JPH06504436A - 染色体に組込まれた異種遺伝子を高度に発現する組換え細胞 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 １１、請求の範囲第１０項に記載の組換えホスト細胞であって、前記プロモータ がピルベート−ホルメート−リアーゼ（ｐｆｌ）プロモータである細胞。

１２、請求の範囲第１項に記載の組換えホスト細胞であって、前記異種ＤＮＡ断 片がアルコールデヒドロゲナーゼ及びピルベートデカルボキシラーゼをコードす る細胞。

１３、請求の範囲第１２項に記載の組換えホスト細胞であって、前記アルコール デヒドロゲナーゼ及びピルベートデカルボキシラーゼがｚｙｍｏｍｏｎａｓ　ｍ ｏｂｉｌｉｓ由来の遺伝子によってコードされる細胞。

１４、請求の範囲第１３項に記載の組換えホスト細胞であって、前記細胞はグル コース又はキシロースの醗酵によって、添加された糖のエタノールへの少なくと も約１００％の変換に対応する理論収率で、エタノールを産生できる細胞。

１５、請求の範囲第１２項に記載の組換えホスト細胞であって、前記染色体が更 に、スクシネート産生を阻害する突然変異を有している細胞。

１６、請求の範囲第１５項に記載の組換えホスト細胞であって、スクシネート産 生を阻害する前記突然変異が、フマレートレダクターゼ（ｆｒｄ）遺伝子におけ る突然変異を含んでいる細胞。

１７、請求の範囲第１項に記載の組換えホスト細胞であって、前記染色体が更に 、前記ホスト細胞内における組換えを阻害する突然変異を有している細胞。

１８、請求の範囲第１７項に記載の組換えホスト細胞であって、組換えを阻害す る前記突然変異がｒｅｃＡ遺伝子における突然変異を含んでいる細胞。

１９、所定の方法の産物である細胞株であって、該所定の方法が、 （ａ）ホスト細胞にとって内因性であるプロモータと該内因性プロモータの転写 制御下にあるホスト遺伝子とをコードする染色体を具備したホスト細胞を含む培 養物を与える工程と、 （ｂ）前記培養物中のホスト細胞を異種ＤＮＡ断片で形質転換する工程であって 、該異種ＤＮＡ断片が（１）選別マーカー遺伝子および所望のポリペプチドをコ ードする遺伝子を含む複数の遺伝子と、（１１）相同的組換えによって、前記異 種ＤＮＡ断片によりコードされる前記複数の遺伝子の前記ホスト遺伝子内への組 込みを可能にするために、前記ホスト遺伝子に対して充分に相同的で且つ前記異 種ＤＮＡ断片中に正しく位置した配列 とを具備する形質転換工程と、 （ｃ）前記培養物中のホスト細胞またはその子孫について、第一レベル（ａ　ｆ ｉｒｓｔ　１ｅｖｅｌ）で前記選別マーカー遺伝子を発現するものを選別する工 程と、 （ｄ）工程（Ｃ）で選別されたホスト細胞またはその子孫をスクリーニングし、 前記所望のポリペプチドを初期レベルで産生ずるホスト細胞を得る工程と、 （ｅ）工程（ｄ）で同定されたホスト細胞またはその子孫を、前記染色体中に突 然変異が創製される条件下で、任意に突然変異誘発物質に曝す工程と、 （１）工程（ｄ）または工程（ｅ）で製造されたホスト細胞またはその子孫を、 前記所望のタンパクを前記初期レベルよりも高いレベルで産生ずるホスト細胞に ついて試験することにより、前記異種ＤＮＡ断片の発現を増大させる突然変異で あって、該突然変異のない前記ホスト細胞による前記ポリペプチドの産生に比較 して、前記ホスト細胞による前記所望のポリペプチドの産生増大をもたらし、且 つ前記異種ＤＮＡ断片の発現増大は、このような発現の増大した細胞を選別する 条件の不存在下においても保持される突然変異をもったホスト細胞を得る工程と を具備している細胞株。

２０、請求の範囲第１９項に記載の細胞株であって、前記方法が更に、 （ｉ）工程（ｂ）において、前記異種ＤＮＡ断片には更に、複製が温度感受性で あるレプリコンを含むプラスミドを有することと、 （２）工程（ｂ）において、前記ホスト細胞の形質転換には更に、前記異種ＤＮ Ａ断片をホスト細胞内に導入することと、このホスト細胞を、前記選別マーカー 遺伝子を第一レベルで発現する細胞が選別される条件下で、且つ前記プラスミド が複製されない温度で増殖させることとが具備され、これにより前記ＤＮＡ断片 が相同性組換えによって前記染色体の前記ホスト遺伝子内に組込まれることと、 （ｉｉｉ）工程（Ｃ）において、前記ホスト細胞の選別には更に、前記選別マー カー遺伝子を第一レベルで発現する前記ホスト細胞を、前記選別マーカー遺伝子 を発現する細胞が選別されない条件下で増殖させることが具備され、ここで前記 ホスト細胞は前記プラスミドが複製される第一温度での非選別条件下で増殖され て、前記プラスミド及び前記選別マーカー遺伝子の前記ホスト遺伝子からの切除 がもたらされ、また前記ホスト細胞は、次いで前記プラスミドが複製されない第 二温度での非選別条件下において増殖され、前記選別マーカー遺伝子および前記 プラスミドの不存在下で前記所望のポリペプチドをコードする遺伝子を保持した ホスト細胞がもたらされることとを具備した細胞株。

２１、請求の範囲第１９項に記載の細胞株であって、前記方法が更に、 （ｉ）工程（ｂ）において、前記異種ＤＮＡ断片が複製能力のない閉環状ＤＮＡ を具備することと、（１１）工程（１）において、前記ホスト細胞の試験が、工 程（ｄ）または工程（ｅ）で製造されたホスト細胞またはその子孫について、前 記選別マーカー遺伝子を前記第一レベルよりも高い第ニレベルで発現するものを 選別し、次いで前記選別マーカー遺伝子を前記第ニレベルで発現する前記ホスト 細胞を、所望のタンパクを前記初期レベルよりも高いレベルで産生ずるホスト細 胞についてスクリーニングすることとを具備した細胞株。

２２、請求の範囲第１９項に記載の細胞株であって、前記ホスト細胞株が微生物 細胞株である細胞株。

２３、請求の範囲第１９項に記載の細胞株であって、前記選別マーカータンパク が、前記ホスト細胞株にクロラムフェニコールに対する耐性を与える細胞株。

２４、請求の範囲第１９項に記載の細胞株であって、前記選別マーカー遺伝子の 前記第一レベルの発現が、少なくとも約２０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコール に対する耐性を与える細胞株。

２５、請求の範囲第２２項に記載の細胞株であって、前記選別マーカー遺伝子の 前記第一レベルの発現が少なくとも約２０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールに 対する耐性を与え、前記選別マーカータンパクの前記第ニレベルの発現が少なく とも約１００μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールに対する耐性を与える細胞株。

２６、請求の範囲第１９項に記載の細胞株であって、前記選別マーカ遺伝子が、 前記所望のポリペプチドをコードする遺伝子の下流にある前記異種ＤＮＡ断片内 に位置したプロモータの転写制御下にある細胞株。

２７、請求の範囲第２６項に記載の細胞株であって、前記異種ＤＮＡ断片が転写 ターミネータを更に具備し、該転写ターミネータが前記所望のポリペプチドをコ ードする遺伝子と前記選別マーカー遺伝子との間に位置している細胞株。

２８、請求の範囲第１９項に記載の細胞株であって、前記ホスト細胞株が腸内バ クテリア株である細胞株。

２９、請求の範囲第１９項に記載の細胞株であって、前記腸内バクテリア株がＥ ｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏ！ｉの株である細胞株。

３０、請求の範囲第１９項に記載の細胞株であって、前記プロモータが強力なプ ロモータである細胞株。

３１、請求の範囲第３０項に記載の細胞株であって、前記プロモータがピルベー ト・ホルメート−リアーゼ（ｐｆｌ）プロモータである細胞株。

３２、請求の範囲第１９項に記載の細胞株であって、前記異種ＤＮＡ断片がアル コールデヒドロゲナーゼ及びピルベートデカルボキシラーゼをコードする細胞株 。

３３、請求の範囲第３２項に記載の細胞株であって、前記アルコールデヒドロゲ ナーゼ及び前記ピルベートデカルボキシラーゼがＸｙｍｏｍｏｎａａ　ｍｏｂｉ ｌｉｓ由来の遺伝子によッテコードされる細胞株。

３４、請求の範囲第３３項に記載の細胞株であって、前記株はグルコース又はキ シロースの醗酵によって、添加された糖のエタノールへの少なくとも約Ｉｎ％の 変換に対応する理論収率で、エタノールを産生できる細胞株。

３５、請求の範囲第３２項に記載の細胞株であって、前記染色体が更に、スクシ ネート産生を阻害する突然変異を有している細胞株。

３６、請求の範囲第３５項に記載の細胞株であって、スクシネート産生を阻害す る前記突然変異が、フマレートレダクターゼ（ｆｒｄ）遺伝子における突然変異 を含んでいる細胞株。

３７、請求の範囲第１９項に記載の細胞株であって、前記染色体が更に、前記ホ スト細胞株内における組換えを阻害する突然変異を有している細胞株。

３８、請求の範囲第３７項に記載の細胞株であって、組換えを阻害する前記突然 変異がｒｅｃＡ遺伝子における突然変異を含んでいる細胞株。

３９、高レベルの所望のポリペプチドを産生ずる組換えホスト細胞を製造する方 法であって、 （ａ）ホスト細胞にとって内因性であるプロモータと該内因性プロモータの転写 制御下にあるホスト遺伝子とをコードする染色体を具備したホスト細胞を含む培 養物を与える工程と、 （ｂ）前記培養物中のホスト細胞を異種ＤＮＡ断片で形質転換する工程であって 、該異種ＤＮＡ断片が（ｉ）選別マーカー遺伝子および前記所望のポリペプチド をコードする遺伝子を含む複数の遺伝子と、（■）相同的組換えによって、前記 異種ＤＮＡ断片によリコードされる前記複数の遺伝子の前記ホスト遺伝子内への 組込みを可能にするため（へ前記ホスト遺伝子に対１．．７て充分に相同的で且 つ前記異種ＤＮＡ断片中に正し、く位置した配列 とを具備する形質転換工程と、 （ｃ）前記培養物中のホスト細胞またはその子孫について、第一レベル（ａ　１ ｉｒｓｊ　１ｅｖｅｌ）で前記選別マーカー遺伝子を発現するものを選別するす る工程と、 （（１）工程（ｅ）で選別されたホスト細胞またはその子孫をスクリーニングし 、前記所望のポリペプチドを初期レベルで産生ずるホスト細胞を得る工程と、 （ｅ）工程（ｄ）で同定されたホスト細胞またはその子孫を、前記染色体中に突 然変異が創製される条件下で、任意に突然変異誘発物質に曝す工程と、 ｉｆ）工程（ｄ）または工程（ｅ）で製造されたホスト細胞またはその子孫を、 前記所望のタンパクを前記初期レベルよりも高いレベルで産生ずるホスト細胞に ついて試験することにより、前記異種ＤＮＡ断片の発現を増大させる突然変異で あって、該突然変異のない前記ホスト細胞による前記ポリペプチドの産生に比較 して、前記ホスト細胞による前記所望のポリペプチドの産生増大をもたらし、且 つ前記異種ＤＮＡ断片の発現増大は、前記発現の増大した細胞を選別する条件の 不存在下においても保持される突然変異をもったホスト細胞を得る工程とを具備 した方法。

４０、請求の範囲第３９項に記載の方法であって、前記方法が更に、 （ｉ）工程（ｂ）において、前記異種ＤＮＡ断片には更に、レプリコンを含むプ ラスミドを有することと、（口１）工程ＦＣ）において、前記ホスト細胞の選別 には更に、前記選別マーカー遺伝子を第一レベルで発現する前記ホスト・細胞を 、前記選別マーカー遺伝子を発現する細胞が選別されない条件下で増殖させるこ とが具備され、ここで前記ホスト細胞は前記プラスミドが複製される第一温度で の非選別条件下で増殖されて、前記プラスミド及び前記選別マーカー遺伝子の前 記ホスト遺伝子からの切除がもたらされ、また前記ホスト細胞は、次いで前記プ ラスミドが複製されない第二温度での非選別条件下において増殖され、前記選別 マーカー遺伝子および前記プラスミドの不存在下で前記所望のポリペプチドをコ ードする遺伝子を保持したホスト細胞がもたらされることとを具備した方法。

４１、請求の範囲第３９項に記載の方法であって、前記方法が更に、 （１）工程（ｂ）において、前記異種ＤＮＡ断片が複製能力のない閉環状ＤＮＡ を具備することと、（■）工程（１）において、前記ホスト細胞の試験が、工程 （ｔｌ）または工程（ｅ）で製造されたホスト細胞またはその子孫について、前 記選別マーカー遺伝子を前記第一レベルよりも高い第ニレベルで発現するものを 選別し、次いで前記選別マーカー遺伝子を前記第ニレベルで発現する前記ホスト 細胞を、所望のタンパクを前記初期レベルよりも高いレベルで産生ずるホスト細 胞についてスクリーニングすることとを具備した方法。

４２、請求の範囲第３９項に記載のホスト細胞株であって、前記ホスト細胞株か 微生物ホスト細胞株である細胞株。

４３、請求の範囲第３９項に記載の方法であって、前記選別マーカータンパクが 、前記ホスト細胞株にクロラムフェニコールに対する耐性を与える細胞株。

４４、請求の範囲第４３項に記載の方法であって、前記選別マーカー遺伝子の前 記第一レベルの発現が、少なくとも約２０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールに 対する耐性を与える方法。

４５、請求の範囲第４３項に記載の方法であって、前記選別マーカー遺伝子の前 記第一レベルの発現が少なくとも約２０μｇ／ｍ１のクロラムフェニコールに対 する耐性を与え、前記選別マーカータンパクの前記第ニレベルの発現が少なくと モ約１００μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールに対する耐性を与える方法。

４６、請求の範囲第３９項に記載の方法であって、前記選別マーカ遺伝子が、前 記所望のポリペプチドをコードする遺伝子の下流にある前記異種ＤＮＡ断片内に 位置したプロモータの転写制御下にある方法。

４７、請求の範囲第４６項に記載の方法であって、前記異種ＤＮＡ断片が転写タ ーミネータを更に具備し、該転写ターミネータが前記所望のポリペプチドをコー ドする遺伝子と前記選別マーカー遺伝子との間に位置している方法。

４８、請求の範囲第３９項に記載の方法であって、前記ホスト細胞株か腸内バク テリア株である方法。

４９、請求の範囲第３９項に記載の方法であって、前記腸内ホスト細胞株がＥｓ ｃｈｅｒｉｃｂｉａ　ｃｏｌｉの株である方法。

５０、請求の範囲第３９項に記載の方法であって、前記プロモータが強力なプロ モータである方法。

５１、請求の範囲第５０項に記載の方法であって、前記プロモータがピルベート 赤ホルメートーリアーゼ（ｐｆｌ）プロモータである方法。

５２、請求の範囲第３９項に記載の方法であって、前記異種ＤＮＡ断片がアルコ ールデヒドロゲナーゼ及びピルベートデカルボキシラーゼをコードする方法。

５３、請求の範囲第５１項に記載の方法であって、前記アルコールデヒドロゲナ ーゼ及び前記ピルベートデカルボキシラーゼがｚｙｍｏｍｏｎａｓ　ｍｏｂｉｌ ｉｓ由来の遺伝子ニヨッテコートサれる方法。

５４、請求の範囲第５３項に記載の細胞株であって、前記株はグルコース又はキ シロースの醗酵によって、添加された糖のエタノールへの少なくとも約１００％ の変換に対応する理論収率で、エタノールを産生できる方法。

５５、請求の範囲第５１項に記載の方法であって、前記染色体が更に、スクシネ ート産生を阻害する突然変異を有している方法。

５６、請求の範囲第５５項に記載の方法であって、スクシネート産生を阻害する 前記突然変異がフマレートレダクターゼ（ｆｒｄ）遺伝子における突然変異を含 んでいる方法。

５７．請求の範囲第３９項に記載の方法であって、前記染色体が更に、前記ホス ト細胞株内における組換えを阻害する突然変異を有している方法。

５８、請求の範囲第５７項に記載の細胞株であって、組換えを阻害する前記突然 変異がｒｅｃＡ遺伝子における突然変異を含んでいる方法。

５９、ＡＴＣＣ６８４８４の寄託番号で特定されたアメリカン・タイプφカルチ ャーψコレクションへの寄託によって示される、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏ ｌｉの組換えホスト株（ｐ［，０１５１０）。

６０、ＡＴＣＣ６８４８５の寄託番号で特定されたアメリカン・タイプ・カルチ ャー・コレクションへの寄託によって示される、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏ ｌｉの組換えホスト株（ｐＬＯＩ５４３）。

６１、　ＡＴＣＣ５５１２３の寄託番号で特定されたアメリカン・タイプ・カル チャー・コレクションへの寄託によって示される、請求の範囲第１９項に記載の Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　［０４の組換えホスト株。

６２、　ＡＴＣＣ５５１２４の寄託番号で特定されたアメリカンφタイプ番カル チャー・コレクションへの寄託によって示される、請求の範囲第１９項に記載の Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＫＯＩＩの組換えホスト株。

６３、　ＡＴＣＣ５５１２５の寄託番号で特定されたアメリカン・タイプ・カル チャー・コレクションへの寄託によって示される、請求の範囲第１９項に記載の Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＫＯ１２の組換えホスト株。

６４、ＡＴＣＣ５５１２６の寄託番号で特定されたアメリカンψタイプΦカルチ ャーΦコレクションへの寄託によって示される、請求の範囲第１９項に記載のＥ ｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＫＯ２０の組換えホスト株。

８Ｊ−１絢　濡 本出願は、同時係属出願第０７／３５２．０６２号（１９８９年５月１５日出願 ）の一部継続出願である。この親出願は、もはや放棄された出願番号節０７／２ ３９．０９９号（１９８８年８月３１日出願）の一部継続出願である。

この発明に関する仕事は、一部はアメリカ合衆国エネルギー省基礎エネルギー科 学局の補助金ＦＧＯ５−８６ＥＲ３５７４号によって援助され、また一部はアメ リカ合衆国農務省アルコール燃料計画の補助金８８−３７２３３−３９８７号に よって援助された。アメリカ合衆国政府は、本発明において一定の権利を有する 。

〔発明の背景〕

本発明は、染色体中に安定に一組込まれ且つ内因性プロモータの制御下にあるポ リヌクレオチド断片であって、ポリペプチドをコードする異種のポリヌクレオチ ド断片を具備した組換えホスト細胞に関する。例えば、組込まれた断片がチモモ ナス・モビリス（Ｘｙｍｏｍｏｎａｓ　ｍｏｂｉｌｉｓ）のような充分なエタノ ール産生体からのエタノール産生遺伝子を具備するとき、本発明の範囲内に包含 される組換えＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ及び他の腸内細菌は、バイオマ ス由来の広範囲の糖を効率的にエタノールに変換することができる。この発明は また、染色体に組込まれた異種の遺伝子（内因性プロモータの制御下に発現され るもの）によりコードされるタンパクの産生を増大する変異体と、このような変 異体を同定する方法に関する。

グリコリンスの間に、細胞はグルコースのような単糖類をピルビン酸に変換し、 ＡＴＰおよびＮＡＤＨを産生する。酸化的リン酸化のための機能的な電子伝達系 の不存在下においては、少なくとも９５％のピルビン酸が、ＮＡＤ十を再生し且 つグリコリシスの継続およびＡＴＰ産生に対する不可避的要求を再生する短絡経 路において消費される。これらＮＡＤ＋再生系の排出物は、通常、醗酵生成物と 称される。

微生物は、夫々の属に特異的な一連の醗酵生成物において特に多様である。例え ば、Ｋｒｉｅｇ、Ｎ、Ｒ，、ａｎｄ　Ｊ、Ｇ、Ｈｏ１ｊ、ｅｄｓ。

［１９８４１ＢＥＲＧＥＹ’　Ｓ　ＭＡＮＵＡＬ　ＯＦ　ＳＹＳＴＥＭＡＴＩＣ ＢＡＣＴＥＲＩＯＬＯＧＹ　（Ｎｉｌｌｉａｍｓ　＆　Ｗｉｌｋｉｎｓ　Ｃｏ、 、　Ｂａｌｆｉｍｏｒｅ）を参照のこと。これらの生成物には、ラクテート、ア セテート、スクシネート及びブチレートのような有機酸、並びにエタノール、ブ タノール、アセトン及びブタンジオールのような中性生成物が含まれる。

実際に、バクテリアによる醗酵生成物は、その多様性によって、分類学における 主要な決定因子として用いられる。上記Ｋｒｉｅｇ　ａｎｄ　Ｒｏｌｌ　［１９ ８４］　を参照のこと。

醗酵の最終生成物は、幾つかの基本的な特徴を共存している。これら生成物は、 それらが最初に産生される条件下では比較的無毒であるが、蓄積されると毒性を 有するようになる。

これらは、その直接の前駆体がグリコリシスにおいて最終的な電子受容体として 働くため、ピルベートよりも低減される。

これら醗酵生成物の微生物的産生は、バイオテクノロジーにおける我々の伝統的 かつ経済的に最も成功した応用の基礎をなし、これら産物には酪農品、肉、飲料 および燃１１が含まれる。

殆どの燃料エタノールは、現在のところ、ザッカロマイセスφセレビシェ（Ｓａ ｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｅｅｒｅｖｉｓｉａｅ）またはチモモナスナモビリス （２，ＩＩＩｏｂｉｌｉｓ）の何れかを利用して、コーン澱粉または甘蔗シロッ プ中のヘキソースから製造される。しかし、これらは比較的高価なバイオマス糖 源であり、食品としての価値と競争している。加えて、醗酵の間に多量のヘキソ ースが、エタノールに変換されるよりも、むしろ微生物細胞を含むバイオマスに 逆変換される。従来のエタノール産生微生物について、このバイオマスは、最良 でも例えば栄養補足月のような限られた商業的価値しかもたず、従って高価な糖 基質の非効率的な利用を与えるに過ぎない。

澱粉およびヘキソース糖は、植物における全炭水化物の単なる一部分にしか過ぎ ない。幹、葉、果皮、殻、コーンの穂軸等における植物炭水化物の主要な形態は 、構造的壁を構成するポリマー、セルロース及びヘミセルロースである。これら ポリマーの加水分解によって、グルコース、キシロース、マンノース、ガラクト ース及びアラビノースを含む中性糖混合物が放出される。天然に存在する微生物 で、これら全ての糖（特にペント−ス）を迅速かつ効率的にエタノールまたは他 の何れかの価値ある単一生成物に代謝するものは知られていない。

Ｅｓｃｈｅ＋１ｃｈｉｘ　ｃｏｌｉ　ｆＥ、　ｃｏｌｉ）および関連腸内細菌は 、嫌気的条件下での醗酵によって、バイオマス由来の全範囲の糖を代謝できる商 業的に有用な微生物のうちの主要な微生物である。

しかし、これら微生物は嫌気的発酵条件下において、少量のエタノールを含んだ 可溶性生成物の経済的には分離できない混合物に糖を変換する。ｌｎｇｒａｍ、 Ｌ、Ｏ，、Ｔ、Ｃｏｎｗａｙ、　Ｄ、Ｐ、ＣＩａｔｋ、　Ｇ、Ｗ、Ｓｅｗｅｌ！ 、ａｎｄ　Ｊ、Ｆ、Ｐｒｅｓｊｏｎ　［１９８７Ｊ　Ａｐｐｌ、Ｅｎｙｉｒｏｎ 、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　５３：２４２０−２４２５を参照されたい。然して、 このような腸内細菌はバイオマス由来の全範囲の糖を効率的に利用するが、商業 的に価値のある充分な収率および均一性で生成物を製造することはできない。

従って、Ｅ、ｃｏｌｉのような成る種の腸内細菌が示すバイオマス由来の全範囲 の糖の効率的な代謝と、エタノールのような商業的に価値ある単一の優勢な可溶 性醗酵生成物を高レベルで産生ずる能力とを併有した微生物が必要とされている 。更に、商業的に価値のあるタンパクのような付加的生成物を含む微生物バイオ マスを、充分な収率および経済的な回収品質で製造できる微生物が必要とされて いる。

醗酵経路は、ピルビン酸を酸性生成物および中性生成物の混合物に変える。Ｅ、 ｃｏｌｉのような腸内細菌においては、二つの経路が有力である。ラクテートデ ヒドロゲナーゼは、ＮＡＤＨを直接ＮＡＤ＋に酸化しながら、ピルベートの乳酸 への還元を触媒する。ピルベート・ホルメート−リアーゼを含む第二経路はもっ と複雑である。ピルベート・ホルメート−リアーゼ（ホルメート＋アセチル補酵 素Ａへのピルベートの開裂を触媒する）は、Ｅ、ｃｏｌｉの嫌気的代謝の中心的 酵素である。

何故なら、酵素は嫌気生活下での大部分のピルベートの代謝を担っているからで ある。ピルベート・ホルメート−リアーゼをコードするＥ、ｃｏｌｉ遺伝子（ｐ 　ｆ　１遺伝子）がクローン化され、配列が決定されている。Ｃｈｒｉｓｆｉａ ｎｓｅｎ、ｔ、、ａｎｄ　Ｓ、Ｐｅｄｅｒｓｅｎ　［１９８１］　Ｍａｔ、Ｇｅ ｎ、Ｇｅｎｅｔ、１８１：５４８−５５ｆ；Ｒｏｄｅｌ、Ｗ、、　Ｗ、ＰＩａｇ ａ、Ｒ，Ｆｒｘｎｋ、ａｎｄ　Ｊ、Ｋｎａｐｐｅ　［１９８８］　Ｅｕｒ、Ｊ、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、１７７：１５３−１５８を参照のこと。ｐｆｌ遺伝子の前には 多重プロモータが存在し、該遺伝子は嫌気生活によって高レベルの発現が誘導さ れる。５ａｖｅｒｓ、Ｇ、、ａｎｄ　Ａ、Ｂｏｃｋ　［１９８８）　Ｊ、Ｂａｃ ｔｅｒｉｏｌ、１７０＋　５３３０−５３３６を参照のこと。

本発明の組換えホストにエタノール産生遺伝子を与えるために用いられるＤＮＡ は、例えばｚ、ｍｏｂｉｌｉｓから単離される。

これは、植物樹液および蜂蜜中に普通に見出だされる異常な代謝的特徴をもった 微生物である。野生型ｚ、ｍｏｂｉｌｉｓは長い間、リュウゼツラン樹液の醗酵 でプルヶ（メキシコのアルコール飲料）を製造するための天然の接種菌として、 またパームワインのための接種菌として役立ってきた。上記のように、この微生 物は燃料エタノール製造にも用いられ、そのエタノール産生速度は酵母のそれよ りも実質的に高いことが報告されている。

２、ｍｏｂｉｌｉｓは栄養要求性が単純であり、且つアミノ酸類、ヌクレオチド 類およびビタンミン類を合成することができるが、この微生物によって代謝され る糖の範囲は著しく限定されており、通常はグルコース、フククＩ・−スおよび 蔗糖からなる。これら糖の醗酵からの基質レベルでのリン酸化は、生合成および ホメオスタシスのための唯一のエネルギー源である。Ｚ、ｍｏｂｉｌｉｓは、た とえ栄養ブロスのような富裕培地中であっても、発酵可能な糖なしでは増殖でき ない。

Ｘ、ｍｏｂｉｌｉｓにおいては、ピルベートをエタノールに変換し且つＮＡＤ＋ を再生するために二つの酵素、即ちピルベートデカルボキシラーゼ（ＤＰＣ）お よびアルコールデヒドロゲナーゼ、就中■型（ＡＤＨｎ）が必要とされる。１ｍ ｏｂｉｌｉｓの細胞質内には個々のタンパクが、夫々の可溶性タンパクの２％〜 ５％に亘る高レベルで存在する。このような高レベルは、エネルギー生成のため に要求される高速のＮＡＤＨ酸化およびグリコリシス流（ｇｌｙｃｏｌｙｊｉｃ 　ｆｌｕｘ）にとって不可欠であると思われる。２１口ｏｂｉｆｉｓのＰＤＣお よびＡＤＨＩＩをコードする、ｐｄｃ遺伝子およびａｄｈＢ遺伝子のクローン化 および配列決定が既に報告されている。Ｃｏｎｗａｙ、Ｔ、、　Ｙ、Ａ、Ｏｓｍ ａｎ、１．　ｆ、Ｋｏｎ＋＋ａｎ、　Ｅ、Ｍ、Ｂａｆｆｍｚｎ、ａｎｄ　Ｌ、Ｏ ，Ｉｎｇｒａｔｎ　［１９８７］　Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１６９：９４９− ９５４；　Ｃｏｎｗａｙ、Ｔ、、　Ｇ、Ｗ、５ｅｖｅｌｌ、　Ｙ、Ａ、Ｏｓｍａ ｎ。

ａｎｄ　Ｌ、０．ｔｏｇｒａｍ　［１９８７］　ＬＢａｃｔｅｒｉｏｌ、１６９ ：２５９１−２５９７；　Ｂｒｇｕ。

Ｂ、、ａｎｄ　Ｉ？、Ｓａｈｍ　［１９８６］　Ａｒｃｈ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ 、１４６：Ｉ（１５−１１０；　Ｂｔａｕ、Ｂ、、ａｎｄ　Ｈ，Ｓａｈｍ　［１ ９８６］　Ａｒｅｈ、Ｍｉｃｒｏｂｔｏｌ、１４４：２９６−３０１；　Ｎｅａ ｌｅ、Ａ、Ｄ、、Ｒ，に、５ｃｏｐｅｓ、Ｒ，Ｅ、Ｈ，Ｗｅｆ、ｔｅｎｈａｌｌ 、ａｎｄ　Ｎ、Ｊ、Ｈｏｏｇｅｎｒａａｄ　［１９８７］　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａ ｃ１ｄ、Ｒｅｓ、１５：１７５３−１７６１；　Ｉｎｇｒａｒｎ、Ｌ、Ｏ，。

ａｎｄ　Ｔ、Ｃｏｎｗａｙ　［１９８８］　Ａｐｐ［、Ｅｎｖｉｔｏｎ、Ｍｉｃ ｒｏｂｉｏｌ、５４：３９７−４０４；　Ｉｎｇｒａｍ、Ｌ、０．、　Ｔ、Ｃｏ ｎｗａｙ、　Ｄ、Ｐ、ＣＩａｒｋ、　Ｇ、Ｗ、Ｓｅｗｅｌｌ、ａｎｄ　Ｊ。

Ｆ、Ｐｒｅｓｊｏｎ　［１９８７］　Ａｐｐｌ、Ｅｎｖｉｒｏｎ、Ｍｉｃｒｏｂ ｌｏｌ、５３：２４２０−２４２５を参照のこと。

分子遺伝学は、Ｅ、ｃｏｌｉのようなペントースを利用する腸内細菌の嫌気的代 謝経路と、ｚ、ｍｏｂｉｌｉｓのようなエタノール産生菌の効率的なエタノール 産生経路とを、単一の微生物内で組み合わせることについての可能性を提供する 。従って、Ｅ。

ｃｏｌｉＳＥｒｗｉｎｉｘ　ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉおよびＫｌｅｂｓｉｅｌ ｌａ　ｐｌａｎｊｉｃｏｌａのような腸内細菌における２、　ｍｏｂｉｌｉｇ　 ｐ　ｄ　ｃ遺伝子の発現は、低レベルの本来のＡＤＨ活性を用いることによって 、ピルベートの流れを醗酵生成物としてのエタノールに部分的に転換する。ＰＤ ＣおよびＡＤＨＩＩをコードする多重コピープラスミド上の１ｍｏｂｉｌｉｓ遺 伝子を有する組換えＥ、ｃｏｌｉによって、より効率的なエタノール産生および 高濃度のエタノールが得られている。上記１ａｇｒａｍ　ｅｌ　ａｌ、［１９８ ７］；　Ｎｅ＋ｌ、Ａ、Ｄ、、　Ｒ，Ｋ。

５ｃｏｐ！ｓ、　＋ｕ＋ｄ　Ｊ、Ｍ、Ｋｅｌｌｙ　［１９８８］　Ａｐｐｌ、Ｍ ｉｃｒｏｂｉｏｌ、Ｂｉｏｔｃｃｈｎｏｌ、　２９：１６２−１６７を参照のこ と。Ｅ、　ｃｏｌｉ　Ｂ　（ｐＬＯｒ２９７　）株およびＥ、ｃｏｌｉ　ＡＴＣ Ｃ１５２２４（ｐＬＯＩ２９７　）株は、エタノール産生および環境的耐性の点 で優れた菌である。ＡＩｊｅｒｌｈｕｍ、Ｆ、、ａｎｄ　Ｌ。

０、Ｉｎｇｒａｍ　［１９８９］　Ａｐｐｌ、Ｅｎｖｉｒｏｎ、Ｍｉｃｒｏｂｉ ｏｌ、５５：１９４３−１９４８を参照のこと。これら組換えＥ、ｃｏｌｉは、 グルコース、ラクトース及びキシロースを効率的にエタノールに醗酵させる。

上記組換えＥ、ｃｏｌｉは、プラスミドに保持されたｚ、ｍｏｂｉｌｉｓ由来の エタノール産生遺伝子を用いて、有用なレベルのエタノール産生を達成する。更 に、多重コピープラスミドに外来遺伝子を配置することによって、プロトタイプ 株におけるエタノール産生の初期試験が容易になる。しかし、プラスミドをホス ト細胞内に確実に保持する選択圧（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ　ｐｒｅｓｓｕｒｅ）の 不存在下において該プラスミドは本来的に不安定であるため、外来遺伝子は完全 には安定ではない。更に、プラスミドの不適合性に起因して、エタノール産生遺 伝子のための典型的なＥ、ｃｏｌｉ発現プラスミドを使用すると、有用なタンパ クのような他の選ばれた生成物を産生ずる追加の外来遺伝子を、基本的な商業的 エタノール産生株中に導入するための最も便利な手段が排除される。

〔発明の概要〕

本発明は有用なポリペプチドをコードする染色体に組込まれた異種遺伝子を、高 レベルで発現する組換えホスト細胞に関する。本発明の一つの側面に従えば、こ のような組換え細胞は、まず所望のポリペプチド（＠）をコードする異種ＤＮＡ 断片を、内因性プロモータ（好ましくは強力なプロモータ）の制御下でホスト細 胞染色体中に挿入することによって得られる。次いで、形質転換された細胞は、 任意に突然変異誘発物質で処理される。最後に、挿入されたＤＮＡ断片の発現が 増大され、挿入されたＤＮＡ断片にコードされる夫々のポリペプチド産生の増大 がもたらされる突然変異形質転換体を見付けるために、形質転換体は異種遺伝子 の発現について、遺伝子選別または遺伝子スクリーニングにより試験される。

染色体に組込まれた異種遺伝子、並びに発現を増大させる突然変異゛は、増大し た遺伝子発現の保持を選別する条件の不存在下においてさえ著しく安定である。

また、この遺伝子工学的に加工されたホストは、移動性の遺伝子要素を有してい ないので、従来のプラスミドを基礎とした組換え産生系よりも環境的に安全であ る。

以下では、ｚｙｍｏｍｏｎａｓ　ｍｏｂｉｌｉｓのような効率的なエタノール産 生体からのエタノール産生外来遺伝子を用いて、全範囲のバイオマス由来の糖を エタノールに変換できる組換え腸内細菌のＥｓｈＣｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉにつ いて詳細に例示される。これらエタノール遺伝子は、Ｅ、ｃｏｌｉピルベートー ホルメートーリアゼ（ｐ　ｆ　１）遺伝子のための内因性プロモータの制御下で 、組換えホストの染色体中に安定に組込まれる。このホストの染色体は更に、本 発明に従うエタノール産生タンパクの製造を増大させる突然変異を含んでいる。

これらの組換えホストは、エタノールと共に、商業的に価値あるタンパクのよう な他の望ましい生成物を効率的に同時産生ずるために、通常のＥ、ｃｏｌｉ発現 プラスミドを収容することができる。従って、エタノール産生のための本発明の バクテリアによる大量醗酵から得られる残渣バイオマスは、任意に、−以上の追 加の高価値生成物を多量に提供し得る。

特に、本発明の一つの側面は、組換えホスト細胞であって、その染色体が（１） 該ホスト細胞にとって内因性であるプロモータの転写制御下にあり、且つ所望の ポリペプチドをコードする異種ＤＮＡ断片と、　（ｂ）前記異種ＤＮＡ断片の発 現を増大させる突然変異で、該突然変異のない前記組換え細胞による前記ポリペ プチドの産生に比較して、前記組換えホストによる前記所望のポリペプチドの産 生増大をもたらす突然変異とを具備した組換えホスト細胞に関する。前記異種Ｄ ＮＡ断片の発現増大は、このような発現の増大した細胞を選別するにおいて、前 記組換えホスト細胞の染色体は、複数の遺伝子をコードする異種ＤＮＡ断片を具 備する。この複数の遺伝子のうちの一つは、選別マーカー遺伝子であるのが有利 である。

本発明はまた、下記の方法で得られる細胞株に関し、この方法は、 （８）ホスト細胞にとって内因性であるプロモータと該内因性プロモータの転写 制御下にある異種遺伝子を組込むためのホスト遺伝子とをコードする染色体を具 備したホスト細胞を含む培養物を与える工程と、 （ｂ）　この培養物中のホスト細胞を異種ＤＮＡ断片で形質転換する工程であっ て、該異種ＤＮＡ断片が（ｉ）選別マーカー遺伝子および所望のポリペプチドを コードする遺伝子を含む複数の遺伝子と、（ｉｉ）相同的組換えによって、前記 異種ＤＮＡ断片によりコードされる複数の遺伝子の前記ホスト遺伝子内への組込 みを可能にするために、前記ホスト遺伝子に対して充分に相同的で且つ前記異種 ＤＮＡ断片中に正しく位置した配列 とを具備する形質転換工程と、 （Ｃ）上記培養物中のホスト細胞またはその子孫について、第一レベル（ａ　ｆ ｉｒｒｔ　１ｅｖｅｌ）で前記選別マーカー遺伝子を発現するものを選別するす る工程と、 （ｄ）工程（Ｃ）で選別されたホスト細胞またはその子孫をスクリーニングし、 所望のポリペプチドを初期レベルで産生ずるホスト細胞を辱る工程と、 （ｅ）工程（ｄ）で同定されたホスト細胞またはその子孫を、ホスト細胞染色体 中に突然変異が造り出される条件−ドで９．任意に突然変異誘発物質に曝す工程 と、 （ｆ）工程（ｄ）または工程（ｅ）で製造されたホスト細胞またはその子孫を、 前記所望のタンパクを前記初期レベルよりも高いレベルで産生ずるホスト細胞に ついて試験し、前記異種ＤＮＡ断片の発現を増大させる突然変異菌を得る工程と を具備する。

この発現増大は、前記突然変異のないホスト細胞による所望のポリペプチドの産 生に比較して、ホスト細胞による所望のポリペプチドの産生増大をもたらす。更 に、この組込まれた異種ＤＮＡの発現増大は、このような増大した発現を有する 細胞を選別する条件の不存在下においても保持される。

本発明の好ましい態様において、上記の方法は、次のようにして更に改善される 。

（ｉ）工程（ｂ）において、前記異種ＤＮＡ断片には更に、複製が温度感受性で あるレプリコンを含むプラスミドが具備される。

（１１）工程（ｂ）において、ホスト細胞を形質転換する前記方法にはまた、前 記異種ＤＮＡ断片をホスト細胞内に導入することと、このホスト細胞を、前記選 別マーカー遺伝子を第一レベルで発現する細胞が選別される条件下で増殖させる こととが具備される。この細胞は前記プラスミドが複製されない温度で増殖され 、前記ＤＮＡ断片は、相同性組換えの発生によプて前記染色体の前記ホスト遺伝 子内に組込まれることになる。

（ｉ　ｉ　ｉ）工程（Ｃ）において、ホスト細胞を選別する方法には更に、前記 選別マーカー遺伝子を第一・レベルで発現する前記ホスト細胞を、前記選別マー カー遺伝子を発現する細胞が選別されない条件下において増殖させることが具備 される。特に、これらホスＩ・細胞は前記プラスミドが複製される第一温度での 非選別条件下で増殖され、前記プラスミド及び前記選別マーカー遺伝子は、第二 の相同性組換えの発生によって前記ホスト遺伝子から自然に切除される。次いで 、ホスト細胞は前記プラスミドが複製されない第二温度での非選別条件下におい て増殖され、前記選別マーカー遺伝子および前記プラスミドの不存在下で前記所 望のポリペプチドをコードする遺伝子を保持したホスト細胞が得られる。

本発明のこの側面に従って、非選別条件およびプラスミドの複製が得られない温 度を用いるのは、前記プラスミドレプリコンの染色体中への組込みによって増殖 速度が若干阻害されることに基づいている。従って、切除されたプラスミドを有 する株は、組込まれたプラスミドを保持し、た株よりも若干速く増殖し、こうし てプラスミドレプリコンおよび選別マーカー遺伝子が同時に削除されたクローン を富化するための基礎か提供される。

本発明のこの側面に関する他の好ましい態様において、上記の方法は、（１）工 程（ｂ）において、前記異ＤＮＡ断片が複製能力のない閉環状ＤＮＡを具備する ことと、（１１）工程（ｆ）においで、ホスト細胞を試験する方法に、工程（ｄ ）または工程（ｅ）で製造されたホスト細胞またはその子孫について、前記選別 マーカー遺伝子を前記第一レベルよりも高い第ニレベルで発現するものを選別す ることと、次いで所望のタン／＜りを前記初期レベルよりも高いレベルで産生ず るホスト細胞を得るために、前記選別マーカー遺伝子を前記第ニレベルで発現す るこれらホスト細胞をスクリーニングすることとを具備させるように更に改良さ れる。前記選別マーカー遺伝子がクロラムフェニコール耐性を与えるときは、例 えば上記方法の工程（ｄ）または（ｅ）で製造されたホスト細胞は、少なくとも 約２０μｇ　／　ｍ　１のクロラムフェニコールに対する耐性を与えるような第 一レベルで、クロラムフェニコール耐性遺伝子を発現し得る。第二の高いレベル でクロラムフェニコール耐性遺伝子の発現を生じる突然変異細胞を更に選別する ことが前記方法に含まれる態様においては、前記第ニレベルの発現ハ、少なくと も約１００μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールに対する耐性を与え得る。クロラ ムフェニコール耐性の高レベル発現を有する突然変異体の選別を、約６００μｇ 　／　ｍ　１のクロラムフェニコールを用いて行なうのが有利である。

本発明の組換えホスト細胞は、腸内細菌のような微生物細胞であり得る。この点 において適切な腸内細菌の例は、Ｅｒｗｉｎｉａ　ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ株 、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ株およびＫｌｅｂｓｉｅｌ　ｌａｐｎｅｕ ｍｏＩＩｉａｅ株である０ 成る態様において、前記異種ＤＮＡ断片は、高レベルのエタノールを産生ずる微 生物に由来するアルコールデヒドロゲナーゼ及びピルベートデカルボキシラーゼ をコードする。このような酵素は、ｚｙｍｏｍｏｎａｓ　ｍｏｂｉｌｉｓ由来の 遺伝子によってコードされるアルコールデヒドロゲナーゼ及びピルベートデカル ボキシラーゼによって例示される。本発明の好ましい態様において、前記組換え ホスト細胞は、例えばグルコースまたはキシロースの醗酵によって、添加された 糖のエタノールへの少なくとも約９０％または１００％の変換率に夫々対応する 収率でエタノールを産生ずることができる。幾つかの場合には、エタノールの観 察された収率は、添加された糖の量に基づいて可能な収率を越えるように思える 。この結果は、複合栄養のピルベートへの、従ってエタノールへの同時異化を反 映している。

本発明の追加の側面に従えば、更なる突然変異、特にスクシネート産生を減少さ せて酸の生成（これはエタノールの産生を阻害し得る）を低減するような、フマ レートレダクターゼ（ｆｒｄ）遺伝子における突然変異をもった染色体を含む上 記組換えホスト細胞が提供される。

本発明の範囲内に包含される組換えホスト細胞は、その移動性遺伝子要素と相互 作用する能力を低減することによって該細胞を環境的に安全にするために、細胞 内での組換えを阻害する更なる突然変異を具備し得る。一つの態様において、組 換えを阻害するこの突然変異はｒｅｃＡ遺伝子における突然変異を含み得る。

本発明の組換えホスト細胞は、ここで特に例示した方法以外にも、種々の方法に よって製造され得る。このような方法の典型例は、異種ＤＮＡ断片をホスト細胞 染色体上の所定の位置に挿入するための、並びに発現を増大させる突然変異を発 生させ且つ同定するための遺伝子工学的方法である。特に、本発明の組換え微生 物株の標準的な遺伝子解析によって、組換えホスト細胞（これも同様に本発明の 範囲内にある）を作製する他の方法を採用することが可能となる。例えば、本発 明に従って生じた特定の突然変異に伴うＤＮＡ配列変化の知識は、所望のタンパ クをコードする遺伝子のみならず、該遺伝子の高レベルの発現を生じるプロモー タおよび突然変異をも含んだ異種ＤＮＡ断片の設計、合成およびホスト染色体中 への導入を可能にする。従って、所望の遺伝子に関する適切な突然変異およびプ ロモータを含む異種ＤＮＡ断片を具備したこのような遺伝子の構築は、本発明の 範囲内にある他の態様である。

〔図面の簡単な説明〕

図１は、エタノール産生遺伝子（ｚ、ＨＨｂｉｌｉｇのｐｄｃ遺伝子およびａｄ ｈＢ遺伝子）およびクロラムフェニコール耐性遺伝子をＥ、ｃｏｌｉ染色体のｐ ｆｌ遺伝子中に組込むための、温度調節レプリコン（ｐｓｃｌｏｌ；Ｈａｍｉｌ ｔｏｎ、Ｃ，Ｍ、、　Ｍ、Ａｌｄｅａ、　Ｂ、Ｋ。

Ｗａｓｈｂｕｒｎ、　Ｐ、ＢａｂＮｘｋｅ、ａｎｄ　Ｓ、Ｒ，Ｋｕｓｈｎｅｒ　 ［１９８９］　ＩＢａｃｊｅｒｉｏｆ、１７１：４６１７−２２　）を含んだ組 込みベクター（ｐＬＯＩ５４３　）の構築を示す模式図である。略号：　Ｋｌｅ ｎｏｗは、Ｅ、ｃｏｌｉ　ＤＮＡポリメラーゼＩを用いてオーバーハング領域を 塩基で埋めることにより、平滑末端とすることを意味する。

図２は、ベクターなしの環化されたＤＮＡフラグメントを用いて、２．ｍｏｂｉ ｌｉｓのｐｄｃ遺伝子およびａｄｈＢ遺伝子をＥ、ｃｏｌｉ染色体のｐｆｌ遺伝 子中に組込むためのプラスミド（ｐＬＯＩ５１０　）の構築を示す模式図である 。略号：　Ｋｌｅｎｏｗは、Ｅ、ｃｏｌｉ　ＤＮＡポリメラーゼ■を用いてオー バーハング領域を塩基で埋めることにより、平滑末端とすることを意味する；Ｃ ｉｒ、　Ｆｒａｇ、は、アガロースゲルから溶出されライゲートされて閉環に形 成された、ｐＬＯ１５１０由来の環化された５ａｌＩフラグメントを意味する。

図３は、バッチ醗酵の間のエタノール生成（Ａ、Ｃ，Ｅ。

Ｇ）および増殖（Ｂ、Ｄ、Ｆ）を示す。ＡおよびＢは１ｏ％グルコースの醗酵で ある。記号：・はプラスミドに基づくエタノール産生株＾ＴＣＣ１１３０３（ｐ ＬＯＩ２９７　）　；　Ｏは発現増大突然変異を欠く染色体組込みエタノール産 生株ＫＯ２゜ＣおよびＤは、１０％グルコースの醗酵である。記号二〇は自然な 発現増大突然変異を欠く染色体組込み株ＫＯ３、・は自然な発現増大突然変異を 含む染色体組込み株ＫＯ４；ムは２２ｍＭの酢酸ナトリウムを補充したＫＯ４゜ ＥおよびＦは、８％キシロースの醗酵である。記号：・はＫＯ４、ムはＫＯ４の 更なる突然変異体ＫＯＩＩで、フマレートレダクターゼ活性（ｆｒｄ）を欠くも の；口はＫＯＩＩの更なる突然変異体ＫＯ１２で、ｒｅｃＡ突然変異を有するも の。Ｇは誘発突然変異をもった染色体組込み株のＫＯ２０による醗酵である。記 号：■は１０％グルコース；・は８％キシロース。

図４はｐＨ制御なしの、ＫＯＩＩ　（ｆ　ｒ　ｄ）による１０％グルコースの醗 酵を示す。Ａは増殖（・）およびエタノール生成（０）である。Ｂはブロスのｐ Ｈである。

〔好ましい態様の詳細な説明〕

本発明は、組換えホスト細胞であって、その染色体が（ａ）該ホスト細胞にとっ て内因性であるプロモータの転写制御下にあり、且つ所望のポリペプチドをコー ドする異種ＤＮＡ断片と、　（ｂ）前記異種ＤＮＡ断片の発現を増大させる突然 変異で、該突然変異のない前記ホスト細胞による前記ポリペプチドの産生に比較 して、前記ホスト細胞による前記所望のポリペプチドの産生増大をもたらす突然 変異とを具備した組換えホスト細胞に関する。前記異種ＤＮＡ断片の発現増大は 、このような発現の増大した細胞を選別する条件の不存在下においても保持され る。

く定義〉： 本発明の内容において「異種Ｊ　ＤＮＡ断片とは、該ＤＮＡ断片が、この異種断 片を挿入される細胞の染色体における内因性プロモータよりも下流の、対応する 位置での配列とは異なった配列を含むことを意味する。従って、本発明の異種Ｄ ＮＡ断片には、ホスト染色体の一つの位置から採取されて他の位置（該断片に関 する本来のプロモータ以外の内因性プロモータの制御下にある）に挿入されるＤ ＮＡ断片、並びに他の微生物からのＤＮＡ断片が含まれる。該異種ＤＮＡ断片の ヌクレオチド配列は一以上の構造遺伝子をコードし、また、例えば原核細胞、真 核細胞もしくはウィルのゲノム、または遺伝子工学によって創製された人工的コ ード配列を含む何れかの遺伝子源から誘導される。

上記の異種断片は、内因性プロモータ（５′）側の下流でホスト細胞染色体中に 組込まれることによって、該内因性プロモータの転写制御下にある。先に述べた ように、この内因性プロモータは好ましくは、Ｅ、ｃｏｌｉのラクトースオペロ ン（ｌａｃ）プロモータのような典型的な微生物プロモータを基準にして高レベ ルの遺伝子発現を与えるという意味において、「強力な」プロモータである。こ の強力なプロモータのなかには、プロモータ活性のための、即ちＲＮＡポリメラ ーゼを結合して該酵素を正しい転写開始部位に向けるための単一の部位を含むも の、および複数のこのような部位を含むものが存在する。前者のカテゴリー（単 一部位）に属する強力なプロモータの例は、周知のトリプトファン（ｔｒｐ）プ ロモータである。後者のカテゴリー（複数部位）は、ピルベート中ホルメートー リアーゼ（ｐ　ｆ　１）遺伝子のためのプロモータによって例示され、その相同 性変種はＥ、ｃｏｌｉおよび他の腸内細菌中に見られる。ピルベート・ホルメー ト−リアーゼは、特に強制的通気のない醗酵に関する嫌気的条件の下で、正常に は高レベルで発現される。例えばｐｆｌ・ｍＲＮＡの配列分析およびＲＮＡポリ メラーゼがどこに結合するかを示す「フットプリンティング」データにおいて、 またはｍＲＮＡの５′末端を示す「プライマー伸長」分析において考えられるよ うに、現実のｐｆｌプロモータにはプロモータ活性のための七つの部位が含まれ る。

ここでの記述において、「突然変異」とは遺伝物質における相対的に永続性の変 化をいい、典型的には遺伝−丁を構成゛ｄるコト寛・・の生化学的変化を含むが 、染色体構造の物理的変（【６をも含み得る。本発明に従って適切に用いられる 突然変異は７、前記の異種ＤＮＡ断片の発現を増大し６、該突然変異のないホス ト細胞による当該ポリペプチドの産生に比較して、ホスト細胞による前記断片に よりコードされる夫々のポリペプチドの産生増大をもたらす。こうして達成され た発現の増大は、このような発現増大を有する細胞を選別する条件の不存在下に おいても維持される。例えば、本発明に従って、染色体中に組込まれた抗生物質 耐性遺伝子およびエタノール産生酵素遺伝子の両者の発現を増大させる突然変異 をもった細菌株においては、抗生物質での選別なしでポピユレーションを６８倍 増（６８ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ　ｂｏｕｂｌｉｎｇｓ）　した後にも、組込まれ た遺伝子の高レベル発現の喪失は検出されない。

本発明に従う突然変異をもった形質転換ホスト細胞は、標準的な遺伝子的方法論 に従って、挿入されたＤＮＡ断片によりコードされる一以上のポリペプチドの増 大した発現によって都合良く検出され得る。一つのポリペプチドの増大した発現 は、該ポリペプチドを直接検出することによって決定され、或いは当該ポリペプ チドによる活性から推論される。挿入されたＤＮＡ断片によってコードされる遺 伝子の一つは選別マーカー遺伝子、例えば、当該ホストに抗生物質耐性を与える 遺伝子であるのか有利である。この場合、抗生物質耐性遺伝子の発現か増大した 突然変異細胞は、当該異種ＤＮＡ断片の発現を増大する突然変異のないホスト細 胞を阻害する第一レベルよりも高い抗生物質濃度を用いて、好都合に選別され得 る。

特に、本発明での使用に適した突然変異は、自然の突然変異としで、或いは従来 の突然変異誘発に続いて、高レベルで発現している組込まれた遺伝子の所望の発 現型を有する細胞を選別またはスクリーニングすることによって確実に得ること ができる。こうして、このような突然変異の不存在下で耐え得る濃度の３０倍も 高い抗生物質濃度で細胞増殖が行なわれるような、組込まれたクロラムフェニコ ール耐性遺伝子の増大した発現を有する細胞の選別に際して、所定のバクテリア における適切な突然変異が１０−４〜１０−５オーダーの頻度で自然に起きるこ とが見出される。同様に、突然変異誘発物質で所定のバクテリア細胞を処理した 後にも、このような突然変異誘発処理を行なわない場合よりも約１０倍高いレベ ルでのエタノール関連酵素の発現を有する細胞をスクリーニングすることによっ て、約０．５−ＩＸＩＯ−４の頻度の突然変異生存において適切な突然変異を得 ることができる。

本発明での使用に適した突然変異は、実際に、本発明に従って染色体に組込まれ た遺伝子の単一コピーからのポリペプチド産生が、多重コピープラスミド上に担 持された同じ遺伝子の多重コピーで達成される産生に匹敵する程度にまで、挿入 された遺伝子の過剰発現を生じる。例えば、このような適切な突然変異を有する バクテリア細胞は、クロラムフェニコール耐性およびエタノール産生のための組 込まれた遺伝子を、多重コピープラスミド上の同じ遺伝子の３Ｏ−３（１０コピ ーを含む細胞と機能的に等価なレベルで発現することができる。

本発明に従って使用するための、ここで説明したようにして確認された突然変異 についての分子的基礎は決定されていない。しかし、−回のスクリーニング又は 選別工程で得られる遺伝子発現の増大の大きさく例えば約１０倍のオーダー）は 、遺伝子複製を含む突然変異機構について期待されるよりも実質的に大きい。選 別遺伝子の発現において、遺伝子複製によって匹敵する増大を達成するためには 、典型的には、選別剤のレベルを逐次的に高くして、反復した選別工程を必要と する。更に、この突然変異の反転の低い頻度（実際には検出不能）もまた、これ ら突然変異の基礎としての遺伝子複製に対して影響を及ぼす。現実に、双頭遺伝 子反復（ｔａｎｄｅｍ　ｇｅｍｅ　ｒｅｐｅｔｉｔｉｏｎ）によって増大した遺 伝子発現を生じる突然変異は、本発明の突然変異とは対照的に典型的には不安定 であり、このような増大した遺伝子発現を有する細胞を選別する条件の不存在下 では維持され得ないことが知られている。反対に、本発明に従って自然に起きる 適切な突然変異の観察される頻度は、点突然変異を含む原因機構に匹敵する。

組込まれた遺伝子の発現を増大する突然変異の選別マーカー遺伝子を用いた選別 は、当該技術において、突然変異処理の生存当り少なくとも約１０−４オーダー の頻度で誘導され得る突然変異をもったクローンを選別するための実際の遺伝子 的方法が知られているような、何れのタイプのホスト細胞においても本発明に従 って行なわれ得る。同様に、本発明に従う突然変異ホスト細胞のスクリーニング は充分な数のクローンを調製するための実際的な方法を必要とし、この夫々のク ローンは、特定の所望遺伝子に適した方法によって、組込まれた所望の遺伝子の 高レベルの発現を検出するための充分な細胞を含んでいる。

適切な突然変異のためのこのような選別またはスクリーニングは、前核細胞（バ クテリア）および酵母細胞の場合のように、容易に大量培養されるホストで最も 容易に行なわれる。

説明のために、このようなホストを「微生物細胞」いい、それが構成する株を「 微生物株」という。微生物細胞の範鴫において、Ｅｒｗｉｎｉａ　ｃｈｒｙｓａ ｎｊｈｅｍｉ、　Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉならびにＫｌｅｂｓｉｅｌｌ ａ　ｐｌａｎｔｉｃｏｌａは、これらがペントース及び乳糖を含む広範囲の種々 の糖を利用することができるので、特に魅力的なホストである。微生物細胞は好 ましいホストであるが、本発明は真菌細胞および真核細胞（動物、昆虫及び植物 ）を含む、異種ＤＮＡ断片を内因性プロモータの制御下に挿入できる他のタイプ の細胞性ホストの使用をも考慮している。従って、上記のように、ホスト細胞は 組込まれた異種ＤＮＡの増大した発現を有する細胞の選別またはスクリーニング のレジンに服し、これによって発現の増大した適切な突然変異体を得ることのみ を必要とする。

くエタノール生成Ｅ、ｃｏｌｉに関する態様〉：本発明の例示的適用には、Ｅ、 ｃｏｌｉ染色体のｐｆｌ領域にエタノール産生のための２．ｍｏｂｉｌｉｓ遺伝 子を組込むことが含まれる。このｐｆｌ遺伝子は正常な醗酵代謝の中心をなし、 ホルメート＋アセチルＣｏＡへのピルベートの変換を触媒し、生合成のための実 質的なアセチル単位源を提供する。この遺伝子の挿入不活性化は、ピルベートを 微生物によるエタノールの産生から逸らす競争分岐点の阻害を表わす。また、ス クシネート産生を除き、且つＲＥＣＡ遺伝子を不活性化する追加の遺伝子的改良 も記述される。

これらの組換微生物は、バイオマス糖類をのエタノール醗酵する際の、同時生成 物としての組換ポリペプチドの製造に有用である。染色体中への組込みの結果と して、エタノール産生形質の安定性は、エタノール製造用のための工業的規模の 醗酵に用いるプラスミドを基礎とする系に比較して顕著に改善される＝６８世代 後のエタノール遺伝子の保持は１００％であり、比較対象のプラスミドを基礎と する構築物では９８％に過ぎない。また、エタノール産生遺伝子を担持したプラ スミドが省略されることによって、エタノール産生能力の妨害を受けることなく 、同時生成物を産生ずるためのプラスミドの挿入が可能となる。

〈生物学的寄託〉 次の培養物は、アメリカ合衆国メリーランド州２０８５２０ツクウィル１２３０ １パークローンドライブのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａ ＴＣＣ）に寄託されている。表１には、寄託機関によって該培養物に与えられた 受付は番号が列記されている。

表１＝生物学的寄託 培　養　物　受付は番号 Ｅ、ｃｏｌｉ　（ＰＬＯＩ５１０　）　ＡＴＣＣ６８４８４Ｅ、ｃｏｌｉ　（Ｐ ＬＯＩ５４３　）　ＡＴＣＣ６８４８５Ｅ、ｃｏｌｉＫＯ４ＡＴＣＣ５５１２３ Ｅ、　ｃｏｌｉＫ　０１１　Ａ　Ｔ　ＣＣ５５１２４Ｅ、　ｃｏｌｉＫ　０１２ 　Ａ　Ｔ　ＣＣ５５１２５Ｅ、ｃｏｌｉＫＯ２０ＡＴＣＣ５５１２６主題の培養 物は、この特許出願が係属している間は、３７ＣＦ　Ｒｇ　１．１４および３５ 　Ｕ　Ｓ　Ｃｆｉ　１２２に従って特許商標庁長官によって資格を与えられた者 の該培養物へのアクセスが保証される条件の下で寄託されている。この寄託物は 、主題の出願の対応出願またはその関連出願が出願された外国の特許法による要 求に応じて入手可能である。しかしながら、該寄託物の入手可能性は、政府の処 分によって付与された特許権を減損して、本発明を実施することの許諾を意味す るものではない。

更に、主題の培養寄託物は、微生物の寄託に関するブダペスト条約の規定に従っ て保存され、且つ公衆が入手可能とされる。即ち、これらは該寄託物のサンプル の分譲をめる最も新しい請求の後の少なくとも３年の間、および全ての場合にお いて寄託の日から３０年の間、または該培養物を開示して発行された何れかの特 許の存続期間の間、これを汚染せずにその生存を維持するために必要な全ての注 意をもって保存されるであろう。寄託者は、寄託物の分譲が請求されたときに、 寄託物の状態に起因してそのサンプルの分譲ができなくなったならば、寄託物を 置き換える義務を負うことを承認する。主題の培養寄託物の公衆の入手可能性に 関する全ての制限は、これを開示する特許の付与の際に、回復不能なものとして 除去される。

＜Ｅ、ｃｏ１ｉＢ染色体中べの、２．ｍｏｂｉｌｉｓのｐｄｃ遺伝子およびａｄ ｈＢ遺伝子の組込み〉： 以下に記載する二つの例に具体化された二つのアプローチは、外来遺伝子（ここ ではエタノール産生のための２．ｍｏｂｉ１ｉｓＥ遺伝子）が染色体遺伝子（ｐ ｆｌ遺伝子によって例示されるもの）中に組込まれるＥ、　ｃｏｌｉ　（ＡＴ　 ＣＣ１１３０３）のようナハクテリア株を構築するために、本発明に従って採用 され得る異なった戦略を表わしている。第一のアプローチにおいては、Ｈａｍｉ ｌｔｏｎ　ｅｌ　！＋、によって開発された温度条件付き組込みペクト−の誘導 体を使用することが伴われる。Ｂａｍ１Ｈｏｎ、Ｃ，Ｍ、、　Ｍ、Ａｌｄｅａ、 Ｂ、に、Ｗａｓｈｂｕｒｎ、　Ｐ、Ｂａｂｉｆｘｋｅ、　ａｎｄ　Ｓ、Ｒ，Ｋｕ ｓｈｎｅｒ　［１９８９］　Ｌ　Ｂａｃｆｅｒｉｏｌ、　１７１：４６１７−２ ２　；および後述の例３を参照のこと。

従って例に示すように、ＡＴＣＣ１１３０３は温度依存性複製プラスミドのｐＬ ＯＩ５４３で形質転換され、続いて温度に基づく選別か行なわれ、二つの相同的 組換えが起こった。コロニーの６４．５％はクロラムフェニコール（Ｃｍ）に感 受性であり、プラスミドの喪失を示した。これらＣｍ感受性クローンのうち５． ９％は、アルデヒド試験プレート上にピンクのコロニーを形成し、１．　ｍｏｂ ｉｌｉｓ　Ａ　Ｄ　ＨＩＩの存在を示した。組込まれたエタノール産生遺伝子は 保持しているがＣｍ耐性遺伝子およびプラスミドは喪失しているこれらコロニー のうちの二つは、更なる研究のために選別され、ＫＯＩおよびＫＯ２と命名され た。

例４において考慮されるが、第二のアプローチによって、プラスミドｐＬＯＩ５ １０からの環化された５ａｌＩフラグメントを用いてＣｍ耐性の形質転換体が得 られ、ＫＯ３と命名された。このアプローチにおいては、置換プラスミドは細胞 中に導入されない；エタノール産生遺伝子および関連のＣｍ耐性遺伝子のみが染 色体中に組込まれる。このＫＯ３クローンもまた、アルデヒド指示プレート上で ＫＯＩおよびＫＯ２と同じピンクのコロニーを形成した。対象のＡＴＣＣ１１３ ０３は白色のコロニーを形成する一方、ＡＴＣＣ１１３０３（ｐＬＯＩ２９７　 ）は強い赤色のコロニーを形成してｚ、ｍｏｂｉｌｉｓ遺伝子の高レベルの発現 を示した。

続いて、アルカリ性ＳＤＳ溶解法によって、これら三つの組換体からのベクター の単離が試みられた。臭化エチジウムで染色されたこれら三つのプレバレージョ ンのアガロースゲル中には、肉眼で視認できるベクターは存在しなかった。これ らプレバレージョンはまた、ホストとしてのＴｅ３に関して、Ｃｍ耐性の選別を 伴う形質転換実験で試験された。形質転換体は全く回収されず、ベクターの不存 在が更に確認された。

＜ＫＯＩ、ＫＯ２およびＫＯ３株による醗酵〉二図３Ａおよび図３Ｂは、１０％ グルコースでのＫＯ２およびＡＴＣＣ１１３０３（ｐＬＯＩ２９７　）による醗 酵の比較を示している。ＫＯ１株による醗酵はＫＯ２による醗酵と同一であり、 提示されていない。これらの新規な構築物は、低い容量生産性（ｖｏｌｕｍｅｔ ｒｉｃ　ｐｒｏｄｕｃｊｉｖＮｙ）およびエタノール収率（表２）に示されるよ うに、極めて非効率的なエタノール産生体である。増殖はＡＴＣＣ１１３０３（ ｐＬＯＩ２９７　）の半分未満に制限され、また７２時間後でも４ｇ／リットル のエタノールしか産生されなかった。ＫＯ３株はＫＯＩおよびＫＯ２よりも若干 良好ではあるが、依然として極めて貧弱なエタノール産生体である（図３Ｃ−Ｄ 、表２）。

表２　Ｅ、　ｃｏｌｉ　（ＡＴＣＣ１１３０３）の組換え株によるグルコースお よびキシロースからのエタノール生成ｐｌ、０１２９７ｂ［０１１０２ＫＯ３Ｋ Ｏ４［０５塩基　１．１　５．７　６．３　５゜５　１．３　１．４（ｍｍｏｌ ｅｓ／ｇ糖） エタノール収率　４８．８　４．０　４．０　１０．４　５２．８　５２．８（ ｇ／ｌ） エタノール収率　０．５２　（１，０５１１，０５１）、１３　０．５６　０． ５６（ｇ／ｇ糖） 理論上の収率　１０１　１０　１０　２６　１　１１（１（％） Ｖｏｌ、Ｐｒｏｄ、　１．９　０ｊ　Ｏｊ　Ｏ，４１，５１，５（ｇ／ｌ　＊ｈ ） ３０−ｈエタノール　４１．８　３．２　３．２　６．４　３６．０　３６．０ （ｇ／ｌ） 細胞収率　、０４８　．０２１　．０２１　．０２８　０．４４　．０４０（ｇ ／ｇ糖） ａ　最初に添加された糖の全量に基づく計算。

ｂ　ＡＴＣＣ１）３０３（ｐＬＯＩ２９７）はプラスミドに担持されたエタノー ル遺伝子を有している。

ｃ　Ｖｏｌ、Ｐｒｏｄ、；容積生産性−収率／時間表２（続き） ＫＯｌｏ　Ｋｏｌｌ　Ｋｏｌｌ　ＫＯ１２ＫＯ４（ｒｅｃＡ）　（ｆｒｄ）　（ ｆｒ＋１）ｄ（ｆｒｄ、ｔｅｃＡ）　＋ＡＣｅ塩基　１．１０．６　０　＋、１ １．０（ｍｍｏｌｅｓ／ｇ糖） エタノール収率　５１．２　５２．８　３８．８　５４，４　５４．４（ｇ／ｌ 、） エタノール収率　０．５４　０．５４　０．３９　０．５７　０．５７（ｇ／ｇ 糖） 理論上の収率　１０７　１０７　７６　１１２　１１２（％） ３０−ｈエタノール　３８．０　３８．０　２９．０　３０．４　３８．５（ｇ ／ｌ） 細胞収率　、（１４１，０４２，０４１，０３５，０４５ｄ　ｐＨ制御なしで行 なった醗酵。

ｅ　３ｇ／ｌの酢酸ナトリウム（最終濃度２２　ｍＭ　）を補充。

表２　（続き） ｐＬＯ１２９７ＫＯ４Ｋｏｌｌ　ＫＯ１２（ｆｒｄ）　（ｆｒｄ、　ｒｅｃＡ） 塩基　１．４　１．６　０．５　０．６４（ｍｍｏｌｅｓ／ｇ糖） エタノール収率　３６．０　３６．０　４１．６　４０．８（ｇ／ｌ） エタノール収率　０．４７　０．４７　０．５３　０．５３（ｇ／ｇ糖） 理論上の収率　９４　９４　１０４　１０３（％） Ｖｏｌ、Ｐｒｏｄ、　１．０　１．１　１ｊ　］、、１（ｇ／ｌ＊ｈ） ３０−ｈエタノール　３０．０　２５．６　３０．４　２６．０（ｇ／　１　） 細胞収率　、０５０　．０４７　．０５１　．０４８（ｇ／ｇ糖） ａ　最初に添加された糖の全量に基づく計算。

ｂ　ＡＴＣＣ１１３０３（ｐＬＯｆ２９７）はプラスミドに担持されたエタノー ル遺伝子を有している。

これら三つの新規株による醗酵の間、ｐＨを維持するために大容量の塩基が消費 され、酸性醗酵生成物の過剰生成が示された。

く組込まれたｐｄｃ遺伝子およびａｄｈＢ遺伝子の突然変異による発現の増大〉 アルデヒド指示プレート上で観察されたピンクの発現型は、エタノール産生のた めの２．ｍｏｂｉｌｉｓ遺伝子の発現が不十分であることを示していると思われ る。当該技術において周知の標準的条件下でのエチルメタンスルホネートを用い た突然変異誘発の後に、アルデヒド指示プレート上での暗赤色の発現型をスクリ ーニングスルことによって、ＫＯ２に組込まれた遺伝子の発現増大を生じる突然 変異が得られた。一つのプレートに２００−４００のコロニーを有する約２００ のプレートを分析した。四つの暗赤色コロニーが単離され、色が濃くなったこと によってＡＤＨｎの発現増大が示された。

高レベルの抗生物質耐性を発現する突然変異体が挿入された他の遺伝子をも高レ ベルで発現するか否かを決定するために、高レベルのＣｍ耐性の選別を用いて、 ＫＯ３の自然突然変異体が富化された。−晩培養したものの稀釈列を、２％グル コースおよび６００μｇ／ｍｌのＣｍを含むルリア観点プレート上に撒いた。− 晩インキユベーションした後に、撒かれた細胞１００．０００個当たり略一つの 頻度で、２．ｍｏｂｉｌｉｓのｐｃｉＣおよびａｄｈＢｉｔａ遺伝子の高レベル 発現を示す大きなコロニーの発生が観察された。これら全てのコロニーはＡＴＣ Ｃ１１３０３（ＰＬＯＩ２９７　）　、即ち優れたエタノール産生株であるプラ スミドに基づく構築物と同じく、アルデヒド指示プレート上で暗赤色の発現型を 示した。二つの突然変異体、即ちＫＯ４株およびＫＯ５株が更なる研究のために 保存された。

Ｃｍ耐性の選別に際してＫＯ４株およびＫＯ５株からのＤＮＡプレバレージョン がＴｅ３を形質転換できないこと、および臭化エチジウムで染色されたアガロー スゲル中にベクターＤＮＡが存在しないことによって、これら株におけるベクタ ーの欠失が再度確認された。

＜ＫＯ４、ＫＯ５およびＫＯ２０による醗酵〉：図３Ｃおよび図３Ｄは、ＫＯ４ およびＫＯ５による１０％グルコースの醗酵を示している。この二つの株は、高 レベルの抗生物質に対する耐性を選別することによって、組込まれたエタノール 産生遺伝子の発現を増大させる突然変異が同時に選別されたものである。二つの 株は同一であり、ＫＯ４による醗酵のみがプロットされている。これら改良され た構築物による増殖、細胞収率およびエタノール収率は、プラスミドに基づく構 築物であるＡＴＣＣ１１３０３（ｐＬＯｆ２９７　）のそれに殆ど等価であった 。表２を参照のこと。初期段階の容量生産性によって、また３０時間後に達成さ れるエタノールレベルによって示されるエタノール生成速度はＡＴＣＣ１１３０ ３（ｐＬ０１２９７　）よりもやや遅かったが、ＫＯ４およびＫＯ５での理論収 率は高く、添加されたグルコースに基づく１００％を越えていた。この遅い醗酵 の際の高収率は、複合栄養物がピルベート（従ってエタノール）に同時異化され ることを反映している。これらの複合栄養物は、生合成のための主要な窒素源と して役立つ。糖が消費され尽くした後の継続する脱窒素によって、ＫＯ４、ＫＯ ５およびＡＴＣＣ１１３０３（ｐＬＯ！２９７　）でのｐＨの上昇を生じた。こ のようなｐＨ上昇は、糖の消費をモニターするための便利な方法を提供する。

また、ＫＯ４およびＡＴＣＣ１１３０３（ｐＬＯＩ２９７　）による８％キシロ ースの醗酵が比較された（図３Ｅおよび図３Ｆ）。

ＫＯ４は、３０時間後のエタノールレベルから明らかなようにエタノール生成速 度は若干遅かったが、エタノール収率ではプラスミドに基づく構築物と等価であ った（表２）。

図３Ｇは、組込まれたエタノール産生遺伝子の発現を増大させる誘発突然変異を もったＫＯ２０株による、１０％グルコースおよび８％キシロースの醗酵を示し ている。誘発された突然変異をもったこの株による二つの糖の醗酵は、高レベル の抗生物質で選別された自然突然変異を有するＫＯ４株およびＫＯ５株による醗 酵と本質的に同じであった。

く添加された酢酸の影響〉： 嫌気的増殖の際の、ｐｆｌ遺伝子生成物は酢酸産生の主要ルートであり、また生 合成のための主要なアセチルＣｏＡ源であることが示されている。２．ｍｏｂｉ ｌｉｓエタノール経路遺伝子による挿入不活性化は、ＡＴＣＣ１１３０３の誘導 体における脂質合成のためのアセテート欠乏を導き得る。酢酸ナトリウムを補充 することによってエタノール産生速度が改善され、収率が僅かに増大されること が見出された（図３０およびＤ；表２）。

く組換えＥ、ｃｏｌｉにおける２、ｍｏｂｉｌｉｓ酵素の発現〉：選別された組 換え株のフレンチプレス抽出物において、１、　ｍｏｂｉｌｉｓ　Ｐ　Ｄ　Ｃの 比活性が測定された。ＰＤＣは比較的熱に安定な酵素であり、活性は、このよう な測定を複雑にする天然のＥ、ｃｏｌｉ活性を熱で不活性化した後の抽出物にお いて測定された。対照株のＡＴＣＣ１１３０３には活性が検出されなかった。Ｋ Ｏ２およびＫＯ３の両者は、０．２　Ｕ／ｍｇの低レベルの活性を生じた。高Ｃ ｍ耐性の突然変異体であるＫＯ４の抽出物には、１０倍も高い活性（２，Ｉ　Ｕ ／ｍｇタンパク）が存在した。

ＫＯ４におけるＰＤＣのレベルは、プラスミドに基づく構築物のＡＴＣＣ１１３ ０３（ｐＬＯｒ２９７　）中で産生されるレベルと殆ど等価であり、天然の２． ｍｏｂｉｌｉｓ中に見られレベル（Ｉｎｇｒｍｍ、Ｌ、Ｌ、、　ａｎｄ　Ｔ、Ｃ ｏｎｗａｙ　［１９８８］　Ａｐｐｌ、Ｅｎｖｉｒｏｎ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、 　５４：３９７−４０４　）と同様であった。

これらの株からのタンパク抽出物は、５ＤＳ−ＰＡＧＥによっても試験された。

ＡＴＣＣ１１３０３と組換え誘導体との間には、１ｍｏｂｉｌｉｓ遺伝子に帰す べき変化に加えて、タンパクにおける数多くの変化が観察された。ＫＯ４および ＡＴＣＣ１１３０３（ｐＬＯ！２９７　）は、ＫＯ２およびＫＯ３に存在するよ りも高レベルで、ＰＤＣのサイズに対応する６０．０００　ＭＮ領域のタンパク バンドを含んでいた。このバンドはＡＴＣＣ１１３０３対照株には存在しなかっ た。ｚ、ｍｏｂｉｌｉｓのＡＤＨＩＩが見出される３８．０００　ＭＮ領域には 多くの内因性タンパクが見出だされたため、発現の相違は不明瞭であった。

＜　Ｅ、　ｃｏｌｉ　ＡＴＣＣ１１３０３によって産生される有機酸〉：醗酵の 間に、Ｅ、ｃｏｌｉのエタノール産生株によって著しい量の塩基が消費され（表 ２）、同時生成物としての酸の生成が示された。表３に示すように、高レベルの これら酸は、ＡＴＣＣ１１３０３親株およびＫＯ３株によって産生される。

酢酸　乳酸　コハク酸 ＡＴＣＣ１１３０３６６６４１５８ （なし） ＡＴＣＣ１１３０３（ｐＬＯＩ２９７）　２１　３２　４９（プラスミド担持） ＫＯＩ　１８　６７３　６２ （組込み、突然変異なし） ＫＯ２１８６０２５７ （組込み、突然変異なし） ＫＯ３６９５２５６６ （組込み、自然の） ＫＯ４２２２９７０ （組込み、自然の） ＫＯＩＯ１８２０７３ （ＫＯ４，ｒｅｃＡ　） Ｋｏｊｉ　１４　３２　２ （ＫＯ４，ｆｒｄ） ＫＯ１２６４０２ （Ｋ　０４．　ｒｅｃＡ、ｆｒｄ） ＫＯ２０４６０２ （組込み、誘発） ａ　１０％ゲルコールでの２回の醗酵の平均、７２時間後にサンプリングされた ｂ　括弧内の注記は、外来エタノール遺伝子およびエタノール産生を増大する関 連突然変異の状態を示す。

ＡＴＣＣ１１３０３（ｐＬＯＩ２９７　）およびＫＯ４は低レベルの酢酸および 乳酸を産生ずるが、ＫＯ４によるコハク酸産生は高いままである。コハク酸産生 をなくすために、Ｔ　ｎ　１（ｌのテトラサイクリン耐性マーカーの選別を含む 標準的な遺伝子的方法を用いてＴｎｌＯベクターを挿入し、続いてフザリン酸選 別を用いてＴ　ｎ　１０を除去して、ＴｎｌＯの不正確な切除に起因するｆｒｄ 削除をもたらすことによって、ｆｒｄ突然変異が導入された。得られた株（ＫＯ ＩＩ）はフマレートレダクターゼ活性を欠失していた。

このｆｒｄ突然変異は、グルコース醗酵の際のコハク酸産生のレベルを、親のＫ Ｏ４における産生の３％にまで減少させた（表３）。しかしながら、醗酵の間に 酸の滴定をしないならば、この低レベルの酸の産生でさえ、滴定をしない醗酵中 のｐＨを低減し、従ってグルコースからのエタノールの生産性を減少させるには 充分である。

しかし、酸の滴定を伴うならば、フマレートレダクターゼの除去によって、キシ ロースからのエタノール産生速度、細胞収率およびエタノール収率は改善される （表２）。また、滴定を伴うならば、エタノール収率は本質的に同じままである が、グルコースからの容量生産性は増大する（表２）。

く染色体に組込まれた遺伝子およびプラスミドに基づく遺伝子のＥ、ｃｏｌｉ中 における安定性の比較〉：ＡＴＣＣ１１３０３（ｐＬＯＩ２９７　）　、ＫＯ４ およびＫＯ５が、抗生物質選別を伴わずに、１０％（ｗ＃　）を含むルリアブロ ス中において３０℃で６８世代まで増殖された。４８時間後および１２０時間後 に、培養物は選別プレート、非選別プレートおよびアルデヒド指示プレート上に 撒かれ、全ＣＦＵに対するＣｍ耐性ＣＦＵの比ならびにエタノール産生コロニー の比率が測定された。表４は、ＫＯ４およびＫＯ５の挿入された遺伝子が、染色 体挿入物として安定に保持されたことを示している。

組換体　形質産生を保持した。＜−セントＣ世代数） ＫＯ４１００（３８，５）　１００（６８，５）Ｋ　Ｏ５１００（３８，７）　 １００　（６８，７）ＴｃＥ、ｃｏｌｉＢ（ｐＬＯＩ２９７）　１００（３７ｊ ）　９７（６７，３）ａ　：形質転換されたＥ、ｃｏｌｉＢが、抗生物質選別を 伴わず（こ、１０％（Ｗ／Ｖ　）を含むルリアブロス中において３０℃で増殖さ れた。Ｔｃ耐性遺伝子およびエタノール遺伝子は、プラスミドに基づく構築物か ら同等に喪失された。

エタノール産生のための遺伝子が染色体中に組込まれて０るＫＯ４株およびＫＯ ５株は、プラスミド９ＬＯ１２９７での従来の構築物よりも優れている。組換形 質であるエタノール産生の保持ついては、Ａｌｔｅｒｒｈｕｎ、Ｆ、、　ａｎｄ 　Ｌ、０．Ｉｎｇｒａｍ　［１９８９］　Ａｐｐｉ、Ｅｎｖｊｒｏｎ、Ｍｉｃｒ ｏｂｉｏｌ、５５：１９４３−１９４８を参照のこと。たとえ、ｐＬ０１２９７ を有するＥ、ｃｏｌｉ株のようにプラスミド喪失の比率力（低いときでも、少な い培養物を数百刃ガロンの醗酵ブロス１こまでスケールアップすることが含まれ る商業的なエタノール製造の目的において、本発明に従って組込まれた外来遺伝 子を有する株は、比較され得るプラスミドに基づく株を凌駕した著しい利点を与 える。

＜　ｒ　ｅ　ｃＡ突然変異の効果〉： ｒｅｃＡ突然変異はＫＯ４およびＫＯＩＩにも導入され、これら株は組換えプラ スミドのホストとして使用された。得られた株は、夫々ＫＯＩＯおよびＫＯ１２ と命名された。このｒｅｃＡ突然変異は酢酸、乳酸またはコハク酸の産生には影 響しなかったが、ｒｅｃＡ、ｆｒｄ突然変異体（ＫＯ１２）における増殖および 遅い醗酵を減少させた（表２）。この影響の基礎は知られておらず、構築の間に 創製された二次的突然変異を表わしているかもしれない。

く本発明に従って染色体に挿入され得る遺伝子〉：本発明は、ここに特別に例示 したａｄｈおよびｐｄｃ遺伝子以外の遺伝子を用いて実施することができる。グ リコリシスの酵素は、主要な配列に関してかなりの保存性を示すことが確立され ている。例えば、Ｃ０ＩＩＷＩＴ、　Ｓｗｅｌｌ、ａｎｄ　ｌｎｇｒａｍ［１９ ８７Ｊ　ＩＢａｃｔｅｒｉｏｌ、１６９：５６５３−５６６２を参照のこと。こ の高レベルの保存性は、当業者が、酵素ファミリーの一以上のメンバーからの主 要な情報を用いて、機能的に等価で且つ遺伝子的に関連した酵素を他の微生物か ら単離することを可能にする。実際に、１ｍｏｂｉｌｉｓ　ｐｄｃ及びＳ、　ｃ ｅｒｅｖｉｓｉａｅのｐｄｃに関する本件発明者の情報をＤＮＡプローブの設計 に用いて、とうもろこし由来のピルベートデカルボキシラーゼ遺伝子をクローン 化するために、丁度このようなアプローチが成功裡に用いられている。Ｋｅｌｌ ｙ、Ｐ、Ｍ、［１９８９］　Ｐｌａｎ！　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ＢｉｏｌｏｇＦ 　１３：２１３−２２２を参照のこと。また、全体の遺伝子をプローブとして用 いる他の戦略も使用され得る。従って、本発明の目的にとっては、ピルベートデ カルボキシラーゼ活性が、本発明で例示したように１ｍｏｂｉｌｉｓからの遺伝 子によって与えられるか、或いは同一の酵素活性を指示するコーン由来の遺伝子 （既にクローン化され、配列決定されている）、酵母または他の微生物由来の遺 伝子によって提供されるかということは問題ではない。また、本発明を実施する ために、アルコールデヒドロゲナーゼ活性がウマ、酵母、ヒトもしくは昆虫由来 の遺伝子によって与えられるか、或いは他のバクテリア遺伝子から与えられるか も問題ではない。アルコールデヒドロゲナーゼ活性の発現はアルデヒド指示プレ ート上で直接観察され得るから、配列情報は必ずしも、この酵素活性を示す蛋白 をコードする追加の遺伝子を単離するための最良のアプローチではないであろう 。しかしながら、このような単離のために配列が用いられるか否かは、現実的に は重要ではない。実際に、多くのアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子が既に入手 されており、多くの論文で良く説明されている。

ｚ、ｍｏｂｉｌｉｓは、機能的なアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子をコードす る二つの遺伝子を含んでいる。一つは、ここに例示されたａｄｈＢであり、これ はＣＩｏｓｔｒｉｄｉｕａ＋　ａｃｅｔｏｂｕｔ７１ｆｃｕｍ由来のブタノール （アルコール）デヒドロゲナーゼ、Ｅ、ｅｏｌｉ由来のプロパンジオール（アル コール）オキシドレダクターゼおよびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ由来のＡＤＨ ＩＶアルコールデヒドロゲナーゼと進化論的に関連している。これらは全てクロ ーン化され配列が決定されている。アルコールデヒドロゲナーゼをコードする第 二の２．ｍｏｂｉｌｉｓ遺伝子はａｄｈＡであり、これは亜鉛アルコールデヒド ロゲナーゼであり、最近になって我々本願発明者がクローン化し、配列を決定し た。このａｄｈＡは、全て入手可能なヌクレオチド配列から推論された一次構造 の比較に基づいて、動物、植物中における記述された典型的なアルコールデヒド ロゲナーゼおよび酵母において優勢な遺伝子と進化論的に関連している。我々は 、本発明に従って予想されるように、このａｄｈＡ遺伝子が非常にうまく元のａ ｄｈＢ遺伝子を置換することを見出した。

ピルベートデカルボキシラーゼ活性（ピルベートはアセトアルデヒド十二酸化炭 素に変換される）をもった蛋白の合成は、アルデヒド指示プレート上で直接観察 され得る。このアルコールデヒドロゲナーゼ活性の発現もまた、アルデヒド指示 プレート上で直接観察され得る。従って、上記のように我々の仕事による配列情 報がコーンｐｄｃ遺伝子の単離に最近用いられたが、配列情報は他のａｄｈ遺伝 子またはｐｄｃ遺伝子の配置に対する必ずしも最良のアプローチではない。こう して、機能的等傷物を与える多くの他のｐｄｃ遺伝子およびａｄｈ遺伝子が、他 の生命体から単離され得る。これらの他の遺伝子は、使用のために入手可能なｚ 、ｍｏｂｉｌｉｓのｐｄｃ遺伝子およびａｄｈ遺伝子のための適切な置換体であ ること、また、他のこのような遺伝子は現在の遺伝子をプローブとして用いるこ とによって、或いは、より好ましくは指示プレート上での活性を観察することに よって同定され得ることは完全に予期され得る。

より一般的には、エタノール酸性遺伝子以外の多くの遺伝子が、本発明に従って 染色体中に組み込まれ、発現され得るであろう。これらに本質的に含まれるのは 、組換ホスト内で何れかの望ましいポリペプチドを発現し得る遺伝子、例えばイ ンスルン、成長ホルモン、および商業的に重要な酵素をコードする遺伝子である 。

く例示バクテリアの有用性〉： ある種のバクテリアおよび他の単純な生命体は、ヘキソース、ペントース及び乳 糖を含む広範囲の基質を活発に代謝することができる。この特徴が、Ｅ、ｃｏｌ ｉを組換ＤＮＡ製造法のための魅力的なホストにしている。ここに記載される発 明は、種々のバイオマス源、特に木および非食用植物の主要部分をなすヘミセル ロース（キシロース、アラビノース及び他の糖を含む）並びにホエー（乳糖）の ような未利用バイオマス（ｕｎｄｅｒ　ｕ目１ｉｘｅｄ　ｂｉｏｍａｓａ）から 、エタノールの経済的に製造するために、組換えバクテリア株を使用することを 可能にする。また、複合ポリマーを分解する細胞外酵素の産生のような特殊な能 力をもった微生物が、本発明に従ってエタノール産生体に変換され得る。

従って、本発明の一つの側面は、エタノールの製造のための改良された微生物を 提供する。Ｅ、ｃｏｌｉ細胞は、ａｄｈおよびｐｄｃをコードする遺伝子がホス ト染色体中に組み込まれるように形質転換された。従来は、エタノール産生のた めの上記二つの遺伝子を具備したプラスミドで形質転換することによって、Ｅ、 ｃｏｌｉにエタノール産生能力が与えられてきた。

これら従来の形質転換の成功は、遺伝子の多重コピー、典型的には細胞当たり３ ０−３００コピーから得られる極めて高レベルのエタノール産生酵素によっても たらされた。

ここに記載する、ｐｄｃおよびａｄｈ遺伝子の単一コピーがホスト染色体中に組 み込まれた初期構築物は、代謝をエタノールに変え、またこれらプラスミド上の 遺伝子の多重コピーによって与えられる機能レベルを倍加するには不十分なレベ ルのＰＤＣおよびＡＤＨを与えた。続いて、上記の自然の突然変異および誘発突 然変異によって、クロラムフェニコール耐性のための遺伝子（もし存在するなら ば）並びにＡＤＨおよびＰＤＣのための遺伝子を含む、染色体に組み込まれた全 ての遺伝子の発現を自然に増大させる細胞が与えられた。

これらの突然変異体は高レベルのエタノール産生酵素を生成し、従って多重コピ ープラスミドを含む従来のバクテリアと機能的に同等であった。Ｃｍ耐性マーカ ー遺伝子並びにエタノール遺伝子を有する株での自然の突然変異の場合に、Ｃｍ 耐性遺伝子の発現増大がエタノール関連酵素の発現増大をも示すという結果は、 特に驚くべきものであった。何故なら、Ｃｍ耐性遺伝子はそれ自身のプロモータ を含み得るし、またａｄｈＢ遺伝子の転写ターミネータの下流にさえ存在し得る からである。

本発明の他の側面は、組換タンパクの効率的な製造のために、このエタノール産 生組換えバクテリアを使用することに関する。即ち、この組換細胞は、有用なタ ンパクをコードする遺伝子で更に形質転換され得る。また、これら追加の遺伝子 は染色体中に組み込まれ得るし、或いはプラスミドにも担持され得る。実際のと ころ、本発明に従えば、組み込まれた遺伝子（この例ではエタノール産生遺伝子 ）の高レベルの発現によってプラスミドにこれらを担持させる必要性がなくなる から、本発明の組換細胞は、プラスミド上に担持された追加の遺伝子を受入れ且 つ維持するために特に適している。ｒｅｃＡ突然変異のような、相同性組換を阻 害する追加の突然変異は、組換タンパクの製造におけるこのようなホストの環境 的安全性を増大するであろう。

糖代謝からの有機酸の蓄積は、一般的に嫌気的増殖の間の醗酵の結果と考えられ る。しかし、一般には好気的条件下での激しい撹拌の間でさえ、多量のアセテー トがＥ、ｃｏｌｉによって生成される。細胞密度が高いときは、アセテートの産 生は増殖の初期の段階から進行し、後期の段階に限定されない。

この好気的条件下でのグルコースからの酸生成は、リン酸緩衝液を補充した培地 中での最終細胞密度が増大することによって示されるように、ブロス中および固 体培地上での増殖を制限するように働く。

ホスト微生物のエタノール醗酵への転換は、種々の組換生成物の産生を増大させ るために用いられ得る。これら生成物における機能の維持は、高密度培養におけ る増殖の際のブロスのｐＨに関係する。単位細胞タンパク当たりのこの酸性化の 範囲は、有機酸よりもエタノールを酸性させることによって最小限に抑制される 。酸素移動は屡々、微生物の高密度培養での増殖の際の主要な制限因子であり、 酸生成および増殖培地のｐＨドリフトをもたらすのはこの制限による。醗酵生成 物としてエタノールを産生ずる組換え体において、エタノール産生酵素は、グリ コリシスからのピルベートの一部をアセトアルデヒドに変換し、またＮＡＤＨを 再酸化して、与える損傷の少ない代謝産物のエタノールを産生ずる。酸化的リン 酸化のための機能的呼吸銀およびエタノール産生酵素の両方を含む株は、ＮＡＤ ＋の再生の間に両者の系が作動し、また酸性廃棄生成物が還元されるため、より 高い細胞密度にまで増殖され得る。このような固有の柔軟性によって、組換生成 物の収率増大がもたらされるのと同様、プロセス制御についてもさほど厳格な条 件は要求されなくなる。

従って、本発明のエタノール産生バクテリア株は、最小限の酸生成を伴う嫌気的 条件下で組換タンパクを製造するための優れたホストである。多くの組換えタン パクはシスティン架橋またはジスルヒド架橋を含み、これらの適切な折り畳みま たは反応は活性酵素を形成するための不可欠の特徴である。

ジスルヒド結合の形成は酸素によって促進されるから、このようなタンパクを嫌 気的条件下で合成することによって、単離および制御された条件下での折り畳が 行なわれる前に誤った折り畳みが起こる機会が減少し、生物学的に活性な生成物 を多く回収することが可能となる。

既述したところから、本発明によって与えられる、タンパクまたは全体の代謝経 路をコードする遺伝子を染色体に形質転換する能力は極めて有用であることが、 当業者には容易に明らかであろう。この点に関して、例えば、異なった遺伝子座 からの遺伝子が染色体上に配置される種々の状況に対して、本発明を適用するこ と考えられる。エタノール産生をコードする遺伝子の配置は、この新規な発明概 念の一つの例にしか過ぎない。ここに説明した原理に従えば、種々の生命体由来 のアルコールデヒドロゲナーゼ活性をコードする遺伝子が、望ましい経路を創製 するために、種々の生命体由来のピルベートデカルボキシラーゼ活性をコードす る遺伝子と組合わされ得る。他の経路に必要なタンパクをコードする遺伝子もま た、染色体に組み込まれ得るであろう。また、当業者には明らかなように、ここ に説明したエタノール経路について、アルコールデヒドロゲナーゼ活性およびピ ルベートデカルボキシラーゼ活性をコードする遺伝子が共通の制御下にあること は必要とされない。

次に、以下に示す例に基づいて本発明を更に詳細に説明する。

この例を通して、特に言及しない限りは次の材料および方法が用いられた。全て の遺伝子構築物のために、Ｅ、ｃｏｌｉＴＣ４が用いられた。ＣｏｎｗＨ，Ｔ、 　、Ｙ、　Ａ、　Ｏｓｍｍｎ、Ｊ、　Ｉ、　Ｋｏｎｎａｎ、Ｅ。

Ｍ、Ｈｏｆｆ＋ｎａｎ、ａｎｄ　Ｌ、０．Ｉｎｇｒａｍ　［１９８７］　Ｊ、Ｂ ａｃｔｅｒｉｏｌ、１６９：９４９−９５４を参照のこと。全ての増殖実験にお いて、選別のための適切な抗生物質および指示濃度のグルコースを含むルリアブ ロスが用いられた。特に言及した場合を除き、抗生物質は次の最終濃度で用いら れた：アンビシリンは５０μｇ／ｍｌ；クロラムフェニコール（Ｃｍ）は指示に 従って２０μｇ／ｍｌまたは６００μｇ／ｍｌ；テトラサイクリンは１２．５μ ｇ／ｍ１６１゜ｍｏｂｉｌｉｓ　ＡＤＨＩ［を発現する組換えＥ、ｃｏｌｉによ って、エタノールから生成されたアルデヒドを検出するために、シッフ試薬を含 むＡＤＨ指示プレートが用いられた。Ｃ０ＩＩＷＩＴ、Ｔ、、　Ｇ、Ｗ、５ｅｖ ｅｌｌ、Ｙ、Ａ、Ｏｓｍａｎ、ａｎｄ　Ｌ、０．’ｌＢｒｍｍ　［１９８７］　 Ｊ、Ｂａｃｔｅｔｉｏｌ。

１６９：２５９１−２５９７を参照のこと。

プラスミドの調製、制限酵素での消化、ライゲーション、形質転換およびゲル電 気泳動のために、標準的方法が用いられた。続いて行なわれるクローニングのた めの制限フラグメントの単離は、ＭｉｃｒｏｆｉＨｅｒｒｕｇｅ管（Ｒｘｉｎｉ ｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｊ　Ｃｏ）を用いることによりマイクロフィルターＧＴ Ｇアガラロース（ＦＭＣＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ、ＭＥ）からの溶出によって達 成された。

Ｅ、ｃｏｌｔピルベート拳ホルメート−リアーゼ遺伝子（ｐｆｌ）を含む組込み プラスミドを構築するために用いた方法が、図１に示されている。Ｅ、ｃｏ！ｉ の不完全なピリベート・ホルメート−リアーゼ（ｐｆｌ）遺伝子を有するプラス ミドｐＨ８４（既出のＳａｖ！ｒｓ　ｅｒ　ＡＩ　［１９８８］　）がＢａｍＨ Ｉで部分的に消化され、その５′−突出末端がＤＮＡポリメラーゼ■のフレノウ フラグメントで埋められ、該フラグメントは５ＡＩＩリンカ−（ｄＣＧＴＣＧＡ ＣＧ）へのライゲーションによって再結合された。ｐｆｌ遺伝子の外側のＢａｍ ＨＩ部位がＳＡＩ■部位で置き換えられたこれらのプラスミドは、個々の形質転 換体のスクリーニングによって同定された。得られたプラスミドのｐＬＯＩ５１ ３は、該プラスミドのｐｆ１部分をプラスミドの残りの部分から取出すことを可 能とする二つの５ＡＩＩ部位を含んでいる。

クロラムフェニコール耐性マーカー遺伝子は、１ｊ７−ｋｂのＨｈａＩフラグメ ントとして、プラスミドクローニングベクターのｐＢＲ３２５から切り出された 。Ｐｒｅｎｔｋｉ、Ｐ、、　Ｆ、にｘｒｃｈ、　Ｓ、ｌ１ｄａ、ａｎｄ　Ｊ、Ｍ ｅ７ｅｒ　［１９８１１Ｇｅｎｅ　１４：２８９−２９９を参照のこと。

このＨｈａＩフラグメントは、フレノウポリメラーゼで処理されて突出末端を埋 められ、ｐＬＯＩ２９５内のａｄｈＢ遺伝子の下流にあるフレノウ処理されたＢ ａｍＨ１部位に、ｐｄｃ遺伝子およびａｄｈＢ遺伝子と同じ向きでライゲートさ °れて、ｐＬＯＩ５１５が創製された。ｌｎｇｒａｍ、　Ｌ、　Ｏ，、Ｔ、　Ｃ ｏｎｗｍ７．　Ｄ、　Ｐ、　Ｃ１ａｒｋ、　Ｇ、Ｗ、Ｓｅｗｅｌｌ、　ｕｄ　Ｊ 、Ｆ、Ｐｒｅｊｏｎ　［１９８７］　Ａｐｐｌ、Ｅｎｖｉｒｏｎ、Ｍｉｃｒ。

ｂｉｏｌ、５３：２４２０−２４２５を参照のこと。プラスミドｐＬＯＩ５１５ は次いで５ＡＩＩで消化され、またＥｃｏＲＩで部分的に消化された。そして、 クレノウポリメリゼーションで平滑末端とした後、ＢａｍＨＩリンカ−（ｄＣＣ ＧＧＡＴＣＣＧＧ）でライゲートされた。このライゲーション混合物は、ＧＴＧ アガロースゲル上で分離された。プロモータのないｐｄｃおよびａｄｈ遺伝子、 並びにＣｍ遺伝子（プロモータ有り）を有すＥｃｏＲＩ−ＳＡＩ　Ｉフラグメン トの夫々の末端にＥｃｏＲＩおよび５ＡＩＩ部位が創製されたこのＢａｍＨＩフ ラグメントは、ｐＵｃ１９　（Ｂｅｆｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｕｒｃｈ　Ｌａｂｏｒ ａｔｏｒｉｅｓから入手−ゼで埋められ、再ライゲーションされてｐＬＯＩ５０ ８が創製された。ｐＬＯ＋５０８の４．６−ｋｂＢ　ａ　ｍ　ＨＩフラグメント が、プラスミドｐＬＯ１５１３に担持された不完全なｐｆｌ構造遺伝子における ＢａｍＨ１部位に挿入された。こうして得られたプラスミドｐＬＯＩ５１０は、 以下に説明する相同性組換（例４）を使用することによって、Ｅ、ｃｏｌｉ株Ｂ 　（ＡＴＣＣ１１３０３）の染色体中にｐｄｃ遺伝子、ａｄｈＢ遺伝子およびＣ ｍ遺伝子を導入するために用いられた。

例２　Ｅ、ｃｏｌｉピルベート・ホルメート−リアーゼ遺伝子およびプラスミド 複製のための温度感受性を含む組込みプラスミドの構築 プラスミドｐＬＯＩ２９５をＥｃｏＲＩおよび５ＡＩＩで消化し、ｐｄｃおよび ａｄｈＢ遺伝子を有する３、２−ｋｂのＥｃｏＲｌ　ＳＡＩ　Ｉフラグメントを 、ＤＮＡポリメラーゼのフレノウフラグメントで処理して平滑末端を形成した。

この平滑末端フラグメントを、転写に関して同じ向きの不完全なｐｆｌ遺伝子を もった、ｐＬＯＩ５１３のフレノウ処理されたしたＢａｍＨ１部位にライゲート してｐＬ０１５４２を得た。次に、ｐＬＯＩ５４２は５ＡＩＩで消化され、７． ２−ｋｂの５ＡＩＩフラグメントは、温度感受性のレプリコンおよびＣｍ遺伝子 を含むｐＭＡＫ７０５のポリリンカーにおける５ＡＩＩ部位にライゲートされた （図２）　。Ｈａｍｉｌｔｏｎ、Ｃ，Ｍ、、　Ｍ、ＡＩｄｅａ、Ｂ、に、ＷＨｈ ｂｔｌｒｎ、Ｐ、Ｂａｂｉｔｘｋｅ、　ａｎｄ　Ｓ、Ｒ，Ｋｕｓｈｎｅｒ　［１ ９８９］　）、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１７１：４６１７−４６２２を参照のこ と。得られたプラスミドｐＬＯＩ５４３は、相同性組換えによってＥ、ｃｏｌｉ 染色体中に組み込まれた（以下の例３を参照組換えプラスミドｐＬＯＩ５４３　 （これは３０℃で複製するが４４℃では複製しない）を用いることにより、Ｅ、 ｃｏｌｉ　ＢをＣｍ遺伝子で形質転換し、クロラムフェニコール耐性を与えた。

形質転換された細胞は、２０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコール及び５％（Ｗ／ Ｖ　）のグルコースを含む１００ｍ　ｌのルリアブロス中において４４℃で２４ 時間増殖され、染色体中へのプラスミドの組込みについて選別された。この培養 物の一部（０，１ｍｌ）を稀釈し、該稀釈された細胞懸濁液が、５％（ｗ／マ） グルコースヲ含み且つクロラムフェニコールを含まない１００　ｍｌ　（７）ル リアブロスを接種するために用いられた。この培養物は、切除を行なうために３ ０℃で１２時間増殖された。培養物の一部（０，１ｍｌ）を稀釈し、これを１０ ０　ｍｌの新鮮な培地に接種することによって、２回以上の増殖サイクルが実行 されな。次いで、１２時間培養物の稀釈された細胞懸濁液を用いて５％（Ｗ／ｖ ）グルコースを含むルリアブロスを接種し、プラスミドを除去するために４４℃ でインキュベートされた。最後に、該培養物の稀釈系列を２％（ｖ＃　）グルコ ースを含むルリア寒天プレート上に撒き、３０℃で増殖させることによって、単 一のコロニーが単離された。プレート上に現れた単一のコロニーは、アルデヒド 指示プレートを用いることによってエタノール産生遺伝子についてスクリーニン グされ、またクロラムフェニコールに対する感受性によりプラスミドの喪失につ いてスクリーニングされた。クロラムフェニコールに対して感受性であるが、エ タノール産生遺伝子を含んでいる二つのクローン、即ち、ＫＯ１株およびＫＯ２ 株が選別された。これらのクローンは、アルデヒド指示プレート上でピンクのコ ロニーを生成した。

例４　付随する抗生物質耐性遺伝子が保持される、’１．　ｍｏｂｉｌｉｓ　ｐ 　ｄ　ｃ及びａｄｈＢ遺伝子のＥ、ｃｏｌｉＢでの自己ライゲーションによって 環化された。共有結合的に閉館されたＤＮＡフラグメントは、自立的な複製を可 能とする配列を欠いていた。Ｅ、ｃｏｌｉＢは、２０ｇｇ／ｍｌのクロラムフェ ニコールに対する耐性について選別することによって、このライゲーション混合 物で形質転換された。クロラムフェニコール耐性の形質転換体におけるａｄｈＢ 遺伝子の発現は、クロラムフェニコールプレートからのコロニーを、ＡＤＨ指示 プレート上に撒くことによって確認された。単一のクローンが更なる特徴付けの ために選別され、ＫＯ３と命名された。

プラスミドに担持されたａｄｈ遺伝子またはクロラムフェニコール耐性遺伝子が 欠失していることは、ＤＮＡプレバレージョンに形質転換体が存在しないこと、 およびアガロースゲル上での直接分析によって確認された。このクローンは、ア ルデヒド指示プレート上でピンクのコロニーを生成した。

例３においては、ホスト細胞を形質転換させるために用いたＤＮＡ断片上のエタ ノール遺伝子に付随した抗生物質耐性遺伝子の喪失をもたらす条件下で、１ｍｏ ｂｉｌｉｓ　ｐ　ｄ　ｃおよびａｄｈＢ遺伝子のＥ、ｃｏｌｉＢにおける染色体 への組込みが行なわれた。例３の方法によって得られたＫＯ２株が、バクテリア 遺伝子学の技術で周知の標準的条件下で、メチルメタンスルホネートを用いて突 然変異誘発された。突然変異誘発されて生き残った細胞（約４−８Ｘ１０４）を 、］、プレート当たり２００−４００コロニーでアルデヒド指示プレート上に撒 いた。

ＡＤＨｎの増大した発現を示す四つの暗赤色コロニーが単離され、後記の例８で 説明するようにしてエタノール産生が試験された。これらの突然偏位体のうち、 エタノール産生収率が最も高いものをＫＯ２０株と命名した。

例６　付随した抗生物質耐性遺伝子の発現増大について選別することによる、１ ｍｏｂｉｌｉｓ　ｐ　ｄ　ｃおよびａｄｈＢ遺伝子の発現を増大させる突然変異 の選別例４において、Ｘ、ｍｏｂｉｌｉｓ　ｐ　ｄ　ｃ及びａｄｈＢ遺伝子のＥ 、ｃｏｌｉＢにおける染色体への組込みが、ホスト細胞を形質転換するために用 いたＤＮＡ断片上のエタノール遺伝子に付随した抗生物質耐性遺伝子の保持がも たらされる条件下で行なわれた。例４の方法で得られたＫＯ３株の稀釈系列を、 ２％グルコース及び６（ｌ［ｌμｇ／ｒｎｌのクロラムフェニコールを含んだル リア寒天プレート上に撒いた。−晩インキユベートした後に、撒かれた細胞１（ １０，０（１０個当たり略一つの頻度で、大きな脂肪コロニーが観察された。こ れらの大きなコロニーはアルコールを産生じ、アルコール指示プレート上での試 験において明赤色を呈した。ＫＯ４およびＫＯ５の二つの株について更に研究が 行なわれた。

例７　ｒｅｃＡおよびｆｒｄ突然変異の導入Ｅ、ｃｏｌｉ株ＪＣ１０２４０にお けるｒｅｃＡ突然変異が、Ｃｍ及びテトラサイクリンの両者に対する耐性（Ｔｎ ｌＯ付近の）についての選別によって、ＫＯ４株およびＫＯ５株に導入された。

ｒｅｃＡ発現型の同時遺伝（ｃｏ−ｉｎｈｅｒＨｇｎｅｅ）は、ＵＶ感受性の増 大によって確認された。

ｆｒｄ突然変異を可動化できるＥ、　ｃｏｌｉ　Ｈｆｒ株が、ＴｎｌＯについて の選別を伴って、ＤＷ１２からのｆｒｄ欠失突然変異［ｚ：ｄ：：ＴｎｌＯ，Δ （ＶｒｄＡＢｃＤ）コをＫ　Ｌ　２８２株に変換することによって構築された。

Ｂｌａｕｉ、Ｍ、、　Ｘ、Ｗｈｉｆｊａｃｈｅｒ、Ａ、Ｖａｌｄｏｖｉｎｏｓ、 　Ｂ、Ａ、Ｃ，Ａｃｋｒｅｌｌ、　Ｒ，Ｐ、Ｇｕｎｓａｉｕｓ　ｕ＋ｄ　Ｇ、Ｃ ｅｃｃｈ：ｎｉ　［１９８９］　Ｊ。

Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　２６４＋１３５９９−１３６０４を参照のこと。ｆｒｄ 突然変異は、フマレートレダクターゼ活性の喪失によって、テトラサイクリン耐 性形質導入体の中から同定された。こうして得られたＨｆｒ株のＳ　Ｅ　１７０ ６は、ｆｒｄ欠失をＫＯ４株に接合させるために用いられた。

ＴｎｌＯは、改良フザリン酸培地上での選別によって構築物から削除された。例 えばＭａｌｏ７．Ｓ、Ｒ，、ａｎｄ　Ｗ、Ｄ、Ｎｕｎｎ　［１９８１］ｌＢａｃ ｊｅｒｉｏｌｏｇＦ　１４５：１１１０−１１１２を参照のこと。この培地は］ リットル当たり、１５ｇの寒天、５ｇのトリプトン、５ｇの酵母抽出物、２０ｇ のグルコース、ＩＯｇのＮａＣ１，５（１ｍＨのクロルテトラサイクリン、１０ ｇのＮａＨ２ＰＯ４，１２ｍｇのフザリン酸、および１０　ｍＭのＺ　ｎ　Ｃ１ ２を含んでいる。クロルテトラサイクリン（１２，５ｍｇ／ｍｌ）及びフザリン 酸（１ｍｇ／ｍｌ）のストックが、７０％エタノール中で調製された。クロルテ トラサイクリン、リン酸ナトリウムおよび塩化亜鉛を含む複合培地成分が別々に オートクレーブ処理され、冷却した後に混合された。７０％エタノール中の抗生 物質はそのままで滅菌的である。ＴｎｌＯ喪失を選別するために、対数増殖期の 培養物の稀釈系列をフザリン酸プレート上に広げ、３７℃で一晩インキユベート した。得られたコロニーは、単離のために別のフザリン酸プレート上で画線培養 され、テトラサイクリン耐性の喪失について試験された。ＫＯＩＯ（ｒ　ｅ　ｃ Ａ）　、ＫＯＩＩＣｆｒｄ）およびＫＯ１２ＣｒｅｃＡ、ｆｒｄ）の三つの株が 構築された。

例８　エタノール遺伝子発現の特徴付けく醗酵実験〉： 醗酵は、１０％（ｗ／ｖ）グルコースまたは８％（Ｗ／Ｖ）キシロースを補充し たルリアブロス中で行なわれた。３５０１の培地を収容したフリー力（５００− ｍｌ、　Ｆｉｇｈ＊ｒ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　ＣＯＩｌＣｏｌｌｌＰ。

０ｔｌａｎｄｏ、　ＦＬ）に、適切に穿孔されたゴムキャ・ノブを介してｐＨ電 極、ガス出口およびサンプリング口を設けた。塩基（２Ｎ　Ｍｏ１ｌりの添加に より６．０のｐＨを維持するために、ｐＨコントローラ（Ｊｅｎｃｏ　ｍｏｄｅ ｌ　３６７１　；Ｗｈａｔｍａｎ　Ｌａｂ　５ａｌｅｓ、　Ｈｉｌｌｓｂｏｒｏ 、　ＯＲ）が用いられた。１６２５インチの星型磁石棒（１００ｒｐｍ　）で連 続的に撹拌しながら、３０℃でのバッチ醗酵を繰り返し行なつた。

単離されたコロニーからの接種菌は、振薇しないフラスコ内において３０℃で一 晩増殖された。醗酵は、略１．０の初期０、Ｄ、　（乾燥重量３３０　ｍｇの細 胞／リッタ）まで接種５０ｎｍ された。

分光光度計（Ｂａｕｓｃｈ　ａｎｄ　Ｌｏｍｂ　５ｐｅｃｔｒｏｎｉｅ　７０　 ）を用いた５５０　ｎｍでの混濁測定によって、細胞増殖をモニターした。エタ ノールは、例えばＤｏｍｂｅｋ、に、Ｍ、、　ａｎｄ　Ｌ、０．Ｉｎｇｒａｍ　 ［１９８６］Ａｐｐｌ、Ｅｎｖｉｒｏｎ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、５１：１９７− ２００に記載されているようにして、ガスー液体クロマトグラフィーによって測 定された。

変換効率の値は、塩基の添加によって生じる醗酵容量変化について補正され、ま た最初に添加された全ての糖が代謝されたと仮定された。容量生産性および死生 産性は、醗酵の初期段階（６−２４時間）の間に評価されたもので、最大容量を 表わす。表および図に示した全ての醗酵データは、２回以上のバッチ醗酵の平均 を表わす。

特表千６−５０４４３６　（１９） く培養における揮発性および非揮発性の酸の分析〉＝７２時間の醗酵の後、有機 酸分析のためにサンプルが取り出された。揮発性酸および非揮発性酸は、Ｈｅｗ ｌｅｊｆ−Ｐａｃｋｔｒｄ３３９０Ａインテグレータに接続されたＧｏｔ−Ｍａ ｃ　５ｅｒｉｅｓ　５８０ガスクロマトグラフ（Ｇｏｔ−Ｍａｃ　Ｉｎｓｔｒｕ ｍｅｎｔ　Ｃｏｍｐａｎ７．Ｂｒｉｄｇｅｗａｔｅｒ、Ｎｌ）を用いて、ガスー 液体クロマトグラフィーによって測定された。非揮発性酸は、分析の前にメチル エステルに変換された。

くドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧ Ｅ）＞　： 細胞は、醗酵条件の下で２４時間増殖され、０℃に冷却され、遠心分離（７，０ ００ＸＧ、　１０分）によって回収され、１０　ｍＭの２−メルカプトエタノー ルを含んだ１／３容量の５１１ＩＭのリン酸ナトリウム緩衝液で２回洗浄し、− ２０℃で凍結保存した。細胞ベレットは等容量の緩衝溶液中に再懸濁され、２０ ，０００　ｐｓｉでフレンチプレッシャーセルに２回通すことによって破壊され た。膜類は、１００，０００　ｘＧで９０分間遠心することによって除去された 。上清は、８％アクリルアミド変性ドデシル硫酸ナトリウムゲルを用、Ｂｉｏｒ ｓｄ　Ｍｉｎｉ−Ｐｔｏｌｅｉｎ　ＩＩ電気泳動ユニット（Ｂｉｏｒａｄ　Ｌａ ｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＣＡ）で分離された。タンパクは 、ブラッドフォード試薬で測定された。Ｂｒｘｄｆｏｒｄ、　Ｍ、Ｍ、［１９７ ９］　Ｍｏｌ、Ｇｅｎ、Ｇｅ＋２ｔ、１８１：５４８−５５１を参照のこと。夫 々のレーンには略２０μｇのタンパクが負荷された。

く酵素活性〉： ＰＤＣ活性は、例えば、Ｃｏｎｖａ７．　Ｔ、　、　Ｙ、　Ａ、　Ｏｓｍａｎ、 　Ｊ、　１．　ｌ：。

ｎｎａｎ、Ｅ、Ｍ、Ｈｏｌｆｍｘｎｎ　ａｎｄ　Ｌ、０．Ｉｎｇｔａｍ　［１９ ８７７Ｊ、Ｂａｃｊｅｒｉｏｌ。

１６９：９４９−９５４に記載されているようにして、熱処理されたフレンチプ レス抽出物中で測定された。熱処理は、詰抗する天然の酵素（これは組換Ｅ、ｃ ｏｌｉにおけるＰＤＣの測定を複雑にする）を不活性化するために用いられた。

なお、ここに説明された例および態様は例示の目的でのみ記載したものであり、 この記載に照らして種々の改良または変更が当業者に示唆されるであろう。従っ て、これらの改良または変更もまた、この出願の精神および範囲内のものであり 、請求の範囲中に含まれるものであることに留意すべきである。

ＦＩＧ、２ ＦＩＧ、３Ａ ＦＩＧ、３Ｂ ＦＩＧ、３Ｃ 時間（ｈ） ＦＩＧ、３Ｄ ＦＩＧ、３Ｅ 時間（ｈ） 時間（ｈ） ＦＩＧ、３Ｇ ＦＩＧ、４Ａ 時間　（ｈ） 補正書の翻訳文提出書（特許法第１８４条の７第１項）平成５年６月７日　易

Claims (64)

【特許請求の範囲】
1. １．組換えホスト細胞であって、その染色体が（ａ）該ホスト細胞にとって内因 性であるプロそータの転写制御下にあり、且つ所望のポリペプチドをコードする 異種ＤＮＡ断片と、 （ｂ）前記異種ＤＮＡ断片の発現を増大させる突然変異であって、該突然変異の ない前記ホスト細胞による前記ポリペプチドの産生に比較して、前記ホスト細胞 による前記所望のポリペプチドの産生増大をもたらし、且つ前記異種ＤＮＡ断片 の発現増大は、このような発現の増大した細胞を選別する条件の不存在下におい ても保持される突然変異とを具備している組換えホスト細胞。
2. ２．請求の範囲第１項に記載の組換えホスト細胞であって、前記細胞が微生物細 胞である細胞。
3. ３．請求の範囲第１項に記載の組換えホスト細胞であって、前記異種遺伝子断片 が複数の遺伝子をコードする細胞。
4. ４．請求の範囲第３項に記載の組換えホスト細胞であって、前記複数の遺伝子に 選別マーカー遺伝子が含まれる細胞。
5. ５．請求の範囲第４項に記載の組換えホスト細胞であって、前記選別マーカー遺 伝子の発現が前記細胞に対して抗生物質耐性を与える細胞。
6. ６．請求の範囲第５項に記載の組換えホスト細胞であって、前記マーカー遺伝子 の発現が前記細胞に対してクロラムフェニコール耐性を与える細胞。
7. ７．請求の範囲第２項に記載の組換えホスト細胞であって、前記細胞が腸内バク テリアである細胞。
8. ８．請求の範囲第７項に記載の組換えホスト細胞であって、前記腸内バクテリア がＥｒｗｉｎｉａ　ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌ ｉ、又はＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅから選択される細胞。
9. ９．請求の範囲第７項に記載の組換えホスト細胞であって、前記腸内バクテリア がＥｓｃｈｏｒｉｃｈｉｓ　ｃｏｌｉの株である細胞。
10. １０．請求の範囲第１項に記載の組換えホスト細胞であって、前記異種ＤＮＡ断 片が強力な内因性プロモータの転写制御下にある細胞。
11. １１．請求の範囲第１０項に記載の組換えホスト細胞であって、前記プロモータ がピルベート・ホルメートーリアーゼ（ｐｆ１）プロモータである細胞。
12. １２．請求の範囲第１項に記載の組換えホスト細胞であって、前記異種ＤＮＡ断 片がアルコールデヒドロゲナーゼ及びピルベートデカルボキシラーゼをコードす る細胞。
13. １３．請求の範囲第１２項に記載の組換えホスト細胞であって、前記アルロール デヒドロゲナーゼ及びピルベートデカルボキシラーゼがＺｙｍｏｎａｓ　ｍｏｂ ｉｌｉｓ由来の遺伝子によってコードされる細胞。
14. １４．請求の範囲第１３項に記載の組換えホスト細胞であって、前記細胞はグル コース又はキシロースの醗酵によって、添加された糖のエタノールヘの少なくと も約１００％の変換に対応する理論収率で、エタノールを産生できる細胞。
15. １５．請求の範囲第１２項に記載の組換えホスト細胞であって、前記染色体が更 に、スクシネート産生を阻害する突然変異を有している細胞。
16. １６．請求の範囲第１５項に記載の組換えホスト細胞であって、スクシネート産 生を阻害する前記突然変異が、フマレートレダクターゼ（ｆｒｄ）遺伝子におけ る突然変異を含んでいる細胞。
17. １７．請求の範囲第１項に記載の組換えホスト細胞であって、前記染色体が更に 、前記ホスト細胞内における組換えを阻害する突然変異を有している細胞。
18. １８．請求の範囲第１７項に記載の組換えホスト細胞であって、組換えを阻害す る前記突然変異がｒｅｃＡ遺伝子における突然変異を含んでいる細胞。
19. １９．所定の方法の産物である細胞株であって、該所定の方法が、 （ａ）ホスト細胞にとって内因性であるプロモータと該内因性プロモータの転写 制御下にあるホスト遺伝子とをコードする染色体を具備したホスト細胞を含む培 養物を与える工程と、 （ｂ）前記培養物中のホスト細胞を異種ＤＮＡ断片で形質転換する工程であって 、該異種ＤＮＡ断片が（ｉ）選別マーカー遺伝子および所望のポリペプチドをコ ードする遺伝子を含む複数の遺伝子と、（ｉｉ）相同的組換えによって、前記異 種ＤＮＡ断片によりコードされる前記複数の遺伝子の前記ホスト遺伝子内への組 込みを可能にするために、前記ホスト遺伝子に対して充分に相同的で且つ前記異 種ＤＮＡ断片中に正しく位置した配列 とを具備する形質転換工程と、 （ｃ）前記培養物中のホスト細胞またはその子孫について、第一レベル（ａｆｉ ｒｓｔ　ｌｅｖｅｌ）で前記選別マーカー遺伝子を発現するものを選別する工程 と、 （ｄ）工程（ｃ）で選別されたホスト細胞またはその子孫をスクリーニングし、 前記所望のポリペプチドを初期レベルで産生するホスト細胞を得る工程と、 （ｅ）工程（ｄ）で同定されたホスト細胞またはその子孫を、前記染色体中に突 然変異が創製される条件下で、任意に突然変異誘発物質に曝す工程と、 （ｆ）工程（ｄ）または工程（ｅ）で製造されたホスト細胞またはその子孫を、 前記所望のタンパクを前記初期レベルよりも高いレベルで産生するホスト細胞に ついて試験することにより、前記異種ＤＮＡ断片の発現を増大させる突然変異で あって、該突然変異のない前記ホスト細胞による前記ポリペプチドの産生に比較 して、前記ホスト細胞による前記所望のポリペプチドの産生増大をもたらし、且 つ前記異種ＤＮＡ断片の発現増大は、このような発現の増大した細胞を選別する 条件の不存在下においても保持される突然変異をもったホスト細胞を得る工程と を具備している細胞株。
20. ２０．請求の範囲第１９項に記載の細胞株であって、前記方法が更に、 （ｉ）工程（ｂ）において、前記異種ＤＮＡ断片には更に、複製が温度感受性で あるレプリコンを含むプラスミドを有することと、 （ｉｉ）工程（ｂ）において、前記ホスト細胞の形質転換には更に、前記異種Ｄ ＮＡ断片をホスト細胞内に導入することと、このホスト細胞を、前記選別マーカ ー遺伝子を第一レベルで発現する細胞が選別される条件下で、且つ前記プラスミ ドが複製されない温度で増殖させることとが具備され、これにより前記ＤＮＡ断 片が相同性組換えによって前記染色体の前記ホスト遺伝子内に組込まれることと 、 （ｉｉｉ）工程（ｃ）において、前記ホスト細胞の選別には更に、前記選別マー カー遺伝子を第一レベルで発現する前記ホスト細胞を、前記選別マーカー遺伝子 を発現する細胞が選別されない条件下で増殖させることが具備され、ここで前記 ホスト細胞は前記プラスミドが複製される第一温度での非選別条件下で増殖され て、前記プラスミド及び前記選別マーカー遺伝子の前記ホスト遺伝子からの切除 がもたらされ、また前記ホスト細胞は、次いで前記プラスミドが複製されない第 二温度での非選別条件下において増殖され、前記選別マーカー遺伝子および前記 プラスミドの不存在下で前記所望のポリペプチドをコードする遺伝子を保持した ホスト細胞がもたらされることとを具備した細胞株。
21. ２１．請求の範囲第１９項に記載の細胞株であって、前記方法が更に、 （ｉ）工程（ｂ）において、前記異種ＤＮＡ断片が複製能力のない閉環状ＤＮＡ を具備することと、（ｉｉ）工程（ｆ）において、前記ホスト細胞の試験が、工 程（ｄ）または工程（ｅ）で製造されたホスト細胞またはその子孫について、前 記選別マーカー遺伝子を前記第一レベルよりも高い第二レベルで発現するものを 選別し、次いで前記選別マーカー遺伝子を前記第二レベルで発現する前記ホスト 細胞を、所望のタンパクを前記初期レベルよりも高いレベルで産生するホスト細 胞についてスクリーニングすることとを具備した細胞株。
22. ２２．請求の範囲第１９項に記載の細胞株であって、前記ホスト細胞株が微生物 細胞株である細胞株。
23. ２３．請求の範囲第１９項に記載の細胞株であって、前記選別マーカータンパク が、前記ホスト細胞株にクロラムフェニコールに対する耐性を与える細胞株。
24. ２４．請求の範囲第１９項に記載の細胞株であって、前記選別マーカー遺伝子の 前記第一レベルの発現が、少なくとも約２０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコール に対する耐性を与える細胞株。
25. ２５．請求の範囲第２２項に記載の細胞株であって、前記選別マーカー遺伝子の 前記第一レベルの発現が少なくとも約２０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールに 対する耐性を与え、前記選別マーカータンパクの前記第二レベルの発現が少なく とも約１００μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールに対する耐性を与える細胞株。
26. ２６．請求の範囲第１９項に記載の細胞株であって、前記選別マーカ遺伝子が、 前記所望のポリペプチドをコードする遺伝子の下流にある前記異種ＤＮＡ断片内 に位置したプロモータの転写制御下にある細胞株。
27. ２７．請求の範囲第２６項に記載の細胞株であって、前記異種ＤＮＡ断片が転写 ターミネータを更に具備し、該転写ターミネータが前記所望のポリペプチドをコ ードする遺伝子と前記選別マーカー遺伝子との間に位置している細胞株。
28. ２８．請求の範囲第１９項に記載の細胞株であって、前記ホスト細胞株が腸内バ クテリア株である細胞株。
29. ２９．請求の範囲第１９項に記載の細胞株であって、前記腸内バクテリア株がＥ ｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉの株である細胞株。
30. ３０．請求の範囲第１９項に記載の細胞株であって、前記プロモータが強力なプ ロモータである細胞株。
31. ３１．請求の範囲第３０項に記載の細胞株であって、前記プロモータがピルベー ト・ホルメートーリアーゼ（ｐｆ１）プロモータである細胞株。
32. ３２．請求の範囲第１９項に記載の細胞株であって、前記異種ＤＮＡ断片がアル コールデヒドロゲナーゼ及びピルベートデカルボキシラーゼをコードする細胞株 。
33. ３３．請求の範囲第３２項に記載の細胞株であって、前記アルコールデヒドロゲ ナーゼ及び前記ピルベートデカルボキシラーゼがＺｙｍｏｍｏｎａｓ　ｍｏｂｉ ｌｉｓ由来の遺伝子によってコードされる細胞株。
34. ３４．請求の範囲第３３項に記載の細胞株であって、前記株はグルコース又はキ シロースの醗酵によって、添加された糖のエタノールヘの少なくとも約１００％ の変換に対応する理論収率で、エタノールを産生できる細胞株。
35. ３５．請求の範囲第３２項に記載の細胞株であって、前記染色体が更に、スクシ ネート産生を阻害する突然変異を有している細胞株。
36. ３６．請求の範囲第３５項に記載の細胞株であって、スクシネート産生を阻害す る前記突然変異が、フマレートレダクターゼ（ｆｒｄ）遺伝子における突然変異 を含んでいる細胞株。
37. ３７．請求の範囲第１９項に記載の細胞株であって、前記染色体が更に、前記ホ スト細胞株内における組換えを阻害する突然変異を有している細胞株。
38. ３８．請求の範囲第３７項に記載の細胞株であって、組換えを阻害する前記突然 変異がｒｅｃＡ遺伝子における突然変異を含んでいる細胞株。
39. ３９．高レベルの所望のポリペプチドを産生する組換えホスト細胞を製造する方 法であって、 （ａ）ホスト細胞にとって内因性であるプロモータと該内因性プロモータの転写 制御下にあるホスト遺伝子とをコードする染色体を具備したホスト細胞を含む培 養物を与える工程と、 （ｂ）前記培養物中のホスト細胞を異種ＤＮＡ断片で形質転換する工程であって 、該異種ＤＮＡ断片が（ｉ）選別マーカー遺伝子および前記所望のポリペプチド をコードする遺伝子を含む複数の遺伝子と、（ｉｉ）相同的組換えによって、前 記異種ＤＮＡ断片によりコードされる前記複数の遺伝子の前記ホスト遺伝子内へ の組込みを可能にするために、前記ホスト遺伝子に対して充分に相同的で且つ前 記異種ＤＮＡ断片中に正しく位置した配列 とを具備する形質転換工程と、 （ｃ）前記培養物中のホスト細胞またはその子孫について、第一レベル（ａ　ｌ ｉｒｓｔ　ｌｅｖｅｌ）で前記選別マーカー遺伝子を発現するものを選別するす る工程と、 （ｄ）工程（ｃ）で選別されたホスト細胞またはその子孫をスクリーニングし、 前記所望のポリペプチドを初期レベルで産生するホスト細胞を得る工程と、 （ｅ）工程（ｄ）で同定されたホスト細胞またはその子孫を、前記染色体中に突 然変異が創製される条件下で、任意に突然変異誘発物質に曝す工程と、 （ｆ）工程（ｄ）または工程（ｅ）で製造されたホスト細胞またはその子孫を、 前記所望のタンパクを前記初期レベルよりも高いレベルで産生するホスト細胞に ついて試験することにより、前記異種ＤＮＡ断片の発現を増大させる突然変異で あって、該突然変異のない前記ホスト細胞による前記ポリペプチドの産生に比較 して、前記ホスト細胞による前記所望のポリペプチドの産生増大をもたらし、且 つ前記異種ＤＮＡ断片の発現増大は、前記発現の増大した細胞を選別する条件の 不存在下においても保持される突然変異をもったホスト細胞を得る工程とを具備 した方法。
40. ４０．請求の範囲第３９項に記載の方法であって、前記方法が更に、 （ｉ）工程（ｂ）において、前記異種ＤＮＡ断片には更に、レプリコンを含むプ ラスミドを有することと、（ｉｉｉ）工程（ｃ）において、前記ホスト細胞の選 別には更に、前記選別マーカー遺伝子を第一レベルで発現する前記ホスト細胞を 、前記選別マーカー遺伝子を発現する細胞が選別されない条件下で増殖させるこ とが具備され、ここで前記ホスト細胞は前記プラスミドが複製される第一温度で の非選別条件下で増殖されて、前記プラスミド及び前記選別マーカー遺伝子の前 記ホスト遺伝子からの切除がもたらされ、また前記ホスト細胞は、次いで前記プ ラスミドが複製されない第二温度での非選別条件下において増殖され、前記選別 マーカー遺伝子および前記プラスミドの不存在下で前記所望のポリペプチドをコ ードする遺伝子を保持したホスト細胞がもたらされることとを具備した方法。
41. ４１．請求の範囲第３９項に記載の方法であって、前記方法が更に、 （ｉ）工程（ｂ）において、前記異種ＤＮＡ断片が複製能力のない閉環状ＤＮＡ を具備することと、（ｉｉ）工程（ｆ）において、前記ホスト細胞の試験が、工 程（ｄ）または工程（ｅ）で製造されたホスト細胞またはその子孫について、前 記選別マーカー遺伝子を前記第一レベルよりも高い第二レベルで発現するものを 選別し、次いで前記選別マーカー遺伝子を前記第二レベルで発現する前記ホスト 細胞を、所望のタンパクを前記初期レベルよりも高いレベルで産生するホスト細 胞についてスクリーニングすることとを具備した方法。
42. ４２．請求の範囲第３９項に記載のホスト細胞株であって、前記ホスト細胞様が 微生物ホスト細胞株である細胞株。
43. ４３．請求の範囲第３９項に記載の方法であって、前記選別マーカータンパクが 、前記ホスト細胞株にクロラムフェニコールに対する耐性を与える細胞株。
44. ４４．請求の範囲第４３項に記載の方法であって、前記選別マーカー遺伝子の前 記第一レベルの発現が、少なくとも約２０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールに 対する耐性を与える方法。
45. ４５．請求の範囲第４３項に記載の方法であって、前記選別マーカー遺伝子の前 記第一レベルの発現が少なくとも約２０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールに対 する耐性を与え、前記選別マーカータンパクの前記第二レベルの発現が少なくと も約１００μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールに対する耐性を与える方法。
46. ４６．請求の範囲第３９項に記載の方法であって、前記選別マーカ遺伝子が、前 記所望のポリペプチドをコードする遺伝子の下流にある前記異種ＤＮＡ断片内に 位置したプロモータの転写制御下にある方法。
47. ４７．請求の範囲第４６項に記載の方法であって、前記異種ＤＮＡ断片が転写タ ーミネータを更に具備し、該転写ターミネータが前記所望のポリペプチドをコー ドする遺伝子と前記選別マーカー遺伝子との間に位置している方法。
48. ４８．請求の範囲第３９項に記載の方法であって、前記ホスト細胞株が腸内バク テリア株である方法。
49. ４９．請求の範囲第３９項に記載の方法であって、前記腸内ホスト細胞様がＥｓ ｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉの株である方法。
50. ５０．請求の範囲第３９項に記載の方法であって、前記プロモータが強力なプロ モータである方法。
51. ５１．請求の範囲第５０項に記載の方法であって、前記プロモータがピルベート ・ホルメートーリアーゼ（ｐｆ１）プロモータである方法。
52. ５２．請求の範囲第３９項に記載の方法であって、前記異種ＤＮＡ断片がアルコ ールデヒドロゲナーゼ及びピルベートデカルボキシラーゼをコードする方法。
53. ５３．請求の範囲第５１項に記載の方法であって、前記アルコールデヒドロゲナ ーゼ及び前記ピルベートデカルボキシラーゼがＺｙｍｏｍｏｎａｓ　ｍｏｂｉｌ ｉｓ由来の遺伝子によってコードされる方法。
54. ５４．請求の範囲第５３項に記載の細胞様であって、前記株はグルコース又はキ シロースの醗酵によって、添加された糖のエタノールヘの少なくとも約１００％ の変換に対応する理論収率で、エタノールを産生できる方法。
55. ５５．請求の範囲第５１項に記載の方法であって、前記染色体が更に、スクシネ ート産生を阻害する突然変異を有している方法。
56. ５６．請求の範囲第５５項に記載の方法であって、スクシネート産生を阻害する 前記突然変異がフマレートレダクターゼ（ｆｒｄ）遺伝子における突然変異を含 んでいる方法。
57. ５７．請求の範囲第３９項に記載の方法であって、前記染色体が更に、前記ホス ト細胞株内における組換えを阻害する突然変異を有している方法。
58. ５８．請求の範囲第５７項に記載の細胞株であって、組換えを阻害する前記突然 変異がｒｅｃＡ遺伝子における突然変異を含んでいる方法。
59. ５９．ＡＴＣＣ６８４８４の寄託番号で特定されたアメリカン・タイプ・カルチ ャー・コレクションヘの寄託によって示される、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏ ｌｉの組換えホスト株（ｐＬ０１５１０）。
60. ６０．ＡＴＣＣ６８４８５の寄託番号で特定されたアメリカン・タイプ・カルチ ャー・コレクションヘの寄託によって示される、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏ ｌｉの組換えホスト株（ｐＬ０１５４３）。
61. ６１．ＡＴＣＣ５５１２３の寄託番号で特定されたアメリカン・タイプ・カルチ ャー・コレクションヘの寄託によって示される、請求の範囲第１９項に記載のＥ ｓｃｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｋ０４の組換えホスト株。
62. ６２．ＡＴＣＣ５５１２４の寄託番号で特定されたアメリカン・タイプ・カルチ ャー・コレクションヘの寄託によって示される、請求の範囲第１９項に記載のＥ ｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｋ０１１の組換えホスト株。
63. ６３．ＡＴＣＣ５５１２５の寄託番号で特定されたアメリカン・タイプ・カルチ ャー・コレクションヘの寄託によって示される、請求の範囲第１９項に記載のＥ ｓｃｈｅｒｉｃｈｅａ　ｃｏｌｉ　Ｋ０１２の組換えホスト株。
64. ６４．ＡＴＣＣ５５１２６の寄託番号で特定されたアメリカン・タイプ・カルチ ャー・コレクションヘの寄託によって示される、請求の範囲第１９項に記載のＥ ｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｋ０２０の組換えホスト株。