BRPI0618937A2 - células de levedura que produzem ácido lático tendo l-ou d-lactato não funcional: gene de ferricitocromo c oxidoredutase - Google Patents

Abstract

CéLULAS DE LEVEDURA QUE PRODUZEM ACIDO LATICO TENDO L- OU D-LACTATO NAO FUNCIONAL: GENE DE FERRICITOCROMOC OXIDOREDUTASE São descritas células de levedura tendo um gene lactato desidrogenase exógeno e modificadas reduzindo-se a atividade L- ou D-lactato:ferricitocromo c oxidoredutase nacélula. Isto leva ao menor consumo de lactato pela célula e pode aumentar os rendimentos gerais de lactato em um processo de fermentação. Células tendo a menor atividade L- ou D- lactato:ferricitocromo c oxidoredutase podem ser selecionadas pela resistência a ácidos orgânicos, tais como ácido lá tico ou glicólico.

Description

"CÉLULAS DE LEVEDURA QUE PRODUZEM ÁCIDO LÁTICO TENDO L- OU D-LACTATO NÃO FUNCIONAL: GENE DE FERRICITOCROMO C OXIDOREDUTASE"

Esta invenção foi feita com -suporte do governo pe- la Cooperative Agreement DE-FC36- 03G013145 outorgado pelo United States Department of Energy. O governo tem certos di- reitos nesta invenção.

Este pedido reivindica beneficio para pedido pro- visório dos Estados Unidos 60/739.458 e 60/739.824, ambos depositados em 23 de novembro de 2005.

Esta invenção diz respeito a certa levedura gene- ticamente modificada, métodos para preparar esta levedura e processos de fermentação para produzir ácido lático· usando esta levedura geneticamente modificada.

Ácido lático é. fabricado por um processo de fer- mentação industrial. A fermentação é conduzida usando vários tipos de espécies bacterianas, que consomem açúcares (prin- cipalmente glicose) e convertem estes açúcares no ácido de- sejado. À medida que ácido lático é produzido, o meio de fermentação torna-se cada vez mais ácido. A maioria das bac- térias que produz estes ácidos orgânicos não tem bom desem- penho em ambientes fortemente ácidos - elas tanto não sobre- vivem nestas condições como de outra maneira geram o produto tão lentamente a ponto de ser economicamente inviáveis.

Por este motivo, processos de fermentação do ácido comercial são tamponados pela adição de um agente que neu- traliza à medida que ele é formado. Isto mantém o caldo no pH neutro ou próximo dele e permite que a bactéria cresça e produza de maneira eficiente. Entretanto, isto converte o á- cido em um. sal, que subseqüentemente pode ser dividido para obter o produto na sua forma de ácido desejado..

O agente de tamponamento mais comum é um composto de cálcio, que neutraliza o ácido orgânico para formar o sal de cálcio correspondente. Após o sal de cálcio ser recupera- do do caldo de fermentação, ele é dividido pela adição de um ácido, mineral, tipicamente ácido sulfúrico, para gerar o á- cido orgânico e formar um sal de cálcio insolúvel do ácido mineral. Este processo então envolve despesa direta para o agente de tamponamento e ácido mineral, bem como custos para o manuseio e disposição do subproduto de sal de cálcio inde- sejável. Estes custos podem ser reduzidos ou eliminados se o biocatalisador puder crescer e produzir de maneira eficiente em condições de pH baixo.

Espécies de levedura foram consideradas candidatas para tais fermentações de baixo pH. Muitas espécies de leve- dura fermentam naturalmente açúcares de hexose em etanol, mas poucas, talvez nenhuma, produzem naturalmente ácidos or- gânicos desejados tal como ácido lático. Conseqüentemente, foram feitos esforços para modificar geneticamente várias espécies de levedura para inserir um ou mais genes que per- mitirão á célula produzir ácido lático. A fim de desviar o metabolismo do açúcar da produção de etanol para a produção de ácido lático, estas células também foram geneticamente modificadas para interromper ou deletar o gene piruvato des- carboxilase nativo (PDC). Este trabalho é descrito, por e- xemplo, em WO 99/14335, WO 00/71738 Al, WO 02/42471 A2, WO 03/049525 Α2, WO 03/102152 Α2 e WO 03/102201Α2.

Continua a existir um desejo de fornecer biocata- lisadores ainda melhores para processos de fermentação do ácido orgânico. De um modo particular, é desejável melhorar as produtividades e rendimentos destes processos de fermen- tação, particularmente em processos de fermentação de baixo pH não tamponado.

Em um aspecto, esta invenção é uma célula de leve- dura geneticamente modificada tendo pelo menos um gene de lactato deidrogenase (LDH) funcional exógeno cuja célula de levedura é incapaz de crescer em D-lactato, L-Iactato ou tanto em D- quanto em L-Iactato como uma única fonte de car- bono .

Esta invenção é também uma célula de levedura ge- neticamente modificada tendo (a) pelo menos um gene de lac- tato deidrogenase (LDH) funcional exógeno integrado em seu genoma e (b) uma deleção ou ruptura de pelo menos um gene de L- ou D-lactato:ferricitocromo c oxidoredutase nativo. Em modalidades preferidas, pelo menos um gene L- lactato:ferricitocromo c oxidoredutase é deletado e inter- rompido, quando o dito gene LDH é um gene L-LDH, e pelo me- nos um gene D-Iactatorferricitocromo c oxidoredutase nativo é deletado ou interrompido se o gene LDH for um gene D-LDH.

Esta invenção é também um processo de fermentação em que uma célula de levedura geneticamente modificada da invenção é cultivada em condições de fermentação em um caldo de fermentação que inclui um açúcar fermentável para produ- zir ácido lático ou um sal deste. Esta invenção é também um método para produzir uma célula de levedura geneticamente modificada da maneira des- crita anteriormente, compreendendo (a) interromper ou dele- tar um gene de L- ou D-Iactato:ferricitocromo c oxidoreduta- se nativo em uma célula de levedura e (b) transformar a cé- lula de levedura tendo o gene L- ou D-Iactato:ferricitocromo c oxidoredutase deletado ou interrompido com um vetor con- tendo um cassete do gene LDH exógeno funcional para integrar o cassete do gene LDH no genoma da célula de levedura. Pre- fere-se que o cassete do gene LDH inclua um gene L-LDH fun- cional no caso de um ruptura ou deleção de um gene L- lactato:ferricitocromo c oxidoredutase e inclui um gene DLDH no caso de uma ruptura ou deleção de um gene D-Lactato:ferricitocromo c oxidoredutase.

Esta invenção é um método para produzir uma célula de levedura geneticamente modificada da maneira descrita an- teriormente, compreendendo a) transformar uma célula de le- vedura tendo um gene L-Iactato:ferricitocromo c oxidoreduta- se nativo com uma construção contendo um L-Cassete do gene LDH exógeno para produzir um mutante tendo um gene L-LDH e- xógeno funcional integrado em seu genoma e em seguida (b) interromper ou deletar o gene L-Iactato:ferricitocromo c o- xidoredutase nativo.

Esta invenção é um método para produzir uma célula de levedura geneticamente modificada da maneira descrita an- teriormente, compreendendo transformar uma célula de levedu- ra tendo um gene L-Iactato:ferricitocromo c oxidoredutase nativo com uma construção contendo (a) uma região flanquea- dora 5' gene L-Iactato:ferricitocromo c oxidoredutase nati- vo; (b) uma região f lanqueadora 3' gene L- lactato:ferricitocromo c oxidoredutase nativo e (c) um cas- sete do gene L-LDH exógeno residindo no construção a jusante da região flanqueadora 5' gene L-Iactato:ferricitocromo c oxidoredutase nativo e a montante da região flanqueadora 3' do gene L-Iactato:ferricitocromo c oxidoredutase nativo, a construção sendo desprovida de um cassete do gene L- lactato:ferricitocromo c oxidoredutase funcional.

Esta invenção é ainda um método adicional para produzir uma célula de levedura geneticamente modificada do primeiro aspecto, compreendendo a) transformar uma célula de levedura tendo um gene D-Iactato:ferricitocromo c oxidoredu- tase nativo com uma construção contendo um cassete do gene D-LDH exógeno para produzir um mutante tendo um gene D-LDH exógeno funcional integrado em seu genoma e em seguida (b) interromper ou deletar o gene D-Iactato:ferricitocromo c o- xidoredutase nativo.

Esta invenção é, além disso, um método para produ- zir uma célula de levedura geneticamente modificada do pri- meiro aspecto, compreendendo transformar uma célula de leve- dura tendo um gene D-Iactatorferricitocromo c oxidoredutase nativo com um vetor contendo (a) uma região flanqueadora 5' do gene D-Iactato:ferricitocromo c oxidoredutase nativo; (b) uma região flanqueadora 3' do gene D-Iactatorferricitocromo c oxidoredutase nativo e (c) um cassete do gene D-LDH exóge- no residindo no construção a jusante da região flanqueadora 5' do gene D-Iactatorferricitocromo c oxidoredutase nativo e a montante da região flanqueadora 3' do gene D- lactato:ferricitocromo c oxidoredutase nativo, o vetor sendo desprovido de um cassete do gene D-lactato:ferricitocromo c oxidoredutase funcional.

Observou-se que a célula geneticamente modifi- cada da invenção produz lactato em produtividades maiores e tituladores de lactato maiores, especialmente em condições de baixo pH, do que célula similar contendo o mesmo cassete do gene LDH exógeno, mas tendo um gene L- lactato:ferricitocromo c oxidoredutase funcional (no caso de um cassete do gene L-LDH) ou gene D-lactato:ferricitocromo c oxidoredutase (no caso de um cassete do gene D-LDH). A célu- la transformada não tem a capacidade de crescer em um meio contendo lactato como sua única fonte de carbono, e assim a deleção do gene L- ou D-Iactato:ferricitocromo c oxidoredu- tase permite que a célula transformada seja identificada, se desejado, baseado na incapacidade dos transformantes de cres- cer no lactato como uma única fonte de carbono. Além disso, observou-se que a deleção do gene L-lactato:ferricitocromo c oxidoredutase de acordo com a invenção melhora a resistência do ácido da célula transformada, e em particular melhora sua resistência a ácido glicólico. Isto permite que transforman- tes bem sucedidos sejam selecionados usando um meio ácido tal como um meio contendo ácido glicólico. A capacidade de usar ácidos tal como ácido glicólico como um agente seletivo torna possível evitar o uso de antibiótico ou outros marca- dores de gene de resistência durante a transformação das ce- pas para deletar ou interromper o gene L- Iactato:ferricitocromo c oxidoredutase.

Figura 1 é um diagrama que descreve o plasmideo pMM22.

Figura 2 é um diagrama que descreve o plasmideo pMM28.

Figura 3 é um diagrama que descreve o plasmideo pMM35,

Figura 4 é um diagrama que descreve o plasmideo pBH76.

Figura 5 é um diagrama que descreve o plasmideo pMM38.

Figura 6 é um diagrama que descreve o plasmideo pMI318

Figura 7 é um diagrama que descreve o plasmideo pMI355.

Figura 8 é um diagrama que descreve o plasmideo pMI355.

Figura 9 é um diagrama que descreve o plasmideo pMI356.

Figura 10 é um diagrama que descreve o plasmideo pMI433.

Figura 11 é um diagrama que descreve o plasmideo pMI449

Figura 12 é um diagrama que descreve o plasmideo pMI454

Figura 13 é um diagrama que descreve o plasmideo pMM44.

Figura 14 é um diagrama que descreve o plasmideo pΜΜ4 5.

Figura 15 é um diagrama que descreve o plasmideo

pCM14 9.

A levedura geneticamente modificada da invenção é preparada realizando certas modificações genéticas em uma célula de levedura hospedeira. A célula de levedura hospe- deira é uma que, como uma cepa tipo selvagem, é capaz de me- tabolizar de forma nativa pelo menos um açúcar em piruvato. Ela pode ser incapaz de crescer de forma nativa no lactato como uma única fonte de carbono. S. bulderi é um exemplo de uma célula de levedura como essa. Em outras modalidades da invenção, a célula é geneticamente modificada para torná-la incapaz de crescer no lactato como uma única fonte de carbo- no. Quando transformada para introduzir um gene L-LDH exóge- no da maneira aqui descrita, a célula de levedura hospedeira preferivelmente é uma que como uma cepa tipo selvagem tem um gene L- lactato:ferricitocromo c oxidoredutase funcional na- tivo. A célula de levedura hospedeira preferivelmente é uma que, como uma cepa tipo selvagem, contém pelo menos um gene D-lactato:ferricitocromo c oxidoredutase. funcional nativo, se ela tiver que ser transformada com um gene Ό-LDH exógeno da maneira descrita a seguir.

Um L-lactato:ferricitocromo c oxidoredutase é um gene que codifica para uma enzima L-lactatorferricitocromo c oxidoredutase funcional, que catalisa a metabólise de L- lactato em piruvato. Embora uma enzima como essa possa aju- dar a célula a metabolizar a reação reversa de piruvato com L-lactato, ela é muito mais eficiente na catalisação da rea- ção reversa de lactato de volta para piruvato, e assim as células tipo selvagem não produzem essencialmente nenhum L- lactato, a despeito da presença deste gene funcional. A en- zima L-Iactatorferricitocromo c oxidoredutase é também co- nhecida pelo nome sistemático (S)-lactato:ferricitocromo-c 2-oxidoredutase ou como L-Iactato deidrogenase (citocromo). O gene L-Iactato:ferricitocromo c oxidoredutase é adequada- mente um que tem uma região de codificação identificada como SEQ. ID. NO. í (o gene L-Iactatorferricitocromo c oxidoredu- tase CYB2 de uma cepa K. marxianus tipo selvagem ), SEQ. ID. NO. 79 (o gene CYB2A de uma cepa I. orientalis tipo selva- gem) ou SEQ. ID. NO. 81 (o gene CYB2B de uma cepa I. orien- talis tipo selvagem) , ou é um gene que é pelo menos 40 %, preferivelmente pelo menos 75 %, mais preferivelmente pelo menos 90 % e ainda mais preferivelmente pelo menos 95 % ho- móloga a pelo menos um de SEQ. ID. NOs. 1, 79 ou 81. O gene L-Iactatorferricitocromo c oxidoredutase é adequadamente um que codifica um proteina com uma seqüência de aminoácidos identificada como SEQ. ID. NO. 2, SEQ. ID. NO. 80 ou SEQ. ID. NO. 82, ou codifica para uma proteina que é pelo menos 40 %, preferivelmente pelo menos 75 %, mais pref erivelmente pelo menos 90 % e ainda mais preferivelmente pelo menos 95 % homóloga a pelo menos uma de SEQ. ID. NOs. 2, 80 ou 82.

Um D-Iactatorferricitocromo c oxidoredutase é um gene que codifica para uma enzima D-Iactatorferricitocromo c oxidoredutase funcional, que catalisa o metabolismo de D- lactato com piruvato muito mais fortemente do que ele cata- lisa a reação reversa. O enzima D-Iactatorferrieitocromo c oxidoredutase é também conhecida pelo nome sistemático (R)- lactato:ferricitocromo-c 2-oxidoredutase ou como D-Iactato deidrogenase (citocromo). 0 gene D-Iactato:ferricitocromo c oxidoredutase é adequadamente um que tem uma região de codi- ficação identificada como SEQ. ID. NO. 83 (o gene D- lactato:ferricitocromo c oxidoredutase (DLDl) de uma cepa K. marxianus tipo selvagem), o gene DLDl de S. cerevisiae, o gene DLDl de I. orientalis, ou é um gene que é pelo menos 40 %, preferivelmente pelo menos 75 %, mais preferivelmente pelo menos 90 % e ainda mais preferivelmente pelo menos 95 % homólogo a pelo menos um de tais genes. 0 gene D- lactato:ferricitocromo c oxidoredutase é adequadamente um que codifica uma proteína com uma seqüência de aminoácidos identificada como SEQ. ID. NO. 84, uma proteína tendo a se- qüência de aminoácidos de uma proteína codificada pelo gene DLDl de S. cerevisiae, uma proteína tendo a seqüência de a- minoácido de uma proteína codificada pelo gene DLDl de I. orientalis, ou uma proteína que é pelo menos 40 %., preferi- velmente pelo menos 75 %, mais preferivelmente pelo menos 90 % e ainda mais preferivelmente pelo menos 95 % homóloga a um desses.

Uma "construção" é uma seqüência de DNA que é usa- da para transformar uma célula. A construção pode ser, por exemplo, na forma de um plasmídeo ou vetor circular, na forma de um plasmídeo ou vetor linearizado, pode ser uma porção de um plasmídeo ou vetor circular (tal como é obtido digerindo o plasmídeo ou vetor com uma ou mais enzimas de restrição), ou pode ser um produto PCR preparado usando um plasmídeo, vetor ou DNA genômico como um gabarito.

O termo "nativo", quando usado aqui com relação a materiais genéticos (por exemplo, um gene, promotor, termi- nador ou outra seqüência de DNA), refere-se a materiais ge- néticos que são encontrados (exceto de mutações indivíduo para indivíduo que não afetam a função) no genoma de células tipo selvagem desta espécie de levedura. "Capacidade nativa" (e suas variações tal como "nativamente capaz") indica a ca- pacidade de células tipo selvagem realizarem a função indi- cada. Por exemplo, uma célula é nativamente capaz de metabo- lizar um açúcar em piruvato, se células tipo selvagem dessa espécie possuírem esta capacidade antes de quaisquer modifi- cações genéticas. Um gene é considerado "funcional" dentro da célula se suas funções dentro da célula produzirem uma proteína ativa.

Nesta invenção, "exógeno" com relação a qualquer material genético significa que o material genético não é nativo para a célula hospedeira.

Células de levedura adequadas incluem aquelas de genera Candidar Saccharomycesr Shizosaccharomyes, Kluyve- romyees, Piehia, Issaehenkia e Hansenula. Célula de genera Candida, Kluyveromyces, Saccharomyees e Issaehenkia são par- ticularmente preferidas. Células especialmente preferidas são C. sonorensisr K marxianusr K. thermotolerans, C. metha- nesorbosar S. bulderi e I. orientalis. Células mais preferi- das são K marxianusr S. eerevisiaer C. sonorensis e I. ori- entalis. I. orientalis é referida algumas vezes como Candida krusei ou Piehia kudriavzevii. Cepas adequadas de K. marxia- nus e C. sonorensis incluem aquelas descritas em WO 00/71738 Al, WO 02/42471 A2, WO 03/049525 A2, WO 03/102152 A2 e WO 03/102201A2. Uma cepa adequada de I. orientalis é cepa ATCC 32196.

A célula da invenção também contém pelo menos um funcional, gene lactato deidrogenase (LDH) exógeno integrado em seu genoma. Um gene LDH é um gene que codifica para uma enzima de lactato deidrogenase funcional. Genes LDH são es- pecíficos para a produção tanto de L-LDH quanto de D-LDH, que respectivamente permitem à célula produzir tanto o enan- tiômero L- quanto D- ácido lático (ou seus sais) . É possível que o célula modificada da invenção contenha tanto os genes L- quanto D-LDH, e assim é capaz de produzir ambos enantiô- meros de ácido lático. Entretanto, prefere-se que apenas ge- nes L- ou apenas D-LDH estejam presentes, assim a célula produz um produto de ácido lático oticamente mais puro.

Genes LDH adequados incluem aqueles obtidos a par- tir de fontes bacterianas, fúngicas, de levedura ou mamífe- ras. Exemplos de genes L-LDH específicos são aqueles obtidos a partir de L. helveticus, L. casei, B. megateriuni, P. aci- dilactici, e fontes bovinas. Exemplos de específicos genes D-LDH são aqueles obtidos a partir de L. helveticus, L. johnsonii, L. bulgaricus, L. delbrueckii, L. plantarum e L. pentosus. Genes funcionais que são idênticos ou pelo menos 8 0 % homólogos a qualquer desses genes L-LDH ou D-LDH são adequados. Os genes nativos obtidos a partir de qualquer dessas fontes podem ser submetidos a mutagênese, se necessá- rio, para fornecer uma seqüência de codificação começando com o usual códon de partida eucariótico (ATG), ou com ou- tros propósitos. Um gene L-LDH preferido é aquele obtido a partir de L. helveticus ou um que é pelo menos 80 %, 85 %, 90 % ou 95 % homólogo a tal gene. Um outro gene L-LDH prefe- rido é aquele obtido a partir de B. megaterium ou um que é pelo menos 80 %, 85 %, 90 % ou 95 % homólogo a tal gene. Um gene D-LDH preferido é aquele obtido a partir de L. helveti- cus ou um que é pelo menos 80 %, 85 %, 90 % ou 95 % homóloga to tal gene.

Porcentagem de homologia de DNA, RNA ou de outro material genético e de seqüências de aminoácidos de proteína pode ser computado convenientemente usando suporte lógico BLAST versão 2.2.1 com parâmetros padrões. Seqüências tendo uma pontuação de identidades de pelo menos XX %, usando o algoritmo BLAST versão 2.2.1 com parâmetros padrões, são consideradas pelo menos XX % homólogas.

Particularmente, genes LDH adequados incluem aque- les que codificam para uma enzima com uma seqüência de ami- noácidos que tem uma pontuação de identidades de pelo menos 60 %, especialmente pelo menos 80 %, 85 % ou 95 %, comparado com SEQ. ID. NO. 4 5 de WO 03/04 9525 ou comparado com SEQ. ID. NO. 49 de WO 031049525. Genes LDH particularmente ade- quados também incluem aqueles que codificam uma enzima tendo uma seqüência de proteína que é pelo menos 60 %, 80 %, 85 % ou 95 % homóloga a SEQ ID. NO. 46 ou 50 de WO 03/049525.

A célula transformada pode conter um único gene LDH ou múltiplos genes LDH, tal como de 1-10 genes LDH, es- pecialmente de 1-5 genes LDH. Quando a célula transformada contém múltiplos genes LDHr os genes individuais podem ser cópias do mesmo gene, ou incluir cópias de dois ou mais di- ferentes genes LDH. Múltiplas cópias do gene LDH exógeno podem ser integradas em um locus único (assim, eles ficam adjacentes um ao outro), ou em diversos Ioci dentro do geno- ma da célula hospedeira.

O gene LDH exógeno está sob o controle transcri- cional de um ou mais promotores e um ou mais terminadores, ambos os quais são funcionais na célula de levedura modifi- cada. Da maneira aqui usada, o termo "promotor" refere-se a uma seqüência não transcrita localizada a montante (isto é, 5') do códon de inicio de tradução de um gene estrutural (geralmente em cerca de 1 a 1.000 bp, preferivelmente 1-500 bp, especialmente 1-100 bp) e que controla o inicio de transcrição do gene estrutural. Similarmente, o termo "ter- minador" refere-se a uma seqüência não transcrita localizada a jusante (isto é, 3') para o códon final de tradução de um gene estrutural (geralmente em cerca de 1 a 1.000 bp, mais tipicamente 1-500 pares base e especialmente 1-100 pares ba- se) e que controla o final de transcrição do gene estrutu- ral. Um promotor ou terminador é "operacionalmente ligado" a um gene estrutural se sua posição no genoma com relação à- quele do gene estrutural for tal que o promotor ou termina- dor, conforme possa ser o caso, realiza sua função transcri- cional de controle.

Seqüências promotoras e terminadoras podem ser na- tivas ou exógenas para a célula hospedeira.

Um tipo adequado de promotor é pelo menos 50%, 70 %, 90 %, 95 % ou 99 % homólogo a um promotor que é nativo a um gene de levedura. Um tipo mais adequado de promotor é pe- lo menos 50 %, 70 %, 90 %, 95 % ou 99 % homólogo a um promo- tor para um gene que é nativo para a célula hospedeira. Pro- motores particularmente usados incluem promotores para piru- vato descarboxilase de levedura (PDCl), quinase de fosfogli- cerato (PGK), xilose redutase (XR) xilitol deidrogenase (XDH) , L-( + )-lactato-citocromo c oxidoredutase (CYB2) e genes de fator-1 de prolongamento de transcrição (TEFl) e fator-2 de prolongamento de transcrição (TEF2), especialmente a par- tir dos genes respectivos da célula hospedeira. Um promotor especialmente usado inclui a porção funcional de um promotor para um gene PDCl, PGKr TEFl ou TEF2 da célula hospedeira ou pelo menos 80 %, 85 %, 90 % ou 95 % homóloga a um promotor como esse.

Um tipo adequado de terminador é pelo menos 50 %, 70 %, 90 %, 95 % ou 99 % homólogo a um terminador para um gene que é nativo de uma célula de levedura. 0 terminador pode ser pelo menos 90 %, 95 % ou 99 % homólogo a um termina- dor para um gene que é nativo da célula hospedeira. Termina- dores particularmente usados incluem terminadores para piru- vato descarboxilase de levedura (PDCl) , xilose redutase, (XR) , xilitol deidrogenase (XDH) , gene L- lactato:ferricitocromo c oxidoredutase ou genes iso-2- citocromo c (CYC), ou um terminador a partir da família ga- lactose de genes em levedura, particularmente o assim chama- do terminador GAL10. Um terminador especialmente preferidas inclui uma porção funcional de um terminador para um gene PDCl da célula hospedeira ou é pelo menos 80 %, 85 %, 90 % ou 95 % homólogo a isto.

O uso de promotores e terminadores nativos (para a célula hospedeira), juntamente com as respectivas regiões flanqueadoras a montante e a jusante, pode permitir a inte- gração visada do gene LDH em Ioci especifico do genoma da célula hospedeira, e integração simultânea do gene LDH e deleção ou ruptura de um outro gene nativo, tal como, por exemplo, um gene PDCl.

Quando múltiplos genes LDH exógenos são introduzi- dos na célula hospedeira, é possivel para os os diferentes genes LDH fiquem sob o controle de diferentes tipos de pro- motores e/ou terminadores.

O gene LDH exógeno pode ser integrado aleatoria- mente no genoma da célula hospedeira ou inserido em uma ou mais localizações visadas. Exemplos de localizações visadas incluem o locus de um ou mais genes que são desejavelmente deletados ou interrompidos, tais como a de um gene PDCl ou a do gene L- ou D-Iactato:ferricitocromo c oxidoredutase.

Em modalidades em que a célula contém um cassete do gene L-LDH funcional, a célula modificada da invenção mais preferivelmente inclui uma deleção ou ruptura de pelo menos um gene L-Iactato:ferricitocromo c oxidoredutase nati- vo. "Deletar ou interromper" significa que toda a região de codificação do gene é eliminada (deleção) , ou o gene, seu promotor e/ou sua região terminadora é modificado (tal como por deleção, inserção ou mutação) de maneira que o gene tan- to não produza mais a proteína ou uma versão ativa da prote- ina, quanto produza uma enzima com atividade severamente re- duzida (pelo menos 75 % reduzida, preferivelmente pelo menos 90 % reduzida) . A deleção ou ruptura pode ser realizada por métodos de engenharia genética, evolução forçada ou mutagê- nese, seguido por seleção ou classificação apropriada para identificar os mutantes desejados. Se a célula contém gene L-Iactato:ferricitocromo c oxidoredutases múltiplo (tanto cópias múltiplas do mesmo gene quanto dois ou mais diferen- tes L-Iactato:ferricitocromo c oxidoredutase) parálogo, pelo menos um daqueles genes é deletado ou interrompido, e é pre- ferível deletar ou interromper todos aqueles gene L- lactato:ferricitocromo c oxidoredutases.

Em modalidades onde a célula contém um cassete do gene D-LDH funcional, a célula modificada da invenção prefe- rivelmente inclui uma deleção ou ruptura de pelo menos um gene D-Iactato:ferricitocromo c oxidoredutase nativo. Como antes, é preferível deletar ou interromper todos aqueles ge- nes quando múltiplas cópias ou alelos do gene estão presen- tes na cepa tipo selvagem.

A célula de levedura geneticamente modificada da invenção pode incluir modificações genéticas adicionais que fornecem um ou mais atributos desejáveis à célula. Uma modi- ficação adicional de particular interesse inclui uma deleção ou ruptura de gene(s) de piruvato dicarboxilato, reduzindo dessa forma a capacidade da célula produzir etanol.

Uma outra modificação adicional de particular in- teresse é um (ou mais) que confere individual ou coletiva- mente à célula a capacidade de fermentar açúcares de pentose em produtos de fermentação desejáveis. Entre o último tipo de modificações estão (1) inserção de um gene de xilose iso- merase funcional, (2) uma deleção ou ruptura de um gene na- tivo que produz uma enzima que catalisa a conversão de xilo- se em xilitol, (3) uma deleção ou ruptura de um gene de xi- litol deidrogenase funcional e/ou (4) modificações que fazem com que a célula sobreexpresse um .xiluloquinase funcional. Métodos para introduzir aquelas modificações em células de levedura são descritos, por exemplo, em WO 04/099381, aqui incorporado pela referência.

Uma terceira modificação de particular interesse é a inte- gração de uma ou mais cassetes marcadores de seleção funcio- nal no genoma de célula hospedeira, para permitir seleção de transformantes bem sucedidos.

Deleção ou ruptura do gene L- ou D- lactato:ferricitocromo c oxidoredutase pode ser realizada em uma variedade de maneiras, incluindo por métodos de engenha- ria genética evolução forçado, ou mutagênese, acoplado com seleção ou classificação para identificar os mutantes dese- jados.

Métodos de mutagênese EMS e ultravioleta podem ser usados para deletar ou interromper o gene L- ou D- lactato:ferricitocromo c oxidoredutase. Estes métodos são bem conhecidos. Nestes métodos, célula são expostas a radia- ção ultravioleta ou uma substância mutagênica, em condições suficientes par atingir uma alta taxa de morte (60-99 %, preferivelmente 90-99 %) da célula. Célula sobreviventes são em seguida plaqueadas e selecionadas ou classificadas para célula tendo gene L- ou D-lactato:ferricitocromo c oxidore- dutase deletado ou interrompido. No caso de uma deleção ou ruptura de um gene L-lactato:ferricitocromo c oxidoredutase, isto é convenientemente feito selecionando para célula que são resistentes a ácido glicólico.

Engenharia genética da célula hospedeira (para de- letar ou interromper o gene L- ou D-lactato:ferricitocromo c oxidoredutase ou fazer outras modificações) é conveniente- mente realizada em uma ou mais etapas por meio do projeto e construção de construções apropriados e transformação da cé- lula hospedeira com aqueles construções. Eletroporação e/ou substância química (tal como cloreto de cálcio - ou acetato da base de lítio) métodos de transformação podem ser usados. As construções em cada caso podem tanto ser cortadas com en- zimas de restrição particulares, usadas como DNA circular ou usadas como o gabarito para gerar um produto PCR.

Em um método de engenharia genética adequado para deletar ou interromper o gene L- ou D-lactato: ferricitocromo c oxidoredutase, uma construção de deleção é convenientemen- te montado primeiro clonando duas seqüências de DNA não con- tínuas do gene de L- ou D-lactato:ferricitocromo c oxidore- dutase nativo e/ou suas regiões flanqueadoras a montante ou a jusante. Neste contexto, "não contínuo" significa que as seqüências de DNA não são imediatamente adjacentes umas com as outras no genoma do tipo selvagem, mas, em vez disso, são separadas umas das outras no genoma do tipo selvagem por al- gum outro material genético (que pode ser tão pequeno quanto um único par base). Entre elas, estas seqüências não contí- nuas podem incluir pelo menos uma porção da região de codi- ficação do gene e/ou suas regiões promotoras e terminadoras. Prefere-se que uma das seqüências inclua uma região flanque- adora 5' do gene L- ou D-Iactato:ferricitocromo c oxidoredu- tase (incluindo toda ou uma porção da região promotora e to- da ou uma porção da seqüência de codificação de L- ou D- lactatorferricitocromo c oxidoredutase), e que as outras se- qüências incluam uma região flanqueadora 3' do gene L- ou D- lactatorferricitocromo c oxidoredutase (incluindo toda ou uma porção da região terminadora e/ou toda ou uma porção da seqüência de codificação de o L- ou D-Iactatorferricitocromo c oxidoredutase). As seqüências não continuas podem ser clo- nadas separadamente. Alternativamente, toda a região, inclu- indo os f lanços 5' e 3' e o gene L- ou D- lactatorferricitocromo c oxidoredutase podem ser clonados com deleção subseqüente de pelo menos parte do gene para torná-los não funcionais. As seqüências não continuas podem incluir toda ou uma porção das regiões promotoras e termina- doras de L-ou D-Iactatorferricitocromo c oxidoredutase, res- pectivamente. Uma construção de deleção é em seguida produ- zida contendo as duas seqüências não continuas orientadas na mesma direção, e a construção é usada para transformar a cé- lula hospedeira. A construção inserida no locus do gene L- ou D-Iactatorferricitocromo c oxidoredutase em algum dos transformantes. Um evento de recombinação duplo cruzado ho- mólogo resulta em uma deleção do gene funcional L- ou D- lactatorferricitocromo c oxidoredutase em algum de o trans- formantes. Transformantes bem sucedidos podem ser (1) sele- cionados pela resistência ao ácido glicólico (no caso de uma ruptura ou deleção do gene L-Iactato:ferricitocromo c oxido- redutase) ou (2) classificados pela falta de capacidade de crescer no lactato como uma única fonte de carbono ou com base nas características transmitidas para a célula através do uso de um marcador de seleção da maneira descrita mais completamente a seguir. Alternativamente, classificação pode ser realizada por PCR. Análise de PCR ou Southern pode ser usada para confirmar se ocorreu a deleção desejada.

A construção de deleção de L- ou D- lactato:ferricitocromo c oxidoredutase pode também incluir um ou mais genes estruturais funcionais, notavelmente um cassete do gene LDH, inserido a jusante das porções flan- queadoras 5' do gene L- ou D-Iactato:ferricitocromo c oxido- redutase e a montante da porção flanqueadora 3' do gene L- ou D-Iactato:ferricitocromo c oxidòredutase. Esta abordagem permite que a inserção do gene estrutural no locus do gene L- ou D-Iactato: ferricitocromo c oxidoredutase. Em um caso preferido, o gene estrutural é um cassete do gene LDH', em cujo caso deleção do gene L- ou D-Iactato: ferricitocromo c oxidoredutase e inserção do cassete do gene LDH no locus do gene L- ou D-Iactatorferricitocromo c oxidoredutase pode ser realizado em uma etapa de transformação única. Transforman- tes bem sucedidos podem ser identificados por métodos de hi- bridização PCR ou Southern, ou detectando a atividade do ge- ne estrutural inserido usando qualquer método de ensaio con- veniente. No caso onde gene estrutural é um gene LDHr trans- formantes bem sucedidos podem ser identificados por sua ca- pacidade de produzir ácido lático. Transformantes em que um gene L-Iactato:ferricitocromo c oxidoredutase deletado u in- terrompido pode ser selecionado com base nas sua resistência ao ácido glicólico.

A construção de deleção de L- ou D- lactato:ferricitocromo c oxidoredutase pode também incluir um gene marcador de seleção em vez de ou em adição ao gene estrutural. O uso de um gene marcador de seleção tem a van- tagem de introduzir um meio adicional de selecionar trans- formantes bem sucedidos, mas não é exigido·. Um "gene marca- dor de seleção" é um gene que codifica uma proteína necessá- ria para a sobrevivência e/ou crescimento da célula trans- formada em um meio de cultura seletivo. Genes marcadores de seleção típicos codificam proteínas que (a) conferem resis- tência a antibióticos ou outras toxinas, (tal como zeocina (Streptoalloteichus hindustanus gene resistente a ble ble- omicina), G418 (gene resistente a canamicina de Tn903) ou higromicina (gene resistente a antibiótico aminoglicosídeo de E. coli)) , (b) complementar deficiências auxotrófica da célula (tal como deficiência leucina no aminoácido (gene K. marxianus LEU2) ou deficiência de uracila (por exemplo, ge- ne K marxianus ou S. cerevisiae URA3)), (c) permite que a célula sintetize nutrientes críticos não disponíveis no meio simples ou (d) confere a capacidade da célula de crescer em uma fonte de carbono particular, (tais como os genes MELl ou MEL5 de S. cerevisiae, que confere a capacidade de crescer na melibiose como uma única fonte de carbono. Marcadores de seleção preferidos incluem o gene resistente, a zeocina, gene resistente a G418, um genes MELl e MEL5 e gene resistente a higromicina (hph) .

O cassete marcador de seleção incluirá adicional- mente seqüências promotoras e terminadoras, operacionalmente ligadas ao gene marcador de seleção, e que são operáveis na célula hospedeira. Promotores adequados incluem aqueles des- critos anteriormente com relação ao gene LDH, bem como ou- tros, tais como os que estão descritos em WO 99114335, WO 00171738, WO 02142471, WO 03/102201, WO 03/102152 e WO 031049525. Um promotor especialmente preferido é um promotor TEFlf PGK ou PDCl (ou porção funcional destes) de uma espé- cie de levedura, especialmente a cepa hospedeira, ou uma se- qüência que é pelo menos 80, 85, 90 ou 95 % homóloga a um promotor TEFlf PGK ou PDCl como esse. Terminadores adequados incluem aqueles descritos anteriormente com relação a genes LDH.

O gene marcador de seleção é similarmente posicio- nado na construção a jusante da porção flanqueadora 5' do gene L- ou D-Iactato:ferricitocromo c oxidoredutase e a mon- tante da porção flanqueadora 3' do gene L- ou D- lactatorferricitocromo c oxidoredutase. Em uma porção da cé- lula transformada com esta construção, um evento de recombi- nação homóloga faz com que o marcador de seleção cassete (e cassete de gene estrutural, se presente) torne-se integrado no locus do gene CYB2 ou DLDl respectivamente. Transfor- mantes bem sucedidos podem ser selecionados com base nas ca- racterísticas transmitidas a eles pelo gene marcador de se- leção. Transformantes em que o gene L-Iactato:ferricitocromo c oxidoredutase torna-se deletado ou interrompido pode ser selecionado com base na sua resistência ao ácido glicólico e/ou classificado por sua incapacidade de crescer no lactato como uma única fonte de carbono, métodos de análise PCR e Southern podem ser usados como antes para caracterizar os transformantes.

Métodos para transformar cepas de levedura para inserir um gene LDH exógeno são descrito em WO 99114335, WO 00171738, WO 02142471, WO 03/102201, WO 03/102152 e WO 031049525; estes métodos são geralmente aplicáveis para transformar célula de acordo com esta invenção. As constru- ções podem tanto ser cortadas com enzimas de restrição parti- culares, usadas como DNA circular, quanto usadas como o gaba- rito para gerar um produto PCR.

Construções para inserção visada do cassete do ge- ne LDH no locus do gene da célula hospedeira L- ou D- lactato:ferricitocromo c oxidoredutase (com simultânea dele- ção do gene L- ou D-lactato:ferricitocromo c oxidoredutase) são descritas anteriormente. Quando não se' deseja inserir o cassete do gene LDH no. locus do gene L- ou D- lactato:ferricitocromo c oxidoredutase, vetores projetados de forma diferente são usados.

Geralmente, um gene LDH exógeno é inserido prepa- rando uma construção que contém o cassete do gene LDH (isto é o gene estrutural e seqüências promotoras e terminadoras associadas) . A construção pode conter sítios de restrição de vários tipos para linearização ou fragmentação. A construção pode conter adicionalmente uma porção espinha da dorsal (tal como para propagação em. E. coli) , muitas das quais são con- venientemente obtidas a partir de levedura ou vetores bacte- rianos comercialmente disponíveis.

A construção de inserção de LDH preferivelmente contém um ou mais cassetes de gene marcador de seleção. In- tegração visada do cassete do gene LDH pode ser realizada criando uma construção tendo as seqüências não contínuas que são homólogas aos flancos a montante (5'-) e a jusante (3'-) de um gene visado. Essas regiões não contínuas têm cada qual adequadamente a partir de cerca de 50 a 3.000 bp em compri- mento, especialmente cerca de 200-2.000 bp em comprimento. Qualquer uma ou ambas dessas seqüências não contínuas pode incluir uma porção da região de codificação do gene visado bem como uma porção ou toda as regiões promotoras ou termi- nadoras respectivas. O cassete do gene LDH é arranjado na construção entre as duas seqüências não contínuas. Um gene visado preferido (sem ser gene L- ou D- lactato:ferricitocromo c oxidoredutase) é um gene piruvato decarboxilato (PDC), como a célula da invenção preferivel- mente tem um ruptura ou deleção de pelo menos um gene(s) PDC nativo(s). Conseqüentemente, seqüências não contínuas prefe- ridas são tomadas a partir do locus de um gene PDC nativo. Entretanto, outros genes nativos podem servir como alvos pa- ra inserção do cassete do gene LDH, usando as seqüências não contínuas a partir do locus do gene visado na construção de inserção de LDH de uma forma análoga.

O cassete LDH (incluindo promotores e terminadores associados, se diferentes daqueles do gene visado) e marca- dor(s) de seleção (com promotores e terminadores associados, conforme possa ser necessário) residirá na construção de inserção de LDH entre as regiões que são homólogas aos flancos a montante e a jusante do gene visado, a jusante do flanço homólogo 5' e a montante do flanço homólogo 3'.

Se for usado um cassete marcador de seleção, ele similarmente reside no vetor entre as duas seqüências não continuas tomadas a partir do locus do gene visado, da ma- neira supradescrita.

Uma porção de células transformadas com esta cons- trução passará por um evento de recombinação homóloga em que o gene visado é deletado ou interrompido, e o cassete LDH (e cassete marcador de seleção, se presente) é integrado no locus do gene visado. No caso preferido em que o gene visado é um gene PDCr os transformantes terão uma deleção ou rup- tura do gene PDC. Transformantes bem sucedidos podem ser selecionados de uma maneira conhecida, usando abordagens da maneira descrita anteriormente.

Quando a inserção de LDH e a deleção ou ruptura do gene L- ou D-Iactato:ferricitocromo c oxidoredutase são fei- tos seqüencialmente, as etapas podem ser conduzidas em qual- quer ordem, isto é, a deleção do gene L- ou D- lactato:ferricitocromo c oxidoredutase pode ser realizada primeiro, seguido pela inserção de LDH, ou a inserção de LDH pode ser realizada primeiro, seguida pela deleção ou ruptura do gene L- ou D-Iactato:ferricitocromo c oxidoredutase.

Quando um gene L-Iactatorferricitocromo c oxidore- dutase é deletado primeiro, torna-se possível usar o gene L- lactato:ferricitocromo c oxidoredutase em si como um marca- dor de seleção durante a inserção de LDH e/ou outras trans- formações subseqüentes. Em cada um dos casos o vetor de transformação LDH inclui um cassete do gene L- lactatorferricitocromo c oxidoredutase, em que gene o L- lactato:ferricitocromo c ôxidoredutase é operacionalmente ligado a uma seqüência promotora e terminadora e terminado- ra. O cassete do gene L-Iactato:ferricitocromo c oxidoredu- tase é localizado na vetor de inserção de LDH entre as se- qüências não continuas a partir do locus do gene visado. Uma porção dos transformantes conterão tanto o cassete LDH quan- to o cassete de L-Iactato:ferricitocromo c oxidoredutase no locus do gene visado (que neste caso é pref erivelmente um gene PDC ou outro gene que é desejavelmente deletado ou in- terrompido). Transformantes bem sucedidos podem ser selecio- nados com base na sua capacidade de crescer em lactato como uma única fonte de carbono, ou por outros métodos da maneira descrita anteriormente.

Caso queira usar o gene L-Iactatorferricitocromo c oxidoredutase como um gene marcador de seleção uma segunda vez de acordo com esta invenção, é necessário que o primeiro gene marcador L-Iactatorferricitocromo c oxidoredutase sub- seqüentemente seja deletado ou interrompido. Uma maneira conveniente de realizar isto é projetar uma construção de maneira que o cassete do gene L-Iactatorferricitocromo c oxi- doredutase seja flanqueado pelas seqüências repetitivas di- retas. Seqüências repetitivas diretas são seqüências de DNA idênticas, que podem ser nativas, mas preferivelmente não são nativas para a célula hospedeira, e que são orientadas na mesma direção com relação uma a outra na construção. As seqüências repetitivas diretas são vantajosamente cerca de 50-1.500 bp em comprimento. Não é necessário que as seqüên- cias repetitivas diretas codifiquem para qualquer coisa. Em um pequeno número de transformantes, esta construção permite que ocorra um evento de recombinação homóloga, resultando em uma deleção do gene marcador L-Iactato:ferricitocromo c oxi- doredutase e uma das seqüências repetitivas diretas. É nor- malmente necessário crescer transformantes no não meio sele- tivo para permitir que ocorra a recombinação homóloga espon- tânea entre as seqüências repetitivas diretas. Também como antes, célula em que o gene L-Iactato:ferricitocromo c oxi- doredutase foi deletado pode ser selecionada com base nas sua resistência a ácido glicólico ou classificada usando sua in- capacidade de crescer em lactato como uma única fonte de carbono.

Prefere-se deletar ou interromper um gene PDC na- tivo na célula hospedeira, de maneira que a célula transfor- mada tenha uma capacidade reduzida para produzir etanol. Se a célula hospedeira contiver múltiplos genes PDCr prefere- se especialmente deletar ou interromper todos os genes PDCr embora seja possível deletar menos do que todos tais genes PDC. Deleção de PDC pode ser realizada usando métodos aná- logos àqueles descritos em WO 99114335, WO 021424 71, WO 031049525, WO 03/102152 e WO 031102201. Deleção de PDC pode também ser realizada com inserção simultânea de um cassete do gene LDH ou outro estrutural ou cassete do gene marcador de seleção. Em um método de interesse particular (1) seqüên- cias não continuas a partir do locus do(s) gene(s) PDC são clonados, de modo opcional juntamente com uma porção do gene PDC funcional; (2) uma construção contendo as seqüências não continuas é produzida (de modo opcional contendo uma porção não funcional do gene PDC estrutural), e (3) a célula hospe- deira é transformada com a construção. Um evento de recombi- nação homóloga resulta em uma deleção ou ruptura do gene PDC funcional em uma porção dos transformantes. Isto pode ser repetido se necessário para deletar.ou interromper múltiplos genes PDC. Em alguma espécie de levedura, tal como I. orien- talis, existem múltiplos genes PDC ou alelos que são bastante homólogos. Observou-se que, em tais casos, seqüências não continuas tomadas a partir do locus de qualquer gene podem ser usadas na construção para deletar ou interromper ambos os genes PDC. A construção usada para interromper o(s) gene(s) PDC pode incluir um ou mais funcional genes estruturais in- seridos a jusante da porção flanqueadora 5' do gene PDC na- tivo e a montante das porções flanqueadoras 3' do gene PDC nativo. o gene estrutural preferivelmente é parte de um cas- sete que inclui seqüências promotoras e terminadoras funcio- nais operacionalmente ligadas ao gene estrutural. Esta abor- dagem permite a deleção do gene PDC e inserção do gene fun- cional cassete em uma etapa de transformação única. A cons- trução pode incluir um cassete do gene marcador de seleção em substituição, ou em adição ao gene estrutural. Novamente, o cassete do gene marcador de seleção é posicionado no vetor como antes, entre as seqüências não continuas tomadas a par- tir do locus do gene PDC sendo visadas, e foi inserido no locus do gene PDC funcional em uma porção de transformantes.

Métodos adequados para inserir um gene de xilose isomerase funcional, deletar ou interromper um gene nativo que produz uma enzima que catalisa a conversão de xilose em xilitol, deletar ou interromper um gene de xilitol deidroge- nase funcional, modificar a célula que sobreexpressa um xi- luloquinase funcional são descritos, por exemplo, em WO 04/099381, aqui incorporados pela referência.

No processo de fermentação da invenção, a célula da invenção é cultivada em um meio de fermentação que inclui um açúcar que é fermentável pela célula transformada. O açú- car pode ser um açúcar hexose tais como glicose, glicano ou outro polímero de glicose, oligômeros de glicose tais como maltose, maltotriose e isomaltotriose, panose, frutose, e oligômeros de frutose. Se a célula de forma nativa tiver ca- pacidade ou for modificada para conferir a fermentação de açúcares de pentose, o meio de fermentação pode incluir um açúcar de pentose tal como xilose, xilano ou outro oligômero de xilose. Tais açúcares de pentose são adequadamente hidro- lisados de uma biomassa contendo hemicelulose. No caso de a- çucares oligoméricos, pode ser necessário adicionar enzimas aò caldo de fermentação a fim de digeri-los com o açúcar mo- nomérico correspondente para fermentação pela célula.

O meio tipicamente conterá nutrientes exigidos pe- la célula particular, incluindo uma fonte de nitrogênio (tal como aminoácidos, proteínas, fontes de nitrogênio inorgânico tal como sais de amônia ou amônio, e similares) , e várias vitaminas, minerais e similares.

Outras condições de fermentação, tais como tempe- ratura, densidade celular, seleção de substrato(s), seleção de nutrientes, e similares não são considerados críticos pa- ra a invenção e são geralmente selecionados para fornecer um processo econômico. Temperaturas durante cada fase de cres- cimento e a fase de produção podem variar acima da tempera- tura de congelamento do meio até cerca de 50 °C, embora isto dependa até certo ponto da capacidade da cepa de tolerar temperaturas elevadas. Uma temperatura preferida, particu- larmente durante a fase de produção, é cerca de 30-45 °C.

Durante a fase de produção, a concentração da cé- lula no meio de fermentação é tipicamente na faixa de cerca de 0,1-20, preferivelmente cerca de 0,1-5, ainda mais prefe- rivelmente cerca de 1-3 g células secas/litro do meio de fermentação.

A fermentação pode ser conduzida aerobicamente, microaerobicamente ou anaerobicamente. Se desejado, a taxa de captação de oxigênio pode ser usada como um controle do processo, da maneira descrita em WO 03/102200. A célula da invenção apresenta uma boa capacidade de fermentar açúcares no ácido lático ou misturas de ácido lático/etanol, em boas produtividades volumétricas e específicas ainda em condições anaeróbicas.

O meio pode ser tamponado durante a fase de produ- ção da fermentação de maneira que o pH é mantido em uma fai- xa de cerca de 3,5 a cerca de 9,0, tal como de cerca de 4,5 a cerca de 7,0. Agentes de tamponamento adequados são mate- riais básicos que neutralizam ácido lático a medida que ele é formado, e incluem, por exemplo, hidróxido de cálcio, car- bonato de cálcio, hidróxido de sódio, hidróxido de potássio, carbonato de potássio, carbonato de sódio, carbonato de amô- nio, amônia, hidróxido de amônio e similares. De um modo ge- ral, aqueles agentes de tamponamento que foram usados em processos de fermentação convencionais também são adequados aqui.

Em uma fermentação tamponada, produtos de fermen- tação ácidos tal como ácido lático são neutralizados a medi- da que eles são formados no sal de lactato correspondente. Recuperação do ácido envolve então regenerar o ácido livre. Isto é feito tipicamente removendo a célula e acidulando o caldo de fermentação com um ácido forte tal como ácido sul- fúrico. Um subproduto do sal é formado (gesso no caso onde um sal de cálcio é o agente neutralizante e ácido sulfúrico é o agente acidulante) ,' que é separado a partir do ácido. 0 ácido é em seguida recuperado através de técnicas tal como extração liquido-liquido, destilação, absorção, etc., tal como são descritos em T.B. Vickroy, Vol. 3, Chapter 38 of Comprehensive Biotechnology, (ed. M. Moo-Young), Pergamon, Oxford, 1985; R. Datta, et al., FEMS Microbiol. Rev., 1995, 16:221-231; patentes U.S. nos. 4.275.234, 4.771.001, 5.132.456, 5.420.304, 5.510.526, 5.641.406 e 5.831.122 e WO 93/00440.

Prefere-se, entretanto, permitir que o pH do meio de fermentação goteje de um pH de partida que é tipicamente 5,5 ou mais, para o pKa acima do produto de fermentação do ácido, tal como na faixa de cerca de 1,5 a cerca de 3,5, na faixa de cerca de 1,5 a cerca de 3,0, ou na faixa de cerca de 1,5 a cerca de 2,5. A célula desta invenção tem uma capa- cidade inesperada de crescer e produzir bem, mesmo no meio de fermentação não tamponado onde o pH final cai abaixo de 3,5, abaixo de 3,0, abaixo de 2,5, e ainda abaixo de 2,0.

É também possível conduzir a fermentação mantendo o pH no pKa do ácido lático ou abaixo dele por todo o pro- cesso. Em um caso como este, o pH do caldo de fermentação é ajustado até o pKa de ácido lático ou abaixo dele antes do início do processo de fermentação ou nele, e mantido em tal nível como a fermentação procede. Nesta modalidade, o pH é preferivelmente mantido na faixa de cerca de 1,5 a cerca de 3,5, na faixa de cerca de 1,5 a cerca de 3,0, ou na faixa de cerca de 1,5 a cerca de 2,5.

Recuperação de ácido lático a partir de um meio de fermentação de baixo pH pode ser conduzida usando métodos tais como aqueles descritos em na patente U.S. 6.229.046.

O processo da invenção pode ser conduzido continu- amente, em lotes, ou em alguma combinação destes.

A deleção ou ruptura do gene L- ou D- lactato:ferricitocromo c oxidoredutase, como pode ser o ca- so, pode levar a diversos benefícios. Tituladores de ácido lático são freqüentemente melhorados. Isto é observado espe- cialmente quando a célula hospedeira é uma cepa de Kluyue- romyces, tal como Kluyveroniyces marxianus. Rendimentos de lactato bem como taxas de produção de lactato são igualmente aumentadas, comparado com cepas similares que não têm a de- leção de L-Iactato:ferricitocromo c oxidoredutase. Novamen- te, isto é especialmente observado em cepa de Kluyueromyces modificada. Uma vantagem adicional é que baixa produção de piruvato é observada.

Os exemplos seguintes são fornecidos para ilustrar a invenção, mas não são destinados a limitar seu escopo. To- das as partes e porcentagens são em peso, a menos que de ou- tra forma indicada.

Exemplo IA: Mutagênese de cepa CD607 de K. marxia- nus e seleção de cepa mutante (CD635) tendo resistência ao ácido glicólico.

Cepa CD607 de K. marxianus é descrita no Exemplo 3D de WO 031102152. Esta cepa tem uma deleção de seu gene I piruvato descarboxilase e uma inserção de um gene de lactato deidrogenase exógeno neste locus. Célula de cepa CD607 são submetidas a mutagênese por meio de exposição a luz ultravio- leta ou metanossulfonato de etila, de acordo com o seguintes protocolos:

Mutagênese UV

Células de uma placa YPD fresca (Difco #0427-17,

Sparks, MD, contendo extrato de levedura 10 g/L, peptona 20 g/L, dextrose 20 g/L e ágar 15 g/L) são ré-suspensas em 2 mL de peptona de levedura + e mais 50 g/L de glicose para um OD6oo aproximado de 6. Dez alíquotas de 125 μL desta suspen- são da célula são pipetadas em dez poços de um placa micro- tituladora de 96 poços de 300 μL. A placa microtituladora é exposta a 12.500 pJoule/cm2 de luz UV até 90-99 % de morte da célula. Duas alíquotas 125 pL adicionais da suspensão da célula são em seguida adicionadas à placa microtituladora como controles tratados simulados. As suspensões da célula de um dos doze poços são transferidas para tubos de microfu- ga de 1,5 mL. Os doze tubos de microfuga são em seguida in- cubados no escuro por toda a noite a 30 0C com agitação (225 rpm) para permitir que a célula se recupere antes de plaque- amento em placas de seleção.

Alíquotas de 100 yL de nove das suspensões da cé- lula tratadas por UV e de uma das suspensões da célula tra- tada simulada são em seguida plaqueadas em uma placa de ágar de dextrose de batata (PDA, Difco Laboratories, Cat. No. 0013-17, Sparks,, MD) + 15 g/L de ácido glicólico para sele- cionar cepas resistentes a ácido glicólico. Estas placas são incubadas a 30 0C por diversos dias até aparecerem colônias. Uma colônia única é isolada de cada uma das nove placas para análise posterior. Mutagênese EMS

Células de uma placa YPD fresca são ré-suspensas em 2 mL de salina tamponada com fosfato com um Οϋεοο aproxi- mado de 6. Doze alíquotas de 200 yL desta suspensão da célula são pipetadas em doze tubos com tampa de pressão de 14 mL, e 4 pL de metanossulfonato de etila (EMS, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, catalog # M0880, 1,17 g/mL de solução) são a- dicionados a dez dos doze tubos. Os dois tubos restantes servem como controles tratados simulados. Os tubos são em seguida incubados a 30 0C com agitação (225 rpm) por 30 minu- tos, novamente até 90-99 % de morte da célula. Depois da ex- posição a EMS, as células dos doze tubos são precipitadas, lavadas duas vezes com Na2S203 5,0 % para neutralizar o EMS e lavadas uma vez com água. As células são ré-suspensas em 100 μL; de meio YPD e incubadas por 6 horas a 30 0C com agi- tação (225 rpm) para permitir que a célula se recupere antes de plaqueamento em placas de seleção.

Após a recuperação, 100 uL de nove das suspensões da célula tratadas com EMS e de uma das suspensões da célula tratada simulada são plaqueadas em uma placa PDA + 15 g/L de ácido glicólico para selecionar a resistência ao ácido gli- cólico. Estas placas são incubadas a 30 0C por diversos dias até aparecerem colônias. Uma colônia única é isolada para análise posterior.

Classificação da célula mutagenizada é feita como a seguir. Aproximadamente 2 X IO8 células que foram mutage- nizadas em um dos processos apenas descritos são plaqueadas em (PDA) placas contendo 15 g/L de ácido glicólico e incuba- das a 30 °C. Colônias que crescem nestas placas crescem por toda a noite em frascos de agitação defletidos a 30 0C e agi- tação 225 rpm em YP (extrato de levedura 10 g/L, peptona 20 g/L) + 100 g/L de glicose sem tampão. Frascos de produção são em seguida inoculados com 2 g/L de peso seco de célula desses frascos de agitação. Os frascos de produção são cul- tivados a 30 0C e 70 rpm agitação em YP + 50 g/L de glicose. Amostras são extraídas periodicamente para medir glicose, lactato, etanol e piruvato por HPLC usando métodos tal como descrito no Exemplo IM de WO 03/102201.

Uma cepa é designada cepa CD635. Cepa CD635 resul- ta do tratamento mutagênese UV descrito anteriormente. Cepa CD635 produz cerca de 13 g/L de lactato após 88 horas, com- parado com menos que 9 g/L para a cepa pai, CD607. Cepa CD635 consome levemente mais glicose do que a cepa CD607 du- rante este período de tempo, e obtém um rendimento signifi- cativamente maior com lactato. Cepa CD635 é capaz de crescer no lactato como uma única fonte de carbono.

Exemplo 1B: Mutagênese adicional de cepa CD635 K. marxianus e seleção de cepas mutantes (CD832, CD839, CD840, CD841, CD850, CD851 e CD853) tendo resistência ao ácido glicólico.

Células de cepa CD635 (Exemplo IA) são submetidas a mutagênese usando os métodos descritos no Exemplo IA, com a célula mutagenizada resultante sendo selecionada das colô- nias que são capazes de crescer em PDA contendo 25 g/L de ácido glicólico. A partir de um total de 23 eventos mutagê- neses, aproximadamente 5,9 X 10^9 célula são plaqueadas, das quais diversas colônias são produzidas que são resistentes ao ácido glicólico. Algumas dessas colônias resultam da mu- tagênese com EMS, outras resultam da mutagênese com luz UV, e ainda outras resultam de mutações espontâneas.

As colônias resistentes a ácido glicólico crescem separadamente por toda a noite em YB + 100 g/L de glicose em frascos de agitação a 30 0C e agitação a 250 rpm. Biomassa é coletada por centrifugação e 2 g/L de peso seco de célula são inoculados em 50 mL de YP + 50 g/L de glicose em um frasco de agitação defletido. Os frascos são cultivados a 30 °C e agitados a 250 rpm por Aproximadamente 92 horas. Sete mutantes que produzem tituladores de lactato finais signifi- cativamente maiores, comparado com cepas pai CD607 e CD635, são designados como cepas, CD832, CD839, CD840, CD841, CD850, CD851 e CD853.

Cepas CD832, CD839, CD840, CD841, CD850, CD851 e CD853 são incapazes de crescer em lactato como uma única fonte de carbono, indicando que o gene Km CYB2 tornou-se não funcional nestes mutantes. Então, o região de codifica- ção KmCYB2 mais «=500 bp e a jusante da região de codificação KmCYB2 é separadamente amplificado para cada uma dessas ce- pas usando PCR com enzima FailSafe de alta fidelidade e DNA genômico como o gabarito. Os produtos de PCR -2,75 kbp re- sultantes são purificados por meio de purificação de coluna Qiagen e seqüenciada em toda a região de codificação KmCYB2.

Cepa CD635 pode crescer em lactato como uma única fonte de carbono, que indicada que ela contém um gene KmYB2 funcional. Seqüenciamento do gene CYB2 a partir de CD635 confirma que ele tem a seqüência CYB2 tipo selvagem. A se- qüência de DNA do gene KmCYB2 de cepa CD635 é dada como SEQ. ID. NO. 1. A seqüência de aminoácidos da proteína codificada por esse gene CYB2 é dada como SEQ. ID. NO. 2.

Cepas CD832, CD839, CD840, CD841, CD850, CD851 e CD853 todas não têm a capacidade de crescer em lactato como uma única fonte de carbono, e têm uma resistência maior ao ácido gli- cólico comparado com a cepa CD607. Cada uma dessas caracte- rísticas indica que estas cepas faltam um gene KmCYB2 fun- cional. As seqüências de DNA nas regiões de codificação de Km CYB para estas cepas em cada caso apresentam mutações na porção de codificação do gene KmCYB2, comparado com o gene KmCYB2 de cepa CD635, que tem a seqüência CYB2 tipo selva- gem. Seqüência de aminoácidos para as enzimas produzidas por estas regiões de codificação também apresentam diferenças. As diferenças no DNA e seqüência de aminoácidos são:

Cepa CD832: uma .mutação de ponto na posição do a- minoácido 457 causa uma mutação sem sentido, mudando uma ar- ginina para um códon de parada. Esta mutação trunca a prote- ína em 135 aminoácidos.

Cepas CD839: uma mutação de ponto na posição do aminoácido 272 causa uma mutação de sentido incorreto, mu- dando uma prolina para uma treonina.

Cepa CD840: uma mutação de ponto na posição do aminoácido 222 causa uma mutação sem sentido, mudando um triptofano para um códon de parada. Esta mutação trunca a proteína em 370 aminoácidos.

Cepa CD841: uma mutação de ponto na posição do aminoácido 147 muda uma histidina para uma tirosina.

Cepa CD850: uma mutação de ponto duplo na posição do aminoácido 309 muda uma serina para uma fenilalanina.

Cepa CD851: uma deleção de dois pares base no par base 219 (posição do aminoácido 74) causa uma mutação por deslocamento do quadro de leitura, resultando em um códon de parada na posição do aminoácido 7 6 e truncando a proteína.

Cepa CD853: uma inserção de quarto de bases na posição do aminoácido 62 causa uma mutação por deslocamento do quadro de leitura, resultando em um códon de parada na posição do aminoácido 76 e truncando a proteína. Exemplo 2A: Construção de um plasmídeo (pMM22, Fig. 1) con- tendo um cassete do gene resistente G418 entre as regiões flanqueadoras 5' e 3' do gene Κ. marxianus CYB2.

O gene K. marxianus L-Iactatorferricitocromo c oxidoredutase (KmCYB2) região de codificação do gene é i- dentificado dentro da seqüência de DNA genômica de uma cepa tipo selvagem de K. marxianus (designada CD21, ATCC 52486) comparando homologia com a homologia conhecida do gene S. cerevisiae L-Iactato:ferricitocromo c oxidoredutase. Uma região flanqueadora « 2kbp diretamente 5' da região de co- dificação KmCYB2 é amplificada, com introdução de sítios de restrição MluI e PstI, por PCR usando iniciadores identifi- cados como SEQ. ID. NO. 3 e SEQ. ID. NO. 4 e DNA genômico como o gabarito. Similarmente, uma região flanqueadora - 2kbp diretamente 3' da região de codificação CYB2 é ampli- ficada com introdução de sítios de restrição ApaI e NgoMIV por PCR usando iniciadores identificados como SEQ. ID. NO. 5 e SEQ. ID. NO. 6 e DNA genômico como o gabarito.

Um plasmídeo designado pVR29 (descrito no Exemplo IC e Figura 4 de WO 031102152) é digerido com MluI e PstI e o flanço KmCYB2 5' é ligado com o fragmento resultante para produzir um plasmídeo designado como pMM21. Plasmídeo pMM21 contém o flanco KmCYB2 5' a montante de um cassete do gene resistente a G418.

Plasmídeo pMM21 é digerido com ApaI e NgoMIV e o fragmento resultante é ligado com o 3' KmCYB2 flanco para produzir um plasmídeo designado pMM22 (figura 1). Plasmídeo pMM22 contém o flanco KmCYB2 5' a montante do cassete do gene resistente a G418, e o flanco KmCYB2 3' a jusante do cassete do gene resistente a G418. Exemplo 2B: Geração de um mutante K. marixanus (CD936) com um gene LDH integrado, gene PDC deletado e gene KmCYB2 de- letado transformando a cepa CD607 K. marxianus com plasmi- deo pMM22 (figura 1, Ex. 2A).

Uma colônia K. marxianus correspondente a CD607 (ver Ex. IA) é cultivada e 20 mL de células são centrifuga- das. Plasmideo pMM22 é digerido com NheI e NaeI (ambas as quais cortadas nos flancos KmCYB2 no plasmideo) e o fragmen- tos resultantes são usados para transformar cepa CD607 K. marxianus usando métodos de eletroporação padrões. Trans- formantes são selecionados com base na resistência a G418.

Transformantes selecionados são classificadas no nitrogênio levedura base (YNB) + placas de lactato 1 % e YNB (Nitrogênio levedura base 6,7 g/L, Difco Laboratories, Sparks MD, Cat. No. 0392-15) + glicose 1 %." Transformantes que apresentam crescimento reduzido no meio de lactato são selecionados. Estes transformantes são classificados usando um PCR de colônia de dentro para fora usando iniciadores de- signados como SEQ. ID. NO. 7 e SEQ. ID. NO. 8. 0 iniciador 5' é posicionado no f lanço 5' CYB2 fora da homologia da construção de ruptura e o iniciador 3' é posicionado dentro do cassete G418. Cada um dos transformantes selecionados a- presenta uma inserção do cassete G418 no locus KmCYB2. DNA genômico de quatro destes transformantes é isolado e análi- se PCR do locus KmCYB2 realizada usando iniciadores desig- nados como SEQ. ID. NO. 9 e SEQ. ID. NO 10. Estes iniciado- res são posicionados «=500 bp a montante e/ou a jusante da região de codificação CYB2 para assegurar amplificação completa do locus. Produtos de PCR tendo um tamanho maior com relação a região de codificação CYB2 nativa indicam a substituição do cassete G418 pelo gene CYB2 para cada um desses quatro transformantes. Um destes transformantes é designado como cepa CD936.

Exemplo 2C: Geração de um mutante K. marixanus (CD998) com um gene LDH integrado, gene PDC deletado e gene KmCYB2 deletado transformando cepa CD635 K. marxianus com plasmideo pMM22 (figura 1, Ex. 2A).

Células de cepa CD635 (Exemplo 1A) são transforma- das com plasmideo pMM22 de uma maneira geral descrito no E- xemplo 2B. Transformantes são selecionados com base na re- sistência a G418.

Transformantes selecionados são classificados em YNB + placas de lactato 1 % e + glicose 1 %. Todos os transformantes apresentaram crescimento reduzido no meio de lactato. Estes transformantes são classificados usando uma PCR de colônia de dentro para fora da maneira descrita no Exemplo 2B, e observou-se que 11 dos transformantes têm uma inserção do cassete G418 no locus KmCYB2. DNA genômico de quatro destes transformantes é isolado e análise PCR do lo- cus KmCYB2 realizado da maneira descrita no Exemplo 2B. Co- mo antes, os iniciadores são posicionados «500 bp a montan- te e/ou a jusante da região de codificação KmCYB2 para as- segurar amplificação completa do locus. Produtos de PCR ten- do um tamanho maior com relação a região de codificação KmCYB2 nativa indicam a substituição do cassete G418 pelo gene KmCYB2 para três desses quatro transformantes. Um des- ses três transformantes é designado como CD998. Exemplo 3A: Construção de um plasmideo (pMM28, Fig. 2) con- tendo o cassete do gene KmCYB2 entre seqüências repetitivas diretas de K. thermotolerans.

Todo o cassete do gene K. marxianus CYB2 (KmCYB2), incluindo regiões promotoras e terminadoras, é PCR amplificado do DNA genômico de uma cepa K. marxianus tipo selvagem designada como CD21, com introdução de sítios de restrição BamHI. e SalIr por PCR usando iniciadores iden- tifiçados como SEQ. ID. NO. 11 e SEQ. ID. NO. 12. O produto PCR é ligado a um vetor comercial designado como pUC18 (pe- la Invitrogen Corp., Carlsbad, CA USA) que é digerido com BamHI e SalI. 0 plasmideo resultante é designado como pMM25.

Uma seqüência de 705 bp identificada como SEQ. ID. NO. 13 é amplificada por PCR do DNA genômico de K. thermotolerans, com introdução de sítios de restrição SphI e SalIr usando iniciadores identificados como SEQ. ID. NO. 14 e SEQ. ID. NO. 15. Esta seqüência K. thermotolerans não codifica para qualquer proteína ativa. Plasmideo pMM25 é digerido com SphI e SalI e a seqüência K. thermotolerans é ligada a ele a montante (51) do cassete KmCYB2 para formar um plasmideo designado como pMM27.

Uma seqüência K. thermotolerans idêntica é ampli- ficado por PCR com adição de sítios de restrição BamHI e XmaIr usando iniciadores identificados como SEQ. ID. NO. 16 e SEQ. M. NO. 17. Plasmideo pMM2 7 é digerido com BamHI e XmaI e a seqüência K. thermotolerans é ligada a ele a ju- sante (31) do cassete KmCYB2 para formar um plasmideo desig- nado como pMM28 (figura 2). Plasmideo pMM28 contém o casse- - te KmCYB2 flanqueado pelas seqüências repetitivas diretas de K. thermotolerans, ambas orientadas na mesma direção. Exemplo 3B: construção de um plasmideo (pMM35, Fig. 3) con- tendo um cassete de expressão do gene MEL1 S. cerevisiae entre seqüência K. thermotolerans idênticas e entre regiões flanqueadoras 5' e 3' KmCYB2.

Um vetor designado como pNC16 é obtido a partir do National Research Energy Laboratories in Golden, Colora- do. Este plasmideo contém o gene MEL1 S. cerevisiae sob o controle do promotor PDCl S. cerevisiae e terminador S. ce- revisiae GALlO. O cassete do gene MEL1 é amplificado por PCR com adição de sitios de restrição BgIII e SalI usando iniciadores designados como SEQ. ID. NO. 18 e SEQ. ID. NO. 19. Plasmideo pMM28 (figura 2, Ex. 3A) é digerido com Ba- mHI e SalI e ligado com o cassete MEL1 . Isto deleta simul- taneamente o cassete KmCYB2 de plasmideo pMM28 e o substi- tui com o cassete MEL1. O plasmideo resultante é designado pMM31. Ele contém o cassete MEL1 flanqueado pelas seqüên- cias repetitivas diretas K. thermotolerans.

Uma região f lanqueadora = 2kbp diretamente 3' da região de codificação KmCYB2 é amplificada com introdução de sitios de restrição XmaI e SacI por PCR usando iniciadores identificados como SEQ. ID. NO. 20 e SEQ. ID. NO. 21 e DNA genômico como o gabarito. 0 fragmento resultante é ligado ao plasmideo pMM31 digerido por XmaI/SacI para inserir o flanco 3' CYB2 a jusante (3') da seqüência repetitiva dire- ta K. thermotolerans que é em si a jusante do cassete MEL1. O plasmideo resultante é designado como pMM32.

Uma região flanqueadora «=2kbp diretamente 5' da região de codificação KmCYB2 é amplificada com introdução de sítios de restrição AatII e NarI por PCR usando iniciadores identificados como SEQ. ID. NO. 22 e SEQ. ID. NO. 23 e DNA genômico como o gabarito. 0 fragmento resultante é ligado ao plasmideo pMM32 digerido por AatlI/NarI. 0 plasmideo re- sultante (designado pMM35, Fig. 3), contém, na ordem, a re- gião flanqueadora 5' KmCYB2, uma primeira seqüência repeti- tiva direta K. thermotolerans, o cassete MELlr a segunda seqüência repetitiva direta K. thermotolerans e a região flanqueadora 3' KmCYB2.

Exemplo 3C: Geração de um mutante K. marixanus (CD1287) com um gene KmCYB2 deletado transformando um cepa K. marxianus tipo selvagem com plasmideo pMM35.

Plasmideo pMM35 é digerido com BsmI e NheI e usa- do para transformar células de uma cepa K. marxianus do ti- po selvagem, usando métodos de eletroporação padrões. Transformantes são selecionados para crescimento plaqueando em YNS + melibiose 2%, com a adição de 32 mg/L XaGaI (5- bromo-4-cloro-3-indolil-beta-D-galactosídeo, LabScientific, Inc., Livingston, NJ, Cat. No. X-566). Todos os transfor- mantes cresceram neste meio são de cor azul. Eles são sub- seqüentemente marcados nas placas de melibiose para análise posterior. Os transformantes são classificados por recombi- nação homóloga no locus KmYB2 por meio de 51 de PCR de co- lônia dentro para fora usando iniciadores identificados como SEQ. M. NO. 7 e SEQ. ID. NO. 8. Colônias rendendo um produto de PCR positivo são isoladas duas vezes da colônia única em YNB + melibiose 2 % e 32 mg/L XaGal para eliminar contami- nação de fundo. DNA genômico é obtido a partir dessas ce- pas .

Todo o locus KmCYB2 é amplificado por meio de PCR usando iniciadores identificados como SEQ. ID. NO. 24 e SEQ. ID. NO. 25. Quatro colônias dão um produto de PCR como esperado para uma recombinação homóloga em KmYB2 resultando em uma inserção do cassete do gene MELl no locus KmCYB2. Uma dessas colônias é designada CD1286.

Cepa CD1286 é marcada em um meio não seletivo pa- ra duas rodadas e plaqueada por isolados de colônia única, para classificar para a saida do laço do cassete MELl. Três de Aproximadamente 1.300 colônias parecem ser brancas, indi- cando a ausência do gene MELl. DNA genômico é obtido a par- tir dessas três colônias, e PCR de todo o locus KmCYB2 é realizado, novamente usando iniciadores identificados como SEQ. ID. NO. 24 e SEQ. ID. NO. 25. Todas as três colônias dão o produto de PCR esperado para um evento da saida do laço, indicando que o cassete MELl foi deletado do.genoma da célula. Uma dessas cepas é designada CD1287.

Exemplo 4A: Construção de um plasmideo (pMM38, Fig. 5) con- tendo a região flanqueadora 5' KmPDCl, um cassete de ex- pressão do gene LDH L. helveticus, um cassete de expressão do gene KmCYB2 flanqueado pela seqüência K. thermotolerans repetitivas diretas, e a região flanqueadora 3' KmPDCl.

A região promotora de TEF2 a partir de uma cepa K marxianus tipo selvagem é amplificada com a adição de si- tios Kpnl/Xbal usando iniciadores identificados como SEQ. ID. NO. 26 e SEQ. ID. NO. 26, usando DNA genômico como o gabarito. A ligação subsegüente deste produto em um plasmí- deo designado pBH7 6 (figura 4) rende um plasmideo designado como pMM36. Plasmideo pMM36 contém, na ordem, a região flanqueadora 5' KmPDCl, o promotor KmTEF2, o gene LhLDH e o terminador ScGALlO. A região fianqueadora 3' KmPDCl é em seguida amplificada por PCR com adição de sítios Xmal/Pcil usando iniciadores identificados como SEQ. ID. NO. 28 e SEQ. ID. NO. 29 e DNA genômico como o gabarito. Este amplicon é ligado no plasmideo pMM28 (figura 2, Ex. 3A) cortando com Xmal/Pcil para render um plasmideo designado pMM37. A regi- ão KmPDCl e cassete de expressão LhLDH do plasmideo pMM36 são amplificados com a adição de sítios Narl/Ndel usando iniciadores designados como SEQ. ID. NO 30 e SEQ. ID. NO. 31, e esta região é ligada no pMM37 digerido por Narl/Ndel para produzir plasmideo pMM38 (figura 5) . Plasmideo pMM38 é designado para inserção visada de LhLDH e cassete de ex- pressão do genes KmCYB2 no PDCl locus K. marxianus. Exemplo 4B: Geração de um mutante K. marxianus (CD 1300) tendo um gene LDH exógeno, um gene PDC deletado e gene CYB2 que saiu do laço, transformando cepa CD1287 com plasmideo pMM38 (Fig 5, Ex. 4A).

Plasmideo' pMM38 é digerido com NdeI e usado para transformar cepa CD 1287, usando métodos de eletroporação padrões. Transformantes são selecionados para o crescimento em YNB +placas de lactato 2 %. Transformantes que crescem nas placas de lactato são marcados pelas placas de lactato e pelas placas YPD. Estes transformantes são classificados pa- ra uma recombinação homóloga no locus PDCl por meio de 3' PCR de dentro para fora usando iniciadores identificados co- mo SEQ. ID. NO. 32 e SEQ. ID. NO. 33. Transformantes renden- do um produto de PCR do tamanho esperado (2251 bp) são mar- cados para isolação de colônia única. DNA genômico de três isolados de colônia única de cada transformante positivo é obtido e o locus PDCl é amplificado por meio de PCR usando iniciadores identificados como SEQ. ID. NO. 34 e 35. Isola- dos dando o produto de PCR esperado (8453 bp vs. 3 730 bp pa- ra o locus PDC do tipo selvagem, indicando a perda do gene PDC e integração do gene LDH) são em seguida testados pelo fenótipo Pdc- avaliando se ele produz etanol. Uma das cepas que não produz etanol é designada cepa CD1298. Cepa CD1298 contém um gene PDC deletado, o cassete do gene LDH exógeno, e o cassete do gene CYB2 do plasmideo pMM38.

Cepa CD1298 é marcada no meio YPD não seletivo para três rodadas e um lama de célula é plaqueada em PDA + placas de ácido glicólico 7,5 g/L. Após 72 horas a 30 °C, colônias são selecionadas e classificadas por meio de PCR de colônia para uma saida do laço do gene KmCYB2, usando iniciadores identificados como SEQ. ID. NO. 36 e 37. Quatro colônias dão o tamanho correto do produto para uma saida do laço do gene CYB2 (1109 bp vs 5129 bp para o produto contendo o cassete CYB2) . Colônias únicas são isoladas de cada uma dessas qua- tro cepas. DNA genômico é obtido a partir de cada uma dessas colônias únicas e o locus PDCl é amplificado por meio de PCR usando iniciadores identificados como SEQ. ID. NO. 38 e 36. Duas cepas rendem um produto de PCR do tamanho esperado para uma saída do laço do cassete CYB2 (3249 bp vs 7269 bp para o produto contendo o cassete CYB2 e 2546 para o produto de PCR do tipo selvagem). Uma dessas duas cepas é designada como cepa CD 1300.

Exemplo 5A: Caracterizações de' frasco de agitação microaeróbico de cepas CD635 (Ex. IA) , CD853 (Ex. IA) e CD998 (Ex. 2C)

Cepas CD635, CD853 e CD998 são separadamente cul- tivadas em baixa densidade (0,05-0,10 0D600) e permitindo que a cultura produza produtos de fermentação enquanto que cresce. Vinte mL do meio (YP + dextrose 60 g/L) são pipeta- dos em um frasco de agitação defletido de 250 mL e o meio é inoculado com a quantidade exigida de biomassa. O frasco é em seguida incubado a 30 0C e orbitalmente agitado a 70 rpm por 92 horas, com amostras sendo retiradas (« a cada 24 ho- ras) durante o curso do experimento para testar para consumo de glicose, acúmulo de fermentação do produto, bem como cres- cimento de biomassa.

Após 92 horas de cultivo, a cepa CD635 (não um e- xemplo desta invenção) consumiu 17,6 g/L de glicose e produ- ziu 11,4 g/L de lactato. No mesmo período de tempo, cepa CD853 consome 26,9 g/L de glicose e produz 23,3 g/L de lac- tato, . levemente mais do que o dobro produzido pela cepa CD635. Cepa CD998 consome 21,9 g/L de glicose e produz 18,5 g/L de lactato, mais do que 60 % mais do que cepa CD635. Rendimento para lactato é «=65 % para cepa CD635, ao passo que rendimentos para cepas CD835 e CD998 são «86,6 % e «84,5 %, respectivamente.

Exemplo 5B: Avaliação de resistência ao ácido glicólico para cepas CD635 (Ex. IA), CD853 (Ex. IA) e CD998 (Ex. 2C) .

Placas PDA em duplicata são feitas contendo con- centrações entre 5 g/L através de 25 g/L de ácido glicólico. Placas de controle não contendo nenhum ácido glicólico são também preparadas. Uma série de diluição de cepas CD635, CD853 e CD998 é preparada, e 5 yL de cada diluição da série de diluição é pontuada em cada uma das placas anteriores. As placas inoculadas são cultivadas a 30 0C por três dias. Cepa CD635 comparativa cresce em placas contendo ácido glicólico até uma concentração de 15 g/L, mas falta crescer em qual- quer das placas contendo ácido glicólico com maior concen- tração. Cepa CD853 apresenta capacidade de crescer nas pla- cas contendo ácido glicólico até 25 g/L de ácido glicólico. Cepa CD998 pode crescer nas placas contendo até 22,5 g/L de ácido glicólico. Estes testes indicam que ácido glicólico pode ser usado como um meio seletivo para cepas mutantes tendo um gene CYB2 não funcional.

Exemplo 6: caracterizações de frasco de agitação microaeró- bicos de cepa CD607 comparativa (Ex. IA) , cepa CD936 (Ex. 2B) e cepa CD1300 (Ex. 3C).

Cepas CD607, CD936 e CD1300 são separadamente cul- tivadas nas condições descritas no Exemplo 5A. Após 93 horas de cultivo, cepa CD607 comparativa consumiu 16,5 g/kg de glicose e produziu 10,8 g/kg de lactato. No mesmo período de tempo cepa CD936 consome 21,6 g/kg de glicose e produz 19,3 g/kg de lactato, ligeiramente menos que o dobro produzido pela cepa CD607. Cepa CD1300 consome 29,9 g/kg de glicose e produz 24,6 g/kg de lactato, mais do que 125 % a mais que a cepa CD607. Rendimento para lactato é 65,5 % para cepa CD607, ao passo que rendimentos para cepas CD936 e CD1300 são 89,4 % e 82,3 %, respectivamente. A cepa CD607 também produz 2,02 g/kg de ácido pirúvico neste intervalo de tempo, ao passo que CD936 e CD1300 produzem 0,68 g/kg e 0,83 g/kg de ácido pirúvico respectivamente. Também neste intervalo de tempo, CD607 produz 0,67 g/kg de ácido acético em comparação com a produção de ácido acético tanto para CD936 quanto para CD1300.

O crescimento é também monitorado durante este ex- perimento. Após 93 horas, a cepa CD607 comparativa cresceu até um OD6OO de cerca de 5,7, ao passo que cepas CD936 e CD1300 cresceram até um 00600 de cerca de 7,5 e 3,2, respec- tivamente. O crescimento muito baixo de cepa CD1300 indica que a produtividade especifica desta cepa é muito maior do que da cepa CD607 comparativa e cepa CD936.

Exemplo 7A: Clonagem de região promotora I. orientalis PGK (IoPGKl); construção de um plasmideo (pMl318, Fig. 6) tendo o gene da higromicina de E. coli sob o controle do promotor IoPGKl e o terminador S. cerevisiae GAL10.

Um fragmento da sonda de 920 bp de o gene C. sono- rensis PGKl é obtido a partir do DNA genômico de C. sonoren- sis da mesma maneira descrita no Exemplo 22 de WO 02/042471, usando iniciadores identificados como SEQ. ID. NO. 39 e SEQ. ID. NO. 40. DNA genômico é isolado de um que cresce cepa I. orientalis e ré-suspenso em Tris-HCl 10 mM + EDTA 1 mM (pH 8) (TE). O DNA genômico I. orientalis é cortado com HindIIIr e um Southern blot é preparado e hibridizado usando métodos padrões com o gene C. sonorensis PGKl como uma sonda. Frag- mentos de tamanho «2 kbp são isolados do gel de agarose e clonados em um plasmideo cortado com HindIII. Hibridização de colônia dos Transformantes do E. coli com a Sonda PGKl resulta na isolação de um fragmento de HindIII contendo mais das seqüências de codificação de proteína I. orientalis PGKl (IoPGKl), mas nenhuma seqüências promotoras, conforme verificado pelo seqüenciamento.

Fragmentos genômicos contendo a região promotora de IoPGKl são obtidos com amplificação de PCR mediada por ligação (Mueller, P.R. and Wald, B. 1989, "In vivo footprin- ting of a muscle specific enhancer by ligation mediated PCR." Science 246:780-786). Uma mistura de um ligante iden- tificado como SEQ. ID. NO. 41 e um ligante identificado como SEQ. ID. NO. 42 é ligada ao DNA genômico I. orientalis di- gerido pelo HaeIII com T4 DNA ligase (New England BioLabs). Amostras das misturas da ligação são usadas como gabarito de 50 μl para reações contendo 0,1 pM de um iniciador identi- ficado como SEQ. ID. NO. 43 e 1 μΜ de um iniciador identi- ficado como SEQ. ID. NO. 44. A mistura da reação é aquecida a 94 °C por 3 minutos após 2 U de Dynazyme EXT ser adicio- nado. As reações são cicladas 30 vezes como a seguir: 1 mi- nuto a 94 °C, 2 minutos a 68 0C e 2 minutos a 72 °C, com uma extensão final de 10 minutos a 72 °C. Uma amostra dilu- ída desta primeira amplificação por PCR é usada como o gaba- rito em uma reação de PCR aninhada (50 yL) contendo 0,05 μΜ de um iniciador identificada como SEQ. ID. NO. 45 e 0,5 μΜ de um iniciador identificado como SEQ. ID. NO. 46. A mistura da reação é aquecida a 94 0C por 3 minutos após 2 U de Dy- nazyme EXT ser adicionado. As reações são em seguida cicla- das 30 vezes como a seguir: 1 minuto a 94 °C, 2 minutos a 67 °C e 2 minutos a 72 °C, com um extensão final de 10 mi- nutos a 72 °C.

Um fragmento de PCR de «600 bp é isolado e seqüen- ciado. Iniciadores aninhados identificados como SEQ. ID. NO. 47 e SEQ. ID. NO. 48 são designados e usados em uma ampli- ficação de PCR mediada por ligação juntamente com oligonu- cleotideos identificados como SEQ. ID. NO. 49 e SEQ. ID. NO. 50 similarmente da maneira anterior exceto que DNA I. orientalis digerido por SphI é usado e o PCR é realizado usando uma temperatura de anelamento de 65 °C.

O promotor de PGKl de I. orientalis é PCR ampli- ficado usando iniciadores identificados como SEQ. ID. NO. 51 e SEQ. ID. NO. 52 e o DNA genômico I. orientalis como o gabarito. O fragmento é cheio usando a enzima Klenow e em seguida cortado com XbaI. Um fragmento de 633 bp. é gel iso- lado e ligado a um fragmento de 4428 bp obtido digerindo um plasmideo designado como pMI270 (descrito na Fig. 4 de WO 031049525) com XhoIf enchendo o fragmento usando a enzima Klenow e 0,1 mM de dNTP, e digerindo com XbaI. Plasmideo pMl270 contém o gene de higromicina da E. coli ligado com um promotor C. sonorensis PGKl e um terminador S. cerevisiae GAL10. O plasmideo resultante é . designado pMI318 (figura 6). Plasmideo pMI318 contém o gene de higromicina da E. co- li sob o controle do promotor I. orientalis PGKl e o termi- nador S. cerevísiae GALlO.

Exemplo 7B: Construção de um plasmideo (pMl321, Fig. 7) contendo o gene de higromicina sob o controle do promotor de IoPGKl e o terminador de S. cerevísiae GALlO, e o gene LDH L. helveticus sob o controle do promotor de IoPGKl e terminador S. cerevísiae CYC1.

O promotor I. orientalis PGKl do Exemplo 7A é PCR amplificado usando iniciadores identificados como SEQ. ID. NO. 53 e SEQ. ID. NO. 54 e o DNA genômico I. orientalis co- mo o gabarito. O fragmento é cheio usando a enzima Klenow e 0,1 mM de dNTP, e em seguida cortado com NcoI. Um fragmento de 633 bp é gel isolado.

Plasmideo pVRl (descrito em WO 03/102152 Figura 7) contém o gene L. helveticus LDH sob o controle de o S. cerevísiae TEFl promotor e o S. cerevísiae CYC1 terminador. Plasmideo pVRl é digerido com XhoI, cheio em usando a enzi- ma Klenow, e cortadas com NcoI. Um fragmento de 7386 bp de plasmideo pVRl é ligado com o fragmento promotor de IoPGKl de 633 bp. O plasmideo resultante é designado pMl320. Plas- mideo pMl320 contém o gene L. helveticus LDH sob o controle do promotor de IoPGKl e terminador S. cerevísiae CYCl.

Plasmideos pMI318 (figura 6, Ex. 7A) e pMI320 são digeridos com ApaI e NotI. Um fragmento de 5008 bp do plas- mideo pMI318 é ligado a um fragmento de 1995 bp do plasmi- deo pMI320 para formar o plasmideo pMl321 (figura 7). O gène de higromicina (e seu terminador) é posicionado no plasmideo pMl321 entre duas cópias do promotor de IoPGKlr que serve como seqüências repetitivas diretas. Esta constru- ção pode permitir uma célula transformada com plasmideo pMl321 a engajar em uma recombinação homóloga para "saída do laço" o gene de higromicina e terminador, juntamente com uma cópia do promotor de IoPGKl.

Exemplo 7C: Clonagem de região promotora I. orientalis PDC (IoPDClA); construção de um plasmideo (pMl355, Fig. 8) ten- do o Gene de higromicina da E. coli sob o controle do pro- motor de IoPGKl e o terminador S. cerevisiae GAL10, o gene L. hel-veticus LDH sob o controle do promotor de IoPGKl e terminador S. cerevisiae CYCl, e a região flanqueadora I- oPDClA 5'.

Uma biblioteca genômica da cepa I. orientalis do tipo selvagem ATCC PTA-6658 é construída no vetor cosmídeo SuperCosl (Stratagene) de acordo com instruções fornecidas pelo fabricante. Seqüências do tipo PDC são amplificadas por PCR a partir do DNA genômico da cepa com iniciadores designados como SEQ.. ID. NO. 55 e SEQ. ID. NO. 56. Um frag- mento· de 700 bp de um gene PDC é amplificado. A biblioteca genômica é classificada usando técnicas de hibridização com fragmentos de PCR marcados como sondas da maneira descrita em WO 03/04 9525 e clones de cosmídeo contendo o gene PDC são isolados e seqüenciados. A região I. orientalis PDClA 5' de 1000 bp a 167 bp a montante do início de o quadro de leitura aberto é amplificado por PCR usando iniciadores identifica- dos como SEQ. ID. NO. 57 e SEQ. ID. NO. 58 e o DNA do cos- mídeo I. orientalis PDC como o gabarito. O fragmento é cor- tado com SalI e Saci. Um fragmento de 836 bp é gel isolado e ligado a um fragmento de 6992 bp obtido digerindo plasmi- deo pMl321 (figura 7, Exemplo 7B) com SalI e Saci. 0 plas- mideo resultante é nomeado pMI355 (figura 8). Exemplo 7D: Clonagem de região terminadora I. orientalis PDC (IoPDClA) ; construção de pasmldeos (pMI356 (figura 9) e pMl357) e tendo a região flanqueadora IoPDClA 5', o Gene de higromicina da E. coli sob o controle do promotor de IoPGKl e o terminador S. cerevisiae GALlO, o gene L. hel- veticus LDH sob o controle do promotor de IoPGKl e termi- nador S. cerevisiae CYC1, e a região flanqueadora IoPDClA 3'.

A região I. orientalis PDC 3' correspondente às seqüências de 233 bp a 872 bp a jusante do PDC códon de parada de tradução é amplificada por PCR usando iniciado- res identificados como SEQ. ID. NO. 59 e SEQ. ID. NO. 60 e o DNA do cosmídeo I. orientalis PDClA (Exemplo 7C) como o gabarito. O fragmento é cortado com ApaI e SmaI. Um frag- mento de 630 bp é gel isolado e ligado a um fragmento de 7809 bp obtido digerindo plasmideo pMI355 (figura 8, Ex. 7C) com ApaI e SmaI. O plasmideo resultante é nomeado pMI356 (figura 9). Ele contém o higromicina e cassetes LDH do plasmideo pMI355 entre o flanco 5' e uma porção do flanço 3' do gene de IoPDClA.

Plasmideo pMl357 é feito de uma maneira similar, exceto que ele difere do plasmideo pMI356 com relação à porção do flanco 3' IoPDClA que está presente. Estas regi- ões correspondem à seqüência 5 bp a montante e 216 bp a ju- sante do códon de parada de tradução de PDC. Exemplo 7E: Geração de um mutante I. orientalis (CD1184) com genes IoPDClA e IoPDClB deletados e gene LhLDH inte- grado em uma etapa transformando cepa I. orientalis do ti- po selvagem com plasmideo pM356 (figura 9, Ex. 7D) .

Cepa I. orientalis do tipo selvagem ATCC PTA 6658 é transformada com plasmideo pMl356 usando métodos pa- drões. Cepas transformadas que crescem nas placas de hi- gromicina são cultivadas. Um transformante que não produz etanol é selecionado para análise Southern, que confirma a deleção tanto dos genes IoPDClA e IoPDClB quanto inserção de pelo menos uma cópia do gene LhLDH. Esta cepa é desig- nada CD1184.

Exemplo 7F: Construção de plasmideo pM433 (figura 10) con- tendo a região flanqueadora IoPDClA 5', o gene ScMEL5 sob o controle do promotor de IoPGKl, o gene L. helveticus LDH sob o controle do promotor de IoPGKl e terminador SeCYCl, e a região flanqueadora IoPDClA 3'.

O promotor I. orientalis PGKl é amplificado por PCR usando iniciadores identificados como SEQ. ID. NO. 61 e SEQ. ID. NO. 62 e o DNA genômico I. orientalis como o gabarito. O fragmento é cheio usando a enzima Klenow e 0,1 mm de dNTP, e em seguida cortado com SphI. Um fragmento de 669 bp é gel isolado. Um plasmideo designado como pMI233 (descrito em Fig. 23C de WO 03/049525) é cortado com XhoI. O fragmento é cheio com a enzima Klenow e cortado com SphI. Os fragmentos 4534 bp e o 669 bp são ligados e o plasmideo re- sultante é nomeado pMI319. Plasmideo pMI319 contém o gene S. cerevisiae MEL5 (ScMEL5) e a região promotora de IoPGKl. Plasmideo pMl319 é cortado com ApaI, sua extremi- dade fica romba com polimerase T4, e cortado com Notl. Um fragmento de 2 317 bp é gel isolado. Ele é ligado a um frag- mento de 6498 bp obtido digerindo plasmideo pMI357 (Exemplo 7D) com SalI, fazendo sua extremidade romba com a enzima Klenow e em seguida cortando com Notl. O plasmideo resultan- te contém o gene ScMELS (com seu terminador nativo) em vez de gene de higromicina de plasmideo pMI357. O plasmideo re- sultante é designado pMI433 (figura 10). Exemplo 7G: Construção de plasmideos pMI449 (figura 11) e pMI454 (figura 12) contendo região flanqueadora I. orienta- lis CYB2 5', cassete do gene ScMEL5 entre seqüências repeti- tivas diretas K. thermotolerarxs e da região flanqueadora I. orientalis CYB2 3'.

Plasmideo pMM28 (figura 2, Ex. 3A) é digerido com BamHI, cheio em com a enzima Klenow, e digerido com SalI. O fragmento de 4077 bp obtido dessa maneira é ligado a um fragmento de 2317 bp Notl (cheio com enzima Klenow)-SalI de pMI433 (figura 10, Ex. 7F). O plasmideo resultante é desig- nado pMI44 5.

A região flanqueadora 3' do gene I. orientalis L- lactatorferricitocromo c oxidoredutase (IoCYB2A) (corres- pondente às seqüências de 90 a 67 6 bp a jusante do quadro de leitura aberto previsto) é amplificado por PCR usando inici- adores identificados como SEQ. ID. NO. 63 e SEQ. ID. NO. 64 usando um clone do cosmideo CYB2-2 como um gabarito. O Pro- duto de PCR é digerido com SacI e SmaI e o fragmento de 607 bp é ligado com o fragmento de 638 6 bp SacI - SmaI do pias- mídeo pMI445. O plasmídeo resultante é designado pMI448.

A região flanqueadora IoCYB2A 5' (correspondente às seqüências de 913 a 487 bp a montante do quadro de leitu- ra aberto previsto) é amplificado por PCR usando iniciadores identificados como SEQ. ID. NO. 65 e SEQ. M. NO. 66, nova- mente usando o clone do cosmideo CYB2-2 como um gabarito. O Produto de PCR é digerido com SphI e o fragmento de 454 bp é ligado com o fragmento de 6993 bp SphI obtido digerindo par- cialmente pMI448. O plasmideo resultante é designado pMI449 (figura 11).

A região flanqueadora IoCYB2A 5' (correspondente às seqüências de 4 66 a 7 bp a montante do quadro de leitura aberto previsto) é amplificada por PCR usando iniciadores identificados como SEQ. ID. NO. 67 e SEQ. ID. NO. 68, uma vez novamente usando o clone do cosmideo CYB2-2 como o gaba- rito. O Produto de PCR é digerido com SphI e o fragmento de 493 bp foi ligado com o fragmento de 6993 bp SphI obtido digerindo parcialmente plasmideo pMI448. O plasmideo resul- tante é designado pMI453.

A região flanqueadora IoCYB2A 3' (correspondente às seqüências de 402 bp a montante a 77 bp a jusante do có- don de parada previsto) é amplificada por PCR usando inicia- dores identificados como SEQ. ID. NO. 69 e SEQ. ID. NO. 70 usando o cosmideo CYB2-2 como um gabarito. O Produto de PCR é digerido com ApaI e Smal e o fragmento de 506 bp é ligado com o fragmento de 6886 bp ApaI - Smal de plasmideo pMI453.

O plasmideo resultante é designado pMI454 (figura 12). Exemplo 7H: Geração de cepa mutante I. orientalis (CD1496) para transformar sucessivamente cepa CD1184 (Ex. 7E) com plasmídeos pMI449 e pM454, seguido por mutagênese.

Cepa CD1184 é transformada com plasmideo pMI449 usando o método de acetato de litio e transformantes (colô- nias azuis) são selecionados com base na atividade de melibi- ase em placas YPD Χ-α-gal. A substituição do gene IoCYB2A da cepa CD 1184 com o DNA transformado é confirmada por PCR de colônia e análise Southern em alguns dos transformantes. O marcador MEL5 sai do laço de um destes transformantes por meio de um evento de recombinação homóloga através das se- qüências repetitivas K. thermotolerans, como confirmado por análise Southern. O segundo alelo CYB2A é deletado deste transformante usando plasmideo pMI454. Transformantes são analisados por PCR de colônia para a ausência de um produto de PCR especifico de 1000 bp CYB2A. O marcador MEL5 do plasmideo pMI454 é que saiu do laço de um transformante ten- do uma deleção do segundo alelo CYB2A por meio de recombina- ção como antes. Este transformante é designado cepa CD 1436.

Cepa CD1436 é submetida a mutagênese EMS usando as condições apresentadas no Exemplo IA, exceto que as condições de exposição são 8 uL por 1 hora. Células mutagenizadas re- cuperam naturalmente por 6 horas em YPD e em seguida são plaqueadas em PDA + placas de ácido lático 35 g/L e incuba- das por uma semana a 30 °C. Uma cepa que produz mais lactato e menos glicerol do que cepa CD 1436 é designada como cepa CD 1496. Cepa CD 1496 tem uma deleção tanto de alelos PDCl (com substituição por um cassete do gene L-LDH funcional, quanto de uma deleção de cada um de seus dois alelos IoCYB2A nati- vos) .

Exemplo 71: Fermentações de frascos de agitação usando cepas CD1184, CD1436 e CD1496.

Cepas CD1184 e CD1436 são avaliadas em fermenta- ções frasco de agitação microaeróbico de uma maneira geral descrito no Exemplo 5A, exceto a concentração de dextrose de partida ser 100 g/L e agitação ser a 100 rpm. Cada cepa pára de consumir glicose após cerca de 80 horas de produção. Após 144 horas de cultivo, titulador de lactato final é pro- dução de lactato é cerca de 60 g/kg para cepa CD 1184 e 53 g/kg pra cepa CD1436. O rendimento de lactato é cerca de 88 % para cepa CD1184 e 86 % para cepa CD 1436. Rendimento de glicerol é cerca de 5,5 % para cepa CD 1184 e 8,5 % para cepa CD 1436.

Cepas CD 1436 e CD 1496 são similarmente avaliadas em cultivos microaeróbicos em duplicata. Após 144 horas de cultivo, titulador de lactato final é produção de lactato é cerca de 58 g/kg para cepa CD1436 e 65 g/kg para cepa CD1496. O rendimento de lactato é cerca de 68 % para cada cepa. Rendimento de glicerol é cerca de 11 % para cepa CD1436 e apenas cerca de 8 % para cepa CD 1496. Exemplo 7J: fermentações pH 3 de cepas CD1436 (Exemplo 7H) e CD1496 (Exemplo 7H).

Cepas CD1436 e CD1496 são usadas em fermentações separadas tamponadas a um pH de 3,0. Em cada caso as célu- las são inoculadas com um fermentador Braun-B de 5 L com um volume de trabalho de 3 L. O caldo de fermentação contém 110 g/L de dextrose no inicio da fermentação. Hidróxido de potássio é adicionado como necessita de manter o pH do cal- do de fermentação a 3,0. A temperatura da fermentação é 30 °C. Oxigênio é adicionado para manter uma taxa de captação de oxigênio de 5-6 mmol/L-hr.

Cepa CD1436 produz lactato em uma taxa de 0,77 g/1-hr, até um rendimento final de 69 %. Cepa CD 1496 produz lactato em uma taxa de 0,83 g/l-hr, até um rendimento final de 64 %. Cepas CD1436 e CD1496 produzem 0,8 e 0,0 g/L de piruvato, respectivamente. Elas produzem 18 e 23 g/L de glicerol, respectivamente. Nenhuma das duas produz acetato mensurável

Exemplo 7K: fermentações pH 3 de cepa CD1436 (Ex. 7H) e sua cepa CDl184 pai (Ex. 7E) .

Cepa CD1436 e sua cepa CD1184 pai é usada em fer- mentações separadas tamponadas a um pH de 3,0. Em cada caso as células são inoculadas com um fermentador Braun-B de 5 L com um volume de trabalho de 3 L. O caldo de fermentação contém 130 g/L de dextrose no inicio da fermentação. Hidró- xido de potássio é adicionado como necessidade de para man- ter o pH do caldo, de fermentação a 3,0. A temperatura da fermentação é 30 °C. Oxigênio é adicionado para manter uma taxa de captação de oxigênio de 2 mmol/L-hr.

Cepa CD1436 produz um lactato de 66 g/L após cerca de 160 horas de cultivo, ao passo que cepa CD1184 produz a- penas 56 g/L de lactato. Cepa CD1436 também produz lático em uma taxa volumétrica maior do que cepa CD1184 (0, 43 vs. 0,35 gL/h). Além disso, cepa CD1436 acumula no acetato ou piruva- to ao passo que cepa CD1184 produz cerca de 1 g/L de piruva- to e 3 g/L de acetato. Cepa CD 1436 tem um rendimento geral de lático na glicose de cerca de 67 % vs. 69 % para seu pai. Os rendimentos comparáveis são obtidos em virtude da cepa CD1436 produzir mais glicerol do que a cepa CD 1184.

Exemplo 8A: Deleção de gene DLDl de uma cepa K. marxianus contendo um cassete do gene D-LDH exógeno.

0 locus 3' a jusante do gene DLDl de uma cepa K. marxianus do tipo selvagem é amplificado com adição de sí- tios de restrição NarI/SalI usando iniciadores identificados como SEQ. ID. NO. 71 e SEQ. ID. NO. 72 e DNA genômico como o gabarito. A região clonada é ligada ao plasmídeo pMM31 (Ex. 3B) para formar plasmídeo pMM44 (figura 13). 0 locus 5' a jusante do gene DLDl de uma cepa K. marxianus do tipo sel- vagem é amplificado com adição de sítios de restrição Xmal/Ncol usando iniciadores identificados como SEQ. ID. NO. 73 e SEQ. ID. NO. 74 e DNA genômico como o gabarito. A regi- ão clonada é ligada ao plasmídeo pMM31 (Ex. 3B) para formar plasmídeo pMM45 (figura 14).

Um fragmento é amplificado do plasmídeo pMM4 4 u- sando iniciadores identificados como SEQ. ID. NO. 71 e SEQ. ID. NO. 75. Um outro fragmento é amplificado do plasmídeo pMM45 usando iniciadores identificados como SEQ. ID. NO. 74 e SEQ. ID. NO. 76. Os produtos amplificados (-2,8 kbp do pMM44 e =2,5 kbp do pMM45) são gel purificado e usados para transformar uma cepa K. marxianus contendo um cassete do gene DLDH exógeno (e tendo um gene PDC intacto), que é pre- parado de acordo com métodos similares àqueles descritos em WO 03/102152. Depois de uma recuperação de 4 horas, células são plaqueadas em YNB 2 % de melibiose + placas XaGal 32 mg/L.

Transformantes são classificados para uma recombi- nação homóloga do DNA transformado no locus DLDl por meio de PCR de colônia de dentro para fora usando iniciadores i- dentificados como SEQ. ID. NO. 77 e SEQ. ID. NO. 78. Os ini- ciadores são homólogos a uma região a montante da região 5' clonada e a região de codificação do marcador de seleção Sc- MELl, respectivamente. Três dos 32 transformantes classifi- cados dão o produto de PCR esperado de 1,8 kb e são marcados para isolados de colônia única.

Todo o locus DLDl é amplificado de DNA genômico dos isolados de colônia única de dois dos três transforman- tes positivos usando iniciadores identificados como SEQ. ID. NO. 74 e SEQ. ID. NO. 77. Todas as colônias únicas renderam o produto esperado para um nocaute do gene DLDl. Uma das cepas é identificada como cepa CD1603.

Cepa CD1603 e a cepa pai foram separadamente mar- cadas por placas YNB contendo ácido D-lático 2 % como uma única fonte de carbono. A cepa pai cresce bem neste meio, mas a cepa CD1603 apresenta crescimento desprezível.

Cepa CD1603 e a cepa pai são separadamente culti- vadas de uma maneira geral descrita no Exemplo 5A. Ácido lático e produção do subproduto são medidos por meio de HPLC por todos os cultivos. Produção de ácido lático é me- lhorado em cepa CD1603 comparado com a cepa pai. Tanto a taxa de produção lática quanto titulador lático são maiores em cepa CD1603 do que na cepa pai. Exemplo 8B: fermentações pH 3 de cepa CD1603 (Exemplo 8A) e sua cepa pai.

Cepas CD1603 e seu pai são usadas em fermentações separadas tamponadas a um pH de 3,0. Em cada caso as célu- las são inoculadas com um fermentador Braun-B de 5 L com um volume de trabalho de 3 L. O caldo de fermentação contém 90 g/L de dextrose no inicio da fermentação. Hidróxido de po- tássio é adicionado como necessidade para manter o pH do caldo de fermentação a 3,0. A temperatura da fermentação é 30°C. Oxigênio é adicionado para manter uma taxa de capta- ção de oxigênio de 5-6 mmol/L-hr.

Cepa CD1603 produz lactato a uma taxa de 0,58 g/L- hr, até um rendimento final de 69 %. Ela produz piruvato em um rendimento de 0,8% e glicerol em um rendimento de 7,3 %. A cepa pai produz lactato em um taxa de apenas 0,09 g/L- hr, até um rendimento final de 68%. O piruvato e rendimen- tos de glicerol da cepa pai são 21% e 6,9%, respectiva- mente. Estes valores indicam que a cepa pai consome lactato da maneira que a forma, convertendo-a em piruvato. Além disso, a cepa pai produz um rendimento de 15% de acetato.

Exemplo 9 Produção de células de levedura S. bulderi tendo um gene LhLDH exógeno e um cassete do gene G418 exógeno.

S. bulderi é um levedura que, como uma cepa nati- va, não tem capacidade de crescer no lactato como a única fonte de carbono. Iniciadores identificados como SEQ. ID. NO. 85 e SEQ. ID. NO. 86 são usados para andar juntamente com estojo APl da Universal Gene Walking (BD BioSciences Clontech, Pal to, CA, Catalog No. K1807-1) para elucidar uma seqüência de «1 kbp a montante do gene S. bulderi TEFl. Uma seqüência de 850 bp da qual a seqüência a montan- te é clonada imediatamente a montante de um gene LhLDHr usando sítios de clonagem Sacl/Xbal em iniciadores identifi- cados como SEQ. ID. NO. 87 e SEQ. ID. NO. 88, para produzir um plasmideo designado como pCMl49 (figura 15) . Plasmideo pCMl4 9 contém, na ordem, o promoter SbTEFl, o gene LhLDH, um termina dor Saccharomyces exigus PGlr um cassete do gene G418 sob o controle do promotor ScPDCl e o terminador Sc- GALlO. O terminador SePGl é obtido amplificando DNA genômi- co de S. exiguus com iniciadores identificados como SEQ. ID. NO. 89 e SEQ. ID. NO. 90. 0 cassete do gene G418 é des- crito no Exemplo IA (figura 4) de W003/102152.

Células de um tipo selvagem S. bulderi (cepa ATCC MYA-403) são transformadas com plasmideo pCM14 9 usando méto- dos padrões de acetato de lítio. Transformantes são plaquea- dos em YPD + 300 mg/L G418, e três transformantes produzem halos púrpuros fracos usando um ensaio LASSO, que indicam que estas cepas estão produzindo ácido lático. Estas três cepas são separadamente inoculadas em frascos de agitação YPD, e todas as três são para produzir ácido lático. Todas as três cepas produzem de 5-7 g/L de ácido lático após cerca de 24 horas de cultivo. A cepa pai tipo selvagem não produz qualquer ácido lático. Listagem de Seqüência

<110> Natureworks LLC Miller, Matthew Suominen, Pirkko Aristidou, Aristos Hause, Benjamin van Hoek1 Pim Dundon, Catherine

<120>"CÉLULAS DE LEVEDURA QUE PRODUZEM ÁCIDO LÁTICO TENDO L-OU D- LACTATO NAO FUNCIONAL: GENE DE FERRICITOCROMO C OXIDOREDUTASE"

<130> 1181A

<150> US 60/739,458

<151> 2005-11-23

<150> US 60/739,824

<151> 2005-11-23

<160> 90

<170> Patentln versão 3.3

<210> 1

<211> 1779

<212> DNA

<213> Kluyveromyces marxianus

<400> 1

atgagatctg cagctagagt catcaacaag agctgtagcg gctctgctct ttcgagaaga 60 tgtctgagaa aatcgagctt gagcatgagt atgagatatt taagtacttc gaacatcgga 120 gtcagaaaag gtttcaacgg acagggtaaa agttcgaata aaacgatgtt gtttttggct 180 gctggggctt cagctgtagc tgggatcggg ctgctctctc aatttagcga cagcttgcaa 240 aatgctacga aagaagagct aaacaagcca aaggtttccc cgctcgaggt cgccaagcac 300 tcgágtcccg atgactgctg ggtggtgatc gatgggtttg tctacaattt gacggaattc 360 attagcgccc atcctggtgg accagctatc atcgagaaca acgccggtaa ggatgtgacg 420 gcgatctttg gcccaattca tgcgccagat gtcattgaga agtacattgc tccggagaac 480 cggatcggtc ctctagacgg gaaaatgccc gacgacttga tctgtgcgcc attgacgccc 540 ggtgagactc ctgaggatgt tgccagaaag gaggagttgc gtcaaaatat gccagatctc 600 gactcgttgg tcaacattta cgatttcgag ttcttggcgt cccagatttt gaccaaacag 660 gcatggtcct actactcttc tgctgccgat gaçgaagtca cccacagaga gaaccatgct 720 gcataccacc gtatcttctt caagccaaga atectagtca acgtcaagga ggtggacact 780 tccaccacca tgttgggtga aaaagtgggt gttccattct atgtgtctgc taccgcttta 840 tgtaaattgg gtaatccaaa ggaaggtgaa aaggatatcg ctagaggttg tggcgagagc 900 gacgtgaagc caatccagat gatttccact ttggcctctt gttctttgca agaaatcgtc 960 gaagcagcac cttccaagga ccaaatccaa tggttccaat tgtatgtcaa cagtgaccgt 1020 aagattaccg aggaattgat caaaaacgtc gaaaagctgg gcttgaaggc tatcttcgtt 1080 actgtggatg ccccatctct cggtaacaga gaaaaggatg ctaaggtcaa attcaccaac 1140 aaggacag-tt ecgeaa'âgge carggáfSàag âgcaacgtca aggaatccaa gggtgcttcc 1200 agagctcttt ccactttcat tgaccctgct ctatgctggg atgatatcgt taccttgaaa 1260 tcaaagacca agttgccaat tgtcattaag ggtgttcaat gcgtcgaaga cgtcttgaaa 1320 gccgcagaaa ttggtgccgc cggtgtcgtc ttgtccaacc acggtggtag acaactagac 1380 ttttccagag cgccaatcga agtcttggcc gaaacaatgc a a w v»& u w»— ku&u agaaaagaaa 144Q ctagacgaca agatcgaaat cttcatcgat ggtggtgtca gaagaggtac cgatatattg 1500 aaggccttgt gtcttggtgc caagggtgtc ggtttaggta gaccattctt gtacgcaaac 1560 agttgttacg gtaaggaagg tgtcaagaaa gctatcgaat tgctaaagga cgaactagaa 1620 atgtcaatga gattgcttgg tgtcâctagc atcgaccaat tgtctgagaa gtatctggat 1680 ctatctactc ttcacggtag aactgttagc gtacctcgtg acaacttgta caacggagtg 1740 tatgttccac acgaaccaac tgacttcaag gaaaattga 1779

<210> 2

<211> 592

<212> PRT

<213> Kluyveromyces marxianus

<400> 2

Met Arg Ser Ala Ala Arg Val Ile Asn Lys Ser Cys Ser Gly Ser Ala 1 5 10 15

Leu Ser Arg Arg Cys Leu Arg Lys ser ser Leu ser Met Ser Met Arg 20 25 30

Tyr Leu Ser Thr Ser Asn Ile Gly vai Arg Lys Gly Phe Asn Gly Gln 35 40 45

Gly Lys Ser Ser Asn Lys Thr Met Leu Phe Leu Ala Ala Gly Ala Ser 50 55 60

Ala Val Ala Gly Ile Gly Leu Leu ser Gln Phe Ser Asp ser Leu Gln 65 70 75 80

Asn Ala Thr Lys Glu Glu Leu Asn Lys Pro Lys vai Ser Pro Leu Glu 85 90 95

vai Ala Lys His ser ser Pro Asp Asp Cys Trp vai vai Ile Asp Gly 100 105 110

Phe vai Tyr Asn Leu Thr Glu Phe lie Sèr Ala His Pro Gly Gly Pro 115 120 125

Ala Ile Ile Glu Asn Asn Ala Gly Lys Asp Val Thr Ala Ile Phe Gly 130 135 140

Pro lie His Ala Pro Asp Val lie Glu Lys Tyr Ile Ala Pro Glu Asn 145 150 155 160

Arg Ile Gly Pro Leu Asp Gly Lys Met Pro Asp Asp Leu lie Cys Ala 165 170 175

Pro Leu Thr Pro Gly Glu Thr Pro Glu Asp Val Ala Arq Lys Glu Glu 180 185 190

Leu Arg Gln Asn Met Pro Asp Leu Asp ser Leu vai Asn Il e Tyr Asp 195 200 205

Phe Glu Phe Leu Ala Ser Gln Ile Leu Thr Lys Gln Ala Trp Ser Tyr 210 215 220

Tyr Ser ser Ala Ala Asp Asp Glu Val Thr His Arg Glu Asn His Ala 225 230 235 240

Ala Tyr His Arg Ile Phe Phe Lys Pro Arg lie Leu Val Asn Val Lys 245 250 255

Glu Val Asp Thr Ser Thr Thr Met Leu Gly Glu Lys Val Gly vai Pro 260 265 270

Phe Tyr Val Ser Ala Thr Ala Leu Cys Lys Leu Gly Asn Pro Lys Glu 275 280 285

Gly Glu Lys Asp Ile Ala Arg Gly Cys Gly Glu Ser Asp Val Lys Pro 290 295 300

Ile Gln Met Ile Ser Thr Leu Ala Ser Cys ser Leu Gln Glu Ile vai 305 310 315 320

Glu Ala Ala Pro ser Lys Asp Gln Ile Gln Trp Phe Gln Leu Tyr Val 325 330 335

Asn Ser Asp Arg Lys Ile Thr Glu Glu Leu Ile Lys Asn vai Glu Lys 340 345 350

Leu Gly Leu Lys Ala Ile Phe Val Thr Val Asp Ala Pro Ser Leu Gly 355 360 365

Asn Arg Glu Lys Asp Ala Lys vai Lys Phe Thr Asn Lys Asp ser Ser 370 375 380

Ala Lys Ala Met Glu Lys Ser Asn Val Lys Glu Ser Lys Gly Ala Ser 385 390 395 400

Arg Ala Leu Ser Thr Phe Ile Asp Pro Ala Leu Cys Trp Asp Asp Ile 405 410 415

Val Thr Leu Lys Ser Lys Thr Lys Leu Pro Ile vai Ile Lys Gly Val 420

425

430

Gln Cys vai Glu Asp vai Leu Lys Ala Ala Glu Ile Gly Ala Ala Gly 435 440 445

Val Val Leu Ser Asn His Gly Gly Arg Gln Leu Asp Phe Ser Arg Ala 450 455 460

Pro Ile Glu Val Leu Ala Glu Thr Met Pro Ile Leu Lys Glu Lys Lys

465 470 475 480

Leu Asp Asp Lys lie Glu Ile Phe Ile Asp Gly Gly Val Arg Arg Gly

485 490 495

Thr Asp Ile Leu Lys Ala Leu Cys Leu Gly Ala Lys Gly Val Gly Leu

500 505 510

Gly Arg Pro Phe Leu Tyr Ala Asn Ser Cys Tyr Gly Lys Glu Gly Val

515 520 525

Lys Lys Ala Ile Glu Leu Leu Lys Asp Glu Leu Glu Met Ser Met Arg

530 535 540

Leu Leu Gly Val Thr Ser Ile Asp Gln Leu Ser Glu Lys Tyr Leu Asp

545 550 555 560

Leu Ser Thr Leu His Gly Arg Thr Val ser Val Pro Arg Asp Asn Leu 565 570 575

Tyr Asn Gly vai Tyr vai Pro His Glu pro Thr Asp Phe Lys Glu Asn

γολ pop rnn

}OU JOJ J3U

<210> 3

<211> 33

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Primer

<400> 3

cagataacgc gtctggctcg atacttctta ttc

<210> 4

<211> 33

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Primer

<400> 4

tgcagactgc agtgctactg gtattgtatt act

<210> 5 <211> 34

<212> BNA

<213> Artificial

<220>

<223> Primer

<400> 5

attatagggc cccacaaaat gtatctatct ctcc

<210> 6

<211> 34

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Primer

<400> 6

tataatgccg gccagaagtc tctggatcct cttc

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Primer

<400> 7

cctgaccact aaacgtctac

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Primer

<400> 8

cacctctttg catgagcttg

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Primer

<400> 9

ctggatctac agcgattctc

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Primer

<400> 10 tgtaccggct gtccttaaac 20 <210> 11 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 11 tccccggtcg accggaactt agcttactcg tc 32 <210> 12 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 12 ttgcgaggat cctgagtgca gtagctgtac ac 32 <210> 13 <211> 706 <212> DNA <213> Kluyveromyces marxianus <400> 13 cactcgcaag ctgtgccatc gcccaacggt taattataag aaatcaacat cagccaacaa 60 ctattttcgt ccccctcttt tcagtggtaa cgagcaatta cattagtaag agactatttt 120 cttcagtgat ttgtaatttt ttttcagtga tttgtaattc tttctcgaaa tatgcgggct 180 vvaamtaatcc ggacattcac tacatgcaag naaaaarnan ————ZJ—ZJ asrrnrnnsn ----ZJ~ZJ ^ — W atttcctcag 240 taagtaacaa tgatgatctt tttacgcttc atcatcactt tccaaagttc taagctataa 300 gttcaagcct agatacgctg aaaaactcct gaccaacaat gtaaagaaaa caattacaat 360 tgtaaggttg aaaacatcta aaaatgaaat attttattgt acatgcacac cctgatagtc 420 attctcttac ttcatccctg aaagacgtgg ctgtacaaga gttggaatcg caaggtcatg 480 aggttaaagt tagtgatctt tatgctcaaa agtggaaggc ctcáatagac cgtgacgacw 540 wmaaaaaama aamrmaagaa gagaggttaa aaatacccca agcttcttat gaagcgtatg 600 ccagaggagc attaacaaaa gacgtaaatc aggaacagga aaaacttatt tgggcggact 660 ttgtcatttt gtcgtttcct atatggtggt cttctatgcc ggctag 706

<210> 14

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Primer

<400> 14

tigtcagcatg cactcgcaag ctgtgccatc <210> 15

<211> 33

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Pritner

<400> 15

aaccttgtcg actagccggc atagaagacc acc

<210> 16

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Primer

<400> 16

tgtcaggatc cactcgcaag ctgtgccatc

<210> 17

<211> 33

<212> DNA

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<220>

<223> Primer

<400> 17

aaccttcccg ggtagccggc atagaagacc acc

<210> 18

<21±> 33

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Primer

<400> 18

aaaaaagtcg accgataaca agctcatgca aag

<210> 19

<211> 32

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Primer

<400> 19

aaaaaaagat ctgcgtaacg aaataaatcc gc

<210> 20

<211> 32

<212> DNA

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<220> <223> Primer

<400> 20

aaaaaacccg ggcttcctcc gctgcaggtt ca

<210> 21

<211> 32

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Primer

<400> 21

aaaaaagagc tcgaagtctc tggatcctct tc

<210> 22

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<212> DNA

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<220>

<223> Primèr

<400> 22

aaaaaagacg tcctggctcg atacttctta ttc

<210> 23

<211> 32

<212> DNA

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<220>

<223> Primer

<400> 23

aaaaaaggcg ccgctggcag atactagttc ag

<210> 24

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Primer

<400> 24

cgctgtgctg tgcactgtaa

<210> 25

<211> 32

<212> DNA

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<220>

<223> Primer

<400> 25

aaaaaagagc tcgaagtctc tggatcctct tc

<210> 26

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<220>

<223> Primer

<400> 26

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32

<210> 27

<211> 32

<212> DNA

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<220>

<223> Primer

<400> 27

aaaaaatcta gataatgtta cttctcttgg ag 32

<210> 28

<211> 32

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Primer

<400> 28

aaaaaacccg gggagaggga gaggataaag ag 32

<210> 29

<211> 32

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Primer

<210> 30

<211> 32

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<:223> Primer

<400> 30

aaaaaacata tgtgcaggtg tcgaccagaa tg 32

<210> 31

<211> 32

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Primer

<400> 29

aaaaaaacat gttcccatac tggtccatgc tc

32

<400> 31

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<220>

<223> Primer <400> 33

cggtatcgtc gtctcagagt

<210> 34

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Primer

<400> 34

cggccacaaa gaccacaaag

<210> 35

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Primer

<400> 35

cggtatcgtc gtctcagagt

<210> 36

<211> 20

<212> DNA

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<220>

<223> Primer

<400> 36

ggctggttgg ttgttgttgt

<210> 37

<211> 20

<212> DNA

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<400> 37

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<210> 38

<211> 20

<212> DNA

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<220>

<223> Primer

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cggccacaaa gaccacaaag

<210> 39

<211> 23

<212> DNA

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<220>

<223> Primer

<400> 39

aaccaaagaa ttgttgctgc ttt

<210> 40

<211> 25

<212> DNA

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<220>

<223> Primer

<400> 40

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<210> 41

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Primer

<400> 41

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<210> 42

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<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Primer

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<210> 43 <211> 25 <212> PNA

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<220>

<223> Primer <400> 43

gcggtgaccc gggagatctg aattc

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<212> DNA

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<220>

<223> Primer

<400> 44

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<210> 45

<211> 25

<212> DNA

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<220>

<223> Primer

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<210> 46

<211> 21

<212> DNA

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<223> Primer

<400> 46

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<210> 47

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<223> Primer

<400> 47

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<210> 48

<211> 24

<212> DNA

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<220>

<223> Primer

<400> 48

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<212> DNA

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<220>

<223> Primer

<400> 49

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<210> 50

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<212> DNA

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<220>

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<210> 51

<211> 36

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<220>

<223> Primer

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<210> 52

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<400> 52

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<210> 53

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<223> Primer

<400> 53

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<210> 54

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<212> DNA

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<220>

<223> Primer

<400> 55

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<212> DNA

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<220>

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<220>

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<210> 57

<211> 36

<212> DNA

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<220>

<223> Primer

<400> 57

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<210> 58

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<212> DNA

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<220>

<223> Primer

<400> 56

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44

<400> 58

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38

<210> 59 <211> 35 <212> DNA <213> Arti fiei ai

<220>

<223> Primer

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35

<210> 60

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<212> DNA

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<220>

<223> Primer

<400> 60

ccaagagtta tggggcccca gttg 24

<210> 61

<211> 36

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Primer

<210> 62

<211> 69

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Primer <400> 62

tggactagta catgcatgcg gtgagaaagt agaaagcaaa cattgttgtt gttgttgtcg 60 ttgtttttg 69

<210> 63

<211> 42

<212> DNA

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<220>

<223> Primer

<210> 64

<211> 43

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

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<400> 64

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36

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<210> 65

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<223> Primer

<400> 65

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<400> 66

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<212> DNA

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<400> 67

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<400> 68

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52

<210> 69

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<400> 69

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53

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<210> 71

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<400> 71

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<210> 72

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<210> 73

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<212> DNA

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<210> 74

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<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Primer

<400> 74

aaaaacccgg gtgagtcgga cttgaacaac g

<210> 75

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Primer

<400> 75

tctccagact cttgttgctg

<210> 76 <211>

<212> DNA.

<213> Artificial

<220>

<223> Primer

<400> 76

gtgaggaaga agatgcacag 20

<210> 77

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Primer

<400> 77

gcctgttgga tattctctcc 20

<210> 78

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Primer

<400> 78

gaggacagct aggtttatgc 20

<210> 79

<211> 1737

<212> DNA

<220>

<221> nrisc_feature <222> C546)..(546) <223> η is a, c, g, or t

<400> 79

atgttactca gatcactaaa ctcttctgct cgttgtgtca aacaaacaac cagaacaaag 60

gttaggtatc tcagccacgt cagtggtgca agcatggcga aacctacatt gaagaacaac 120

tcgagagaat ccaacaaatc cagaaactat ctaattgctg ctgtgacagc attggctgta 180

tcaacctcaa ttggagttgc cgtacatgtg aaggacccct tgtataacga tgctaccggc 240

agtgattctc cgagaagtat atctgttgac gagtttgtca agcataattc acaaaacgac 300

tgttggattg caatcaatgg caaggtttat gatttcactg attttattcc aaaccatcca 360

ggtggggtac ctccattagt taatcatgct ggttatgatg gtactaaact ttatgagaaa 420

ttgcatccaa aaggtacaat tgagaaattc ttgccaaagg ataagtttct gggtgtgtta 480

gatggtgaag cgccaaaatt ggaagcagac tatttggttg acgatgatga acaagagcga 540

ctggantatt tgggcaactt acctcctttg tcatctattc agaatgttta tgatttcgaa 600

tacttggcca agaagatttt acctaaagat gcctgggcat attattcttg tggtgccgat 660 gatgaaatrca caatgagag aaéCccfaTtâfgcttatcaaa gagtttattt cagaccaaga 720 atttgtgttg atgtcaagga agttgatact tcttatgaaa tgttaggcac taaaacctct 780 gttccttttt atgtatctgc caccgctttg gctaaattag gccatcctga tggtgaatgc 840 tcaattgcta gaggcgctgg taaggaaggt gtcgttcaaa tgatttcgac cctttcctca 900 atgtcattag atgaaattgc cgctgctaga attccaggtg caacccaatg gttccaatta 960 tacattaatg aggatagaaa tgtcgctaaa ggtctggtca aacatgcaga agacttgggt 1020 atgaaggcta tctttataac tgttgatgct ccttctctag gtaacagaga aaaggataaa 1080 agattaaagt ttgttaatga caccgatgtc gatttgggtg attccgcaga tcgaaacagt 1140 ggtgcttcaa aggcactatc ttcgttcatt gatgcttctg tctcttggaa tgacgtcaaa 1200 gcggtcaagt cgtggactaa attgcctgtc ttagttaaag gtgttcaaac agttgaagac 1260 gttattgaag cttacgatgc tggttgtcaa ggtgttgttt tgtcaaacca cggtggtagg 1320 caactagata ctgctcctcc tccaatcgaa ttattagctg aaactgttcc aactttgaag 1380 agattgggta aattaagacc agattttgaa attttaattg acggtggtgt caaaagaggt 1440 accgatattt tgaaagcagt cgcaatcggt ggccaagatg tcagagtttc agttggtatg 1500 ggtagacctt tcttatatgc caactcttgc tatggtgaag caggtgttag aaaattaatt 1560 caaaatctaa aggatgaatt agaaatggat atgagattgt tgggtgtcac taaaatggac 1620 cagctatctt cgaaacatgt cgatactaaa cgtttgattg gtagagatgc gatcaactat 1680 ttgtatgata atgtatacag cccaatcgaa accgttaaat tcaacaatga agattga 1737

<210> 80 <211> 577 <212> PRT <213> Issatchenkia orientalis <400> 80

Met Leu Leu Arg Ser Leu Asn ser Ser Ala Arg Cys Val Lys Gln Thr 1 5 10 15

Thr Arg Thr Lys vai Arq Tyr Leu Ser His Val ser Gly Ala Ser Met 20 25 30

Ala Lys Pro Thr Leu Lys Asn Asn Ser Arg Glu ser Asn Lys Ser Arg 35 40 45

Asn Tyr Leu Ile Ala Ala Val Thr Ala Leu Ala vai Ser Thr Ser Ile 50 55 60

Gly vai Ala vai His vai Lys Asp Pro Leu Tyr Asn Asp Ala Thr Gly 65 70 75 80

Ser Asp ser Pro Arg Ser lie Ser Val Asp Glu Phe Val Lys His Asn 85 90 95 Ser Gln Ksh Aslp' cySTrp Πί Wivrie Asn Gly Lys Val Tyr Asp Phe 100 105 110

Thr Asp Phe Ile Pro Asn His Pro Gly Gly Val Pro Pro Leu Val Asn 115 120 125.

Gly Thr Ile Glu Lys Phe Leu Pro Lys Asp Lys Phe Leu Gly Val Leu 145 150 155 160

Asp Gly Glu Ala Pro Lys Leu Glu Ala Asp Tyr Leu Val Asp Asp Asp 165 170 175

Glu Gln Glu Arg Leu Tyr Leu Gly Asn Leu Pro Pro Leu Ser ser Ile 180 185 190

Gln Asn Val Tyr Asp Phe Glu Tyr Leu Ala Lys Lys Ile Leu Pro Lys 195 200 205

Asp Ala Trp Ala Tyr Tyr Ser Cys Gly Ala Asp Asp Glu Ile Thr Met 210 215 220

Arg Glu Asn His Tyr Ala Tyr Gln Arg Val Tyr Phe Arg Pro Arg Ile 225 230 235 240

Cys vai Asp vai Lys Glu vai Asp Thr ser Tyr Glu Met Leu Gly Thr 245 250 255

Lys Thr Ser Val Pro Phe Tyr Val Ser Ala Thr Ala Leu Ala Lys Leu 260 265 270

Gly His Pro Asp Gly Glu Cys ser Ile Ala Arg Gly Ala Gly Lys Glu 275 280 285

Gly Val Val Gln Met Ile ser Thr Leu Ser ser Met Ser Leu Asp Glu 290 295 300

Ile Ala Ala Ala Arg Ile Pro Gly Ala Thr Gln Trp Phe Gln Leu Tyr 305 310 315 320

Ile Asn Glu Asp Arg Asn Val Ala Lys Gly Leu Val Lys His Ala Glu 325 330 335

Asp Leu Gly Met Lys Ala Ile Phe Ile Thr Val Asp Ala Pro ser Leu 340 345 350

Gly Asn Arg Glu Lys Asp Lys Arg Leu Lys Phe Val Asn Asp Thr Asp 355 360 365 Val Aèp-teu "èly-ASp""ser A1Ia WSp'"ATg Asn ser Gly Ala ser Lys Ala 370 375 380

Leu ser ser Phe Ile Asp Ala Ser Val ser Trp Asn Asp vai Lys Ala 385 390 395 400

Val Lys ser Trp Thr Lys Leu Pro vai Leu Val Lys Gly Val Gln Thr 405 410 415

Val Glu Asp Val Ile Glu Ala Tyr Asp Ala Gly Cys Gln Gly Val Val 420 425 430

Leu Ser Asn His Gly Gly Arg Gln Leu Asp Thr Ala Pro pro Pro Ile 435 440 445

Glu Leu Leu Ala Glu Thr Val Pro Thr Leu Lys Arg Leu Gly Lys Leu 450 455 460

Arg Pro Asp Phe Glu Ile Leu Il e Asp Gly Gly Val Lys Arg Gly Thr 465 470 475 480

Asp Ile Leu Lys Ala Val Ala Ile Gly Gly Gln Asp Val Arg vai Ser 485 490 495

Val Gly Met Gly Arg Pro Phe Leu Tyr Ala Asn Ser Cys Tyr Gly Glu 500 505 510

Ala Gly vai Arg Lys Leu Ile Gln Asn Leu Lys Asp Glu Leu Glu Met 515 520 525

Asp Met Arg Leu Leu Gly vai Thr Lys Met Asp Gln Leu Ser Ser Lys 530 535 540

His Val Asp Thr Lys Arg Leu Ile Gly Arg Asp Ala Ile Asn Tyr Leu 545 550 555 560

Tyr Asp Asn Val Tyr ser Pro Ile Glu Thr Val Lys Phe Asn Asn Glu 565 570 575

ASp

<210> 81

<211> 1698

<212> DNA

<213> Issatchenkia orientalis

<220>

<221> misc_feature

<222> (941)..(941)

<223> η is a, c, g, ou t <220>

<221> IMrscrfearwrer <222> (943)..(943) <223> η is a, c, g, ou t

<400> 81

atgttaagat cccagttcaa aaacattttg aaaaatgtta acaagaacca ttctctaagg 60

agaactttta cttccagcac ctcaaaggct ggaaaaaatg cttcatacaa tgccaagatt 120

atatctgcaa ccgtggcctc gattgttgca gcagctggct cttatatgtt ggtccagcct 180

tcactàgcta atgatgaggc acagtctgct aatccaacta ggaagatctc tgttgacgaa 240

tttgttaaac acaaccatgc cgatgattgt tggatcactg ttaacggtaa cgtctatgac 300

ttgactgatt tcattteaat gcatccaggt ggtactaccc cattgattca aaatgcaggt 360

cacgacgcaa ctgaaattta caacaagatt catccaaagg gtacaatcga gaacttctta 420

ccaaaggaaa agcaattggg tgttttggat ggtgaagctc ctaaaatcga agttgtgctt 480

gacgaaaagg agaaacacag attggagttg ttgaatcatc tccctgctct ttccagaatt 540

caaaacattt atgatttcga acatattgct tctagagttt tgagcgacca agcatggaac 600

tactattcat gtggtgccga agatgaaatc accttgaggg aaaatcatta tgcttaccaa 660

agaatctact ttaagccaaa atgttgtgtc aatgttgcag aagttgatac ctctcatgaa 720

attttaggta caaaagcttc tgttcctttc tacgtttccg cagccgcttc tgcaaagttg 780

gggcacgagg atggtgaatg ttccattgct agaggtgcag gtaaggaagg cgttattcaa 840

atgatttctt ccttctcttc caactctttg gaggaaattg cagaatccag aattcctggt 900

gcaacacaat ggtttcaatt atacgttaat gaagacaagg ntnttgtgaa gaagacttta 960

aaaagggccg aaaacttggg tatgaaggcc atctttgtca ctgtggacgc tgctagtaga 1020

ggtaatagag aaaaagacat tacaatgaga attaccgaag atacagatga gttaatagac 1080

gattcttctg ttagagctgg ttctacctct ggtgcattgc cagctttcat tgacaagagg 1140

ctgacttggg atgaagttaa ggatatcatt tcatggacca agttaccagt tttgctgaag 1200

ggtgttcaaa gaactgatga tattgagaag gcaattgata ttggttgtaa gggtgttgtc 1260

ttgtccaatc atggtggtag acaattagat acttctcctc ctccaataga agttatggct 1320

gaatctgttc caatcctaaa gcaaaagggt aaactggatc caaatttcag tattttcgtt 1380

gatggtggtg ttagaagagg tacagatatt ttgaaagctt tggctattgg tggcagagac 1440

tgtaaagttg ctgttggtct gggtagacct ttcctttatg caaatactgg ttatggtgaa 1500

aagggtgtca gaaaggccgt gcaaáttcta agagaagaat taaaggctga catgagaatg 1560

ttgggcgtta cctctttgaa cgagctagac gactcttaca ttgacaccag aagattacta 1620 ggtagagatg ctgttaacca catatacaac aacaactact acccaatgtc taagattcaa 1680

ttcaaaaacg aaaaataa 1698

<210> 82 <211> 565 <212> PRT <213> Issatchenkia orientalis <220>

<221> misc_feature

<222> (314)..(315)

<223> Xaa pode ser qualquer aminoácido de ocorrência natural

<400> 82

Met Leu Arg ser Gln Phe Lys Asn Ile Leu Lys Asn Val Asn Lys Asn 1 5 10 15

His Ser Leu Arg Arg Thr Phe Thr Ser ser Thr Ser Lys Ala Gly Lys 20 25 30

Asn Ala Ser Tyr Asn Ala Lys Ile Ile ser Ala Thr vai Ala ser Ile 35 40 45

Val Ala Ala Ala Gly Ser Tyr Met Leu Val Gln Pro ser Leu Ala Asn 50 55 60

Asp Glu Ala Gln Ser Ala Asn Pro Thr Arg Lys Ile Ser vai Asp Glu 65 70 75 80

Phe Val Lys His Asn His Ala Asp Asp Cys Trp Ile Thr Val Asn Gly 85 90 95

Asn vai Tyr Asp Leu Thr Asp Phe Ile Ser Met His Pro Gly Gly Thr 100 105 110

Thr Pro Leu Ile Gln Asn Ala Gly His Asp Ala Thr Glu Ile Tyr Asn 115 120 125

Lys Ile His Pro Lys Gly Thr Ile Glu Asn Phe Leu Pro Lys Glu Lys 130 135 140

Gln Leu Gly Val Leu Asp Gly Glu Ala Pro Lys Ile Glu vai vai Leu 145 150 155 160

Asp Glu Lys Glu Lys His Arg Leu Glu Leu Leu Asn His Leu Pro Ala 165 170 175

Leu Ser Arg Ile Gln Asn Ile Tyr Asp Phe Glu His Ile Ala Ser Arg 180 185 190

vai Leu Ser Asp Gln Ala Trp Asn Tyr Tyr Ser Cys Gly Ala Glu Asp 195 200 205

Glu Ile Thr Leu Arg Glu Asn His Tyr Ala Tyr Gln Arg Ile Tyr Phe 210 215 220

Lys Pro Lys Cys Cys Val Asn vai Ala Glu Val Asp Thr ser His Glu 225 230 235 240 Ile Leu Gly Thr Lys Ala Ser Val Pro Phe Tyr vai ser Ala Ala Ala 245 250 255

Ser Ala Lys Leu Gly His Glu Asp Gly Glu Cys ser lie Ala Arg Gly 260 265 270

Ala Gly Lys Glu Gly vai Ile Gln Met Ile ser ser Phe Ser ser Asn 275 280 285

Ser Leu Glu Glu Ile Ala Glu Ser Arg lie Pro Gly Ala Thr Gln Trp 290 295 300

Phe Gln Leu Tyr Val Asn Glu Asp Lys Xaa Xaa Val Lys Lys Thr Leu 305 310 315 320

Lys Arg Ala Glu Asn Leu Gly Met Lys Ala Ile Phe Val Thr vai Asp 325 330 335

Ala Ala ser Arg Gly Asn Arg Glu Lys Asp Ile Thr Met Arg lie Thr 340 345 350

Glu Asp Thr Asp Glu Leu Ile Asp Asp Ser Ser Val Arg Ala Gly Ser 355 360 365

Thr ser Gly Ala Leu Pro Ala Phe Ile Asp Lys Arg Leu Thr Trp Asp 370 375 380

Glu vai Lys Asp Ile Ile Ser Trp Thr Lys Leu Pro vai Leu Leu Lys 385 390 395 400

Gly vai Gln Arg Thr Asp Asp Ile Glu Lys Ala Ile Asp Ile Gly Cys 405 410 415

Lys Gly Val vai Leu Ser Asn His Gly Gly Arg Gln Leu Asp Thr Ser 420 425 430

Pro Pro Pro Ile Glu Val Met Ala Glu Ser Val Pro Ile Leu Lys Gln 435 440 445

Lys Gly Lys Leu Asp Pro Asn Phe ser Ile Phe Val Asp Gly Gly vai 450 455 460

Arg Arg Gly Thr Asp Ile Leu Lys Ala Leu Ala Ile Gly Gly Arg Asp 465 470 475 480

Cys Lys Val Ala Val Gly Leu Gly Arg Pro Phe Leu Tyr Ala Asn Thr 485 490 495

Gly Tyr Gly Glu Lys Gly vai Arg Lys Ala Val Gln Ile Leu Arg Glu 500 505 510 Glu Leu Lys Ala Asp Met Arg Met Leu Gly Val Thr ser Leu Asn Glu 515 520 . 525

Leu Asp Asp ser Tyr Ile Asp Thr Arg Arg Leu Leu Gly Arg Asp Ala

vai Asn His Ile Tyr Asn Asn Asn Tyr Tyr Pro Met ser Lys Ile Gln

545 550 555 560

Phe Lys Asn Glu Lys 565

<210> 83 <211> 1778 <212> DNA

<213> Kluyveromyces marxianus <400> 83

atgctaccaa ggttcgtggt tagatctggt gccgcaggaa gaaacctggg cttcagtttc 60

actcgtaaat gcgaccatac ttttctaagt aagactgtgc gcaatgactt gtcgcacaga 120

ccctattcta ccggaactaa cggtaatggc agtgccaatg ccggtaaaag ccaaagcggt 180

ttgttgtttg gtgtttttgg aggtactttg atcggtggtg ggctggttgc gtactttttg 240

gggtcgaagt tcgaccagca acagagctca tctcagcaag tcagcgattt gtccattgct 300

agactagagg atttggactc gcccaagtac tgcgacaaga agacgtttgc tactgctgtc 360

gaggagttga aacaggtgtt ggataacaac ccagagaact tttcggacgc caagagcgac 420

ttagactcgc actcagacac atatttcaac tcgcaccatg ccacgccaga acagagaccc 480

gaaatcgttt tgttcccccg taacacggaa gacgtttcca agttactcaa gatatgccac 540

aagtactcca ttcctgtcat tccattctcc ggtgggacct cgctcgaggg ccacttcatg 600

cccacgagac cgggctcctg cgtcgttttg gacatctcca agtacatgaa ccaattatcc 660

agttgaacaa ggaagacctc gacgtggtcg tgcaaggtgg tgttccatgg gaagacttga 720

acgactactt gaacgaccac gggttgttgt tcggttgcga tcctggtcca ggtgcccaga 780

tcgctggttg tattgctaac tcttgttccg gaaccaatgc gtaccgttac ggtactatga 840

aagaaaacgt cgtcaacatc accatgtgtc ttgccgacgg taccatcatc aagaccaaga 900

gaagaccaag aaaatcctct gctggttaca acttgaacgg tttgatcatc ggaagcgagg 960

gtaccttggg tattgtcacc gaggcaacaa taaagtgtca cgtgagatct aactttgaaa 1020

ccgtcgctgt tgttccgttc cccagcgtgg ccgatgctgc ctcgtgctcc tcccacttga 1080

tccaggccgg tatccagctg aatgccatgg aattgttgga cgataacatg atgaagatca 1140

tcaacaagag cggtgctact tcaagaacaa actgggtcga atcaccaacc ttattçttca 1200

agattggtgg gagaagcgaa aaggccatca aagaagtggt taaagaggtc gagaagatcg 1260

cctctcaaca caacaacagc aacttcgaat ttgcatctga tgaagaaact aaattggaat 1320 tgtgggaagc tagaaaaçpc gcUGttitiggt· ctacgattga tgcaggtaag aagttggatc 1380

caaacgtcaa cgtttggacc accgatgttg ccgttcctat ctccaaattc gcccaggtta 1440

tcaacgatac aaaggaggaa atgaacgctt ctggattatt gacctctctt gttggtcatg 1500

ccggtgacgg taatttccat gctttcatca tttacaatgc cgaacaacgt aagaccgcag 1560

aaaccattgt cgaaaatatg gtcaagagag ccattgacgc agaaggtacc tgtaccggtg 1620

aacacggtgt tggtattggt aagagagagt ttttggttga agagttgggc gaagatacaa 1680

ttgctgtcat gagaaaattg aaacttgcct tggatccaaa gaggatcttg aaccctgaca 1740

aggtcttcaa gattgaccct aacgatcacc aacactga 1778

<210> 84

<211> 592

<212> PRT

<213> Kluyveromyces marxianus

<400> 84

Met Leu Pro Arg Phe Val Val Arg Ser Gly Ala Ala Gly Arg Asn Leu 1 5 10 15

Gly Phe ser Phe Thr Arg Lys Cys Asp His Thr Phe Leu ser Lys Thr 20 25 30

Val Arg Asn Asp Leu Ser His Arg Pro Tyr ser Thr Gly Thr Asn Gly 35 40 45

Asn Gly Ser Ala Asn Ala Gly Lys Ser Gln Ser Gly Leu Leu Phe Gly 50 55 60

Val Phe Gly Gly Thr Leu Ile Gly Gly Gly Leu Val Ala Tyr Phe Leu 65 70 75 80

Gly ser Lys Phe Asp Gln Gln Gln Ser ser Ser Gln Gln vai ser Asp 85 90 95

Leu Ser Ile Ala Arg Leu Glu Asp Leu Asp Ser Pro Lys Tyr Cys Asp 100 105 110

Lys Lys Thr Phe Ala Thr Ala Val Glu Glu Leu Lys Gln Val Leu Asp 115 120 125

Asn Asn Pro Glu Asn Phe Ser Asp Ala Lys Ser Asp Leu Asp ser His 130 135 140

Ser Asp Thr Tyr Phe Asn Ser His His Ala Thr Pro Glu Gln Arg Pro 145 150 155 160

Glu Ile vai Leu Phe Pro Arg Asn Thr Glu Asp Val Ser Lys Leu Leu 165 170 175 Lys Ile-Cys His Lys Tyr Sera .Φ.1 a i£ro vai Ile Pro Phe ser Gly Gly 180 185 190

Thr Ser Leu Glu Gly His Phe Met Pro Thr Arg Pro Gly Ser Cys vai 195 200 205

Val Leu Asp lie Ser Lys Tyr Met Asn Gln Ile Ile Gln Leu Asn Lys 210 215 220

Glu Asp Leu Asp Val Val Val Gln Gly Gly Val Pro Trp Glu Asp Leu 225 230 235 240

Asn Asp Tyr Leu Asn Asp His Gly Leu Leu Phe Gly Cys Asp Pro Gly 245 250 255

Pro Gly Ala Gln ile Ala Gly Cys Ile Ala Asn Ser Cys Ser Gly Thr 260 265 270

Asn Ala Tyr Arg Tyr Gly Thr Met Lys Glu Asn Val Val Asn Ile Thr 275 280 285

Met Cys Leu Ala Asp Gly Thr Ile Ile Lys Thr Lys Arg Arg Pro Arg 290 295 300

Lys ser Ser Ala Gly Tyr Asn Leu Asn Gly Leu Ile Ile Gly Ser Glu 305 310 315 320

Gly Thr Leu Gly Ile vai Thr Glu Ala Thr Ile Lys Cys His Val Arg 325 330 335

Ser Asn Phe Glu Thr Val Ala Val vai Pro Phe Pro Ser vai Ala Asp 340 345 350

Ala Ala Ser Cys Ser Ser His Leu Ile Gln Ala Gly Ile Gln Leu Asn 355 360 365

Ala Met Glu Leu Leu Asp Asp Asn Met Met Lys Ile ile Asn Lys ser 370 375 380

Gly Ala Thr Ser Arg Thr Asn Trp Val Glu Ser Pro Thr Leu Phe Phe 385 390 395 400

Lys Ile Gly Gly Arg ser Glu Lys Ala Ile Lys Glu Val Val Lys Glu 405 410 415

vai Glu Lys Ile Ala Ser Gln His Asn Asn Ser Asn Phe Glu Phe Ala 420 425 430

Ser Asp Glu Glu Thr Lys Leu Glu Leu Trp Glu Ala Arg Lys Val Ala 435 440 445 Leu Trp Ser Thr Xle Asp..Ala ,Gily fcys Lys Leu Asp Pro Asn Val Asn 460

Val Trp Thr Thr Asp vai Ala Val Pro lie Ser Lys Phe Ala Gln vai 465 470 475 480

lie Asn Asp Thr Lys Glu Glu Met Asn Ala Ser Gly Leu Leu Thr ser 485 490 495

Leu Val Gly His Ala Gly Asp Gly Asn Phe His Ala Phe lie lie Tyr 500 505 510

Asn Ala Glu Gln Arg Lys Thr Ala Glu Thr Ile Val Glu Asn Met Val 515 520 525

Lys Arg Ala Ile Asp Ala Glu Gly Thr Cys Thr Gly Glu His Gly Val 530 535 540

Gly Ile Gly Lys Arg Glu Phe Leu vai Glu Glu Leu Gly Glu Asp Thr 545 550 555 560

Ile Ala Val Met Arg Lys Leu Lys Leu Ala Leu Asp Pro Lys Arg lie 565 570 575

Leu Asn Pro Asp Lys Val Phe Lys Ile Asp Pro Asn Asp His Gln His 580 585 590

<210> 85 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial

<220>

<223> Primer <400> 85

gcgatatcaa tggtgatacc tc 22

<210> 86

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Primer <400> 86

gaacccaagc gtacttgaaa g 21

<210> 87

<211> 32

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Primer <400> 87

attaaiegagai idtear-gt^ag-'tgcgre^tea gg 32

<210> 88

<211> 34

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Primer

<400> 88

ataatttcta gatgttgatg atgtgttgaa tttg 34

<210> 89

<211> 33

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Primer

<400> 89

gaaggatccg tgttgaatta ggtaaggttc tag 33

<210> 90

<211> 33

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Primer

<4Q0> 90

gaaactagtc ttccagtaac catatctttc ctg

33

Claims (14)

1. Célula de levedura geneticamente modificada, CARACTERIZADA pelo fato de que tem (a) pelo menos um gene de lactato desidrogenase (LDH) exógeno funcional integrado no seu genoma e (b) uma deleção ou ruptura de (i) pelo menos um gene nativo de L- ou D-lactato:ferricitocromo c oxidoredutase.

2. Célula de levedura geneticamente modificada, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que tem (a) uma deleção ou ruptura de pelo menos um gene L- lactato:ferricitocromo c oxidoredutase e (b) pelo menos um gene de L-lactato desidrogenase exógeno funcional integrado no seu genoma.

3. Célula de levedura geneticamente modificada, de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADA pelo fato de que é uma célula do gêneros Candida, Saccharomyces, Shizosae- eharomyes, Kluyveromyces, Piehia, Issaehenkia ou Hansenula.

4. Célula de levedura geneticamente modificada, de acordo com a reivindicação 3, CARACTERIZADA pelo fato de que é uma célula das espécies K. marxianus, S. cerevisiae, C. sonorensis, S. bulderi ou I. orientalis.

5. Célula de levedura geneticamente modificada, de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADA pelo fato de que adicionalmente tem uma deleção ou ruptura de pelo menos um gene piruvato descarboxilase.

6. Célula de levedura geneticamente modificada, de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADA pelo fato de que o gene deletado ou interrompido L-lactatorferricitocromo c oxidoredutase é um gene tendo uma seqüência identificada co- mo SEQ ID NO. 1 , SEQ. ID. NO. 79 ou SEQ. ID. NO. 81, ou é pe- lo menos 4 0 % homóloga a qualquer um de tais genes.

7. Célula de levedura geneticamente modificada, de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADA pelo fato de que o gene deletado ou interrompido L-Iactato:ferricitocromo c oxidoredutase codifica para uma enzima tendo uma seqüência de aminoácidos identificada como SEQ. ID. NO. 2, SEQ. ID. NO. 80 ou SEQ. ID. NO. 82, ou uma enzima que tem uma seqüên- cia de aminoácidos que é pelo menos 40 % homóloga a qualquer uma destas.

8. Célula de levedura geneticamente modificada, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que tem (a) uma deleção ou ruptura de pelo menos um gene D- lactato:ferricitocromo c oxidoredutase e (b) pelo menos um gene de D-Iactato desidrogenase exógeno funcional integrado no seu genoma.

9. Célula de levedura geneticamente modificada, de acordo com a reivindicação 8, CARACTERIZADA pelo fato de que é uma célula do gênero Candida, Saccharomyces, Shizosaccha- romyes, Kluyveromyces, Pichiar Issaehenkia ou Hansenula .

10. Célula de levedura geneticamente modificada, de acordo com a reivindicação 9, CARACTERIZADA pelo fato de que é uma célula das espécies K. marxianus, S. eerevisiae, C. sonorensis, S. bulderi ou I. orientalis.

11. Célula de levedura geneticamente modificada, de acordo com a reivindicação 8, CARACTERIZADA pelo fato de que adicionalmente tem uma deleção ou ruptura de pelo menos um gene piruvato descarboxilase.

12. Célula de levedura geneticamente modificada, de acordo com a reivindicação 8, CARACTERIZADA pelo fato de que o gene deletado ou interrompido D-Iactatorferricitocromo c oxidoredutase é um gene tendo uma seqüência identificada como SEQ. ID. NO. 83 (o gene D-Iactatorferricitocromo c oxi- doredutase (DLDl) de uma cepa de K. marxianus tipo selva- gem) , o gene DLDl de S. cerevisiae, o gene DLDl de I. ori- entalis, ou é um gene que é pelo menos 40 % homólogo a pelo menos um de tais genes.

13. Célula de levedura geneticamente modificada, de acordo com a reivindicação 8, CARACTERIZADA pelo fato de que o gene deletado ou interrompido D-Iactatorferricitocromo c oxidoredutase codifica para uma enzima tendo uma seqüência de aminoácidos identificada como SEQ. ID. NO. 84, uma prote- ína tendo a seqüência de aminoácidos de uma proteína codifi- cada pelo gene DLDl de S. cerevisiae, uma proteína tendo a seqüência de aminoácidos de uma proteína codificada pelo ge- ne DLDl de I. orientalis, ou uma proteína que é pelo menos -40 % homóloga a uma destas.

14. Processo de fermentação, CARACTERIZADO pelo fato de que uma célula de levedura geneticamente modificada, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1-13 é cultivada em condições de fermentação em um caldo de fermen- tação que inclui um açúcar fermentável para produzir ácido lático ou um sal deste.