KR102219700B1 - Fps1의 활성이 감소된, 내산성을 갖는 효모 세포 및 그를 이용하여 락테이트를 생산하는 방법 - Google Patents

Abstract

유전적으로 조작되지 않은 세포에 비하여 Fps1의 활성이 감소된, 내산성을 갖는 효모 세포 및 그를 이용하여 락테이트를 생산하는 방법을 제공한다.

Description

Fps1의 활성이 감소된, 내산성을 갖는 효모 세포 및 그를 이용하여 락테이트를 생산하는 방법{Acid resistant yeast cell with reduced Fps1 activity and method for producing lactate using the same}

Fps1의 활성이 감소된, 내산성을 갖는 효모 세포 및 그를 이용한 락테이트를 생산하는 방법에 관한 것이다.

락테이트는 식품, 제약, 화학, 전자 등 다양한 산업 분야에서 폭넓게 사용되는 유기산이다. 락테이트는 무색, 무취이고 물에 잘 용해되는 저휘발성 물질이다. 락테이트는 인체에 독성이 없어 향미제, 산미제, 보존제 등으로 활용되고 있고, 또한 환경친화적으로 대체 고분자 물질이고, 생분해성 플라스틱인 폴리락틱산 (polylactic acid: PLA)의 원료이다.

PLA는 기술적으로는 고분자 중합을 위해 다이머인 락티드 (lactide)로 전환하여 개환 중합된 (ring-open polymerization) 폴리에스터계 수지이며, 필름, 시트, 섬유, 사출 등의 다양한 가공이 가능하다. 따라서, PLA는 폴리에틸렌 (PE), 폴리프로필렌 (PP), 폴리에틸렌 테레프탈레이트 (PET), 폴리스틸렌 (PS) 등 기존 범용 석유화학 플라스틱을 광범위하게 대체할 수 있는 바이오 플라스틱으로서 최근 수요가 크게 증가하고 있다.

또한, 락테이트는 수산기와 카르복실기를 동시에 갖고 있어 반응성이 매우 크고, 그에 따라 락테이트 에스테르, 아세트알데이드, 프로필렌글리콜 등 공업적으로 중요한 화합물로의 전환이 용이하여, 화학공업 분야에 있어서도 차세대 대체 화학 원료로서 주목받고 있다.

현재, 락테이트는 산업적으로 석유화학적 합성 공정과 생물공학적 발효 공정에 의해 생산되고 있다. 석유화학적 합성 공정은, 원유에서 유래된 에틸렌을 산화시키고, 아세트알데히드를 거쳐 시안화수소 첨가 반응에 의해 락토니트릴을 만든 후, 증류시켜 정제하고, 염산이나 황산을 사용하여 가수분해함으로써 제조된다. 또한, 생물공학적 발효 공정은 전분, 수크로스, 말토스, 글루코스, 프럭토스, 자일로스 등의 재생가능한 탄수화물을 기질로 하여 락테이트를 제조할 수 있다.

따라서, 이러한 종래 기술에 의하더라도, 락테이트를 효율적으로 생산할 수 있는 균주 및 그를 이용한 락테이트 생산 방법이 요구되고 있다.

일 양상은 Fps1의 활성이 감소된, 내산성을 갖는 효모 세포를 제공하는 것이다.

다른 양상은 상기 효모 세포를 이용하여 락테이트를 효율적으로 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

본 명세서에서 사용된 용어 효소 또는 폴리펩티드의 "활성 감소"는 세포, 또는 단리된 효소 또는 폴리펩티드가 비교 가능한 동일 종의 세포 또는 그의 본래 폴리펩티드에서 측정된 활성 수준과 비교하여 낮은 활성 수준을 나타내거나 활성을 나타내지 않는 것을 의미한다. 즉 해당 효소 또는 폴리펩티드의 활성이 본래 조작되지 않은 효소 또는 폴리펩티드에 의한 동일한 생화학적 활성보다 약 5% 이상, 약 10% 이상, 약 15% 이상, 약 20%이상, 약 30%이상, 약 40%이상, 약 50% 이상, 약 55% 이상, 약 60% 이상, 약 70% 이상, 약 75% 이상, 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상, 또는 약 100% 감소된 것일 수 있다. 또한, 해당 세포 중의 특정 효소 또는 폴리펩티드의 활성이 조작되지 않은 세포 중의 상기 효소 또는 폴리펩티드의 활성보다 약 5% 이상, 약 10% 이상, 약 15% 이상, 약 20% 이상, 약 30% 이상, 약 50% 이상, 약 60% 이상, 약 70% 이상, 또는 약 100% 이상 감소된 것일 수 있다. 감소된 효소 또는 폴리펩티드의 활성은 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 확인될 수 있다. 상기 효소 또는 폴리펩티드의 활성이 감소되는 것은 상기 효소 또는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 제거 또는 파괴에 의한 것일 수 있다. 상기 유전자의 "제거 (deletion)" 또는 "파괴 (disruption)"는 유전자가 발현되지 않거나 발현량이 감소되거나, 발현되어도 효소 활성을 나타내지 않거나 활성이 감소되도록, 유전자의 일부 또는 전부가, 또는 그 프로모터, 그 터미네이터 영역 등의 조절인자의 일부 또는 전부가 변이, 치환, 삭제되거나 유전자에 하나 이상의 염기가 삽입되는 것을 말한다. 상기 유전자의 제거 또는 파괴는 상동재조합과 같은 유전자 조작, 돌연변이 유발, 또는 분자 진화를 통해 달성될 수 있다. 세포가 복수개의 같은 유전자를 포함하거나 2개 이상의 다른 폴리펩티드 동종상동유전자(paralog)를 포함하는 경우, 하나 또는 그 이상의 유전자가 제거 또는 파괴될 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 효소 또는 폴리펩티드의 "활성 증가"는 효소 또는 폴리펩티드가 활성을 나타낼 수 있도록 충분한 정도로 증가된 것일 수 있으며, 세포 또는 단리된 폴리펩티드가 비교 가능한 동일 종의 세포 또는 그의 본래 폴리펩티드에서 측정된 활성 수준과 비교하여 높은 활성 수준을 나타냄을 의미한다. 즉 해당 효소 또는 폴리펩티드의 활성이 본래 조작되지 않은 효소 또는 폴리펩티드에 의한 동일한 생화학적 활성보다 약 5% 이상, 약 10% 이상, 약 15% 이상, 약 20% 이상, 약 30% 이상, 약 50% 이상, 약 60% 이상, 약 70% 이상, 또는 약 100% 이상 증가된 것일 수 있다. 또한, 해당 세포 중의 특정 효소 또는 폴리펩티드의 활성이 조작되지 않은 세포 중의 상기 효소 또는 폴리펩티드의 활성보다 약 5% 이상, 약 10% 이상, 약 15% 이상, 약 20% 이상, 약 30% 이상, 약 50% 이상, 약 60% 이상, 약 70% 이상, 또는 약 100% 이상 증가된 것일 수 있다. 폴리펩티드의 증가된 활성을 갖는 세포는 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 확인될 수 있다.

효소 또는 폴리펩티드의 활성 증가는 발현 증가 또는 비활성 (specific activity)의 증가에 의하여 얻을 수 있다. 상기 비활성 증가는 상기 효소 또는 폴리펩티드 중 활성 도메인 (active domain)의 특정 아미노산의 변이 또는 임의 돌연변이유발 (random mutagenesis)에 의한 효소 공학 (enzyme engineering)에 의한 것일 수 있다. 상기 발현 증가는 효소 또는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 세포에 도입되거나 카피수가 증가되거나, 또는 상기 폴리뉴클레오티드의 조절 영역의 변이에 의한 것일 수 있다. 외부에서 도입되거나 또는 카피수가 증가되는 폴리뉴클레오티드는 내인성 (endogenous) 또는 외인성 (exogenous)일 수 있다. 상기 내인성 유전자는 미생물 내부에 포함된 유전물질 상에 존재하던 유전자를 말한다. 외인성 유전자는 외부로부터 세포 내로 도입 (integration)되는 유전자를 의미하며, 도입되는 유전자는 도입되는 숙주세포에 대해 동종 (homologous) 또는 이종 (heterologous)일 수 있다.

"이종성 (heterologous)"은 천연 (native)이 아닌 외인성 (foreign)을 의미할 수 있다.

용어 "카피 수 증가 (copy number increase)"는 상기 유전자의 도입 또는 증폭에 의한 것일 수 있으며, 조작되지 않은 세포에 존재하지 않는 유전자를 유전적 조작에 의해 갖게 되는 경우도 포함한다. 상기 유전자의 도입은 벡터와 같은 비히클을 매개하여 이루어질 수 있다. 상기 도입은 상기 유전자가 게놈에 통합되지 않은 임시적 (transient) 도입이거나 게놈에 삽입되는 것일 수 있다. 상기 도입은 예를 들면, 목적하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 삽입된 벡터를 상기 세포로 도입한 후, 상기 벡터가 세포 내에서 복제되거나 상기 폴리뉴클레오티드가 게놈으로 통합됨으로써 이루어질 수 있다.

본 발명에서 사용되는 유전자의 조작은 당업계에 공지된 분자생물학적 방법에 의할 수 있다 (Roslyn M. Bill, Recombinant Protein Production in Yeast: Methods and Protocols (2012), Sambrook et al., Molecular cloning, A laboratory manual: Cold Spring Habor Laboratory (1989), R Daniel Gietz et al., Quick and easy yeast transformation using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method: Nature protocols (2007)).

용어 "유전자"는 전사 및 번역 중 하나 이상에 의하여 발현 산물, 예를 들면, mRNA 또는 단백질을 생성할 수 있는 핵산 단편을 의미하며, 코딩영역 또는 코딩영역 외 5'-비코딩 서열 (5'-non coding sequence)과 3'-비코딩 서열(3'-non coding sequence) 등의 조절 (regulatory) 서열을 포함할 수 있다.

"세포 (cell)", "균주 (strain)", 또는 "미생물 (microorganism)"은 교체 사용이 가능한 것으로서, 효모, 박테리아, 또는 곰팡이 등을 포함할 수 있다.

본 발명의 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드의 "서열 동일성 (sequence identity)"은 특정 비교 영역에서 양 서열을 최대한 일치되도록 얼라인시킨 후 서열간의 아미노산 잔기 또는 염기의 동일한 정도를 의미한다. 서열 동일성은 특정 비교 영역에서 2개의 서열을 최적으로 얼라인하여 비교함으로써 측정되는 값으로서, 비교 영역 내에서 서열의 일부는 대조 서열 (reference sequence)과 비교하여 부가, 삭제되어 있을 수 있다. 서열 동일성 백분율은 예를 들면, 비교 영역 전체에서 두 개의 최적으로 정렬된 서열을 비교하는 단계, 두 서열 모두에서 동일한 아미노산 또는 핵산이 나타나는 위치의 갯수를 결정하여 일치된 (matched) 위치의 갯수를 수득하는 단계, 상기 일치된 위치의 갯수를 비교 범위 내의 위치의 총 갯수 (즉, 범위 크기)로 나누는 단계, 및 상기 결과에 100을 곱하여 서열 동일성의 백분율을 수득하는 단계에 의해 계산될 수 있다. 상기 서열 동일성의 퍼센트는 공지의 서열 비교 프로그램을 사용하여 결정될 수 있으며, 일례로 BLASTN(NCBI), CLC Main Workbench (CLC bio), MegAlignTM(DNASTAR Inc) 등을 들 수 있다.

여러 종의 동일하거나 유사한 기능이나 활성을 가지는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 확인하는데 있어 여러 수준의 서열 동일성을 사용할 수 있다. 예를 들어, 50%이상, 55%이상, 60%이상, 65%이상, 70%이상, 75%이상, 80%이상, 85%이상, 90%이상, 95%이상, 96%이상, 97%이상, 98%이상, 99%이상 또는 100% 등을 포함하는 서열 동일성이다.

본 명세서에서 사용된 용어 "조작되지 않은 세포 (non-engineered cell)"란 Fps1의 활성이 감소되도록, 유전적으로 조작되지 않은 것을 의미한다. "유전적 조작 (genetic engineering)"이란 세포의 유전물질의 구성 또는 구조를 인위적으로 변경시키는 것을 포함한다. 상기 조작되지 않은 세포는 Fps1의 활성이 감소되도록 유전적으로 조작하는데 사용된 모균주 (parent strain)일 수 있다.

본 명세서에 사용된 용어 락테이트(lactate)는 젖산(lactic acid) 자체뿐만 아니라, 음이온 형태, 그의 염, 용매화물, 다형체 또는 그 조합을 포함하는 것으로 해석된다. 상기 염은 예를 들면 무기산염, 유기산염 또는 금속염일 수 있다. 무기산염은 염산염, 브롬산염, 인산염, 황산염 또는 이황산염일 수 있다. 유기산염은 포름산염, 초산염, 아세트산염, 프로피온산염, 젖산염, 옥살산염, 주석산염, 말산염, 말레인산염, 구연산염, 푸마르산염, 베실산염, 캠실산염, 에디실염, 트리플루오로아세트산염, 벤조산염, 글루콘산염, 메탄술폰산염, 글리콜산염, 숙신산염, 4-톨루엔술폰산염, 갈룩투론산염, 엠본산염, 글루탐산염 또는 아스파르트산염일 수 있다. 금속염은 칼슘염, 나트륨염, 마그네슘염, 스트론튬염 또는 칼륨염일 수 있다.

일 양상은 유전적으로 조작되지 않은 세포에 비하여 Fps1의 활성이 감소된, 내산성을 갖는 효모 세포를 제공한다.

상기 효모 세포는 Fps1을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 제거 또는 파괴된 것일 수 있다. 상기 Fps1은 아쿠아글리세로포린 (aquaglyceroporin)일 수 있다. 상기 Fps1은 글리세롤 채널 단백질(glycerol channel protein), 글리세롤 트랜스포트 폴리펩티드 (glycerol transport polypeptide), 글리세롤 촉진자 채널 (glycerol facilitator channel), 또는 글리세롤 흡수/유출 촉진자 단백질 (Glycerol uptake/efflux facilitator protein으로 지칭될 수 있다. 상기 Fps1을 통하여 글리세롤이 세포 외부로 분비될 수 있다. 상기 Fps1은 Transport Classification Database (M. Saier; U of CA, San Diego)에 의해 제공된 transporter classification system에서 TCDB 1.A.8.5.1로 분류될 수 있다. Fps1 단백질 (Fps1p)은 서열번호 1의 아미노산 서열과 60%이상, 또는 70%이상, 80%이상, 90%이상, 95%이상, 96%이상, 97%이상, 98%이상, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 가질 수 있다. Fps1 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1의 아미노산 서열과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 서열번호 2의 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다.

상기 효모 세포에 있어서, 내산성 (acid resistance)은 조작되지 않은 세포에 비하여, 산성 조건에서 더 좋은 성장을 보이는 것일 수 있다. 상기 산성 조건은 유기산, 무기산 또는 그 조합을 포함하는 산성 조건일 수 있다. 상기 유기산은 C1 내지 C20을 갖는 유기산일 수 있다. 상기 유기산은 아세트산, 젖산, 프로피온산, 3-히드록시프로피온산, 부티르산, 4-히드록시부티르산, 숙신산, 푸마르산, 말산, 옥살산, 아디프산, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 효모 세포는 Fps1의 활성이 감소되지 않은 효모 세포에 비하여, pH 2.0 내지 7.0, 예를 들면, pH 2.0 내지 5.0, pH 2.0 내지 4.5, pH 2.0 내지 4.0, pH 2.0 내지 3.8, pH 2.5 내지 3.8, pH 3.0 내지 3.8, pH 2.0 내지 3.0, pH 2.0 내지 2.7, pH 2.0 내지 2.5, 또는 pH 2.5 내지 3.0의 범위에서 더 잘 생장할 수 있는 것일 수 있다.

또는 내산성은 조작되지 않은 세포에 비하여, 산성 조건에서 더 높은 생존을 보이는 것일 수 있다. 상기 산성 조건은 유기산, 무기산 또는 그 조합을 포함하는 산성 조건일 수 있다. 상기 유기산은 C1 내지 C20을 갖는 유기산일 수 있다. 상기 유기산은 아세트산, 젖산, 프로피온산, 3-히드록시프로피온산, 부티르산, 4-히드록시부티르산, 숙신산, 푸마르산, 말산, 옥살산, 아디프산, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 효모 세포는 Fps1의 활성이 감소되지 않은 효모 세포에 비하여, pH 2.0 내지 7.0, 예를 들면, pH 2.0 내지 5.0, pH 2.0 내지 4.5, pH 2.0 내지 4.0, pH 2.0 내지 3.8, pH 2.5 내지 3.8, pH 3.0 내지 3.8, pH 2.0 내지 3.0, pH 2.0 내지 2.7, pH 2.0 내지 2.5, 또는 pH 2.5 내지 3.0의 범위에서 더 잘 생존할 수 있는 것일 수 있다.

또는 내산성은 조작되지 않은 세포에 비하여, 산성 조건에서 더 좋은 대사 과정을 보이는 것일 수 있다. 상기 산성 조건은 유기산, 무기산 또는 그 조합을 포함하는 산성 조건일 수 있다. 상기 유기산은 C1 내지 C20을 갖는 유기산일 수 있다. 상기 유기산은 아세트산, 젖산, 프로피온산, 3-히드록시프로피온산, 부티르산, 4-히드록시부티르산, 숙신산, 푸마르산, 말산, 옥살산, 아디프산, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 효모 세포는 Fps1의 활성이 감소되지 않은 효모 세포에 비하여, pH 2.0 내지 7.0, 예를 들면, pH 2.0 내지 5.0, pH 2.0 내지 4.5, pH 2.0 내지 4.0, pH 2.0 내지 3.8, pH 2.5 내지 3.8, pH 3.0 내지 3.8, pH 2.0 내지 3.0, pH 2.0 내지 2.7, pH 2.0 내지 2.5, 또는 pH 2.5 내지 3.0의 범위에서 더 잘 대사할 수 있는 것일 수 있다. 이 때 "대사할 수 있는 (metabolizable)"의 정도는 세포당 영양분 흡수율, 예를 들면, 세포당 포도당 흡수율을 통해 측정될 수 있다. 또는 "대사할 수 있는 (metabolizable)"의 정도는 세포당 산물 배출율, 예를 들면 세포당 이산화탄소 배출율을 통해 측정될 수 있다.

상기 효모 세포는 사카로마이세스 (Saccharomyces), 클루이베로마이세스 (Kluyveromyces), 캔디다 (Candida), 피치아 (Pichia), 이사첸키아 (Issatchenkia), 데바리오마이세스 (Debaryomyces), 자이고사카로마이세스 (Zygosaccharomyces), 쉬조사카로마이스세 (Shizosaccharomyces) 또는 사카로마이콥시스 (Saccharomycopsis) 속에 속하는 것일 수 있다. 사카로마이세스 속은 예를 들면, 사카로마이세스 세레비지애 (S. cerevisiae), 사카로마이세스 바야누스 (S. bayanus), 사카로마이세스 보울라디 (S. boulardii), 사카로마이세스 불데리 (S. bulderi), 사카로마이세스 카리오카누스 (S. cariocanus), 사카로마이세스 카리오쿠스 (S. cariocus), 사카로마이세스 체발리에리 (S. chevalieri), 사카로마이세스 다이레넨시스 (S. dairenensis), 사카로마이세스 엘립소이데우스 (S. ellipsoideus), 사카로마이세스 유바야뉴스 (S. eubayanus), 사카로마이세스 엑시거스 (S. exiguus), 사카로마이세스 플로렌티누스 (S. florentinus), 사카로마이세스 클루이베리 (S. kluyveri), 사카로마이세스 마티니에 (S. martiniae), 사카로마이세스 모나센시스 (S. monacensis), 사카로마이세스 노르벤시스 (S. norbensis), 사카로마이세스 파라독서스 (S. paradoxus), 사카로마이세스 파스토리아누스 (S. pastorianus), 사카로마이세스 스펜서로룸 (S. spencerorum), 사카로마이세스 투리센시스 (S. turicensis), 사카로마이세스 우니스포루스 (S. unisporus), 사카로마이세스 우바룸 (S. uvarum), 또는 사카로마이세스 조나투스 (S. zonatus)일 수 있다.

상기 효모 세포는 락테이트 생산능을 갖는 것일 수 있다. 상기 효모 세포는 피루베이트를 락테이트로 전환하는 폴리펩티드의 활성을 갖는 것일 수 있다. 상기 효모 세포는 피루베이트를 락테이트로 전환하는 폴리펩티드의 활성이 증가되어 있는 것일 수 있다. 피루베이트를 락테이트로 전환하는 폴리펩티드는 락테이트 데히드로게나제 (LDH)일 수 있다. 상기 락테이트 데히드로게나제는 NAD(P)-의존성 효소일 수 있다. 또한 상기 락테이트 데히드로게나제는 스테레오-특이적 (specific)일 수 있으며, L-락테이트만 또는 D-락테이트만, 또는 L-락테이트와 D-락테이트 모두를 생산할 수 있다. 상기 NAD(P)-의존성 효소는 L-락테이트에 작용하는 것인 EC 1.1.1.27, 또는 D-락테이트에 작용하는 것인 EC 1.1.1.28로 분류되는 효소일 수 있다.

상기 락테이트 생산능을 갖는 효모 세포는 락테이트 데히드로게나제의 활성이 증가되어 있는 것일 수 있다. 상기 효모 세포는 적어도 하나의 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 상기 유전자는 외인성 (exogenous)일 수 있다. 상기 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 박테리아, 효모, 진균, 포유동물 또는 파충류로부터 유래한 것을 포함할 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 락토바실러스 헬베티쿠스 (Lactobacillus helveticus), L. 불가리쿠스 (L. bulgaricus), L. 존소니 (L. johnsonii), L. 플란타룸(L. plantarum), 일본자라 (Pelodiscus sinensis japonicus), 오리너구리 (Ornithorhynchus anatinus), 병코돌고래 (Tursiops truncatus), 노르웨이산집쥐 (Rattus norvegicus), 및 개구리 (Xenopus laevis)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 LDH를 코딩하는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 일본자라로부터 유래한 락테이트 데히드로게나제, 오리너구리로부터 유래한 락테이트 데히드로게나제, 병코돌고래로부터 유래한 락테이트 데히드로게나제, 및 노르웨이산집쥐로부터 유래한 락테이트 데히드로게나제는 각각 서열번호 3, 4, 5, 및 6의 아미노산 서열과 60%이상, 또는 70%이상, 80%이상, 90%이상, 95%이상, 96%이상, 97%이상, 98%이상, 또는 99%이상의 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일례로, 상기 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 3, 4, 5, 및 6의 아미노산 서열과 95%이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 또는 상기 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 3, 4, 5, 6의 아미노산 서열과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 서열번호 7의 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다.

상기 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 벡터 내 포함될 수 있다. 상기 벡터는 복제개시점, 프로모터, 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 터미네이터를 포함할 수 있다. 상기 복제 개시점은 효모 자가복제 서열 (autonomous replication sequence, ARS)을 포함할 수 있다. 상기 효모 자가복제서열은 효모 동원체 서열 (centrometric sequence, CEN)에 의해 안정화될 수 있다. 상기 프로모터는 CYC (cytochrome c), TEF (translation elongation factor), GPD, CCW12, 및 ADH 유전자의 프로모터로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다. 있다. 상기 CYC (cytochrome c), TEF (translation elongation factor), GPD, CCW12, 및 ADH 유전자의 프로모터는 각각 서열번호 19, 20, 21, 22 및 23의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 터미네이터는 PGK1 (phosphoglycerate kinase 1), CYC1 (cytochrome c 1), 및 GAL1 (galactokinase 1) 유전자의 터미네이터로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다. CYC1 터미네이터는 서열번호 24의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 벡터는 선별 마커를 더 포함할 수 있다. 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 효모 세포 게놈의 특정 위치에 포함될 수 있다. 상기 특정 위치는 PDC, CYB2와 같이 제거 또는 파괴하고자 하는 유전자의 유전자좌 (locus)를 포함할 수 있다. 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 세포 내에서 활성 단백질을 생산하기 위해 기능하는 경우, 상기 폴리뉴클레오티드는 세포 내에서 "기능성 (functional)"인 것으로 고려된다.

상기 효모 세포는 단일의 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 또는 2 내지 10 카피수의 복수의 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 상기 효모 세포는 예를 들면 1 내지 8, 1 내지 7, 1 내지 6, 1 내지 5, 1 내지 4, 또는 1 내지 3 카피의 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 상기 효모 세포가 복수의 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 경우, 각각의 폴리뉴클레오티드는 동일하거나 둘 이상의 상이한 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 조합일 수 있다. 외인성 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 복수의 카피는 숙주 세포의 게놈 내에 동일한 유전자좌 (locus) 또는 여러 유전자좌에 포함될 수 있고, 각 카피의 프로모터나 터미네이터가 동일하거나 상이할 수 있다.

또한, 상기 효모 세포는 피루베이트를 아세트알데히드로 전환하는 폴리펩티드, 락테이트를 피루베이트로 전환하는 폴리펩티드, 디히드록시아세톤 포스페이트 (DHAP)를 글리세롤-3-포스페이트로 전환하는 폴리펩티드, 익스터널 미토콘드리아 NADH 데히드로게나제 (external mitochondral NADH dehydrogenase), 또는 그의 조합의 활성이 감소된 것일 수 있다.

상기 효모 세포는 피루베이트를 아세트알데히드로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자가 제거 또는 파괴된 것일 수 있다. 피루베이트를 아세트알데히드로 전환하는 폴리펩티드는 EC 4.1.1.1로 분류되는 효소일 수 있다. 상기 피루베이트를 아세트알데히드로 전환하는 폴리펩티드는 예를 들면, 피루베이트 데카르복실라제 (pyruvate decarboxylase)일 수 있으며, PDC1일 수 있다. 상기 피루베이트로부터 아세트알데히드로 전환하는 폴리펩티드는 서열번호 8의 아미노산 서열과 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있다. 상기 피루베이트로부터 아세트알데히드로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자는 서열번호 8의 아미노산 서열과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 서열번호 9의 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 유전자는 pdc1일 수 있다.

상기 효모 세포는 락테이트를 피루베이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자가 제거 또는 파괴된 것일 수 있다. 상기 락테이트를 피루베이트로 전환하는 폴리펩티드는 시토크롬 c-의존성 효소일 수 있다. 상기 락테이트를 피루베이트로 전환하는 폴리펩티드는 D-락테이트에 작용하는 것인 EC 1.1.2.4, 또는 L-락테이트에 작용하는 것인 EC 1.1.2.3으로 분류되는 효소일 수 있다. 상기 락테이트를 피루베이트로 전환하는 폴리펩티드는 락테이트 시토크롬-c 옥시도리덕타제일 수 있고, CYB2 (CAA86721.1), CYB2A, CYB2B, 또는 DLD1 등일 수 있다. 상기 락테이트를 피루베이트로 전환하는 폴리펩티드는 서열번호 10의 아미노산 서열과 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있다. 상기 락테이트를 피루베이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자는 서열번호 10의 아미노산 서열과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 서열번호 11의 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다.

상기 효모 세포는 디히드록시아세톤 포스페이트 (DHAP)를 글리세롤-3-포스페이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자가 제거 또는 파괴된 것일 수 있다. 상기 디히드록시아세톤 포스페이트 (DHAP)를 글리세롤-3-포스페이트로 전환하는 폴리펩티드는 시토졸성 글리세롤-3-포스페이트 데히드로게나제일 수 있으며, NADH 또는 NADP의 NAD+ 또는 NADP+로의 산화를 이용하여 디히록시아세톤 포스페이트 (DHAP)를 글리세롤-3-포스페이트로의 환원을 촉매하는 효소일 수 있다. 상기 폴리펩티드는 EC 1.1.1.8에 속하는 것일 수 있다. 상기 시토졸성 글리세롤-3-포스페이트 데히드로게나제는 GPD1일 수 있다. 상기 시토졸성 글리세롤-3-포스페이트 데히드로게나제는 서열번호 12의 아미노산 서열과 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 시토졸성 글리세롤-3-포스페이트 데히드로게나제를 코딩하는 유전자는 서열번호 12의 아미노산 서열과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 서열번호 13의 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다.

상기 효모 세포는 익스터널 미토콘드리아 NADH 데히드로게나제를 코딩하는 유전자가 제거 또는 파괴된 것일 수 있다. 상기 익스터널 미토콘드리아 NADH 데히드로게나제는 EC. 1.6.5.9 또는 EC. 1.6.5.3으로 분류되는 효소일 수 있다. 상기 익스터널 미토콘드리아 NADH 데히드로게나제는 유형 Ⅱ NADH:유비퀴논 옥시도리덕타제 (type Ⅱ NADH:ubiquinone oxidoreductase)일 수 있다. 상기 익스터널 미토콘드리아 NADH 데히드로게나제는 세포질 (cytoplasm)을 향하는 내부 (inner) 미토콘드리아막의 외부면에 위치한 것일 수 있다. 상기 익스터널 미토콘드리아 NADH 데히드로게나제는 시토졸 NADH (cytosolic NADH)의 NAD+로의 산화를 촉매하는 효소일 수 있다. 상기 익스터널 미토콘드리아 NADH 데히드로게나제는 해당과정에 의해 형성된 시토졸 NADH의 재산화시키는 것일 수 있다. 상기 익스터널 미토콘드리아 NADH 데히드로게나제는 시토졸 NADH를 미토콘드리아 호흡 사슬 (mitochondrial respiratory chain)에 제공하는 것일 수 있다. 상기 NADH 데히드로게나제는 NDE1, NDE2, 또는 그의 조합일 수 있다. 상기 익스터널 미토콘드리아 NADH 데히드로게나제는 미토콘드리아 내부에 위치하여 작용하는 인터널 미토콘드리아 NADH 데히드로게나제 (internal mitochondral NADH dehydrogenase) NDI1과 구별되는 것일 수 있다. 상기 익스터널 미토콘드리아 NADH 데히드로게나제 서열번호 14 또는 16의 아미노산 서열과 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있다. 일례로 NDE1 및 NDE2는 각각 서열번호 14 및 16의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 익스터널 미토콘드리아 NADH 데히드로게나제를 코딩하는 유전자는 각각 서열번호 14 또는 16의 아미노산 서열과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 서열번호 15 또는 17의 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다. 일례로, 상기 nde1은 서열번호 15, nde2는 서열번호 17의 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다.

또한 일례로 효모 세포는 Fps1의 활성이 감소되어 있고, 피루베이트를 아세트알데히드로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 락테이트를 피루베이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 디히드록시아세톤 포스페이트 (DHAP)를 글리세롤-3-포스페이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 익스터널 미토콘드리아 NADH 데히드로게나제를 코딩하는 유전자, 또는 그 조합이 제거 또는 파괴되어 있고, 피루베이트를 락테이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자가 포함 또는 추가 도입되어 있는 효모 세포일 수 있다. 상기 효모 세포는 사카로마이세스 세레비지애일 수 있다.

다른 양상은 상기한 효모 세포를 포함하는, 락테이트를 생산하는데 사용하기 위한 조성물을 제공한다.

다른 양상은 상기한 효모 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 락테이트를 생산하는 방법을 제공한다.

상기 배양은 당업계에 알려진 적당한 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있다. 통상의 기술자라면 선택되는 미생물에 따라 배지 및 배양조건을 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 배양 방법은 예를 들면, 회분식, 연속식 및 유가식 배양을 포함할 수 있다. 상기 효모 세포는 상기한 바와 같다.

상기 배지는 다양한 탄소원, 질소원 및 미량원소 성분을 포함할 수 있다.

상기 탄소원은, 예를 들면, 포도당, 자당, 유당, 과당, 말토오스, 전분, 셀룰로오스와 같은 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유와 같은 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤 및 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산, 및/또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 상기 배양은 예를 들면, 글루코스를 탄소원으로 하여 수행될 수 있다. 상기 질소원은, 예를 들면, 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아 추출물, 옥수수 침지액 (CSL), 및 대두밀과 같은 유기 질소원 및 요소, 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄과 같은 무기 질소원, 및/또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 상기 배지는 인의 공급원으로서, 예를 들면, 인산이수소칼륨, 인산수소이칼륨 및 상응하는 소듐-함유 염, 황산마그네슘 또는 황산철과 같은 금속염을 포함할 수 있다. 또한, 아미노산, 비타민, 및 적절한 전구체 등이 배지에 포함될 수 있다. 상기 배지 또는 개별 성분은 배양액에 회분식 또는 연속식으로 첨가될 수 있다.

또한, 배양 중에 수산화암모늄, 수산화칼륨, 암모니아, 인산 및 황산과 같은 화합물을 미생물 배양액에 적절한 방식으로 첨가하여 배양액의 pH를 조정할 수 있다. 또한, 배양 중에 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다.

상기 세포는 호기, 미호기, 또는 혐기 조건에서 배양될 수 있다. 상기 미호기 조건은 대기 중 산소의 수준보다 낮은 수준의 산소가 배지 중으로 용해되는 배양 조건을 의미한다. 상기 낮은 수준의 산소는 예를 들면, 대기에 대한 포화 용존 산소 농도의 0.1% 내지 10%, 1% 내지 9%, 2% 내지 8%, 3% 내지 7%, 또는 4 내지 6%일 수 있다. 또한, 미호기 조건은 예를 들면, 배지 중의 용존 산소 농도가 0.9 ppm에서 3.6 ppm인 것일 수 있다. 배양 온도는 예를 들면, 20℃ 내지 45℃ 또는 25℃ 내지 40℃일 수 있다. 배양 기간은 원하는 목적 락테이트가 원하는 만큼 얻어질 때까지 지속될 수 있다. 상기 락테이트를 생산하는 방법은 배양물로부터 락테이트를 회수 또는 분리하는 단계를 포함할 수 있다.

배양물로부터의 락테이트의 회수는, 통상적으로 알려진 분리 및 정제방법을 사용하여 수행될 수 있다. 상기 회수는 원심분리, 이온교환 크로마토그래피, 여과, 침전, 추출, 증류, 또 조합에 의하여 이루어질 수 있다. 예를 들면 배양물을 원심분리하여 바이오매스를 제거하고, 얻어진 상등액을 이온교환 크로마토그래피를 통하여 분리할 수 있다.

일 양상에 따른 효모 세포에 의하면, 락테이트를 고농도 및 높은 수율로 생산할 수 있다.

일 양상에 따른 락테이트를 생산하는 방법에 의하면, 락테이트를 고농도 및 높은 수율로 생산할 수 있다.

도 1은 일 구체예에 따른 내산성을 가진 효모 세포의 락테이트 생산 경로를 나타낸 도면이다.
도 2는 p416-CCW12p-LDH 벡터를 나타낸 도면이다.
도 3은 pUC19-HIS3 벡터를 나타내는 도면이다.
도 4는 pUC19-CCW12p-LDH-HIS3 벡터를 나타내는 도면이다.
도 5는 pUC57-ura3HA 벡터를 나타내는 도면이다.
도 6은 pUC57-CCW12-LDH-ura3HA 벡터를 나타내는 도면이다.
도 7a 내지 7e는 Δfps1 균주와 Δnde1Δnde2 균주(C)의 배지에 첨가된 젖산의 농도에 따른 세포 성장을 나타낸 도면이다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 락테이트의 고효율 생산을 위한 균주 제작 및 발현 벡터의 제작

1.1 pdc1 , cyb2 , 및 gpd1 유전자가 제거되고 ldh 유전자가 도입된 사카로마이세스 세레비지애 균주의 제작

사카로마이세스 세레비지애 CEN.PK2-1D (MATαura3-52; trp1-289; leu2-3,112; his3Δ1; MAL2-8C; SUC2, EUROSCARF accession number: 30000B)를 락테이트 생산 균주로 이용하여, 주요 부산물인 에탄올과 글리세롤 생산 경로 차단을 위해, 알코올 발효의 주요 효소인 피루베이트 데카르복실라제 (pyruvate decarboxylase: pdc1) 유전자, 글리세롤 생합성의 주요 효소인 NAD-의존성 글리세롤-3-포스페이트 데히드로게나제 (NAD-dependent glycerol-3-phosphate dehydrogenase: gpd1) 유전자, 및 락테이트 분해 효소인 L-락테이트 시토크롬-c 옥시도리덕타제 (L-lactate cytochrome-c oxidoreductase 2: cyb2) 유전자가 파괴되고, 상기 각 유전자 위치에 락테이트 데히드로게나제 유전자가 도입된 사카로마이세스 세레비지애 CEN.PK2-1D Δpdc1::ldh Δcyb2::ldhΔgpd1::ldh (KCTC 12415BP)를 사용하였다.

1.1.1 L- LDH 과발현 벡터 제조

L-LDH 과발현을 위해 사카로마이세스 세레비지애 CEN.PK2-1D의 게놈 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 25와 26의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하여 얻어진 CCW12 프로모터 PCR 절편을 SacI과 XbaI으로 절단하고 이를 SacI과 XbaI으로 GPD 프로모터를 절단한 p416-GPD (http://www.atcc.org/products/all/87360.aspx)에 도입하여 p416-CCW12p을 제작하였다.

그 후, 일본 자라 (Pelodiscus sinensis japonicus) 유래의 L-ldh (서열번호 7)의 게놈 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 27과 28의 프라이머를 사용하여 PCR을 수행한 다음, 얻어진 PCR 절편과 제작된 p416-CCW12p를 BamHI 과 SalI으로 절단하고 이를 리게이션하여 p416-CCW12p-LDH을 제작하였다. 상기 L-ldh 발현 벡터는 서열번호 18의 효모 자가복제 서열/효모 동원체 서열, 서열번호 19의 CYC 프로모터, 서열번호 22의 CCW12 프로모터, 및 서열번호 24의 CYC1 터미네이터를 갖고, 상기 L-ldh 발현 벡터는 서열번호 3의 일본 자라 유래의 L-ldh를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하였다. 도 2는 p416-CCW12p-LDH 벡터를 나타낸 도면이다.

1.1.2 L- ldh 유전자의 염색체 도입 벡터 제조

산화 환원 밸런스 (redox balance) 강화 또는 해당과정 경로 조작 (glycolysis pathway engineering)을 통한 락테이트의 생산 증가를 위하여 L-ldh를 KCTC12415BP호 균주의 게놈 내에 추가적으로 도입하였다. L-ldh 유전자를 KCTC12415BP호의 게놈 내 도입하기 위하여 유전자 도입 벡터를 다음과 같이 제작하였다.

이를 위하여 제작된 상기의 p416-CCW12p-LDH를 주형으로 하고, 서열번호 29 및 30의 프라이머를 사용하여 PCR을 수행한 다음, 얻어진 PCR 절편과 기 제작된 pUC19-HIS3 (Appl Environ Microbiol. 2002 May;68(5):2095-100, 도 3) 벡터를 SacI으로 절단하고 이를 라이게이션하여 pUC19-CCW12p-LDH-HIS3 (도 4)를 제작하였다. 상기 pUC19-CCW12p-LDH-HIS3를 주형으로 하고 하기 서열번호 31과 32의 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하여 TRP1 위치에 삽입하기 위한 카세트를 제작하였다. 상기 L-ldh를 포함하는 발현 카세트는 TRP1의 유전좌에 삽입될 수 있고, 이 경우 TRP1 유전자가 결실되면서 L-ldh가 삽입될 수 있다. L-ldh 삽입된 변이 균주는 다음과 같이 제작하였다.

KCTC12415BP 균주를 YPD (10 g yeast extract, 20 g peptone, 20 g 포도당) 고체배지에 도말하여 24시간 동안 30℃에서 배양한 후, 콜로니를 YPD 액체 배지 10ml에 접종하여 18시간 동안 30℃에서 배양하였다. 충분히 자란 배양액을 250 ml 플라스크에 담긴 YPD 액체배지 50 ml에 1%(v/v) 접종하여 230 rpm, 30℃ 배양기에서 배양하였다.

약 4-5시간 후, OD₆₀₀이 0.5 정도가 되면 4,500 rpm, 10분 조건으로 원심 분리하여 세포를 수득한 다음 100 mM 농도의 리튬 아세테이트 용액에 세포를 현탁하였다. 그리고 다시 4,500 rpm, 10분 조건으로 원심 분리하여 세포를 수득 후 15% 글리세롤이 첨가된 1 M 농도의 리튬 아세테이트 용액에 세포를 재현탁하였다.

TRP1 결실과 동시에 L-ldh 발현을 위해, 상기 L-ldh를 포함하는 발현 카세트를 50% 폴리에틸렌글리콜, 단일 가닥 담체 DNA (single stranded carrier DNA)와 혼합 한 다음, 상기 재현탁액 100 ul에 가하여 42℃ 수조에서 1시간 동안 반응하였다. 이후 배양액을 히스티딘 (his) 무첨가 최소 고체배지 (YSD, 6.7 g/L yeast nitrogen base without amino acids, 1.4 g/L Amino acid dropout mix (-his))에 도말하여 30℃에서 24시간 이상 배양하였다. 상기 플레이트에서 형성된 콜로니 (변이 균주) 10개를 선별해 다시 YSD (-his) 고체 배지에 옮김과 동시에 YSD (-his) 액체 배지에 배양해 균주로 부터 상용 키트 (Gentra Puregene Cell kit, Qiagen, USA)를 이용하여 게놈 DNA를 분리하였다. 상기 분리된 변이주의 게놈 DNA를 주형으로 하여, TRP1 결실을 확인하기 위해 서열번호 33 및 34의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행한 다음, 수득된 PCR 산물을 전기영동을 실시하여 L-ldh 발현 카세트 삽입을 확인하였다. 이렇게 하여 Δtrp1::ldh 균주(KCTC12415BP Δtrp1::ldh)를 얻었다.

1.2 nde1 및 nde2 가 제거된 사카로마이세스 세레비지애 균주의 제조

1.2.1 nde1 유전자 제거 카세트의 제조

pUC57-CCW12p-LDH-ura3HA의 제작: 실시예 1.1.1의 p416-CCW12p-LDH를 주형으로 하고, 서열번호 29 및 30의 프라이머를 사용하여 PCR을 수행한 다음, 얻어진 PCR 절편과 제작된 pUC57-ura3HA (Genetics 116: 541-545, August, 1987, 도 5) 벡터를 SacI으로 절단하고 이를 라이게이션하여 pUC57-CCW12p-LDH-ura3HA (도 6)를 제작하였다.

nde1 유전자 제거 카세트를 제작하기 위하여, 제작된 pUC57-CCW12p-LDH-ura3HA를 주형으로 하고 서열번호 35 및 36의 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하여 nde1 유전자 제거 카세트를 제작하였다.

1.2.2 nde1 이 제거된 사카로마이세스 세레비지애 균주의 제조

상기 Δtrp1::ldh 균주 (KCTC12415BPΔtrp1::ldh)에서 nde1이 제거된 변이균주를 다음과 같이 제작하였다.

상기 Δtrp1::ldh 균주(KCTC12415BPΔtrp1::ldh)를 YPD (10 g yeast extract, 20 g peptone, 20 g 포도당) 고체배지에 도말하여 약 24시간 동안 약 30℃에서 배양한 후, 콜로니를 YPD 액체 배지 약 10 ml에 접종하여 약 18시간 동안 약 30℃에서 배양하였다. 충분히 자란 배양액을 250 ml 플라스크에 담긴 YPD 액체배지 약 50 ml에 1%(v/v) 접종하여 약 230 rpm, 약 30℃ 배양기에서 배양하였다. 약 4-5시간 후, OD₆₀₀이 약 0.5 정도가 되면 약 4,500 rpm, 약 10분 조건으로 원심 분리하여 세포를 수득한 다음 약 100 mM 농도의 리튬 아세테이트 용액에 세포를 현탁하였다. 그 후, 약 4,500 rpm, 약 10분 조건으로 원심 분리하여 세포를 수득 후 약 15% 글리세롤이 첨가된 약 1 M 농도의 리튬 아세테이트 용액에 세포를 재현탁하였다

nde1 유전자 제거를 위해, 상기에서 제작된 nde1 유전자 제거 카세트를 50% 폴리에틸렌글리콜, 단일 가닥 담체 DNA (single stranded carrier DNA)와 혼합한 다음, 상기 수용성 세포 재현탁액 100 ul에 가하여 약 42℃ 수조에서 약 1시간 동안 반응하였다. 이후 배양액을 우라실(ura) 무첨가 최소 고체배지 (YSD, 6.7 g/L yeast nitrogen base without amino acids, 1.4 g/L Amino acid dropout mix (-ura))에 도말하여 30℃에서 24시간 이상 배양하였다. 상기 플레이트에서 형성된 콜로니 10개를 선별해 다시 우라실 무첨가 최소 고체배지에 옮김과 동시에 같은 성분의 액체 배지에 배양해 균주로부터 상용 키트 (Gentra Puregene Cell kit, Qiagen, USA)를 이용하여 게놈 DNA를 분리하였다. 상기 분리된 변이주의 게놈 DNA를 주형으로 하여 nde1 제거를 확인하기 위해 서열번호 37 및 38의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행한 다음, 수득된 PCR 산물을 전기영동을 실시하여 nde1 제거를 확인하였다. 그 결과, KCTC12415BPΔtrp1::ldhΔnde1+ura3을 수득하였다.

또한, 상기 유전자 제거 벡터를 이용한 추가 유전자 제거를 위해 nde1 제거를 위해 이용한 선별 마커인 URA3 유전자를 URA3 pop-out 방법을 이용하여 제거하였다. 즉 KCTC12415BPΔtrp1::ldhΔnde1+ura3를 YPD 액체 배지 약 10 ml에 접종하여 약 18시간 동안 30℃에서 배양한 후, 5-FOA (YSD, 6.7g /L yeast nitrogen base without amino acids, 1.4 g/L Amino acid dropout mix, 1 μg/L 5-Fluoroorotic Acid) 고체 배지에 도말하여 약 24시간 동안 30℃에서 배양하였다. 상기 플레이트에서 형성된 콜로니 (URA3 pop-out 균주) 10개를 선별해 다시 5-FOA 고체배지에 옮김과 동시에 YPD 액체 배지에 배양해 균주로부터 상용 키트 (Gentra Puregene Cell kit, Qiagen, USA)를 이용하여 게놈 DNA를 분리하였다. 상기 분리된 URA3 pop-out 균주의 게놈 DNA를 주형으로 하여 URA3 제거를 확인하기 위해 하기 서열번호 37 및 38의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행한 다음, 수득된 PCR 산물을 전기영동을 실시하여 URA3 제거를 확인하였다. 그 결과, Δnde1 균주(KCTC12415BP Δtrp1::ldhΔnde1)을 수득하였다.

1.2.3 nde2 유전자의 제거 카세트의 제조

nde2 유전자를 상동성 재조합 방법으로 제거시키기 위하여 nde2 유전자의 파괴용 벡터는 상기 실시예 1.2.1에서 제작된 pUC57-CCW12p-LDH-ura3HA를 이용하였다. nde2 유전자 제거 카세트를 제작하기 위하여, 제작된 pUC57-CCW12p-LDH-ura3HA를 주형으로 하고 서열번호 39 및 40의 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하여 nde2 유전자 제거 카세트를 제작하였다.

1.2.4 nde1 및 nde2 이 제거된 사카로마이세스 세레비지애 균주의 제조

상기 Δnde1 균주 (KCTC12415BPΔtrp1::ldhΔnde1)에서 nde2가 제거된 변이균주를 다음과 같이 제조하였다.

상기 Δnde1 균주를 실시예 1.2.2와 같은 방법으로 리튬 아세테이트 용액을 처리하여 수용성 세포(competent cell)를 얻었다.

nde2 유전자 제거를 위해, 1.2.3에서 제작된 nde2 유전자 제거 카세트를 50% 폴리에틸렌글리콜, 단일 가닥 담체 DNA (single stranded carrier DNA)와 혼합한 다음, 상기 수용성 세포 재현탁액 100 ul에 가하여 실시예 1.2.2와 같은 방법으로 실시하여 우라실 무첨가 최소 고체배지에서 콜로니를 얻었다. 상기 플레이트에서 형성된 콜로니 (변이 균주) 10개를 선별해 다시 우라실 무첨가 최소 고체배지에 옮김과 동시에 같은 성분의 액체 배지에 배양해 균주로부터 상용 키트 (Gentra Puregene Cell kit, Qiagen, USA)를 이용하여 게놈 DNA를 분리하였다. 상기 분리된 변이주의 게놈 DNA를 주형으로 하여 nde2 제거를 확인하기 위해 서열번호 41 및 42의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행한 다음, 수득된 PCR 산물을 전기영동을 실시하여 nde2 제거를 확인하였다. 그 결과, KCTC12415BPΔtrp1::ldhΔnde1Δnde2+ura3을 수득하였다.

또한, 추가 유전자 제거를 위해 실시예 1.2.2와 동일한 방식의 URA3 pop-out 방법을 이용하여, nde2 제거를 위해 이용한 선별 마커인 URA3 유전자를 사카로마이세스 세레비지애 KCTC12415BP Δtrp1::ldhΔnde1Δnde2+ura3로부터 제거하였다. 분리된 URA3 pop-out 균주의 게놈 DNA를 주형으로 하여 URA3 제거를 확인하기 위해 서열번호 41 및 42의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행한 다음, 수득된 PCR 산물을 전기영동을 실시하여 URA3 제거를 확인하였다. 그 결과, Δnde1Δnde2 균주 (KCTC12415BPΔtrp1::ldhΔnde1Δnde2)을 수득하였다.

실시예 2. fps1 이 제거된 사카로마이세스 세레비지애 균주의 제조

2.1 fps1 유전자 제거 카세트의 제조

fps1 유전자를 상동성 재조합 방법으로 제거시키기 위하여, 도면 5의 pUC57-ura3HA 를 주형으로 하고 하기 서열번호 43 및 44의 프라이머 (fps1_del_F, fps1_del_R)를 사용하여 PCR을 수행하여 fps1 유전자 제거카세트를 제작하였다.

2.2 fps1 이 제거된 사카로마이세스 세레비지애 균주의 제조

상기 Δnde1Δnde2 균주 (KCTC12415BPΔtrp1::ldh Δnde1Δnde2)에서 fps1이 제거된 변이균주를 다음과 같이 제작하였다.

실시예 1의 Δnde1Δnde2 균주를 실시예 1.2.2와 같은 방법으로 리튬 아세테이트 용액을 처리하여 수용성 세포 재현탁액을 얻었다.

fps1 유전자 제거를 위해, 실시예 2.1에서 제작된 fps1 유전자 제거 카세트를 50% 폴리에틸렌글리콜, 단일 가닥 담체 DNA (single stranded carrier DNA)와 혼합한 다음 상기 수용성 세포 재현탁액 100 ul에 가하여 실시예 1.2.2와 같은 방법으로 실시하여 우라실 무첨가 최소 고체배지에서 콜로니를 얻었다. 상기 플레이트에서 형성된 콜로니 (변이 균주) 10개를 선별해 다시 우라실 무첨가 최소 고체배지에 옮김과 동시에 같은 성분의 액체 배지에 배양해 균주로부터 상용 키트 (Gentra Puregene Cell kit, Qiagen, USA)를 이용하여 게놈 DNA를 분리하였다. 상기 분리된 변이주의 게놈 DNA를 주형으로 하여 fps1 제거를 확인하기 위해 서열번호 45 및 46의 프라이머 (fps1_F , fps1_R)를 이용하여 PCR을 수행한 다음, 수득된 PCR 산물을 전기영동을 실시하여 fps1 제거를 확인하였다. 그 결과, KCTC12415BPΔtrp1::ldh Δnde1Δnde2Δ fps1+ura3을 수득하였다.

또한, 추가 유전자 제거를 위해 실시예 1.2.2와 동일한 방식의 URA3 pop-out 방법을 이용하여, fps1 제거를 위해 이용한 선별 마커인 URA3 유전자를 사카로마이세스 세레비지애 KCTC12415BPΔtrp1::ldhΔnde1Δnde2Δfps1+ura3로부터 제거하였다. 분리된 URA3 pop-out 균주의 게놈 DNA를 주형으로 하여 URA3 제거를 확인하기 위해 서열번호 45 및 46의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행한 다음, 수득된 PCR 산물을 전기영동을 실시하여 URA3 제거를 확인하였다. 그 결과, Δfps1 균주 (KCTC12415BPΔtrp1::ldhΔnde1Δnde2Δfps1)을 수득하였다.

실시예 3. fps1 유전자가 제거된 균주를 이용한 내산성 측정

실시예 1 및 2에서 제조된 Δnde1Δnde2 균주 및 Δfps1 균주 각각을 YPD 고체배지에 도말하여 30℃에서 24시간 이상 배양한 후, 0 내지 30 g/L의 젖산, 및 40 g/L 포도당을 포함한 50 ml YPD 액체 배지에 접종하여 호기 조건으로 30℃에서 48시간 동안 배양하였다. 배양 도중 플라스크로부터 주기적으로 배양물을 채취하여, 세포 농도를 OD₆₀₀ nm에서 측정하였다.

도 7a 내지 7e는 Δfps1 균주와 Δnde1Δnde2 균주(C)의 배지에 첨가된 젖산의 농도에 따른 세포 성장을 나타낸 도면이다. 도 7a 내지 7e에 나타낸 바와 같이, 첨가된 젖산의 양이 증가할수록, Δfps1 균주의 OD₆₀₀값이 Δnde1Δnde2 균주(C)에 비하여 더 높음을 알 수 있다. 이는 상기 Fps1 유전자가 제거된 효모 세포는 상기 세포 내 글리세롤 함량을 증가시키고, 내산성을 가져 산성 조건에서 더 좋고, 더 높은 성장을 보임을 알 수 있다.

실시예 4. fps1 유전자가 제거된 균주를 이용한 락테이트 생산

실시예 1 및 2에서 제조된 Δnde1Δnde2 균주 및 Δfps1 균주 각각을 YPD 고체배지에 도말하여 30℃에서 24시간 이상 배양한 후, 40 g/L 포도당을 포함한 50 ml YPD 액체 배지에 접종하여 호기 조건으로 30℃에서 48시간 동안 배양하였다. 발효는 상기의 50 ml의 균주 배양액내의 세포농도를 분광광도계를 이용 흡광도가 600 nm에서 5.0이 되는 양을 정량한 후 원심분리 하여 상층액을 버린 후 세포를 재현탁하여 80 g/L 포도당이 포함된 새로운 50 ml의 YPD 액체 배지에 다시 접종하여 실시하였다.

발효조건은 약 90 rpm을 유지하는 교반 배양기에서 30℃에서 24시간 이상 동안 배양하였다. 발효 중 플라스크로부터 주기적으로 샘플을 채취하였으며, 채취된 시료는 약 13,000 rpm에서 약 10분 동안 원심분리 후, 상층액의 락테이트의 농도를 액체크로마토그래피 (HPLC)로 분석하였다.

표 1에 나타낸 바와 같이 Δfps1 균주는 fps1 유전자가 제거되지 않은 Δnde1Δnde2 균주에 비해 OD₆₀₀ 값은 15.22에서 15.62로 상승하였고, L-락테이트 생산성은 33.9 g/L에서 35.3 g/L로 상승하였으며, 수율은 43.4%에서 46.6%로 상승하였다. 이와 같이 fps1 유전자를 제거한 균주에서 락테이트의 생산 및 수율이 증가함을 알 수 있다. 또한 fps1 유전자를 제거한 균주는 더 높은 농도의 락테이트 하에서도 더 높은 세포 성장을 가질 뿐만 아니라, 더 좋은 대사 과정을 나타내어 상기 락테이트의 생산 및 수율이 증가하였음을 알 수 있다.

균주명	특성	O D 600	LA (g/L)	수율 (%)
Δnde1Δnde2	KCTC12415BPΔtrp1::ldhΔnde1Δnde2	15.22	33.9	43.4
Δfps1 균주	KCTC12415BPΔtrp1::ldhΔnde1Δnde2Δfps1	15.62	35.3	46.6

50 ml 플라스크, 약 25 시간 배양, LA: 락테이트

한국생명공학연구원 KCTC12415BP 20130530

<110> Samsung Electronics Co. Ltd. <120> Acid resistant yeast cell with reduced Fps1 activity and method for producing lactate using the same <130> PN105504 <160> 46 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 669 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 1 Met Ser Asn Pro Gln Lys Ala Leu Asn Asp Phe Leu Ser Ser Glu Ser 1 5 10 15 Val His Thr His Asp Ser Ser Arg Lys Gln Ser Asn Lys Gln Ser Ser 20 25 30 Asp Glu Gly Arg Ser Ser Ser Gln Pro Ser His His His Ser Gly Gly 35 40 45 Thr Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Ser Asn Asn 50 55 60 Asn Asn Asn Gly Asn Asp Gly Gly Asn Asp Asp Asp Tyr Asp Tyr Glu 65 70 75 80 Met Gln Asp Tyr Arg Pro Ser Pro Gln Ser Ala Arg Pro Thr Pro Thr 85 90 95 Tyr Val Pro Gln Tyr Ser Val Glu Ser Gly Thr Ala Phe Pro Ile Gln 100 105 110 Glu Val Ile Pro Ser Ala Tyr Ile Asn Thr Gln Asp Ile Asn His Lys 115 120 125 Asp Asn Gly Pro Pro Ser Ala Ser Ser Asn Arg Ala Phe Arg Pro Arg 130 135 140 Gly Gln Thr Thr Val Ser Ala Asn Val Leu Asn Ile Glu Asp Phe Tyr 145 150 155 160 Lys Asn Ala Asp Asp Ala His Thr Ile Pro Glu Ser His Leu Ser Arg 165 170 175 Arg Arg Ser Arg Ser Arg Ala Thr Ser Asn Ala Gly His Ser Ala Asn 180 185 190 Thr Gly Ala Thr Asn Gly Arg Thr Thr Gly Ala Gln Thr Asn Met Glu 195 200 205 Ser Asn Glu Ser Pro Arg Asn Val Pro Ile Met Val Lys Pro Lys Thr 210 215 220 Leu Tyr Gln Asn Pro Gln Thr Pro Thr Val Leu Pro Ser Thr Tyr His 225 230 235 240 Pro Ile Asn Lys Trp Ser Ser Val Lys Asn Thr Tyr Leu Lys Glu Phe 245 250 255 Leu Ala Glu Phe Met Gly Thr Met Val Met Ile Ile Phe Gly Ser Ala 260 265 270 Val Val Cys Gln Val Asn Val Ala Gly Lys Ile Gln Gln Asp Asn Phe 275 280 285 Asn Val Ala Leu Asp Asn Leu Asn Val Thr Gly Ser Ser Ala Glu Thr 290 295 300 Ile Asp Ala Met Lys Ser Leu Thr Ser Leu Val Ser Ser Val Ala Gly 305 310 315 320 Gly Thr Phe Asp Asp Val Ala Leu Gly Trp Ala Ala Ala Val Val Met 325 330 335 Gly Tyr Phe Cys Ala Gly Gly Ser Ala Ile Ser Gly Ala His Leu Asn 340 345 350 Pro Ser Ile Thr Leu Ala Asn Leu Val Tyr Arg Gly Phe Pro Leu Lys 355 360 365 Lys Val Pro Tyr Tyr Phe Ala Gly Gln Leu Ile Gly Ala Phe Thr Gly 370 375 380 Ala Leu Ile Leu Phe Ile Trp Tyr Lys Arg Val Leu Gln Glu Ala Tyr 385 390 395 400 Ser Asp Trp Trp Met Asn Glu Ser Val Ala Gly Met Phe Cys Val Phe 405 410 415 Pro Lys Pro Tyr Leu Ser Ser Gly Arg Gln Phe Phe Ser Glu Phe Leu 420 425 430 Cys Gly Ala Met Leu Gln Ala Gly Thr Phe Ala Leu Thr Asp Pro Tyr 435 440 445 Thr Cys Leu Ser Ser Asp Val Phe Pro Leu Met Met Phe Ile Leu Ile 450 455 460 Phe Ile Ile Asn Ala Ser Met Ala Tyr Gln Thr Gly Thr Ala Met Asn 465 470 475 480 Leu Ala Arg Asp Leu Gly Pro Arg Leu Ala Leu Tyr Ala Val Gly Phe 485 490 495 Asp His Lys Met Leu Trp Val His His His His Phe Phe Trp Val Pro 500 505 510 Met Val Gly Pro Phe Ile Gly Ala Leu Met Gly Gly Leu Val Tyr Asp 515 520 525 Val Cys Ile Tyr Gln Gly His Glu Ser Pro Val Asn Trp Ser Leu Pro 530 535 540 Val Tyr Lys Glu Met Ile Met Arg Ala Trp Phe Arg Arg Pro Gly Trp 545 550 555 560 Lys Lys Arg Asn Arg Ala Arg Arg Thr Ser Asp Leu Ser Asp Phe Ser 565 570 575 Tyr Asn Asn Asp Asp Asp Glu Glu Phe Gly Glu Arg Met Ala Leu Gln 580 585 590 Lys Thr Lys Thr Lys Ser Ser Ile Ser Asp Asn Glu Asn Glu Ala Gly 595 600 605 Glu Lys Lys Val Gln Phe Lys Ser Val Gln Arg Gly Lys Arg Thr Phe 610 615 620 Gly Gly Ile Pro Thr Ile Leu Glu Glu Glu Asp Ser Ile Glu Thr Ala 625 630 635 640 Ser Leu Gly Ala Thr Thr Thr Asp Ser Ile Gly Leu Ser Asp Thr Ser 645 650 655 Ser Glu Asp Ser His Tyr Gly Asn Ala Lys Lys Val Thr 660 665 <210> 2 <211> 2010 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 2 atgagtaatc ctcaaaaagc tctaaacgac tttctgtcca gtgaatctgt tcatacacat 60 gatagttcta ggaaacaatc taataagcag tcatccgacg aaggacgctc ttcatcacaa 120 ccttcacatc atcactctgg tggtactaac aacaataata acaataataa taataataat 180 aacagtaaca acaacaacaa cggcaacgat gggggaaatg atgacgacta tgattatgaa 240 atgcaagatt atagaccttc tccgcaaagt gcgcggccta ctcccacgta tgttccacaa 300 tattctgtag aaagtgggac tgctttcccg attcaagagg ttattcctag cgcatacatt 360 aacacacaag atataaacca taaagataac ggtccgccga gtgcaagcag taatagagca 420 ttcaggccta gagggcagac cacagtgtcg gccaacgtgc ttaacattga agatttttac 480 aaaaatgcag acgatgcgca taccatcccg gagtcacatt tatcgagaag gagaagtagg 540 tcgagggcta cgagtaatgc tgggcacagt gccaatacag gcgccacgaa tggcaggact 600 actggtgccc aaactaatat ggaaagcaat gaatcaccac gtaacgtccc cattatggtg 660 aagccaaaga cattatacca gaaccctcaa acacctacag tcttgccctc cacataccat 720 ccaattaata aatggtcttc cgtcaaaaac acttatttga aggaattttt agccgagttt 780 atgggaacaa tggttatgat tattttcggt agtgctgttg tttgtcaggt caatgttgct 840 gggaaaatac agcaggacaa tttcaacgtg gctttggata accttaacgt taccgggtct 900 tctgcagaaa cgatagacgc tatgaagagt ttaacatcct tggtttcatc cgttgcgggc 960 ggtacctttg atgatgtggc attgggctgg gctgctgccg tggtgatggg ctatttctgc 1020 gctggtggta gtgccatctc aggtgctcat ttgaatccgt ctattacatt agccaatttg 1080 gtgtatagag gttttcccct gaagaaagtt ccttattact ttgctggaca attgatcggt 1140 gccttcacag gcgctttgat cttgtttatt tggtacaaaa gggtgttaca agaggcatat 1200 agcgattggt ggatgaatga aagtgttgcg ggaatgtttt gcgtttttcc aaagccttat 1260 ctaagttcag gacggcaatt tttttccgaa tttttatgtg gagctatgtt acaagcagga 1320 acatttgcgc tgaccgatcc ttatacgtgt ttgtcctctg atgttttccc attgatgatg 1380 tttattttga ttttcattat caatgcttcc atggcttatc agacaggtac agcaatgaat 1440 ttggctcgtg atctgggccc acgtcttgca ctatatgcag ttggatttga tcataaaatg 1500 ctttgggtgc atcatcatca tttcttttgg gttcccatgg taggcccatt tattggtgcg 1560 ttaatggggg ggttggttta cgatgtctgt atttatcagg gtcatgaatc tccagtcaac 1620 tggtctttac cagtttataa ggaaatgatt atgagagcct ggtttagaag gcctggttgg 1680 aagaagagaa atagagcaag aagaacatcg gacctgagtg acttctcata caataacgat 1740 gatgatgagg aatttggaga aagaatggct cttcaaaaga caaagaccaa gtcatctatt 1800 tcagacaacg aaaatgaagc aggagaaaag aaagtgcaat ttaaatctgt tcagcgcggc 1860 aaaagaacgt ttggtggtat accaacaatt cttgaagaag aagattccat tgaaactgct 1920 tcgctaggtg cgacgacgac tgattctatt gggttatccg acacatcatc agaagattcg 1980 cattatggta atgctaagaa ggtaacatga 2010 <210> 3 <211> 332 <212> PRT <213> Pelodiscus sinensis japonicus <400> 3 Met Ser Val Lys Glu Leu Leu Ile Gln Asn Val His Lys Glu Glu His 1 5 10 15 Ser His Ala His Asn Lys Ile Thr Val Val Gly Val Gly Ala Val Gly 20 25 30 Met Ala Cys Ala Ile Ser Ile Leu Met Lys Asp Leu Ala Asp Glu Leu 35 40 45 Ala Leu Val Asp Val Ile Glu Asp Lys Leu Arg Gly Glu Met Leu Asp 50 55 60 Leu Gln His Gly Ser Leu Phe Leu Arg Thr Pro Lys Ile Val Ser Gly 65 70 75 80 Lys Asp Tyr Ser Val Thr Ala His Ser Lys Leu Val Ile Ile Thr Ala 85 90 95 Gly Ala Arg Gln Gln Glu Gly Glu Ser Arg Leu Asn Leu Val Gln Arg 100 105 110 Asn Val Asn Ile Phe Lys Phe Ile Ile Pro Asn Val Val Lys Tyr Ser 115 120 125 Pro Asp Cys Met Leu Leu Val Val Ser Asn Pro Val Asp Ile Leu Thr 130 135 140 Tyr Val Ala Trp Lys Ile Ser Gly Phe Pro Lys His Arg Val Ile Gly 145 150 155 160 Ser Gly Cys Asn Leu Asp Ser Ala Arg Phe Arg Tyr Leu Met Gly Glu 165 170 175 Lys Leu Gly Ile His Ser Leu Ser Cys His Gly Trp Ile Ile Gly Glu 180 185 190 His Gly Asp Ser Ser Val Pro Val Trp Ser Gly Val Asn Val Ala Gly 195 200 205 Val Ser Leu Lys Ala Leu Tyr Pro Asp Leu Gly Thr Asp Ala Asp Lys 210 215 220 Glu His Trp Lys Glu Val His Lys Gln Val Val Asp Ser Ala Tyr Glu 225 230 235 240 Val Ile Lys Leu Lys Gly Tyr Thr Ser Trp Ala Ile Gly Leu Ser Val 245 250 255 Ala Asp Leu Ala Glu Thr Val Met Lys Asn Leu Arg Arg Val His Pro 260 265 270 Ile Ser Thr Met Val Lys Gly Met Tyr Gly Val Ser Ser Asp Val Phe 275 280 285 Leu Ser Val Pro Cys Val Leu Gly Tyr Ala Gly Ile Thr Asp Val Val 290 295 300 Lys Met Thr Leu Lys Ser Glu Glu Glu Glu Lys Leu Arg Lys Ser Ala 305 310 315 320 Asp Thr Leu Trp Gly Ile Gln Lys Glu Leu Gln Phe 325 330 <210> 4 <211> 332 <212> PRT <213> Ornithorhynchus anatinus <400> 4 Met Ala Gly Val Lys Glu Gln Leu Ile Gln Asn Leu Leu Lys Glu Glu 1 5 10 15 Tyr Ala Pro Gln Asn Lys Ile Thr Val Val Gly Val Gly Ala Val Gly 20 25 30 Met Ala Cys Ala Ile Ser Ile Leu Met Lys Asp Leu Ala Asp Glu Leu 35 40 45 Ala Leu Val Asp Val Ile Glu Asp Lys Leu Lys Gly Glu Met Met Asp 50 55 60 Leu Gln His Gly Ser Leu Phe Leu Arg Thr Pro Lys Ile Val Ser Gly 65 70 75 80 Lys Asp Tyr Ser Val Thr Ala Asn Ser Lys Leu Val Ile Ile Thr Ala 85 90 95 Gly Ala Arg Gln Gln Glu Gly Glu Ser Arg Leu Asn Leu Val Gln Arg 100 105 110 Asn Val Asn Ile Phe Lys Phe Ile Ile Pro Asn Val Val Lys Tyr Ser 115 120 125 Pro Asn Cys Lys Leu Leu Val Val Ser Asn Pro Val Asp Ile Leu Thr 130 135 140 Tyr Val Ala Trp Lys Ile Ser Gly Phe Pro Lys Asn Arg Val Ile Gly 145 150 155 160 Ser Gly Cys Asn Leu Asp Ser Ala Arg Phe Arg Tyr Leu Met Gly Glu 165 170 175 Arg Leu Gly Ile His Ser Thr Ser Cys His Gly Trp Val Ile Gly Glu 180 185 190 His Gly Asp Ser Ser Val Pro Val Trp Ser Gly Val Asn Val Ala Gly 195 200 205 Val Ser Leu Lys Asn Leu His Pro Asp Leu Gly Thr Asp Ala Asp Lys 210 215 220 Glu Gln Trp Lys Asp Val His Lys Gln Val Val Asp Ser Ala Tyr Glu 225 230 235 240 Val Ile Lys Leu Lys Gly Tyr Thr Ser Trp Ala Ile Gly Leu Ser Val 245 250 255 Ala Asp Leu Ala Glu Ser Ile Val Lys Asn Leu Arg Arg Val His Pro 260 265 270 Ile Ser Thr Met Ile Lys Gly Leu Tyr Gly Ile Lys Asp Glu Val Phe 275 280 285 Leu Ser Val Pro Cys Val Leu Gly Gln Asn Gly Ile Ser Asp Val Val 290 295 300 Lys Ile Thr Leu Lys Ser Glu Glu Glu Ala His Leu Lys Lys Ser Ala 305 310 315 320 Asp Thr Leu Trp Gly Ile Gln Lys Glu Leu Gln Phe 325 330 <210> 5 <211> 332 <212> PRT <213> Tursiops truncatus <400> 5 Met Ala Thr Val Lys Asp Gln Leu Ile Gln Asn Leu Leu Lys Glu Glu 1 5 10 15 His Val Pro Gln Asn Lys Ile Thr Val Val Gly Val Gly Ala Val Gly 20 25 30 Met Ala Cys Ala Ile Ser Ile Leu Met Lys Asp Leu Ala Asp Glu Leu 35 40 45 Ala Leu Val Asp Val Ile Glu Asp Lys Leu Lys Gly Glu Met Met Asp 50 55 60 Leu Gln His Gly Ser Leu Phe Leu Arg Thr Pro Lys Ile Val Ser Gly 65 70 75 80 Lys Asp Tyr Ser Val Thr Ala Asn Ser Lys Leu Val Ile Ile Thr Ala 85 90 95 Gly Ala Arg Gln Gln Glu Gly Glu Ser Arg Leu Asn Leu Val Gln Arg 100 105 110 Asn Val Asn Ile Phe Lys Phe Ile Val Pro Asn Ile Val Lys Tyr Ser 115 120 125 Pro His Cys Lys Leu Leu Val Val Ser Asn Pro Val Asp Ile Leu Thr 130 135 140 Tyr Val Ala Trp Lys Ile Ser Gly Phe Pro Lys Asn Arg Val Ile Gly 145 150 155 160 Ser Gly Cys Asn Leu Asp Ser Ala Arg Phe Arg 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Ala Ile Ser Ile Leu Met Lys Asp Leu Ala Asp Glu Leu 35 40 45 Ala Leu Val Asp Val Ile Glu Asp Lys Leu Lys Gly Glu Met Met Asp 50 55 60 Leu Gln His Gly Ser Leu Phe Leu Lys Thr Pro Lys Ile Val Ser Ser 65 70 75 80 Lys Asp Tyr Ser Val Thr Ala Asn Ser Lys Leu Val Ile Ile Thr Ala 85 90 95 Gly Ala Arg Gln Gln Glu Gly Glu Ser Arg Leu Asn Leu Val Gln Arg 100 105 110 Asn Val Asn Ile Phe Lys Phe Ile Ile Pro Asn Val Val Lys Tyr Ser 115 120 125 Pro Gln Cys Lys Leu Leu Ile Val Ser Asn Pro Val Asp Ile Leu Thr 130 135 140 Tyr Val Ala Trp Lys Ile Ser Gly Phe Pro Lys Asn Arg Val Ile Gly 145 150 155 160 Ser Gly Cys Asn Leu Asp Ser Ala Arg Phe Arg Tyr Leu Met Gly Glu 165 170 175 Arg Leu Gly Val His Pro Leu Ser Cys His Gly Trp Val Leu Gly Glu 180 185 190 His Gly Asp Ser Ser Val Pro Val Trp Ser Gly Val Asn Val Ala Gly 195 200 205 Val Ser Leu Lys Ser Leu Asn Pro Gln Leu Gly Thr Asp Ala Asp Lys 210 215 220 Glu Gln Trp Lys Asp Val His Lys Gln Val Val Asp Ser Ala Tyr Glu 225 230 235 240 Val Ile Lys Leu Lys Gly Tyr Thr Ser Trp Ala Ile Gly Leu Ser Val 245 250 255 Ala Asp Leu Ala Glu Ser Ile Met Lys Asn Leu Arg Arg Val His Pro 260 265 270 Ile Ser Thr Met Ile Lys Gly Leu Tyr Gly Ile Lys Glu Asp Val Phe 275 280 285 Leu Ser Val Pro Cys Ile Leu Gly Gln Asn Gly Ile Ser Asp Val Val 290 295 300 Lys Val Thr Leu Thr Pro Asp Glu Glu Ala Arg Leu Lys Lys Ser Ala 305 310 315 320 Asp Thr Leu Trp Gly Ile Gln Lys Glu Leu Gln Phe 325 330 <210> 7 <211> 999 <212> DNA <213> Pelodiscus sinensis japonicus <400> 7 atgtccgtaa aggaactact tatacaaaac gtccataagg aggagcattc tcacgctcac 60 aataagataa cagttgtagg agtaggtgca gtaggtatgg catgtgctat ttcgatatta 120 atgaaagact tggctgatga actagccttg gttgatgtga ttgaggataa gttacgtgga 180 gaaatgttag atttgcaaca tggttcattg ttcttgagaa cccccaaaat tgtctcgggt 240 aaggattatt cagtcactgc tcattctaaa ctggttatca ttacagcagg tgcaagacag 300 caagaagggg agagcagact aaatctggtt caacgtaatg tcaacatctt caagtttatc 360 atcccgaacg tagtaaaata cagtccagac tgcatgttgc ttgttgtgag taatccagtt 420 gacatcttaa cctatgttgc gtggaaaatc agtgggtttc caaaacatag ggtgattggc 480 tcaggatgca accttgatag cgccaggttt aggtatctaa tgggagaaaa attaggtatt 540 cactccttat cttgtcatgg ctggataata ggcgaacatg gtgattcttc ggtacctgtt 600 tggtccgggg ttaatgtggc tggtgttagt ttaaaagcat tatatcctga cctgggtact 660 gatgccgata aagaacattg gaaagaagtg cacaaacaag tggttgattc tgcttacgaa 720 gttattaaac ttaagggcta cacttcttgg gctataggtc tatcagtagc tgatttggca 780 gaaaccgtta tgaaaaattt aagaagagtc cacccaattt ccacgatggt caagggtatg 840 tacggtgtta gctctgacgt cttcttatct gttccttgtg ttttgggata tgcgggaatt 900 acagacgtcg tgaagatgac attgaaatca gaggaagagg aaaaactaag aaagtcagcc 960 gatactctgt ggggcattca aaaggaattg cagttttaa 999 <210> 8 <211> 563 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 8 Met Ser Glu Ile Thr Leu Gly Lys Tyr Leu Phe Glu Arg Leu Lys Gln 1 5 10 15 Val Asn Val Asn Thr Val Phe Gly Leu Pro Gly Asp Phe Asn Leu Ser 20 25 30 Leu Leu Asp Lys Ile Tyr Glu Val Glu Gly Met Arg Trp Ala Gly Asn 35 40 45 Ala Asn Glu Leu Asn Ala Ala Tyr Ala Ala Asp Gly Tyr Ala 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agatgtatca gaaccactta cgtcacccaa 480 agaccagtct acttaggttt gccagctaac ttggtcgact tgaacgtccc agctaagttg 540 ttgcaaactc caattgacat gtctttgaag ccaaacgatg ctgaatccga aaaggaagtc 600 attgacacca tcttggcttt ggtcaaggat gctaagaacc cagttatctt ggctgatgct 660 tgttgttcca gacacgacgt caaggctgaa actaagaagt tgattgactt gactcaattc 720 ccagctttcg tcaccccaat gggtaagggt tccattgacg aacaacaccc aagatacggt 780 ggtgtttacg tcggtacctt gtccaagcca gaagttaagg aagccgttga atctgctgac 840 ttgattttgt ctgtcggtgc tttgttgtct gatttcaaca ccggttcttt ctcttactct 900 tacaagacca agaacattgt cgaattccac tccgaccaca tgaagatcag aaacgccact 960 ttcccaggtg tccaaatgaa attcgttttg caaaagttgt tgaccactat tgctgacgcc 1020 gctaagggtt acaagccagt tgctgtccca gctagaactc cagctaacgc tgctgtccca 1080 gcttctaccc cattgaagca agaatggatg tggaaccaat tgggtaactt cttgcaagaa 1140 ggtgatgttg tcattgctga aaccggtacc tccgctttcg gtatcaacca aaccactttc 1200 ccaaacaaca cctacggtat ctctcaagtc ttatggggtt ccattggttt caccactggt 1260 gctaccttgg gtgctgcttt cgctgctgaa gaaattgatc caaagaagag agttatctta 1320 ttcattggtg acggttcttt gcaattgact gttcaagaaa tctccaccat gatcagatgg 1380 ggcttgaagc catacttgtt cgtcttgaac aacgatggtt acaccattga aaagttgatt 1440 cacggtccaa aggctcaata caacgaaatt caaggttggg accacctatc cttgttgcca 1500 actttcggtg ctaaggacta tgaaacccac agagtcgcta ccaccggtga atgggacaag 1560 ttgacccaag acaagtcttt caacgacaac tctaagatca gaatgattga aatcatgttg 1620 ccagtcttcg atgctccaca aaacttggtt gaacaagcta agttgactgc tgctaccaac 1680 gctaagcaat aa 1692 <210> 10 <211> 591 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 10 Met Leu Lys Tyr Lys Pro Leu Leu Lys Ile Ser Lys Asn Cys Glu Ala 1 5 10 15 Ala Ile Leu Arg Ala Ser Lys Thr Arg Leu Asn Thr Ile Arg Ala Tyr 20 25 30 Gly Ser Thr Val Pro Lys Ser Lys Ser Phe Glu Gln Asp Ser Arg Lys 35 40 45 Arg Thr Gln Ser Trp Thr Ala Leu Arg Val Gly Ala Ile Leu Ala Ala 50 55 60 Thr Ser Ser Val Ala Tyr Leu Asn Trp His Asn Gly Gln Ile Asp Asn 65 70 75 80 Glu Pro Lys Leu Asp Met Asn Lys Gln Lys Ile Ser Pro Ala Glu Val 85 90 95 Ala Lys His Asn 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His Pro Gly Leu 420 425 430 Phe Pro Thr Ala Gln Val Ala His Gln Glu Gly Glu Tyr Leu Ala Gln 435 440 445 Tyr Phe Lys Lys Ala Tyr Lys Ile Asp Gln Leu Asn Trp Lys Met Thr 450 455 460 His Ala Lys Asp Asp Ser Glu Val Ala Arg Leu Lys Asn Gln Ile Val 465 470 475 480 Lys Thr Gln Ser Gln Ile Glu Asp Phe Lys Tyr Asn His Lys Gly Ala 485 490 495 Leu Ala Tyr Ile Gly Ser Asp Lys Ala Ile Ala Asp Leu Ala Val Gly 500 505 510 Glu Ala Lys Tyr Arg Leu Ala Gly Ser Phe Thr Phe Leu Phe Trp Lys 515 520 525 Ser Ala Tyr Leu Ala Met Cys Leu Ser Phe Arg Asn Arg Val Leu Val 530 535 540 Ala Met Asp Trp Ala Lys Val Tyr Phe Leu Gly Arg Asp Ser Ser Ile 545 550 555 560 <210> 15 <211> 1683 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 15 atgattagac aatcattaat gaaaacagtg tgggctaact cctccaggtt tagcctacag 60 agcaagtcgg ggcttgtgaa atatgccaaa aatagatcgt tccatgcagc aagaaatttg 120 ctagaggaca agaaagtcat tttgcaaaaa gtggcgccca ctactggcgt tgttgcgaag 180 cagtcctttt tcaagagaac tgggaaattt actttgaagg ctttattgta ttctgccctc 240 gcgggtacgg cttacgtttc atactcactt taccgagaag ctaacccttc tacccaagtt 300 cctcaatcgg acacttttcc aaacggttca aagaggaaga ctttggtaat tctgggctcc 360 ggttggggtt ctgtgtcgct tttgaaaaat ttggacacca cgttgtataa tgttgttgtt 420 gtttctccaa gaaattattt tctttttact ccgctattgc catctacccc agttggtacc 480 atcgaattga aatctattgt tgaacctgtc aggactattg ctagaagatc gcacggtgaa 540 gtccattact atgaagctga agcgtacgac gttgatcctg aaaacaaaac aattaaggtc 600 aaatcttccg ctaagaataa cgactacgac ttggacttga aatacgacta tctggttgtc 660 ggtgtgggtg ctcaaccaaa cacttttggt actccgggag tttatgaata ttcttctttc 720 ttgaaggaaa tatccgacgc tcaagagatc agattaaaaa ttatgtccag tattgagaaa 780 gctgcctccc tatctccaaa agatcctgag agagcaagat tgttgagctt tgttgtcgtt 840 ggtggtggtc ccaccggtgt cgaatttgcc gctgaattga gagattatgt tgaccaggac 900 ttgagaaaat ggatgcccga attgagtaaa gaaattaaag tcactttggt ggaggctttg 960 ccaaacattt tgaacatgtt tgacaagtat ctcgttgact atgctcaaga tttattcaaa 1020 gaggaaaaaa tcgatttaag attgaaaaca atggttaaga aagttgacgc taccactata 1080 actgccaaaa ctggcgatgg tgacattgaa aatataccgt atggtgtatt agtttgggct 1140 acaggtaatg cgccaagaga agtgtctaag aacctaatga ctaaattaga ggaacaggac 1200 tcaagacgtg gtttgttgat agataacaaa cttcaacttt tgggtgctaa gggatctatt 1260 tttgctatcg gcgattgtac cttccaccct ggcttgttcc ctaccgctca agttgcccac 1320 caagaaggtg aatacttggc tcagtatttc aagaaagctt ataaaatcga tcaattgaac 1380 tggaaaatga cccatgctaa agacgattca gaagtcgcta gattaaagaa ccaaatagtc 1440 aaaacgcaat cgcaaattga agacttcaag tacaaccata agggtgctct ggcttatatt 1500 ggttcagata aagccattgc tgatcttgcc gttggtgaag ccaaatatag gttagccggc 1560 tcattcacct tcctattctg gaaatctgct tatttggcaa tgtgtctatc ctttagaaac 1620 agagttcttg tcgctatgga ttgggctaaa gtttatttct tgggtagaga ttcatctatc 1680 tag 1683 <210> 16 <211> 545 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 16 Met Leu Pro Arg Leu Gly Phe Ala Arg Thr Ala Arg Ser Ile His Arg 1 5 10 15 Phe Lys Met Thr Gln Ile Ser Lys Pro Phe Phe His Ser Thr Glu Val 20 25 30 Gly Lys Pro Gly Pro Gln Gln Lys Leu Ser Lys Ser Tyr Thr Ala Val 35 40 45 Phe Lys Lys Trp Phe Val Arg Gly Leu Lys Leu Thr Phe Tyr Thr Thr 50 55 60 Leu Ala Gly Thr Leu Tyr Val Ser Tyr Glu Leu Tyr Lys Glu Ser Asn 65 70 75 80 Pro Pro Lys Gln Val Pro Gln Ser Thr Ala Phe Ala Asn Gly Leu Lys 85 90 95 Lys Lys Glu Leu Val Ile Leu Gly Thr Gly Trp Gly Ala Ile Ser Leu 100 105 110 Leu Lys Lys Leu Asp Thr Ser Leu Tyr Asn Val Thr Val Val Ser Pro 115 120 125 Arg Ser Phe Phe Leu Phe Thr Pro Leu Leu Pro Ser Thr Pro Val Gly 130 135 140 Thr Ile Glu Met Lys Ser Ile Val Glu Pro Val Arg Ser Ile Ala Arg 145 150 155 160 Arg Thr Pro Gly Glu Val His Tyr Ile Glu Ala Glu Ala Leu Asp Val 165 170 175 Asp Pro Lys Ala Lys Lys Val Met Val Gln Ser Val Ser Glu Asp Glu 180 185 190 Tyr Phe Val Ser Ser Leu Ser Tyr Asp Tyr Leu Val Val Ser Val Gly 195 200 205 Ala Lys Thr Thr Thr Phe Asn Ile Pro Gly Val Tyr Gly Asn Ala Asn 210 215 220 Phe Leu Lys Glu Ile Glu Asp Ala Gln Asn Ile Arg Met Lys Leu Met 225 230 235 240 Lys Thr Ile Glu Gln Ala Ser Ser Phe Pro Val Asn Asp Pro Glu Arg 245 250 255 Lys Arg Leu Leu Thr Phe Val Val Val Gly Gly Gly Pro Thr Gly Val 260 265 270 Glu Phe Ala Ala Glu Leu Gln Asp Tyr Ile Asn Gln Asp Leu Arg Lys 275 280 285 Trp Met Pro Asp Leu Ser Lys Glu Met Lys Val Ile Leu Ile Glu Ala 290 295 300 Leu Pro Asn Ile Leu Asn Met Phe Asp Lys Thr Leu Ile Lys Tyr Ala 305 310 315 320 Glu Asp Leu Phe Ala Arg Asp Glu Ile Asp Leu Gln Val Asn Thr Ala 325 330 335 Val Lys Val Val Glu Pro Thr Tyr Ile Arg Thr Leu Gln Asn Gly Gln 340 345 350 Thr Asn Thr Asp Ile Glu Tyr Gly Met Leu Val Trp Ala Thr Gly Asn 355 360 365 Glu Pro Ile Asp Phe Ser Lys Thr Leu Met Ser Arg Ile Pro Glu Gln 370 375 380 Thr Asn Arg Arg Gly Leu Leu Ile Asn Asp Lys Leu Glu Leu Leu Gly 385 390 395 400 Ser Glu Asn Ser Ile Tyr Ala Ile Gly Asp Cys Thr Ala His Thr Gly 405 410 415 Phe Phe Pro Thr Ala Gln Val Ala His Gln Glu Gly Glu Tyr Leu Ala 420 425 430 Lys Ile Leu Asp Lys Lys Leu Gln Ile Glu Gln Leu Glu Trp Asp Met 435 440 445 Leu Asn Ser Thr Asp Glu Thr Glu Val Ser Arg Leu Gln Lys Glu Val 450 455 460 Asn Leu Arg Lys Ser Lys Leu Asp Lys Phe Asn Tyr Lys His Met Gly 465 470 475 480 Ala Leu Ala Tyr Ile Gly Ser Glu Thr Ala Ile Ala Asp Leu His Met 485 490 495 Gly Asp Ser Ser Tyr Gln Leu Lys Gly Met Phe Ala Phe Leu Phe Trp 500 505 510 Lys Ser Ala Tyr Leu Ala Met Cys Leu Ser Ile Arg Asn Arg Ile Leu 515 520 525 Ile Ala Met Asp Trp Thr Lys Val Tyr Phe Leu Gly Arg Asp Ser Ser 530 535 540 Val 545 <210> 17 <211> 1638 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 17 atgctgccca gacttggttt tgcgaggact gctaggtcca tacaccgttt caagatgacc 60 cagatctcta aacctttttt ccattccact gaagttggta agcccggacc acagcagaag 120 ctatcgaaat cttacactgc ggtattcaag aaatggtttg tcagaggttt aaagttaacc 180 ttttacacga cgttggccgg cacattgtat gtgtcatacg agctgtacaa agaatcgaac 240 ccacccaaac aggttcccca atcgaccgct tttgctaatg gtttgaaaaa gaaggagctg 300 gttattttgg gtacaggctg gggcgccata tctcttttga agaaattaga cacgtctttg 360 tataacgtga ccgtggtgtc gccaagaagc ttctttttgt tcacaccgtt attaccctca 420 acgcctgtgg gtacgataga gatgaagtct attgtcgaac cggttagatc gatcgctaga 480 agaacgcctg gagaagttca ctacattgag gcggaagcgt tggacgttga tccaaaggcc 540 aaaaaagtaa tggtgcaatc ggtgtcagag gacgaatatt tcgtttcgag cttaagttac 600 gattatcttg ttgttagtgt aggcgctaaa accactactt ttaacattcc cggggtctat 660 ggcaatgcta acttcttgaa agagattgaa gatgctcaaa atattcgtat gaagttaatg 720 aaaaccatag aacaggcaag ttcatttcct gtgaacgatc cggaaaggaa gcgattatta 780 acgttcgtgg ttgttggagg gggccctacg ggggttgaat ttgccgccga actgcaagat 840 tacatcaatc aagatttgag gaagtggatg cccgacttaa gtaaagaaat gaaggttatc 900 ttaattgaag ccctgcctaa tatcctaaac atgttcgata agacgttgat caagtatgcc 960 gaggaccttt ttgccagaga tgaaattgac ttgcaagtga atactgccgt gaaagtcgta 1020 gagccaacct atatacgcac tctgcaaaac ggccaaacaa acacggatat cgaatacggg 1080 atgctggttt gggccacggg aaatgaacca atcgattttt caaagacact gatgagtaga 1140 ataccggagc aaactaatag gcgtggtctg ttaattaatg acaagttgga gcttctcggt 1200 tctgagaatt cgatttatgc aattggtgat tgtaccgcac acacgggttt ctttcccacg 1260 gcacaagttg cacatcagga aggcgaatac ttggccaaga tcttggataa aaaattacag 1320 atagaacaat tggaatggga catgctcaac agtaccgatg aaactgaggt atcacgtcta 1380 caaaaagagg ttaatttgag gaaatctaag ttggataagt tcaactacaa gcatatgggt 1440 gcccttgcgt acatcggctc tgaaaccgca attgcagatt tgcatatggg cgactcatca 1500 taccagttga aaggtatgtt tgccttcttg ttttggaaat ccgcttattt ggccatgtgt 1560 ctctctatca ggaataggat tttaattgcc atggactgga ccaaagttta ctttcttgga 1620 agggattcct ccgtgtag 1638 <210> 18 <211> 1267 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARS/CEN <400> 18 gagctccttt catttctgat aaaagtaaga ttactccatt tatcttttca ccaacatatt 60 catagttgaa agttatcctt ctaagtacgt atacaatatt aattaaacgt aaaaacaaaa 120 ctgactgtaa aaatgtgtaa aaaaaaaata tcaaattcat agcagtttca aggaatgaaa 180 actattatga tctggtcacg tgtatataaa ttattaattt taaacccata taatttatta 240 tttttttatt ctaaagttta aagtaatttt agtagtattt tatattttga ataaatatac 300 tttaaatttt tatttttata ttttattact tttaaaaata atgtttttat ttaaaacaaa 360 attataagtt aaaaagttgt tccgaaagta aaatatattt tatagttttt acaaaaataa 420 attattttta acgtattttt tttaattata tttttgtatg tgattatatc cacaggtatt 480 atgctgaatt tagctgtttc agtttaccag tgtgatagta tgattttttt tgcctctcaa 540 aagctatttt tttagaagct tcgtcttaga aataggtggt gtataaattg cggttgactt 600 ttaactatat atcattttcg atttatttat tacatagaga ggtgctttta attttttaat 660 ttttattttc aataatttta aaagtgggta cttttaaatt ggaacaaagt gaaaaatatc 720 tgttatacgt gcaactgaat tttactgacc ttaaaggact atctcaatcc tggttcagaa 780 atccttgaaa tgattgatat gttggtggat tttctctgat tttcaaacaa gaggtatttt 840 atttcatatt tattatattt tttacattta ttttatattt ttttattgtt tggaagggaa 900 agcgacaatc aaattcaaaa tatattaatt aaactgtaat acttaataag agacaaataa 960 cagccaagaa tcaaatactg ggtttttaat caaaagatct ctctacatgc acccaaattc 1020 attatttaaa tttactatac tacagacaga atatacgaac ccagattaag tagtcagacg 1080 cttttccgct ttattgagta tatagcctta catattttct gcccataatt tctggattta 1140 aaataaacaa aaatggttac tttgtagtta tgaaaaaagg cttttccaaa atgcgaaata 1200 cgtgttattt aaggttaatc aacaaaacgc atatccatat gggtagttgg acaaaacttc 1260 aatcgat 1267 <210> 19 <211> 289 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CYC promoter <400> 19 atttggcgag cgttggttgg tggatcaagc ccacgcgtag gcaatcctcg agcagatccg 60 ccaggcgtgt atatatagcg tggatggcca ggcaacttta gtgctgacac atacaggcat 120 atatatatgt gtgcgacgac acatgatcat atggcatgca tgtgctctgt atgtatataa 180 aactcttgtt ttcttctttt ctctaaatat tctttcctta tacattagga cctttgcagc 240 ataaattact atacttctat agacacgcaa acacaaatac acacactaa 289 <210> 20 <211> 401 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TEF promoter <400> 20 atagcttcaa aatgtttcta ctcctttttt actcttccag attttctcgg actccgcgca 60 tcgccgtacc acttcaaaac acccaagcac agcatactaa atttcccctc tttcttcctc 120 tagggtgtcg ttaattaccc gtactaaagg tttggaaaag aaaaaagaga ccgcctcgtt 180 tctttttctt cgtcgaaaaa ggcaataaaa atttttatca cgtttctttt tcttgaaaat 240 tttttttttg atttttttct ctttcgatga cctcccattg atatttaagt taataaacgg 300 tcttcaattt ctcaagtttc agtttcattt ttcttgttct attacaactt tttttacttc 360 ttgctcatta gaaagaaagc atagcaatct aatctaagtt t 401 <210> 21 <211> 655 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GPD promoter <400> 21 agtttatcat tatcaatact cgccatttca aagaatacgt aaataattaa tagtagtgat 60 tttcctaact ttatttagtc aaaaaattag ccttttaatt ctgctgtaac ccgtacatgc 120 ccaaaatagg gggcgggtta cacagaatat ataacatcgt aggtgtctgg gtgaacagtt 180 tattcctggc atccactaaa tataatggag cccgcttttt aagctggcat ccagaaaaaa 240 aaagaatccc agcaccaaaa tattgttttc ttcaccaacc atcagttcat aggtccattc 300 tcttagcgca actacagaga acaggggcac aaacaggcaa aaaacgggca caacctcaat 360 ggagtgatgc aacctgcctg gagtaaatga tgacacaagg caattgaccc acgcatgtat 420 ctatctcatt ttcttacacc ttctattacc ttctgctctc tctgatttgg aaaaagctga 480 aaaaaaaggt tgaaaccagt tccctgaaat tattccccta cttgactaat aagtatataa 540 agacggtagg tattgattgt aattctgtaa atctatttct taaacttctt aaattctact 600 tttatagtta gtcttttttt tagttttaaa acaccagaac ttagtttcga cggat 655 <210> 22 <211> 292 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CCW12 promoter <400> 22 ttcgcggcca cctacgccgc tatctttgca acaactatct gcgataactc agcaaatttt 60 gcatattcgt gttgcagtat tgcgataatg ggagtcttac ttccaacata acggcagaaa 120 gaaatgtgag aaaattttgc atcctttgcc tccgttcaag tatataaagt cggcatgctt 180 gataatcttt ctttccatcc tacattgttc taattattct tattctcctt tattctttcc 240 taacatacca agaaattaat cttctgtcat tcgcttaaac actatatcaa ta 292 <210> 23 <211> 1468 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ADH promoter <400> 23 gccgggatcg aagaaatgat ggtaaatgaa ataggaaatc aaggagcatg aaggcaaaag 60 acaaatataa gggtcgaacg aaaaataaag tgaaaagtgt tgatatgatg tatttggctt 120 tgcggcgccg aaaaaacgag tttacgcaat tgcacaatca tgctgactct gtggcggacc 180 cgcgctcttg ccggcccggc gataacgctg ggcgtgaggc tgtgcccggc ggagtttttt 240 gcgcctgcat tttccaaggt ttaccctgcg ctaaggggcg agattggaga agcaataaga 300 atgccggttg gggttgcgat gatgacgacc acgacaactg gtgtcattat ttaagttgcc 360 gaaagaacct gagtgcattt gcaacatgag tatactagaa gaatgagcca agacttgcga 420 gacgcgagtt tgccggtggt gcgaacaata gagcgaccat gaccttgaag gtgagacgcg 480 cataaccgct agagtacttt gaagaggaaa cagcaatagg gttgctacca gtataaatag 540 acaggtacat acaacactgg aaatggttgt ctgtttgagt acgctttcaa ttcatttggg 600 tgtgcacttt attatgttac aatatggaag ggaactttac acttctccta tgcacatata 660 ttaattaaag tccaatgcta gtagagaagg ggggtaacac ccctccgcgc tcttttccga 720 tttttttcta aaccgtggaa tatttcggat atccttttgt tgtttccggg tgtacaatat 780 ggacttcctc ttttctggca accaaaccca tacatcggga ttcctataat accttcgttg 840 gtctccctaa catgtaggtg gcggagggga gatatacaat agaacagata ccagacaaga 900 cataatgggc taaacaagac tacaccaatt acactgcctc attgatggtg gtacataacg 960 aactaatact gtagccctag acttgatagc catcatcata tcgaagtttc actacccttt 1020 ttccatttgc catctattga agtaataata ggcgcatgca acttcttttc tttttttttc 1080 ttttctctct cccccgttgt tgtctcacca tatccgcaat gacaaaaaaa tgatggaaga 1140 cactaaagga aaaaattaac gacaaagaca gcaccaacag atgtcgttgt tccagagctg 1200 atgaggggta tctcgaagca cacgaaactt tttccttcct tcattcacgc acactactct 1260 ctaatgagca acggtatacg gccttccttc cagttacttg aatttgaaat aaaaaaaagt 1320 ttgctgtctt gctatcaagt ataaatagac ctgcaattat taatcttttg tttcctcgtc 1380 attgttctcg ttccctttct tccttgtttc tttttctgca caatatttca agctatacca 1440 agcatacaat caactccaag ctggccgc 1468 <210> 24 <211> 252 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CYC1 terminator <400> 24 tcatgtaatt agttatgtca cgcttacatt cacgccctcc ccccacatcc gctctaaccg 60 aaaaggaagg agttagacaa cctgaagtct aggtccctat ttattttttt atagttatgt 120 tagtattaag aacgttattt atatttcaaa tttttctttt ttttctgtac agacgcgtgt 180 acgcatgtaa cattatactg aaaaccttgc ttgagaaggt tttgggacgc tcgaaggctt 240 taatttgcgg cc 252 <210> 25 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 25 cgagctcttc gcggccacct acgccgctat c 31 <210> 26 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 26 gctctagata ttgatatagt gtttaagcga at 32 <210> 27 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 27 ggatccatgt ccgtaaagga actact 26 <210> 28 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 28 acgcgtcgac ttaaaactgc aattcctttt gaat 34 <210> 29 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 29 gagctcaatt aaccctcact aaaggg 26 <210> 30 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 30 gagctccaaa ttaaagcctt cgagcg 26 <210> 31 <211> 69 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 31 tgagcacgtg agtatacgtg attaagcaca caaaggcagc ttggagtatg gtgctgcaag 60 gcgattaag 69 <210> 32 <211> 67 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 32 aggcaagtgc acaaacaata cttaaataaa tactactcag taataacccg gctcgtatgt 60 tgtgtgg 67 <210> 33 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 33 gccaaatgat ttagcattat c 21 <210> 34 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 34 aaaaggagag ggccaagagg g 21 <210> 35 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 35 atgattagac aatcattaat gaaaacagtg tgggctaact ccagtcacga cgttgtaaaa 60 60 <210> 36 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 36 ctagatagat gaatctctac ccaagaaata aactttagcc aggtttcccg actggaaagc 60 60 <210> 37 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 37 actgatcatc atttaaaaat gt 22 <210> 38 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 38 aaggaaaaaa attttcacac ta 22 <210> 39 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 39 atgctgccca gacttggttt tgcgaggact gctaggtcca tacaccgttt ccagtcacga 60 cgttgtaaaa 70 <210> 40 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 40 ctacacggag gaatcccttc caagaaagta aactttggtc aggtttcccg actggaaagc 60 60 <210> 41 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 41 caggaacata gtagaaagac 20 <210> 42 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 42 taacgcgaat cttccatg 18 <210> 43 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 43 atgagtaatc ctcaaaaagc tctaaacgac tttctgtcca gtgaatctgt ccagtcacga 60 cgttgtaaaa 70 <210> 44 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 44 tcatgttacc ttcttagcat taccataatg cgaatcttct gatgatgtgt aggtttcccg 60 actggaaagc 70 <210> 45 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 45 atgagtaatc ctcaaaaagc 20 <210> 46 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 46 tcatgttacc ttcttag 17

Claims (20)

1. 유전적으로 조작되지 않은 세포에 비하여 Fps1의 활성이 감소된, 젖산에 대한 내산성을 갖는 효모 세포로서,
   피루베이트를 락테이트로 전환하는 폴리펩티드의 활성을 갖는 것인 효모 세포.
2. 청구항 1에 있어서, 상기 Fps1을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 제거 또는 파괴된 것인 효모 세포.
3. 청구항 1에 있어서, 상기 Fps1은 서열번호 1의 아미노산 서열과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드인 것인 효모 세포.
4. 청구항 1에 있어서, 상기 Fps1을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1의 아미노산 서열과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 서열번호 2의 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는 것인 효모 세포.
5. 청구항 1에 있어서, 사카로마이세스 (Saccharomyces), 클루이베로마이세스 (Kluyveromyces), 캔디다 (Candida), 피치아 (Pichia), 이사첸키아 (Issatchenkia), 데바리오마이세스 (Debaryomyces), 자이고사카로마이세스 (Zygosaccharomyces), 쉬조사카로마이세스 (Shizosaccharomyces) 또는 사카로마이콥시스 (Saccharomycopsis) 속인 것인 효모 세포.
6. 청구항 1에 있어서, 사카로마이세스 세레비지애인 것인 효모 세포.
7. 삭제
8. 청구항 1에 있어서, 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것인 효모세포.
9. 청구항 1에 있어서, 피루베이트를 락테이트로 전환하는 폴리펩티드는 서열번호 3의 아미노산 서열과 95% 이상의 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 가지는 것인 효모 세포.
10. 청구항 8에 있어서, 피루베이트를 락테이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 3의 아미노산 서열과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 서열번호 7의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 효모 세포.
11. 청구항 1에 있어서, 락테이트 데히드로게나제의 발현 또는 비활성이 증가된 것인 효모 세포.
12. 청구항 1에 있어서, 추가로 피루베이트를 아세트알데히드로 전환하는 폴리펩티드, 락테이트를 피루베이트로 전환하는 폴리펩티드, 디히드록시아세톤 포스페이트 (DHAP)를 글리세롤-3-포스페이트로 전환하는 폴리펩티드, 익스터널 미토콘드리아 NADH 데히드로게나제 (external mitochondral NADH dehydrogenase), 또는 그 조합의 활성이 감소된 것인 효모 세포.
13. 청구항 1에 있어서, 추가로 피루베이트를 아세트알데히드로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 락테이트를 피루베이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 디히드록시아세톤 포스페이트 (DHAP)를 글리세롤-3-포스페이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 익스터널 미토콘드리아 NADH 데히드로게나제 (external mitochondral NADH dehydrogenase)를 코딩하는 유전자, 또는 그 조합이 제거 또는 파괴된 것인 효모 세포.
14. 청구항 12에 있어서, 피루베이트를 아세트알데히드로 전환하는 폴리펩티드, 락테이트를 피루베이트로 전환하는 폴리펩티드, 디히드록시아세톤 포스페이트 (DHAP)를 글리세롤-3-포스페이트로 전환하는 폴리펩티드, 익스터널 미토콘드리아 NADH 데히드로게나제 (external mitochondral NADH dehydrogenase는 각각 서열번호 8, 10, 12, 14 또는 16의 아미노산 서열과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 것인 효모 세포.
15. 청구항 12에 있어서, 피루베이트를 아세트알데히드로 전환하는 폴리펩티드, 락테이트를 피루베이트로 전환하는 폴리펩티드, 디히드록시아세톤 포스페이트 (DHAP)를 글리세롤-3-포스페이트로 전환하는 폴리펩티드, 익스터널 미토콘드리아 NADH 데히드로게나제 (external mitochondral NADH dehydrogenase)를 코딩하는 유전자는 각각 서열번호 8, 10, 12, 14 또는 16의 아미노산 서열과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 서열번호 9, 11, 13, 15 또는 17의 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는 것인 효모 세포.
16. 청구항 1의 효모 세포를 포함하는, 락테이트를 생산하는데 사용하기 위한 조성물.
17. 청구항 1의 효모 세포를 배양하는 단계를 포함하는 락테이트를 생산하는 방법.
18. 청구항 17에 있어서, 배양물로부터 락테이트를 회수하는 단계를 포함하는 것인 방법.
19. 청구항 17에 있어서, 상기 배양은 미호기 또는 혐기 조건에서 수행되는 것인 방법.
20. 청구항 17에 있어서, 상기 배양은 pH 2 내지 7의 범위에서 수행되는 것인 방법.

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