KR20150011111A

KR20150011111A - 대장균 돌연변이체 및 이를 사용한 유기산 합성방법

Info

Publication number: KR20150011111A
Application number: KR1020130085935A
Authority: KR
Inventors: 이진숙; 강진호; 이선주; 최인석
Original assignee: 삼성종합화학주식회사
Priority date: 2013-07-22
Filing date: 2013-07-22
Publication date: 2015-01-30

Abstract

본 발명은 유기산 내성 대장균 돌연변이체 및 이를 사용한 유기산 합성방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는, 서열목록 1에 기재된 yqhD 유전자, 서열목록 2에 기재된 ackA 유전자 및 서열목록 3에 기재된 pta 유전자 중에서 어느 하나 이상의 유전자가 불활성화되고 유기산 합성능을 갖는 대장균 돌연변이체 및 이를 사용한 유기산 합성 방법에 관한 것으로, 본 발명에 따르면 돌연변이체를 사용하여 유기산을 고농도로 합성할 수 있다.

Description

대장균 돌연변이체 및 이를 사용한 유기산 합성방법{Mutant of Escherichia coli and the preparation method of organic acid using the same}

본 발명은 대장균 돌연변이체 및 이를 사용한 유기산 합성방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는, 서열목록 1에 기재된 yqhD 유전자, 서열목록 2에 기재된 ackA 유전자 및 서열목록 3에 기재된 pta 유전자 중에서 어느 하나 이상의 유전자에 변이를 포함하고 유기산 합성능을 갖는 대장균 돌연변이체 및 이를 사용한 유기산 합성 방법에 관한 것이다.

화석연료의 사용 후 발생하는 탄소가스에 따른 지구온난화 및 환경오염에 대한 문제들, 그리고 자원 고갈 이후의 대책들은 미래 인류 생존을 위해 꼭 해결되어야 할 부분들이다. 이에 따라 석유를 원료로 하여 화학공정을 통해 생산하던 화학물질들을 생물학적 공정을 통하여 대체하려는 연구들이 선진국들을 중심으로 급속도로 늘고 있으며, 국제유가의 변화와 세계 환경 위기 문제로 인하여 기존의 석유화학 기반 물질이 아닌 바이오 기반 물질들이 주목을 받고 있다.

다양한 화학물질들이 현재 바이오 기반 산업을 통하여 생산되고 있으며 정밀화학제품에서부터 에탄올과 같은 연료에 이르기까지 다양하다.

2004 미국 에너지 부 리포트, "바이오매스(biomass)로부터 최고의 가치가 추가된 화합물(Top value added chemicals from biomass)"로 명명된, 는 재생 가능한 공급 재료들로부터 생산될 수 있는 12개 빌딩 블록 화합물들(building block chemicals)을 확인하였다. 12개 슈거-베이스의 빌딩 블록들은 1,4-이중산들 (1,4-diacids)(숙신산의(succinic), 푸마르산의(fumaric) 및 말산의(malic)), 2,5-퓨란디카르복실산(2,5-furandicarboxylic acid), 3-하이드록시프로피온산(3-hydroxy propionic acid), 아스파르트산(aspartic acid), 글루칸산(glucaric acid), 글루탐산(glutamic acid), 이타콘산(itaconic acid), 레불린산(levulinic acid), 3-하이드록시부티로락톤(3-hydroxybutyrolactone), 글리세롤(glycerol), 소르비톨(sorbitol) 및 자일리톨(xylitol)/ 아라비니톨(arabinitol)이다.

빌딩 블록 화합물들(building block chemicals)은 새로운 과(families)의 유용한 분자들로 변환될 가능성을 가지고 있는 다중 기능성 그룹들을 가진 분자들이다. 이들 12개의 빌딩 블록들은 후속적으로 많은 수의 높은 가치의 바이오-베이스의 화합물들 또는 재료들로 전환될 수 있다.

이들 화합물질들은 다양한 탄소원들로부터 합성되는데, 대표적인 탄소원으로는 포도당, 젖당, 글리세롤, 갈락토오스, 말토오스, 자일로스 등이 존재한다. 그 중 글리세롤은 유기화학에서 가장 다양한 용도로 이용되는 물질 중의 하나로 매일 이용되는 다양한 생활 필수품용 화합물 합성에 일차 재료로 활용되고 있다. 최근 바이오디젤의 대량 생산으로 인하여 부산물인 글리세롤의 생산이 급증하였고, 바이오디젤 10억 갤런당 77억 파운드의 글리세롤이 생산되고 있다. 앞으로 바이오디젤의 시장 수요가 증가하면서 부산물인 글리세롤의 생산량도 급격하게 증가할 것으로 예측된다. 글리세롤은 글루코오스와 마찬가지로 미생물의 에너지원으로 쓰이는데, 이를 사용하여 다양한 물질을 생산해 낼 수 있다.

글리세롤을 활용하여 생산할 수 있는 다양한 플랫폼 화합물 중 3-하이드록시프로피온산 (3-hydroxypropionic acid: 3-HP)은 젖산, 숙신산과 더불어 바이오매스 유래의 3대 플랫폼 화학원료로 주목을 받고 있는 물질로서, 글리세롤과 같은 재생 가능한 자원으로부터 생산된다.

이 중 3-하이드록시프로피온산(3-hydroxypropionic acid, 3-HP)는 아크릴산으로 전환되어 친환경 코팅제 및 흡착제 관련 제품으로 이용될 수 있어 상용화가 이루어질 경우 그 활용도가 높다. 젖산은 생분해성 필름, 섬유, 의료용으로 사용되는 폴리젖산(polylactic acid, PLA) 제조에 사용되며, 숙신산 역시 1,4-부타네디올(1,4-butanediol), N-메틸-2-파이롤리돈(N-methyl-2-Pyrrolidone, NMP), 및 바이오 나일론의 제조에 사용될 수 있어 그 활용도가 높다.

이러한 유기산을 생산하는 방법에는 글루코오스(포도당)을 이용한 방법과 글리세롤을 이용하는 방법이 대표적이라 할 수 있다. 유채 및 콩 등을 이용한 바이오디젤의 개발로 그 부산물인 글리세롤 생산도 증가하였으며, 세계적으로 80억 파운드 이상의 글리세롤이 생산되고 있다. 그 가격은 kg당 30 ~ 40 센트이며 이는 kg당 80센트인 글루코오스보다 저렴하여 탄소원으로 글리세롤을 사용하는 것이 원가 측면에서 유리하다.

그러나, 미생물 특히, 산업적으로 유용한 대장균을 이용하여 유기산을 생산하는 경우 대장균이 산성에 대한 내성이 약하여, 생성된 유기산이 세포에 대해 독성을 나타내므로 고농도 발효가 어려운 문제가 있다.

이를 해결하기 위하여 미국공개특허 제2010-0210017호에서는 유기산에 대한 내성을 증가시키기 위하여 chorismate super-pathway에 변형을 가하는 기술을 개시하여, 유기산 내성에 관한 것을 주목적으로 하여 게노믹 라이브러리(genomic library)를 구축 및 삽입하여 내성에 영향을 미치는 유전자를 찾고자 하였다. 그러나 이 방법은 실제 향상된 유기산 내성도가 유기산의 생산성에 어떻게 영향을 미치는지 확인이 필요하며, 실제로 내성도는 향상되었으나 유기산 생산성은 오히려 저하되거나 큰 차이를 보이지 않는 경우가 많다. 유기산 생산성 확인을 위하여 생산 유전자를 지닌 플라스미드(plasmid)가 균주에 삽입될 경우, 내성유전자를 포함한 플라스미드와의 상호작용으로 인하여, 내성유전자의 기능이 제대로 작용하지 않을 가능성이 있다.

또한, 미국공개특허 제2010-0151505호에는 호모세린 석시닐전이효소(homoserine o-succinyltransferase) 유전자 (MetA)를 변이시켜 내산성을 증가시키고자 하였다. 그러나 이는 타겟 유전자 하나에 해당되는 것으로서 내산성이 상기 유전자 단독이 아닌 다른 유전자와의 상호 작용을 요하거나, 다른 유전자의 영향이 더 클 경우 이 부분이 간과될 수 있다.

또한, 대장균이 탄소원으로 글리세롤을 이용하는 경우 그 대사과정에서 아세트산, 젖산, 에탄올을 생산하게 되며, 두 효소를 이용하여 3-하이드록시프로피온산을 생산할 때에도 1,3-프로판디올을 함께 생산하게 되므로 이로 인하여 3-하이드록시프로피온산의 생산수율이 떨어지게 되는 문제가 있다(도 1 참조).

미국공개특허 2010-0210017 미국공개특허 2010-0151505

Annual Review of Microbiology, 23: 487-514 (1969)

상기와 같은 문제점을 해결하기 위한 본 발명은 유기산 합성 효율이 높은 균주를 제공하는 데 목적이 있다. 본 발명의 또 다른 목적은 대장균 돌연변이체를 사용하여 유기산을 고농도로 합성할 수 있는 유기산 합성 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은, 서열목록 1에 기재된 yqhD 유전자, 서열목록 2에 기재된 ackA 유전자 및 서열목록 3에 기재된 pta 유전자 중에서 어느 하나 이상의 유전자에 변이를 포함하고 유기산 합성능을 갖는 대장균 돌연변이체를 제공한다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명의 대장균 돌연변이체는 자외선 조사에 의한 돌연변이 과정을 추가로 거치고, 서열목록 4에 기재된 16s 리보솜 염기서열을 갖는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명의 대장균 돌연변이체는 기탁번호 KCCM11421P인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명의 대장균 돌연변이체는 3-하이드록시프로피온산, 숙신산 및 락트산 중에서 선택된 하나 이상의 유기산 합성능을 갖는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명의 대장균 돌연변이체는 3-하이드록시프로피온산, 숙신산 및 락트산 중에서 선택된 하나 이상의 유기산에 내성을 갖는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명의 대장균 돌연변이체는 3-하이드록시프로피온산 5g/l 이상 또는 젖산 15g/l 이상의 농도에서 야생형 또는 모균주에 비하여 세포 생존능이 높은 것을 특징으로 한다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명의 대장균 돌연변이체는 글리세롤 데히드라타제 폴리펩타이드 또는 디올 데히드라타제 폴리펩타이드를 발현하는 핵산분자를 추가로 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 글리세롤 데히드라타제 폴리펩타이드 또는 디올 데히드라타제 폴리펩타이드는 서열목록 5 내지 서열목록 7로 표시되는 폴리펩타이드 또는 서열목록 11 내지 서열목록 13으로 표시되는 폴리펩타이드인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명의 대장균 돌연변이체는 글리세롤 데히드라타제 재활성화 인자 폴리펩타이드 또는 디올 데히드라타제 재활성화 인자 폴리펩타이드를 발현하는 핵산분자를 추가로 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 글리세롤 데히드라타제 재활성화 인자 폴리펩타이드 또는 디올 데히드라타제 재활성화 인자 폴리펩타이드는 서열목록 17 및 18로 표시되는 폴리펩타이드 또는 서열목록 21 및 22로 표시되는 폴리펩타이드인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명의 대장균 돌연변이체는 알데히드 데히드로게나제 폴리펩타이드를 발현하는 핵산분자를 추가로 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 알데히드 데히드로게나제 폴리펩타이드는 서열목록 25로 표시되는 폴리펩타이드 또는 서열목록 27로 표시되는 폴리펩타이드인 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따르면, 상술한 대장균 돌연변이체를 배양하는 단계를 포함하는 유기산 합성방법을 제공한다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명의 유기산 합성 방법은 3-하이드록시프로피온산, 숙신산 및 락트산 중에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 대장균 돌연변이체를 통하여 유기산을 고농도로 합성할 수 있다. 보다 구체적으로는, 3-하이드록시프로피온산, 숙신산 및 락트산과 같은 유기산을 효율적으로 고농도로 생산할 수 있다.

도 1은 글리세롤을 이용한 3-하이드록시프로피온산(3-HP) 생산경로를 도식화하여 나타낸 그림이다.
도 2는 발명에 따른 돌연변이체(yghD 결실 균주)를 제작하는 과정이다.
도 3은 본 발명에 따른 돌연변이체(yghD, ackA-pta 결실 균주)를 제작하는 과정이다.
도 4는 3-HP 생산확인을 위해 이용된 벡터(pET-IC)의 모식도이다.
도 5는 본 발명에 따른 돌연변이체(2R)의 세포 성장을 대조군과 대비한 결과이다.
도 6은 본 발명에 따른 돌연변이체(2R)를 사용한 3-HP 합성양을 대조군과 대비한 결과이다.
도 7은 본 발명에 따른 돌연변이체(2R)를 사용한 1,3-프로판디올(1,3-PDO) 합성양을 대조군과 대비한 결과이다.
도 8은 본 발명에 따른 돌연변이체(2R)를 사용한 아세트산 합성량을 대조군과 대비한 결과이다.
도 9는 본 발명에 따른 돌연변이체(자외선 돌연변이)의 개발과정을 간략하게 나타낸 그림이다.
도 10은 본 발명에 따른 돌연변이체(3R)의 3-HP 및 락틱산(lactic acid)에 대산 내성도를 측정한 결과이다.
도 11은 본 발명에 따른 돌연변이체(3R)의 세포 성장을 대조군과 대비한 결과이다.
도 12는 본 발명에 따른 돌연변이체(3R)를 사용한 3-HP 합성양을 대조군과 대비한 결과이다.

본 명세서에 사용된 용어를 정의한다.

본 명세서에서 사용되는 '폴리펩타이드'는 일련의 잔기, 인접한 아미노산들의 아미노기와 카르복실기 사이에서 전형적인 펩타이드 결합에 의해 서로 연결되어 있는 L-아미노산들을 전형적으로 지칭하도록 사용되고, 용어 '올리고펩타이드', '폴리펩타이드', '펩타이드' 및 '단백질'은 상호 교차 사용될 수도 있다.

본 발명은 상기 기재된 특정의 아미노산 서열(폴리펩타이드)에 제한되지 않고, 해당 아미노산 서열에 대하여 실질적인 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은 본 발명의 아미노산 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 사용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 60%의 상동성, 보다 바람직하게는 최소 80%의 상동성, 가장 바람직하게는 최소 90%의 상동성을 나타내는 아미노산 서열을 의미한다.

예를 들어, 상기 폴리펩타이드는 기재된 특정의 아미노산 서열과 약 60% 이상, 61% 이상, 62% 이상, 63% 이상, 64% 이상, 65% 이상, 66% 이상, 67% 이상, 68% 이상, 69% 이상, 약 70% 이상, 71% 이상, 72% 이상, 73% 이상, 74% 이상, 75% 이상, 76% 이상, 77% 이상, 78% 이상, 79% 이상, 80% 이상, 81% 이상, 82% 이상, 83% 이상, 84% 이상, 85% 이상, 86% 이상, 87% 이상, 88% 이상, 89% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 99.1% 이상, 99.2% 이상, 99.3% 이상, 99.4% 이상, 99.5% 이상, 99.6% 이상, 99.7% 이상, 99.8% 이상, 또는 99.9% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가지며 글리세롤 대사에 관련하는 폴리펩타이드를 포함한다. 일반적으로, 동일성 % 는 높을수록 바람직하다.

또한 상기 동일성을 가지는 폴리펩타이드는 기재된 특정 아미노산 서열의 폴리펩타이드에서 1 내지 100, 1 내지 90, 1 내지 80, 1 내지 70, 1 내지 60, 1 내지 50, 1 내지 40, 1 내지 39, 1 내지 38, 1 내지 37, 1 내지 36, 1 내지 35, 1 내지 34, 1 내지 33, 1 내지 32, 1 내지 31, 1 내지 30, 1 내지 29, 1 내지 28, 1 내지 27, 1 내지 26, 1 내지 25, 1 내지 24, 1 내지 23, 1 내지 22, 1 내지 21, 1 내지 20, 1 내지 19, 1 내지 18, 1 내지 17, 1 내지 16, 1 내지 15, 1 내지 14, 1 내지 13, 1 내지 12, 1 내지 11, 1 내지 10, 1 내지 9, 1 내지 8, 1 내지 7, 1 내지 6, 1 내지 5, 1 내지 4, 1 내지 3, 1 내지 2, 또는 1 개의 아미노산 잔기가 소실, 치환, 삽입, 및/또는 첨가된 아미노산 서열을 포함하면서 글리세롤 대사와 관련되는 폴리펩타이드를 포함한다. 일반적으로, 소실, 치환, 삽입, 및/또는 첨가의 수는 적을수록 바람직하다.

본 명세서에 사용되는 '핵산분자' 또는 '폴리뉴클레오타이드'는 DNA(gDNA 및 cDNA) 그리고 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 가지고, 핵산분자에서 기본 구성 단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드 뿐만 아니라, 당 또는 염기부위가 변형된 유사체(analogues)도 포함하며, '뉴클레오티드 서열', '폴리뉴클레오티드' 또는 '핵산'은 상호 교차 사용될 수 있고, 이중 가닥 DNA, 단일 가닥 DNA 또는 상기 DNA들의 전사 산물(예를 들어, RNA 분자) 중 어느 하나를 의미하는 것으로 이해된다.

본 발명은 상기 기재된 특정의 아미노산 서열(폴리펩타이드)을 암호화하는 핵산분자에 제한되지 않고, 상기에서 서술한 것처럼 특정 아미노산 서열에 대하여 실질적인 동일성을 나타내는 아미노산 서열 또는 그에 상응하는 기능을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산분자를 포함하는 것으로 해석된다.

상기의 실질적인 동일성은 본 발명의 아미노산 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 사용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 60%의 상동성, 보다 바람직하게는 최소 80%의 상동성, 가장 바람직하게는 최소 90%의 상동성을 나타내는 아미노산 서열을 의미한다.

상기 상응하는 기능을 가진 폴리펩타이드는 예를 들어, 하나 이상의 아미노산이 소실, 치환, 삽입, 및/또는 첨가되는 아미노산 서열의 폴리펩타이드를 포함한다. 그러한 폴리펩타이드는 상기 상술한 것처럼 1 개 이상의 아미노산 잔기가 소실, 치환, 삽입, 및/또는 첨가된 아미노산 서열로 이루어지며 3-하이드록시프로피온산 합성 관련되는 폴리펩타이드를 포함하며, 아미노산 잔기의 소실,치환,삽입,및/또는 첨가의 수가 적은 것이 바람직하다. 또한, 상기 폴리펩타이드는 상기 상술한 것처럼 기재된 특정의 아미노산 서열과 약 60% 이상의 동일성을 갖는 아미노산서열을 가지며 글리세롤 대사에 관련하는 폴리펩타이드를 포함하며, 동일성이 높을수록 바람직하다.

본 명세서에서 사용되는 용어 '상보적' 또는 '상보성'은 퓨린 및 피리미딘 뉴클레오티드가 수소 결합을 통해 결합하여 더블 스트랜드 핵산분자를 형성하는 능력을 의미하며, 부분적으로 상보적인 경우도 포함한다. 하기 염기쌍이 상보성과관련된다: 구아닌 및 시토신; 아데닌 및 티민; 및 아데닌 및 우라실. '상보적'은 상기 언급된 관계가 전장의 상기 분자에 걸쳐 2개의 싱글-스트랜드 핵산분자를 포 함하는 모든 염기쌍에 실질적으로 적용된다. '부분적으로 상보적'은 2개의 싱글-스트랜드 핵산분자 중 하나의 길이 짧기 때문에 그 분자들 중 하나의 일부가 싱글스트랜드로 남아있는 것 관계를 의미한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 '혼성화'는 싱글 스트랜드 핵산분자가 뉴클레오티드 염기 쌍을 통해 상보적인 스트랜드와 결합하는 과정을 언급한다. 따라서, 본 명세서에서 '서열번호 제1서열과 엄격한 조건에서 혼성화 되는 염기 서열을 포함하는 핵산분자"는 서열번호 제1서열에 기재된 염기 서열의 전부 또는 일부를 사용하여 콜로니 혼성화 기술, 플라크 혼성화 기술, 서던 혼성화 기술 등에 의해 수득된, DNA 와 같은 핵산분자를 말한다. 혼성화 방법은 당업자에게 알려진 다양한 방법이 사용가능하며, 예를 들어, Wood W. I. 등(Wood W. I. 등, Proc. Natl. Acad. Sci., vol.82, pp.1585-1588, 1985.)에 기술된 방법일 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어 '엄격'은 혼성화 조건을 언급한다. 고도로 엄격한 조건은 비상동성인 염기 쌍에 바람직하지 못하다. 낮은 엄격성은 반대 작용을 갖고 있다. 엄격성은 예를 들면, 온도, 염 농도에 의해 변경될 수 있다. 본원에서 사용된 용어 '엄격한 조건'은 낮은 엄격한 조건, 중간 엄격한 조건, 또는 높은 엄격한 조건 중 임의일 수 있다. '낮은 엄격한 조건'은, 예를 들어, 32℃ 에서 5 x SSC, 5 x Denhardt's 용액, 0.5% Sodium Dodecyl Sulfate(SDS), 50% 포름아미드(formamide)이다. '중간 엄격한 조건'은 예를 들어, 42℃ 에서 5 x SSC, 5 x Denhardt's 용액, 0.5% SDS, 50% 포름아미드이다. '높은 엄격한 조건'은 예를 들어, 50℃ 에서 5 x SSC, 5 x Denhardt's 용액, 0.5% SDS, 50% 포름아미드이다. 상기 조건 하에, 더 높은 상동성을 가진 DNA와 같은 폴리뉴클레오티드가 더 높은 온도에서 효율적으로 수득될 것으로 예상되며, 그럼에도 불구하고, 다수의 요소가 온도, 프로브 농도, 프로브 길이, 이온 세기, 시간, 염 농도 및 기타를 포함하여 혼성화 엄격성에 관여하고, 당업자는 이러한 요소를 적절하게 선택하여, 유사한 엄격성을 실현시킬 수 있다. 시판의 키트가 혼성화에 사용되는 경우, 예를 들어, Alkphos Direct Labeling Reagents (Amersham Pharmacia, 영국)가 사용될 수 있다. 이 경우, 첨부된 프로토콜에 따르면, 표지된 프로브로 밤새 인큐베이션시킨 후, 55℃에서 0.1% (w/v) SDS 를 함유하는 1 차 세정 완충액으로 막을 세정하여, DNA 와 같은 혼성화 된 핵산분자를 검출한다.

한편, 혼성화될 수 있는 기타 핵산분자는 디폴트 변수를 사용하는 FASTA 및 BLAST 와 같은 상동성 연구 소프트웨어에 의해 계산된 바와 같이, 기재된 특정 아미노산 서열을 암호화하는 핵산분자에 약 60% 이상, 61% 이상, 62% 이상, 63% 이상, 64% 이상, 65% 이상, 66% 이상, 67% 이상, 68% 이상, 69% 이상, 약 70% 이상, 71% 이상, 72% 이상, 73% 이상, 74% 이상, 75% 이상, 76% 이상, 77% 이상, 78% 이상, 79% 이상, 80% 이상, 81% 이상, 82% 이상, 83% 이상, 84% 이상, 85% 이상, 86% 이상, 87% 이상, 88% 이상, 89% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 99.1% 이상, 99.2% 이상, 99.3% 이상, 99.4% 이상, 99.5% 이상, 99.6% 이상, 99.7% 이상, 99.8% 이상 또는 99.9% 이상의 동일성을 가진 핵산분자를 포함한다.

아미노산 서열 또는 염기 서열 사이의 동일성은 Karlin 및 Altschul 에 의한 알고리즘 BLAST를 사용해 측정될 수 있으며, BLAST 알고리즘을 바탕으로 한 BLASTN 및 BLASTX 라고 하는 프로그램에 의할 수 있다. 염기 서열이 BLASTN 을 사용하여 서열화되는 경우, 변수는 예를 들어, 스코어 = 100 이고, 워드길이 = 12 이다. 아미노산 서열이 BLASTX 를 사용하여 서열화되는 경우, 변수는 예를 들어, 스코어 = 50 이고, 워드 길이 = 3 이다. BLAST 및 Gapped BLAST 프로그램이 사용되는 경우, 각각의 프로그램에 대해 디폴트 변수가 적용된다.

본 명세서에 사용되는 '변이' 또는 '돌연변이'(mutant)는 생물체에 발생하는 여러 가지 변이 중에서 유전자에 변화가 생긴 것을 일컫고, 개방 리딩 프레임, 상부 조절 영역 및 하부 조절 영역을 포함하는 유전자에 대하여 이루어지는 유전적 변형들을 의미한다. 돌연변이가 일어난 유전자 부분이 생물체에 치사작용을 하는 경우를 제외하고는 (이 경우는 그 세대에서 사멸한다) 다음 세대로 그 유전적 정보가 정해진다.

상기 유전자 돌연변이들은 상방 조절(up regulation) 또는 하방 조절(down regulation) 또는 그 유전자의 개방 리딩 프레임의 전사의 완전한 저해 중 어느 것을 유도한다. 상기 유전자 돌연변이들은, 그 유전자의 전체적인 코딩하는 영역 또는 그 코딩하는 뉴클레오티드 서열 부분을 삭제함으로써, 또는 프레임 이동 돌연변이(frame shift mutation), 미스센스 돌연변이(missense), 또는 삽입(insertion)을 도입함으로써, 또는 중지 코돈(stop codon) 또는 그들의 조합들을 도입함으로써의 어느 것에 의하여 달성된다.

상기 돌연변이들은 효소 반응 또는 세포 멤브레인을 관통하는 유기 분자들의 이송과 같은 생물학적 기능들에 직접적으로 관련되는 단백질들에 대하여 코딩하는 구조적 유전자들(structural genes)에서 발생할 수 있다. 대체적으로, 돌연변이들은 그 생물학적 기능들에 직접적으로 관련된 단백질에 대하여 코딩하는 유전자들의 발현을 조절하는 단백질들에 대하여 코딩하는 조절 유전자들(regulatory genes)에서 발생할 수 있다. 다른 유전자들의 발현을 조절하는 단백질들은 조절 단백질들(regulatory proteins)로서 참조되며, 또한 이러한 조절 단백질들에 대하여 코딩하는 유전자들은 조절 유전자들(regulatory genes)로서 참조된다.

또한 돌연변이는 관련성 있는 야생형 생물의 그것에 관련된 DNA 서열 내에서의 어떤 변화를 포함한다. 예로서, 스트레인 KJ122 내에서 발견되는 돌연변이는, 그 돌연변이된 영역의 DNA 서열이 부모의 야생형 스트레인(E. coli. ATCC 8739)의 그것과 비교될 때 발견될 수 있는 DNA 서열 내에서의 어떤 변화이다. 돌연변이는 어떤 수의 염기 짝들(base pairs)에 대한 부가적인 DNA의 삽입 또는 어떤 수의 염기 짝들(base pairs)에 대한 DNA의 삭제일 수 있다. 삽입 돌연변이(insertion mutation)의 특정한 타입은 유전자 듀플리케이트(gene duplicate)이다. 유전자는 자발적인 돌연변이적 사건에 의해 듀플리케이트될 수 있고, 이때 상기 유전자의 이차적 카피(secondary copy)는 고유 카피(original copy)에 인접하여 위치될 수 있거나, 또는 유전자는 유전자 조작에 의해 듀플리케이트 될 수 있고, 여기서 상기 유전자의 이차적 카피(secondary copy)는 상기 고유 카피(original copy)로부터 이격되어 있는 게놈 내의 사이트에 위치될 수 있다.

돌연변이는 예로서 아데닌으로부터 구아닌 염기로의 변화와 같이, 하나의 염기 타입으로부터 또 다른 염기 타입으로의 변화일 수 있다. 유전학의 표현(vernacular)에서, 돌연변이는 미스센스(missense)(코돈에 의하여 그를 위해 코딩된 아미노산을 변화시키는), 비인식의(nonsense)(코돈을 중지 코돈으로 변화시키는), 프레임 이동(frameshift)(세 개의 다중적인 것이 아닌 염기들의 수의 삽입 또는 삭제인, 또한 상기 리딩 프레임을 변화시키고 및 돌연변이로부터 하부로 인코딩된 아미노산 서열을 개조하는, 또한 종종 상기 돌연변이로부터 하부로 중지코돈을 도입하는), 또한 변환(inversion)(극성(polarity)에서 스위치된 그러나 삭제되지는 않은 DNA 서열로부터 도출되는) 일 수 있다.

'돌연변이체'는 그것의 게놈이 하나 이상의 돌연변이들을 포함하는 미생물이다.

상기 상술한 목적을 달성하기 위한 본 발명은 서열목록 1에 기재된 yqhD 유전자, 서열목록 2에 기재된 ackA 유전자 및 서열목록 3에 기재된 pta 유전자 중에서 어느 하나 이상의 유전자에 변이를 포함하고, 유기산 합성능을 갖는 대장균 돌연변이체를 제공하는 것을 특징으로 한다. 이하 첨부된 도면을 이용하여 본 발명의 구성을 더욱 상세하게 살펴보도록 한다.

본 발명의 대장균 돌연변이체는 서열목록 1에 기재된 yqhD 유전자, 서열목록 2에 기재된 ackA 유전자 및 서열목록 3에 기재된 pta 유전자 중에서 어느 하나 이상의 유전자에 변이를 포함하고 유기산 합성능을 갖는다.

본 발명의 돌연변이체를 얻는 방법은 통상의 기술자가 적용할 수 있는 방법이면 제한되지 않으며, 자외선, X-ray, 질산, 니트로소구아니딘 및 에틸메탄 설포네이트 등을 처리하거나, 특정 유전자를 제거하거나 점돌연변이를 유발시킨 후, 모균주(야생형 균주)가 생장할 수 없는 농도의 유기산 또는 유기산 유도체를 포함하는 배지에서 생장할 수 있는 균주를 선별하여 얻을 수 있다.

본 발명의 돌연변이체는 야생형을 모균주로 사용하여 1회 이상의 돌연변이 과정을 거치거나, 상기 야생형으로부터 수득한 돌연변이를 다시 모균주로 사용하여 1회 이상의 돌연변이 과정을 거쳐서 얻을 수 있다.

상기 yqhD 유전자는 NADPH(니코틴아마이드 아데닌 디뉴클레오티드 인산의 환원형, nicotiamide adenine dinucleotide phosphate reduced form) 의존성 알데히드 디하이드로나제 단백질을 합성하며, 이는 글리세롤로부터 생성된 3-하이드록시프로피온알데히드(3-hydroxypropionaldehyde, 3-HPA)를 1,3-프로판디올(1,3-Propandiol, 1,3-PDO)로 전환시키는 작용을 한다. 이처럼 3-HPA가 1,3-PDO가 생성에 사용될 경우 3-HPA로부터 3-HP의 생산량이 감소될 수 있다. yqhD 유전자를 불활성화 시킬 경우 3-HPA가 모두 3-HP로 전환으로 이용될 수 있도록 유도할 수 있다.

상기 ackA-pta 유전자는 각각 아세트산 생산에 관련된 아세테이트 카이네이즈(acetate kinase)와 포스포트랜스아세틸레이즈(phosphotransacetylase) 단백질을 합성한다. 포스포트랜스아세틸레이즈는 아세틸-CoA를 전환시키는 효소이며, 아세테이트 카이네이즈는 아세틸 포스페이트를 아세테이트로 전환시키는 효소이다. 이들 유전자를 불활성화 할 경우 부산물인 아세테이트 생산량이 감소되는 효과를 기대할 수 있다.

본 발명에서의 유전자 상의 변이는 다양한 방법에 의하여 해당 유전자를 불활성화하는 것을 의미할 수 있으며, 여기서 불활성화란 활성이 있는 유전자를 염색체 내에서 제거하여 활성단백질의 발현이 불가능하도록 함을 의미한다.

본 발명의 yghD 및 ackA-pta 유전자의 불활성화 방법은 yghD 및 ackA-pta 유전자의 전부 또는 일부분을 결실시키거나 전부 또는 일부를 치환, 전부 또는 일부에 추가적인 염기 서열을 삽입시키는 등 통상의 기술자에게 알려진 다양한 방법에 의하여 수행될 수 있다. 예를 들어, 상동 재조합을 통해 염색체 상의 yghD 및 ackA-pta 유전자를 불활성화시킬 수 있는데, yghD 및 ackA-pta 유전자 단편을 포함하는 염기서열 또는 이를 포함하는 벡터를 본 발명의 미생물에 형질전환시키면 상기 yghD 및 ackA-pta 유전자 단편이 염색체 상의 yghD 및 ackA-pta 유전자를 대체하게 된다.

상기의 불활성화 방법은 yghD 및 ackA, pta 유전자 또는 그의 DNA 단편을 형질전환에 의하여 숙주세포 내로 도입하여 제조할 수 있다. 이렇게 형질전환에 의하여 숙주세포에 도입된 상기 불활성화 폴리뉴클레오티드 서열은 게놈 DNA 중의 테일 서열과의 상동 재조합에 의하여 야생형 게놈 서열을 불활성화시킬 수 있다.

본 발명의 대장균 돌연변이체는 자외선 조사에 의한 돌연변이 과정을 추가로 거치고, 서열목록 4에 기재된 16s 리보솜 염기서열을 갖는 것을 특징으로 할 수 있다.

돌연변이법을 이용한 균주 개발 중 하나인 자외선(UV)을 이용한 돌연변이 법은 자외선 파장대의 빛에서 DNA의 구조가 변하는 특징을 이용한 것이다. DNA의 피리미딘(pyrimidine) 부분에 자외선 노출이 가해질 때 피리미딘이 다이머(dimer) 구조를 형성함으로서 정상적인 구조인 피리미린-퓨린 결합이 방해되는데 그 원리가 있다. 무작위적으로 변형된 DNA 구조 중 개발하고자 하는 방향으로 변형된 균주를 선별하여 미생물을 개발한다.

구체적으로 자외선 돌연변이의 경우, 광합성을 하는 생명체의 경우를 제외하고는 자외선(UV)는 대부분의 생명체에 유해하며, 그 조사량에 따라 세포내 단백질 및 유전자에 변화를 가져오게 된다. 자외선(UV 300nm 이하)의 에너지가 생명체에 조사되면 유전정보에 변화를 가져오게 되며, 이러한 변화는 그 위치에 따라 단백질 기능 및 구조에 변화를 가져올 수 있으며 변화된 유전자는 다음 세대로 전달될 수 있다. 본 발명에서 '자외선 돌연변이'란 이러한 과정을 거쳐 개발된 돌연변이체를 일컫는다.

본 발명의 대장균 돌연변이체는 기탁번호 KCCM11421P일 수 있다.

본 발명의 대장균 돌연변이체는 유기산을 합성하는 능력을 가질 수 있으며, 보다 구체적으로는 3-하이드록시프로피온산, 숙신산 및 락트산 중에서 선택된 하나 이상의 유기산을 합성하는 능력을 가질 수 있다.

본 발명의 대장균 돌연변이체는 유기산에 대해 내성을 가질 수 있으며, 구체적으로는 3-하이드록시프로피온산, 숙신산 및 락트산 중에서 선택된 하나 이상의 유기산에 대해 내성을 가질 수 있다.

상기 유기산은 특정 유기산에 제한되지는 않으나, 유기산의 생합성과 관련된 물질이 바람직하다. 예를 들어, 3-HP 내성 증가를 목적으로 하는 경우 원료물질인 글리세롤(glycerol) 혹은 중간 생성물인 3-HPA(3-hydroxypropionaldehyde)등이 될 수 있다.

본 발명의 대장균 돌연변이체의 유기산에 대한 내성은 유기산의 농도 및 세포 생존능으로 표현될 수 있으며, 하이드록시프로피온산 5g/l 이상 또는 젖산 15g/l 이상의 농도에서 야생형 또는 모균주에 비하여 세포 생존능이 높은 특징을 지니어 유기산에 대산 내성을 나타낼 수 있다.

본 발명의 대장균 돌연변이체는 유기산이 존재하는 조건하에서 야생형 또는 모균주에 비하여 우수한 내성을 보이며, 돌연변이체의 세포생존능이 100% 이상 향상되거나, 바람직하게는 150% 이상, 더욱 바람직하게는 300% 이상 향상될 수 있다.

또한 1차 선별된 돌연변이체를 대상으로 돌연변이 과정을 반복함으로써 더 고농도인 유기산에 대하여 내성을 갖는 대장균 돌연변이체를 얻을 수 있다.

본 발명의 대장균 돌연변이체는 고속대량스크리닝(High Throughput Screening, HTS)를 이용하여 콜로니 픽킹을 진행할 수 있다. 예를 들어, 1차 선별은 3-HP 생산의 원료가 되는 글리세롤이 포함된 배양액 내에서의 생장속도 (growth rate)를 기준으로 적용한다. 96-well-플레이트에서 1차 선별된 균주들은 250 ml 플라스크를 이용하여 재검증을 진행한다. 이처럼 3-HP가 포함된 아가(agar) 플레이트에서 살아남고, 96-well과 250 ml 플라스크 조건에서 생장속도가 빠른 균주들은 3-HP가 포함된 agar 플레이트에서의 내성테스트를 거친다.

상기 과정을 통해 최종 선별된 균주의 경우 3-HP 생산 관련 유전자가 포함된 플라스미드를 삽입하여 향상된 3-HP 내성도가 생산성에 연결되는 것을 확인하였다. 다른 유기산(예를 들어, 숙신산 또는 락트산)의 내성 향상이 목적인 경우 상기 내용과 마찬가지로 자외선 처리 이후 아가(agar) 배지 내에 해당 유기산을 투입하여 진행하고, 최종 선별 과정에서는 해당 유기산의 생산성을 이용하여 선발할 수 있다. 상술한 돌연변이체 제작 및 선별 과정의 구체적인 공정은 도 2에 개시하였다.

본 발명의 대장균 돌연변이체는 그 자체가 유기산 생산에 관여하는 유전자를 포함하여 유기산을 생산하거나 또는 돌연변이체가 특정 유기산을 생산하지 않거나 유기산의 생산량을 향상시키기 위하여 유기산 생산에 관여하는 유전자를 재조합 방법으로 본 발명의 대장균 돌연변이체에 도입하여 유기산을 생산할 수 있다.

본 발명의 대장균 돌연변이체는 글리세롤 데히드라타제(glycerol dehydratase) 또는 디올 데히드라타제 (diol dehydratase)(이하, 간단히 '글리세롤 데히드라타제'라 칭함)를 암호화하는 핵산분자를 추가로 포함할 수 있다.

상기 글리세롤 데히드라타제는 미생물 배양시 탄소원(carbon source)으로 사용된 글리세롤을 3-HPA로 전환할 수 있는 임의의 글리세롤 데히드라타제 효소가 이용될 수 있다. 상기 글리세롤 데히드라타제는 비타민 B₁₂ 의존성과 비의존성 모두가 사용될 수 있다.

구체적으로는 클랩시엘라 속(Klebsiella sp.), 시트로박터 속(Citrobacter sp.), 클로스트리디움 속(Clostridium sp.), 살로넬라 속(Salmonella sp.), 일로박터 속(Ilyobacter sp.) 균주 등에서 유래한 글리세롤 데히드라타제를 예로 들 수 있다.

일례로, 일로박터 폴리트로퍼스(Ilyobacter polytropus) 유래 글리세롤 데히드라타제이며, 서열번호 5, 6 및 7로 표시되는 폴리펩타이드(각각 DhaB1, DhaB2, DhaB3)를 포함할 수 있다.

상기 글리세롤 데히드라타제를 암호화하는 염기서열은, 서열번호 5, 6 및 7로 표현되는 폴리펩타이드를 암호화하는 염기서열 또는 서열번호 8, 9 및 10으로 표현된 염기서열(각각 dhaB1, dhaB2 및 dhaB3)을 포함할 수 있다.

또 다른 일례로, 클렙시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumonia DSM 2026) 유래 글리세롤 데히드라타제이며, 서열번호 11, 12, 및 13으로 각각 표시되는 폴리펩타이드(각각 DhaB1, DhaB2, DhaB3)를 포함할 수 있다.

상기 글리세롤 데히드라타제를 암호화하는 염기서열은, 서열번호 11, 12 및 13으로 표현되는 폴리펩타이드를 암호화하는 염기서열 또는 서열번호 14, 15 및 16으로 표현된 염기서열(각각 dhaB1, dhaB2 및 dhaB3)을 포함할 수 있다.

본 발명의 핵산 분자는, 상술한 특정 서열에 혼성화되는 서열, 그에 상보적인 서열 또는 상보적인 서열에 혼성화되는 서열로 이루어진 핵산 분자일 수 있으며, 또한 상술한 폴리펩타이드와 실질적으로 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 염기서열로 이루어진 핵산 분자도 본 발명의 범주에 포함된다.

본 발명의 대장균 돌연변이체는 글리세롤 데히드라타제 재활성화 인자 폴리펩타이드 또는 디올 데히드라타제 재활성화 인자 폴리펩타이드를 발현하는 핵산분자를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 글리세롤 데히드라타제 재활성화 인자는, 글리세롤 데히드라타제가 작용하는 동안 비가역적으로 불활성화되는 것을 다시 활성화시켜주는 폴리펩타이드이다.

글리세롤 데히드라타제 재활성화 인자로 일반적으로 알려진 어느 것이라도 사용할 수 있으나, 클랩시엘라 속(Klebsiella sp.), 시트로박터 속(Citrobacter sp.), 락토바실러스 속(Lactobacillus sp.), 살모넬라 속(Salmonella sp.), 일로박터 속(Ilyobacter sp.) 균주 등에서 유래한 글리세롤 데히드라타제 재활성화 인자가 사용될 수 있다. 바람직하게는, 상기 글리세롤 데히드라타제를 제공하는 미생물과 동종의 미생물이다. 구체적으로는 상기 데히드라타제 재활성화 인자는 DhaFG, GdrAB, DdrAB 등일 수 있으며, 이를 암호화하는 염기서열은 dhaFG(ABI36568.1), gdrAB(EF077655.1), ddrAB(AAC15871) 등으로부터 선택될 수 있다.

일례로, 일로박터 폴리트로퍼스(Ilyobacter polytropus) 유래 글리세롤 데히드라타제 재활성화인자이며, 서열번호 17 및 18로 표시되는 폴리펩타이드(각각 GdrA 및 GdrB)를 포함할 수 있다.

상기 글리세롤 데히드라타제를 암호화하는 염기서열은, 서열번호 17 및 18로 표현되는 폴리펩타이드를 암호화하는 염기서열 또는 서열번호 19 및 20으로 표현된 염기서열(각각 gdrA 및 gdrB)을 포함할 수 있다.

또 다른 일례로, 클렙시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumonia DSM 2026) 유래 글리세롤 데히드라타제 재활성화인자이며, 서열번호 21 및 22로 표시되는 폴리펩타이드(각각 GdrA 및 GdrB)를 포함할 수 있다.

상기 글리세롤 데히드라타제를 암호화하는 염기서열은, 서열번호 21 및 22 로 표현되는 폴리펩타이드를 암호화하는 염기서열 또는 서열번호 23 및 24로 표현된 염기서열(각각 gdrA 및 gdrB)을 포함할 수 있다.

본 발명의 대장균 돌연변이체가 내인성으로 데히드로게나제 유전자를 포함하고 있는 경우 상기 데히드로게나제 유전자를 외부에서 숙주세포 내 도입하는 것이 필요하지 않을 수 있으나, 상기 효소의 발현양을 증가시키기 위하여 데히드로게나제를 발현하는 핵산분자를 추가로 돌연변이체에 도입할 수도 있다.

본 발명의 데히드로게나제는 3-하이드록시프로피온알데히드(3-Hydroxy propionaldehyde; 3-HPA)를 3-하이드록시프로피온산(3-Hydroxypropionic acid, 3-HP)으로 전환하는 효소일 수 있다. 3-히드록시프로피온알데히드 데히드로게나제에는 3-HPA를 3-HP로 전환시키는 활성을 가지는 효소라면 어느 효소라도 포함된다. 3-하이드록시프로피온알데히드 데히드로게나제는 조효소로서 NAD+ 또는 NADP+를 사용할 수 있다

본 발명에서 3-하이드록시프로피온알데히드 데히드로게나제는 AldH2, Ald4, AldA, AldB 및 AldH로 이루어진 그룹에서 선택되는 것일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 효소를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열로는, 호모 사피엔스(Homo sapiens) 유래의 aldH2 유전자(NM_000690.3, NM_001204889.1), 사카로마이세스 세레비지에(S. cerevisiae) 유래의 ald4 유전자(NM_001183794.1), 대장균(E. coli) 유래의 aldA, aldB, aldH 유전자 (NC_000913.2) 등으로부터 선택될 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

일례로, 쿠프리아비두스 네카터(Cupriavidus necator) 유래의 숙신산 세미알데히드 데히드로게나제를 사용할 수 있으며, 서열번호 25로 표시되는 폴리펩타이드(GabD4)를 포함할 수 있다.

상기 숙신산 세미알데히드 데히드로게나제를 암호화하는 염기서열은, 서열번호 25로 표현되는 폴리펩타이드를 암호화하는 염기서열 또는 서열번호 26으로 표현된 염기서열(gabD4)을 포함할 수 있다.

또 다른 일례로, 대장균 K12 MG1655(Escherichia coli) 유래 3-하이드록시프로피온알데히드 데히드로게나제이며, 서열번호 27로 표시되는 폴리펩타이드(AldH)를 포함할 수 있다.

상기 3-하이드록시프로피온알데히드 데히드로게나제를 암호화하는 염기서열은, 서열번호 27로 표현되는 폴리펩타이드를 암호화하는 염기서열 또는 서열번호 28로 표현된 염기서열(aldH)을 포함할 수 있다.

상기 핵산 분자는 해당 폴리펩타이드를 발현하기에 적절한 벡터에 삽입되어 균주로 도입될 수 있다. 상기 발현벡터는 상기 유전자의 발현 조절을 위하여 항시성(constitutive) 또는 유도성 프로모터, 전사 인핸서(enhancer), 전사 터미네이터 등을 포함할 수 있다. 복수의 외인성 유전자를 발현시키는 경우 여러 유전자가 한 발현벡터에 삽입되거나 별도의 발현벡터에 삽입될 수도 있다.

상기 발현 벡터는 알려진 방법으로 숙주 세포 내 도입될 수 있다. 상기 각 폴리뉴클레오타이드는 동일 또는 상이한 프로모터에 각각 작동되도록 연결될 수 있다. 일례로 글리세롤 데히드라타제 및 그 활성화 인자는 동일 프로모터에 작동되도록 연결될 수 있다. 일례로 본 발명에서는 상기 글리세롤 데히드라타제를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터는 혐기성 조건에서 작동이 유도되는 혐기성 프로모터, 예를 들어 nar, PadhE, Nirb, fdhF, phTERT, PnirB 프로모터를 포함할 수 있다(Kim et. Al., J. Biotechnology, Vol.151, Issue 1, pp.102-107; Wei et. Al., Applied Microbiology and Biotechnology March 2009, Volume 82, Issue 4, pp 703-712; Oxer et. Al., Peakman TC, Charles IG, et al. 1991).

본 발명의 재조합 미생물은 재조합 벡터와 같은 발현카세트로 숙주 세포에 도입하는 형질전환 방법에 의하여 만들어질 수 있으며, 상기 도입 방법 역시 공지의 기술, 예컨데 염화칼슘법, 열 충격법, 전기충격법 등의 형질전환방법이나 재조합 파지 바이러스를 통한 형질주입을 통해 도입할 수 있다. 상기의 숙주 세포 이외에도 발현의 목적에 따라 달라지는 벡터에 의존하여 다양한 균주를 용이하게 이용할 수 있음은 당업자에게 명백한 일이다.

상술한 3-HP와 동일한 방법으로 숙신산 합성에 관여하는 폴리펩타이드를 발현하는 핵산분자, 락트산 합성에 관여하는 폴리펩타이드를 발현하는 핵산분자를 본 발명의 대장균 돌연변이체에 도입하여 숙신산 또는 락트산을 합성하도록 할 수 있다(Enzyme and Microbial Technology 39 (2006) 352-361, Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology (2001) 27, 259-264), US7629162, Zhou S., Caussey T. B., Hasona A., Shanmugan K. T., Ingram L. O. 2003a. Production of optically pure D-lactic acid in mineral salts medium by metabolically engineered Escherichia coli W3110. Applied and Environmental Microbiology 69(1): 399-407). 숙주세포를 본 발명의 변이체로 하여 상기와 같은 방법으로 재조합하는 경우 세포에 독성 유발을 감소시키면서 고농도로 배양할 수 있다.

본 발명에 따르면, 상술한 대장균 돌연변이체를 배양하는 단계를 포함하는 유기산 합성방법을 제공한다. 일례로 3-하이드록시프로피온산, 숙신산 및 락트산 중에서 선택된 하나 이상의 유기산을 합성할 수 있다.

상기 배양은 통상의 기술자가 균주 배양에 적용할 수 있는 방법이면 제한되지 않으며, 배치, 연속식 또는 유가식 배양일 수 있다.

사용 가능한 배지는 탄소원으로 글루코스, 글리세롤, molasses 등을 포함할 수 있고, 질소원으로는 암모니아, 황산 암모늄, 질산염 등을 포함할 수 있다. 글루코스를 글리세롤로 전환하지 못하는 미생물의 경우에는 공지의 방법으로 전환에 필요한 외래 유전자를 도입시켜 글루코스로부터 유기산이 생산되도록 할 수 있다(US7,005,291). 기타 인산염, 무기염, 비타민, 아미노산 등 유기산을 발효하기 위하여 첨가되는 성분을 포함될 수 있다.

배양 온도는 30~ 37℃이며, pH는 6.0 ~ 8.0, 바람직하게는 6.8 ~ 7.2이다. 배양조건은 사용된 미생물에 따라 적절히 조절할 수 있는데, 대장균의 경우 미호기성(microaerobic) 조건하에서 배양할 수 있다.

이하에서는 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 다만, 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다 할 것이다.

[ 실시예 1] yqhD, ackA-pta 불활성화에 의한 돌연변이 방법

단계 1) yqhD 유전자 제거

우선 pKD13(AmpR, kanamycin template plasmid)을 주형으로 하고 다음의 두 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하여 yqhD 유전자 제거용 PCR 절편을 확보하였다.

이때 PCR은 Phusion high fidelity DNA 폴리머라아제 (Thermoscientific) 사용하여 Cycle I (98℃ 3 분), Cycle Ⅱ (30 cycles/ 98℃ 30초, 55℃ 30초, 72℃, 2 min), Cycle Ⅲ (72℃, 5분)의 과정으로 실행되었다.

■ Primer 정보 : E. coli K12 유래 yqhD 증폭용 프라이머

yqhD_F : ATGAACAACTTTAATCTGCACACCCCAACCCGCATTCTGTTTGGTGTGTAG (서열번호 29)

yqhD_R : TTAGCGGGCGGCTTCGTATATACGGCGGCTGACATCCAACGTAATATTCCG (서열번호 30)

수득된 PCR 절편을 pKD46(AmpR, lamda red recombinase expression plasmid, ara-inducible expression, temperature sensitive, 6.3-kb)으로 형질전환된 대장균 W3110 균주에 일렉트로포레이션 하였다.

다음으로 resistance marker(KmR)가 포함된 LB 평판배지에 도말하고 37℃에서 배양하여 yqhD 유전자가 가나마이신(Kanamycin) 저항성 유전자로 치환된 균주 ΔyqhD::Km을 선별하였다. 선별된 균주에 pCP20(AmpR, flp recombinase expression plasmid, 9.4-kb)을 형질전환하여 Kanamycin 저항성 유전자를 제거한 ΔyqhD 균주 (돌연변이체 1)를 선별하였다(도 2 참조).

단계 2) Δ yqhD 균주에서 ackA - pta 유전자 제거

우선 pKD13 (AmpR, kanamycin template plasmid)을 주형으로 하고 다음의 두 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하여 ackA-pta 유전자 제거용 PCR 절편을 확보하였다.

이때 PCR은 LA taq 폴리머라아제(Takara, Japan)를 사용하여 Cycle I (95℃ 3 분), Cycle Ⅱ (30 cycles/ 98℃ 30초, 55℃ 30초, 72℃, 4 min), Cycle Ⅲ (72℃, 5분)의 과정으로 실행되었다.

■ Primer 정보 : E. coli K12 유래 ackA-pta 증폭용 프라이머

ackA-pta_F : CGTAGTGATCGATGAGTCTGTTATTCAGGGTATCAAAGGTGTAGGCTGGAG (서열번호 31)

ackA-pta_R : CAATCCCTGCACCCAGTTCTACACCCTGAGACGCTGATTCCGGGGATCCGT (서열번호 32)

수득된 PCR 절편을 pKD46 (AmpR, lamda red recombinase expression plasmid, ara-inducible expression, temperature sensitive, 6.3-kb)으로 형질전환된 실시예 2에서 제작한 ΔyqhD 균주에 일렉트로포레이션 하였다.

다음으로 resistance marker(KmR)가 포함된 LB 평판배지에 도말하고 37℃에서 배양하여 ackA-pta 유전자가 Kanamycin 저항성 유전자로 치환된 균주 ΔyqhD ΔackA-pta::Km를 선별하였다. 선별된 균주에 pCP20(AmpR, flp recombinase expression plasmid, 9.4-kb)을 형질전환하여 Kanamycin 저항성 유전자를 제거한 ΔyqhD ΔackA-pta 균주(돌연변이체 2)를 최종 선별하였다 (도 3 참조).

[ 실시예 2] 3-HP 합성 형질전환체의 제조

3-하이드록시프로피온산를 생산하기 위하여 재조합 발현벡터를 도 4와 같이 제조하였다.

단계 1) 글리세롤 데히드라타제 ( glycerol dehydratase ) 발현 유전자 획득

일리오박터 폴리트로퍼스 DSM 2926 으로부터 게놈 DNA를 추출한 후 dhaB1, dhaB2, dhaB3 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머를 사용하여 PCR(Polymerase Chain Reaction)을 수행함으로써 dhaB1, dhaB2, dhaB3 유전자를 증폭하였고 gdrA, gdrB 역시 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하여 유전자를 증폭하였다. BspHI과 BamHI으로 dhaB1, dhaB2, dhaB3 를 절단하고, BamHI 과 SacI으로 gdrA, gdrB 를 절단하였다.

이때 PCR 반응은 Phusion high fidelity DNA 폴리머라아제(Thermo scientific) 를 사용하여 Cycle I (95℃, 3 min), Cycle II (30 cycles/ 98℃ 10 sec, 55℃ 30 sec, 72℃ 3 min), Cycle III (72℃, 5 min) 조건에서 수행하였고 증폭된 DNA를 각 효소로 처리한 pETDuet 벡터 (Novagen)에 도입하여 pET-I 벡터를 제작하였다

■ Primer 정보 : Ilyobacter polytropus dhaB1, dhaB2, dhaB3

dhaB1B2B3_F IP: TCATGAAATCAAAAAGATTTGAAGTATTGAAG(BspHI) (서열번호 33)

dhaB1B2B3_R IP: GGATCCCTAATCTTTTCTAAGTTGACCTCTTTGTTC (BamHI) (서열번호 34)

■ Primer 정보 : Ilyobacter polytropus gdrA, gdrB

gdrAB_F IP: GGATCCAAAGGTTCGGGGATAGTTATGAAG(BamHI) (서열번호 35)

gdrAB_R IP: GAGCTCTTATCTAAGTGGCAGACCCTTTACAAG(SacI) (서열번호 36)

단계2 ) 숙신산 세미알데히드 데히드로게나제( Succinate semialdehyde dehydrogenase) 발현 유전자 획득

쿠프리아비두스 네카터 ATCC 17699로부터 게놈 DNA를 추출하고 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하여 gabD4 유전자를 증폭하고, NheI과 KpnI으로 절단하였다.

이때 PCR 반응은 Phusion high fidelity DNA 폴리머라아제 (Thermo scientific) 를 사용하여 Cycle I (95℃, 3 min), Cycle II (30 cycles/ 98℃ 10 sec, 55℃ 30 sec, 72℃ 2 min), Cycle III (72℃, 5 min) 조건에서 수행하였고 증폭된 DNA를 각 효소로 처리한 pET-I 벡터에 도입하여 pET-IC 벡터를 제작하였다.

■ Primer 정보 : Cupriavidus necator 유래 gabD4

gabD4_F RI: AAAGCTAGCATGTACCAGGATCTCGCCC (NheI) (서열번호 37)

gabD4_R RI: AATGGTACCTCAGGCCTGGGTGATGAACTT (KpnI) (서열번호 38)

단계 3) 숙주세포로의 도입

상기에서 제조한 pET-IC 재조합 벡터를 상기에서 얻은 돌연변이체 1에 도입하여 형질전환한 돌연변이체 1R을 제조하고, 돌연변이체 2에 pET-IC 재조합 벡터를 도입하여 형질전환한 돌연변이체 2R을 제조하였다.

또한 상기에서 제조한 pET-IC 재조합 벡터를 대장균 W3110 균주에 도입하여 형질전환하여 대조군 1R (control 1)로 사용하였다.

[ 실시예 3] 돌연변이체 1R에 의한 3-하이드록시프로피온산 발효

상기에서 얻은 돌연변이체 1R 및 대조군 1R를 각각 50μM 비타민 B₁₂ 및 40 g/L 글리세롤을 첨가한 M9배지(Sambrook, et al., Molecular cloning, 3rd edition, Cold Spring Harbor Laboratory press) 50 ml (250ml flask)에서 33℃에서 진탕 배양하였다.

배양 결과는 다음 표 1과 같다.

	3- HP 생산량(g/l)	1,3- 프로판디올 생산량(g/l)
돌연변이체 1R	10.62	0.0
대조군 1R	9.67	2.78

[ 실시예 4] 돌연변이체 2R에 의한 3-하이드록시프로피온산 발효

상기에서 얻은 돌연변이체 2R을 50μM 비타민 B₁₂및 40 g/L 글리세롤을 첨가한 M9 배지 50 ml (250ml flask)에 접종하고 33℃에서 배양기에서 진탕 배양하였다.

배양 결과, 돌연변이체 2R은 대조군에 비하여 배양 24시간 이후부터는 생장속도가 저하된 것을 확인하였다(도 5 참조).

3-하이드록시프로피온산, 1,3-프로판디올 및 아세트산의 생산량은 다음 표 2 및 도 6, 7 내지 8에 나타내었다.

	3- HP 생산량(g/l)	1,3- 프로판디올 생산량(g/l)	아세트산(g/l)
돌연변이체 2R	16.9	0.14	0.52
대조군 1R	8.58	2.97	5.30

본 실험은 대장균에서 yqhD와 ackA-pta 유전자를 제거할 경우, 1,3-프로판디올과 아세트산과 같은 부산물들을 제거하고 3-히드록시프로피온산 생산량을 향상시켜 고효율의 3-히드록시프로피온산 생산성을 가질 수 있음을 보여주었다.

[ 실시예 5] 자외선(UV)를 이용한 대장균(Escherichia coli)의 돌연변이 방법

상기 실시예 2에서 개발한 돌연변이 2 균주를 50 ml 플라스크에 50 ml LB 배지(Lauria Broth, 염화나트륨(NaCl) 10 g/L, 트립톤(Tryptone) 10 g/L, 효모추출물(Yeast Extract) 5 g/L)에 접종한 뒤, 37℃, 250 rpm 진탕배양기(shaking incubator)에서 배양하여 활성화 되도록 하였다.

배양된 균주의 흡광도값이 2.0에 이르렀을 때까지 세포를 원심분리기를 이용하여 새로운 LB 액체배지로 3회 세척하였으며, 세척된 세포는 10배 희석하여 자외선 램프에서 15 cm의 거리에서 20초간 자외선 조사하였다.

자외선 조사된 세포를 10배 단위로 희석하여 3-HP가 포함된 LB agar 배지에 도말하여 37℃ 에서 배양하였다. 플레이트에 선별과정을 진행할 수 있는 적정 콜로니가 나오는 조건을 확인하여, 다음 실험시 그 희석 농도에서 도말하였다.

처음 돌연변이를 시작할 때의 agar 배지내 3-HP량은 5g/L이었으며, 선별된 내성균주에 대해 자외선을 재처리하는 경우에는 배지내 3-HP량을 1g/L 씩 증가하는 방식(즉, 2차 처리에서는 6g/L. 3차 처리에서는 7g/L)으로 진행하였다. 최종 선별된 425-27 균주의 경우 3-HP 20g/L의 agar 배지 조건에서 배양된 콜로니이다.

[ 실시예 6] 대장균(Escherichia coli) 자외선 돌연변이체 1차 선별방법

상기 실시예 5에서 고체 배지에서 생장하는 돌연변이체 1,152 개(96-well x 12 plate)를 HTS(High throughput system)을 이용하여 콜로니를 취하고, 이들을 다시 액체 배지(12.8 g/L 인산수소이나트륨(Na₂HPO₄-7H₂O), 3 g/L 인산이수소칼륨 (KH₂PO₄), 1.5 g/L 염화나트륨(NaCl), 2 g/L 염화암모늄(NH₄Cl), 17.4 g/L 인산수소이칼륨(K₂HPO₄), 0.5 g/L 효모 추출물(yeast extract), 3 mL 1M 황산마그네슘(MgSO₄), 0.1 mL 1M 염화칼슘(CaCl₂), 20 g/L 글리세롤(Glycerol), pH 7.4) 에 배양하였다.

96-well-플레이트를 이용하여 콜로니들을 24시간 진탕 배양기에서 배양하였으며, 배양된 세포들의 흡광도를 600 nm에서 측정하여 흡광도 값이 높은 균주 50 개를 1차 선별하였다.

[ 실시예 7] 대장균(Escherichia coli) 자외선 돌연변이체 2차 선별방법

상기 실시예 6에서 1차로 선별된 50개의 균주들을 LB agar 플레이트에서 활성화시킨 후 250 ml 플라스크를 이용하여 생장속도를 재확인하였다. 250 mL 플라스크에 50 mL 배지(12.8 g/L 인산수소이나트륨(Na₂HPO₄-7H₂O), 3 g/L 인산이수소칼륨 (KH₂PO₄), 1.5 g/L 염화나트륨(NaCl), 2 g/L 염화암모늄(NH₄Cl), 17.4 g/L 인산수소이칼륨(K₂HPO₄), 0.5 g/L 효모 추출물(yeast extract), 3 mL 1M 황산마그네슘(MgSO₄), 0.1 mL 1M 염화칼슘(CaCl₂), 40 g/L 글리세롤(Glycerol), pH 7.8)에서 배양하여 24시간 후에 흡광도 값을 측정하여 선별하였다.

이 과정을 통하여 총 50개의 균주 중 흡광도가 우수한 5개를 선별하여 내성도 분석을 진행하였다(실시예 8).

[ 실시예 8] 대장균(Escherichia coli) 자외선 돌연변이체의 3-HP 내성

상기 실시예 3에서 선별된 5개의 균주에 대한 3-HP 내성 여부를 측정하였다.

선별된 5개의 균주와 모균주(돌연변이 2)를 LB 배지에 접종하여 37℃, 250 rpm 조건에서 16시간 동안 배양하였다. 배양된 균주들을 3-HP가 각각 5g, 10g, 15g, 20g 포함된 액체배지(그 성분은 실시예 7과 동일)에 1/10 volume 접종한 뒤, 37℃, 250 rpm 조건에서 6시간 동안 배양하였다. 배양된 균주들의 세포 100 ul를 멸균수 900 ul에 희석하여 10^-1 현탁액을 준비한 후 10배 단위로 10^- ⁶ 까지 멸균수로 희석하였다. 이 중 10^- ³ 에서 10^-6까지 LB agar 배지에 100ul 도말한 뒤 37℃에서 16시간 배양한 후 희석 배수에 따른 콜로니 개수로 내성도를 확인하였다.

상술한 내용에서 3-HP가 포함된 액체배지를 8N 수산화칼륨(KOH)를 이용하여 pH를 7로 조정한 것을 제외하고는 동일한 방법으로 내성을 평가하였다.

도 10에서 확인되는 바와 같이 선별된 5개의 균주 중 가장 우수한 내산성을 보인 돌연변이체 3은 10 g/L이상의 3-HP를 포함한 배지에서 모균주 대비 150% 이상 내성도가 향상되었으며, 3-HP를 투입한 후 pH를 7.0으로 보정한 배지에서는 그 효과가 더 뚜렷하여 5g/L의 조건에서도 400% 이상 세포생존능(cell viability)이 향상되었다.

[ 실시예 9] 자외선 돌연변이 대장균 균주의 젖산 내성도 분석

상술한 실시예 8의 내용에서 3-HP가 포함된 액체배지 대신 젖산을 사용한 것을 제외하고는 동일한 방법으로 젖산 내성을 평가하였다.

도 4에서 확인되는 바와 같이 선별된 균주는 15 g/L 이상의 젖산을 포함한 배지에서 모균주 대비 130% 이상 내성도가 향상되었다.

상기 과정을 통해 최종 선별되어 유기산에 대한 내성이 확인된 돌연변이체를 425-27로 명명(돌연변이체 3)하고 KCCM에 기탁하였다.(기탁번호: KCCM11421P)

[ 실시예 10] 3-HP 합성 형질전환체의 제조 1

상기 실시예 2에서 제조한 pET-IC 재조합 벡터를 상기에서 얻은 돌연변이체 3에 도입하여 형질전환한 돌연변이체 3R를 제조하였다.

[ 실시예 11] 돌연변이체 1R에 의한 3-HP 합성 분석

상기 실시예 10에서 얻은 돌연변이체 3R의 발효실험을 통해 3-HP 생산성 및 균체 성장을 조사하였다.

돌연변이체 3R 균주, 대조군 1R, 및 돌연변이체 2R 균주를 각각 500 mL 플라스크에 50 ㎍/mL의 암피실린(ampicillin)이 포함된 100ml LB 배지를 이용하여 37℃에서 전배양한 후, 동일한 온도에서 5L 발효조를 사용하여 2L 배지(12.8 g/L인산수소이나트륨(Na₂HPO₄-7H₂O), 3 g/L 인산이수소칼륨(KH₂PO₄), 1.5 g/L 염화나트륨(NaCl), 2 g/L 염화암모늄(NH₄Cl), 17.4 g/L 인산수소이칼륨(K₂HPO₄), 0.5 g/L 효모 추출물(yeast extract), 120 mL 1M 황산마그네슘(MgSO₄), 4 mL 1M 염화칼슘(CaCl₂), 80 g/L 글리세롤(glycerol), pH 7.0)에서 배양하였다. 이후, 600nm에서 측정한 흡광도(OD)값이 0.6~0.8일 때, 0.03mM IPTG 및 48μM 비타민 B₁₂를 (최종 농도) 첨가하여 단백질의 발현 및 3-HP의 생산을 유도하고 3-HP의 함량을 측정하였다.

3-HP의 함량은 실시예 4에서 사용한 것과 동일한 방법으로 측정하였으며, 균체 성장을 나타내는 흡광도는 도 11에, 3-HP 생산량은 도 12에 도시하였다.

본 발명에 따른 돌연변이체 3R의 최고 흡광도값은 대조군 1R에 비하여 10%이상 향상되었으며, 배양이 끝난 후의 세포를 확인한 결과 대조군 1R의 경우 대부분 사멸한 세포인 반면 돌연변이체 3R의 세포는 대조군 1R에 비하여 30% 이상 생존하고 있어 본 발명에 따른 돌연변이체 3R의 3-HP 내성도가 향상되었음을 알 수 있었다.

또한 도 11에서 보는 바와 같이, 본 발명에 따른 돌연변이체 3R은 3-HP를 46 g/L 생산하여, 대조군 1R(야생형 균주)보다 220% 이상 향상되었고 돌연변이체 2R보다는 130% 이상 향상되었음을 확인하였다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항 들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

한국미생물보존센터(국외)

KCCM11421P

20130530

<110> Samsung Petrochemical Co., LTD. <120> New strain of Escherichia coli tolerable to organic acid and the preparation method of organic acid using the same <160> 4 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1542 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> gene <222> (1)..(1542) <223> 16s rDNA <400> 1 taaggaggtg atccaaccgc aggttcccct acggttacct tgttacgact tcaccccagt 60 catgaatcac aaagtggtaa gcgccctccc gaaggttaag ctacctactt cttttgcaac 120 ccactcccat ggtgtgacgg gcggtgtgta caaggcccgg gaacgtattc accgtggcat 180 tctgatccac gattactagc gattccgact tcatggagtc gagttgcaga ctccaatccg 240 gactacgacg cactttatga ggtccgcttg ctctcgcgag gtcgcttctc tttgtatgcg 300 ccattgtagc acgtgtgtag ccctggtcgt aagggccatg atgacttgac gtcatcccca 360 ccttcctcca gtttatcact ggcagtctcc tttgagttcc cggccggacc gctggcaaca 420 aaggataagg gttgcgctcg ttgcgggact taacccaaca tttcacaaca cgagctgacg 480 acagccatgc agcacctgtc tcacggttcc cgaaggcaca ttctcatctc tgaaaacttc 540 cgtggatgtc aagaccaggt aaggttcttc gcgttgcatc gaattaaacc acatgctcca 600 ccgcttgtgc gggcccccgt caattcattt gagttttaac cttgcggccg tactccccag 660 gcggtcgact taacgcgtta gctccggaag ccacgcctca agggcacaac ctccaagtcg 720 acatcgttta cggcgtggac taccagggta tctaatcctg tttgctcccc acgctttcgc 780 acctgagcgt cagtcttcgt ccagggggcc gccttcgcca ccggtattcc tccagatctc 840 tacgcatttc accgctacac ctggaattct acccccctct acgagactca agcttgccag 900 tatcagatgc agttcccagg ttgagcccgg ggatttcaca tctgacttaa caaaccgcct 960 gcgtgcgctt tacgcccagt aattccgatt aacgcttgca ccctccgtat taccgcggct 1020 gctggcacgg agttagccgg tgcttcttct gcgggtaacg tcaatgagca aaggtattaa 1080 ctttactccc ttcctccccg ctgaaagtac tttacaaccc gaaggccttc ttcatacacg 1140 cggcatggct gcatcaggct tgcgcccatt gtgcaatatt ccccactgct gcctcccgta 1200 ggagtctgga ccgtgtctca gttccagtgt ggctggtcat cctctcagac cagctaggga 1260 tcgtcgccta ggtgagccgt taccccacct actagctaat cccatctggg cacatccgat 1320 ggcaagaggc ccgaaggtac ccctctttgg tcttgcgacg ttatgcggta ttagctaccg 1380 tttccagtag ttatccccct ccatcaggca gtttcccaga cattactcac ccgtccgcca 1440 ctcgtcagca aagaagcaag cttcttcctg ttaccgttcg acttgcatgt gttaggcctg 1500 ccgccagcgt tcaatctgag ccatgatcaa actcttcaat tt 1542 <210> 2 <211> 1665 <212> DNA <213> Ilyobacter polytropus <220> <221> CDS <222> (1)..(1662) <223> dhaB1 of Ilyobacter polytropus <400> 2 atg aaa tca aaa aga ttt gaa gta ttg aag gaa cgt cct gta aat aaa 48 Met Lys Ser Lys Arg Phe Glu Val Leu Lys Glu Arg Pro Val Asn Lys 1 5 10 15 gat ggc ttt ata agt gaa tgg ata gaa gaa gga cta atc gca atg gaa 96 Asp Gly Phe Ile Ser Glu Trp Ile Glu Glu Gly Leu Ile Ala Met Glu 20 25 30 agt cct aac gat cct aat cca agt ttg aaa ata gaa aat ggt caa ata 144 Ser Pro Asn Asp Pro Asn Pro Ser Leu Lys Ile Glu Asn Gly Gln Ile 35 40 45 aca gag tta gac ggt aaa agc aga gaa gaa ttt gac atg atc gac aga 192 Thr Glu Leu Asp Gly Lys Ser Arg Glu Glu Phe Asp Met Ile Asp Arg 50 55 60 ttt ata gca gat tat gca ata aat atg gaa aat gct gaa aaa gct atg 240 Phe Ile Ala Asp Tyr Ala Ile Asn Met Glu Asn Ala Glu Lys Ala Met 65 70 75 80 aaa atg tca tct atg gaa ata tct aaa aaa cta 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tct gta gaa gaa gct act gaa 624 Gly Arg Gly Gly Ile Leu Thr Gln Cys Ser Val Glu Glu Ala Thr Glu 195 200 205 tta gag ctt gga atg aaa gga ttc aca agt tat gca gaa aca gtg tct 672 Leu Glu Leu Gly Met Lys Gly Phe Thr Ser Tyr Ala Glu Thr Val Ser 210 215 220 gta tat ggt aca gag caa gtg ttt ata gac ggt gac gac act cct tgg 720 Val Tyr Gly Thr Glu Gln Val Phe Ile Asp Gly Asp Asp Thr Pro Trp 225 230 235 240 tca aaa gcc ttc ctt gct tca gca tat gca tca aga gga tta aaa atg 768 Ser Lys Ala Phe Leu Ala Ser Ala Tyr Ala Ser Arg Gly Leu Lys Met 245 250 255 aga ttt aca tct gga act ggt tca gag gct ctt atg gga aat gct gaa 816 Arg Phe Thr Ser Gly Thr Gly Ser Glu Ala Leu Met Gly Asn Ala Glu 260 265 270 ggg aaa tca atg ctt tac ctt gaa gca aga tgt atc tac gta aca aga 864 Gly Lys Ser Met Leu Tyr Leu Glu Ala Arg Cys Ile Tyr Val Thr Arg 275 280 285 ggg tct gga gta caa gga cta caa aat ggt tct gta agc tgc ata ggg 912 Gly Ser Gly Val Gln Gly Leu Gln Asn Gly Ser Val Ser Cys Ile Gly 290 295 300 atg cct ggg tca cta cct gga gga ata agg gct gta ctg gct gaa aac 960 Met Pro Gly Ser Leu Pro Gly Gly Ile Arg Ala Val Leu Ala Glu Asn 305 310 315 320 ctg ata gca atg tta ctt gac tta gaa tgt gca tca gca aat gac cag 1008 Leu Ile Ala Met Leu Leu Asp Leu Glu Cys Ala Ser Ala Asn Asp Gln 325 330 335 aca ttc tct cac tca gaa tat aga agg aca gca aga act cta atg cag 1056 Thr Phe Ser His Ser Glu Tyr Arg Arg Thr Ala Arg Thr Leu Met Gln 340 345 350 atg ctt cct gga aca gac ttc ata ttc tca gga tat agt gcc gta cca 1104 Met Leu Pro Gly Thr Asp Phe Ile Phe Ser Gly Tyr Ser Ala Val Pro 355 360 365 aac tgt gat aac atg ttt gct gga tca aat ttt gat gca gag gat ttt 1152 Asn Cys Asp Asn Met Phe Ala Gly Ser Asn Phe Asp Ala Glu Asp Phe 370 375 380 gat gac tat aat gct ctt cag aga gac ctt aaa ata gac ggt ggt tta 1200 Asp Asp Tyr Asn Ala Leu Gln Arg Asp Leu Lys Ile Asp Gly Gly Leu 385 390 395 400 aaa cct gta act gaa gat gag att gtc aaa gta aga aat aaa gca gcc 1248 Lys Pro Val Thr Glu Asp Glu Ile Val Lys Val Arg Asn Lys Ala Ala 405 410 415 aga gca ata cag ggg tta ttc aaa gaa ctt gat ctt cct gaa ata aca 1296 Arg Ala Ile Gln Gly Leu Phe Lys Glu Leu Asp Leu Pro Glu Ile Thr 420 425 430 gat gaa gaa gtg gaa gca gca aca tat gcc cac gga agt gtt gat atg 1344 Asp Glu Glu Val Glu Ala Ala Thr Tyr Ala His Gly Ser Val Asp Met 435 440 445 cct gca aga aat gtg gtt gaa gat tta aaa gcg gca gaa gaa ctt tta 1392 Pro Ala Arg Asn Val Val Glu Asp Leu Lys Ala Ala Glu Glu Leu Leu 450 455 460 agc tct gga ata aca gga gta gat ctt gtt aaa gga ctt agc aga agc 1440 Ser Ser Gly Ile Thr Gly Val Asp Leu Val Lys Gly Leu Ser Arg Ser 465 470 475 480 gga ttt gac gat gta gct gag cat gtt tta ggt atg tta aaa cag aga 1488 Gly Phe Asp Asp Val Ala Glu His Val Leu Gly Met Leu Lys Gln Arg 485 490 495 gtt tca gga gat tac ctg caa act tca gct ata tta gac aaa ggc ttt 1536 Val Ser Gly Asp Tyr Leu Gln Thr Ser Ala Ile Leu Asp Lys Gly Phe 500 505 510 aaa ata aag agt gcc ata aac gat aga aat gat tac atg ggt cct gga 1584 Lys Ile Lys Ser Ala Ile Asn Asp Arg Asn Asp Tyr Met Gly Pro Gly 515 520 525 agc gga tat aga ata agc gag gaa aga tgg gaa gag atc aaa aat atc 1632 Ser Gly Tyr Arg Ile Ser Glu Glu Arg Trp Glu Glu Ile Lys Asn Ile 530 535 540 cca tca gct ata aaa cca gaa agt ata gaa tag 1665 Pro Ser Ala Ile Lys Pro Glu Ser Ile Glu 545 550 <210> 4 <211> 564 <212> DNA <213> Ilyobacter polytropus <220> <221> CDS <222> (1)..(561) <223> dhaB2 of Ilyobacter polytropus <400> 4 atg gaa aat aaa ttt gta cca tct gta aag ata gaa gaa atc gga gaa 48 Met Glu Asn Lys Phe Val Pro Ser Val Lys Ile Glu Glu Ile Gly Glu 1 5 10 15 gca aaa aaa gga agc aga tct gaa gaa gta gtt ata gga ctg gct cct 96 Ala Lys Lys Gly Ser Arg Ser Glu Glu Val Val Ile Gly Leu Ala Pro 20 25 30 gca ttt aaa aaa ttt caa cat aaa aca ata aca gat gtc cct cac gat 144 Ala Phe Lys Lys Phe Gln His Lys Thr Ile Thr Asp Val Pro His Asp 35 40 45 gaa gtc ctg act gaa ctt atc gca ggt ata gag gaa gag gga tta aag 192 Glu Val Leu Thr Glu Leu Ile Ala Gly Ile Glu Glu Glu Gly Leu Lys 50 55 60 gca aga atc gta aga gta aca aga act tct gat gtt tca ttt atg gcg 240 Ala Arg Ile Val Arg Val Thr Arg Thr Ser Asp Val Ser Phe Met Ala 65 70 75 80 ctg gat gct gca aag tta agt ggt tct gga ata gga ata gga att cag 288 Leu Asp Ala Ala Lys Leu Ser Gly Ser Gly Ile Gly Ile Gly Ile Gln 85 90 95 tca aag gga aca aca gta atc cac caa aag gat ctg ctt cct cta aac 336 Ser Lys Gly Thr Thr Val Ile His Gln Lys Asp Leu Leu Pro Leu Asn 100 105 110 aat cta gaa ctt ttc cca cag gct cca cta tta aca cct gaa aca ttc 384 Asn Leu Glu Leu Phe Pro Gln Ala Pro Leu Leu Thr Pro Glu Thr Phe 115 120 125 aga tta ata gga aaa aat gct gca aaa tat gca aag gga gaa tct cca 432 Arg Leu Ile Gly Lys Asn Ala Ala Lys Tyr Ala Lys Gly Glu Ser Pro 130 135 140 aat cca gta cct gta gcc agt gac cag atg gcg aga cct aaa tat cag 480 Asn Pro Val Pro Val Ala Ser Asp Gln Met Ala Arg Pro Lys Tyr Gln 145 150 155 160 gca aaa gca gca tta cta cat ata aaa gag aca aaa cat gtc gtt caa 528 Ala Lys Ala Ala Leu Leu His Ile Lys Glu Thr Lys His Val Val Gln 165 170 175 cac gga aaa cca gta gag ata aag tat gaa ttt tag 564 His Gly Lys Pro Val Glu Ile Lys Tyr Glu Phe 180 185 <210> 6 <211> 432 <212> DNA <213> Ilyobacter polytropus <220> <221> CDS <222> (1)..(429) <223> dhaB3 of Ilyobacter polytropus <400> 6 atg aat ata gat gtt aaa aat ata aat cca atc tct gat tat cca tta 48 Met Asn Ile Asp Val Lys Asn Ile Asn Pro Ile Ser Asp Tyr Pro Leu 1 5 10 15 gga gaa aag aga aaa gaa tgg ttg aaa aca tcc aca ggt aaa act ttg 96 Gly Glu Lys Arg Lys Glu Trp Leu Lys Thr Ser Thr Gly Lys Thr Leu 20 25 30 gat gaa ata act tta gaa aat gta ata aat gga gat ata aag cct gaa 144 Asp Glu Ile Thr Leu Glu Asn Val Ile Asn Gly Asp Ile Lys Pro Glu 35 40 45 gat ata aga atc tca cct gaa act cta aaa tta cag gga gag ata gca 192 Asp Ile Arg Ile Ser Pro Glu Thr Leu Lys Leu Gln Gly Glu Ile Ala 50 55 60 aag aaa ggt aac agg cca act ata aca aag aac ttt gaa aga gcc agt 240 Lys Lys Gly Asn Arg Pro Thr Ile Thr Lys Asn Phe Glu Arg Ala Ser 65 70 75 80 gaa atg gtt gcc att cca gat gat aaa ata tta gca act tac aac gct 288 Glu Met Val Ala Ile Pro Asp Asp Lys Ile Leu Ala Thr Tyr Asn Ala 85 90 95 ttg aga cct tac aga tct tca aag gaa gaa tta ttt gaa ata gcc gat 336 Leu Arg Pro Tyr Arg Ser Ser Lys Glu Glu Leu Phe Glu Ile Ala Asp 100 105 110 gaa cta gaa agt aag tat tca gct gtt gta ata tct gca ttt atc aag 384 Glu Leu Glu Ser Lys Tyr Ser Ala Val Val Ile Ser Ala Phe Ile Lys 115 120 125 gaa gcc gca gaa gtt tat gaa caa aga ggt caa ctt aga aaa gat t 430 Glu Ala Ala Glu Val Tyr Glu Gln Arg Gly Gln Leu Arg Lys Asp 130 135 140 ag 432

Claims

서열목록 1에 기재된 yqhD 유전자, 서열목록 2에 기재된 ackA 유전자 및 서열목록 3에 기재된 pta 유전자 중에서 어느 하나 이상의 유전자에 변이를 포함하고유기산 합성능을 갖는 대장균 돌연변이체.
제1항에 있어서,
상기 대장균 돌연변이체는 자외선 조사에 의한 돌연변이 과정을 추가로 거치고, 서열목록 4에 기재된 16s 리보솜 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 대장균 돌연변이체.
제1항에 있어서,
상기 대장균 돌연변이체는 기탁번호 KCCM11421P인 것을 특징으로 하는 대장균 돌연변이체.
제1항에 있어서,
상기 유기산은 3-하이드록시프로피온산, 숙신산 및 락트산 중에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 대장균 돌연변이체.
제1항에 있어서,
상기 대장균 돌연변이체는 3-하이드록시프로피온산, 숙신산 및 락트산 중에서 선택된 하나 이상의 유기산에 대한 내성을 지니는 것을 특징으로 하는 대장균 돌연변이체.
제5항에 있어서,
상기 유기산에 대한 내성은 하이드록시프로피온산 5g/l 이상 또는 젖산 15g/l 이상의 농도에서 야생형 또는 모균주에 비하여 세포 생존능이 높은 것을 특징으로 하는 대장균 돌연변이체.
제1항에 있어서,
상기 대장균 돌연변이체는 글리세롤 데히드라타제 폴리펩타이드 또는 디올 데히드라타제 폴리펩타이드를 발현하는 핵산분자를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 대장균 돌연변이체.
제7항에 있어서,
상기 글리세롤 데히드라타제 폴리펩타이드 또는 디올 데히드라타제 폴리펩타이드는 서열목록 5 내지 서열목록 7로 표시되는 폴리펩타이드 또는 서열목록 11 내지 서열목록 13으로 표시되는 폴리펩타이드인 것을 특징으로 하는 대장균 돌연변이체.
제7항에 있어서,
상기 대장균 돌연변이체는 글리세롤 데히드라타제 재활성화 인자 폴리펩타이드 또는 디올 데히드라타제 재활성화 인자 폴리펩타이드를 발현하는 핵산분자를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 대장균 돌연변이체.
제9항에 있어서,
상기 글리세롤 데히드라타제 재활성화 인자 폴리펩타이드 또는 디올 데히드라타제 재활성화 인자 폴리펩타이드는 서열목록 17 및 18로 표시되는 폴리펩타이드 또는 서열목록 21 및 22로 표시되는 폴리펩타이드인 것을 특징으로 하는 대장균 돌연변이체.
제1항에 있어서,
상기 대장균 돌연변이체는 알데히드 데히드로게나제 폴리펩타이드를 발현하는 핵산분자를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 대장균 돌연변이체.
제11항에 있어서,
상기 알데히드 데히드로게나제 폴리펩타이드는 서열목록 25로 표시되는 폴리펩타이드 또는 서열목록 27로 표시되는 폴리펩타이드인 것을 특징으로 하는 대장균 돌연변이체.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 대장균 돌연변이체를 배양하는 단계를 포함하는 유기산 합성방법.
제13항에 있어서,
상기 유기산은 3-하이드록시프로피온산, 숙신산 및 락트산 중에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 유기산 합성방법.