FI111552B - Menetelmä rekombinanttisen isäntäsolukannan tuottamiseksi ja näin saatu rekombinanttinen isäntäsolu - Google Patents

Menetelmä rekombinanttisen isäntäsolukannan tuottamiseksi ja näin saatu rekombinanttinen isäntäsolu Download PDF

Info

Publication number
FI111552B
FI111552B FI932559A FI932559A FI111552B FI 111552 B FI111552 B FI 111552B FI 932559 A FI932559 A FI 932559A FI 932559 A FI932559 A FI 932559A FI 111552 B FI111552 B FI 111552B
Authority
FI
Finland
Prior art keywords
gene
host cell
expression
mutation
ethanol
Prior art date
Application number
FI932559A
Other languages
English (en)
Swedish (sv)
Other versions
FI932559A0 (fi
FI932559A (fi
Inventor
Lonnie O Ingram
Kazuyoshi Ohta
Original Assignee
Univ Florida
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=24501169&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=FI111552(B) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Univ Florida filed Critical Univ Florida
Publication of FI932559A0 publication Critical patent/FI932559A0/fi
Publication of FI932559A publication Critical patent/FI932559A/fi
Application granted granted Critical
Publication of FI111552B publication Critical patent/FI111552B/fi

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/01—Preparation of mutants without inserting foreign genetic material therein; Screening processes therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
    • C12N15/902—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
    • C12P7/06—Ethanol, i.e. non-beverage
    • C12P7/065—Ethanol, i.e. non-beverage with microorganisms other than yeasts
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
    • Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
    • Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Description

111552
Menetelmä rekombinanttisen isäntäsolukannan tuottamiseksi ja näin saatu rekambinanttinen isäntäsolu 5 Tämä hakemus on samanaikaisesti vireillä olevan patenttihakemuksen, jonka sarjanumero on 07/352 062 (jätetty 15. toukokuuta 1989) ja joka on jo hylätyn patenttihakemuksen, jonka sarjanumero on 07/239 099 (jätetty 31. elokuuta 1988), osittainen jat-kohakemus, osittainen jatkohakemus.
10 Tähän keksintöön liittyvä tutkimustyö on rahoitettu osittain stipendillä FG05-86ER3574, jonka on myöntänyt Office of Basic Energy Science, U.S. Department of Energy, sekä osittain stipendillä 88-37233-3987, jonka on myöntänyt Alcohol Fuels Pro-15 gram, U.S. Department of Agriculture. Yhdysvaltain hallituksella on tiettyjä oikeuksia tähän keksintöön.
Oheisen keksinnön kohteena ovat yhdistelmä-DNA-tekniikalla saadut isäntäsolut (yhdistelmäsolut), jotka käsittävät polypepti-20 diä koodaavan heterologisen polynukleotidilohkon yhdennettynä pysyvästi kromosomiin, endogeenisen promoottorin säätelyn alaisuuteen. Kun tämä yhdennetty lohko käsittää esimerkiksi etanolia tehokkaasti tuottavasta organismista kuten Zvmomonas mobi-1is-bakteerista peräisin olevia etanolin tuotantogeenejä, niin 25 tällöin oheisen keksinnön mukaiset, yhdistelmä-DNA-tekniset
Escherichia coli-bakteerit ja muut enterobakteerisolut kykenevät muuttamaan monia erilaisia biomassasta peräisin olevia sokereita tehokkaasti etanoliksi. Keksintö kohdistuu myös mutaatioihin, jotka parantavat sellaisten kromosomeihin yhdennetty-30 jen heterologisten geenien koodaamien proteiinien tuotantoa, jotka geenit ilmentyvät endogeenisen promoottorin säätelyn alaisuudessa, sekä menetelmiin näiden mutaatioiden tunnistamiseksi .
35 Glykolyysin aikana solut muuntavat yksinkertaiset sokerit kuten glukoosin palorypälehapoksi, jolloin syntyy ylimäärin ATP:tä ja NADHrta. Kun toimiva elektroninsiirtojärjestelmä hapettavaa 2 111552 fosforylaatiota varten puuttuu, niin tällöin vähintään 95 % palorypälehaposta kuluu lyhyissä poluissa, joissa syntyy NAD+:ia, joka on jatkuvan glykolyysin ja ATP-tuotannon välttämätön edellytys. Näissä NAD+-tuotantojärjestelmissä syntyviä 5 jätetuotteita kutsutaan yleisesti fermentointituotteiksi.
Mikro-organismit poikkeavat huomattavasti toisistaan näiden erilaisten fermentointituotteiden suhteen, jotka tuotteet ovat spesifisiä kullekin suvulle. Katso esimerkiksi teos Krieg, N.R. 10 ja J.G. Holt, toimittajat, (1984), BERGEY'S MANUAL OF SYSTEMATIC BACTERIOLOGY (Williams & Wilkins Co., Baltimore). Näistä tuotteista voidaan mainita orgaaniset hapot kuten laktaatti, asetaatti, sukkinaatti ja butyraatti sekä neutraalit tuotteet kuten etanoli, butanoli, asetoni ja butaanidioli. Niinpä näiden 15 bakteeriperäisten fermentointituotteiden erilaisuudesta johtuen niitä on alettu käyttää tärkeimpänä määreenä taksonomiassa.
Katso edellä mainittu teos Krieg ja Holt (1984) .
Fermentoinnin lopputuotteilla on lukuisia yhteisiä peruspiir-20 teitä. Ne ovat suhteellisen myrkyttömiä olosuhteissa, joissa niitä alunperin muodostuu, mutta niiden myrkyllisyys kasvaa pitoisuuden kasvaessa. Ne ovat pelkistyneempiä kuin pyruvaatti, koska niiden välittömät esiasteet ovat toimineet lopullisina elektronin vastaanottajina glykolyysin aikana. Biotekniikan 25 perinteiset ja taloudellisesti kaikkein kannattavimmat sovellu-tukset perustuvat näiden fermentointituotteiden mikrobiologiseen tuotantoon, joista sovellutuksista voidaan mainita meijerituotteet, lihat, virvoitusjuomat ja polttoaineet.
30 Tällä hetkellä suurin osa polttoaine-etanolista tuotetaan mais-sitärkkelyksessä tai ruokosokerissa läsnäolevista heksoosisoke-i reistä käyttäen joko Saccharomvces cerevisiae-hiivaa tai Zvmo-monas mobilis-bakteeria (Z. mobolisl. Nämä ovat kuitenkin bio-. massasokereiden suhteellisen kalliita lähteitä, ja niillä on 35 kilpailevaa merkitystä myös ravintoaineina. Lisäksi fermentoinnin aikana suuri osa heksoosista muuttuu väistämättä takaisin biomassaksi kuten mikrobisoluiksi eikä etanoliksi. Tavanomais- 3 111552 ten etanolia tuottavien mikro-organismien tapauksessa tällaisella biomassalla on korkeintaan vain rajallista kaupallista arvoa esimerkiksi elintarvikkeiden lisäaineena, joten ne edustavat kalliin sokerisubstraatin tehotonta hyväksikäyttöä.
5 Tärkkelykset ja heksoosisokerit muodostavat vain pienen osan kasvien kaikista hiilihydraateista. Kasvien varsissa, lehdissä, kuorissa, akanoissa, tähkissä ja muissa osissa esiintyvän hiilihydraatin pääasiallisia muotoja ovat seinämien rakennepoly-10 meerit, selluloosa ja hemiselluloosa. Näiden polymeerien hydro-lyysi vapauttaa neutraalien sokereiden kuten glukoosin, ksyloo-sin, mannoosin, galaktoosin ja arabinoosin seoksen. Yksikään tunnettu luonnossa esiintyvä organismi ei kykene metaboloimaan nopeasti ja tehokkaasti näitä kaikkia sokereita, erityisesti 15 pentooseja, etanoliksi tai joksikin muuksi yhdeksi arvokkaaksi tuotteeksi.
Escherichia coli (E. colil ja muut samankaltaiset suolistobakteerit ovat tärkeimpiä kaupallisesti käyttökelpoisia mikro-or-20 ganismeja, jotka kykenevät metaboloimaan kaikkia biomassasta peräisin olevia sokereita fermentoimalla niitä anaerobisissa olosuhteissa. Kuitenkin anaerobisissa fermentointiolosuhteissa nämä organismit muuttavat sokerit liukoisten tuotteidenseokseksi, joka sisältää pieniä määriä etanolia, ja jota ei kyetä 25 erottamaan taloudellisesti. Katso julkaisu Ingram, L.O., T. Conway, D.P. Clark, G.W. Sewell ja J.F. Preston (1987), Appi. Environ. Microbiol. 53: 2420-2425. Niinpä tällaiset enteeriset bakteerit käyttävät tehokkaasti hyväkseen kaikkia biomassasta peräisin olevia sokereita, mutta ne eivät kykene tuottamaan 30 niistä sellaista tuotetta, jonka saanto ja yhdenmukaisuus olisivat riittävät kaupallista arvoa ajatellen.
Näin ollen alalla esiintyy tarvetta löytää mikro-organismi, jossa kyky metaboloida tehokkaasti kaikkia biomassasta peräi-35 sin olevia sokereita, kuten asianlaita on tiettyjen suolisto-bakteereiden kuten E. coli-bakteerin tapauksessa, yhdistyy kykyyn tuottaa suuria määriä vain yhtä pääasiallista, kaupalli- 4 111552 sesti arvokasta liukoista fermentointituotetta kuten etanolia. Edelleen, alalla esiintyy jatkuvaa tarvetta löytää sellaisia organismeja, jotka voivat tuottaa mikrobibiomassaa, joka käsittää lisätuotteita kuten kaupallisesti arvokkaita proteiineja 5 riittävän suurena saantona ja riittävän hyvälaatuisena kaupallista talteenottoa ajatellen.
Fermentointipolut muuttavat palorypälehapon happamien ja neutraalien tuotteiden seokseksi. Kaksi polkua ovat hallitsevia 10 suolistobakteereissa kuten E. coli:ssa. Laktaatti-dehydrogenaa-si katalysoi pyruvaatin pelkistymistä maitohapoksi, jolloin NADH pelkistyy suoraan muotoon NAD+. Toinen polku, johon pyru-vaatti-formaatti-lyaasi osallistuu, on monimutkaisempi. Pyru-vaatti-formaatti-lyaasi, joka katalysoi pyruvaatin pilkkoutu-15 mistä formaatiksi ja asetyyli-koentsyymi A:ksi, on keskeinen entsyymi E. coli:n anaerobisessa metaboliassa, koska anaerobi-oosissa tämä entsyymi aiheuttaa pyruvaatin suuren osan metabo-loitumisen. Pyruvaatti-formaatti-lyaasia koodaava E. coli-qeeni (pfl-geeni) on kloonattu ja sen sekvenssi on määritetty. Katso 20 julkaisu Christiansen, L., ja S. Pedersen (1981), Mol. Gen.
Genet. 181: 548-551; Rodel, W., W. Plaga, R. Frank ja J. Knappe (1988), Eur. J. Biochem. 177: 153-158. Tätä pfl-geeniä edeltävät moninkertaiset promoottorit ja anaerobioosi indusoi sen voimakkaaseen ilmentymiseen. Katso julkaisu Sawers, G., ja A.
25 Bock (1988), J. Bacteriol.. 170: 5330-5336.
DNA, jota käytetään etanolia tuottavien geenien aikaansaamiseksi oheisen keksinnön mukaista yhdistelmäisäntää varten, on eristetty esimerkiksi Z. mobilis-bakteerista. Tämä on mikro-30 organismi, jolla on epätavalliset metaboliset tunnusomaiset piirteet, ja jota esiintyy tavallisesti kasvien medessä ja hu-*: najassa. Z. mobilis-villityyppiä on käytetty jo kauan luonnol lisena siirrosteena agavesta saatavaa kasvimehua fermentoitaes-sa nimellä "pulque" tunnetun meksikolaisen alkoholijuoman tuot-35 tamiseksi sekä siirrosteena palmuviinejä tuotettaessa. Kuten edellä on huomautettu, tätä organismia käytetään myös polttoaine-etanolin tuottamiseksi, ja kirjallisuudessa on esitetty, 5 111552 .että se kykenee tuottamaan etanolia tuotantonopeuksilla, jotka ovat olennaisesti suurempia kuin hiivoilla saavutettavat tuo-tantonopeudet.
5 Vaikka Z. mobilis onkin ravintovaatimuksiltaan yksinkertainen ja vaikka se kykeneekin syntetisoimaan aminohappoja, nukleotidejä ja vitamiineja, niin kuitenkin niiden erilaisten sokerien joukko, jonka tämä organismi kykenee metaboloimaan, on hyvin rajallinen, koostuen normaalisti glukoosista, fruktoosista ja 10 sakkaroosista. Näiden sokereiden fermentoituessa substraatti-tasolla tapahtuva fosforylaatio on biosynteesin ja homeostasian ainoa energianlähde. Z. mobilis ei kykene kasvamaan ilman käy-miskelpoista sokeria edes rikkaassa alustassa kuten ravinteita sisältävässä elatusalustassa.
15 Z. mobilis-bakteerissa kaksi entsyymiä eli pyruvaatti-dekarbok-sylaasi (PDC) ja alkoholi-dehydrogenaasi, erityisesti II-muoto (ADHII) ovat välttämättömiä pyruvaatin muuntamiseksi etanoliksi ja NAD+:n tuottamiseksi. Suuria määriä näitä erillisiä proteii-20 neja esiintyy Z. mobolis-bakteerin sytoplasmassa, tämän määrän ollessa alueella 2-5 % kumpaakin liukoista proteiinia. Nämä suuret määrät oletetaan olennaisiksi suurella nopeudella tapahtuvalle NADH:n hapettumiselle ja glykolyyttiselle vuolle, joka on välttämätön energian tuotannon kannalta. Alalla on jo esi-25 tetty PDC:tä ja ADHII:ta koodaavien Z. mobilis pdc- ja adhB^ I geenien kloonaus ja sekvenssin määritys. Katso julkaisut Conway, T., Y.A. Osman, J.I. Konnan, E.M. Hoffman ja L.O. Ingram (1987), J. Bacteriol. 169: 949-954; Conway, T., G.W. Sewell, Y.A. Osman ja L.O. Ingram (1987), J. Bacteriol., 169: 2591-30 2597; Brau, B., ja H. Sahm (1986), Arch. Microbiol. . 146: 105- 110; Brau, B., ja H. Sahm (1986), Arch. Microbiol.. 144: 296-*: 301; Neale, A.D., R.K. Scopes, R.E.H. Wettenhall ja N.J. Hoo- genraad (1987), Nucleic Acid. Res.. 15: 1753-1761; Ingram, L.O. ja T. Conway (1988), Appi. Environ. Microbiol.. 54: 397-404; 35 Ingram, L.O., t. Conway, D.P. Clark, G.W. Sewell ja J.F. Preston (1987), AppI. Environ. Microbiol.. 53: 2420-2425.
6 111552
Molekyyligenetiikan avulla yhteen ainoaan organismiin voidaan yhdistää pentoosia hyväksikäyttävissä suolistobakteereissa kuten E. coli-bakteerissa esiintyvä anaerobinen metaboliapolku sekä etanolin tuottajassa kuten Z. mobilis-bakteerissa esiin-5 tyvä, etanolia tehokkaasti tuottava polku. Täten, Z. mobilis pdc-geenin ilmentyminen suolistobakteereissa kuten E. coli:ssa. Erwinia chrvsanthemi:ssa ja Klebsiella planticola;ssa poikkeuttaa pyruvaattivirtaa osittain siten, että fermentointituotteena saadaan etanolia, kun luonnollista ADH-aktiivisuutta käytetään 10 pieninä pitoisuuksina. Tehokkaampaan etanolituotantoon ja suurempiin etanolipitoisuuksiin ollaan päästy yhdistelmä-E. coli-bakteerilla, joka käsittää PDC:ta ja ADHII:ta koodaavat Z. mo-bilis-geenit monikopioplasmidissa. Katso julkaisut Ingram et ai. (1987), edellä; Neale A.D., R.K. Scopes ja J.M. Kelly 15 (1988), Appi. Microbiol. Biotechnol.. 29: 162-167. E. coli B
(pLOI297)- ja E. coli ATCC 15224 (pL0I1297)-kannat ovat erinomaisia muodosteita etanolituotantoa ja ympäristöolosuhteiden sietokykyä ajatellen. Katso julkaisu Alterthum, F. ja L.O.
Ingram (1989), Appi. Environ. Microbiol.. 55: 1943-1948. Nämä 20 vhdistelmä-E. coli-kannat fermentoivat tehokkaasti glukoosin, laktoosin ja ksyloosin etanoliksi.
Näillä edellä kuvatuilla vhdistelmä-E. coli-bakteereilla on päästy määrällisesti käyttökelpoiseen etanolituotantoon käyt-25 täen Z. mobilis-bakteerista saatuja, plasmidiin sidottuja, eta-*. nolituotantoon johtavia geenejä. Edelleen, prototyyppikantojen etanolituotannon alustavaa testaamista helpotettiin sijoittamalla nämä eksogeeniset geenit monikopioplasmidiin. Nämä ekso-geeniset geenit eivät olleet kuitenkaan täysin stabiileja, kos-30 ka nämä plasmidit olivat luontaisesti epästabiileja ilman valintapainetta, joka takaa niiden pysymisen isäntäsolussa. Li-säksi plasmidien yhteensopimattomuudesta johtuen, etanolituotantoon johtavien geenien tapauksessa tyypillisen E. coli-il-mentämisplasmidin käyttö tekee mahdottomaksi käyttää kaikkein 35 tarkoituksenmukaisinta tapaa istuttaa etanolia tuottavaan kaupalliseen peruskantaan muita eksogeenisiä geenejä muiden valittujen tuotteiden kuten arvokkaiden proteiinien tuottamiseksi.
7 111552
Oheinen keksintö kohdistuu yhdistelmä-DNA-tekniikalla saatuihin isäntäsoluihin, jotka ilmentävät tehokkaasti hyödyllisiä poly-peptidejä koodaavia, kromosomeihin yhdennettyjä heterologisia geenejä. Keksinnön erään piirteen mukaisesti tällaisia yhdis-5 telmäsoluja saadaan siten, että toivottua polypeptidiä tai po-lypeptidejä koodaava heterologinen DNA-lohko istutetaan ensin isäntäsolun kromosomiin endogeenisen ja edullisesti vahvan promoottorin säätelyn alaisuuteen. Tämän jälkeen transformoituja soluja käsitellään sitten valinnaisesti mutageenillä. Lopuksi 10 heterologisten geenien ilmentyminen näissä transformanteissa testataan joko geneettisen valinnan avulla tai seulomalla niiden transformanttien löytämiseksi, jotka sisältävät mutaation, joka saa aikaan istutetun DNA-lohkon voimistunutta ilmentymistä ja edelleen jokaisen tähän istutettuun DNA-lohkoon koodautuneen 15 polypeptidin suurempaa tuotantoa.
Nämä kromosomeihin yhdennetyt heterologiset geenit ja mutaatio, joka johtaa suurempaan ilmentymiseen, ovat äärimmäisen stabiileja jopa ilman niitä olosuhteita, joissa geenin voimistuneen 20 ilmentymisen pysyminen valikoituu. Näin ollen nämä keinotekoisesti aikaansaadut isännät ovat ympäristölle turvallisempia kuin tavanomaiset, plasmidiin perustuvat yhdistelmä-DNA-tekni-set tuotantojärjestelmät, koska ne eivät sisällä liikkuvia geneettisiä elementtejä.
25
Erityisenä esimerkkinä voidaan mainita yhdistelmä-DNA-tekninen suolistobakteeri Escherichia coli. joka kykenee muuttamaan tehokkaasti kaikki biomassasta peräisin olevat sokerit etanoliksi, kun siinä käytetään tehokkaasta etanolin tuottajasta kuten 30 Zvmomonas mobilis-bakteerista peräisin olevia eksogeenisia, etanolin tuotantoon johtavia geenejä. Nämä etanoligeenit yhden-: tyvät pysyvästi yhdistelmä-NDA-teknisen isännän kromosomiin, E.
coli:n pyruvaatti-formaatti-lyaasi-geenin (pfl-geenin) endogeenisen promoottorin säätelyn alaisuuteen. Tämän isännän kromo-35 somi käsittää lisäksi mutaation, joka lisää etanolituotantoon johtavien proteiinien tuotantoa oheisen keksinnön mukaisesti. Nämä yhdistelmä-DNA-tekniset isännät voivat ottaa vastaan ta- 8 111552 vallisia E. coli-ilmentämisplasinide~ia muiden toivottujen tuotteiden, kuten kaupallisesti arvokkaiden proteiinien tehokkaaksi tuottamiseksi etanolin ohella. Näin ollen keksinnön mukaisten bakteereiden suurena tilavuutena toteutetusta, etanolin 5 tuotantoon tähtäävästä fermentaatiosta peräisin oleva jäännös-biomassa voi valinnaisesti sisältää hyvin runsaasti yhtä tai useampaa arvokasta lisätuotetta. Keksinnön oleelliset tunnusmerkit on esitetty oheisissa patenttivaatimuksissa.
10 Erityisemmin, oheisen keksinnön eräs piirre kohdistuu yhdis-telmä-DNA-tekniseen isäntäsoluun, jonka kromosomi käsittää (a) heterologisen DNA-lohkon tämän isäntäsolun suhteen endogee-nisen promoottorin kopioitumisen säätelyn alaisuudessa, tämän DNA-lohkon koodatessa toivottua polypeptidiä; sekä (b) mutaa-15 tion, joka saa aikaan tämän heterologisen DNA-lohkon voimistunutta ilmentymistä, mikä johtaa siihen, että yhdistelmä-DNA-tekninen isäntäsolu tuottaa enemmän toivottua polypeptidiä verrattuna yhdistelmä-DNA-teknisen isäntäsolun kykyyn tuottaa tätä polypeptidiä ilman mainittua mutaatiota. Tämä heterologi-20 sen DNA-segmentin voimistunut ilmentyminen säilyy ilman sellaisia olosuhteita, joissa tällä tavoin voimakkaammin ilmentävät solut valikoituvat. Eräässä edullisessa suoritusmuodossa tämän yhdistelmä-DNA-teknisen isäntäsolun kromosomi käsittää heterologisen DNA-lohkon, johon on koodautunut lukuisia gee-25 nejä. Näiden lukuisten geenien joukossa on edullisesti myös valikoitavan merkitsimen geeni.
Oheinen keksintö kohdistuu myös solukantaan, joka saadaan tuotteena menetelmästä, jonka käsittämissä vaiheissa: 30 (a) aikaan saadaan sellaisten isäntäsolujen viljelmä, joiden isäntäsolujen käsittämään kromosomiin on koodautunut näille isäntäsoluille endogeeninen promoottori sekä isäntägeeni, joka on mainitun endogeenisen promoottorin kopioitumisen säätelyn alaisuudessa, he-35 terologisten geenien yhdentämiseksi kromosomiin; (b) tässä viljelmässä olevat isäntäsolut transformoidaan heterologisella DNA-lohkolla, joka käsittää: 9 111552 (i) lukuisia geenejä, mukaan lukien valikoitavan mer-kitsimen geeni sekä toivottua polypeptidiä kooda-ava geeni; sekä (ii) sekvenssejä, jotka ovat riittävän homologisia 5 isäntägeenin suhteen, ja jotka sijaitsevat sopi valla tavalla tässä heterologisessa DNA-lohkossa siten, että tähän heterologiseen DNA-lohkoon koo-dautuneet lukuisat geenit voidaan yhdentää isän-tägeeniin homologisesti yhdistämällä; 10 (c) edellä olevasta viljelmästä valikoidaan isäntäsolut tai niiden jälkeläiset, jotka ilmentävät valikoitavan merkitsimen geeniä ensimmäisellä tasolla; (d) vaiheessa (c) valikoimalla saadut isäntäsolut tai niiden jälkeläiset seulotaan toivottua polypeptidiä alku- 15 peräisellä tasolla tuottavien isäntäsolujen saamisek si; (e) vaiheessa (d) tunnistettuja isäntäsoluja tai niiden jälkeläisiä käsitellään valinnaisesti mutageenilla sellaisissa olosuhteissa, että isäntäsolun kromosomiin 20 syntyy mutaatioita; ja sitten (f) vaiheessa (d) tai vaiheessa (e) saadut isäntäsolut tai niiden jälkeläiset testataan sellaisten isäntäsolujen löytämiseksi, jotka isäntäsolut tuottavat toivottua proteiinia alkuperäistä tasoa korkeammalla tasolla 25 sellaisten bakteereiden saamiseksi, joissa bakteereis- . sa oleva mutaatio johtaa heterologisen DNA-lohkon voi makkaampaan ilmentymiseen.
Tällainen voimistunut ilmentyminen johtaa siihen, että isäntä- 30 solu tuottaa enemmän toivottua polypeptidiä verrattuna siihen, miten paljon nämä isäntäsolut tuottavat toivottua polypeptidiä *: mutaation puuttuessa. Lisäksi yhdentyneen heterologisen DNA:n parantunut ilmentyminen säilyy ilman olosuhteita, joissa voimakkaammin ilmentävät solut valikoituvat.
Oheisen keksinnön edullisissa suoritusmuodoissa edellä kuvatun menetelmän piirteinä on lisäksi se, että 35 l0 111552 (i) vaiheessa (b) heterologinen DNA-lohko käsittää lisäksi plasmidin, jossa läsnäoleva replikoni on herkkä lämpötilalle replikaatiota ajatellen; 5 (ii) vaiheessa (b) menetelmä isäntäsolujen transformoimiseksi käsittää myös vaiheen, jossa heterologinen DNA-lohko viedään isäntäsoluihin ja näitä isäntäsoluja kasvatetaan olosuhteissa, joissa valikoitavan merkitsimen geeniä ensimmäisellä tasolla ilmentävät solut valikoituvat. Soluja kasvatetaan lämpötilassa, 10 joka ei salli plasmidin replikoitumista, minkä seurauksena heterologinen DNA-lohko yhdentyy kromosomissa läsnäolevaan isän-tägeeniin homologisen yhdistymistapahtuman seurauksena; (iii) vaiheessa (c) menetelmä isäntäsolujen valikoimiseksi kä-15 sittää lisäksi vaiheen, jossa valikoitavan merkitsimen geeniä ensimmäisellä tasolla ilmentäviä isäntäsoluja kasvatetaan olosuhteissa, joissa ei tapahdu valikoitavan merkitsimen geeniä ilmentävien solujen valikointia. Erityisesti, näitä isäntäsoluja kasvatetaan näissä ei-valikoivissa olosuhteissa ensimmäises-20 sä lämpötilassa, joka sallii plasmidin replikoitumisen, joka johtaa plasmidin ja valikoitavan merkitsimen geenin spontaaniin leikkautumiseen isäntägeenistä toisen homologisen yhdistymistapahtuman seurauksena. Sitten isäntäsoluja kasvatetaan näissä ei-valikoivissa olosuhteissa toisessa lämpötilassa, joka ei 25 salli plasmidin replikoitumista, mikä johtaa isäntäsoluihin, . jotka käsittävät toivottua polypeptidiä koodaavan geenin ilman valikoitavan merkitsimen geeniä ja plasmidia.
Ei-valikoivien olosuhteiden ja sellaisen lämpötilan, joka ei 30 salli plasmidin replikoitumista, käyttö perustuvat keksinnön tämän piirteen mukaisesti siihen, että plasmidireplikonin yh-: dentyminen kromosomiin pienentää jonkin verran kasvunopeutta.
Tästä syystä kannat, joista plasmidi on leikkautunut, kasvavat hieman nopeammin kuin ne, jotka käsittävät vielä yhdentyneen 35 plasmidin, minkä avulla voidaan rikastaa klooneja, joista plas-midireplikoni ja samalla valikoitavan merkitsimen geeeni ovat hävinneet.
111552 11
Eräässä toisessa, keksinnön tähän suoritusmuotoon liittyvässä edullisessa suoritusmuodossa edellä kuvatun menetelmän tunnusomaisina piirteinä on vielä se, että (i) vaiheessa (b) hetero-loginen DNA-lohko käsittää suljettuna renkaana olevaa DNA:ta, 5 joka ei kykene replikoitumaan, sekä (ii) vaiheessa (f) menetelmä isäntäsolujen testaamiseksi käsittää vaiheet, joissa valikoidaan vaiheessa (d) tai vaiheessa (e) tuotetut sellaiset isäntäsolut tai niiden jälkeläiset, jotka ilmentävät valikoitavan merkitsimen geeniä toisella tasolla, joka on ensimmäistä 10 tasoa suurempi, minkä jälkeen näistä isäntäsoluista, jotka ilmentävät tätä valikoitavan merkitsimen geeniä toisella tasolla, seulotaan isäntäsolut, jotka tuottavat toivottua proteiinia alkuperäistä tasoa korkeammalla tasolla. Kun valikoitavan merkitsimen geeni saa aikaan esimerkiksi kloramfenikolin vastus-15 tuskyvyn, niin edellä mainitun menetelmän vaiheessa (d) tai (e) tuotetut solut voivat ilmentää kloramfenikolin vastustuskyvyn geeniä ensimmäisellä tasolla, joka saa aikaan vastustuskyvyn vähintään noin 20 /xg/ml olevalle kloramfenikolipitoisuudelle. Niissä suoritusmuodoissa, joissa menetelmään kuuluu vielä vai-20 he, jossa valikoidaan edelleen solut, joissa oleva mutaatio saa aikaan kloramfenikolin vastustuskyvyn geenin ilmentymisen toisella, korkeammalla tasolla, niin tämä toisella tasolla tapahtuva ilmentyminen voi saada aikaan vastustuskyvyn vähintään noin 100 jug/ml olevalle kloramfenikolipitoisuudelle. Edullises-25 ti, kloramfenikolin vastustuskykyä korkeammalla tasolla ilmen-; tävät mutanttisolut voidaan valikoida käyttäen noin 600 jug/ml olevaa kloramfenikolipitoisuutta.
Tämän keksinnön mukainen yhdistelmä-DNA-tekninen isäntäsolu voi 30 olla mikrobisolu kuten suolistobakteeri. Esimerkkeinä tässä mielessä sopivista suolistobakteereista voidaan mainita kannat 1 Erwinia chrvsanthemi. Escherichia coli ja Klebsiella pneumoniae.
35 Heterologinen DNA-lohko, joka on yhdennetty yhdistelmäisännän perimään kuuluvaan kromosomiin oheisen keksinnön mukaisesti, on edullisesti vahvan endogeenisen promoottorin, esimerkiksi py- 12 111552 ruvaatti-formaatti-lyaasi- (pfl-) promoottorin säätelyn alaisuudessa .
Eräissä suoritusmuodoissa heterologinen DNA-lohko koodaa suuria 5 määriä etanolia tuottavasta organismista peräisin olevaa alko-holidehydrogenaasia sekä pyruvaatti-dekarboksylaasia. Esimerkkeinä näistä entsyymeistä voidaan mainita Zvmomonas mobilis-bakteerista peräisin olevien geenien koodaama alkoholidehydro-genaasi ja pyruvaatti-dekarboksylaasi. Oheisen keksinnön edul-10 lisessa suoritusmuodossa yhdistämällä saatu isäntäsolu kykenee tuottamaan etanolia fermentoimalla esimerkiksi glukoosia tai ksyloosia, teoreettisten saantojen vastatessa tällöin lisätyn sokerin vähintään noin 90- tai 100-prosenttista konversiota etanoliksi, vastaavasti. Eräissä tapauksissa todetut etanoli-15 saannot näyttävät olevan suurempia, kuin mikä on mahdollista lisätyn sokerimäärän perusteella laskien, mistä tuloksesta nähdään, että monimutkaiset ravinteet kataboloituvat samalla pyru-vaatiksi ja täten siis etanoliksi.
20 Oheisen keksinnön lisäpiirteen mukaisesti aikaan saadaan edellä kuvatusti yhdistämällä saatu isäntäsolu, jonka sisältämä kromosomi käsittää vielä toisen mutaation, erityisesti fumaraatti-reduktaasigeenissä (frd-geenissä) esiintyvän mutaation, joka häiritsee sukkinaatin syntymistä, vähentäen täten etanolituo-25 tantoa mahdollisesti estävän hapon tuotantoa.
• «
Oheisen keksinnön mukainen, yhdistämällä saatu isäntäsolu voi käsittää vielä muun mutaation, joka häiritsee yhdistymistä solussa, jolloin solu on turvallisempi ympäristölle siinä suh-30 teessä, että sen kyky olla vuorovaikutuksessa liikkuvien geneettisten elementtien kanssa on heikentynyt. Eräässä suoritus-: muodossa yhdistymistä häiritsevä mutaatio on recA-geenissä esiintyvä mutaatio.
35 Keksinnön mukainen, yhdistämällä saatu isäntäsolu voidaan tuottaa ohessa erityisesti mainittujen menetelmien lisäksi myös muilla erilaisilla tavoilla. Esimerkkeinä näistä muista mene- 13 111552 telmistä voidaan mainita geneettiset manipulointimenetelmät heterologisen DNA-lohkon istuttamiseksi isäntäsolun kromosomissa olevaan ennaltamäärättyyn asemaan sekä ilmentymistä parantavien mutaatioiden aikaansaamiseksi ja tunnistamiseksi. Erityi-5 sesti, oheisen keksinnön mukaisen, yhdistämällä saadun mikrobi-kannan molekyyligeneettiset standardianalyysit tekevät mahdolliseksi sen, että yhdistelraä-DNA-teknisiä isäntäsoluja voidaan valmistaa myös muilla, oheisen keksinnön kattamilla menetelmillä. Esimerkiksi, oheisen keksinnön mukaisesti toteutettuun eri- 10 tyiseen mutaatioon liittyvien DNA-sekvenssien muutosten tunteminen tekee mahdolliseksi sellaisen heterologisen DNA-lohkon suunnittelun, synteesin ja istuttamisen isäntäkromosomiin, joka DNA-lohko ei sisällä yksinomaan toivottuja proteiineja koodaa-via geenejä, vaan myös näiden geenien promoottorin ja mutaati- 15 on, joka johtaa näiden geenien voimakkaaseen ilmentymiseen. Tällainen geneettinen muodoste, jonka käsittämä heterologinen DNA-lohko sisältää sopivan mutaation ja promoottorin toivottujen geenien lisäksi, on näin ollen oheisen keksinnön eräs suoritusmuoto .
20
Kuvio 1 esittää kaavamaisesti yhdentämisvektorin (pLOI543) muodostamista, joka vektori sisältää lämpötilasta riippuvan repli-konin (pSCIOI; Hamilton, C.M., M. Aldea, B.K. Washburn, P. Ba-bitzke ja S.R. Kushner (1989), J. Bacteriol.. 171: 4617-22) 25 etanolia tuottavien geenien (Z. mobilis pdc- ja adhB-geenit) • sekä kloramfenikolin vastustuskyvyn geenin yhdentämiseksi E. coli kromosomin pfl-geeniin. Lyhenne: Klenow, ylimenevän alueen täyttäminen emäksillä tylpän pään saamiseksi käyttäen E. coli DNA-polymeraasi I:n Klenow-kappaletta.
30
Kuvio 2 esittää kaavamaisesti plasmidin (pLOI510) muodostamista * 2. mobilis pdc- ja adhB-geenien yhdentämiseksi E. coli kromosomin pfl-geeniin käyttäen vektoritonta, renkaaksi tehtyä DNA-kappaletta. Lyhenteet: Klenow, ylimenevän alueen täyttäminen 35 emäksillä tylpän pään saamiseksi käyttäen E. coli DNA-polymeraasi I:n Klenow-kappaletta; Cir. Frag., rengasmaiseksi tehty 111552
Sali-kappale plasmidista pLOI510, joka on eluoitu agaroosigee-listä ja ligatoitu sulkeutuneiden renkaiden saamiseksi.
Kuvio 3 esittää etanolin (A, C, E, G) tuotantoa ja kasvua (B, 5 D, F) panosfermentoinnin aikana. A ja B. 10-prosenttisen glukoosin fermentointi. Symbolit: ·, plasmidipohjäinen etanolia tuottava kanta ATCC11303(pLOI297); O, kromosomiin yhdennetty, etanolia tuottava kanta, josta puuttuu ilmentymistä parantava mutaatio, K02. C. ja D. 10-prosenttisen glukoosin fermentointi.
10 Symbolit: 0, kromosomiin yhdennetty kanta, josta puuttuu ilmentymistä parantava spontaani mutaatio, K03; t, kromosomiin yhdennetty kanta, joka sisältää ilmentymistä parantavan spontaanin mutaation, K04; a, K04, jota on täydennetty 22 mM:llä nat-riumasetaattia. E. ja F. 8-prosenttisen ksyloosin fermentointi.
15 Symbolit: ·, K04; A, KOll, K04:n muu mutantti, josta puuttuu fumaraattireduktaasin (frd) aktiivisuus; O, K012, KOll:n muu mutantti, joka käsittää recA-mutaation. G. Fermentointi K020:n avulla, joka on kromosomiin yhdennetty kanta, johon on indusoitu mutaatio. Symbolit: , 10 % glukoosia, 0, 8 % ksyloosia.
20
Kuvio 4 esittää 10-prosenttisen glukoosin fermentointia KOll:n (frd) avulla ilman pH-säätöä. A. Kasvu (·) ja etanolituotanto (O). B. Elatusalustan pH (Δ).
25 Oheinen keksintö kohdistuu yhdistämällä saatuun isäntäsoluun, jonka kromosomi käsittää (a) heterologisen DNA-lohkon tämän isäntäsolun suhteen endogeenisen promoottorin kopioitumisen säätelyn alaisuudessa, tämän DNA-lohkon koodatessa toivottua polypeptidiä; sekä (b) mutaation, joka saa aikaan tämän hetero- 30 logisen DNA-lohkon voimistunutta ilmentymistä, mikä johtaa siihen, että tämä yhdistämällä saatu isäntäsolu tuottaa enemmän ] ' toivottua polypeptidiä verrattuna yhdistelmä-DNA-teknisen isäntäsolun kykyyn tuottaa tätä polypeptidiä ilman mainittua mutaatiota. Tämä heterologisen DNA-segmentin voimistunut ilmentymi- 35 nen säilyy ilman sellaisia olosuhteita, joissa tällä tavoin voimakkaammin ilmentävät solut valikoituvat.
15 111552 Määritelmiä: Ohessa "heterologinen" DNA-lohko tarkoittaa sitä, että DNA-lohko sisältää sekvenssin, joka eroaa vastaavassa asemassa, endogeenisen promoottorin jälkeen sijaitsevasta sekvenssistä, tämän endogeenisen promoottorin kuuluessa sen solun, jo-5 hon heterologinen lohko on istutettu, kromosomiin. Täten, oheisen keksinnön mukainen heterologinen DNA-lohko sisältää DNA-lohkon, joka on otettu isäntäkromosomin yhdestä asemasta ja istutettu toiseen asemaan (sellaisen endogeenisen promoottorin säätelyn alaisuuteen, joka promoottori on muu kuin tähän loh-10 koon luonnollisesti liittyvä promoottori), sekä toisesta organismista peräisin olevan DNA-lohkon. Heterologisen DNA-lohkon nukleotidisekvenssiin on koodautunut yksi tai useampi rakenne-geeni ja se voi olla peräisin mistä tahansa geenilähteestä, joista voidaan mainita esimerkiksi eukarioottisten tai prokari-15 oottisten solujen perimät tai virusperimät, tai geneettisillä manipulointitekniikoilla luoduista keinotekoisista koodaavista sekvensseistä.
Heterologinen lohko on endogeenisen promoottorin kopioitumisen 20 säätelyn alaisuudessa siksi, että se on yhdennetty isäntäsolun kromosomiin tämän promootorin jälkeen (eli 5'-puolelle). Kuten edellä on mainittu, tämä endogeeninen promoottori on edullisesti "vahva” promoottori siinä mielessä, että se saa aikaan geenin voimakasta ilmentymistä verrattuna tyypillisempään mikrobi-25 promoottoriin kuten E. coli:n laktoosioperoni (lac) -promootto-,♦ riin. Vahvoja promoottoreita ovat ne, jotka sisältävät vain yhden kohdan promoottorin aktiivisuutta varten eli RNA-polyme-raasin sitomiseksi ja tämän entsyymin ohjaamiseksi kopioitumisen oikeaan alkamiskohtaan, sekä ne, jotka sisältävät lukuisia 30 tällaisia kohtia. Esimerkkinä tällaisesta ensimmäistä tyyppiä olevasta (vain yhden kohdan käsittävästä) vahvasta promootto- • «· | ‘ rista voidaan mainita hyvin tunnettu tryptofaani (trp) -promoottori. Esimerkkinä viimeksimainittua tyyppiä olevasta (monta kohtaa käsittävästä) promoottorista voidaan mainita pyruvaatti-35 formaatti-lyaasi (pfl) -geenin promoottori, jonka homologisia muunnoksia on löydettävissä E. colirsta ja muista enteerisistä bakteereista. Pyruvaatti-formaatti-lyaasia ilmentyy tavallises- 16 111552 ti suurina määrinä, erityisesti anaerobisissa olosuhteissa, jotka säilyvät fermentoinnin aikana ilman voimakasta ilmastusta. Itse asiassa pf1-promoottori sisältää seitsemän kohtaa promoottorin aktiivisuutta varten, mikä todetaan esimerkiksi pfl 5 mRNArn sekvenssianalyyseista ja "jalanjälki"-tiedoista, jotka osoittavat, mihin RNA-polymeraasi on sitoutunut, tai "alukejat-ke"-analyyseista, jotka osoittavat mRNA:n 5'-pään.
Tässä kuvauksessa "mutaatio" tarkoittaa suhteellisen pysyvää 10 muutosta perinnöllisessä materiaalissa, tämän muutoksen käsittäessä tyypillisesti biokemiallisen muutoksen kodoneissa, joista geenit muodostuvat, muutoksen käsittäessä myös mahdollisesti fysikaalisen muutoksen kromosomisuhteissa. Oheisen keksinnön mukainen sopiva mutaatio saa aikaan heterologisen DNA-lohkon 15 voimistunutta ilmentymistä, minkä seurauksena isäntäsolu tuottaa enemmän kutakin tähän lohkoon koodautunutta polypeptidiä verrattuna isäntäsolun kykyyn tuottaa kutakin polypeptidiä tällaisen mutaation puuttuessa. Täten saavutettu voimistunut ilmentyminen säilyy ilman sellaisia olosuhteita, joissa tällä 20 tavalla voimakkaammin ilmentävät solut valikoituvat. Esimerkiksi bakteerikannoissa, joissa on keksinnön mukainen, sekä antibiootin vastustuskykyä aikaansaavien entsyymien että etanolin tuotantoon johtavien entsymien ilmentymistä voimistava, kromosomiin yhdentynyt mutaatio, ei todeta yhdentyneiden geenien 25 voimistuneen ilmentymisen heikkenemistä edes sen jälkeen, kun populaatio on kaksinkertaistunut 68 kertaa, eikä ilman antibiootilla valikointia.
Transformoidut isäntäsolut, joissa on oheisen keksinnön mukai-30 nen mutaatio, voidaan ilmaista tarkoituksenmukaisesti yhden tai useamman, istutettuun DNA-lohkoon koodautuneen polypeptidin voimistuneen ilmentymisen perusteella, geneettisiä standardimenetelmiä käyttäen. Polypeptidin voimistunut ilmentyminen voidaan määrittää ilmaisemalla polypeptidi suoraan tai se voidaan 35 päätellä tähän polypeptidiin liittyvästä aktiivisuudesta. Edullisesti, yksi istutettuun DNA-lohkoon koodautunut geeni voi olla valikoitavan merkitsimen geeni, esimerkiksi geeni, joka 17 111552 saa aikaan isännässä antibiootin vastustuskykyä. Tässä tapauksessa mutanttisolut, joissa antibiootin vastustuskyvyn geeni ilmenee voimakkaammin, voidan valikoida tarkoituksenmukaisesti käyttämällä ensimmäistä tasoa suurempia antibioottipitoisuuk-5 siä, jotka inhiboivat niitä isäntäsoluja, joista puuttuu hete-rologisen DNA-lohkon ilmentymistä voimistava mutaatio.
Erityisemmin ollaan todettu, että oheisen keksinnön kannalta sopivat mutaatiot voidaan saada luotettavasti spontaaneina mu-10 tantteina tai indusoimalla ne tavanomaisella mutageneesillä, minkä jälkeen valikoidaan tai seulotaan ne solut, joilla on yhdentyneiden geenien voimistunutta ilmentymistä vastaava toivottu fenotyyppi. Niinpä sopivien mutaatioiden todetaan syntyvän tietyissä bakteereissa spontaanisti suuruusluokkaa 10'4 -15 10’5 olevalla taajuudella valikoitaessa soluja, jotka ilmentä vät voimakkaammin yhdentynyttä kloramfenikolin vastustuskyvyn geeniä, jolloin nämä solut kasvavat vielä sellaisessa antibi-oottipitoisuudessa, joka on 30 kertaa suurempi kuin se pitoisuus, jota solut sietävät ilman tällaista mutaatiota. Samoin 20 sen jälkeen, kun tiettyjä bakteerisoluja on käsitelty mutagee-nilla, sopivia mutaatioita voidaan saada noin 0,5 - lxlO'4 olevalla taajuudella mutageneesissä eloonjääneistä soluista seulomalla esiin solut, jotka ilmentävät etanoliin liittyviä entsyymejä noin 10-kertaisina määrinä ilman tällaista mutageenista 25 käsittelyä saataviin määriin verrattuna.
* ·
Oheisen keksinnön kannalta sopivat mutaatiot saavat itse asiassa aikaan istutettujen geenien yli-ilmentymistä siinä määrin, että oheisen keksinnön mukaisesti kromosomiin yhdennetyn geenin 30 vain yhdestä kopiosta saatu polypeptidituotanto on verrattavissa tämän saman, monikopioplasmidissa läsnäolevan geenin moninkertaisilla kopioilla saavutettuun tuotantoon. Esimerkiksi tällaisen sopivan mutaation käsittävät bakteerisolut voivat ilmentää yhdennettyjä, esimerkiksi kloramfenikolin vastustuskykyä ja 35 etanolituotantoa aikaansaavia geenejä tasoilla, jotka vastaavat toiminnallisesti sellaista solua, joka sisältää 30-300 näiden samojen geenien kopiota monikopioplasmidissa.
18 111552
Tunnistetuille, oheisen keksinnön mukaisesti käytetyille mutaatioille ei ole määritetty molekyylitason perusteita. Kuitenkin geenin ilmentymisen voimistumisen suuruus (esimerkiksi noin 10-kertaiseksi muuttunut ilmentyminen), johon päästää vain yhdellä 5 seulomis- tai valikointivaiheella, on olennaisesti suurempi kuin mikä olisi odotettavissa geenimonistukseen perustuvalta mutaatiomekanismilta. Valikoitavan geeni-ilmentymisen samankaltaisen voimistumisen saavuttaminen geenimonistuksen avulla edellyttää tyypillisesti toistettuja valikointivaiheita, joissa 10 valikoivaa ainetta käytetään jatkuvasti suurenevina määrinä. Lisäksi oheisten mutaatioiden pieni palautumistaajuus (joka on itse asiassa niin pieni, ettei sitä voida todeta) puhuu sitä vastaan, että nämä mutaatiot perustuisivat geenimonistukseen. Itse asiassa tiedetään, että mutaatiot, jotka saavat aikaan 15 geenin voimistunutta ilmentymistä geenin tandem-toiston avulla, ovat tyypillisesti epästabiileja, eikä niitä voida pitää yllä ilman olosuhteita, joissa tätä geeniä voimakkaammin ilmentävät solut valikoituvat, päin vastoin kuin oheisen keksinnön mukaisten mutaatioiden tapauksessa. Kääntäen, keksinnön mukaisten, 20 spontaanisti syntyvien sopivien mutaatioiden havaittu taajuus on verrattavissa kausaaliseen mekanismiin, johon liittyy piste-mutaatioita.
Yhdentyneiden geenien ilmentymistä voimistavien mutaatioiden 25 valikointi valikoitavan merkitsimen geeniä hyväksikäyttäen voi-: daan toteuttaa oheisen keksinnön mukaisesti minkä tahansa tyyp pisessä isäntäsolussa, jonka tapauksessa alalla tunnetaan käytännön geneettisiä menetelmiä sellaisten kloonien valikoimiseksi, joiden kloonien käsittämät mutaatiot voidaan indusoida vä-30 hintään noin 10’4 olevalla taajuudella mutageenisessä käsittelyssä eloonjäänyttä solua kohden. Samoin oheisen keksinnön mukaisten mutantti-isäntäsolujen seulominen edellyttää käytännöllisiä menetelmiä kloonien valmistamiseksi riittävän suurina lukumäärinä, joista klooneista kukin käsittää riittävästi solu-35 ja toivotun yhdentyneen geenin voimakkaan ilmentymisen ilmaise-misksi tälle kyseessä olevalle toivotulle geenille sopivalla menetelmällä.
19 111552 Tällainen valikointi tai seulominen sopivien mutaatioiden löytämiseksi voidaan toteuttaa kaikkein helpoimmin isäntäsoluilla, joita voidaan viljellä vaivattomasti suurina määrinä, kuten asianlaita on prokarioottisten solujen (bakteerisolujen) ja 5 hiivasolujen tapauksessa. Tämän kuvauksen tavoitteita varten tällaista isäntää kutsutaan "mikrobisoluksi" ja kanta, johon se kuuluu, on "mikrobikanta”. Tällaisista mikrobisoluista erityisen edullisia isäntiä ovat suolistobakteerit kuten Erwinia chrvsanthemi. Escherichia coli ja Klebsiella olanticola. koska 10 ne kykenevät käyttämään hyväkseen monia erilaisia sokereita, mukaan lukien pentoosit ja laktoosi. Vaikka mikrobisolut ovatkin edullisia isäntiä, niin kuitenkin oheisen keksinnön puitteissa voidaan myös käyttää muuntyyppisiä soluisäntiä, mukaan lukien sienisolut ja eukarioottiset solut (eläin-, hyönteis- ja 15 kasvisolut), joihin heterologinen DNA-lohko voidaan istuttaa endogeenisen promoottorin säätelyn alaisuuteen. Täten isäntäso-luista on vain voitava valikoida tai seuloa edellä kuvatulla tavalla sellaiset solut, joissa yhdentyneen heterologisen DNA:n ilmentyminen on voimistunut, tällä tavalla sopivien, paremmin 20 ilmentävien mutanttien saamiseksi.
Etanologeeniseen E. coli-bakteeriin liittyvä suoritusmuoto:
Oheista keksintöä havainnollistava sovellutus käsittää Z. mobi-lis-bakteerista peräisin olevien, etanolituotantoon liittyvien 25 geenien yhdentämisen E. coli-kromosomin pf1-alueeseen. Tällä pfl-geenillä on keskeistä merkitystä normaalille fermentatiivi-selle metabolialle, sen katalysoidessa pyruvaatin muuttumista formaatiksi ja asetyyli-CoArksi ja sen toimiessa asetyyliyksi-köiden olennaisena lähteenä biosynteesiä varten. Täten tämän 30 geenin istuttamalla aiheutettu inaktivoituminen tarkoittaa sitä, että kilpaileva haarautumispiste, jossa pyruvaatti poikkeu-taan etanolituotannosta, on inhiboitunut tässä mikro-organismissa. Ohessa kuvataan myös muita geneettisiä parannuksia, joiden ansiosta sukkinaatin tuotanto eliminoituu ja recA-geeni 35 inaktivoituu.
20 111552 Näiden yhdistämällä saatujen bakteereiden avulla voidaan valmistaa yhdistelmä-polypeptidejä, jotka saadaan sivutuotteina biomassasta peräisin olevien sokereiden etanologeenisen fermen-toinnin aikana. Kromosomiin yhdentymisen seurauksena etanoli-5 tuotannon stabiilisuus paranee merkittävästi verrattuna vastaaviin plasmidipohjäisiin järjestelmiin, mikä on edullista teollisessa mitassa tapahtuvalle fermentoinnille etanolin tuottamiseksi: etanolia tuottavista geeneistä 100 % on säilynyt 68 sukupolven jälkeen, kun taas vain 97 % niistä on säilynyt ver-10 rannollisen, plasmidipohjäisen muodosteen tapauksessa. Samoin etanolituotantoon liittyviä geenejä kantavan plasmidin eliminointi tekee mahdolliseksi sivutuotteiden muodostumiseen johtavien plasmidien istuttamisen, tällöin kuitenkaan etanolin tuotantokykyä häiritsemättä.
15
Biologiset talletukset: Seuraavat talletukset on talletettu kantakokoelmaan American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, 20852, USA. Taulukossa l on lueteltu talletusten vastaanottajan näille viljelmille an-20 tamat talletusnumerot:
Taulukko 1
Biologiset talletukset 25 Viljelmä Talletusnumero E. coli (pLOI510) ATCC 68484 E. COli (pLOI543) ATCC 68485 E. coli KO4 ATCC 55123 E. coli K011 ATCC 55124 30 E. coli K012 ATCC 55125 E. coli K020 ATCC 55126
35 Nämä kyseessä olevat viljelmät on talletettu ehdoilla, jotka takaavat, että viljelmät ovat tämän patenttihakemuksen vireil-läoloaikana sellaisen henkilön saatavilla, jonka patenttiviranomaiset Commissioner of Patents and Trademarks ovat oikeutetta-neet käyttämään näitä viljelmiä pykälien CFR 1.14 ja 35 USC
„ 111552 21 122 nojalla. Nämä talletukset ovat saatavilla vieraiden maiden patenttilakien edellyttämällä tavalla niissä maissa, joissa tämän hakemuksen vastine tai sen jatkohakemukset jätetään tarkastettaviksi. Kuitenkin on selvää, ettei näiden talletusten 5 saatavuus tarkoita sitä, että oheisen keksinnön saisi toteuttaa käytännössä hallitusten myöntämiä patenttioikeuksia rikkoen.
Edelleen, kyseisiä talletettuja viljelmiä säilytetään ja ne ovat yleisön saatavilla mikro-organismien säilytykseen liit-10 tyvän Budapestin sopimuksen mukaisesti, toisin sanoen niitä säilytetään mahdollisimman huolellisesti niiden pitämiseksi elävinä ja kontaminoitumattomina vähintään viiden vuoden pituisen ajanjakson ajan siitä, kun talletuksesta on viimeisen kerran pyydetty näyte, ja joka tapauksessa vähintään 30 vuoden 15 ajan talletuspäivämäärästä laskien tai mahdollisen myönnetyn patentin, jossa viljelmät on kuvattu, arvioidun elinajan. Tallettaja on tietoinen siitä, että hänen on korvattava talletus, mikäli talletuksen hoitaja ei kykene toimittamaan siitä toivottaessa näytettä talletuksen tilasta johtuen. Kaikki kyseisten 20 talletettujen viljelmien yleiselle saatavuudelle asetetut rajoitteet kumoutuvat vääjäämättä nämä viljelmät kuvaavan patentin myöntämisen jälkeen.
Z. mobilis pdc- ja adhB-geenien yhdentäminen E. coli:n B-kromo-25 somiin: Kaksi jäljempänä olevissa esimerkeissä kuvattua lähes-: tymistapaa edustavat niitä strategioita, joita voidaan käyttää oheisen keksinnön mukaisesti sellaisen bakteerikannan kuten E. coli-kannan (ATCC 11303) muodostamiseksi, jossa kannassa vieras geeni (tässä Z. mobilis-bakteerin etanolituotannon geenit) on 30 yhdennetty kromosomaaliseen geeniin, jota on havainnollistettu pf1-geenillä. Ensimmäisessä lähestymistavassa käytetään Hamiltoniin et ai. kehittämän, lämpötilasta riippuvan yhtentämisvek-torin johdannaista. Katso Hamilton, C.M., M. Aldea, B.K. Washburn, P. Babitzke ja S.R. Kushner (1989), J. Bacteriol.. 171: 35 4617-22; sekä alla oleva esimerkki 3.
22 1115 5 2 Täten, kuten esimerkeissä on esitetty, ATCC 11303 transformoitiin lämpötilasta riippuvalla replikointiplasmidilla pLOI543, mitä seurasi kahden homologisen yhdistymistapahtuman valikointi ja rikastus lämpötilan avulla, 64,5 % pesäkkeistä 5 oli herkkiä kloramfenikolille (Cm), mikä osoitti niiden menettäneen plasmidin. Näistä Cm-herkistä klooneista 5,9 % muodosti vaaleanpunaisia pesäkkeitä aldehyditestimaljoilla, mikä osoitti Z. mobilis ADHII:n läsnäolon. Kaksi näistä klooneista, joissa yhdentyneet etanolituotannon geenit olivat säilyneet, mutta 10 joista Cm-vastustuskyvyn geeni ja plasmidi olivat hävinneet, valittiin lisätutkimusta varten, ja niille annettiin nimeksi KOI ja K02.
Esimerkissä 4 esitetyssä toisessa lähestymistavassa Cm-vastus-15 tuskykyinen transformantti saatiin käyttämällä plasmidista pLOI510 peräisin olevaa, rengasmaiseksi tehtyä Sall-kapaletta, jolle annettiin nimeksi K03. Tässä lähestymistavassa soluun ei viety replikoituvaa plasmidia; kromosomiin yhdennettiin vain etanolituotannon geenit ja niihin liittynyt Cm-vastustuskyvyn 20 geeni. Myös K03-klooni muodosti vaaleanpunaisia pesäkkeitä al-dehydi-indikaattorimaljoilla samalla tavalla kuin KOI ja K02. Vertailuna toiminut ATCC 11303 muodosti valkoisia pesäkkeitä (negatiivinen), kun taas ATCC 11303 (pLOI297), joka käsitti Z. mobilis etanoligeenit plasmidissa, muodosti voimakkaan punaisia 25 pesäkkeitä, osoittaen Z. mobilis geenien voimakkaan ilmentymi-; sen.
Tämän jälkeen vektori yritettiin eristää näistä kolmesta DNA-yhdistelmästä alkalisella SDS-hajotusmenetelmällä. Vektoria ei 3 0 saatu näkyviin näiden, preparaattien agaroosigeeleillä, jotka oli värjätty etidiumbromidilla. Nämä preparaatit testattiin myös transformointikokeissa, joissa isäntänä oli TC4, ja joissa valikointi tapahtui Cm-vastustuskyvyn suhteen. Täteen ei saatu lainkaan transformantteja, mikä varmisti edelleen vektorin 35 puuttumisen.
23 1115 5 2
Fermentointi kannoilla KOI/ K02 ja K03: Kuviossa 3 A ja B on verrattu toisiinsa fermentointeja, joissa on käytetty kantoja K02 ja ATCC 11303 (pLOI297), sekä 10 % glukoosia. Kannalla KOI toteutettu fermentointi oli samanlainen kuin kannan K02 tapauk-5 sessa, eikä sitä ole esitetty. Nämä uudet muodosteet tuottivat etanolia hyvin tehottomasti, mikä nähdään pienestä tilavuuden suhteen lasketusta tuottavuudesta ja etanolisaannosta (taulukko 2). Kasvu rajoittui alle puoleen ATCC 11303 (pLOI297):n kasvusta, ja etanolia oli syntynyt vain 4 g/1 72 tunnin kuluttua.
10 Vaikka kanta K03 olikin hieman parempi kuin KOI ja K02, niin siitä huolimatta se on edelleen huono etanolituottaja (kuvio 3 C-D; taulukko 2).
15 20 25 » i 30 35 24 111552
Taulukko 2 E. coli:sta (ATCC 11303) saatujen yhdistelmäkantojen kyky tuottaa etanolia glukoosista ja ksyloosista 5 _10 % glukoosia_
Parametri3 pLOI297° KOIKÖ2 K03 K04 K05 10 Emäs 1,1 5,7 6,3 5,5 1,3 1,4 mmol/g sokeria)
Etanolisaanto 48,8 4,0 4,0 10,4 52,8 52,8 g/i) 15
Etanolisaanto 0,52 0,05 0,05 0,13 0,56 0,56 g/g sokeria)
Teoreettinen 101 10 10 26 110 110 20 saanto (%)
Til. tuottavuus0 1,9 0,3 0,3 0,4 1,5 1,5 (g/litra-h) 25 30 h etanoli 41,8 3,2 3,2 6,4 36,0 36,0
(g/D
Solusaanto 0,048 0,021 0,021 0,028 0,44 0,040 g/g sokeria 30 -------------------------------------------------------------- 3 Laskettu alunperin lisätystä kokonaissokerista. b ATCC 11303 (pLOI297):ssa etanoligeenit sijaitsevat plas-midissa.
« 35 0 Til. tuottavuus = tilavuuden suhteen laskettu tuottavuus = saanto/aika.
40 45 25 1115 5 2
Taulukko 2 (jatkoa) _10 % glukoosia_ 5 Parametri3 K010 KOll KOll K012 K04 (recA) (frd) (frd)d (frd. recA) +Ace
Emäs 1,1 0,6 0 1,1 1,0 10 mmol/g sokeria)
Etanolisaanto 51,2 52,8 38,8 54,4 54,4 g/1) 15 Etanolisaanto 0,54 0,54 0,39 0,57 0,57 g/g sokeria)
Teoreettinen 107 107 76 112 112 saanto (%) 20
Til. tuottavuus 1,8 1,7 1,4 1,2 1,6 (g/litra-h) 30 h etanoli 38,0 38,0 29,0 30,4 38,5 25 (g/1)
Solusaanto 0,041 0,042 0,041 0,035 0,045 g/g sokeria 30 d Fermentointi toteutettiin ilman pH-säätöä. e Täydennetty 3 g/litra natriumasetaattia (lopullinen pitoisuus 22 mM).
’ 35 40 45 26 111552
Taulukko 2 (jatkoa) __8 % ksvloosia__
Parametri3 pL0I297D K04 K011K012 5 (frd) (frd. recA)
Emäs 1,4 1,6 0,5 0,64 mmol/g sokeria) 10
Etanolisaanto 36,0 36,0 41,6 40,8 g/i)
Etanolisaanto 0,47 0,47 0,53 0,53 15 g/g sokeria)
Teoreettinen 94 94 104 103 saanto (%) 20 Til. tuottavuus 1,0 1,1 1,3 1,1 (g/litra-h) 30 h etanoli 30,0 25,6 30,4 26,0 (g/i) 25
Solusaanto 0,050 0,047 0,051 0,048 g/g sokeria 30 3 Laskettu alunperin lisätystä kokonaissokerista.
b ATCC 11303 (pL0I297):ssa etanoligeenit sijaitsevat plas-midissa.
"35
Suuria tilavuuksia emästä kului pH-arvon ylläpitämiseen näillä kolmella uudella kannalla toteutettujen fermentointien aikana, mikä osoittaa, että happamia fermentointituotteita syntyi hyvin paljon.
40
Yhdentyneiden pdc- ja adhB-geenien ilmentymisen voimistaminen mutaatioiden avulla: Vaaleanpunainen fenotyyppi, joka havaittiin aldehydi-indikaattorimaljoilla, näytti osoittavan etanoli-tuotantoon liittyvien Z. mobolis-geenien riittämättömän ilmen-45 tymisen. Mutaatio, joka saa aikaan K02:ssa yhdentyneiden geenien voimistuneen ilmentymisen, saatiin seulomalla tummanpunaisen 27 111552 fenotyypin löytämiseksi aldehydi-indikaattorimaljoilla etyyli-metaanisulfonaatilla toteutetun mutageneesin jälkeen alalla hyvin tunnetuissa standardiolosuhteissa. Noin 200 maljaa analysoitiin, kunkin maljan käsittäessä 200-400 pesäkettä. Neljä 5 tummanpunaista kloonia eristettiin, voimakkaamman värin osoittaessa ADHII:n voimakkaamman ilmentymisen. Yhtä niistä kutsuttiin K020-kannaksi.
Spontaanit K03-mutantit rikastettiin käyttäen suurten Cm-pitoi-10 suuksien vastustuskykyyn perustuvaa valikointia, millä pyrittiin määrittämään se, ilmentivätkö antibiootin vastustuskykyä voimakkaasti ilmantävät mutantit myös toisia istutettuja geenejä voimakkaasti. Yön yli kasvatettujen viljelmien laimennussar-ja maljattiin Luria-agarmaljoille, jotka sisälsivät 2 % glukoo-15 siä ja 600 ^g/ml Cm. Yön yli kestäneen inkuboinnin jälkeen todettiin suuria muodostuneita pesäkkeitä, jotka osoittivat Z. mobilis pdc- ja adhgita-geenien voimakkaan ilmentymisen, näiden pesäkkeiden esiintymistaajuuden ollessa noin 1 100 000 maljat-tua solua kohden. Näillä kaikilla pesäkkeillä oli aldehydi-in-20 dikaattorimaljoilla tummanpunainen fenotyyppi, joka oli samanlainen kuin muodosteella ATCC 11303 (pL0I297), joka on plasmi-dipohjainen muodoste ja etanolia erinomaisesti tuottava kanta. Kaksi mutanttia eli kannat K04 ja K05 otettiin talteen lisätutkimuksia varten. Vektorin puuttuminen näistä kannoista varmis-25 tui jälleen sen perusteella, ettei K04:stä ja K05:stä saaduilla : DNA-preparaateilla kyetty transformoimaan TC4:ää Cm-vastustus- kykyyn perustuvan valikoinnin aikana, ja ettei vektori-DNA:ta ollut läsnä etidiumbromidilla värjätyillä agaroosigeeleillä.
30 Fermentointi kannoilla K04, K05 ja K020: Kuvio 3 C ja D esittää 10 % glukoosin fermentointia K04:llä ja K05:llä. Nämä kaksi kantaa, joissa läsnäoleva spontaani mutaatio parantaa etanoli-tuotantoon liittyvien yhdentyneiden geenien ilmentymistä, valikoituivat samalla kun valikointi toteutettiin suurten antibi-35 oottipitoisuuksien vastustuskyvyn suhteen. Molemmat kannat olivat samanlaisia ja vain fermentointi K04:llä on esitetty. Näillä parannetuilla muodosteilla saavutettu kasvu, solusaanto ja 28 1 1 1552 etanolisaanto olivat lähes samanlaiset kuin plasmidipohjäisen muodosteen ATCC 11303 (pLOI297) tapauksessa. Katso taulukko 2. Vaikka etanolituotannon nopeus, tarkasteltaessa tilavuuden suhteen laskettua tuottavuutta varhaisissa vaiheissa sekä 30 tun-5 nin jälkeen saavutettua etanolipitoisuutta, olikin jonkin verran pienempi kuin muodosteen ATCC 11303 (pLOI297) tapauksessa, niin kuitenkin K04:llä ja K05:llä saavutetut teoreettiset saannot olivat suurempia, ollen yli 100 % lisätystä glukoosista laskien. Tämä suurempi saanto hitaamman fermentoinnin aikana 10 osoittaa, että monimutkaiset ravinteet kataboloituvat samalla pyruvaatiksi ja täten edelleen etanoliksi. Nämä monimutkaiset ravinteet toimivat pääasiallisena typen lähteenä biosynteesissä. Jatkuva typen poistaminen aiheutti pH-arvon kasvua K04:n, K05:n ja ATCC 11303 (pLOI297):n tapauksessa sen jälkeen, kun 15 sokerit olivat kuluneet loppuun. Tämä tuloksena oleva pH-arvon kasvu on tarkoituksenmukainen menetelmä seurata sokerin loppumista.
8 % ksyloosin fermentointia K04-kannalla ja ATCC 11303 20 (pLOI297)-muodosteella verrattiin myös toisiinsa (kuvio 3 E ja F). K04 oli samanlainen kuin plasmidipohjäinen kanta etanoli-tuotannon suhteen, vaikka etanolituotannon nopeus olikin hieman pienempi, mikä nähdään etanolipitoisuudesta 30 tunnin jälkeen (taulukko 2).
25 I Kuvio 3 G esittää 10 % glukoosin ja 8 % ksyloosin fermentointia K020-kannalla, joka käsittää indusoidun mutaation, joka voimistaa etanolituotantoon liittyvien yhdentyneiden geenien ilmentymistä. Näiden molempien sokereiden fermentoiminen tällä kannal-30 la, jossa on indusoitu mutaatio, oli olennaisesti samanlaista kuin kannoilla K04 ja K05, joissa on spontaani mutaatio, ja jotka on valittu suurten antibioottipitoisuuksien avulla.
Lisätyn asetaatin vaikutus: Anaerobisen kasvun aikana pfl-gee-35 nituote on osoitettu asetaatin muodostumisen varsinaiseksi poluksi sekä asetyyli-CoA:n pääasialliseksi lähteeksi biosynteesiä varten (7,17). Z. mobilisiin etanolipolkuun liittyvien gee- 29 111552 nien inaktivoituminen istutuksen seurauksena saattaa johtaa asetaattipuutokseen lipidisynteesiä ajatellen ATCC 11303-joh-dannaisissa. Natriumasetaatin lisäämisen todettiin parantavan etanolituotannon nopeutta, myös saannon kasvaessa vähän (kuvio 5 3 C ja D; taulukko 2).
Z. mobilis-entsvvmien ilmentyminen vhdistelmä-E. coli:ssa: Z.
mobilis PDC:n ominaisaktiivisuus mitattiin French-press-laitteella valituista yhdistelmäkannoista saaduista uutteista. PDC 10 on suhteelliss lämpöstabiili entsyymi ja aktiivisuudet mitattiin uutteista sen jälkeen, kun mittausta hankaloittavat luonnolliset E. coli-aktiivisuudet oli inaktivoitu lämmön avulla. Vertailukannassa ATCC 11303 ei todettu lainkaan tällaista aktiivisuutta. Sekä K02 että K03 tuottivat vähäistä aktiivisuut-15 ta, joka oli 0,2 U/mg proteiinia. Kymmenkertainen aktiivisuus todettiin K04-uutteissa (2,1 U/mg proteiinia), joka K04 on suuria Cm-pitoisuuksia vastustava mutantti. PDC-taso K04:ssä oli lähes yhtäsuuri kuin se taso, jonka plasmidipohjäinen muodoste ATCC 11303 (pLOI297) oli tuottanut, ja samankaltainen kuin se 20 taso, joka todettiin luonnollisessa Z. mobilis-bakteerissa (Ingram, L.O. ja T. Conway (1988), AppI. Environ. Microbiol.. 54: 397-404).
Näistä kannoista saadut proteiiniuutteet tutkittiin myös SDS-25 PAGE-menetelmällä. Lukuisia proteiinimuutoksia todettiin ATCC • 11303-kannan ja yhdistelmäjohdannaisten välillä Z. mobilis-qee-neistä johtuvien muutosten lisäksi.. K04 ja ATCC 11303 (pLOI297) sisälsivät enemmän PDC:n kokoa vastaavalla, 60 000 olevalla mo-lekyylipainoalueella olevaa proteiinivyöhykettä kuin K02 ja 30 K03. Tämä vyöhyke puuttui ATCC 11303-vertailusta. Useita endo- geenisia proteiineja löydettiin 38 000 olevalta molekyylipaino-alueelta, josta Z. mobilis ADHII löytyy, hämärtäen ilmentymis-eroja.
35 E. coli-muodosteen ATCC 11303 kyky tuottaa orgaanisia happoja:
Etanologeeniset E. coli-kannat kuluttivat huomattavia määriä emästä fermentointien aikana (taulukko 2), mikä osoitti, että 30 111552 happoja syntyy sivutuotteina. Kuten taulukosta 3 nähdään, ATCC 11303-lähtökanta ja K03 tuottavat suuria määriä kolmea happoa.
Taulukko 3 5 Hamppamien fermentointituotteiden syntyminen3
Orgaaninen happo (mM)_
Yhdistelmä6 Etikka- Maito- Meripihka- happo happo happo 10 ------------------------------------------------------------- ATCC 11303 66 641 58 (puuttuu) 15 ATCC 11303 (pLOI297) 21 32 49 (plasmidipohjäinen) KOI (yhdentynyt, 18 673 62 ei mutaatiota) 20 K02 (yhdentynyt, 18 602 57 ei mutaatiota) KO3 (yhdentynyt, 69 525 66 25 spontaani) KO4 (yhdentynyt, 22 29 70 spontaani) 30 K010 (K04, recA) 18 20 73 K011 (K04, frd) 14 32 2 K012 6 40 2 35 (K04, recA, frd) K020 (yhdentynyt, 4 60 2 indusoitu) 40 3 Kahden fermentoinnin, joissa käytettiin 10 % glukoosia, keskiarvo; näytteet otettiin 72 tunnin jälkeen.
: b Suluissa olevat huomautukset viittaavat eksogeenisten eta- noligeenien ja niihin liittyvien, etanolin tuotantoa paran-45 tavien mutaatioiden asemaan.
31 111552
Vaikka ATCC 11303 (pLOI297) ja K04 tuottivatkin vähemmän etik-kahappoa ja maitohappoa, niin K04 tuotti kuitenkin edelleen paljon sukkinaattia. Sukkinaattituotannon eliminoimiseksi frd-mutaatio saatiin aikaan istuttamalla TnlO-vektori käyttäen ge-5 neettisiä standardimenetelmiä, mukaan lukien valikointi Tnl0:n tetrasykliinin vastustuskykyyn perustuvan merkitsimen avulla, minkä jälkeen TnlO eliminoitiin käyttäen valikointia fusaari-hapon avulla, mikä johti frd:n häviämiseen TnlO:n epätarkasta leikkautumisesta johtuen. Tuloksena olleesta kannasta (KOll) 10 puuttui fumaraattireduktaasin aktiivisuus.
Tämä frd-mutaatio vähensi glukoosin fermentoinnin aikana syntyneen sukkinaatin määrän 3 %:iin emäkannan K04 tuotannosta (taulukko 3). Kuitenkin, mikäli tätä happoa ei titrattu fermen-15 toinnin aikana, niin myös tämä vähäinen happotuotanto kykeni edelleen laskemaan fermentointiajc pH-arvoa ilman titrausta, jolloin etanolin muodostuminen glukoosista väheni (kuvio 4, taulukko 2).
20 Kuitenkin, happotitrausta käytettäessä, fumaraattireduktaasin eliminointi paransi todellakin etanolin tuotantonopeutta, solu-saantoa ja etanolisaantoa ksyloosista (taulukko 2). Titrausta käytettäessä tilavuuden suhteen laskettu tuottavuus glukoosista parani samoin tämän mutaation ansiosta, vaikka etanolisaanto 25 pysyikin olennaisesti samana (taulukko 2).
* *
Kromosomiin yhdennettyjen ja plasmidipohjaisten geenien stabii-lisuuden vertaaminen E. colitssa: ATCC 11303 (pLOl297)-, K04-ja K05-kantaa kasvatettiin Luria-alustalla, joka sisälsi 10 % 30 (p/t) glukoosia, 68. sukupolveen saakka 30 °C:n lämpötilassa ilman valikointia antibiootin avulla. Viljelmät maljättiin se-* lektiivisille ja epäselektiivisille maljoille ja aldehydi-indi-kaattorimaljoille 48 ja 120 tunnin kuluttua Cm:lie vastustuskykyisten CFU:jen ja kaikkien CFU:jen välisen suhteen sekä eta-35 nolia tuottavien pesäkkeiden osuuden määrittämiseksi. Taulukosta 4 nähdään, että K04:n ja K05:n istutetut geenit olivat pysyviä kromosomaalisiä istutteita.
32 111552
Taulukko 4
Kromosomiin yhdennettyjen geenien stabiilisuuden vertaaminen plasmidipohjäisten geenien stabiilisuuteen E. coli B-kannassa8
Prosentuaalinen osuus, jossa tunnus-5 omaisten piirteiden tuotanto on säilynyt
Yhdistelmä (sukupolvien lukumäärä) 10 K04 100 (38,5) 100 (68,5) K05 100 (38,7) 100 (68,7)
Te E. COli B 100 (35,3) 97 (67,3) 15 (pLOI297) 8 Transformoituja E. coli B-soluia kasvatettiin 30 °C:ssa Lu-ria-elatusalustassa, joka sisälsi 10 % (p/t) glukoosia, il-20 man valikointia antibiootin avulla. Tc-vastustuskyvyn ja etanolituotannon geenit menetettiin yhdessä plasmidipohjai-sesta muodosteesta.
K04- ja 0K5-kannat, joiden kromosomiin etanolituotantoon liit-25 tyvät kannat on yhdennetty, ovat parempia kuin plasmidin pLOI297 käsittävä aikaisempi muodoste, katso julkaisu Alter-thun, F. ja L.O. Ingram (1989), Appi. Environ. Microbiol. 55: 1943-1948, yhdistämällä saadun ominaisuuden eli etanolituotannon suhteen. Jopa silloinkin, kun plasmidin häviämisnopeus on 30 pieni, kuten asianlaita on pLOI297-plasmidin käsittävien E_i_ ·: coli-kantojen tapauksessa, keksinnön mukaisilla, yhdentyneitä eksogeenisiä geenejä käsittävillä kannoilla saavutetaan huomattavia etuja vastaaviin plasmidipohjaisiin kantoihin nähden ajatellen kaupallista etanolituotantoa, joissa pienet viljelmät on 35 mitoitettava miljoonien litrojen suuruisiksi fermentointialus-toiksi.
recA-mutaation vaikutus: K04:ään ja K011:een aiheutettiin myös recA-mutaatio siten, että näitä kantoja voitiin käyttää myös 40 yhdistelmäplasmidien isäntinä. Saaduille kannoille annettiin nimiksi K010 ja K012, vastaavasti. Tämä recA-mutaatio ei vai- 111552 kuttanut etikkahapon, maitohapon eikä meripihkahapon tuotantoon, mutta se vähensi kasvua ja hidasti fermentointia (taulukko 2) recA, frd-mutantin (K012) tapauksessa. Syytä tähän vaikutukseen ei tunneta, ja se voi johtua sekundäärisistä mu-5 taatioista, joita on syntynyt muodostamisen aikana.
Geenit, jotka voidaan istuttaa kromosomiin oheisen keksinnön mukaisesti: Oheinen keksintö voidaan toteuttaa käyttämällä muitakin geenejä ohessa esimerkkeinä mainittujen spesifisten adh-10 ja pdc-geenien lisäksi. Nyt ollaan todettu, että glykolyysient-syymien primäärisekvensseissä esiintyy huomattavaa säilymistä. Katso esimerkiksi julkaisu Conway, Sewell ja Ingram (1987) , J. Bacteriol. 169: 5653-5662. Tämä huomattava säilyminen tekee mahdolliseksi sen, että alan asiantuntija kykenee eristämään 15 toiminnallisesti vastaavia, geneettisesti samankaltaisia entsyymejä muista organismeista käyttäen apuna entsyyraiperheen yhdestä tai useammasta jäsenestä saatavaa primääritietoa. Juuri tällaista lähestymistapaa onkin käytetty onnistuneesti maissista saadun pyruvaatti-dekarboksylaasigeenin kloonaamiseksi käyt-20 täen apuna oheisten keksijöiden tietoja Z. mobilis pdc-geenistä ja S. cerevisiae pdc-geenistä DNA-koettimen suunnittelemiseksi. Katso julkaisu Kelly, P.M. (1989), Plant Molecular Biology. 13: 213-222. Käyttökelpoisia ovat myös vaihtoehtoiset strategiat, joissa koettimina käytetään kokonaisia geenejä. Niinpä, oheisen 25 keksinnön tavoitteita ajatellen on yhdentekevää, onko pyruvaat- •J ti-dekarboksylaasin aktiivisuus peräisin Z. mobilis-aeenistä. kuten oheisessa keksinnössä on esimerkkinä esitetty, tai sellaisista geeneistä (jotka on kloonattu ja jonka sekvenssi on määritetty), jotka määräävät saman entsyymiaktiivisuuden mais-30 sissa, hiivoissa tai jossain muussa organismissa. Samoin, oheisen keksinnön toteuttamisen kannalta on yhdentekevää, onko ai- • r * ’ koholi-dehydrogenaasi-aktiivisuus saatu hevosen, hiivan, ih misen tai hyönteisen geenistä tai jostain muusta bakteerigee-nistä. Koska alkoholi-dehydrogenaasiaktiivisuuden ilmentyminen 35 voidaan todeta suoraan aldehydi-indikaattorimaljoilla, niin sekvenssitiedot eivät ole välttämättä paras lähestymistapa proteiineja, joilla on tällaista entsymaattista aktiivisuutta, 34 111552 koodaavien lisägeenien eristämiseksi. Kriittistä ei ole kuitenkaan se, käytetäänkö sekvenssejä tällaiseen eristämiseen vai ei. Saatavilla onkin useita alkoholi-dehydrogenaasigeenejä, jotka on kuvattu hyvin monissa julkaisuissa.
5 Z. mobilis sisältää kaksi geeniä, joihin on koodautunut funktionaalinen alkoholi-dehydrogenaasigeeni. Yksi niistä, joka on esitetty esimerkkinä ohessa, eli adhB, on kehityshistoriallisesti Clostridium acetobutvlicum:ista peräisin olevan butano-10 li(alkoholi)-dehydrogenaasin, E. coli:sta peräisin olevan pro-paanidioli(alkoholi)-oksidoreduktaasin sekä Saccharomvces-hii-vasta peräisin olevan ADHlV-alkoholi-dehydrogenaasin kaltainen. Ne kaikki on kloonattu ja niiden sekvenssi on määritetty. Toinen Z. mobilis-aeeni. joka koodaa alkoholi-dehydrogenaasia, eli 15 adhA, on sinkki-alkoholi-dehydrogenaasi, jonka oheiset keksijät ovat kloonanneet ja jonka sekvenssin he ovat määrittäneet jokin aika sitten. Tämä adhA on kehityshistoriallisesti tyypillisten, eläimissä ja kasveissa esiintyvän sekä hiivan hallitsevaan geeniin koodautuneen alkoholi-dehydrogenaasin kaltainen, meidän 20 kaikkien käytettävissä olevista nukleotidisekvensseistä pääteltyjen primäärirakenteiden vertailun perusteella. Olemme todenneet, että tämä adhA-geeni voi korvata sangen mukavasti alkuperäisen adhB-geenin, mikä on odotettavaa tämän keksinnön perusteella.
25
Proteiinin, jolla on pyruvaatti-dekarboksylaasiaktiivisuutta (joka siis muuttaa pyruvaatin asetaldehydiksi ja hiilidioksidiksi) , synteesi voidaan todeta suoraan aldehydi-indikaattori-maljoilta. Alkoholi-dehydrogenaasiaktiivisuuden ilmentyminen 30 voidaan todeta myös suoraan aldehydi-indikaattorimaljoilta.
Tästä syystä sekvenssitiedot eivät ole välttämättä paras lähes-: tyrnistäpä muiden adh- tai pdc-geenien paikallistamiseksi, vaik kakin, kuten edellä on esitetty, työstämme saatuja sekvenssi-tietoja on käytetty jokin aika sitten maissin pdc-geenin eris-35 tämiseen. Täten, monia muita, toiminnallisina vastineina toimivia pdc- ja adh-geenejä voidaan eristää muista organismeista. Voidaan ennustaa, että näillä muilla geeneillä voidaan korvata 35 111552 sopivalla tavalla saatavilla olevat Z. mobilis pdc- ja adh-gee-nit, ja muita tällaisia geenejä voidaan tunnistaa joko käyttämällä nykyisiä geenejä koettimina, tai edullisemmin, toteamalla aktiivisuus indikaattorimaljoilta.
5
Yleisemmin, etanolituotantoon liittyvien geenien lisäksi kromosomiin voitaisiin sisällyttää monia muitakin geenejä, jotka voidaan ilmentää oheisen keksinnön mukaisesti. Niistä voidaan mainita olennaisesti mitä tahansa toivottua polypeptidiä koo-10 daava geeni, joka voidaan ilmentää yhdistelmäisännässä, ja joista esimerkkeinä voidaan mainita insuliinia, kasvuhormoneja ja kaupallisesti tärkeitä entsyymejä koodaavat geenit.
Esimerkkeinä käytettyjen bakteereiden hyödyllisyys: Eräät bak-15 teerit ja muut yksinkertaiset organismit kykenevät metaboloi-maan aktiivisesti monia erilaisia substraatteja, joista voidaan mainita heksoosit, pentoosit ja laktoosi. Tämän tunnusomaisen piirteen ansiosta E. coli on edullinen isäntä yhdistelmä-DNA-teknisissä tuotantomenetelmissä. Ohessa kuvatun keksinnön avul-20 la voidaan käyttää yhdistämällä saatuja bakteerikantoja etanolin taloudelliseksi tuottamiseksi erilaisista biomassalähteis-tä, erityisesti huonosti hyödynnetyistä biomassalähteistä kuten hemiselluloosasta (käsittäen ksyloosia, arabinoosia ja muita sokereita), joka on puun pääasiallinen komponentti, sekä syötä-25 väksi kelpaamattomat kasvinosat ja hera (laktoosi). Niinpä or-ganismit, joilla on erityisiä kykyjä, kuten kykyä tuottaa solun ulkopuolisia entsyymejä monimutkaisten polymeerien hajottamiseksi, voidaan muuttaa etanolin tuottajiksi oheisen keksinnön mukaisesti.
30
Niinpä oheisen keksinnön erään piirteen mukaisesti aikaan saadaan parannettu organismi etanolin tuottamiseksi. E. coli-solu on transformoitu siten, että Z. mobilis-aeenit. jotka koodaavat ADH:ta ja PDC:tä, on sisällytetty isännän kromosomiin. Aikai-35 semmin E. coli on saatu tuottamaan etanolia transformoimalla se plasmidilla, joka sisältää etanolituotannolle välttämättömät kaksi geeniä. Näiden aikaisempien transformointien onnistuminen 36 111552 oli etanolia tuottavien entsyymien erittäin suuri pitoisuus, jotka entsyymit oli saatu geenien moninkertaisista kopioista, joiden lukumäärä oli tyypillisesti 30-300 kopiota solua kohden.
5 Ohessa kuvatut alustavat muodosteet, joissa pdc- ja adh-geenien yksi ainoa kopio yhdennettiin isännän kromosomiin, tuottivat riittämättömiä määriä PDC:tä ja ADHtta metabolian ohjaamiseksi siten, että saadaan etanolia, ja toiminnallisuustason monistaminen tuotti näiden geenien useita kopioita plasmidissa. Tä-10 män jälkeen edellä kuvatut spontaanit tai indusoidut mutaatiot tuottivat soluja, jotka samanaikaisesti voimistivat kaikkien kromosomiin yhdennettyjen geenien ilmentymistä, mahdollisesti läsnäoleva, kloramfenikolin vastustuskykyä aikaansaava geeni sekä ADHrta ja PDC:tä koodaavat geenit mukaan lukien. Nämä mu-15 tantit tuottavat suuria määriä etanolituotannolle välttämättömiä entsyymejä, joten ne ovat aikaisempien, monikopioplasmideja sisältävien bakteereiden toiminnallisia vastineita. Siinä tapauksessa, että spontaaneja mutaatioita esiintyy kannassa, joka käsittää merkitsimenä käytettyä Cm-vastustuskykyä aiheuttavan 20 geenin sekä etanoligeenit, se tulos, että Cm-vastustuskykyä aiheuttavan geenin voimistunut ilmentyminen osoittaa etanoli-tuotantoon liittyvien entsyymien voimistuneen ilmentymisen, on erityisen yllättävä, koska Cm-vastustuskyvyn geeni voi sisältää oman promoottorinsa ja se voi jopa sijaita adhB-geenin kopioi-25 tumisen päättäjän alapuolella.
• «
Oheisen keksinnön eräs muu piirre kohdistuu etanolia tuottavien yhdistelmäbakteereiden käyttöön yhdistelmäproteiinien tehokkaaksi tuottamiseksi; toisin sanoen, nämä yhdistelmäsolut on 30 voitu transformoida edelleen sellaisilla geeneillä, jotka koodaavat hyödyllisiä proteiineja. Myös nämä lisägeenit on voitu sisällyttää kromosomiin, tai ne voivat sijaita plasmidissa. Koska oheisen keksinnön mukaisesti yhdennettyjen geenien (tässä esimerkissä etanolituotantoa aikaansaavien geenien) voimakas 35 ilmentyminen tekee näitä geenejä kantavan plasmidin tarpeettomaksi, niin oheisen keksinnön mukaiset yhdistelmäsolut voivat erityisen hyvin ottaa vastaan ja säilyttää plasmidissa läsnä- . 111552 37 olevia lisägeenejä. Eräs muu mutaatio kuten homologista yhdistymistä estävä recA-mutaatio parantaa näiden isäntien turvallisuutta ympäristölle yhdistelmäproteiineja tuotettaessa.
5 Huomattakoon, että orgaanisten happojen kerääntymistä sokeri-metaboliasta pidetään yleisesti anaerobisen kasvun aikana tapahtuvan fermentaation seurauksena. E. coli tuottaa kuitenkin yleensä huomattavia määriä asetaattia myös aerobisissa olosuhteissa, viljelmää nopeasti sekoitettaessa. Asetaattituotanto 10 voimistuu kasvun aikaisimmista vaiheista alkaen, eikä se rajoitu myöhempiin vaiheisiin, joissa solutiheys on suuri. Tämä hapon muodostuminen glukoosista myös aerobisissa olosuhteissa rajoittaa kasvua elatusalustassa ja kiinteällä alustalla, mikä nähdään suuremmasta lopullisesta solutiheydestä alustassa, jo-15 hon on lisätty fosfaattipuskuria.
Isäntäorganismin muuttamista siten, että päästään etanolifer-mentaatioon, voidaan käyttää erilaisten yhdistelmätuotteiden tuotannon parantamiseksi. Näihin tuotteisiin johtavan toimin-20 nallisuuden ylläpitäminen riippuu alustan pH:sta kasvun aikana tiheässä viljelmässä. Tämä happamoitumisen voimakkuus solupro-teiiniyksikköä kohden saadaan mahdollisimman vähäiseksi solujen tuottaessa etanolia eikä orgaanisia happoja. Hapen siirto on usein huomattavin rajoitus tiheiden mikro-organismiviljelmien 25 kasvun aikana, ja juuri tämä rajoitus johtaa happotuotantoon ja .· pH:n muuttumiseen kasvualustassa. Yhdistelmissä, jotka tuottavat etanolia fermentointituotteenaan, etanologeeniset entsyymit muuttavat osan glykolyysistä peräisin olevasta pyruvaatista asetaldehydiksi NADH:n hapettuessa uudestaan siten, että syntyy 30 etanolia, joka on vähemmän haitallinen metaboliatuote. Kannat, jotka sisältävät sekä toiminnallisia hengitysketjuja hapettavaa fosforylaatiota varten että etanolia tuottavia entsyymejä, voidaan kasvattaa jopa suurempiin solutiheyksiin, koska kummatkin järjestelmät toimivat NAD+:n uudelleenmuodostumisen ja happami-35 en jätetuotteiden pelkistymisen aikana. Tällaisen luontaisen joustavuuden ansiosta prosessin säätövaatimukset eivät ole niin tiukat ja yhdistelmätuotteiden saannot ovat suuremmat.
38 111552 Näin ollen oheisen keksinnön mukaiset, etanolia tuottavat bakteerikannat ovat erinomaisia isäntiä yhdistelmäproteiinien tuottamiseksi anaerobisissa olosuhteissa, happotuotannon ollessa hyvin vähäistä. Monet yhdistelmäproteiinit sisältävät kys-5 teiini- tai disulfidisiltoja, ja niiden asianmukainen laskostuminen tai niiden asianmukaiset reaktiot ovat olennaisia aktiivisen entsyymin muodostumiselle. Koska happi edistää disul-fidisidosten muodostumista, niin tällaisten proteiinien synteesi anaerobisissa olosuhteissa tarjoaa vähemmän mahdollisuuk-10 siä vääränlaiselle laskostumiselle ennen eristämistä ja laskostamista hallituissa olosuhteissa, jolloin voidaan päästä biologisesti aktiivisen tuotteen parempaan saantoon.
Edellä esitetyn perusteella alan asiantuntijalle tulisi olla 15 selvää, että oheisessa keksinnössä aikaansaatu mahdollisuus transformoida proteiinia tai kokonaista metaboliapolkua koodaa-via geenejä kromosomiin on erittäin hyödyllinen. Tässä suhteessa oheista keksintöä voidaan käyttää esimerkiksi erilaisissa tilanteissa, joissa erilaisista geeniasemista peräisin olevat 20 geenit halutaan sijoittaa kromosomiin. Etanolituotantoa koodaa-vien geenien sijoitus on vain eräs esimerkki keksinnön tarjoamista uusista mahdollisuuksista. Edellä kuvattujen periaatteiden mukaisesti erilaisista organismeista peräisin olevat, alkoholi-dehydrogenaasiaktiivisuutta koodaavat geenit voidaan 25 yhdistää erilaisista organismeista peräisin oleviin, pyruvaat-.· ti-dekarboksylaasiaktiivisuutta koodaaviin geeneihin toivotun metaboliapolun luomiseksi. Muissa poluissa tarpeellisia proteiineja koodaavia geenejä voidaan myös sisällyttää kromosomiin. Alan asiantuntijalle pitäisi olla ilmeistä, että edellä kuvatun 30 etanolipolun tapauksessa ei ole välttämätöntä, että alkoholi-dehydrogenaasiaktiivisuutta ja pyruvaatti-dekarboksylaasiaktii-visuutta koodaavat geenit ovat yhteisen säätelymekanismin alaisuudessa .
35 Keksintöä kuvataan seuraavassa vielä sitä havainnollistavilla esimerkeillä.
39 111552
Esimerkki 1 E. coli:n pyruvaatti-formaatti-lyaasi-geenin sisältävien yh-dentämisplasmidien muodostaminen 5 Seuraavissa esimerkeissä on käytetty seuraavia materiaaleja ja menetelmiä, mikäli toisin ei ole mainittu. Kaikissa geenimuo-dosteissa käytettiin E. coli TC4-kantaa. Katso Conway, T., Y.A. Osman, J.I. Konnan, E.M. Hoffman ja L.O. Ingram (1987), J. Bac-teriol.. 169: 949-954. Kaikissa kasvatuskokeissa käytettiin 10 Luria-elatusalustaa, joka sisälsi asiannmukaista valikoivaa antibioottia sekä glukoosia esitettynä pitoisuutena. Antibiootteja käytettiin seuraavina loppupitoisuuksina, mikäli toisin ei ole mainittu: ampisilliini, 50 /Lig/ml; kloramfenikoli (Cm) , 20 Mg/ml tai 600 ^g/ml, kuten on esitetty; tetrasykliini, 12,5 15 Mg/ml. Schiff:in reagenssia sisältäviä ADH-indikaattorimaljoja käytettiin siitä etanolista syntyneen aldehydin ilmaisemiseksi, jonka etanolin oli tuottanut Z. mobilis-bakteerin ADHII:ta ilmentävä vhdistelmä-E. coli. Conway, T., G.W. Sewell, Y.A. Osman ja L.O. Ingram (1987), J. Bacteriol.. 169: 2591-2597.
20
Tavanomaisia toimenpiteitä käytettiin plasmidien muodostamiseen, restriktioentsyymeillä pilkkomiseen, ligaatioon, trans-formointeihin ja geelielektroforeesiin. Restriktiokappaleiden eristäminen myöhempää kloonaamista varten toteutettin eluoimal-25 la GTG-agaroosilta (FMC BioProducts, ME), käyttäen Microfilter-.· fuge-putkia (Rainin Instrument Co.).
Kuviossa 1 on esitetty toimenpide, jota käytettiin E. coli:n pyruvaatti-formaatti-lyaasi-geenin (pfl-geenin) sisältävien yh-30 dentämisplasmidien muodostamiseksi. Plasmidi pHB4 [Sawers et ai., (1988), edellä], joka käsitti E. coli:n epätäydellisen pyruvaatti-formaatti-lyaasi-geenin (pf1), pilkottiin osittain entsyymillä BamHI, irrallisiksi jääneet 5'-päät täytettiin DNA-polymeraasi I:n Klenow-kappaleella ja saadut kappaleet liitet-35 tiin uudestaan ligatoimalla Sali-kytkijään (dCGTCGACG). Ne sekvenssit, joissa pfl-geenin ulkopuolinen BamHI-kohta oli korvautunut Sali-kohdalla, tunnistettiin erillisiä transformantteja seulomalla. Tuloksena ollut plasmidi pLOI513 sisälsi kaksi
Sali-kohtaa, joiden avulla tässä plasmidissa läsnäoleva pfl- osa voitiin erottaa plasmidin loppuosasta.
40 1115 5 2 5 Kloramfenikolin vastustuskyvyn aiheuttava merkitsingeeni leikattiin irti 1,37 kb:n Hhal-kappaleena plasmidikloonausvekto-rista pBR325. Katso Pretki, P., F. Karch, S. Iida ja J. Meyer (1981), Gene. 14: 289-299. Tämä Hhal-kappale käsiteltiin Kle-now-polymeraasilla irrallisten päiden täyttämiseksi ja se liga-10 toitiin Klenow-kappaleella käsiteltyyn ja plasmidissa pLOI295 adhB-geenin alapuolella sijaitsevaan BamHI-kohtaan, katso julkaisu Ingram, L.O., T. Conway, D.P. Clark, G.W. Sewell ja J.F. Preton (1987), Appi. Environ. Microbiol.. 53: 2420-2425, pdc-ja adhB-geenien tavoin suuntautuneena muodosteen pLOI515 ai-15 kaansaamiseksi. Sitten plasmidi pLOI5l5 pilkottiin entsyymillä Sali ja se pilkottiin osittain entsyymillä EcoRI, päät täytettiin Klenow-polymeroinnilla tylppien päiden aikaansaamiseksi, minkä jälkeen se ligatoitiin BamHI-kytkijään (dCCGGATCCGG). Ligaatioseos erotettiin GTG-agaroosigeelillä. Kappale, joka 20 käsitti promoottorittomat pdc- ja adhB-geenit sekä Cm-geenin (ja sen promoottorin), eristettiin ja pilkottiin entsyymillä BamHI. Tämä BamHI-kappale, jossa alkuperäisen EcoRI-Sall-kappa-leen kumpaankin päähän oli syntynyt uudestaan EcoRI- ja Sali-kohdat, kloonattiin pLOI505:n, joka oli muodostettu poistamalla 25 Sali-kohta pUC19:sta (saatavana laboratoriosta Bethesda Re-·.« search Laboratories) , polykytkijässä olevaan BamHI-kohtaan.
Plasmidissa pLOI506 Cm'-geenin yläpuolella sijaitseva Sall-koh-ta poistettiin pilkkomalla entsyymillä Sali, täyttämällä Kle-now-polymeraasilla ja ligatoimalla uudestaan plasmidin pLOI508 30 muodostamiseksi. pLOI508:n 4,6 kb:n BamHI-kappale istutettiin plasmidissa pLOI513 läsnäolevan epätäydellisen pf1-rakennegee- * < nin BamHI-kohtaan. Tuloksena ollutta plasmidia käytettiin pdc-, adhB- ja Cm'-geenien istuttamiseksi E. coli B-kannan (ATCC 11303) kromosomiin homologisella yhdistämistoimenpiteellä, joka 35 on kuvattu jäljempänä (esimerkissä 4).
41 111552
Esimerkki 2 E. coli:n pyruvaatti-formaatti-lyaasi-geenin sisältävien ja plasmidireplikaatiota ajatellen lämpötilaherkkien yhdentämis-plasmidien muodostaminen 5
Plasmidi pLOI295 pilkottiin entsyymeillä EcoRI ja Sali ja 3,2 kb:n EcoRI-Sall-kappaletta, joka käsitti pdc- ja adhB-geenit, käsiteltiin DNA-polymeraasin Klenov-kappaleella tasattujen päiden tuottamiseksi. Tämä tasapäinen kappale ligatoitiin plasmi-10 din pLOI513, joka käsittii epätäydellisen pfl-geenin kopioinnin kannalta samalla tavalla suuntautuneena, Klenow-käsiteltyyn BamHI-kohtaan plasmidin pLOI542 muodostamiseksi. Sitten pLOI542 pilkottiin entsyymillä Sali ja 7,2 kb:n Sali-kappale ligatoitiin pMAK705:n polykytkijässä olevaan Sali-kohtaan, katso jul-15 kaisu Hamilton, C.M., M. Aldea, B.K. Washburn, P. Babitzke ja S.R. Kushner (1989), J. Bacteriol.. 171: 4617-4622, joka pMAK705 sisälsi lämpötilaherkän replikonin ja Cm'-geenin (kuvio 2). Tuloksena ollut plasmidi pLOI543 istutettiin E. coli-kromo-somiin homologisella yhdistämistoimenpiteellä (katso alla oleva 20 esimerkki 3).
Esimerkki 3 Z. mobilis pdc- ja adhB-geenien yhdentäminen E. coli B:n kromosomiin siten, että niihin liittyvä antibiootin vastustuskykyä 25 aikaansaava geeni menetetään >» •
Yhdistelmäplasmidia pLOI543, joka replikoituu 30 °C:ssa, muttei 44 °C:ssa, käytettiin E. coli B:n transformoimiseksi CM'-geenillä, jolloin siihen saatiin aikaan kloramfenikolin vastustus-30 kyky. Transformoituja soluja kasvatettiin 24 tunnin ajan 44 °C:n lämpötilassa 100 ml:ssa Luria-elatusalustaa, joka sisälsi 20 μg/ml kloramfenikolia ja 5 % (p/t) glukoosia, millä saatiin valikoiduksi plasmidin yhdentyminen kromosomiin. Osa tästä viljelmästä (0,1 ml) laimennettiin ja 0,1 ml tätä laimennettua 35 solususpensiota siirrostettiin 100 ml:aan Luria-elatusalustaa, joka sisälsi 5 % (p/t) glukoosia, ja joka ei sisältänyt kloramfenikolia. Viljelmää kasvatettiin 30 °C:ssa 12 tunnin ajan 111552 pilkkoutumisen toteuttamiseksi. Kaksi tai useampia kasvujaksoja toteutettiin laimentamalla osa (0,1 ml) viljelmästä ja siirros-tamalla se 100 ml:aan uutta alustaa. 12 tunnin ikäisestä viljelmästä saatua laimennettua solususpensiota siirrostettiin 5 sitten Luria-alustaan, joka sisälsi 5 % (p/t) glukoosia, ja jota inkuboitiin sitten 44 °C:ssa plasmidin eliminoimiseksi. Lopuksi yksittäisiä pesäkkeitä eristettiin maljaamalla viljelmästä tehty laimennussarja Luria-agarmaljoille, jotka sisälsivät 2 % (p/t) glukoosia, ja joita kasvatettiin 30 °C:n lämpö-10 tilassa. Maljalle ilmaantuneiden yksittäisten pesäkkeiden joukosta seulottiin etanolituotantoa aikaansaavat geenit käyttämällä aldehydi-indikaattorimaljoja sekä plasmidin menetys klor-amfenikoliherkkyyden avulla. Kaksi kloonia, KOI- ja K02-kannat, valittiin, jotka kloonit olivat herkkiä kloramfenikolille, mut-15 ta jotka sisälsivät etanolituotantoa aikaansaavat geenit. Nämä kloonit tuottivat vaaleanpunaisia pesäkkeitä aldehydi-indikaattorimal j oille.
Esimerkki 4 20 Z. mobilis pdc- ja adhB-geenien yhdentäminen E. coli B:n kromosomiin siten, että niihin liittyvä antibiootin vastustuskykyä aikaansaava geeni säilyy
Plasmidi pLOI510 pilkottiin entsyymillä Sali ja 8,6 kb:n Sall-25 lohko, joka käsitti epätäydellisen pfl-geenin, tehtiin rengasti maiseksi ligatoimalla se itsensä kanssa pienessä DNA-pitoisuu-dessa. Tästä kovalenttisesti sulkeutuneesta DNA-kappaleesta puuttuivat autonomisen replikaation mahdollistavat sekvenssit. E. coli B transformoitiin ligaatioseoksilla valikoimalla 20 30 Mg/ml olevan kloramfehikolipitoisuuden vastustuskyvyn suhteen. adhB-geenin ilmentyminen kloramfenikolille vastustuskykyisissä « .* transformanteissa varmistettiin maljaamalla pesäkkeet kloram-fenikolimaljoilta ADH-indikaattorimaljoille. Yksittäinen klooni, jolle annettiin nimeksi K03-kanta, valittiin tunnusomaisten 35 piirteiden lisäselvittämistä varten. Plasmidissa läsnäolevan adh-geenin tai kloramfenikolin vastustuskykyä aikaansaavan gee- 43 111552 nin puuttuminen varmistettiin transformanttien puuttumisesta DNA-preparaateista sekä suoralla analyysillä agaroosigeelejä käyttäen. Tämä klooni tuotti vaaleanpunaisia pesäkkeitä alde-hydi-indikaattori-maljoilla.
5
Esimerkki 5 Z. mobilis pdc- ja adhB-geenien ilmentymistä voimistavien mutaatioiden aikaansaaminen ja ilmaisu valikoitavan merkitsimen geenin puuttuessa 10
Esimerkissä 3 Z. mobilis-bakteerin pdc- ja adhB-geenien yhdentäminen E. coli B-kromosomiin toteutettiin olosuhteissa, joissa näihin, isäntäsolun transformointiin käytetyssä DNA-lohkossa läsnäoleviin etanoligeeneihin liittynyt, antibiootin vas-15 tustuskykyä aiheuttava geeni menetettiin. Esimerkin 3 mukaisista toimenpiteistä saatu kanta K02 mutagenoitiin metyylimetaani-sulfonaatilla tavanomaisissa olosuhteissa, jotka tunnetaan hyvin bakteerigenetiikan alalla. Eloonjääneitä mutagenoituneita soluja (noin 4-8 x 104) maljattiin aldehydi-indikaattorimal-20 joille noin 200-400 pesäkettä kutakin maljaa kohden. Neljä tummanpunaista pesäkettä, jotka osoittivat voimistuneen ADHII-il-mentymisen, eristettiin ja niiden kyky tuottaa etanolia testattiin alla olevassa esimerkissä 8 kuvatulla tavalla. Näistä mu-tanteista sille, jonka etanolituotannon saanto oli suurin, an-25 nettiin nimeksi K020-kanta.
Esimerkki 6
Mutanttien, joissa Z. mobilis pdc- ja adhB-geenien ilmentyminen on voimistunut, valikointi näihin geeneihin liittyvän, antibi-30 ootin vastustuskykyä aikaansaavan geenin voimistuneen ilmentymisen perusteella
Esimerkissä 4 Z. mobilis-bakteerin pdc- ja adhB-geenien yhdentäminen E. coli B-kromosomiin toteutettiin olosuhteissa, 35 joissa näihin, isäntäsolun transformointiin käytetyssä DNA-loh-kossa läsnäoleviin etanoligeeneihin liittynyt, antibiootin vas- 44 111552 tustuskykyä aiheuttava geeni säilyi. Esimerkin 4 mukaisilla toimenpiteillä saadun kannan K03 lairaennussarja maljättiin Luria-agarmaljoille, joka sisälsi 2 % glukoosia ja 600 /xg/ml kloramfenikolia. Yön yli kestäneen inkuboinnin jälkeen todet-5 tiin suuria, paksuja pesäkkeitä, joiden esiintymistaajuus oli noin 1 pesäke 100 000 maljattua solua kohden. Nämä suuret pesäkkeet tuottivat etanolia ja ne näkyivät kirkkaan punaisina alkoholi-indikaattorimaljoilla. Kahta kantaa, eli kantoja K04 ja K05 tutkittiin lisää.
10
Esimerkki 7 recA- ja frd-mutaatioiden istutus E. coli JC10240-kannassa läsnäoleva recA-mutaatio siirrettiin 15 K04- ja K05-kantoihin konjugoimalla sekä valikoimalla sekä Cm- vastustuskyvyn että tetrasykliinin vastustuskyvyn suhteen (lähellä Tnl0:tä). recA-fenotyypin samanaikainen periytyminen varmistettiin lisääntyneen UV-herkkyyden avulla.
20 frd-mutaation liikkeelle saava E. coli Hfr-kanta muodostettiin transduktoimalla frd-häviämämutaatio DW12:sta [zid:Tnl0,A(frdA-BCD)] KL282-kantaan Tnl0:n suhteen valikoimalla. Katso julkaisu Blaut, M., K. Whittacker, A. Valdovinos, B.A.C. Ackrell, R.P. Gunsalus ja G. Cecchini (1989), J. Biol. Chem.. 264: 13599-25 13604. frd-mutantit tunnistettiin tetrasykliinille vastustus- kykyisten transduktanttien joukosta sen perusteella, että ne olivat menettäneet fumaraatti-reduktaasi-aktiivisuuden. Tuloksena ollutta Hfr-kantaa, SE1706 käytettiin frd-häviämän konju-goimiseksi K04-kantaan.
30
TnlO hävitettiin näistä muodosteista valikoimalla muokatulla * · | ' fusaarihappoalustalla. Katso esim. julkaisu Maloy, S.R. ja W.D. Nunn (1981), J. Bacteriology. 145: 1110-1112. Tämä alusta sisälsi yhdessä litrassa: 15 g agaria, 5 g tryptonia, 5 g hiiva-35 uutetta, 20 g glukoosia, 10 g NaCl, 50 mg klooritetrasykliiniä, 10 g NaH2P0A, 12 mg fusaarihappoa ja 10 mM ZnCl2. Klooritetra- 45 111552 sykliinin varastoliuos (12,5 mg/ml) ja fusaarihapon varasto-liuos (1 mg/ml) valmistettiin 70 % etanoliin. Alustan monimutkaiset komponentit, jotka sisälsivät klooritetrasykliiniä, nat-riumfosfaattia ja sinkkikloridia, autoklavoitiin erikseen ja 5 sekoitettiin niiden jäähdyttyä. 70 % läsnäolevat antibiootit steriloituvat itsestään. TnlOrn häviämän valikoimiseksi logaritmisessa vaiheessa olevien viljelmien laimennussarjät levitettiin fusaarihappomaljoille ja niitä inkuboitiin yön yli 37 °C:n lämpötilassa. Tuloksena olevia pesäkkeitä vedettiin pesäk-10 keiden eristämiseksi toisille fusaarihappomaljoille ja pesäkkeistä testattiin tetrasykliinin vastustuskyvyn menetys. Tällä tavalla muodostettiin kolme kantaa, K010 (recA), KOll (frd) ja K012 (recA, frd).
15 Esimerkki 8
Etanoligeenin ilmentymiseen liittyvät tunnusomaiset piirteet
Fermentointikokeet: Fermentoinnin toteutettiin Luria-elatus-alustassa, jota oli täydennetty 10 %:lla (p/t) glukoosia tai 8 20 %:lla (p/t) ksyloosia. Fermentointipullot (500 ml, Fisher
Scientific company, Orlando, FL) , jotka sisälsivät 350 ml alustaa, varustettiin pH-elektrodilla, kaasun ulostulolla sekä näytteenottokanavalla, jotka oli työnnetty sopivia reikiä käsittävän kumitulpan läpi. Jenco 3671-merkkistä pH-mittaria 25 (Whatman Lab Sales, Hillsboro, OR) käytettiin pH:n säilyttämi-.: seksi arvossa 6,0 emästä (2N KOH) lisäämällä). Panosfermen- taatiot toteutettiin kahtena rinnakkaisena fermentointina 30 °C:n lämpötilassa, ja niitä sekoitettiin jatkuvasti noin 3,2 cm:n pituisella tähden muotoisella magneettitangolla (100 30 kierr./min.).
] Siirrosteita kasvatettiin eristetyistä pesäkkeistä yön yli 30 °C:n lämpötilassa pulloissa, joita ei ravisteltu. Fermentointi-alustat siirrostettiin siten, että alkuperäinen OD550 ^ oli noin 35 1,0 [330 mg soluja (kuivapaino) / litra].
46 111552
Solukasvua seurattiin sameusmittarin avulla aallonpituudella 550 nm, käyttäen Bausch & Lomb Spectronic 70-spektrometriä. Etanoli määritettiin kaasu-neste-kromatografisesti tavalla, joka on kuvattu esimerkiksi julkaisussa Dombek, K.M. ja L.O.
5 Ingram (1986), Appi. Environ. Microbiol. 51: 197-200. Konversion tehokkuutta kuvaavat arvot korjattiin fermentointitilavuu-dessa tapahtuneiden, emäksen lisäyksestä johtuneiden muutosten suhteen, olettaen, että kaikki alunperin lisätty sokeri oli metaboloitunut. Tilavuuden suhteen laskettu tuottavuus ja omi-10 naistuottavuus arvioitiin fermentoinnin varhaisten vaiheiden (6-24 tuntia) aikana ja ne edustavat suurimpia arvoja. Kaikki taulukoissa ja kuvioissa esitetyt fermentointitiedot ovat kahdesta tai useammasta fermentoinnista saatuja keskiarvoja.
15 Haihtuvien ia haihtumattomien happojen analyysi viljelmästä:
Fermentoinneista otettiin näytteitä 72 tuntia jatkuneen fermentoinnin jälkeen orgaanisten happojen analysoimiseksi. Haihtuvat ja haihtumattomat hapot mitattiin kaasu-neste-kromatografisesti Gow-Mac-Series 580-kaasukromatografilia (Gow-Mac Instrument 20 Company, Bridgewater, NJ), joka oli liitetty Hewlwtt-Packard 3390A-integraattoriin. Haihtumattomat hapot muunnettiin metyy-liestereikseen ennen analyysiä.
Elektroforeesi natriumdodekvvlisulfaatti-polvakrvvliamidiaeeliä 25 käyttäen (SDS-Paael: Soluja kasvatettiin 24 tuntia fermentoin-·· tikokeen olosuhteissa, ne jäähdytettiin 0 °C:n lämpötilaan, otettiin talteen sentrifugoimalla (7000 x g, 10 minuuttia), pestiin kahdesti 1/3 tilavuudella 5 mM natriumfosfaattipuskuria (pH 6,5), joka sisälsi 10 mM 2-merkaptoetanolia, ja niitä säi-30 lytettiin pakastettuna -20 °C:ssa. Solukasaumat suspendoitiin uudestaan yhtä suureen tilavuuteen puskuria ja ne rikottiin johtamalla ne kahteen kertaan French pressure cell-laitteen läpi 1379 baarin paineessa. Kalvot poistettiin sentrifugoimalla 90 minuuttia nopeudella 100 000 g. Supernatantit erotettiin 35 Biorad Mini-Protein II-elektroforeesiyksiköllä (Biorad Laboratories, Richmond, CA), käyttäen 8 % akryyliamidia ja denaturoivaa natriumdodekyylisulfaattia käsittävää geeliä. Proteiini 111552 47 määritettiin Bradford-reagenssilla. Katso julkaisu Bradford, M.M. (1979), Mol. Gen. Genet.. 181: 548-551. Jokaiseen uraan laitettiin noin 20 μ9 proteiinia.
5 Entsyymiaktiivisuus: PDC-aktivisuus määritettiin lämpökäsitellyistä French Press-uutteista tavalla, joka on kuvattu esimerkiksi julkaisussa Conway, T., Y.A. Osman, J.I. Konnan, E.M. Hoffmann ja L.O. Ingram (1987), J. Bacteriol..169: 949-954. Lämpökäsittelyä käytettiin kilpailevien luontaisten entsyymien 10 inaktivoimiseksi, jotka luontaiset entsyymit vaikeuttavat PDC-mittauksia yhdistelmä-E. coli:sta.
On selvää, että ohessa kuvatuilla esimerkeillä ja suoritusmuodoilla pyritään pelkästään havainnollistamaan oheista keksintöä 15 ja että alan asiantuntija voi tehdä siihen monia muutoksia ja muokkauksia oheisen hakemuksen hengestä ja tavoitteista poikkeamatta ja liitteenä olevien patenttivaatimusten puitteissa pysyen.
20 25 * · 30 35

Claims (41)

48 1 1 1552
1. Menetelmä rekombinanttisen isäntäsolukannan tuottamiseksi, joka solu tuottaa korkeita tasoja haluttua polypeptidiä, tun- 5 nettu siitä, että se käsittää vaiheet, joissa: (a) yksi tai useampi isäntäsolu transformoidaan nukleinihappo-molekyylillä, joka käsittää: (i) heterologisen polynukleotidilohkon, joka käsittää haluttua polypeptidiä koodaavan sekvenssin, ja 10 (ii) tämän heterologiseen polynukleotidilohkon viereisiä sekvenssejä, jotka ovat homologisia isäntägeenin suhteen endogee-nisen promoottorin transkriptionaalisen säätelyn alaisuudessa; jolloin heterologisen polynukleotidilohkon kromosomaalinen 15 integraatio isäntägeeniin saadaan aikaan homologisella rekombi-naatiolla, (b) kohdassa (a) saaduista isäntäsoluista valikoidaan yksi tai useampi, joka ilmentää mainittua polypeptidiä; (c) vaiheessa (b) identifioitu yksi tai useampi isäntäsolu 20 altistetaan mutageenille sellaisissa olosuhteissa, että kromosomiin syntyy mutaatio, joka saa aikaan mainitun heterologisen polynukleotidilohkon voimakkaamman ilmentymisen; ja sitten (d) vaiheessa (c) saadut isäntäsolut testataan sellaisten isän-täsolujen löytämiseksi, jotka tuottavat toivottua polypeptidiä 25 alkuperäistä tasoa korkeammalla tasolla, sellaisten isäntäsolu-** - jen saamiseksi, joissa on mutaatio, joka johtaa heterologisen polynukleotidilohkon voimakkaampaan ilmentymiseen, minkä seurauksena isäntäsolut tuottavat enemmän haluttua polypeptidiä verrattuna siihen, miten paljon isäntäsolu tuottaa polypeptidiä 30 ilman tällaista mutaatiota, tämän voimakkaamman ilmentymisen ,, säilyessä ilman sellaisia olosuhteita, joissa voimakkaammin ** - ilmentävät solut valikoituvat.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, 35 että valikointivaihe (d) suoritetaan ilman olosuhteita, jotka valikoivat voimakkaamman ilmentymisen omaavia soluja ja joissa mainittu voimakkaampi ilmentyminen säilyy ilman mainittuja valikoivia olosuhteita. 49 111552
3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että (i) vaiheessa (a) mainittu nukleiinihappomolekyyli on plasmi-di, joka käsittää replikonin, joka on herkkä lämpötilalle rep- 5 likaatiota ajatellen; ja (ii) vaiheessa (a) mainittu transformointi käsittää plasmidin viemisen isäntäsoluihin ja näitä isäntäsoluja kasvatetaan olosuhteissa, joissa haluttua polypeptidiä ilmentävät solut valikoituvat lämpötilassa, joka ei salli plasmidin replikoitumista. 10
4. Jonkin patenttivaatimuksen 1-3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että heterologinen polynukleotidilohko käsittää useita geenejä ja/tai koodaa useita polypeptideja.
5. Jonkin patenttivaatimuksen 1-4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että heterologinen polynukleotidilohko käsittää valikoitavan markkerigeenin.
6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, 20 että valikoitava markkeriproteiini saa aikaan isäntäkannassa kloramfenikolin vastustuskyvyn.
7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vastustuskyky on vähintään noin 20 μg/ml olevalle kloram- 25 fenikolipitoisuudelle. * · i
8. Jonkin patenttivaatimuksen 5-7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valikoitava markkerigeeni on sellaisen promoottorin transkriptionaalisen säätelyn alaisuudessa, joka promoottori 30 sijaitsee heterologisessa polynukleotidilohkossa alavirtaan toivottua polypeptidiä koodaavasta sekvenssistä. * · l
9. Jonkin patenttivaatimuksen 5-8 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että toivottua polypeptidiä koodaava sekvenssi on isän- 35 tägeenin promoottorin transkriptionaalisen säätelyn alaisuudessa .
10. Jonkin patenttivaatimuksen 1-9 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että heterologinen polynukleotidilohko käsittää lisäksi so 111552 kopioinnin päättäjän, joka kopioinnin päättäjä sijaitsee toivottua polypeptidiä koodaavan geenin ja valikoitavan markkeri-geenin välissä.
11. Jonkin patenttivaatimuksen 1-10 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että isäntäsolu on mikrobisolu.
12. Patenttivaatimuksen 11 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mikrobisolu on bakteerisolu. 10
13. Patenttivaatimuksen 12 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että solu on suolistoperäinen bakteeri.
14. Patenttivaatimuksen 13 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, 15 että suolistobakteeriperäinen isäntäsolu on valittu Erwinia-, Escherichia- ja Klebsiella-bakteereiden joukosta.
15. Patenttivaatimuksen 14 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että suolistobakteeriperäinen isäntäsolu on Escherichia coli- 20 solu.
16. Jonkin edellä olevan patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että heterologinen polynukleotidilohko on sellaiseen geeniin kuuluvan endogeenisen promoottorin transkrip- 25 tionaalisen säätelyn alaisuudessa, joka geeni ilmentyy olennaisesti yhtä voimakkaasti kuin pyruvaatti-formaatti-lyaasi-geeni (pfl-geeni) tässä isäntäsolussa.
17. Patenttivaatimuksen 16 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, 30 että promoottori on pyruvaatti-formaatti-lyaasi-geenin (pfl- geenin) promoottori.
18. Jonkin edellä olevan patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että heterologinen polynukleotidilohko koodaa 35 alkoholi-dehydrogenaasia ja/tai pyruvaatti-dekarboksylaasia. 51 111552
19. Patenttivaatimuksen 18 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että Zvmomonas mobiliksen geenit koodaavat mainittua alkoholi-dehydrogenaasia ja pyruvaatti-dekarboksylaasia.
20. Patenttivaatimuksen 19 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu solu on Escherichia coli-solu, mainittu promoottori on pyruvaatti-formaatti-lyaasi-geenin (pfl-geenin) promoottori, ja mainittu solu kykenee tuottamaan etanolia glukoosia tai ksyloosia fermentoimalla siten, että teoreettinen saan-10 to vastaa lisätyn sokerin vähintään 90-prosenttista tai 100-prosenttista konversiota etanoliksi, vastaavasti.
21. Patenttivaatimuksen 20 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu teoreettinen saanto vastaa lisätyn ksyloosin vä- 15 hintään 100-prosenttista konversiota etanoliksi.
22. Patenttivaatimuksen 20 tai 21 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu kromosomi käsittää lisäksi mutaation, joka häiritsee sukkinaattituotantoa. 20
23. Patenttivaatimuksen 22 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että sukkinaattituotantoa häiritsevä mutaatio on fumaraatti-reduktaasi-geenissä (frd-geenissä) oleva mutaatio.
24. Jonkin edellä olevan patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu kromosomi käsittää lisäksi mutaation, joka häiritsee rekombinaatiota mainitussa isäntäsolussa.
25. Patenttivaatimuksen 24 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, 30 että rekombinaatiota häiritsevä mutaatio on recA-geenissä oleva mutaatio.
26. Rekombinanttinen isäntäsolu, tunnettu siitä, että se on saatavissa patenttivaatimuksen 1 mukaisella menetelmällä, ja 35 että se käsittää: (a) heterologisen polynukleotidilohkon, joka on stabiilisti - - . integroitu isäntägeeniin kromosomiin, ja joka on promoottorin transkriptionaalisen säätelyn alaisuudessa, mainitun isäntä- 52 1 1 15 5 2 geenin ja promoottorin ollessa endogeenisia isäntäsolun suhteen; (b) mutaation, joka saa aikaan mainitun polynukleotidilohkon koodaaman halutun polypeptidin ilmentymisen kasvun verrattuna 5 ilmentymiseen ilman tällaista mutaatiota.
27. Rekombinanttinen isäntäsolu, tunnettu siitä, että se on saatavissa patenttivaatimuksen 1 mukaisella menetelmällä käytettäväksi teollisessa fermentoinnissa, ja että se käsittää: 10 (a) heterologisen polynukleotidilohkon, joka on stabiilisti integroitu isäntägeeniin kromosomiin, ja joka on promoottorin transkriptionaalisen säätelyn alaisuudessa, mainitun isäntä-geenin ja promoottorin ollessa endogeenisia isäntäsolun suhteen; 15 (b) mutaation, joka saa aikaan mainitun polynukleotidilohkon koodaaman halutun polypeptidin ilmentymisen kasvun verrattuna ilmentymiseen ilman tällaista mutaatiota.
28. Patenttivaatimuksen 26 tai 27 mukainen rekombinanttinen 20 isäntäsolu, tunnettu siitä, että halutun polypeptidin ilmentymisen kasvu säilyy ilman sellaisia olosuhteita, jotka valikoivat soluja, joissa tällainen ilmentymisen kasvu esiintyy.
29. Patenttivaatimuksen 26, 27 tai 28 mukainen rekombinanttinen 25 isäntäsolu, tunnettu siitä, että mainitun polypeptidin ilmenty- »· « minen kasvaa 10-kertaisesti.
30. Jonkin patenttivaatimuksen 26-29 mukainen rekombinanttinen isäntäsolu, tunnettu siitä, että mainittu heterologinen poly- 30 nukleotidilohko käsittää lukuisia geenejä. • *
31. Jonkin patenttivaatimuksen 26-30 mukainen rekombinanttinen isäntäsolu, tunnettu siitä, että mainittu heterologinen poly-nukleotidilohko koodaa lukuisia polypeptidejä. 35
32. Jonkin patenttivaatimuksen 26-31 mukainen rekombinanttinen isäntäsolu, tunnettu siitä, että heterologinen polynukleotidi-lohko käsittää valikoitavan markkerigeenin. 53 11 1552
33. Patenttivaatimuksen 32 mukainen rekombinanttinen isäntäsolu, tunnettu siitä, että tämän valikoitavan markkerigeenin ilmentyminen saa aikaan solussa antibiootin vastustuskyvyn.
34. Patenttivaatimuksen 33 mukainen rekombinanttinen isäntäsolu, tunnettu siitä, että tämän markkerigeenin ilmentyminen saa aikaan solussa kloramfenikolin vastustuskyvyn.
35. Jonkin patenttivaatimuksen 26-34 mukainen rekombinanttinen 10 isäntäsolu, tunnettu siitä, että siinä isäntäsolu, heterologi- nen polynukleotidilohko tai kromosomi on kuten on määritelty missä tahansa patenttivaatimuksista 11-25.
36. Rekombinanttinen isäntäkanta Escherichia coli (pLOI510), 15 joka on talletettu kantakokoelmaan American Type Culture Collection talletusnumerolla ATCC 68484.
37. Rekombinanttinen isäntäkanta Escherichia coli (pLOI543), joka on talletettu kantakokoelmaan American Type Culture Col- 20 lection talletusnumerolla ATCC 68485.
38. Rekombinanttinen isäntäkanta Escherichia coli K04, joka on talletettu kantakokoelmaan American Type Culture Collection talletusnumerolla ATCC 55123. 25 • · <
39. Rekombinanttinen isäntäkanta Escherichia coli KOll, joka on talletettu kantakokoelmaan American Type Culture Collection talletusnumerolla ATCC 55124.
40. Rekombinanttinen isäntäkanta Escherichia coli K012, joka on talletettu kantakokoelmaan American Type Culture Collection *- talletusnumerolla ATCC 55125.
41. Rekombinanttinen isäntäkanta Escherichia coli KO20, joka on 35 talletettu kantakokoelmaan American Type Culture Collection talletusnumerolla ATCC 55126. 54 1 11552
FI932559A 1990-12-07 1993-06-04 Menetelmä rekombinanttisen isäntäsolukannan tuottamiseksi ja näin saatu rekombinanttinen isäntäsolu FI111552B (fi)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US62422790A 1990-12-07 1990-12-07
US62422790 1990-12-07
PCT/US1991/008835 WO1992010561A1 (en) 1990-12-07 1991-12-04 Recombinant cells that highly express chromosomally-integrated heterologous genes
US9108835 1991-12-04

Publications (3)

Publication Number Publication Date
FI932559A0 FI932559A0 (fi) 1993-06-04
FI932559A FI932559A (fi) 1993-07-27
FI111552B true FI111552B (fi) 2003-08-15

Family

ID=24501169

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI932559A FI111552B (fi) 1990-12-07 1993-06-04 Menetelmä rekombinanttisen isäntäsolukannan tuottamiseksi ja näin saatu rekombinanttinen isäntäsolu

Country Status (12)

Country Link
EP (1) EP0560885B1 (fi)
JP (2) JP3593125B2 (fi)
AT (1) ATE177784T1 (fi)
AU (3) AU668677B2 (fi)
BR (1) BR9107210A (fi)
CA (1) CA2097803C (fi)
DE (1) DE69131015T2 (fi)
DK (1) DK0560885T3 (fi)
ES (1) ES2132116T3 (fi)
FI (1) FI111552B (fi)
GR (1) GR3030570T3 (fi)
WO (1) WO1992010561A1 (fi)

Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5424202A (en) * 1988-08-31 1995-06-13 The University Of Florida Ethanol production by recombinant hosts
US5733761A (en) * 1991-11-05 1998-03-31 Transkaryotic Therapies, Inc. Protein production and protein delivery
US5641670A (en) * 1991-11-05 1997-06-24 Transkaryotic Therapies, Inc. Protein production and protein delivery
TW402639B (en) * 1992-12-03 2000-08-21 Transkaryotic Therapies Inc Protein production and protein delivery
DE69432901T2 (de) * 1993-12-23 2004-05-27 Merck & Co., Inc. Expressionssystem von antikörpern bei homologischer rekombinierung in murinezellen
EP0966521A1 (en) * 1996-09-13 1999-12-29 Novo Nordisk Biotech, Inc. Cells having dna insertion mutations which produce altered amounts of a polypeptide
WO2001018222A1 (en) * 1999-09-07 2001-03-15 University Of Florida Methods and compositions for the chromosomal integration of heterologous sequences
US7223559B2 (en) * 2000-04-06 2007-05-29 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Plasmids for chromosomal recombination of Escherichia coli
JP4927297B2 (ja) 2000-06-16 2012-05-09 公益財団法人地球環境産業技術研究機構 組換え型コリネ型細菌を用いるエタノールの製造方法
US6566107B1 (en) * 2000-11-01 2003-05-20 Midwest Research Institute Recombinant Zymomonas mobilis with improved xylose utilization
US8716002B2 (en) * 2006-08-09 2014-05-06 University Of Florida Research Foundation, Inc. Re-engineering bacteria for ethanol production
WO2008120570A1 (ja) * 2007-03-19 2008-10-09 National University Corporation Okayama University タンパク質産生用およびウイルス増殖用の培地

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4551433A (en) * 1981-05-18 1985-11-05 Genentech, Inc. Microbial hybrid promoters

Also Published As

Publication number Publication date
CA2097803A1 (en) 1992-06-08
EP0560885A1 (en) 1993-09-22
AU668677B2 (en) 1996-05-16
EP0560885B1 (en) 1999-03-17
WO1992010561A1 (en) 1992-06-25
CA2097803C (en) 2010-08-03
EP0560885A4 (en) 1994-06-08
DE69131015D1 (de) 1999-04-22
GR3030570T3 (en) 1999-10-29
ATE177784T1 (de) 1999-04-15
DE69131015T2 (de) 1999-11-18
JP2004283176A (ja) 2004-10-14
JP3593125B2 (ja) 2004-11-24
AU6194696A (en) 1996-10-31
AU694674B2 (en) 1998-07-23
JPH06504436A (ja) 1994-05-26
ES2132116T3 (es) 1999-08-16
BR9107210A (pt) 1994-02-08
AU1858699A (en) 1999-09-09
AU9098891A (en) 1992-07-08
FI932559A0 (fi) 1993-06-04
DK0560885T3 (da) 1999-10-11
FI932559A (fi) 1993-07-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US5000000A (en) Ethanol production by Escherichia coli strains co-expressing Zymomonas PDC and ADH genes
US5482846A (en) Ethanol production in Gram-positive microbes
US5602030A (en) Recombinant glucose uptake system
EP0973915B1 (en) Recombinant microorganisms capable of fermenting cellobiose
US6107093A (en) Recombinant cells that highly express chromosomally-integrated heterologous genes
JP2000509988A (ja) キシロースをエタノールに発酵するための安定な組換え酵母
MXPA06014165A (es) Cepas de saccharomyces no recombinantes que se desarrolan sobre xilosa.
US20070172937A1 (en) Recombinant cells that highly express chromosomally-integrated heterologous genes
WO2012071392A2 (en) Engineering of thermotolerant bacillus coagulans for production of d(-)-lactic acid
FI111552B (fi) Menetelmä rekombinanttisen isäntäsolukannan tuottamiseksi ja näin saatu rekombinanttinen isäntäsolu
CN106715679A (zh) 用于生产乙偶姻的方法
JP2018157814A (ja) シュードザイマ・アンタクティカの新規菌株
US20130224839A1 (en) Recombinant Microorganism and Methods of Production Thereof
CN101748069A (zh) 一种重组蓝藻
CN104630100A (zh) 改造的克雷伯氏肺炎杆菌及其生产r-乙偶姻的应用
US9309542B2 (en) Recombinant Caldicellulosiruptor bescii and methods of use
US20050158836A1 (en) Ethanol production in gram-positive microbes
KR101863239B1 (ko) 아세트산을 유일 탄소원으로 이용할 수 있는 미생물
O'Mullan et al. Roles of alcohol dehydrogenases of Zymomonas mobilis (ZADH): characterization of a ZADH-2-negative mutant
AU3556902A (en) Recombinant cells that highly express chromosomally- integrated heterologous genes
JP2004089029A (ja) 新規なセロビオース資化性微生物
JPWO2006085589A1 (ja) 微生物の糖代謝活性を改善する方法
Xu Lehrstuhl für Mikrobiologie
JP2005013105A (ja) 酢酸耐性に関与する遺伝子、該遺伝子を用いて育種された酢酸菌、及び該酢酸菌を用いた食酢の製造方法
JP2005046071A (ja) 酢酸耐性に関与する遺伝子

Legal Events

Date Code Title Description
MA Patent expired