JP2004283176A - 染色体に組込まれた異種遺伝子を高度に発現する組換え細胞 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】その染色体が (a)内因性である第一のプロモータの転写制御下にあるホスト遺伝子中に組み込まれる異種DNA断片であって、該DNA断片は第一のコーディング配列、第二のプロモータ、および該第二のプロモータの転写制御下にある第二のコーディング配列を含んでなり、前記第一のコーディング配列が所望のポリペプチドをコードする異種DNA断片と、(b)前記異種DNA断片の発現を増大させる突然変異であって、該突然変異のない前記ホスト細胞による前記ポリペプチドの産生に比較して、前記ホスト細胞による前記所望のポリペプチドの産生増大をもたらし、且つ前記異種DNA断片の発現増大は、このような発現の増大した細胞を選別する条件の不存在下においても保持される突然変異とを具備している組換えホスト細胞を提供する。
【選択図】なし
Description
(a) ホスト細胞にとって内因性であるプロモータと該内因性プロモータの転写制御下にある異種遺伝子を組込むためのホスト遺伝子とをコードする染色体を具備したホスト細胞を含む培養物を与える工程と、
(b) この培養物中のホスト細胞を異種DNA断片で形質転換する工程であって、該異種DNA断片が
(i) 選別マーカー遺伝子および所望のポリペプチドをコードする遺伝子を含
む複数の遺伝子と、
(ii)相同的組換えによって、前記異種DNA断片によりコードされる複数の
遺伝子の前記ホスト遺伝子内への組込みを可能にするために、前記ホス
ト遺伝子に対して充分に相同的で且つ前記異種DNA断片中に正しく位
置した配列
とを具備する形質転換工程と、
(c) 上記培養物中のホスト細胞またはその子孫について、第一レベル(a first level) で前記選別マーカー遺伝子を発現するものを選別するする工程と、
(d) 工程(c) で選別されたホスト細胞またはその子孫をスクリーニングし、所望のポリペプチドを初期レベルで産生するホスト細胞を得る工程と、
(e) 工程(d) で同定されたホスト細胞またはその子孫を、ホスト細胞染色体中に突然変異が造り出される条件下で、任意に突然変異誘発物質に曝す工程と、
(f) 工程(d) または工程(e) で製造されたホスト細胞またはその子孫を、前記所望のタンパクを前記初期レベルよりも高いレベルで産生するホスト細胞について試験し、前記異種DNA断片の発現を増大させる突然変異菌を得る工程とを具備する。
本発明の内容において「異種」DNA断片とは、該DNA断片が、この異種断片を挿入される細胞の染色体における内因性プロモータよりも下流の、対応する位置での配列とは異なった配列を含むことを意味する。従って、本発明の異種DNA断片には、ホスト染色体の一つの位置から採取されて他の位置(該断片に関する本来のプロモータ以外の内因性プロモータの制御下にある)に挿入されるDNA断片、並びに他の微生物からのDNA断片が含まれる。該異種DNA断片のヌクレオチド配列は一以上の構造遺伝子をコードし、また、例えば原核細胞、真核細胞もしくはウイルのゲノム、または遺伝子工学によって創製された人工的コード配列を含む何れかの遺伝子源から誘導される。
本発明の例示的適用には、E. coli染色体のpf1領域にエタノール産生のためのZ. mobilis 遺伝子を組込むことが含まれる。このpf1遺伝子は正常な醗酵代謝の中心をなし、ホルメート+アセチルCoAへのピルベートの変換を触媒し、生合成のための実質的なアセチル単位源を提供する。この遺伝子の挿入不活性化は、ピルベートを微生物によるエタノールの産生から逸らす競争分岐点の阻害を表わす。また、スクシネート産生を除き、且つRECA遺伝子を不活性化する追加の遺伝子的改良も記述される。
次の培養物は、アメリカ合衆国メリーランド州20852 ロックウイル 12301パークローンドライブのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(ATCC)に寄託されている。表1には、寄託機関によって該培養物に与えられた受付け番号が列記されている。
adhB遺伝子の組込み>:
以下に記載する二つの例に具体化された二つのアプローチは、外来遺伝子(ここではエタノール産生のためのZ. mobilisE遺伝子)が染色体遺伝子(pf1遺伝子によって例示されるもの)中に組込まれるE. coli(ATCC 11303)のようなバクテリア株を構築するために、本発明に従って採用され得る異なった戦略を表わしている。第一のアプローチにおいては、Hamilton et al. によって開発された温度条件付き組込みベクトーの誘導体を使用することが伴われる。Hamilton,C.M., M.Aldea, B.K.Washburn, P.Babitzke, and S.R.Kushner [1989] J.Bacteriol.171:4617-22;および後述の例3を参照のこと。
図3Aおよび図3Bは、10%グルコースでのKO2 およびATCC 11303(pLOI297 )による醗酵の比較を示している。KO1 株による醗酵はKO2 による醗酵と同一であり、提示されていない。これらの新規な構築物は、低い容量生産性(volumetric productivity) およびエタノール収率(表2)に示されるように、極めて非効率的なエタノール産生体である。増殖はATCC 11303(pLOI297 )の半分未満に制限され、また72時間後でも4g/リットルのエタノールしか産生されなかった。KO3 株はKO1 およびKO2 よりも若干良好ではあるが、依然として極めて貧弱なエタノール産生体である(図3C−D;表2)。
による発現の増大>
アルデヒド指示プレート上で観察されたピンクの発現型は、エタノール産生のための Z. mobilis遺伝子の発現が不十分であることを示していると思われる。当該技術において周知の標準的条件下でのエチルメタンスルホネートを用いた突然変異誘発の後に、アルデヒド指示プレート上での暗赤色の発現型をスクリーニングスルことによって、KO2 に組込まれた遺伝子の発現増大を生じる突然変異が得られた。一つのプレートに 200-400のコロニーを有する約200 のプレートを分析した。四つの暗赤色コロニーが単離され、色が濃くなったことによってADHIIの発現増大が示された。
図3Cおよび図3Dは、KO4 およびKO5 による10%グルコースの醗酵を示している。この二つの株は、高レベルの抗生物質に対する耐性を選別することによって、組込まれたエタノール産生遺伝子の発現を増大させる突然変異が同時に選別されたものである。二つの株は同一であり、KO4 による醗酵のみがプロットされている。これら改良された構築物による増殖、細胞収率およびエタノール収率は、プラスミドに基づく構築物であるATCC 11303(pLOI297 )のそれに殆ど等価であった。表2を参照のこと。初期段階の容量生産性によって、また30時間後に達成されるエタノールレベルによって示されるエタノール生成速度はATCC 11303(pLOI297 )よりもやや遅かったが、KO4 およびKO5 での理論収率は高く、添加されたグルコースに基づく 100%を越えていた。この遅い醗酵の際の高収率は、複合栄養物がピルベート(従ってエタノール)に同時異化されることを反映している。これらの複合栄養物は、生合成のための主要な窒素源として役立つ。糖が消費され尽くした後の継続する脱窒素によって、KO4 、KO5 およびATCC 11303(pLOI297 )でのpHの上昇を生じた。このようなpH上昇は、糖の消費をモニターするための便利な方法を提供する。
嫌気的増殖の際の、pf1遺伝子生成物は酢酸産生の主要ルートであり、また生合成のための主要なアセチルCoA源であることが示されている。Z. mobilis エタノール経路遺伝子による挿入不活性化は、ATCC 11303の誘導体における脂質合成のためのアセテート欠乏を導き得る。酢酸ナトリウムを補充することによってエタノール産生速度が改善され、収率が僅かに増大されることが見出された(図3CおよびD;表2)。
選別された組換え株のフレンチプレス抽出物において、Z. mobilis PDCの比活性が測定された。PDCは比較的熱に安定な酵素であり、活性は、このような測定を複雑にする天然のE. coli活性を熱で不活性化した後の抽出物において測定された。対照株のATCC 11303には活性が検出されなかった。KO2 およびKO3 の両者は、0.2 U/mgの低レベルの活性を生じた。高Cm耐性の突然変異体であるKO4 の抽出物には、10倍も高い活性(2.1 U/mgタンパク)が存在した。KO4 におけるPDCのレベルは、プラスミドに基づく構築物のATCC 11303(pLOI297 )中で産生されるレベルと殆ど等価であり、天然のZ. mobilis 中に見られレベル(Ingram,L.L., and T.Conway [1988] Appl.Environ.Microbiol. 54:397-404 )と同様であった。
醗酵の間に、E. coliのエタノール産生株によって著しい量の塩基が消費され(表2)、同時生成物としての酸の生成が示された。表3に示すように、高レベルのこれら酸は、ATCC 11303親株およびKO3 株によって産生される。
のE. coli中における安定性の比較>:
ATCC 11303(pLOI297 )、KO4 およびKO5 が、抗生物質選別を伴わずに、10%(w/v )を含むルリアブロス中において30℃で68世代まで増殖された。48時間後および120 時間後に、培養物は選別プレート、非選別プレートおよびアルデヒド指示プレート上に撒かれ、全CFUに対するCm耐性CFUの比ならびにエタノール産生コロニーの比率が測定された。表4は、KO4 およびKO5 の挿入された遺伝子が、染色体挿入物として安定に保持されたことを示している。
recA突然変異はKO4 およびKO11にも導入され、これら株は組換えプラスミドのホストとして使用された。得られた株は、夫々KO10およびKO12と命名された。このrecA突然変異は酢酸、乳酸またはコハク酸の産生には影響しなかったが、recA、frd突然変異体(KO12)における増殖および遅い醗酵を減少させた(表2)。この影響の基礎は知られておらず、構築の間に創製された二次的突然変異を表わしているかもしれない。
本発明は、ここに特別に例示したadhおよびpdc遺伝子以外の遺伝子を用いて実施することができる。グリコリシスの酵素は、主要な配列に関してかなりの保存性を示すことが確立されている。例えば、Conway, Swell, and Ingram [1987] J.Bacteriol. 169:5653-5662 を参照のこと。この高レベルの保存性は、当業者が、酵素ファミリーの一以上のメンバーからの主要な情報を用いて、機能的に等価で且つ遺伝子的に関連した酵素を他の微生物から単離することを可能にする。実際に、Z. mobilis pdc 及び S.cerevisiae のpdc に関する本件発明者の情報をDNAプローブの設計に用いて、とうもろこし由来のピルベートデカルボキシラーゼ遺伝子をクローン化するために、丁度このようなアプローチが成功裡に用いられている。Kelly,P.M. [1989] Plant Molecular Biology 13:213-222を参照のこと。また、全体の遺伝子をプローブとして用いる他の戦略も使用され得る。従って、本発明の目的にとっては、ピルベートデカルボキシラーゼ活性が、本発明で例示したように Z. mobilisからの遺伝子によって与えられるか、或いは同一の酵素活性を指示するコーン由来の遺伝子(既にクローン化され、配列決定されている)、酵母または他の微生物由来の遺伝子によって提供されるかということは問題ではない。また、本発明を実施するために、アルコールデヒドロゲナーゼ活性がウマ、酵母、ヒトもしくは昆虫由来の遺伝子によって与えられるか、或いは他のバクテリア遺伝子から与えられるかも問題ではない。アルコールデヒドロゲナーゼ活性の発現はアルデヒド指示プレート上で直接観察され得るから、配列情報は必ずしも、この酵素活性を示す蛋白をコードする追加の遺伝子を単離するための最良のアプローチではないであろう。しかしながら、このような単離のために配列が用いられるか否かは、現実的には重要ではない。実際に、多くのアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子が既に入手されており、多くの論文で良く説明されている。
ある種のバクテリアおよび他の単純な生命体は、ヘキソース、ペントース及び乳糖を含む広範囲の基質を活発に代謝することができる。この特徴が、E. coliを組換DNA製造法のための魅力的なホストにしている。ここに記載される発明は、種々のバイオマス源、特に木および非食用植物の主要部分をなすヘミセルロース(キシロース、アラビノース及び他の糖を含む)並びにホエー(乳糖)のような未利用バイオマス(under utilized biomass)から、エタノールの経済的に製造するために、組換えバクテリア株を使用することを可能にする。また、複合ポリマーを分解する細胞外酵素の産生のような特殊な能力をもった微生物が、本発明に従ってエタノール産生体に変換され得る。
含む組込みプラスミドの構築
この例を通して、特に言及しない限りは次の材料および方法が用いられた。全ての遺伝子構築物のために、 E. coli TC4 が用いられた。Conway,T., Y.A.Osman, J.I.Konnan, E.M.Hoffman, and L.O.Ingram [1987] J.Bacteriol.169:949-954を参照のこと。全ての増殖実験において、選別のための適切な抗生物質および指示濃度のグルコースを含むルリアブロスが用いられた。特に言及した場合を除き、抗生物質は次の最終濃度で用いられた:アンピシリンは50μg/ml;クロラムフェニコール(Cm)は指示に従って20μg/mlまたは 600μg/ml;テトラサイクリンは12.5μg/ml。Z. mobilis ADHIIを発現する組換えE. coliによって、エタノールから生成されたアルデヒドを検出するために、シッフ試薬を含むADH指示プレートが用いられた。Conway,T., G.w.Sewell, Y.A.Osman, and L.O.Ingram [1987] J.Bacteriol. 169:2591-2597を参照のこと。
よびプラスミド複製のための温度感受性を含む組込
みプラスミドの構築
プラスミドpLOI295 をEcoRIおよびSAlIで消化し、pdcおよびadhB遺伝子を有する3.2-kbのEcoRI- SAlIフラグメントを、DNAポリメラーゼのクレノウフラグメントで処理して平滑末端を形成した。この平滑末端フラグメントを、転写に関して同じ向きの不完全なpf1遺伝子をもった、 pLOI513のクレノウ処理されたしたBamHI部位にライゲートしてpLOI542 を得た。次に、pLOI542 はSAlIで消化され、7.2-kbのSAlIフラグメントは、温度感受性のレプリコンおよびCm遺伝子を含むpMAK705 のポリリンカーにおけるSAlI部位にライゲートされた(図2)。Hamilton,C.M., M.Aldea, B.K.Washburn, P.Babitzke, and S.R.Kushner [1989] J.Bacteriol. 171:4617-4622 を参照のこと。得られたプラスミド pLOI543は、相同性組換えによってE. coli染色体中に組み込まれた(以下の例3を参照のこと)。
Z. mobilis pdc及びadhB遺伝子のE. coli B
における染色体への組込み
組換えプラスミド pLOI543(これは30℃で複製するが44℃では複製しない)を用いることにより、E. coli BをCm遺伝子で形質転換し、クロラムフェニコール耐性を与えた。形質転換された細胞は、20μg/mlのクロラムフェニコール及び5%(w/v )のグルコースを含む 100mlのルリアブロス中において44℃で24時間増殖され、染色体中へのプラスミドの組込みについて選別された。この培養物の一部(0.1 ml)を稀釈し、該稀釈された細胞懸濁液が、5%(w/v )グルコースを含み且つクロラムフェニコールを含まない 100 ml のルリアブロスを接種するために用いられた。この培養物は、切除を行なうために30℃で12時間増殖された。培養物の一部(0.1 ml)を稀釈し、これを 100 ml の新鮮な培地に接種することによって、2回以上の増殖サイクルが実行された。次いで、12時間培養物の稀釈された細胞懸濁液を用いて5% (w/v )グルコースを含むルリアブロスを接種し、プラスミドを除去するために44℃でインキュベートされた。最後に、該培養物の稀釈系列を2%(w/v )グルコースを含むルリア寒天プレート上に撒き、30℃で増殖させることによって、単一のコロニーが単離された。プレート上に現れた単一のコロニーは、アルデヒド指示プレートを用いることによってエタノール産生遺伝子についてスクリーニングされ、またクロラムフェニコールに対する感受性によりプラスミドの喪失についてスクリーニングされた。クロラムフェニコールに対して感受性であるが、エタノール産生遺伝子を含んでいる二つのクローン、即ち、KO1 株およびKO2 株が選別された。これらのクローンは、アルデヒド指示プレート上でピンクのコロニーを生成した。
Z. mobilis pdc及びadhB遺伝子のE. coli B
における染色体への組込み
プラスミド pLOI510がSAlIで消化され、不完全なpf1遺伝子を含んだ8.6-kbのSAlI断片が、低DNA濃度での自己ライゲーションによって環化された。共有結合的に閉館されたDNAフラグメントは、自立的な複製を可能とする配列を欠いていた。E. coli Bは、20μg/mlのクロラムフェニコールに対する耐性について選別することによって、このライゲーション混合物で形質転換された。クロラムフェニコール耐性の形質転換体におけるadhB遺伝子の発現は、クロラムフェニコールプレートからのコロニーを、ADH指示プレート上に撒くことによって確認された。単一のクローンが更なる特徴付けのために選別され、KO3 と命名された。プラスミドに担持されたadh遺伝子またはクロラムフェニコール耐性遺伝子が欠失していることは、DNAプレパレーションに形質転換体が存在しないこと、およびアガロースゲル上での直接分析によって確認された。このクローンは、アルデヒド指示プレート上でピンクのコロニーを生成した。
pdcおよびadhB遺伝子の発現を増大させる
突然変異の創製および検出
例3においては、ホスト細胞を形質転換させるために用いたDNA断片上のエタノール遺伝子に付随した抗生物質耐性遺伝子の喪失をもたらす条件下で、Z. mobilis pdcおよびadhB遺伝子のE. coli Bにおける染色体への組込みが行なわれた。例3の方法によって得られたKO2 株が、バクテリア遺伝子学の技術で周知の標準的条件下で、メチルメタンスルホネートを用いて突然変異誘発された。突然変異誘発されて生き残った細胞(約4-8 ×104 )を、1プレート当たり 200-400コロニーでアルデヒド指示プレート上に撒いた。ADHIIの増大した発現を示す四つの暗赤色コロニーが単離され、後記の例8で説明するようにしてエタノール産生が試験された。これらの突然偏位体のうち、エタノール産生収率が最も高いものをKO20株と命名した。
することによる、Z. mobilis pdcおよびadhB
遺伝子の発現を増大させる突然変異の選別
例4において、Z. mobilis pdc及びadhB遺伝子のE. coli Bにおける染色体への組込みが、ホスト細胞を形質転換するために用いたDNA断片上のエタノール遺伝子に付随した抗生物質耐性遺伝子の保持がもたらされる条件下で行なわれた。例4の方法で得られたKO3 株の稀釈系列を、2%グルコース及び 600μg/mlのクロラムフェニコールを含んだルリア寒天プレート上に撒いた。一晩インキュベートした後に、撒かれた細胞100,000 個当たり略一つの頻度で、大きな脂肪コロニーが観察された。これらの大きなコロニーはアルコールを産生し、アルコール指示プレート上での試験において明赤色を呈した。KO4 およびKO5 の二つの株について更に研究が行なわれた。
E. coli株JC10240 におけるrecA突然変異が、Cm及びテトラサイクリンの両者に対する耐性(Tn10付近の)についての選別によって、KO4 株およびKO5 株に導入された。recA発現型の同時遺伝(co-inheritance)は、UV感受性の増大によって確認された。
<醗酵実験>:
醗酵は、10%(w/v) グルコースまたは8%(w/v) キシロースを補充したルリアブロス中で行なわれた。350 mlの培地を収容したフリーカ(500-ml, Fisher Scientific Company, Orlando, FL)に、適切に穿孔されたゴムキャップを介してpH電極、ガス出口およびサンプリング口を設けた。塩基 (2N KOH)の添加により6.0 のpHを維持するために、pHコントローラ(Jenco model 3671;Whatman Lab Sales, Hillsboro, OR)が用いられた。1.25インチの星型磁石棒(100 rpm )で連続的に撹拌しながら、 30 ℃でのバッチ醗酵を繰り返し行なった。
72時間の醗酵の後、有機酸分析のためにサンプルが取り出された。揮発性酸および非揮発性酸は、Hewlett-Packard 3390A インテグレータに接続されたGow-Mac Series 580ガスクロマトグラフ(Gow-Mac Instrument Company,Bridgewater,NJ )を用いて、ガス- 液体クロマトグラフィーによって測定された。非揮発性酸は、分析の前にメチルエステルに変換された。
(SDS−PAGE)>:
細胞は、醗酵条件の下で24時間増殖され、0℃に冷却され、遠心分離(7,000 ×G、10分)によって回収され、10 mM の2-メルカプトエタノールを含んだ 1/3容量の5mMのリン酸ナトリウム緩衝液で2回洗浄し、-20 ℃で凍結保存した。細胞ペレットは等容量の緩衝溶液中に再懸濁され、20,000 psiでフレンチプレッシャーセルに2回通すことによって破壊された。膜類は、100,000 ×Gで90分間遠心することによって除去された。上清は、8%アクリルアミド変性ドデシル硫酸ナトリウムゲルを用、Biorad Mini-Protein II電気泳動ユニット(Biorad Laboratories, Richmond,CA)で分離された。タンパクは、ブラッドフォード試薬で測定された。Bradford,M.M. [1979] Mol.Gen.Genet.181:548-551を参照のこと。夫々のレーンには略20μgのタンパクが負荷された。
PDC活性は、例えば、Conway,T., Y.A.Osman, J.I.Konnan, E.M.Hoffmann and L.O.Ingram [1987] J.Bacteriol. 169:949-954 に記載されているようにして、熱処理されたフレンチプレス抽出物中で測定された。熱処理は、詰抗する天然の酵素(これは組換E. coliにおけるPDCの測定を複雑にする)を不活性化するために用いられた。
Claims (34)
- 組換え腸内バクテリアホスト細胞であって、その染色体が
(a)第一のプロモータの転写制御下にあるホスト遺伝子中に組み込まれる異種DNA断片であって、該DNA断片は第一のコーディング配列、第二のプロモータ、および該第二のプロモータの転写制御下にある第二のコーディング配列を含んでなり、また前記ホスト遺伝子および前記第一のプロモータは前記ホスト細胞にとって内因性であり、且つ前記DNA断片の前記第一のコーディング配列が該内因性プロモータの転写制御下にあり、前記第一のコーディング配列が所望のポリペプチドをコードする異種DNA断片と、
(b)前記異種DNA断片の発現を増大させる突然変異であって、該突然変異のない前記ホスト細胞による前記ポリペプチドの産生に比較して、前記ホスト細胞による前記所望のポリペプチドの産生増大をもたらし、且つ前記異種DNA断片の発現増大は、このような発現の増大した細胞を選別する条件の不存在下においても保持される突然変異とを具備している組換えホスト細胞。 - 請求の範囲第1項に記載の組換えホスト細胞であって、前記第一のコーディング配列が複数のポリペプチドをコードする細胞。
- 請求の範囲第2項に記載の組換えホスト細胞であって、前記第二のコーディング配列が選別マーカータンパク質をコードする細胞。
- 請求の範囲第3項に記載の組換えホスト細胞であって、前記選別マーカータンパク質の発現が前記細胞に対して抗生物質耐性を与える細胞。
- 請求の範囲第4項に記載の組換えホスト細胞であって、前記選別マーカータンパク質の発現が前記細胞に対してクロラムフェニコール耐性を与える細胞。
- 請求の範囲第1項に記載の組換えホスト細胞であって、前記異種DNA断片は、前記ホスト細胞内においてピルベート・ホルメート- リアーゼ(pf1)遺伝子が発現されるレベルで発現される遺伝子の、内因性プロモータの転写制御下にある細胞。
- 請求の範囲第6項に記載の組換えホスト細胞であって、前記内因性プロモータがピルベート・ホルメート- リアーゼ(pf1)遺伝子のプロモータである細胞。
- 請求の範囲第1項に記載の組換えホスト細胞であって、前記異種DNA断片がアルコールデヒドロゲナーゼ及びピルベートデカルボキシラーゼをコードする細胞。
- 請求の範囲第8項に記載の組換えホスト細胞であって、前記アルコールデヒドロゲナーゼ及びピルベートデカルボキシラーゼが Zymomonas mobilis由来の遺伝子によってコードされる細胞。
- 所定の方法の産物である細胞株であって、該所定の方法が、
(a) ホスト細胞にとって内因性である第一のプロモータと該第一のプロモータの転写制御下にあるホスト遺伝子とをコードする染色体を具備したホスト腸内バクテリア細胞を含む培養物を与える工程と、
(b) 前記培養物中のホスト細胞をDNA分子で形質転換する工程であって、
該DNA分子は、所望のポリペプチドをコードする第一のコーディング配列、第二のプロモータ、および該第二のプロモータの転写制御下にある選別マーカータンパク質をコードする第二のコーディング配列を含んだ異種DNA断片であり、
かつ前記第一のコーディング配列が前記内因性のプロモータの転写制御下にあるように、相同性組換えによって、前記異種DNA断片の前記ホスト遺伝子内への組込みを生じる形質転換工程と、
(c) 工程(b) で製造された、前記第二のコーディング配列によってコードされる選別マーカータンパク質を第一レベルで発現するホスト細胞を選別する工程と、
(d) 工程(c) で得られたホスト細胞をスクリーニングし、前記所望のポリペプチドを初期レベルで産生するホスト細胞を得る工程と、
(e) 工程(d) で同定されたホスト細胞を、前記染色体中に突然変異が創製される条件下で、任意に突然変異誘発物質に曝す工程と、
(f) 工程(d) または工程(e) で製造されたホスト細胞を、前記所望のポリペプチド又は前記選別マーカーポリペプチドを前記初期レベルよりも高いレベルで産生するホスト細胞について試験することにより、前記異種DNA断片の発現を増大させる突然変異であって、該突然変異のない前記ホスト細胞による前記DNA断片にコードされる全てのポリペプチドの産生に比較して、前記ホスト細胞による前記DNA断片にコードされる全てのポリペプチドの産生増大をもたらし、且つ前記異種DNA断片の発現増大が、このような発現の増大した細胞を選別する条件の不存在下においても保持される突然変異をもったホスト細胞を得る工程とを具備した細胞株。 - 請求の範囲第10項に記載の細胞株であって、前記方法が更に、
(i) 工程(b) において、前記DNA分子が複製能力のない閉環状DNAを具備することと、
(ii)工程(f) において、前記ホスト細胞の試験が、工程(d) または工程(e) で製造されたホスト細胞について、前記選別マーカータンパク質を前記第一レベルよりも高い第二レベルで発現するものを選別し、次いで前記選別マーカータンパク質を前記第二レベルで発現する前記ホスト細胞を、所望のポリペプチドを前記初期レベルよりも高いレベルで産生するホスト細胞についてスクリーニングすることとを具備した細胞株。 - 請求の範囲第10項に記載の細胞株であって、前記選別マーカータンパク質が、前記ホスト株にクロラムフェニコールに対する耐性を与える細胞株。
- 請求の範囲第12項に記載の細胞株であって、前記選別マーカータンパク質の前記第一レベルの発現が、少なくとも20μg/mlのクロラムフェニコールに対する耐性を与える細胞株。
- 請求の範囲第12項に記載の細胞株であって、前記選別マーカータンパク質の前記第一レベルの発現が少なくとも20μg/mlのクロラムフェニコールに対する耐性を与え、前記選別マーカータンパク質の前記第二レベルの発現が少なくとも 100μg/mlのクロラムフェニコールに対する耐性を与える細胞株。
- 請求の範囲第10項に記載の細胞株であって、前記選別マーカータンパク質をコードする第二のコーディング配列が、前記所望のポリペプチドをコードする前記第一のコーディング配列の下流にある前記異種DNA断片内に位置した第二のプロモータの転写制御下にある細胞株。
- 請求の範囲第15項に記載の細胞株であって、前記異種DNA断片が転写ターミネータを更に具備し、該転写ターミネータが前記所望のポリペプチドをコードする第一のコーディング配列と前記選別マーカータンパク質をコードする第二のコーディング配列との間に位置している細胞株。
- 請求の範囲第10項に記載の細胞株であって、前記第一のプロモータは、前記ホスト細胞内においてピルベート・ホルメート- リアーゼ(pf1)遺伝子が発現されるレベルで発現される遺伝子の内因性プロモータである細胞株。
- 請求の範囲第17項に記載の細胞株であって、前記第一のプロモータがピルベート・ホルメート- リアーゼ(pf1)遺伝子のプロモータである細胞株。
- 請求の範囲第10項に記載の細胞株であって、前記異種DNA断片が、アルコールデヒドロゲナーゼ及びピルベートデカルボキシラーゼをコードする細胞株。
- 請求の範囲第19項に記載の細胞株であって、前記アルコールデヒドロゲナーゼ及び前記ピルベートデカルボキシラーゼが Zymomonas mobilis由来の遺伝子によってコードされる細胞株。
- 高レベルの所望のポリペプチドを産生する組換えホスト細胞株を製造する方法であって、
(a) ホスト細胞にとって内因性である第一のプロモータと該第一のプロモータの転写制御下にあるホスト遺伝子とをコードする染色体を具備したホスト腸内バクテリア細胞を含む培養物を与える工程と、
(b) 前記培養物中のホスト細胞をDNA分子で形質転換する工程であって、
該DNA分子は、所望のポリペプチドをコードする第一のコーディング配列、第二のプロモータ、および該第二のプロモータの転写制御下にある選別マーカータンパク質をコードする第二のコーディング配列を含んだ異種DNA断片であり、
かつ前記第一のコーディング配列が前記内因性の第一のプロモータの転写制御下にあるように、相同性組換えによって、前記異種DNA断片の前記ホスト遺伝子内への組込みを生じる形質転換工程と、
(c) 工程(b) で製造された、前記第二のコーディング配列によってコードされる選別マーカータンパク質を第一レベルで発現するホスト細胞を選別する工程と、
(d) 工程(c) で得られたホスト細胞をスクリーニングし、前記所望のポリペプチドを初期レベルで産生するホスト細胞を得る工程と、
(e) 工程(d) で同定されたホスト細胞を、前記染色体中に突然変異が創製される条件下で、任意に突然変異誘発物質に曝す工程と、
(f) 工程(d) または工程(e) で製造されたホスト細胞を、前記所望のポリペプチド又はマーカーポリペプチドを前記初期レベルよりも高いレベルで産生するホスト細胞について試験することにより、前記異種DNA断片の発現を増大させる突然変異であって、該突然変異のないホスト細胞による前記DNA断片にコードされた全てのポリペプチドの産生に比較して、前記ホスト細胞による前記DNA断片にコードされる全てのポリペプチドの産生増大をもたらし、且つ前記異種DNA断片の発現増大は、このような発現の増大した細胞を選別する条件の不存在下においても保持される突然変異をもったホスト細胞を得る工程とを具備した方法。 - 請求の範囲第21項に記載の方法であって、前記方法が更に、
(i) 工程(b) において、前記DNA分子が複製能力のない閉環状DNAを具備することと、
(ii)工程(f) において、前記ホスト細胞の試験が、工程(d) または工程(e) で製造されたホスト細胞について、前記選別マーカータンパク質を前記第一レベルよりも高い第二レベルで発現するものを選別し、次いで前記選別マーカータンパク質を前記第二レベルで発現する前記ホスト細胞を、所望のタンパク質を前記初期レベルよりも高いレベルで産生するホスト細胞についてスクリーニングすることとを具備した方法。 - 請求の範囲第21項に記載の方法であって、前記選別マーカータンパク質が、前記ホスト細胞株にクロラムフェニコールに対する耐性を与える方法。
- 請求の範囲第23項に記載の方法であって、前記選別マーカータンパク質の前記第一レベルの発現が、少なくとも20μg/mlのクロラムフェニコールに対する耐性を与える方法。
- 請求の範囲第23項に記載の方法であって、前記選別マーカータンパク質の前記第一レベルの発現が少なくとも20μg/mlのクロラムフェニコールに対する耐性を与え、前記選別マーカータンパク質の前記第二レベルの発現が少なくとも 100μg/mlのクロラムフェニコールに対する耐性を与える方法。
- 請求の範囲第21項に記載の方法であって、前記選別マーカータンパク質をコードする第二のコーディング配列が、前記所望のポリペプチドをコードする第一のコーディング配列の下流にある前記異種DNA断片内に位置した前記第二のプロモータの転写制御下にある方法。
- 請求の範囲第26項に記載の方法であって、前記異種DNA断片が転写ターミネータを更に具備し、該転写ターミネータが、前記所望のポリペプチドをコードする第一のコーディング配列と前記選別マーカータンパク質をコードする第二のコーディング配列との間に位置している方法。
- 請求の範囲第21項に記載の方法であって、前記第一のプロモータが、前記ホスト細胞内においてピルベート・ホルメート- リアーゼ(pf1)遺伝子が発現されるレベルで発現される遺伝子の内因性プロモータである方法。
- 請求の範囲第28項に記載の方法であって、前記第一のプロモータがピルベート・ホルメート- リアーゼ(pf1)プロモータである方法。
- 請求の範囲第21項に記載の方法であって、前記異種DNA断片がアルコールデヒドロゲナーゼ及びピルベートデカルボキシラーゼをコードする方法。
- 請求の範囲第30項に記載の方法であって、前記アルコールデヒドロゲナーゼ及び前記ピルベートデカルボキシラーゼが Zymomonas mobilis由来の遺伝子によってコードされる方法。
- 請求の範囲第9項に記載の組換えホスト細胞であって、前記第一のプロモータはピルベート・ホルメート- リアーゼ(pf1)遺伝子のプロモータであり、また前記細胞はグルコース又はキシロースの醗酵によって、添加された糖のエタノールへの少なくとも90%の変換に対応する理論収率で、エタノールを産生できる細胞。
- 請求の範囲第20項に記載の株であって、前記第一のプロモータはピルベート・ホルメート- リアーゼ(pf1)遺伝子のプロモータであり、また前記細胞はグルコース又はキシロースの醗酵によって、添加された糖のエタノールへの少なくとも90%の変換に対応する理論収率で、エタノールを産生できる株。
- 請求の範囲第30項に記載の方法であって、前記第一のプロモータはピルベート・ホルメート- リアーゼ(pf1)遺伝子のプロモータであり、また前記細胞はグルコース又はキシロースの醗酵によって、添加された糖のエタノールへの少なくとも90%の変換に対応する理論収率で、エタノールを産生できる方法。
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