 종의 효소가 작용하는 탈수 및 산화 공정을 통하여 글리세롤로부터 생산할 수 있다. 첫 번째 효소인 글리세롤 탈수효소(Glycerol dehydratase)는 글리세롤을 탈수반응시켜 3-히드록시프로피온알데히드(3-Hydroxy propionaldehyde; 3-HPA)를 생산하고, 두 번째 효소인 3-히드록시프로피온알데히드 산화효소(3-HPA dehydrogenase)는 3-HPA를 탈수소화시켜 3-HP를 생산하게 된다. 또한, 1,3-PDO는 글리세롤로부터 탈수 및 환원공정에 의해 생산될 수 있는데, 탈수 공정은 3-HP 생산의 첫번째 단계와 동일한 반응이며, 생성된 3-HPA는 알코올 데하이로게나제(alcohol dehydrogenase, yqhD)과 같은 효소에 의하여 1,3-PDO로 전환된다.

한편, 글리세롤은 미생물에서 탄소원이자 에너지원으로 사용할 수 있으며, 동시에 이를 이용하여 3-HP 또는 1,3-PDO를 생산할 수 있다. 산업미생물 중 대표적인 미생물인 대장균(Escherichia coli)에서 글리세롤을 에너지원으로 이용할 경우, 글리세롤 퍼실리테이터 (glycerol facilitator), 글리세롤 카이네이즈 (glycerol kinase), 그리고 글리세롤 3-인산 탈수소효소가 관여한다.

이를 구체적으로 살펴보면, 글리세롤 퍼실리테이터인 GlpF 효소에 의해 글리세롤이 대장균 세포 안으로 들어오면 글리세롤 카이네이즈인 GlpK에 의하여 글리세롤이 글리세롤 3-인산 (glycerol 3-phosphate)으로 변환된다. 글리세롤 3 인산은 글리세롤 3-인산 탈수소효소인 GlpD (glycerol 3-phosphate dehydrogenase)에 의해서 디하이드록시아세톤 인산 (dihydroxyacetone phosphate, DHP)으로 전환되어 일차 대사과정에 편입된다.

하지만, 대장균에서 글리세롤을 탄소원으로 사용하는 경우 대표적인 탄소원인 글루코오스에 비하여 섭취 및 대사 속도가 현저하게 낮기 때문에 효율적인 3-HP 또는 1,3-PDO 생산을 위해서는 고가의 글루코오스를 함께 사용해야 하는 단점이 있다.

이에 본 발명자들은 탄소원으로 상대적으로 고가인 글루코오스를 이용할 필요없이 저가의 글리세롤을 미생물 발효에 이용할 수 있도록 하기 위하여, 글리세롤 대사 유전자의 결실과 보충을 통하여 효율적인 3-HP 또는 1,3-PDO 생산이 가능함을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 일례는 염색체 상의 글리세롤 카이네이즈 유전자(glpK)가 불활성화되고, 임의로 염색체 외적으로 글리세롤 카이네이즈 유전자를 포함하는 발현카세트를 포함하는 재조합 미생물을 제공한다.

또 다른 예는 상기 재조합 미생물을 유효성분으로 포함하는 글리세롤로부터 글리세롤 탈수 반응 산물을 제조하기 위한 조성물을 제공한다.

또 다른 예는 상기 재조합 미생물을 이용하여 글리세롤로부터 글리세롤 탈수 반응 산물을 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명자들은 글리세롤로부터 유용 화합물을 용이하게 대량으로 생산하기 위한 연구를 거듭한 결과, 미생물 (예컨대, 대장균)에서 글리세롤의 대사 속도를 조절할 목적으로 글리세롤 카이네이즈 유전자(glpK))를 불활성화(예컨대, 제거)하고, 이 유전자의 발현을 보충할 수 있도록 특정 유도제에 의하여 유도되는 전사조절 인자와 글리세롤 카이네이즈 유전자가 포함된 플라스미드(예컨대, pETduet-ara-glpK) 등과 같은 염색체 외부 발현카세트를 삽입하고, 상기 유도제 (예컨대 아라비노오스)의 농도를 조절하여 배양함으로써, 상기 재조합 미생물로부터 3-HP 또는 1,3-PDO의 생산성이 향상될 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 일례는 염색체 상에 글리세롤 카이네이즈 유전자(glpK)가 불활성화되고, 임의로 염색체 외적으로 글리세롤 카이네이즈 유전자를 포함하는 발현카세트를 포함하는 재조합 미생물을 제공한다.

또 다른 예는 상기 재조합 미생물을 유효성분으로 포함하는 글리세롤로부터 글리세롤 탈수 반응 생성물을 제조하기 위한 조성물을 제공한다.

상기 글리세롤 카이네이즈 유전자(glpK)는 GlpK(글리세롤 카이네이즈) 단백질을 암호화하는 유전자이다. glpK 유전자에 의해 발현된 GlpK(글리세롤 카이네이즈) 단백질은 글리세롤을 글리세롤-3-포스페이트로 전환시켜 글리세롤이 해당과정을 거쳐 대사되도록 한다. 따라서 글리세롤로부터 3-HP 및/또는 1,3-PDO를 생산하는 글리세롤 탈수효소(dehydratase)는 글리세롤에 대하여 글리세롤 카이네이즈와 경쟁한다. 따라서, glpK를 불활성화시키면 글리세롤이 해당과정을 통해 대사되는 경로로 진입하지 않고 글리세롤 탈수효소를 통하여 3-HPA로 전환되고 3-HP 및/또는 1,3-PDO의 생산 경로로 진입하여 3-HP 및/또는 1,3-PDO의 생산을 증가시킬 수 있다.

그러나, 탄소원으로 글리세롤만을 사용하는 경우에 글리세롤 카이네이즈를 불활성화시키면 세포 생장이 어려우므로 이를 보완하기 위하여, 바람직한 구체예에서는 염색체 외적으로(extrachromosomal) 글리세롤 카이네이즈(glpK)를 발현할 수 있는 glpK 유전자 발현 카세트를 미생물 내로 도입한 것을 특징으로 한다.

이하 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

상기 미생물은 글리세롤을 대사할 수 있는 미생물로서 염색체 상에 glpK 유전자를 포함하고 있으면서 glpK 유전자가 불활성화될 수 있는 미생물이면 제한 없이 사용 가능하며, 예를 들어, 에스케리키아 (Escherichia) 속, 엔테로박테리아 (Enterobacteria) 속, 브레비박테리움(Brevibacterium) 속, 코리네박테리움 (Corynebacterium) 속, 클로스트리디움 (Clostridium) 속, 크렙시엘라 (Klebsiella) 속, 시트로박터(Citrobacter) 속, 스트렙토마이세스 (Streptomyces) 속, 바실러스 (Bacillus) 속, 락토바실러스(Lactobacillus) 속, 슈도모나스 (Pseudomonas) 속, 사카로마이세스 (Saccharomyces)속, 아스퍼질러스(Aspergillus) 속 등에 포함되는 미생물로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 미생물로서 에스케리키아 (Escherichia) 속에 속하는 미생물, 보다 구체적으로 대장균(E. coli)을 사용할 수 있다.

본 발명에서의 glpK 유전자의 불활성화는 미생물의 염색체 상의 glpK 유전자의 전부 또는 일부분을 결실시키거나, 전부 또는 일부 서열을 상이한 염기서열로 치환, 또는 추가적인 염기 서열을 삽입시키는 등에 의하여 글리세롤 카이네이즈가 암화화되지 못하거나 또는 정상적으로 발현되지 못하게 되는 것을 의미하며, 통상의 기술자에게 알려진 다양한 방법에 의하여 수행될 수 있다. 예를 들어, 상동 재조합을 통해 염색체 상의 glpK을 불활성화시킬 수 있는데, 염색체 내 glpK 유전자를 대체할 폴리뉴클레오타이드 분자 또는 glpK 유전자 중 일부가 제거되거나 다른 염기서열로 치환된 glpK 유전자 단편을 염색체 상의 glpK 유전자 내에 도입하여 불활성화시킬 수 있다. 일례에서, 상기 염색체 상의 glpK 유전자를 불활성시키기 위한 폴리뉴클레오타이드 분자 또는 glpK 유전자 단편의 염기서열은 5' 및 3' 말단에 염색체 상의 glpK 유전자의 일부분을 포함하는 "테일(tail)"을 포함하여, 상동 재조합 수행이 가능한 것일 수 있다.

상기 glpK 유전자를 대체할 폴리뉴클레오타이드 분자 또는 glpK 유전자 중 일부가 제거되거나 다른 염기서열로 치환된 glpK 유전자 단편이 숙주세포의 염색체 내로 도입되는 과정은 통상적인 상동 재조합에 의할 수 있다. 상동 재조합 방법을 이용하여 염색체 내에서 유전자를 제거하기 위해서는 표적 부위 유전자 양쪽 말단에 10 내지 100 bp, 구체적으로 30 내지 60bp, 보다 구체적으로 40 내지 50 bp 정도의 테일(tail) 부분을 포함하고 가운데에는 항생제 내성 관련 유전자 (예컨대, kanamycin 내성 유전자, ampicilin 내성 유전자 등)를 클로닝한 폴리뉴클레오타이드 단편이 필요하다. 상동 재조합의 경우, 숙주세포는 천연적으로 DNA 유입에 대해 컴피턴트(competent)한 것이거나, 형질 전환 이전에 DNA 도입을 위하여 통상적으로 알려진 적절한 방법으로 컴피턴트하도록 만들어 진 것일 수 있다. 상기 균주를 컴피턴트하도록 하기 위하여 사용 가능한 방법으로는 예컨대 CaCl₂에 의한 형질전환 세포 제작법 (Sambrook and Russell 2001 Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition) 등이 있으나 이에 제한되지 않고 통상적인 모든 방법이 사용 가능하다.

상기에서 상기 미생물에 재조합되는 glpK 유전자를 대체할 폴리뉴클레오타이드 분자는 미생물 염색체 상의 glpK 유전자를 전부 제거하기 위하여 사용되는 것으로, 일부 염기서열이 다른 염기서열로 치환된 것이거나 비암호화 서열 또는 glpK 유전자 이외의 유전자의 염기서열을 포함하는 것일 수 있다.

또한, 상기 glpK 유전자 중 일부가 제거되거나 다른 염기서열로 치환된 glpK 유전자 단편은 재조합되는 미생물의 염색체에 존재하는 glpK 유전자의 염기서열 중 암호화부위(CDS 부위) 내의 50개 이상 (예컨대, 50 내지 1600개), 구체적으로 100개 이상(예컨대, 100 내지 1600개), 보다 구체적으로 500개 이상(예컨대, 500 내지 1600개)의 염기가 제거된 것일 수 있다.

상기 불활성화시키는 유전자 서열은 비암호화 서열 또는 glpK 유전자 이외의 유전자의 염기서열을 포함하는 것일 수 있으며, 선별의 편의를 위하여 항생제 내성 유전자 (예컨대 클로람페니콜 내성 유전자, 암피실린 내성 유전자 등) 등의 선별 마커를 암호화하는 서열을 포함하여 glpK 유전자가 불활성화된 형질전환체를 용이하게 선택하게 할 수 있도록 하는 것일 수 있다.

본 발명의 불활성화시키는 glpK 유전자는 앞서 설명한 바와 같은 재조합시키고자 하는 미생물, 즉, 에스케리키아 (Escherichia) 속, 엔테로박테리아 (Enterobacteria) 속, 브레비박테리움(Brevibacterium) 속, 코리네박테리움 (Corynebacterium) 속, 클로스트리디움 (Clostridium) 속, 크렙시엘라 (Klebsiella) 속, 시트로박터(Citrobacter) 속, 스트렙토마이세스 (Streptomyces) 속, 바실러스 (Bacillus) 속, 락토바실러스(Lactobacillus) 속, 슈도모나스 (Pseudomonas) 속, 사카로마이세스 (Saccharomyces)속, 아스퍼질러스(Aspergillus) 속에 속하는 미생물로부터 유래하는 글리세롤 카이네이즈를 암호화하는 glpK 유전자일 수 있으며, 예컨대, 대장균(E. coli) 유래의 glpK 유전자(예컨대, EMBL-CDS: BAE77384.1, NC_007779.1(3519459..3520967, YP_491525.1), GenBank No. M55990.1, L19201 (77347..78855, AAB03058)), 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 유래의 glpK 유전자 (예컨대, GenBank No. X69049.1, NCBI Reference Sequence: NM_001179112.1) 등일 수 있다. 구체예에서, 상기 glpK 유전자는 대장균 (예컨대, 대장균 W3110 균주)로부터 유래하는 것일 수 있고, glpK 유전자의 암호화 부위는 서열번호 2의 아미노산 서열을 암호화는 염기서열을 가질 수 있다. 예컨대, 상기 glpK 유전자의 암호화 부위는 서열번호 1의 염기서열을 갖는 것일 수 있다.

이러한 상동 재조합 기술은 Microbiology and Molecular Biology Reviews(비특허문헌 4) 등을 참고할 수 있다.

앞서 설명한 바와 같이, 상기 재조합 미생물은 염색체 상에 불활성화된 glpK 유전자를 가지는 한편, 세포 성장을 위하여, 글리세롤을 에너지원으로서 사용 가능하도록, glpK 유전자를 포함하는 미생물 내 발현 조절이 가능한 발현 카세트를 염색체 외부에 별도로 추가적으로 포함할 수 있다. 상기와 같은 재조합 미생물은 염색체 상에 glpK 유전자가 불활성화되어 글리세롤로부터 3-HP 및/또는 1,3-PDO의 생산량이 증가됨과 동시에, 상기 미생물 내에서 발현 조절이 가능한 glpK 유전자를 포함하는 발현카세트를 포함함으로써 세포 성장이 가능하도록 글리세롤 대사능을 조절할 수 있는 것을 특징으로 한다.

이와 같은 외부에서 도입된 glpK 유전자를 포함하는 발현 카세트는 염색체 이외(extrachromosoaml)로 존재할 수 있으며, 상기 발현카세트는 플라즈미드, 코즈미드, 박테리오파아지, 바이러스 벡터 등의 형태일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 구체예에서, 상기 발현 카세트는 아라비노스 유도성 프로모터(arabinose inducible promoter; "ara")와 같이 특정 유도제에 의하여 발현이 조절될 수 있는 프로모터, 열(heat)과 같은 물리적인 변화에 의하여 발현이 조절될 수 있는 프로모터 (예컨대, Lamda PL promoter, accession number: X53240.1) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다. 구체적으로 pACYC-ara-glpK 플라스미드, pETduet-ara-glpK 플라스미드 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 아라비노스 유도성 프로모터는 서열번호 19의 염기서열을 갖는 것일 수 있다.

상기 glpK 유전자를 포함하는 발현 카세트는 열충격법, 전기충격법 등의 통상적인 방법을 통해 세포 내로 도입할 수 있다.

상기 염색체 외적으로 도입되는 발현 카세트에 포함되는 glpK 유전자는 앞서 설명한 바와 같고, 예컨대, 재조합시키고자 하는 미생물(숙주세포) 유래의 glpK 유전자일 수 있다.

상기 염색체상의 glpK가 불활성화된 미생물은 상기 글리세롤 카이네이즈(glpK)가 불활성화된 염색체에 글리세롤 탈수효소의 생성물, 특히 3-히드록시프로피온산(3-HP) 및/또는 1,3-프로판디올(1,3-PDO)의 합성 능력을 갖도록 관련 효소를 암호화하는 유전자 중에서 어느 하나 이상을 포함할 수 있다. 상기 같이 글리세롤 탈수효소의 생성물 합성과 관련된 효소를 암호화하는 유전자는 재조합되는 미생물 염색체 내에 존재하는 내부 유전자(endogenous gene)이거나 외부로부터 추가로 도입되는 이종 유전자(heterogeneous gene)일 수 있다. 상기 이종 유전자는 염색체 상에 도입되거나 염색체 외에 존재할 수 있다.

이와 같이 글리세롤 탈수효소의 생성물 합성과 관련된 효소의 유전자(이하 '3-HP 생산 관련 유전자' 및 '1,3-PDO 생산 관련 유전자'로 기재)를 추가로 포함함으로써, 본 발명의 미생물은 글리세롤 이외의 다른 탄소원을 사용하지 않고 글리세롤만을 사용하여 세포 생장과 함께 3-HP 및/또는 1,3-PDO의 생산이 동시에 가능할 수 있다.

상기 3-HP 생산 관련 유전자는 (a) 글리세롤을 3-하이드록시프로피온알데히드(3-HPA)로 전환시키는 글리세롤 탈수효소(glycerol dehydratase) 또는 디올 탈수효소(diol dehydratase)를 암호화하는 유전자; (b) 글리세롤 탈수효소 재활성화 인자를 암호화하는 유전자; 및 (c) 3-하이드록시프로피온알데히드를 3-히드록시프로피온산으로 전환시키는 알데히드 탈수소효소(aldehyde dehydrogenase)를 암호화하는 유전자로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있다.

상기 글리세롤 탈수효소 또는 디올 탈수효소는 글리세롤을 3-히드록시프로피온알데히드로(3-HPA) 전환시키는 효소를 의미하는 것으로, 통상적으로 알려진 글리세롤 탈수효소(Glycerol dehydratase) 및/또는 디올 탈수효소(Diol dehydratases)가 여기에 포함된다. 상기 글리세롤 탈수효소는 비타민 B12 의존 또는 비의존성일 수 있다. 상기 글리세롤 탈수효소 또는 디올 탈수효소를 암호화하는 유전자는 재조합되는 미생물의 내부 유전자 또는 이종 유전자일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니나 클렙시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumonia , GenBank No. U30903, dhaB1, dhaB2 및 dhaB3), 시트로박터 프레운디(Citrobacter freundii , GenBank No. U09771: 염기쌍 8556-10223, 10235-10819, 및 10822-11250), 클로스트리디움 파스튜리아늄(Clostridium pasteurianum , GenBank No. AF051373.1), 살모넬라 타이티무리움(Salmonella typhimurium , GenBank Nos: AAB84105, AF026270; GenBank Nos: AAD39008, AF026270), 클렙시엘라 옥시토카(Klebsiella oxytoca , GenBank Nos: AAC15871, AF017781; GenBank Nos: AAC15872, AF017781), 클로스트리디움 부티리쿰(Clostridium butyricum, GenBank No. AAM54728.1, AFH58722.1) 등으로 이루어진 군에서 선택된 미생물 유래의 것일 수 있다.

구체적으로, 상기 글리세롤 탈수효소는 클렙시엘라 뉴모니아 유래의 DhaB1(예컨대, 서열번호 4), DhaB2(예컨대, 서열번호 6) 및 DhaB3(예컨대, 서열번호 8) (3개의 서브유닛을 포함), 또는 클로스트리디움 부티리쿰 유래의 DhaB1일 수 있다. 상기 클렙시엘라 뉴모니아 유래의 글리세롤 탈수효소를 암호화하는 유전자는 서열번호 4를 암호화하는 염기서열, 서열번호 6을 암호화하는 염기서열, 및 서열번호 8을 암호화하는 염기서열의 조합, 예컨대, 서열번호 3의 염기서열을 갖는 유전자, 서열번호 5의 염기서열을 갖는 유전자 및 서열번호 7의 염기서열의 염기서열을 갖는 유전자의 조합일 수 있다.

글리세롤 탈수효소는 촉매 작용을 하는 동안 글리세롤 또는 1,3-프로판디올과의 상호작용에 의해 비가역적으로 불활성화된다. 따라서, 글리세롤 탈수효소를 활성화시키기 위한 글리세롤 탈수효소 재활성화 인자를 포함할 수 있다. 상기 글리세롤 탈수효소 재활성화 인자를 암호화하는 염기서열은 글리세롤 탈수효소가 유래하는 미생물과 동종 또는 이종의 미생물로부터 유래의 것을 암호화하는 것일 수 있으며, 염기서열의 유사성을 고려하여 동종 미생물로부터 유래한 것을 사용하는 것이 좋다. 구체예에서, 상기 글리세롤 탈수효소 재활성화 인자를 암호화하는 염기서열은 클렙시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumonia; 예컨대, gdrA 및 gdrB, GenBank No. EF077655.1:1..1824 및 1925..2278), 시트로박터 프레운디(Citrobacter freundii; 예컨대, dhaF 및 dhaG (DQ787198.1:1..1812 및 1932..2285), 클로스트리디움 파스튜리아늄(Clostridium pasteurianum; 예컨대 orfZ, GenBank No. AF051373: 2790-4598), 살모넬라 타이티무리움(Salmonella typhimurium; 예컨대, pduG(large subunit, GenBank No. AF026270:6452..8284), pduH((small subunit, GenBank No. AF026270: 8274-8645), 또는 이들의 다이머, 클렙시엘라 옥시토카(Klebsiella oxytoca; diol dehydratase-reactivating factor (ddrA) (large subunit), ddrB (small subunit); AF017781:241..2073 및 2063..2440), 클로스트리디움 부티리쿰(Clostridium butyricum, glycerol dehydratase activator(dhaB2); DQ901407.2:2386..3300) 등으로 이루어진 군에서 선택된 미생물 유래의 것일 수 있고, 보다 구체적으로, 상기 효소는 클렙시엘라 뉴모니아 유래의 gdrA(예컨대, 서열번호 10) 및 gdrB (예컨대, 서열번호 12), 또는 클로스트리디움 부티리쿰 유래의 dhaB2 등일 수 있다.

일례로, 글리세롤 탈수효소 재활성화 인자를 암호화하는 유전자는 서열번호 10의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 암호화 하는 염기서열 및 서열번호 12의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 염기서열의 조합일 수 있으며, 예컨대, 서열번호 9의 염기서열을 갖는 유전자 및 서열번호 11의 염기서열을 갖는 유전자의 조합일일 수 있다.

상기 알데히드 탈수소효소는 3-하이드록시프로피온알데히드(3-hydroxypropionaldehyde; 3-HPA)를 3-하이드록시프로피온산(3-hydroxypropionic acid, 3-HP)로 전환하는 효소를 의미한다. 본 발명에서 알데히드 탈수소효소로는 조효소로서 NAD, NADP, FAD, 또는 PQQ를 사용할 수 있다. 구체적으로 알데히드 탈수소효소는 AldH2, Ald4, AldA, AldB, AldH 등으로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다. 알데히드 탈수소효소를 코딩하는 유전자 서열로는, 호모 사피엔스(Homo sapiens) 유래의 ald2(NM_000690.3, NM_001204889.1), 효모(S. cerevisiae) 유래의 ald4(NM_001183794.1), 및 대장균(E. coli) 유래의 aldA(AC_000091.1: 1489946-1491385), aldB(AC_000091.1: 3883904..3885442) 및 aldH (NC_000913.2:1360767..1362254, NC_017638.1 (1343726..1345213, NC_002655.2:2215131..2216618(complement)) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 것일 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 구체예에서, 상기 알데히드 탈수소효소를 암호화하는 유전자는 서열번호 14의 아미노산 서열을 갖는 AldH(E. coli aldehyde dehydrogenase)를 암호화하는 염기서열을 갖는 것일 수 있으며, 예컨대, 서열번호 13 (E. coli aldehyde dehydrogenase, aldH)의 염기 서열을 갖는 것일 수 있다.

상기 1,3-PDO 생산 관련 유전자는 (a) 글리세롤을 3-하이드록시알데히드(3-HPA)로 전환시키는 글리세롤 탈수효소(glycerol dehydratase) 또는 디올 탈수효소(diol dehydratase)를 암호화하는 유전자; (b) 글리세롤 탈수효소 재활성화 인자를 암호화하는 유전자; 및 (c') 3-하이드록시알데히드를 1,3-PDO로 전환시키는 알코올 탈수소화효소(alcohol dehydrogenase)를 암호화하는 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 것일 수 있다.

이 중에서 글리세롤 탈수효소(glycerol dehydratase) 또는 디올 탈수효소(diol dehydratase)를 암호화하는 유전자 및 글리세롤 탈수효소 재활성화 인자를 암호화하는 유전자는 앞서 설명한 바와 같다.

상기 알코올 탈수소화효소는 NAD, NADP 등의 조효소를 사용할 수 있으며, 1,3-프로판디올 디하이드로지나제(1,3-propanediol dehydrogenase), 1,3-프로판디올 옥시도리덕타아제, 글리콜알데히드 리덕타제(glycolaldehyde reductase; GenBank accession numbers AP007281.1, EDX43365.1, BAG24545.1, ABQ82306.1, ABO43839.1, EEI08979.1, EEI166346.1, EEI73647.1, EEJ92522.1, EEI09194.1, EEI73500.1, ABQ83973.1, BAG26138.1 등), 1,2-프로판디올 옥시도리덕타제(1,2-propanediol oxidoreductase), 에탄올 데히드로지나제(ethanol dehydrogenase) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 것일 수 있다. 구체적으로, 클렙시엘라 뉴모니애 유래의 1,3-propanediol dehydrogenase (dhaT)(예컨대 서열번호 18) 및/또는 E.coli 유래의 YqhD (예컨대 서열번호 16)일 수 있다. 상기 알코올 탈수소화효소를 코딩하는 염기서열은 클렙시엘라 뉴모니애 유래의 dhaT (Genbank accession No. U30903: 서열변호 17), E.coli 유래의 yqhD (NC002655: 서열번호 15), 시트로박터 프레운디(Citrobacter freundii) 유래의 dhaT (U09771;), 클로스트리디움 파스튜리아늄(Clostridium pasteurianum) 유래의 dhaT (AF006034) 등일 수 있다. 일례로 상기 알코올 탈수소화효소(alcohol dehydrogenase)를 암호화하는 유전자는 서열번호 16 또는 서열번호 18의 아미노산 서열을 갖는 알코올 탈수소화효소를 암호화하는 염기서열을 갖는 것일 수 있으며, 예컨대, 서열번호 15 또는 서열번호 17의 염기서열을 갖는 것일 수 있다.

상기에서 3-HP 및/또는 1,3-PDO 생산 관련 유전자(예컨대, 동종 또는 이종 유전자)는 재조합 발현벡터와 같은 발현카세트에 포함되어 숙주 세포(재조합 대상 미생물)에 도입될 수 있으며, 이 경우 염색체 외적(extrachromosomal) 도입 또는 염색체 내 도입이 모두 가능하다. 상기 도입 방법 역시 공지의 기술, 예컨대 염화칼슘법, 열충격법, 유전자총, 전기충격법(electroporation) 등의 형질전환방법이나 재조합 파지 바이러스를 통한 형질주입 등의 방법을 통하여 도입될 수 있다. 상기의 숙주 세포 이외에도 발현의 목적에 따라 달라지는 벡터에 의존하여 다양한 균주를 용이하게 이용할 수 있음은 당업자에게 명백한 일이다.

다른 예에서, 상기 재조합 미생물을 이용하여 글리세롤로부터 글리세롤 탈수 반응 생성물을 제조하는 방법이 제공된다. 구체적으로, 상기 재조합 미생물을 배양하는 단계를 포함하는 글리세롤로부터 글리세롤 탈수 반응 생성물을 제조하는 방법이 제공된다. 상기 글리세롤 탈수 반응 생성물은 3-HP 및/또는 1,3-PDO일 수 있다.

본 발명에 따른 상기 미생물(숙주세포)의 배양과정은 당업계에 알려진 적당한 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있다. 따라서 통상의 미생물 배양 배지를 사용할 수 있으며, 보다 바람직하게는 선택된 미생물 균주에 따라 그 생장에 적합한 것으로 통상의 기술자에게 알려진 다양한 배지가 선택될 수 있다. 예컨대, 상기 배양 단계에서 사용되는 배지 내의 탄소원으로서 글리세롤이 유일하게 제공될 수 있으며, 배지 내 글리세롤 함량이 5 내지 80g/L, 구체적으로 20 내지 60 g/L일 수 있다. 그러나, 미생물의 생장속도를 증진시키기 위하여 배지에 글루코오스를 추가로 첨가할 수 있으며, 이 때 배지 내 글루코오스 농도는 0.5~30g/L 정도일 수 있다. 또한 3-HP 및/또는 1,3-PDO의 생산을 증가시키기 위하여 글리세롤 탈수효소가 잘 작용할 수 있도록 비타민 B₁₂를 추가로 배지에 첨가할 수 있다.

이러한 배양과정은 당업자라면 선택되는 미생물 종류에 따라 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 상기 배양 방법의 예에는, 회분식, 연속식 및 유가식 배양이 포함되나, 여기에 한정되는 것은 아니다.

상기의 배양조건은 사용된 미생물에 따라 적절히 조절할 수 있는데, 예를 들어 대장균의 경우 호기성(aerobic) 조건하에서 pH 6 ~ 7.6, 온도 33 내지 37℃에서, 1 ~ 4 일간 수행될 수 있다. 상기 범위 내에서 배양하는 경우가 세포 성장이 활발하면서 효율적으로 본 발명의 산물을 생산할 수 있다.

다른 예에서, 글리세롤을 고효율로 이용할 수 있는 재조합 미생물의 제조방법이 제공된다.

상기 제조 방법은 미생물(숙주세포)의 염색체 상의 glpK 유전자를 불활성화시키는 단계; 및 상기 glpK 유전자가 불활성화된 미생물을 선별하는 단계를 포함하는 것일 수 있다. 상기 염색체 상의 glpK 유전자를 불활성화 단계는 앞서 설명한 바와 같이 염색체 상의 glpK 유전자를 전부 또는 일부를 결실 또는 일부 염기서열을 상이한 염기서열로 치환, 또는 추가적인 염기서열을 삽입하여 염색체 상의 glpK 유전자를 불활성화시킬 수 있으며, 한 예로 염색체 상의 glpK 유전자를 대체할 폴리뉴클레오타이드 분자 또는 glpK 유전자 중 일부가 제거되거나 다른 염기서열로 치환된 glpK 유전자 단편을 통상적인 형질전환 방법에 의하여 미생물에 도입시켜 상기 미생물의 염색체 상에 존재하는 glpK 유전자와 재조합시키는 단계에 의하여 수행될 수 있다.

상기 글리세롤을 고효율로 이용할 수 있는 재조합 미생물의 제조방법은 상기 glpK 유전자를 불활성화시키는 단계 또는 상기 선별 단계 이후에, 발현 조절 가능한 glpK 유전자를 포함하는 발현 카세트를 염색체 외적으로 미생물에 도입하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 그 구체적인 내용은 앞서 설명한 바와 같다.

또 다른 예에서, 예컨대, 3-HP 및/또는 1,3-PDO와 같은 글리세롤 탈수 반응 산물을 고농도로 생산할 수 있는 재조합 미생물의 제조 방법이 제공된다.

상기 제조 방법은 미생물(숙주세포)의 염색체 상의 glpK 유전자의 전부 또는 일부를 결실, 일부 염기서열을 상이한 염기서열로 치환 또는 추가적인 염기서열을 삽입하여 염색체 상의 glpK 유전자를 불활성화시키는 단계; 및 임의로 상기 glpK 유전자가 불활성화된 미생물을 선별하는 단계를 포함하는 것일 수 있다. 상기 염색체 상의 glpK 유전자를 불활성화 단계는 앞서 설명한 바와 같이 glpK 유전자를 대체할 폴리뉴클레오타이드 분자 또는 glpK 유전자 중 일부가 제거되거나 다른 염기서열로 치환된 glpK 유전자 단편을 통상적인 형질전환 방법에 의하여 미생물에 도입시켜 상기 미생물의 염색체 상에 존재하는 glpK 유전자와 재조합시키는 단계에 의하여 수행될 수 있다.

상기 글리세롤 탈수 반응 산물을 고농도로 생산할 수 있는 재조합 미생물의 제조 방법은 상기 glpK 유전자를 불활성화시키는 단계 또는 상기 선별 단계 이후에, 발현 조절 가능한 glpK 유전자를 포함하는 발현 카세트를 염색체 외적으로 미생물에 도입하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 그 구체적인 내용은 앞서 설명한 바와 같다.

또한, 상기 글리세롤 탈수 반응 산물을 고농도로 생산할 수 있는 재조합 미생물의 제조 방법은 상기 glpK 유전자를 불활성화시키는 단계 또는 상기 선별 단계 이후에, 글리세롤로부터 3-HP 및/또는 1,3-PDO을 생산하는 3-HP 생산 관련 유전자 및/또는 1,3-PDO 생산 관련 유전자를 미생물 내에 도입하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 그 구체적인 내용은 앞서 설명한 바와 같다.

또한, 상기 글리세롤 탈수 반응 산물을 고농도로 생산할 수 있는 재조합 미생물의 제조 방법은 상기 glpK 유전자를 불활성화시키는 단계 또는 상기 선별 단계 이후에, 발현 조절 가능한 glpK 유전자를 포함하는 발현 카세트를 염색체 외적으로 도입하는 단계 및 글리세롤로부터 3-HP 및/또는 1,3-PDO을 생산하는 3-HP 생산 관련 유전자 및/또는 1,3-PDO 생산 관련 유전자를 미생물 내에 도입하는 단계를 추가로 포함하여, 글리세롤 대사 조절이 가능하고 3-HP 및/또는 1,3-PDO의 생산이 증가된 재조합 미생물을 제조하는 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.

본 발명은 glpK 의 유전자 발현 조절을 통하여 3-HP 또는 1,3-PDO의 생산을 증진시키는 방법에 관한 것으로, 고가의 글루코오스를 발효에 이용하지 않고 저가의 글리세롤을 탄소원 및 에너지원으로 사용하여 미생물의 생장 및 3-HP 또는 1,3-PDO 생산 증가에 뛰어난 효과가 있다.

도 1은 글리세롤 경로를 통한 3-하이드록시프로피온산(3-HP), 1,3-프로판디올(1,3-PDO) 등의 핵심 화합물 생성 경로를 모식적으로 보여주는 것이다.
도 2는 pET-BABH 플라스미드의 개열지도를 보여주는 것이다.
도 3은 pACYC-ara-glpK 플라스미드의 개열지도를 보여주는 것이다.
도 4는 아라비노오스 농도에 따른 3-HP 및 1,3-PDO 생산량 및 Max OD 변화를 보여주는 그래프로서, x축은 아라비노오스 농도 (중량%)를 나타낸다.

이하에서는 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 다만, 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 어떠한 경우에도 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는다.

실시예 1. 글리세롤 데하이드라타아제 및 알데히드 탈수소효소를 이용한 3-HP 및 1,3- 프로판디올의 생산

3-하이드록시프로피온산 (3-HP)과 1,3-프로판디올을 생산하기 위하여 재조합 발현벡터를 도 2의 과정으로 제조하였다.

먼저 클렙시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumonia DSM 2026)의 게놈 DNA로부터 dhaB123-gdrA 및 gdrB를 PCR (Polymerase Chain reaction) 증폭하여 각각 pET-Duet 벡터 (Novagen)의 NcoI-EcoRI 및 EcoRI-SalI 위치에 삽입하여 pET-BAB 벡터를 제작하였다.

다음의 프라이머 및 조건 하에서 PCR을 수행하였다:

K. pneumonia 유래 dhaB - gdrA 증폭용 프라이머:

KdhaB_F (서열번호 20): 5'-ATATCATGAAAAGATCAAAACGATTT-3'(BspHI)

KdhaB_R(서열번호 21): 5'-AAAGAATTCCGCGAGCGCCCGTTTAATTC-3'(EcoRI)

K. pneumonia 유래 gdrB 증폭용 프라이머:

gdrB_F (서열번호 22): 5'-TTTGAATTCTAACGAGGGGACCGTCATGTC-3'(EcoRI)

gdrB_R (서열번호 23): 5'-ATAGTCGACTCAGTTTCTCTCACTTAACGG-3'(SalI)

PCR 조건: Cycle I (97℃, 5 min), Cycle II (31 cycles/ 97℃, 1 min/55℃, 1 min, 72℃, 3 min), Cycle III (72℃, 5 min).

대장균 K12 MG1655 (Escherichia coli K12 MG1655, KCCM 41310, 한국미생물보존센터)로부터 게놈 DNA를 추출하여 정방향 및 역방향 프라이머를 이용하고 LA taq 폴리머라아제 (Takara, Japan)을 통하여 PCR을 수행하여 aldH 유전자를 증폭하였고, NdeI 과 BglII로 절단하여 상기 제작된 pET-BAB 벡터에 클로닝하여 pET-BABH 벡터를 완성하였다.

상기 유전자 증폭에 사용된 프라이머 및 PCR 조건은 다음과 같다:

E. coli K12 유래 aldH 증폭용 프라이머

aldH-NdeI (서열번호 24): 5'-TTTCATATGAATTTTCATCATCTGGCTTAC-3'(NdeI)

aldH-BglII (서열번호 25): 5'-TTTAGATCTTTCGGTCATTTCAGGCCTCCA-3'(BglII)

PCR 조건: Cycle I (97℃, 5 min), Cycle II (31 cycles/ 97℃, 1 min/55℃, 1 min, 72℃, 2 min), Cycle III (72℃, 5 min).

이후 상기에서 구축한 pET-BABH 벡터를 대장균 W3110 균주(KCCM40219, 한국미생물보존센터)에 도입하여 재조합 대장균 SPC001을 제조하였다.

유일한 탄소원으로 글리세롤 40g/L과 비타민 B12 50μM이 포함된 M9 배지(Sambrook, et al., Molecular cloning, 3^rd edition, Cold Spring Harbor Laboratory press)를 사용하여 33℃에서 30시간 동안 진탕 배양하여 3-HP과 1,3-PDO가 각각 12g/L 및 3.3g/L의 양으로 생산되는 것을 확인하였다.

실시예 2. 글리세롤 카이네이즈 glpK 유전자 제거 (Δ glpK )

대장균 W3110 KCCM40219 균주로부터 글리세롤을 일차 대사 경로로 편입시키는 glpK 유전자를 제거한 균주를 제작하였다. 우선 pKD3 (Amp^R, chloramphenicol template plasmid, Datsenko, K. A. and Wanner, B.L. PNAS 97, 6640-6645, 2000)을 주형으로 하고 다음의 두 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하여 glpK 제거용 PCR 절편을 확보하였다.

프라이머

glpK_KO_F (서열번호 26): 5'-ATGACTGAAAAAAAATATATCGTTGCGCTCGACCAGGGCACCACCGTGTAGGCTGGAGCT GCTTC-3'

glpK_KO_R (서열번호 27): 5'-TTATTCGTCGTGTTCTTCCCACGCCATCGCGCGTTTAACCGCTTTCATATGAATATCCTCCTTAG-3'

PCR 조건: Cycle I (97℃, 5 min), Cycle II (31 cycles/ 97℃, 2 min/55℃, 1min, 72℃, 1.5 min), Cycle III (72℃, 5 min).

수득된 1.5-kb의 PCR 절편을 pKD46 (Amp^R, lamda red recombinase expression plasmid, arabinose inducible expression, temperature sensitive, 6.3-kb, Datsenko, K. A. and Wanner, B.L. PNAS 97, 6640-6645, 2000)으로 형질 전환된 대장균 W3110 균주에 일렉트로포레이션하였다. 다음으로 resistance marker (cm^R)가 포함된 LB 평판배지에 도말하고, 37℃에서 배양하여, glpK 유전자가 클로람페니콜 저항성 유전자로 치환된 균주를 선별하여 glpK가 제거된 ΔglpK 균주 (SPC007)를 얻었다. 상기 얻어진 Escherichia coli SPC007 (ΔglpK 균주)는 2012년 8월 21일자로 대한민국 서울특별시 서대문구에 소재하는 한국미생물보존센터에 기탁하여, 수탁번호 KCCM11296P를 부여받았다.

실시예 3. 글리세롤 카이네이즈 glpK 유전자 발현 벡터 제작 ( pACYC - ara - glpK )

글리세롤 카이네이즈를 암호화하는 glpK 유전자가 아라비노오스 유도성 프로모터(arabinose inducible promoter)에 의하여 발현되는 벡터를 제작하였다. 우선 pKD46 (AmpR, lamda red recombinase expression plasmid, ara-inducible expression, temperature sensitive, 6.3-kb, Datsenko, K. A. and Wanner, B.L. PNAS 97, 6640-6645, 2000)를 주형으로 아래의 프라이머 쌍을 이용하여 아라비노오스 유도성 프로모터를 증폭하였다. 얻어진 아라비노오스 유도성 프로모터의 DNA 절편을 NotI과 NdeI 효소로 절단하고 동일 효소로 절단한 pACYC-Duet 벡터 (Novagen)에 삽입하여 pACYC-ara 플라스미드를 제작하였다.

AraBAD_F (서열번호 28): 5'-GCGGCCGCTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGGATTTATTATGACAACTTGACGGC-3'(NotI)

AraBAD_R (서열번호 29): 5'-CATATGTATATCTCCTTAGAGCTCGAATTCCC-3'(NdeI)

PCR 조건: Cycle I (97℃, 5 min), Cycle II (31 cycles/ 97℃, 1 min/55℃, 1 min, 72℃, 1.5 min), Cycle III (72℃, 5 min).

다음으로 대장균 W3110의 유전체를 공지된 방법으로 분리 정제하고 (Sambrook, et al., Molecular cloning, 3^rd edition, Cold Spring Harbor Laboratory press), 상기 분리된 대장균 W3110 유전체 DNA를 주형으로 아래의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 수행하여 glpK PCR 절편을 얻었다. 상기 얻어진 glpK PCR 절편을 NdeI과 XhoI 효소로 절단하고, 역시 NdeI과 XhoI으로 절단한 pACYC-ara 플라스미드에 삽입하여 최종적으로 pACYC-ara-glpK 플라스미드(도 3)를 완성하였다.

glpK_F (서열번호 30): 5'-CATATGATGACTGAAAAAAAATATATCGTTGCGCTC-3'(NdeI)

glpK_R (서열번호 31): 5'-CTCGAGTTATTCGTCGTGTTCTTCCCACG-3'(XhoI)

실시예 4. 글리세롤 카이네이즈 glpK 발현 조절 균주 제작 및 발효

실시예 2에서 제작한 ΔglpK 균주(SPC007)를 실시예 3에서 제작한 pACYC-ara-glpK 플라스미드로 형질전환시켜 SPC008 균주를 제작하였다. 상기 얻어진 SPC007 균주(ΔglpK)와 SPC008 균주(ΔglpK & pACYC-ara-glpK)를 각각 글리세롤 40g/L 및 비타민 B12가 50μM이 포함된 M9 최소배지 (Sambrook, et al., Molecular cloning, 3^rd edition, Cold Spring Harbor Laboratory press)에서 배양(33℃, 30 시간; 접종 초기 OD=0.15; OD=0.6에서, 아라비노즈 각각 처리)하여 대장균 생장 속도 (600nm에서의 OD값으로 측정)를 측정한 결과를 아래의 표 1에 나타내었다.

균주명/아라비노즈 농도	SPC007	SPC008/L-ara 0%	SPC008/ L-Ara 10^-7wt%	SPC008/ L-Ara 10^-5wt%	SPC008/ L-Ara 10^-3wt%
0	0.21	0.39	0.32	0.34	0.33
3hr	0.43	0.44	0.43	0.5	0.63
17hr	0.77	1.65	1.70	2.54	3.46
20hr	0.88	1.94	2.00	3.20	4.00
24hr	1.16	2.74	2.80	3.93	4.68

상기 표 1에 나타난 바와 같이, 유도제(inducer)로 작용하는 L-arabinose의 농도가 증가함에 따라 생장속도가 증가함을 확인하였다.

한편, 실시예 1에서 제작한 3-HP 생산 벡터 pET-BABH를 glpK 유전자 발현이 아라비노오스 유도성 프로모터에 의하여 조절되는 상기 SPC008 균주에 추가 도입하여 재조합 균주 SPC009를 제작하였다. 상기 얻어진 SPC009 균주를 글리세롤 40g/L 및 비타민 B12가 50μM이 포함된 M9 최소배지 (Sambrook, et al., Molecular cloning, 3^rd edition, Cold Spring Harbor Laboratory press)에서 배양(33℃, 30 시간; 접종 초기 OD=0.15; OD=0.6에서, 아라비노즈 각각 처리)하여 대장균 생장 속도 (600nm에서의 OD값으로 측정) 및 생산된 3-HP 및 1,3-프로판디올의 농도를 측정하여 도 4에 나타내었다.

도 4에서 보는 바와 같이, 유도제로서 아라비노오스를 10^-7% 정도 첨가하였을 때 가장 높은 3-HP 농도가 검출되었다 (15.3g/L). 대조군으로 사용된 SPC001 균주의 3-HP 생산량이 12g/L인 것과 비교할 때 SPC009 균주 (3-HP 생산량 15.3g/L)는 약 27% 정도의 3-HP 생산 농도 증가 효과를 나타냄을 확인하였다.

또한, 도 4에서 보는 바와 같이, 유도제로서 아라비노오스를 10^-5% 정도 첨가하였을 때 가장 높은 1,3-PDO 농도가 검출되었다 (4.9g/L). 대조군으로 사용된 SPC001 균주의 1,3-PDO 생산량이 3.3g/L인 것과 비교할 때 SPC009 균주 (1,3-PDO 4.9g/L)는 약 48% 정도의 1,3-PDO 생산 농도 증가 효과를 나타냄을 확인하였다. 종합적으로 SPC009 균주 배양시 아라비노즈를 10^-5중량%에서 10^-7중량% 농도로 첨가하였을 때 3-HP 및 1,3-PDO의 생산량이 대조군 (SPC001)균주 대비 각각 최대 27% 및 48% 향상됨을 확인하였다.

한국미생물보존센터(국외)

KCCM11296P

20120821

<110> SAMSUNG PETROCHEMICAL CO., LTD. <120> Recombinant microorganism having improved productivity of glycerol dehydration product and use thereof <130> DPP20124407KR <160> 31 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1509 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GlpK coding nucleotide sequence <400> 1 atgactgaaa aaaaatatat cgttgcgctc gaccagggca ccaccagctc ccgcgcggtc 60 gtaatggatc acgatgccaa tatcattagc gtgtcgcagc gcgaatttga gcaaatctac 120 ccaaaaccag gttgggtaga acacgaccca atggaaatct gggccaccca aagctccacg 180 ctggtagaag tgctggcgaa agccgatatc agttccgatc aaattgcagc tatcggtatt 240 acgaaccagc gtgaaaccac tattgtctgg gaaaaagaaa ccggcaagcc tatctataac 300 gccattgtct ggcagtgccg tcgtaccgca gaaatctgcg agcatttaaa acgtgacggt 360 ttagaagatt atatccgcag caataccggt ctggtgattg acccgtactt ttctggcacc 420 aaagtgaagt ggatcctcga ccatgtggaa ggctctcgcg agcgtgcacg tcgtggtgaa 480 ttgctgtttg gtacggttga tacgtggctt atctggaaaa tgactcaggg ccgtgtccat 540 gtgaccgatt acaccaacgc ctctcgtacc atgttgttca acatccatac cctggactgg 600 gacgacaaaa tgctggaagt gctggatatt ccgcgcgaga tgctgccaga agtgcgtcgt 660 tcttccgaag tatacggtca gactaacatt ggcggcaaag gcggcacgcg tattccaatc 720 tccgggatcg ccggtgacca gcaggccgcg ctgtttggtc agttgtgcgt gaaagaaggg 780 atggcgaaga acacctatgg cactggctgc tttatgctga tgaacactgg cgagaaagcg 840 gtgaaatcag aaaacggcct gctgaccacc atcgcctgcg gcccgactgg cgaagtgaac 900 tatgcgttgg aaggtgcggt gtttatggca ggcgcatcca ttcagtggct gcgcgatgaa 960 atgaagttga ttaacgacgc ctacgattcc gaatatttcg ccaccaaagt gcaaaacacc 1020 aatggtgtgt atgtggttcc ggcatttacc gggctgggtg cgccgtactg ggacccgtat 1080 gcgcgcgggg cgattttcgg tctgactcgt ggggtgaacg ctaaccacat tatacgcgcg 1140 acgctggagt ctattgctta tcagacgcgt gacgtgctgg aagcgatgca ggccgactct 1200 ggtatccgtc tgcacgccct gcgcgtggat ggtggcgcag tagcaaacaa tttcctgatg 1260 cagttccagt ccgatattct cggcacccgc gttgagcgcc cggaagtgcg cgaagtcacc 1320 gcattgggtg cggcctatct cgcaggcctg gcggttggct tctggcagaa cctcgacgag 1380 ctgcaagaga aagcggtgat tgagcgcgag ttccgtccag gcatcgaaac cactgagcgt 1440 aattaccgtt acgcaggctg gaaaaaagcg gttaaacgcg cgatggcgtg ggaagaacac 1500 gacgaataa 1509 <210> 2 <211> 502 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of GlpK <400> 2 Met Thr Glu Lys Lys Tyr Ile Val Ala Leu Asp Gln Gly Thr Thr Ser 1 5 10 15 Ser Arg Ala Val Val Met Asp His Asp Ala Asn Ile Ile Ser Val Ser 20 25 30 Gln Arg Glu Phe Glu Gln Ile Tyr Pro Lys Pro Gly Trp Val Glu His 35 40 45 Asp Pro Met Glu Ile Trp Ala Thr Gln Ser Ser Thr Leu Val Glu Val 50 55 60 Leu Ala Lys Ala Asp Ile Ser Ser Asp Gln Ile Ala Ala Ile Gly Ile 65 70 75 80 Thr Asn Gln Arg Glu Thr Thr Ile Val Trp Glu Lys Glu Thr Gly Lys 85 90 95 Pro Ile Tyr Asn Ala Ile Val Trp Gln Cys Arg Arg Thr Ala Glu Ile 100 105 110 Cys Glu His Leu Lys Arg Asp Gly Leu Glu Asp Tyr Ile Arg Ser Asn 115 120 125 Thr Gly Leu Val Ile Asp Pro Tyr Phe Ser Gly Thr Lys Val Lys Trp 130 135 140 Ile Leu Asp His Val Glu Gly Ser Arg Glu Arg Ala Arg Arg Gly Glu 145 150 155 160 Leu Leu Phe Gly Thr Val Asp Thr Trp Leu Ile Trp Lys Met Thr Gln 165 170 175 Gly Arg Val His Val Thr Asp Tyr Thr Asn Ala Ser Arg Thr Met Leu 180 185 190 Phe Asn Ile His Thr Leu Asp Trp Asp Asp Lys Met Leu Glu Val Leu 195 200 205 Asp Ile Pro Arg Glu Met Leu Pro Glu Val Arg Arg Ser Ser Glu Val 210 215 220 Tyr Gly Gln Thr Asn Ile Gly Gly Lys Gly Gly Thr Arg Ile Pro Ile 225 230 235 240 Ser Gly Ile Ala Gly Asp Gln Gln Ala Ala Leu Phe Gly Gln Leu Cys 245 250 255 Val Lys Glu Gly Met Ala Lys Asn Thr Tyr Gly Thr Gly Cys Phe Met 260 265 270 Leu Met Asn Thr Gly Glu Lys Ala Val Lys Ser Glu Asn Gly Leu Leu 275 280 285 Thr Thr Ile Ala Cys Gly Pro Thr Gly Glu Val Asn Tyr Ala Leu Glu 290 295 300 Gly Ala Val Phe Met Ala Gly Ala Ser Ile Gln Trp Leu Arg Asp Glu 305 310 315 320 Met Lys Leu Ile Asn Asp Ala Tyr Asp Ser Glu Tyr Phe Ala Thr Lys 325 330 335 Val Gln Asn Thr Asn Gly Val Tyr Val Val Pro Ala Phe Thr Gly Leu 340 345 350 Gly Ala Pro Tyr Trp Asp Pro Tyr Ala Arg Gly Ala Ile Phe Gly Leu 355 360 365 Thr Arg Gly Val Asn Ala Asn His Ile Ile Arg Ala Thr Leu Glu Ser 370 375 380 Ile Ala Tyr Gln Thr Arg Asp Val Leu Glu Ala Met Gln Ala Asp Ser 385 390 395 400 Gly Ile Arg Leu His Ala Leu Arg Val Asp Gly Gly Ala Val Ala Asn 405 410 415 Asn Phe Leu Met Gln Phe Gln Ser Asp Ile Leu Gly Thr Arg Val Glu 420 425 430 Arg Pro Glu Val Arg Glu Val Thr Ala Leu Gly Ala Ala Tyr Leu Ala 435 440 445 Gly Leu Ala Val Gly Phe Trp Gln Asn Leu Asp Glu Leu Gln Glu Lys 450 455 460 Ala Val Ile Glu Arg Glu Phe Arg Pro Gly Ile Glu Thr Thr Glu Arg 465 470 475 480 Asn Tyr Arg Tyr Ala Gly Trp Lys Lys Ala Val Lys Arg Ala Met Ala 485 490 495 Trp Glu Glu His Asp Glu 500 <210> 3 <211> 1668 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Klebsiella pneumoniae dhaB1 coding nucleotide sequence <400> 3 atgaaaagat caaaacgatt tgcagtactg gcccagcgcc ccgtcaatca ggacgggctg 60 attggcgagt ggcctgaaga ggggctgatc gccatggaca gcccctttga cccggtctct 120 tcagtaaaag tggacaacgg tctgatcgtc gagctggacg gcaaacgccg ggaccagttt 180 gacatgatcg accgatttat cgccgattac gcgatcaacg ttgagcgcac agagcaggca 240 atgcgcctgg aggcggtgga aatagcccgc atgctggtgg atattcacgt cagtcgggag 300 gagatcattg ccatcactac cgccatcacg ccggccaaag cggtcgaggt gatggcgcag 360 atgaacgtgg tggagatgat gatggcgctg cagaagatgc gtgcccgccg gaccccctcc 420 aaccagtgcc acgtcaccaa tctcaaagat aatccggtgc agattgctgc tgacgccgcc 480 gaggccggga tccgcggctt ctcagaacag gagaccacgg tcggtatcgc gcgctatgcg 540 ccgtttaacg ccctggcgct gttggtcggt tcgcagtgcg gccgccccgg cgttttgacg 600 cagtgctcgg tggaagaggc caccgagctg gagctgggca tgcgtggctt aaccagctac 660 gccgagacgg tgtcggtcta cggcaccgaa gcggtattta ccgacggcga tgatactccg 720 tggtcgaagg cgttcctcgc ctcggcctac gcctcccgcg ggttgaaaat gcgctacacc 780 tccggcaccg gatccgaagc gctgatgggc tattcggaga gcaagtcgat gctctacctc 840 gaatcgcgct gcatcttcat taccaaaggc gccggggttc aggggctgca aaacggcgcg 900 gtgagctgta tcggcatgac cggcgctgtg ccgtcgggca ttcgggcggt gctggcggaa 960 aacctgatcg cctctatgct cgacctcgaa gtggcgtccg ccaacgacca gactttctcc 1020 cactcggata ttcgccgcac cgcgcgcacc ctgatgcaga tgctgccggg caccgacttt 1080 attttctccg gctacagcgc ggtgccgaac tacgacaaca tgttcgccgg ctcgaacttc 1140 gatgcggaag attttgatga ttacaacatc ctgcagcgtg acctgatggt tgacggcggc 1200 ctgcgtccgg tgaccgaggc ggaaaccatt gccattcgcc agaaagcggc gcgggcgatc 1260 caggcggttt tccgcgagct ggggctgccg ccaatcgccg acgaggaggt ggaggccgcc 1320 acctacgcgc acggtagcaa cgagatgccg ccgcgtaacg tggtggagga tctgagtgcg 1380 gtggaagaga tgatgaagcg caacatcacc ggcctcgata ttgtcggcgc gttgagccgc 1440 agcggctttg aggatatcgc cagcaatatt ctcaatatgc tgcgccagcg ggtcaccggc 1500 gattacctgc agacctcggc cattctcgat cggcagttcg aggtggtgag tgcggtcaac 1560 gacatcaatg actatcaggg gccgggcacc ggctatcgca tctctgccga acgctgggcg 1620 gagatcaaaa atattccggg cgtggttcag cccgacacca ctgaataa 1668 <210> 4 <211> 555 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of Klebsiella pneumoniae dhaB1 <400> 4 Met Lys Arg Ser Lys Arg Phe Ala Val Leu Ala Gln Arg Pro Val Asn 1 5 10 15 Gln Asp Gly Leu Ile Gly Glu Trp Pro Glu Glu Gly Leu Ile Ala Met 20 25 30 Asp Ser Pro Phe Asp Pro Val Ser Ser Val Lys Val Asp Asn Gly Leu 35 40 45 Ile Val Glu Leu Asp Gly Lys Arg Arg Asp Gln Phe Asp Met Ile Asp 50 55 60 Arg Phe Ile Ala Asp Tyr Ala Ile Asn Val Glu Arg Thr Glu Gln Ala 65 70 75 80 Met Arg Leu Glu Ala Val Glu Ile Ala Arg Met Leu Val Asp Ile His 85 90 95 Val Ser Arg Glu Glu Ile Ile Ala Ile Thr Thr Ala Ile Thr Pro Ala 100 105 110 Lys Ala Val Glu Val Met Ala Gln Met Asn Val Val Glu Met Met Met 115 120 125 Ala Leu Gln Lys Met Arg Ala Arg Arg Thr Pro Ser Asn Gln Cys His 130 135 140 Val Thr Asn Leu Lys Asp Asn Pro Val Gln Ile Ala Ala Asp Ala Ala 145 150 155 160 Glu Ala Gly Ile Arg Gly Phe Ser Glu Gln Glu Thr Thr Val Gly Ile 165 170 175 Ala Arg Tyr Ala Pro Phe Asn Ala Leu Ala Leu Leu Val Gly Ser Gln 180 185 190 Cys Gly Arg Pro Gly Val Leu Thr Gln Cys Ser Val Glu Glu Ala Thr 195 200 205 Glu Leu Glu Leu Gly Met Arg Gly Leu Thr Ser Tyr Ala Glu Thr Val 210 215 220 Ser Val Tyr Gly Thr Glu Ala Val Phe Thr Asp Gly Asp Asp Thr Pro 225 230 235 240 Trp Ser Lys Ala Phe Leu Ala Ser Ala Tyr Ala Ser Arg Gly Leu Lys 245 250 255 Met Arg Tyr Thr Ser Gly Thr Gly Ser Glu Ala Leu Met Gly Tyr Ser 260 265 270 Glu Ser Lys Ser Met Leu Tyr Leu Glu Ser Arg Cys Ile Phe Ile Thr 275 280 285 Lys Gly Ala Gly Val Gln Gly Leu Gln Asn Gly Ala Val Ser Cys Ile 290 295 300 Gly Met Thr Gly Ala Val Pro Ser Gly Ile Arg Ala Val Leu Ala Glu 305 310 315 320 Asn Leu Ile Ala Ser Met Leu Asp Leu Glu Val Ala Ser Ala Asn Asp 325 330 335 Gln Thr Phe Ser His Ser Asp Ile Arg Arg Thr Ala Arg Thr Leu Met 340 345 350 Gln Met Leu Pro Gly Thr Asp Phe Ile Phe Ser Gly Tyr Ser Ala Val 355 360 365 Pro Asn Tyr Asp Asn Met Phe Ala Gly Ser Asn Phe Asp Ala Glu Asp 370 375 380 Phe Asp Asp Tyr Asn Ile Leu Gln Arg Asp Leu Met Val Asp Gly Gly 385 390 395 400 Leu Arg Pro Val Thr Glu Ala Glu Thr Ile Ala Ile Arg Gln Lys Ala 405 410 415 Ala Arg Ala Ile Gln Ala Val Phe Arg Glu Leu Gly Leu Pro Pro Ile 420 425 430 Ala Asp Glu Glu Val Glu Ala Ala Thr Tyr Ala His Gly Ser Asn Glu 435 440 445 Met Pro Pro Arg Asn Val Val Glu Asp Leu Ser Ala Val Glu Glu Met 450 455 460 Met Lys Arg Asn Ile Thr Gly Leu Asp Ile Val Gly Ala Leu Ser Arg 465 470 475 480 Ser Gly Phe Glu Asp Ile Ala Ser Asn Ile Leu Asn Met Leu Arg Gln 485 490 495 Arg Val Thr Gly Asp Tyr Leu Gln Thr Ser Ala Ile Leu Asp Arg Gln 500 505 510 Phe Glu Val Val Ser Ala Val Asn Asp Ile Asn Asp Tyr Gln Gly Pro 515 520 525 Gly Thr Gly Tyr Arg Ile Ser Ala Glu Arg Trp Ala Glu Ile Lys Asn 530 535 540 Ile Pro Gly Val Val Gln Pro Asp Thr Thr Glu 545 550 555 <210> 5 <211> 585 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Klebsiella pneumoniae dhaB2 coding nucleotide sequence <400> 5 gtgcaacaga caacccaaat tcagccctct tttaccctga aaacccgcga gggcggggta 60 gcttctgccg atgaacgcgc cgatgaagtg gtgatcggcg tcggccctgc cttcgataaa 120 caccagcatc acactctgat cgatatgccc catggcgcga tcctcaaaga gctgattgcc 180 ggggtggaag aagaggggct tcacgcccgg gtggtgcgca ttctgcgcac gtccgacgtc 240 tcctttatgg cctgggatgc ggccaacctg agcggctcgg ggatcggcat cggtatccag 300 tcgaagggga ccacggtcat ccatcagcgc gatctgctgc cgctcagcaa cctggagctg 360 ttctcccagg cgccgctgct gacgctggaa acctaccggc agattggcaa aaacgccgcg 420 cgctatgcgc gcaaagagtc accttcgccg gtgccggtgg tgaacgatca gatggtgcgg 480 ccgaaattta tggccaaagc cgcgctattt catatcaaag agaccaaaca tgtggtgcag 540 gacgccgagc ccgtcaccct gcacgtcgac ttagtaaggg agtga 585 <210> 6 <211> 194 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of Klebsiella pneumoniae dhaB2 <400> 6 Val Gln Gln Thr Thr Gln Ile Gln Pro Ser Phe Thr Leu Lys Thr Arg 1 5 10 15 Glu Gly Gly Val Ala Ser Ala Asp Glu Arg Ala Asp Glu Val Val Ile 20 25 30 Gly Val Gly Pro Ala Phe Asp Lys His Gln His His Thr Leu Ile Asp 35 40 45 Met Pro His Gly Ala Ile Leu Lys Glu Leu Ile Ala Gly Val Glu Glu 50 55 60 Glu Gly Leu His Ala Arg Val Val Arg Ile Leu Arg Thr Ser Asp Val 65 70 75 80 Ser Phe Met Ala Trp Asp Ala Ala Asn Leu Ser Gly Ser Gly Ile Gly 85 90 95 Ile Gly Ile Gln Ser Lys Gly Thr Thr Val Ile His Gln Arg Asp Leu 100 105 110 Leu Pro Leu Ser Asn Leu Glu Leu Phe Ser Gln Ala Pro Leu Leu Thr 115 120 125 Leu Glu Thr Tyr Arg Gln Ile Gly Lys Asn Ala Ala Arg Tyr Ala Arg 130 135 140 Lys Glu Ser Pro Ser Pro Val Pro Val Val Asn Asp Gln Met Val Arg 145 150 155 160 Pro Lys Phe Met Ala Lys Ala Ala Leu Phe His Ile Lys Glu Thr Lys 165 170 175 His Val Val Gln Asp Ala Glu Pro Val Thr Leu His Val Asp Leu Val 180 185 190 Arg Glu <210> 7 <211> 426 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Klebsiella pneumoniae dhaB3 coding nucleotide sequence <400> 7 atgagcgaga aaaccatgcg cgtgcaggat tatccgttag ccacccgctg cccggagcat 60 atcctgacgc ctaccggcaa accattgacc gatattaccc tcgagaaggt gctctctggc 120 gaggtgggcc cgcaggatgt gcggatctcc tgccagaccc ttgagtacca ggcgcagatt 180 gccgagcaga tgcagcgcca tgcggtggcg cgcaatttcc gccgcgcggc ggagcttatc 240 gccattcctg acgagcgcat tctggctatc tataacgcgc tgcgcccgtt ccgctcctcg 300 caggcggagc tgctggcgat cgccgacgag ctggagcaca cctggcatgc gacagtgaat 360 gccgcctttg tccgggagtc ggcggaagtg tatcagcagc ggcataagct gcgtaaagga 420 agctaa 426 <210> 8 <211> 141 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of Klebsiella pneumoniae dhaB3 <400> 8 Met Ser Glu Lys Thr Met Arg Val Gln Asp Tyr Pro Leu Ala Thr Arg 1 5 10 15 Cys Pro Glu His Ile Leu Thr Pro Thr Gly Lys Pro Leu Thr Asp Ile 20 25 30 Thr Leu Glu Lys Val Leu Ser Gly Glu Val Gly Pro Gln Asp Val Arg 35 40 45 Ile Ser Cys Gln Thr Leu Glu Tyr Gln Ala Gln Ile Ala Glu Gln Met 50 55 60 Gln Arg His Ala Val Ala Arg Asn Phe Arg Arg Ala Ala Glu Leu Ile 65 70 75 80 Ala Ile Pro Asp Glu Arg Ile Leu Ala Ile Tyr Asn Ala Leu Arg Pro 85 90 95 Phe Arg Ser Ser Gln Ala Glu Leu Leu Ala Ile Ala Asp Glu Leu Glu 100 105 110 His Thr Trp His Ala Thr Val Asn Ala Ala Phe Val Arg Glu Ser Ala 115 120 125 Glu Val Tyr Gln Gln Arg His Lys Leu Arg Lys Gly Ser 130 135 140 <210> 9 <211> 1824 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Klebsiella pneumoniae gdrA coding nucleotide sequence <400> 9 atgccgttaa tagccgggat tgatatcggc aacgccacca ccgaggtggc gctggcgtcc 60 gacgacccgc aggcgagggc gtttgttgcc agcgggatcg tcgcgacgac gggcatgaaa 120 gggacgcggg acaatatcgc cgggaccctc gccgcgctgg agcaggccct ggcgaaaaca 180 ccgtggtcgg tgagcgatgt ctctcgcatc tatcttaacg aagccgcgcc ggtgattggc 240 gatgtggcga tggagaccat caccgagacc attatcaccg aatcgaccat gatcggtcat 300 aacccgcaga cgccgggcgg ggtgggcgtt ggcgtgggga cgactatcgc cctcgggcgg 360 ctggcgacgc tgccggcggc gcagtatgcc gaggggtgga tcgtactgat tgacgacgcc 420 gtcgatttcc ttgacgccgt gtggtggctc aatgaggcgc tcgaccgggg gatcaacgtg 480 gtggcggcga tcctcaaaaa ggacgacggc gtgctggtga acaaccgcct gcgtaaaacc 540 ctgccggtgg tagatgaagt gacgctgctg gagcaggtcc ccgagggggt aatggcggcg 600 gtggaagtgg ccgcgccggg ccaggtggtg cggatcctgt cgaatcccta cgggatcgcc 660 accttcttcg ggctaagccc ggaagagacc caggccatcg tccccatcgc ccgcgccctg 720 attggcaacc gttcagcggt ggtgctcaag accccgcagg gggatgtgca gtcgcgggtg 780 atcccggcgg gcaacctcta cattagcggc gaaaagcgcc gcggagaggc cgatgtcgcc 840 gagggcgcgg aagccatcat gcaggcgatg agcgcctgcg ctccggtacg cgacatccgc 900 ggcgaaccgg gcactcacgc cggcggcatg cttgagcggg tgcgcaaggt aatggcgtcc 960 ctgaccgacc atgagatgag cgcgatatac atccaggatc tgctggcggt ggatacgttt 1020 attccgcgca aggtgcaggg cgggatggcc ggcgagtgcg ccatggaaaa tgccgtcggg 1080 atggcggcga tggtgaaagc ggatcgtctg caaatgcagg ttatcgcccg cgaactgagc 1140 gcccgactgc agaccgaggt ggtggtgggc ggcgtggagg ccaacatggc catcgccggg 1200 gcgttaacca ctcccggctg tgcggcgccg ctggcgatcc tcgacctcgg cgccggctcg 1260 acggatgcgg cgatcgtcaa cgcggagggg cagataacgg cggtccatct cgccggggcg 1320 gggaatatgg tcagcctgtt gattaaaacc gagctgggcc tcgaggatct ttcgctggcg 1380 gaagcgataa aaaaataccc gctggccaaa gtggaaagcc tgttcagtat tcgtcacgag 1440 aatggcgcgg tggagttctt tcgggaagcc ctcagcccgg cggtgttcgc caaagtggtg 1500 tacatcaagg agggcgaact ggtgccgatc gataacgcca gcccgctgga aaaaattcgt 1560 ctcgtgcgcc ggcaggcgaa agagaaagtg tttgtcacca actgcctgcg cgcgctgcgc 1620 caggtctcac ccggcggttc cattcgcgat atcgcctttg tggtgctggt gggcggctca 1680 tcgctggact ttgagatccc gcagcttatc acggaagcct tgtcgcacta tggcgtggtc 1740 gccgggcagg gcaatattcg gggaacagaa gggccgcgca acgcggtcgc caccgggctg 1800 ctactggccg gtcaggcgaa ttaa 1824 <210> 10 <211> 607 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of Klebsiella pneumoniae gdrA <400> 10 Met Pro Leu Ile Ala Gly Ile Asp Ile Gly Asn Ala Thr Thr Glu Val 1 5 10 15 Ala Leu Ala Ser Asp Asp Pro Gln Ala Arg Ala Phe Val Ala Ser Gly 20 25 30 Ile Val Ala Thr Thr Gly Met Lys Gly Thr Arg Asp Asn Ile Ala Gly 35 40 45 Thr Leu Ala Ala Leu Glu Gln Ala Leu Ala Lys Thr Pro Trp Ser Val 50 55 60 Ser Asp Val Ser Arg Ile Tyr Leu Asn Glu Ala Ala Pro Val Ile Gly 65 70 75 80 Asp Val Ala Met Glu Thr Ile Thr Glu Thr Ile Ile Thr Glu Ser Thr 85 90 95 Met Ile Gly His Asn Pro Gln Thr Pro Gly Gly Val Gly Val Gly Val 100 105 110 Gly Thr Thr Ile Ala Leu Gly Arg Leu Ala Thr Leu Pro Ala Ala Gln 115 120 125 Tyr Ala Glu Gly Trp Ile Val Leu Ile Asp Asp Ala Val Asp Phe Leu 130 135 140 Asp Ala Val Trp Trp Leu Asn Glu Ala Leu Asp Arg Gly Ile Asn Val 145 150 155 160 Val Ala Ala Ile Leu Lys Lys Asp Asp Gly Val Leu Val Asn Asn Arg 165 170 175 Leu Arg Lys Thr Leu Pro Val Val Asp Glu Val Thr Leu Leu Glu Gln 180 185 190 Val Pro Glu Gly Val Met Ala Ala Val Glu Val Ala Ala Pro Gly Gln 195 200 205 Val Val Arg Ile Leu Ser Asn Pro Tyr Gly Ile Ala Thr Phe Phe Gly 210 215 220 Leu Ser Pro Glu Glu Thr Gln Ala Ile Val Pro Ile Ala Arg Ala Leu 225 230 235 240 Ile Gly Asn Arg Ser Ala Val Val Leu Lys Thr Pro Gln Gly Asp Val 245 250 255 Gln Ser Arg Val Ile Pro Ala Gly Asn Leu Tyr Ile Ser Gly Glu Lys 260 265 270 Arg Arg Gly Glu Ala Asp Val Ala Glu Gly Ala Glu Ala Ile Met Gln 275 280 285 Ala Met Ser Ala Cys Ala Pro Val Arg Asp Ile Arg Gly Glu Pro Gly 290 295 300 Thr His Ala Gly Gly Met Leu Glu Arg Val Arg Lys Val Met Ala Ser 305 310 315 320 Leu Thr Asp His Glu Met Ser Ala Ile Tyr Ile Gln Asp Leu Leu Ala 325 330 335 Val Asp Thr Phe Ile Pro Arg Lys Val Gln Gly Gly Met Ala Gly Glu 340 345 350 Cys Ala Met Glu Asn Ala Val Gly Met Ala Ala Met Val Lys Ala Asp 355 360 365 Arg Leu Gln Met Gln Val Ile Ala Arg Glu Leu Ser Ala Arg Leu Gln 370 375 380 Thr Glu Val Val Val Gly Gly Val Glu Ala Asn Met Ala Ile Ala Gly 385 390 395 400 Ala Leu Thr Thr Pro Gly Cys Ala Ala Pro Leu Ala Ile Leu Asp Leu 405 410 415 Gly Ala Gly Ser Thr Asp Ala Ala Ile Val Asn Ala Glu Gly Gln Ile 420 425 430 Thr Ala Val His Leu Ala Gly Ala Gly Asn Met Val Ser Leu Leu Ile 435 440 445 Lys Thr Glu Leu Gly Leu Glu Asp Leu Ser Leu Ala Glu Ala Ile Lys 450 455 460 Lys Tyr Pro Leu Ala Lys Val Glu Ser Leu Phe Ser Ile Arg His Glu 465 470 475 480 Asn Gly Ala Val Glu Phe Phe Arg Glu Ala Leu Ser Pro Ala Val Phe 485 490 495 Ala Lys Val Val Tyr Ile Lys Glu Gly Glu Leu Val Pro Ile Asp Asn 500 505 510 Ala Ser Pro Leu Glu Lys Ile Arg Leu Val Arg Arg Gln Ala Lys Glu 515 520 525 Lys Val Phe Val Thr Asn Cys Leu Arg Ala Leu Arg Gln Val Ser Pro 530 535 540 Gly Gly Ser Ile Arg Asp Ile Ala Phe Val Val Leu Val Gly Gly Ser 545 550 555 560 Ser Leu Asp Phe Glu Ile Pro Gln Leu Ile Thr Glu Ala Leu Ser His 565 570 575 Tyr Gly Val Val Ala Gly Gln Gly Asn Ile Arg Gly Thr Glu Gly Pro 580 585 590 Arg Asn Ala Val Ala Thr Gly Leu Leu Leu Ala Gly Gln Ala Asn 595 600 605 <210> 11 <211> 354 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Klebsiella pneumoniae gdrB coding nucleotide sequence <400> 11 atgtcgcttt caccgccagg cgtacgcctg ttttacgatc cgcgcgggca ccatgccggc 60 gccatcaatg agctgtgctg ggggctggag gagcaggggg tcccctgcca gaccataacc 120 tatgacggag gcggtgacgc cgctgcgctg ggcgccctgg cggccagaag ctcgcccctg 180 cgggtgggta ttgggctcag cgcgtccggc gagatagccc tcactcatgc ccagctgccg 240 gcggacgcgc cgctggctac cggacacgtc accgatagcg acgatcatct gcgtacgctc 300 ggcgccaacg ccgggcagct ggttaaagtc ctgccgttaa gtgagagaaa ctga 354 <210> 12 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of Klebsiella pneumoniae gdrB <400> 12 Met Ser Leu Ser Pro Pro Gly Val Arg Leu Phe Tyr Asp Pro Arg Gly 1 5 10 15 His His Ala Gly Ala Ile Asn Glu Leu Cys Trp Gly Leu Glu Glu Gln 20 25 30 Gly Val Pro Cys Gln Thr Ile Thr Tyr Asp Gly Gly Gly Asp Ala Ala 35 40 45 Ala Leu Gly Ala Leu Ala Ala Arg Ser Ser Pro Leu Arg Val Gly Ile 50 55 60 Gly Leu Ser Ala Ser Gly Glu Ile Ala Leu Thr His Ala Gln Leu Pro 65 70 75 80 Ala Asp Ala Pro Leu Ala Thr Gly His Val Thr Asp Ser Asp Asp His 85 90 95 Leu Arg Thr Leu Gly Ala Asn Ala Gly Gln Leu Val Lys Val Leu Pro 100 105 110 Leu Ser Glu Arg Asn 115 <210> 13 <211> 1488 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of aldH gene of E. coli aldehyde dehydrogenase <400> 13 atgaattttc atcatctggc ttactggcag gataaagcgt taagtctcgc cattgaaaac 60 cgcttattta ttaacggtga atatactgct gcggcggaaa atgaaacctt tgaaaccgtt 120 gatccggtca cccaggcacc gctggcgaaa attgcccgcg gcaagagcgt cgatatcgac 180 cgtgcgatga gcgcagcacg cggcgtattt gaacgcggcg actggtcact ctcttctccg 240 gctaaacgta aagcggtact gaataaactc gccgatttaa tggaagccca cgccgaagag 300 ctggcactgc tggaaactct cgacaccggc aaaccgattc gtcacagtct gcgtgatgat 360 attcccggcg cggcgcgcgc cattcgctgg tacgccgaag cgatcgacaa agtgtatggc 420 gaagtggcga ccaccagtag ccatgagctg gcgatgatcg tgcgtgaacc ggtcggcgtg 480 attgccgcca tcgtgccgtg gaacttcccg ctgttgctga cttgctggaa actcggcccg 540 gcgctggcgg cgggaaacag cgtgattcta aaaccgtctg aaaaatcacc gctcagtgcg 600 attcgtctcg cggggctggc gaaagaagca ggcttgccgg atggtgtgtt gaacgtggtg 660 acgggttttg gtcatgaagc cgggcaggcg ctgtcgcgtc ataacgatat cgacgccatt 720 gcctttaccg gttcaacccg taccgggaaa cagctgctga aagatgcggg cgacagcaac 780 atgaaacgcg tctggctgga agcgggcggc aaaagcgcca acatcgtttt cgctgactgc 840 ccggatttgc aacaggcggc aagcgccacc gcagcaggca ttttctacaa ccagggacag 900 gtgtgcatcg ccggaacgcg cctgttgctg gaagagagca tcgccgatga attcttagcc 960 ctgttaaaac agcaggcgca aaactggcag ccgggccatc cacttgatcc cgcaaccacc 1020 atgggcacct taatcgactg cgcccacgcc gactcggtcc atagctttat tcgggaaggc 1080 gaaagcaaag ggcaactgtt gttggatggc cgtaacgccg ggctggctgc cgccatcggc 1140 ccgaccatct ttgtggatgt ggacccgaat gcgtccttaa gtcgcgaaga gattttcggt 1200 ccggtgctgg tggtcacgcg tttcacatca gaagaacagg cgctacagct tgccaacgac 1260 agccagtacg gccttggcgc ggcggtatgg acgcgcgacc tctcccgcgc gcaccgcatg 1320 agccgacgcc tgaaagccgg ttccgtcttc gtcaataact acaacgacgg cgatatgacc 1380 gtgccgtttg gcggctataa gcagagcggc aacggtcgcg acaaatccct gcatgccctt 1440 gaaaaattca ctgaactgaa aaccatctgg ataagcctgg aggcctga 1488 <210> 14 <211> 495 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of E. coli aldehyde dehydrogenase AldH <400> 14 Met Asn Phe His His Leu Ala Tyr Trp Gln Asp Lys Ala Leu Ser Leu 1 5 10 15 Ala Ile Glu Asn Arg Leu Phe Ile Asn Gly Glu Tyr Thr Ala Ala Ala 20 25 30 Glu Asn Glu Thr Phe Glu Thr Val Asp Pro Val Thr Gln Ala Pro Leu 35 40 45 Ala Lys Ile Ala Arg Gly Lys Ser Val Asp Ile Asp Arg Ala Met Ser 50 55 60 Ala Ala Arg Gly Val Phe Glu Arg Gly Asp Trp Ser Leu Ser Ser Pro 65 70 75 80 Ala Lys Arg Lys Ala Val Leu Asn Lys Leu Ala Asp Leu Met Glu Ala 85 90 95 His Ala Glu Glu Leu Ala Leu Leu Glu Thr Leu Asp Thr Gly Lys Pro 100 105 110 Ile Arg His Ser Leu Arg Asp Asp Ile Pro Gly Ala Ala Arg Ala Ile 115 120 125 Arg Trp Tyr Ala Glu Ala Ile Asp Lys Val Tyr Gly Glu Val Ala Thr 130 135 140 Thr Ser Ser His Glu Leu Ala Met Ile Val Arg Glu Pro Val Gly Val 145 150 155 160 Ile Ala Ala Ile Val Pro Trp Asn Phe Pro Leu Leu Leu Thr Cys Trp 165 170 175 Lys Leu Gly Pro Ala Leu Ala Ala Gly Asn Ser Val Ile Leu Lys Pro 180 185 190 Ser Glu Lys Ser Pro Leu Ser Ala Ile Arg Leu Ala Gly Leu Ala Lys 195 200 205 Glu Ala Gly Leu Pro Asp Gly Val Leu Asn Val Val Thr Gly Phe Gly 210 215 220 His Glu Ala Gly Gln Ala Leu Ser Arg His Asn Asp Ile Asp Ala Ile 225 230 235 240 Ala Phe Thr Gly Ser Thr Arg Thr Gly Lys Gln Leu Leu Lys Asp Ala 245 250 255 Gly Asp Ser Asn Met Lys Arg Val Trp Leu Glu Ala Gly Gly Lys Ser 260 265 270 Ala Asn Ile Val Phe Ala Asp Cys Pro Asp Leu Gln Gln Ala Ala Ser 275 280 285 Ala Thr Ala Ala Gly Ile Phe Tyr Asn Gln Gly Gln Val Cys Ile Ala 290 295 300 Gly Thr Arg Leu Leu Leu Glu Glu Ser Ile Ala Asp Glu Phe Leu Ala 305 310 315 320 Leu Leu Lys Gln Gln Ala Gln Asn Trp Gln Pro Gly His Pro Leu Asp 325 330 335 Pro Ala Thr Thr Met Gly Thr Leu Ile Asp Cys Ala His Ala Asp Ser 340 345 350 Val His Ser Phe Ile Arg Glu Gly Glu Ser Lys Gly Gln Leu Leu Leu 355 360 365 Asp Gly Arg Asn Ala Gly Leu Ala Ala Ala Ile Gly Pro Thr Ile Phe 370 375 380 Val Asp Val Asp Pro Asn Ala Ser Leu Ser Arg Glu Glu Ile Phe Gly 385 390 395 400 Pro Val Leu Val Val Thr Arg Phe Thr Ser Glu Glu Gln Ala Leu Gln 405 410 415 Leu Ala Asn Asp Ser Gln Tyr Gly Leu Gly Ala Ala Val Trp Thr Arg 420 425 430 Asp Leu Ser Arg Ala His Arg Met Ser Arg Arg Leu Lys Ala Gly Ser 435 440 445 Val Phe Val Asn Asn Tyr Asn Asp Gly Asp Met Thr Val Pro Phe Gly 450 455 460 Gly Tyr Lys Gln Ser Gly Asn Gly Arg Asp Lys Ser Leu His Ala Leu 465 470 475 480 Glu Lys Phe Thr Glu Leu Lys Thr Ile Trp Ile Ser Leu Glu Ala 485 490 495 <210> 15 <211> 1164 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of yqhD gene of E. coli alcohol dehydrogenase <400> 15 atgaacaact ttaatctgca caccccaacc cgcattctgt ttggtaaagg cgcaatcgct 60 ggtttacgcg aacaaattcc tcacgatgct cgcgtattga ttacctacgg cggcggcagc 120 gtgaaaaaaa ccggcgttct cgatcaagtt ctggatgccc tgaaaggcat ggacgtgctg 180 gaatttggcg gtattgagcc aaacccggct tatgaaacgc tgatgaacgc cgtgaaactg 240 gttcgcgaac agaaagtgac tttcctgctg gcggttggcg gcggttctgt actggacggc 300 accaaattta tcgccgcagc ggctaactat ccggaaaata tcgatccgtg gcacattctg 360 caaacgggcg gtaaagagat taaaagcgcc atcccgatgg gctgtgtgct gacgctgcca 420 gcaaccggtt cagaatccaa cgcaggcgcg gtgatctccc gtaaaaccac aggcgacaag 480 caggcgttcc attctgccca tgttcagccg gtatttgccg tgctcgatcc ggtttatacc 540 tacaccctgc cgccgcgtca ggtggctaac ggcgtagtgg acgcctttgt acacaccgtg 600 gaacagtatg ttaccaaacc ggttgatgcc aaaattcagg accgtttcgc agaaggcatt 660 ttgctgacgc taatcgaaga tggtccgaaa gccctgaaag agccagaaaa ctacgatgtg 720 cgcgccaacg tcatgtgggc ggcgactcag gcgctgaacg gtttgattgg cgctggcgta 780 ccgcaggact gggcaacgca tatgctgggc cacgaactga ctgcgatgca cggtctggat 840 cacgcgcaaa cactggctat cgtcctgcct gcactgtgga atgaaaaacg cgataccaag 900 cgcgctaagc tgctgcaata tgctgaacgc gtctggaaca tcactgaagg ttccgatgat 960 gagcgtattg acgccgcgat tgccgcaacc cgcaatttct ttgagcaatt aggcgtgccg 1020 acccacctct ccgactacgg tctggacggc agctccatcc cggctttgct gaaaaaactg 1080 gaagagcacg gcatgaccca actgggcgaa aatcatgaca ttacgttgga tgtcagccgc 1140 cgtatatacg aagccgcccg ctaa 1164 <210> 16 <211> 387 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of E. coli alcohol dehydrogenase YqhD <400> 16 Met Asn Asn Phe Asn Leu His Thr Pro Thr Arg Ile Leu Phe Gly Lys 1 5 10 15 Gly Ala Ile Ala Gly Leu Arg Glu Gln Ile Pro His Asp Ala Arg Val 20 25 30 Leu Ile Thr Tyr Gly Gly Gly Ser Val Lys Lys Thr Gly Val Leu Asp 35 40 45 Gln Val Leu Asp Ala Leu Lys Gly Met Asp Val Leu Glu Phe Gly Gly 50 55 60 Ile Glu Pro Asn Pro Ala Tyr Glu Thr Leu Met Asn Ala Val Lys Leu 65 70 75 80 Val Arg Glu Gln Lys Val Thr Phe Leu Leu Ala Val Gly Gly Gly Ser 85 90 95 Val Leu Asp Gly Thr Lys Phe Ile Ala Ala Ala Ala Asn Tyr Pro Glu 100 105 110 Asn Ile Asp Pro Trp His Ile Leu Gln Thr Gly Gly Lys Glu Ile Lys 115 120 125 Ser Ala Ile Pro Met Gly Cys Val Leu Thr Leu Pro Ala Thr Gly Ser 130 135 140 Glu Ser Asn Ala Gly Ala Val Ile Ser Arg Lys Thr Thr Gly Asp Lys 145 150 155 160 Gln Ala Phe His Ser Ala His Val Gln Pro Val Phe Ala Val Leu Asp 165 170 175 Pro Val Tyr Thr Tyr Thr Leu Pro Pro Arg Gln Val Ala Asn Gly Val 180 185 190 Val Asp Ala Phe Val His Thr Val Glu Gln Tyr Val Thr Lys Pro Val 195 200 205 Asp Ala Lys Ile Gln Asp Arg Phe Ala Glu Gly Ile Leu Leu Thr Leu 210 215 220 Ile Glu Asp Gly Pro Lys Ala Leu Lys Glu Pro Glu Asn Tyr Asp Val 225 230 235 240 Arg Ala Asn Val Met Trp Ala Ala Thr Gln Ala Leu Asn Gly Leu Ile 245 250 255 Gly Ala Gly Val Pro Gln Asp Trp Ala Thr His Met Leu Gly His Glu 260 265 270 Leu Thr Ala Met His Gly Leu Asp His Ala Gln Thr Leu Ala Ile Val 275 280 285 Leu Pro Ala Leu Trp Asn Glu Lys Arg Asp Thr Lys Arg Ala Lys Leu 290 295 300 Leu Gln Tyr Ala Glu Arg Val Trp Asn Ile Thr Glu Gly Ser Asp Asp 305 310 315 320 Glu Arg Ile Asp Ala Ala Ile Ala Ala Thr Arg Asn Phe Phe Glu Gln 325 330 335 Leu Gly Val Pro Thr His Leu Ser Asp Tyr Gly Leu Asp Gly Ser Ser 340 345 350 Ile Pro Ala Leu Leu Lys Lys Leu Glu Glu His Gly Met Thr Gln Leu 355 360 365 Gly Glu Asn His Asp Ile Thr Leu Asp Val Ser Arg Arg Ile Tyr Glu 370 375 380 Ala Ala Arg 385 <210> 17 <211> 1164 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of dhaT gene of K. Pneumoniae alcohol dehydrogenase <400> 17 atgagctatc gtatgtttga ttatctggtg ccaaacgtta acttttttgg ccccaacgcc 60 atttccgtag tcggcgaacg ctgccagctg ctggggggga aaaaagccct gctggtcacc 120 gacaaaggcc tgcgggcaat taaagatggc gcggtggaca aaaccctgca ttatctgcgg 180 gaggccggga tcgaggtggc gatctttgac ggcgtcgagc cgaacccgaa agacaccaac 240 gtgcgcgacg gcctcgccgt gtttcgccgc gaacagtgcg acatcatcgt caccgtgggc 300 ggcggcagcc cgcacgattg cggcaaaggc atcggcatcg ccgccaccca tgagggcgat 360 ctgtaccagt atgccggaat cgagaccctg accaacccgc tgccgcctat cgtcgcggtc 420 aataccaccg ccggcaccgc cagcgaggtc acccgccact gcgtcctgac caacaccgaa 480 accaaagtga agtttgtgat cgtcagctgg cgcaacctgc cgtcggtctc tatcaacgat 540 ccactgctga tgatcggtaa accggccgcc ctgaccgcgg cgaccgggat ggatgccctg 600 acccacgccg tagaggccta tatctccaaa gacgctaacc cggtgacgga cgccgccgcc 660 atgcaggcga tccgcctcat cgcccgcaac ctgcgccagg ccgtggccct cggcagcaat 720 ctgcaggcgc gggaaaacat ggcctatgct tctctgctgg ccgggatggc tttcaataac 780 gccaacctcg gctacgtgca cgccatggcg caccagctgg gcggcctgta cgacatgccg 840 cacggcgtgg ccaacgctgt cctgctgccg catgtggcgc gctacaacct gatcgccaac 900 ccggagaaat tcgccgatat cgctgaactg atgggcgaaa atatcaccgg actgtccact 960 ctcgacgcgg cggaaaaagc catcgccgct atcacgcgtc tgtcgatgga tatcggtatt 1020 ccgcagcatc tgcgcgatct gggggtaaaa gaggccgact tcccctacat ggcggagatg 1080 gctctaaaag acggcaatgc gttctcgaac ccgcgtaaag gcaacgagca ggagattgcc 1140 gcgattttcc gccaggcatt ctga 1164 <210> 18 <211> 387 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of K. Pneumoniae alcohol dehydrogenase DhaT <400> 18 Met Ser Tyr Arg Met Phe Asp Tyr Leu Val Pro Asn Val Asn Phe Phe 1 5 10 15 Gly Pro Asn Ala Ile Ser Val Val Gly Glu Arg Cys Gln Leu Leu Gly 20 25 30 Gly Lys Lys Ala Leu Leu Val Thr Asp Lys Gly Leu Arg Ala Ile Lys 35 40 45 Asp Gly Ala Val Asp Lys Thr Leu His Tyr Leu Arg Glu Ala Gly Ile 50 55 60 Glu Val Ala Ile Phe Asp Gly Val Glu Pro Asn Pro Lys Asp Thr Asn 65 70 75 80 Val Arg Asp Gly Leu Ala Val Phe Arg Arg Glu Gln Cys Asp Ile Ile 85 90 95 Val Thr Val Gly Gly Gly Ser Pro His Asp Cys Gly Lys Gly Ile Gly 100 105 110 Ile Ala Ala Thr His Glu Gly Asp Leu Tyr Gln Tyr Ala Gly Ile Glu 115 120 125 Thr Leu Thr Asn Pro Leu Pro Pro Ile Val Ala Val Asn Thr Thr Ala 130 135 140 Gly Thr Ala Ser Glu Val Thr Arg His Cys Val Leu Thr Asn Thr Glu 145 150 155 160 Thr Lys Val Lys Phe Val Ile Val Ser Trp Arg Asn Leu Pro Ser Val 165 170 175 Ser Ile Asn Asp Pro Leu Leu Met Ile Gly Lys Pro Ala Ala Leu Thr 180 185 190 Ala Ala Thr Gly Met Asp Ala Leu Thr His Ala Val Glu Ala Tyr Ile 195 200 205 Ser Lys Asp Ala Asn Pro Val Thr Asp Ala Ala Ala Met Gln Ala Ile 210 215 220 Arg Leu Ile Ala Arg Asn Leu Arg Gln Ala Val Ala Leu Gly Ser Asn 225 230 235 240 Leu Gln Ala Arg Glu Asn Met Ala Tyr Ala Ser Leu Leu Ala Gly Met 245 250 255 Ala Phe Asn Asn Ala Asn Leu Gly Tyr Val His Ala Met Ala His Gln 260 265 270 Leu Gly Gly Leu Tyr Asp Met Pro His Gly Val Ala Asn Ala Val Leu 275 280 285 Leu Pro His Val Ala Arg Tyr Asn Leu Ile Ala Asn Pro Glu Lys Phe 290 295 300 Ala Asp Ile Ala Glu Leu Met Gly Glu Asn Ile Thr Gly Leu Ser Thr 305 310 315 320 Leu Asp Ala Ala Glu Lys Ala Ile Ala Ala Ile Thr Arg Leu Ser Met 325 330 335 Asp Ile Gly Ile Pro Gln His Leu Arg Asp Leu Gly Val Lys Glu Ala 340 345 350 Asp Phe Pro Tyr Met Ala Glu Met Ala Leu Lys Asp Gly Asn Ala Phe 355 360 365 Ser Asn Pro Arg Lys Gly Asn Glu Gln Glu Ile Ala Ala Ile Phe Arg 370 375 380 Gln Ala Phe 385 <210> 19 <211> 1243 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> araBAD promoter <400> 19 catcgattta ttatgacaac ttgacggcta catcattcac tttttcttca caaccggcac 60 ggaactcgct cgggctggcc ccggtgcatt ttttaaatac ccgcgagaaa tagagttgat 120 cgtcaaaacc aacattgcga ccgacggtgg cgataggcat ccgggtggtg ctcaaaagca 180 gcttcgcctg gctgatacgt tggtcctcgc gccagcttaa gacgctaatc cctaactgct 240 ggcggaaaag atgtgacaga cgcgacggcg acaagcaaac atgctgtgcg acgctggcga 300 tatcaaaatt gctgtctgcc aggtgatcgc tgatgtactg acaagcctcg cgtacccgat 360 tatccatcgg tggatggagc gactcgttaa tcgcttccat gcgccgcagt aacaattgct 420 caagcagatt tatcgccagc agctccgaat agcgcccttc cccttgcccg gcgttaatga 480 tttgcccaaa caggtcgctg aaatgcggct ggtgcgcttc atccgggcga aagaaccccg 540 tattggcaaa tattgacggc cagttaagcc attcatgcca gtaggcgcgc ggacgaaagt 600 aaacccactg gtgataccat tcgcgagcct ccggatgacg accgtagtga tgaatctctc 660 ctggcgggaa cagcaaaata tcacccggtc ggcaaacaaa ttctcgtccc tgatttttca 720 ccaccccctg accgcgaatg gtgagattga gaatataacc tttcattccc agcggtcggt 780 cgataaaaaa atcgagataa ccgttggcct caatcggcgt taaacccgcc accagatggg 840 cattaaacga gtatcccggc agcaggggat cattttgcgc ttcagccata cttttcatac 900 tcccgccatt cagagaagaa accaattgtc catattgcat cagacattgc cgtcactgcg 960 tcttttactg gctcttctcg ctaaccaaac cggtaacccc gcttattaaa agcattctgt 1020 aacaaagcgg gaccaaagcc atgacaaaaa cgcgtaacaa aagtgtctat aatcacggca 1080 gaaaagtcca cattgattat ttgcacggcg tcacactttg ctatgccata gcatttttat 1140 ccataagatt agcggatcct acctgacgct ttttatcgca actctctact gtttctccat 1200 acccgttttt ttgggaattc gagctctaag gaggttataa aaa 1243 <210> 20 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KdhaB_F primer <400> 20 atatcatgaa aagatcaaaa cgattt 26 <210> 21 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KdhaB_R primer <400> 21 aaagaattcc gcgagcgccc gtttaattc 29 <210> 22 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gdrB_F primer <400> 22 tttgaattct aacgagggga ccgtcatgtc 30 <210> 23 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gdrB_R primer <400> 23 atagtcgact cagtttctct cacttaacgg 30 <210> 24 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aldH-NdeI primer <400> 24 tttcatatga attttcatca tctggcttac 30 <210> 25 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aldH-BglII primer <400> 25 tttagatctt tcggtcattt caggcctcca 30 <210> 26 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> glpK_KO_F primer <400> 26 atgactgaaa aaaaatatat cgttgcgctc gaccagggca ccaccgtgta ggctggagct 60 gcttc 65 <210> 27 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> glpK_KO_R primer <400> 27 ttattcgtcg tgttcttccc acgccatcgc gcgtttaacc gctttcatat gaatatcctc 60 cttag 65 <210> 28 <211> 67 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AraBAD_F primer <400> 28 gcggccgcta gcataacccc ttggggcctc taaacgggtc ttggatttat tatgacaact 60 tgacggc 67 <210> 29 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AraBAD_R primer <400> 29 catatgtata tctccttaga gctcgaattc cc 32 <210> 30 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> glpK_F primer <400> 30 catatgatga ctgaaaaaaa atatatcgtt gcgctc 36 <210> 31 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> glpK_R primer <400> 31 ctcgagttat tcgtcgtgtt cttcccacg 29

Claims

염색체 상의 글리세롤 카이네이즈 유전자(glpK)가 불활성화된 재조합 미생물.
제1항에 있어서,
1) 글리세롤 카이네이즈 유전자(glpK)를 포함하는 발현 카세트를 염색체 외적으로 추가로 포함하거나;
2) 3-히드록시프로피온산(3-HP) 생산 관련 유전자, 1,3-프로판디올(1,3-PDO) 생산 관련 유전자, 또는 이들의 조합을 추가로 포함하거나; 또는
상기 1)과 2)를 모두를 추가로 포함하는,
재조합 미생물.
제1항에 있어서, 상기 미생물은 에스케리키아 (Escherichia) 속, 엔테로박테리아 (Enterobacteria) 속, 브레비박테리움(Brevibacterium) 속, 코리네박테리움 (Corynebacterium) 속, 클로스트리디움 (Clostridium) 속, 크렙시엘라 (Klebsiella) 속, 시트로박터(Citrobacter) 속, 스트렙토마이세스 (Streptomyces) 속, 바실러스 (Bacillus) 속, 락토바실러스(Lactobacillus) 속, 슈도모나스 (Pseudomonas) 속, 사카로마이세스 (Saccharomyces)속, 및 아스퍼질러스(Aspergillus) 속에 속하는 미생물로 이루어진 군에서 선택된 것인, 재조합 미생물.
제3항에 있어서, 상기 미생물은 대장균인, 재조합 미생물.
제1항에 있어서, 상기 염색체 상의 글리세롤 카이네이즈 유전자(glpK)의 불활성화는 상기 glpK 유전자의 전부 또는 일부가 결실되거나, 전부 또는 일부가 상이한 염기서열로 치환되거나, 상기 glpK 유전자에 추가적인 염기서열이 삽입되어, 글리세롤 카이네이즈가 암호화되지 못하는 것인, 재조합 미생물.
제2항에 있어서, 상기 발현카세트에 포함된 글리세롤 카이네이즈 유전자(glpK)는 에스케리키아 (Escherichia) 속, 엔테로박테리아 (Enterobacteria) 속, 브레비박테리움(Brevibacterium) 속, 코리네박테리움 (Corynebacterium) 속, 클로스트리디움 (Clostridium) 속, 크렙시엘라 (Klebsiella) 속, 시트로박터(Citrobacter) 속, 스트렙토마이세스 (Streptomyces) 속, 바실러스 (Bacillus) 속, 락토바실러스(Lactobacillus) 속, 슈도모나스 (Pseudomonas) 속, 사카로마이세스 (Saccharomyces)속, 및 아스퍼질러스(Aspergillus) 속에 속하는 미생물로 이루어진 군에서 선택된 미생물 유래의 글리세롤 카이네이즈를 암호화하는 유전자인, 재조합 미생물.
제6항에 있어서, 상기 발현카세트에 포함된 글리세롤 카이네이즈 유전자(glpK)는 대장균(E. coli) 유래의 글리세롤 카이네이즈를 암호화하는 유전자인, 재조합 미생물.
제2항에 있어서, 상기 발현 카세트는 아라비노스 유도성 프로모터를 포함하는 것인, 재조합 미생물.
제2항에 있어서, 상기 발현 카세트는 플라즈미드, 코즈미드, 박테리오파아지, 또는 바이러스 벡터 형태의 것인, 재조합 미생물.
제2항에 있어서,
상기 3-HP 생산 관련 유전자는 글리세롤 탈수효소(glycerol dehydratase) 또는 디올 탈수효소(diol dehydratase)를 암호화하는 유전자, 글리세롤 탈수효소 재활성화 인자를 암호화하는 유전자, 및 알데히드 탈수소효소(aldehyde dehydrogenase)를 암호화하는 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상이고,
상기 1,3-PDO 생산 관련 유전자는 글리세롤 탈수효소(glycerol dehydratase) 또는 디올 탈수효소(diol dehydratase)를 암호화하는 유전자, 글리세롤 탈수효소 재활성화 인자를 암호화하는 유전자, 알코올 탈수소화효소(alcohol dehydrogenase)를 암호화하는 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인,
재조합 미생물.
제10항에 있어서,
상기 글리세롤 탈수효소는 클렙시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumoniae), 시트로박터 프레운디(Citrobacter freundii), 클로스트리디움 파스튜리아늄(Clostridium pasteurianum ), 살모넬라 타이티무리움(Salmonella typhimurium), 클렙시엘라 옥시토카(Klebsiella oxytoca), 또는 클로스트리디움 부티리쿰(Clostridium butyricum)에서 유래하는 것이고,
상기 글리세롤 탈수효소 재활성화 인자는 클렙시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumoniae), 시트로박터 프레운디(Citrobacter freundii), 클로스트리디움 파스튜리아늄(Clostridium pasteurianum ), 살모넬라 타이티무리움(Salmonella typhimurium), 클렙시엘라 옥시토카(Klebsiella oxytoca), 또는 클로스트리디움 부티리쿰(Clostridium butyricum)에서 유래 유래하는 것이며,
상기 알데히드 탈수소효소는 호모 사피엔스(Homo sapiens), 효모(S. cerevisiae), 또는 대장균(E. coli)에서 유래하는 것이고,
상기 알코올 탈수소화효소는 1,3-프로판디올 디하이드로지나제(1,3-propanediol dehydrogenase, 1,3-프로판디올 옥시도리덕타아제, 글리콜알데히드 리덕타제(glycolaldehyde reductase), 1,2-프로판디올 옥시도리덕타제(1,2-propanediol oxidoreductase), 및 에탄올 데히드로지나제(ethanol dehydrogenase)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인,
재조합 미생물.
제11항에 있어서,
상기 글리세롤 탈수효소는 클렙시엘라 뉴모니아 유래의 DhaB1, DhaB2 및 DhaB3, 또는 클로스트리디움 부티리쿰 유래의 DhaB1이고,
상기 글리세롤 탈수효소 재활성화 인자는 클렙시엘라 뉴모니아 유래의 GdrA 및 GdrB, 또는 클로스트리디움 부티리쿰 유래의 DhaB2이고,
상기 알데히드 탈수소효소는 AldH2, Ald4, AldA, AldB, 및 AldH로 이루어진 군에서 선택된 것이고,
상기 알코올 탈수소화효소는 클렙시엘라 뉴모니애 유래의 DhaT 또는 대장균(E. coli) 유래의 YqhD인,
재조합 미생물.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 재조합 미생물을 포함하는 글리세롤 탈수 반응 산물의 제조용 조성물.
제13항에 있어서, 상기 글리세롤 탈수 반응 산물은 3-히드록시프로피온산(3-HP), 1,3-프로판디올(1,3-PDO), 또는 이들의 조합인, 글리세롤 탈수 반응 산물의 제조용 조성물.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 재조합 미생물을 배양하는 단계를 포함하는 글리세롤 탈수 반응 산물의 제조 방법.
제15항에 있어서, 상기 글리세롤 탈수 반응 산물은 3-히드록시프로피온산(3-HP), 1,3-프로판디올(1,3-PDO), 또는 이들의 조합인, 글리세롤 탈수 반응 산물의 제조 방법.
제15항에 있어서, 상기 배양하는 단계는 글리세롤을 유일한 탄소원으로 포함하는 배지를 사용하여 수행되는 것인, 글리세롤 탈수 반응 산물의 제조 방법.
제17항에 있어서, 상기 배지 내의 글리세롤의 함량은 5 내지 80g/L인, 글리세롤 탈수 반응 산물의 제조 방법.
미생물의 염색체 상의 글리세롤 카이네이즈 유전자(glpK)의 전부 또는 일부를 결실 또는 상이한 염기서열로 치환 또는 추가적인 염기서열을 삽입하여 염색체 상의 glpK 유전자를 불활성화시키는 단계를 포함하는, 글리세롤 탈수 반응 산물을 고농도로 생산하는 재조합 미생물의 제조 방법.
제19항에 있어서, 상기 글리세롤 탈수 반응 산물은 3-히드록시프로피온산(3-HP), 1,3-프로판디올(1,3-PDO), 또는 이들의 조합인, 글리세롤 탈수 반응 산물을 고농도로 생산하는 재조합 미생물의 제조 방법.
제19항에 있어서, 상기 불활성화시키는 단계 이후에,
i) 글리세롤 카이네이즈 유전자(glpK)를 포함하는 발현 카세트를 염색체 외적으로 도입하는 단계;
ii) 3-히드록시프로피온산(3-HP), 1,3-프로판디올(1,3-PDO) 생산 관련 유전자, 또는 이들의 조합을 염색체 내에 도입하는 단계; 또는
상기 단계 i)과 ii) 모두
를 추가로 포함하는, 글리세롤 탈수 반응 산물을 고농도로 생산하는 재조합 미생물의 제조 방법.