JP2001204468A

JP2001204468A - 耐酸性乳酸生成微生物

Info

Publication number: JP2001204468A
Application number: JP2000018953A
Authority: JP
Inventors: Satoshi Saito; 聡志齋藤; Katsuhiko Kitamoto; 勝ひこ北本
Original assignee: Toyota Motor Corp
Current assignee: Toyota Motor Corp
Priority date: 2000-01-27
Filing date: 2000-01-27
Publication date: 2001-07-31

Abstract

(57)【要約】（修正有）【課題】乳酸生成遺伝子を組み込んだ組換えベクタ
ー、及び耐酸性乳酸生成微生物の提供。【解決手段】ビフィドバクテリア属又はラクトバシル
ス属に属する微生物由来の乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子
及びプロモーターが組み込まれた組換えベクターで、ビ
フィドバクテリウム属に属する微生物がビフィドバクテ
リウム・ロンガムであり、プロモーターがグリセルアル
デヒド３リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子由来である組換
えベクター、並びに該組換えベクターで形質転換した耐
酸性乳酸生成微生物で、ｐＨ６以下の条件でも乳酸発酵
することができる酵母菌又はカビを提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、所定の乳酸生成遺
伝子を組み込んだ組換えベクター、及び該ベクターで形
質転換した耐酸性乳酸生成微生物に関する。

【０００２】

【従来の技術】乳酸は、醸造、漬物などの食品用途、医
薬、農薬、化粧品などの化学原料用途、さらに繊維仕上
げ、塗料、溶剤、生分解性プラスチックなどの工業用途
等に使用されており、需要増加が期待されている。

【０００３】従来より、乳酸発酵には乳酸菌が使用され
ているが、乳酸菌が乳酸発酵することのできるpH範囲は
6〜7であるため、乳酸が生成されてpHが6以下になる
と、それ以上乳酸を生成することができなくなる。従っ
て、高濃度の乳酸を得るためには、発酵中に生成する乳
酸をアルカリ（例えば炭酸カルシウム、アンモニア、水
酸化ナトリウム等）で中和する必要がある。

【０００４】しかし、アルカリで中和すると、乳酸塩を
乳酸に戻す工程が必要であり副産物を生じること等によ
り、その処理にコストがかかる。また、バイポーラ膜と
呼ばれる特殊なイオン交換膜を用いると、副産物を生じ
ることなく乳酸塩を乳酸とアルカリに戻すことができる
が、バイポーラ膜は高価なうえ効率が悪いという問題が
ある。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、所定の乳酸
生成遺伝子を組み込んだ組換えベクター、及び該ベクタ
ーで形質転換した耐酸性乳酸生成微生物を提供すること
を目的とする。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者は、上記課題を
解決するため鋭意研究を行った結果、乳酸デヒドロゲナ
ーゼ遺伝子及びプロモーターを組み込んだ組換えベクタ
ーを構築し、該ベクターを耐酸性の宿主微生物に導入す
ることにより、酸性条件でも乳酸生産性の高い微生物を
得ることに成功し、本発明を完成するに至った。

【０００７】すなわち、本発明は、ビフィドバクテリウ
ム属又はラクトバシルス属に属する微生物由来の乳酸デ
ヒドロゲナーゼ遺伝子及びプロモーターが組み込まれた
組換えベクターである。ビフィドバクテリウム属に属す
る微生物としては、ビフィドバクテリウム・ロンガムが
挙げられ、プロモーターとしては例えばグリセルアルデ
ヒド3リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーターが
挙げられる。また、前記組換えベクターとしては、下記
の制限酵素地図を有し、かつ7480bpの長さを有するもの
が挙げられる。

【０００８】

【化２】

【０００９】上記宿主微生物としては、pH6以下の条件
でも乳酸発酵することができるもの、例えば酵母菌又は
カビが挙げられる。以下、本発明を詳細に説明する。

【００１０】

【発明の実施の形態】本発明は、特定の乳酸生成遺伝子
が組み込まれた組換えベクターである。また本発明は、
耐酸性を有する微生物（耐酸性微生物）に前記組換えベ
クターを導入してなる耐酸性乳酸生成微生物である。

【００１１】１．乳酸生成遺伝子を含む組換えベクター
の調製 (1)乳酸生成遺伝子のクローニング本発明において使用する乳酸生成遺伝子は特に限定され
るものではなく、例えばビフィドバクテリウム属に属す
る微生物（例えばビフィドバクテリウム・ロンガム(Bif
idobacterium longum)）、ラクトバシルス属に属する微
生物（例えばラクトバシルス・アシドフィラス(Lactoba
cillus acidophilus)）などを採取源とし、mRNAから調
製されたcDNAライブラリーからクローニングすることが
できる。乳酸生成遺伝子としては、例えば乳酸デヒドロ
ゲナーゼ（LDH）遺伝子が挙げられる。

【００１２】mRNAの調製は、通常行われる手法により行
うことができる。例えば、上記微生物から、グアニジウ
ムチオシアネート-トリフルオロ酢酸セシウム法などに
より全RNAを抽出した後、オリゴdT-セルロースやポリU-
セファロース等を用いたアフィニティーカラム法によ
り、あるいはバッチ法によりポリ(A)⁺RNA(mRNA)を得る
ことができる。さらに、ショ糖密度勾配遠心法等により
ポリ(A)⁺RNAをさらに分画してもよい。

【００１３】このようにして得られたmRNAを鋳型とし
て、オリゴdTプライマー及び逆転写酵素を用いて一本鎖
cDNAを合成した後、さらに二本鎖cDNAを合成する。次
に、得られた二本鎖cDNAを適当なクローニングベクター
に組み込んで組換えベクターを作製する。そしてこの組
換えベクターを用いて大腸菌等を形質転換し、テトラサ
イクリン耐性、アンピシリン耐性等を指標として形質転
換体を選択することにより、cDNAのライブラリーを得る
ことができる。

【００１４】上記のようにして得られる形質転換体から
目的のDNAを有する株を選択するには、例えば、LDHの一
部のアミノ酸配列に対応する縮重センスプライマー及び
縮重アンチセンスプライマーを合成し、これを用いてPC
Rを行い、得られた断片をプローブとしてcDNAライブラ
リーからスクリーニングする方法を採用することができ
る。あるいはλファージ（λgt11等)を用いた場合は、
λgt11 インサート増幅用のプライマーを用いてPCRを行
う方法を採用することができる。但し、本発明において
はこれらのプライマーに限定されるものではない。な
お、プライマーは化学合成により調製することができ
る。

【００１５】このようにして得られたDNA増幅断片を、
³²P、³⁵S又はビオチン等で標識してプローブとし、これ
を形質転換体のDNAを変性固定したニトロセルロースフ
ィルターとハイブリダイズさせ、得られたポジティブ株
を検索することによりスクリーニングすることができ
る。好ましくは、クローニングした部分配列を鋳型とし
てPCRを行い、より長い部分配列を取得する。その取得
した配列を参考としてPCRによりプローブを作製し、cDN
Aライブラリーから該遺伝子をスクリーニングすること
が望ましい。

【００１６】次に、得られたクローンから全長のcDNAを
クローニングする。cDNAのクローニングには、例えばRA
CE(Rapid Amplification of cDNA ends)法が用いられ
る。RACE法とは、cDNA の5'又は3'欠失部位をPCRにより
迅速に回収する方法である。なお、RACE法は、市販のキ
ット(Marathon^TM cDNA Amplification Kit(Clonetech
社))を用いて行うこともできる。

【００１７】cDNAの塩基配列の決定及び確認は、マキサ
ム-ギルバートの化学修飾法、又はM13ファージを用いる
ジデオキシヌクレオチド鎖終結法等の公知手法により行
うことができるが、通常は自動塩基配列決定装置（例え
ばApplied Biosystems社製ABI373シークエンサー等）を
用いて配列決定が行われる。

【００１８】一旦本発明において使用する乳酸生成遺伝
子の塩基配列が確定されると、その後は化学合成によっ
て、又はクローニングされたcDNAを鋳型としたPCRによ
って、あるいは該塩基配列を有するDNA断片をプローブ
としてハイブリダイズさせることによって、当該遺伝子
を得ることができる。さらに、部位特定変異誘発等によ
って乳酸生成遺伝子の変異体を合成することもできる。
遺伝子に変異を導入するには、Kunkel法、Gapped duple
x法等の公知の手法又はこれに準ずる方法を採用するこ
とができる。例えば、部位特異的突然変異誘発法を利用
した変異導入用キット（例えばMutant-K(TAKARA社製）
やMutant-G(TAKARA社製）)などを用いて、あるいは、TA
KARA社のLA PCR in vitro Mutagenesis シリーズキット
を用いて変異の導入が行われる。

【００１９】(2) 組換えベクターの構築本発明の組換えベクターは、適当なベクターに乳酸遺伝
子を連結(挿入)することにより得ることができる。乳酸
生成遺伝子を挿入するためのベクターは、宿主中で複製
可能なものであれば特に限定されず、例えば、プラスミ
ド DNA、ファージ DNA等が挙げられる。

【００２０】プラスミド DNAとしては、大腸菌由来のプ
ラスミド（例えばpBR322, pBR325,pUC118, pUC119, pUC
18, pUC19等）、枯草菌由来のプラスミド（例えばpUB11
0,pTP5,等)、酵母由来のプラスミド（例えばYEp13, YEp
24, YCp50等)などが挙げられ、ファージDNAとしてはλ
ファージ（Charon4A、Charon21A、EMBL3、EMBL4、λgt1
0、λgt11、λZAP等）が挙げられる。さらに、レトロウ
イルス又はワクシニアウイルスなどの動物ウイルス、バ
キュロウイルスなどの昆虫ウイルスベクターを用いるこ
ともできる。ベクターに乳酸生成遺伝子を挿入するに
は、まず、精製されたDNAを適当な制限酵素で切断し、
適当なベクター DNAの制限酵素部位又はマルチクローニ
ングサイトに挿入してベクターに連結する方法などが採
用される。

【００２１】本発明において使用する乳酸生成遺伝子
は、その遺伝子の機能が発揮されるようにベクターに組
み込まれることが必要である。そこで、本発明のベクタ
ーには、プロモーター、乳酸生成遺伝子、ターミネータ
ーのほか、所望によりエンハンサーなどのシスエレメン
ト、スプライシングシグナル、ポリA付加シグナル、選
択マーカー、リボソーム結合配列（SD配列）などを連結
することができる。なお、選択マーカーとしては、例え
ばジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺伝
子、ネオマイシン耐性遺伝子等が挙げられる。

【００２２】例えば、本発明において使用する組換えベ
クターは、乳酸生成遺伝子の上流にグリセルアルデヒド
3-リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（GAP遺伝子）のプロ
モーター（GAP-P）を、下流にGAP遺伝子のターミネータ
ー（GAP-T）及びアンピシリン耐性遺伝子(Amp^r)を連結
して遺伝子発現カセットを作製し、このカセットを、予
めURA3遺伝子及び２μｍ oriを連結しておいたプラスミ
ドに連結することにより、7480bpの長さを有する組換え
ベクターを構築することができる（図１；pYLD1）。

【００２３】図1において、各制限酵素名の次に記載さ
れている数字は、アンピシリン抵抗性マーカー遺伝子の
HindIII切断位置を０としたときの切断位置を示す。な
お、上記組換えベクターpYLD1は大腸菌に導入され（名
称：「E. coli pYLD1」）、工業技術院生命工学工業技
術研究所（茨城県つくば市東１丁目１番３号）に、FERM
P-17621として寄託されている（寄託日：平成11年10月
26日）。

【００２４】２．耐酸性乳酸生成微生物の調製 (1)耐酸性微生物本発明において、「耐酸性微生物」とは、酸性条件、好
ましくはpHが6以下、さらに好ましくはpH２〜５で乳酸
発酵を行うことができる微生物を意味する。本発明に使
用する微生物は、耐酸性を有し、かつ乳酸生成を行うこ
とができる限り、特に限定されるものではなく、天然か
ら採取されたものも含まれる。本発明では、乳酸生成遺
伝子を組み込んだ組換えベクターを上記耐酸性微生物に
導入して形質転換体を得、乳酸生成遺伝子が機能するよ
うに操作することもできる。「乳酸生成遺伝子が機能す
る」とは、該遺伝子が組み込まれたベクターを導入した
宿主（微生物）を培養して乳酸を生成させたときに、乳
酸の蓄積により培地のpHが酸性になっても（特に、pH6
以下に下がっても）当該発現が維持されて乳酸を生成し
得るように発現することを意味する。

【００２５】本発明において宿主として使用される乳酸
生成微生物は、例えば、サッカロミセス属等の酵母、あ
るいはリゾプス属に属するカビなどが挙げられるが(例
えば下記微生物参照)、これらの微生物に限定されるも
のではない。酵母菌サッカロミセス属：サッカロミセス・セレビシエ(Sacch
aromyces cerevisiae)、サッカロミセス・クルーベリ(S
accharomyces kluyveri)、サッカロミセス・パラドキサ
ス(Saccharomyces paradoxus)、サッカロミセス・パス
トリアヌス(Saccharomyces pastorianus) クルーベルマイセス属：クルーベルマイセス・ラクティ
ス(Kluyveromyces lactis)、クルーベルマイセス・マル
キシアヌス(Kluyveromyces marxianus)、ピキア属：ピキア・パストリス(Pichia pastoris）カビリゾプス属：リゾプス・デレマー(Rhyzopus delemer) アスペルギルス属：アスペルギルス・ニガー(Aspergill
us niger)、アスペルギルス・オリザ(Aspergillus oryzae)

【００２６】(2) 形質転換耐酸性乳酸生成微生物（耐酸性乳酸発酵微生物ともい
う）を得るための形質転換は、上記手法により得られた
耐酸性微生物に、乳酸生成遺伝子を含む本発明の組換え
ベクターを導入し得る方法であれば特に限定されるもの
ではない。例えば、酢酸リチウム法、カルシウムイオン
を用いる方法(Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69, 211
0, 1972)、エレクトロポレーション法等の通常行われる
遺伝子工学的手法により形質転換を行う。

【００２７】３．乳酸発酵本発明の耐酸性乳酸生成微生物は、培養して乳酸を生成
させると、乳酸の蓄積により培地のpHが酸性になっても
（特に、pH6以下に下がっても）当該発現が維持されて
乳酸を生成し得るように機能する。従って、耐酸性乳酸
生成微生物を用いると、中和剤を使用せずに乳酸発酵す
ることができる。

【００２８】本発明において乳酸発酵に使用される糖化
原料としては、さつまいも、ジャガイモ、トウモロコシ
等が挙げられる。これらの原料を洗浄及び破砕した後、
液化・糖化槽に入れ、90〜120℃、好ましくは120℃の蒸
気で5〜30分、好ましくは15分処理する。

【００２９】原料に対し0.5〜2.5倍の水を加えた後、市
販の酵素（例えばターマミル（ノバ社）及びスミチーム
（新日本化学社））を原料重量に対して0.5〜１％添加
する。温度50〜95℃、好ましくは60℃で15〜20時間保持
すれば原料の液化、糖化が完了する。

【００３０】上記のようにして得られた液を遠心分離に
かけ、固形分（リグニン等）を分離し、原液とする。な
お、デンプン原料としてブドウ糖を用いる場合はこれま
での工程を省略し、原液として直接使用することができ
る。この液を基質溶液として菌体培養及び発酵に使用す
る。

【００３１】培養のための培地は、通常は糖類、ペプト
ン、酵母エキスを含む。好ましくは、0.1〜10％グルコ
ース、0.1〜10％ペプトン、0.1〜10％酵母エキスを含
み、さらに好ましくは約2％のグルコース、約2％のペプ
トン、約1％の酵母エキスが使用される。

【００３２】また、培地として予め濾過除菌したものを
用いることができ、特に乳酸菌用培地としてMRS培地又
はGYP培地等を用いることができる。更に、コーンスタ
ーチ製造の副産物であるコーンスティープリカーを使用
することも可能である。発酵条件は以下の通りである。

【００３３】温度：25〜33℃、好ましくは30℃ 菌体密度：10〜30％、好ましくは25％（湿重量ベース）基質濃度：5〜20％、好ましくは10％（バッチ発酵の初
期濃度）発酵時間：10〜30時間、好ましくは20〜24時間

【００３４】本発明の耐酸性乳酸生成微生物は、1種類
単独でもよく、複数種を混合して用いることもできる。
複数種を混合する場合は、互いに同一の属に属する微生
物であっても異なる属に属する微生物であってもよい。
また、混合比率は任意に設定することができ、特に限定
されるものではないが、それぞれ均等（例えば3種類の
微生物を用いるときは1:1:1）となるようにすることが
好ましい。

【００３５】上記条件で発酵させることにより、１〜10
％の乳酸が得られる。乳酸の収率は、例えば、Fキット
（ベーリンガー社）などの市販のキットを用いて測定す
ることができる。本発明においては、上記発酵の際に炭
酸カルシウム、水酸化ナトリウム、アンモニアなどの中
和剤を添加する必要はない。

【００３６】この発酵液を遠心分離装置又はフィルター
にかけて菌体と液分とを分離し、乳酸の液分の採取（精
製・濃縮）を行う。液分の精製・濃縮は、一般に海水や
食品の脱塩に広く採用されているイオン交換膜を利用し
た電気透析装置（例えばアシライザー（旭化成社））に
より行うことができる。

【００３７】本発明に使用されるイオン交換膜は特に限
定されず、従来より公知のイオン交換膜が使用できる。
例えば、陽イオン交換膜としてはスルホン酸基、カルボ
ン酸基、さらにこれらのイオン交換基が複数混在した陽
イオン交換膜が挙げられる。また、陰イオン交換膜とし
ては４級アンモニウム基、１級アミノ基、２級アミノ
基、３級アミノ基、さらにこれらのイオン交換基が複数
混在した陰イオン交換膜が挙げられる。これらの陽イオ
ン及び陰イオン交換膜は、重合型、縮合型、均一型及び
不均一型のいずれでもよく、さらに、補強心材の有無
や、炭化水素系のものであるか否か、フッ素系のもので
あるか否かを問わず、材料・製造方法に由来するイオン
交換膜の種類、形式などに関係なく任意に選択すること
ができる。本発明において、電気透析装置は電極間に陰
イオン交換膜と陽イオン交換膜とを交互に配列して濃縮
室と脱塩室とを形成することによって構成されるものが
好ましい。

【００３８】なお、電気透析時の各種液の温度は、通
常、20〜45℃、好ましくは35〜40℃の範囲である。電気
透析を行うと、イオン性物質と非イオン性物質を分離す
ると同時に乳酸を濃縮することが可能である。この工程
により、発酵液中のアルコール、残糖、タンパク質等を
分離し、乳酸濃度を濃縮することができる。例えば、電
気透析処理により５〜10％の乳酸を25〜30％に濃縮でき
る。

【００３９】電気透析で除去できなかったアミノ酸、無
機イオン（K,Ca,Mg等）、有機酸（クエン酸、リンゴ酸
等）は、クロマト分離装置、イオン交換装置により除去
することができる。クロマト分離装置としては、例えば
固定層式、移動層式、類似的移動層式等が挙げられる。

【００４０】最後に、溶液中の水分を蒸発装置で蒸発さ
せ、50〜90％濃度の乳酸製品を製造することができる。
なお、発酵液の精製・濃縮は、上記の方法に限定される
ものではなく、蒸留法によっても行うことができる。

【００４１】

【実施例】以下、実施例により本発明をさらに具体的に
説明する。但し、本発明はこれら実施例にその技術的範
囲が限定されるものではない。〔実施例1〕組換えベクターの構築及び形質転換１．組換えベクターの構築 (1) 乳酸遺伝子のクローニング B. longum 由来LDHのN末端アミノ酸配列から32mer(5'-A
CIGCICCIG CICCIATIACIGCIAGTTTI GT-3'（配列番号
１）)のオリゴヌクレオチドを作製した。B. longum aM1
01-2株の染色体DNAの4.2kb HindIII断片から上記オリゴ
ヌクレオチドを用いてコロニーハイブリダイゼーション
を行いLDH遺伝子の部分断片を得、pUC19にクローン化し
た。全長断片を取得するため、pUBL1の0.3kbのHindIII-
SacI断片にハイブリダイズする0.9kbのSalI-SacI断片を
pUC118にクローン化した。これらクローンをHindIIIで
処理した後連結を行い、Gene Cleanキット（Bio 101）
により全長LDH遺伝子（Gene, 85(1989) 161-168）を取
得した。

【００４２】(2) 各遺伝子のプラスミドへの連結得られたLDH遺伝子とpKK223-3由来のtacプロモーターを
pUC118に連結した。このプラスミドからEcoRI、XhoIサ
イトでLDH遺伝子を切り出した後、GAPプロモーター、GA
Pターミネーターを含んでいる酵母発現用ベクターpCHI
のEcoRI、SalIサイトに連結した。連結にはTakaraの「l
igation kit ver. 2」を用い16℃で3時間反応させた。
反応後コンピーテントセルである大腸菌DH5αに形質転
換を行い、LB/アンピシリンプレートに撒き、37℃で一
晩培養を行い、形質転換株を得た。得られたクローンか
らアルカリSDS法によりプラスミドの精製、抽出を行
い、酵母発現用LDHベクターであるpYDL1を取得した（図
１）。

【００４３】なお、本発明の組換えベクターpYLD1は大
腸菌に導入され（名称：「E. coli pYLD1」）、工業技
術院生命工学工業技術研究所（茨城県つくば市東１丁目
１番３号）に、FERM P-17621として寄託されている（寄
託日：平成11年10月26日）。

【００４４】２．組換えベクターの宿主への導入宿主である酵母Saccharomyces cerevisiae YPH500株をY
PD培地にて30℃で対数増殖期（O.D. 1.0以下）まで培養
を行い、集菌（3000rpm, 2分）及びTEバッファー(10mM
Tris, 1mM EDTA, pH7.5)による洗浄を行った後、0.5Mの
酢酸リチウム液に懸濁した。上記菌体100μlにpYDL1約1
μgとキャリアーDNA（サケ精子DNA）を1μg添加した。
これに800μlのTLP(40% PEG、0.1M酢酸リチウム、10mM
Tris、1mMEDTA)を加え、室温に40分静置した後、42℃で
10分間熱ショックを与えた。その後菌体を遠心分離し
（1200rpm）TEバッファーで洗浄を行い、200μlのTEに
懸濁した後選択培地で30℃で2日間培養を行い、形質転
換株（YPLD1）を取得した。

【００４５】〔実施例2〕乳酸発酵乳酸発酵の原料であるさつまいも（100ｇ）を洗浄及び
破砕した後、液化・糖化槽に入れ、ターマミル（ノバ
社）1％と水100gを加えて95℃で2時間処理した。続いて
スミチーム（新日本化学社）0.53を添加し、約12時間反
応させ、原料の液化及び糖化を行った。

【００４６】上記のようにして得られた原液を遠心分離
（10,000rpm）にかけ、固形分（リグニン等）を分離し
た。これを発酵原液とし、実施例1で得られた乳酸生成
菌YPLD1を用いて以下の発酵に使用した。培地は、通常
は糖類２％、ペプトン２％、酵母エキス１％をそれぞれ
含むYPD培地を用いた。培地に上記発酵原液10％を加
え、発酵を行った。発酵は、温度30℃、菌体密度2％
（湿重量ベース）、基質濃度5％（バッチ発酵の初期濃
度）、発酵時間20〜24時間で行った。その結果、2％の
乳酸が得られた。

【００４７】この発酵液を遠心分離装置又はフィルター
にかけて菌体と液分とを分離し、乳酸の液分の採取（精
製・濃縮）を行った。液分の精製・濃縮は、旭化成社の
マイクローグMF(PSP-103)装置を用いた。電気透析後、
除去できなかったアミノ酸、無機イオン（K,Ca,Mg
等）、有機酸（クエン酸、リンゴ酸等）を、クロマトグ
ラフィー（擬似移動層クロマト装置トレソーーネ（オル
ガノ社））にかけて除去した。

【００４８】蒸発缶（実験室用エバポレーター）により
水分を蒸発させ、90％の乳酸水溶液を得た。比較対照と
して、耐酸性ではない酵母菌（YPH-500）を用いて、上
記と同様の乳酸発酵を行った。その結果、乳酸生成量は
０％であった。

【００４９】

【発明の効果】本発明により、乳酸生成遺伝子が組み込
まれた組換えベクター、及び該ベクターを含む耐酸性乳
酸生成微生物が提供される。本発明の微生物を用いて乳
酸発酵を行うと、アンモニア等のアルカリ（中和剤）を
添加・回収する工程がないため操作が簡便であり、生産
性が上昇し、さらに、高価なバイポーラ膜を使用する必
要がないためコスト低減を図ることができる。従って、
本発明の微生物は高生産性乳酸発酵用として有用であ
る。

【００５０】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Toyota Motor Corporation <120> Acid-resisting and lactic acid-producing microorganisms <130> P99-0593 <140> <141> <160> 1 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <220> <221> modified base <222> 3 <223> i <220> <221> modified base <222> 6 <223> i <220> <221> modified base <222> 9 <223> i <220> <221> modified base <222> 12 <223> i <220> <221> modified base <222> 15 <223> i <220> <221> modified base <222> 18 <223> i <220> <221> modified base <222> 21 <223> i <220> <221> modified base <222> 24 <223> i <220> <221> modified base <222> 30 <223> i <400> acngcnccng cnccnatnac ngcnagtttn gt 32

【００５１】

【配列表フリーテキスト】配列番号１：合成DNA

【図面の簡単な説明】

【図１】プラスミドpYLD1の構築図である。

─────────────────────────────────────────────────────

【手続補正書】

【書類名】受託番号変更届

【提出日】平成１３年１月１９日

【旧寄託機関の名称】経済産業省産業技術総合研究所
生命工学工業技術研究所

【旧受託番号】ＦＥＲＭＰ−１７６２１

【新寄託機関の名称】経済産業省産業技術総合研究所
生命工学工業技術研究所

【新受託番号】ＦＥＲＭＢＰ−７４２３

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考） (Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＡＣ１２Ｒ 1:865）Ｃ１２Ｒ 1:865）Ｆターム(参考） 4B024 AA03 AA05 AA20 BA80 CA03 CA04 CA05 CA12 DA06 DA12 EA04 FA02 FA07 GA11 GA19 4B064 AD33 CA06 CA19 CC07 CC24 CE06 CE10 DA01 DA10 DA11 4B065 AA21Y AA26X AA80X AB01 AC05 BA02 BB21 BB26 BD15 CA10 CA42 CA44 CA47 CA50

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ビフィドバクテリウム属又はラクトバシ
ルス属に属する微生物由来の乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝
子及びプロモーターが組み込まれた組換えベクター。
【請求項２】ビフィドバクテリウム属に属する微生物
がビフィドバクテリウム・ロンガムである請求項1記載
の組換えベクター。
【請求項３】プロモーターがグリセルアルデヒド3リ
ン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーターである請求
項1又は２記載の組換えベクター。
【請求項４】下記の制限酵素地図を有し、かつ7480bp
の長さを有する組換えベクター。【化１】
【請求項５】請求項1〜４のいずれか1項に記載の組換
えベクターを含む耐酸性乳酸生成微生物。
【請求項６】 pH6以下の条件下で乳酸発酵することが
できる請求項５記載の耐酸性乳酸生成微生物。
【請求項７】微生物が酵母菌又はカビである請求項５
又は６記載の耐酸性乳酸生成微生物。