CN115612678A - 谷氨酸脱氢酶突变体及其应用 - Google Patents

谷氨酸脱氢酶突变体及其应用 Download PDF

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    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
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    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/08—Lysine; Diaminopimelic acid; Threonine; Valine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12Y104/01—Oxidoreductases acting on the CH-NH2 group of donors (1.4) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.4.1)
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Abstract

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及谷氨酸脱氢酶突变体及其应用。本发明的谷氨酸脱氢酶突变体，以大肠杆菌野生型谷氨酸脱氢酶的氨基酸序列为参考序列，所述谷氨酸脱氢酶突变体含有第2位天冬氨酸被谷氨酸、谷氨酰胺或者脯氨酸取代的突变。该菌株相较于原始菌株可以有效地改变赖氨酸的产量。

Description

谷氨酸脱氢酶突变体及其应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体涉及谷氨酸脱氢酶突变体及其应用。
背景技术
L-赖氨酸(又名2，6-二氨基己酸)属于天冬氨酸家族，被广泛应用于养殖业(如猪饲料、鸡饲料、鱼饲料)。一方面可以促进动物的生长，增加农产品的效益；另一方面可以减少氮源流入排泄物中，从而有利环境保护。赖氨酸在氨基酸市场中需求连年上涨。
赖氨酸的生产方法包括化学合成法和生物合成法。化学合成法相较于生物合成具有高耗能、污染环境、不可持续发展等缺点，逐渐被淘汰。随着环境保护理念深入人心，生物合成法成为合成赖氨酸的主流方法，其中微生物发酵法是目前常用生物合成法，由于该方法具有生产条件温和、可利用再生能源等特点，被广泛接纳。目前，常用工业发酵菌株是谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)和大肠杆菌(Escherichia coli)。
对于大肠杆菌发酵生产赖氨酸亟须解决的一个关键技术问题就是提高糖酸转化率，从而达到节约成本的目的。目前，解决该问题的常用策略为通过代谢工程的策略改造糖吸收途径、前体途径、末端途径、能量代谢途径等来提高赖氨酸的转化率。仍有进一步研究更多的方案，来提升赖氨酸转化率的必要。
发明内容
本发明的目的在于提供一个可以有效的改变赖氨酸产量的谷氨酸脱氢酶突变体及其应用。
具体地，本发明提供以下技术方案：
一种谷氨酸脱氢酶突变体，其以大肠杆菌野生型谷氨酸脱氢酶的氨基酸序列为参考序列，所述谷氨酸脱氢酶突变体含有第2位天冬氨酸被谷氨酸、谷氨酰胺或者脯氨酸取代的突变。
本发明通过将一株诱变得到的赖氨酸高产菌的基因组和原始菌株的菌株基因组对比，发现了谷氨酸脱氢酶GdhA序列中第二位的天冬氨酸变为谷氨酸，可以有效的提高赖氨酸转化率，目前还没有研究发现该位点突变有利于赖氨酸的合成。之后本发明又将该点突变为其他谷氨酸族的氨基酸，发现天冬氨酸突变为谷氨酰胺，可以起到相似的效果，但是突变为脯氨酸会起到负效果。较之前的通过强启动子或者多拷贝的方式过表达GdhA的策略，本发明中涉及突变编码序列并获得有效的改造位点并非是显而易见可以获得的。
谷氨酸是合成赖氨酸的必需前体，所以增加它的合成可能是有利于赖氨酸合成的。在大肠杆菌中，谷氨酸脱氢酶是由gdhA基因编码的，它可以将α-酮戊二酸转化谷氨酸。谷氨酸脱氢酶是连接氮代谢和碳代谢的重要桥梁之一，推测通过对它的改造可以加强谷氨酸的合成，进而增强赖氨酸的产量。本发明还可以应用到其他以谷氨酸族氨基酸为前体的代谢物合成。
本发明中所述的谷氨酸脱氢酶突变体，具有如SEQ ID NO.1-3任一所示的氨基酸序列。
本领域技术人员应该理解，在上述谷氨酸脱氢酶突变体序列的N端或C端添加标签蛋白或将其与其他蛋白进行融合形成融合蛋白，在不改变上述突变蛋白本身的活性的情况下，上述添加标签的蛋白或融合蛋白也在本发明的保护范围内。
本发明另提供一种编码上述谷氨酸脱氢酶突变体的核酸，优选，具有如SEQ IDNO.4-6中任一所示的核苷酸序列。
根据上述提供的谷氨酸脱氢酶突变体的氨基酸序列，本领域技术人员能够获得其编码核酸的序列。基于密码子的简并性，编码上述氨基酸序列的核酸序列不止一种，所有能够编码上述谷氨酸脱氢酶突变体的核酸均在本发明的保护范围内。
本发明还提供一种含有上述核酸的生物材料，所述生物材料为表达盒、载体或宿主细胞。
所述表达盒为在所述核酸的上游或下游连接用于驱动其转录、表达的元件得到的重组核酸分子。
所述载体可为表达载体或克隆载体，包括但不限于质粒载体、噬菌体载体、转座子等。
所述宿主细胞包括但不限于微生物细胞。
本发明另提供一种上述谷氨酸脱氢酶突变体或核酸或生物材料在改变大肠杆菌生产以谷氨酸族氨基酸为前体的代谢物性能中的应用，优选，所述代谢物为赖氨酸。
本发明还提供一种重组微生物，所述重组微生物表达上述的谷氨酸脱氢酶突变体。
优选，所述重组微生物为大肠杆菌。
本发明还提供一种重组微生物的构建方法，其包括：将出发菌株中编码谷氨酸脱氢酶的基因突变为编码上述的谷氨酸脱氢酶突变体的基因。
本发明另提供一种生产赖氨酸的方法，其包括以上述重组微生物进行发酵培养的步骤。
本发明的有益效果在于：
本发明构建了一株谷氨酸脱氢酶(GdhA)突变的大肠杆菌，提供了一种新的改变大肠杆菌产赖氨酸性能的方法，其可有效的提高/降低赖氨酸转化率。经诱变得到本发明谷氨酸脱氢酶突变体，通过反向代谢工程验证，将赖氨酸摇瓶产量从21g/L提高到23g/L，摇瓶转化率提高3％，生长基本不受影响。
附图说明
图1为重组质粒pTarget-gdhAmut的示意图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。若未特别指明，实施例中所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。
以下实施例中涉及的引物名称及序列SEQ ID NO.7-22如表1所示。
表1引物序列
Figure BDA0003158835000000031
Figure BDA0003158835000000041
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购买得到的常规产品。
实施例1pTargeT-gdhAmut质粒的构建
pTargeT类型质粒构建及应用是根据中科院上海植物研究所杨晟课题组发表文章：Multigene Editing in the Escherichia coli Genome via the CRISPR-Cas9System。首先，利用一对引物pTarget-gdhA-N20-LF/LR通过环形PCR将对应的N20序列(TCACGCTTTCCTGCCGGTAG，SEQ ID NO.23)引入到对应pTargeT质粒上，与此同时将上下游同源臂up/down(通过两对引物gdhA-up-LF/gdhA-up-LR和gdhA-down-LF/gdhA-down-LR扩增获得)和突变的基因gdhA(通过三对引物gdhAD2E-LF/gdhAD2Q-LF/gdhAD2P-LF和gdhA-LR扩增获得)进行融合PCR，最后，通过诺唯赞的组装试剂盒将融合后的片段和带有N20的pTargeT质粒模版(由一对引物pTarget-gdhA-LF/pTarget-gdhA-LR进行扩增)进行组装，获得组装产物，通过化学转化转入到大肠杆菌DH5α中，之后将转化产物涂布到壮观霉素的LB平板上，过夜培养，待长出单菌落，通过pTarget-YZ-LF/pTarget-YZ-LR进行菌落PCR鉴定，PCR产物进行送测，测序正确，说明质粒构建成功，即为pTarget-gdhAmut质粒，如图1所示。其中，pTarget-gdhAmut分别为pTarget-gdhAD2E、pTarget-gdhAD2Q和pTarget-gdhAD2P，各自包含SEQID NO.4-6所示序列中的一条。
原始gdhA核苷酸序列见SEQ ID NO.24。
实施例2突变谷氨酸脱氢酶菌株的构建
出发菌株MHZ-0914(CGMCC No.22648)感受态的制备，首先将对应的菌株培养OD600＝0.4～0.6，然后用离心管收集菌体冰置15min，低温10％的甘油重新悬浮菌体，-4℃离心10min，重复清洗3次，100μL体积进行分装，待转化或者-80℃储藏。
取实施例1制备得到的100μg pTargeT-gdhAmut质粒加入上述感受态中，然后进行电击，立即加入900μl LB,30℃复苏一小时(初始菌株已经转入了pCas质粒)，将对应的菌株转入到含有kan抗性和spe抗性的平板上，待长出单菌落，通过gdhAmut-YZ-LF/gdhAmut-YZ-LR进行菌落PCR鉴定，所得PCR产物进行测序。最后，获得目的菌株进行下一步操作。
通过上述步骤，由菌株CGMCC No.22648分别获得MHZ-0917-1(gdhAD2Q)、MHZ-0917-2(gdhAD2P)、MHZ-0917-3(gdhAD2E)三株菌，后续将进行发酵表征。
MHZ-0914于2021年6月1日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏中心地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.22648。分类命名：大肠埃希氏菌，Escherichia coli。
实施例3突变菌株发酵表征
种子活化培养基：蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，酵母粉5g/L，18g/L琼脂粉，调节pH至7.0。
种子培养基：葡萄糖20g/L，硫酸铵4g/L，玉米浆2.0g/L，磷酸二氢钾3g/L，七水硫酸镁0.4g/L，硫酸铁0.01g/L，硫酸锰0.01g/L，调节pH至7.0。
发酵培养基：葡萄糖66g/L，糖蜜10g/L，硫酸铵40g/L，玉米浆10g/L，磷酸二氢钾1.6g/L，七水硫酸镁1.0g/L，硫酸铁0.03g/L，硫酸锰0.03g/L，碳酸钙25g/L，调节pH至7.0。
(1)种子活化：从冻存管中取待验证菌株，在种子活化培养基上划线活化，37℃培养12h；
(2)种子培养：挑取平板活化种子1环接至装有20mL种子培养基的500mL三角瓶中，33℃，220r/min振荡培养7h；
(3)发酵培养：将2mL种子液接种至装有30mL发酵培养基的500mL三角瓶中，37℃、220r/min振荡培养12h，每株菌做三个平行。
(4)取2mL发酵液离心(12000rpm，2min)，收集上清液，用高效液相色谱法(HPLC)检测重组菌与对照菌发酵液中的L-赖氨酸含量，每株菌做三个平行，计算平均值，其浓度如下表2所示。
2)500ml摇瓶发酵表征
表2摇瓶发酵液中赖氨酸含量检测
Figure BDA0003158835000000051
Figure BDA0003158835000000061
由表2，可以发现gdhAD2Q和gdhAD2E两个突变体有利于赖氨酸的合成，而gdhAD2P反而引起了赖氨酸产量急剧下降，侧面说明该位点对谷氨酸脱氢酶的生理功能起到了重要作用。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 李岩
<120> 谷氨酸脱氢酶突变体及其应用
<130> KHP211117879.7
<160> 24
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
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caaaatccaa aatatcgcca gatgtcatta ctggagcgtc tggttgaacc ggagcgcgtg 180
atccagtttc gcgtggtatg ggttgatgat cgcaaccaga tacaggtcaa ccgtgcatgg 240
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tttggcggca gtcttattcg cccggaagct accggctacg gtctggttta tttcacagaa 660
gcaatgctaa aacgccacgg tatgggtttt gaagggatgc gcgtttccgt ttctggctcc 720
ggcaacgtcg cccagtacgc tatcgaaaaa gcgatggaat ttggtgctcg tgtgatcact 780
gcgtcagact ccagcggcac tgtagttgat gaaagcggat tcacgaaaga gaaactggca 840
cgtcttatcg aaatcaaagc cagtcgcgat ggtcgagtgg cagattacgc caaagaattt 900
ggtctggtct atctcgaagg ccaacagccg tggtctctac cggttgatat cgccctgcct 960
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<211> 1344
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Claims (10)

1.一种谷氨酸脱氢酶突变体，其特征在于，以大肠杆菌野生型谷氨酸脱氢酶的氨基酸序列为参考序列，所述谷氨酸脱氢酶突变体含有第2位天冬氨酸被谷氨酸、谷氨酰胺或者脯氨酸取代的突变。
2.根据权利要求1所述的谷氨酸脱氢酶突变体，其特征在于，具有如SEQ ID NO.1-3任一所示的氨基酸序列。
3.编码权利要求1或2所述的谷氨酸脱氢酶突变体的核酸。
4.根据权利要求3所述的核酸，其特征在于，具有如SEQ ID NO.4-6任一所示的核苷酸序列。
5.含有权利要求4所述的核酸的生物材料，所述生物材料为表达盒、载体或宿主细胞。
6.权利要求1或2所述的谷氨酸脱氢酶突变体或权利要求3或4所述的核酸或权利要求5所述的生物材料在改变大肠杆菌生产以谷氨酸族氨基酸为前体的代谢物性能中的应用，优选，所述代谢物为赖氨酸。
7.一种重组微生物，其特征在于，所述重组微生物表达权利要求1或2所述的谷氨酸脱氢酶突变体。
8.根据权利要求7所述的重组微生物，其特征在于，所述重组微生物为大肠杆菌。
9.权利要求7或8所述的重组微生物的构建方法，其特征在于，包括：将出发菌株中编码谷氨酸脱氢酶的基因突变为编码权利要求1或2所述的谷氨酸脱氢酶突变体的基因。
10.一种生产赖氨酸的方法，其特征在于，包括以权利要求7或8所述的重组微生物进行发酵培养的步骤。
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