KR101873327B1 - 애기 장대에서 유래한 신규 호밍 엔도뉴클레아제 - Google Patents

Abstract

본 발명은 애기 장대에서 단리된 신규한 호밍 엔도뉴클레아제에 관한 것으로, RNA 및 DNA를 기질로 하는 이원기능적(bi-functional) 특성을 보유하며, (c) 3' 및 5' 돌출부(overhang)에 대한 구조-특이적 활성을 보유하는 GIY-YIG 호밍 엔도뉴클레아제를 제공한다.

Description

애기 장대에서 유래한 신규 호밍 엔도뉴클레아제{NOVEL HOMING ENDONUCLEASE FROM ARABIDOPSIS THALIANA}

본 발명은 애기 장대에서 단리된 신규 GIY-YIG 호밍 엔도뉴클레아제에 관한 것이다.

최근 폭넓은 생물학적 과정에 관여하는 조절성 RNA 의 중요한 신규한 부류로서 마이크로RNA(miR, miRNA)가 대두되었다. 소형 비(非)암호화 RNA 분자는 RNA 분해 촉진, mRNA 번역 저해, 및 유전자 전사를 조절하여 단백질 발현 패턴에 영향을 미친다.

마이크로 RNA(miRNA)는 단일가닥의 짧은(21 내지 22 뉴클레오티드) 비-코딩 RNA 분자이다. miRNA는 전사 후(post-translational) 유전자 조절에서 중요한 역할을 한다. miRNA는 상보적인 염기쌍을 형성(base pairing)하고 메신저 RNA(mRNA) 분해 또는 번역 억제(translational repression)를 유도한다.

인간의 게놈에서 2500개 이상의 miRNA가 동정된 바 있다(miRBase, reported articles). 대다수의 miRNA는 하나 이상의 mRNA를 동시에 표적 할 수 있다. 또한, 상이한 miRNA가 동일한 mRNA를 표적 할 수 있으며 상승적 효과를 유도할 수 있다. miRNA는 분화, 증식, 세포자살, 대사 항상성, 종양형성 및 DNA 메틸화와 같은 다양한 세포 과정에서 중요한 역할을 한다(Li H, et al., Hypertension 2003;42(5):895-900). 따라서, miRNA 발현의 진단 및 분석은 생리학적, 병리학적 상태에 대한 중요한 정보를 제공할 수 있으며, 유전적 질환 또는 전염병을 진단하여 치료법을 개발하는데 사용될 수 있다.

특정 시료에 함유된 상보적인 핵산을 검출하는 방법으로서 표지된 프로브 및 핵산을 혼성화(hybridization) 시키는 방법이 사용된다.

노던 및 서던 블랏은 상기 원리를 이용한 가장 널리 사용되는 핵산 검출 방법이며, 형광 인 시츄 혼성화(fluorescence in situ hybridization; FISH), 중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction; PCR) 및 마이크로어레이 등의 분석 방법도 왓슨-크릭 염기쌍 형성을 통한 서열 특이적 반응에 근거한 것이다.

그러나, 서열 특이적 반응에 기반한 핵산 검출 방법은 비-특이적 혼성화에 의해 위양성(false positive)이 야기될 수 있으며, 위양성 여부를 판단하기 위해 노던 또는 서던 블랏(Southern & Northern blot)과 같은 장시간의 추가적인 절차가 요구되었다.

핵산, 특히 게놈성 DNA는 시료 속에서 점도에 영향을 미치거나 정제, 하부 분석(downstream analysis) 또는 적용을 방해하므로 세포 배양물, 세포 용해물(cell lysates), 단백질 정제 및 분석에서 장애 요인이 될 수 있다.

따라서, 핵산은 물리적, 화학적, 또는 효소적으로 제거될 수 있으며, 효소적 제거는 핵산가수분해효소를 이용하여 수행될 수 있다. 상기 세포 용해물들, 단백질 정제 및 분석 단계 이전에 핵산들을 효소적으로 제거하기 위해 벤조나제, 옴니클레이브(Omnicleave) 또는 DNase I 등이 사용되고 있다.

예컨대, PCR과 같은 핵산 증폭 기술은 생물공학적으로 강력한 도구로서, 소량의 핵산만을 함유하는 시료에서 표적 서열에 대한 다수의 카피를 제조할 수 있다.

PCR 반응은 이중 가닥인 표적 서열의 단일 가닥과 상보적인 프라이머를 표적 서열 및 유리된 뉴클레오티드를 함유하는 반응 혼합물에 첨가하여 수행된다. 이 때, PCR 반응 혼합물에 표적 서열 내부를 절단시키는 엔도뉴클레아제를 처리하여 위양성을 유발하는 DNA의 증폭을 방지할 수 있다.

그러나, 엔도뉴클레아제의 종류는 다양하며, 각 엔도뉴클라아제의 작용 활성 또는 작용 부위가 서로 상이할 수 있다.

예컨대, 엔도뉴클레아제 I은 RNA 및 DNA를 서열-의존적으로 절단하는 약 25 kDa의 주변세포질 또는 세포외, 단량체성 효소이다. 상기 효소는 다양한 프로테오박테리아 및 피브로박터(Fibrobacter)에서 발견된다. 상기 효소의 구조는 9개의 베타 가닥, 5개의 짧은 나선 및 5개의 긴 나선을 함유하는 혼합된 알파/베타 위상(topology)을 갖는다. 상기 효소는 플라스미드들과 ssDNA를 절단할 수 있으며, 포스포디에스테르 결합의 3' 말단을 절단할 수 있다.

한편, GIY-YIG 호밍 엔도뉴클레아제는 Y-형 접합 구조의 DNA의 단일가닥 5'-플랩 및 헤어핀 DNA의 루프 구조를 절단할 수 있으나, RNA에 대한 절단 활성을 나타내지 않는다. 따라서, 상기 GIY-YIG 호밍 엔도뉴클레아제는 구조-특이적 활성에도 불구하고 miRNA 검출 시 위양성을 유발할 수 있는 표적-유사 miRNA를 제거할 수 없으며 miRNA를 대상으로 하는 진단 및 분석 방법에 활용될 수 없다.

본 발명자들은 오랜 연구 끝에 DNA 및 RNA를 기질로 하는 이원기능적 특성을 보유한 신규 효소를 발굴하고 이를 산업적으로 활용하고자 하였다.

본 발명은 전술한 종래기술의 문제점을 해결하기 위하여 위한 것으로, 본 발명의 목적은 DNA 및 RNA 양자를 기질로 하는 이원기능적(bi-functional) 특성을 보유하며, 구조-특이적 활성으로 인해 miRNA 검출 시 유용하게 활용될 수 있는 신규 효소를 제공하는 것이다.

본 발명의 일 측면에 따르면 (a) GIY-YIG 도메인을 포함하고, (b) RNA 및 DNA를 기질로 하는 이원기능적(bi-functional) 특성을 보유하며, (c) 3' 및 5' 돌출부(overhang)에 대한 구조-특이적 활성을 보유하는 단리된 호밍 엔도뉴클레아제(HIGLE)가 제공된다.

일 실시예에 있어서, 상기 호밍 엔도뉴클레아제는 애기 장대(Arabidopsis thaliana)에서 단리될 수 있다.

일 실시예에 있어서, 상기 호밍 엔도뉴클레아제는 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성될 수 있다.

본 발명의 다른 측면에 따르면, 상기 호밍 엔도뉴클레아제를 포함하는 핵산 또는 유전자 검출용 조성물이 제공된다.

본 발명의 다른 측면에 따르면, 상기 호밍 엔도뉴클레아제를 암호화 하는 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터가 제공된다.

본 발명의 다른 측면에 따르면, 상기 호밍 엔도뉴클레아제를 암호화하는 외인성의 핵산 서열을 과발현하는 재조합 숙주 세포가 제공된다.

본 발명의 다른 측면에 따르면, 상기 발현 벡터에 의해 형질 전환된 재조합 숙주 세포가 제공된다.

일 실시예에 있어서, 상기 숙주 세포는 미생물, 동물세포, 식물세포, 동물에서 유래한 배양세포, 또는 식물에서 유래한 배양세포일 수 있다.

본 발명의 다른 측면에 따르면, 상기 호밍 엔도뉴클레아제를 처리하는 단계를 포함하는 핵산의 절단 방법이 제공된다.

일 실시예에 있어서, 상기 핵산은 3' 및 5' 돌출부(overhang)를 포함하는 이중 가닥의 핵산일 수 있다.

일 실시예에 있어서, 상기 이중 가닥은 상기 3' 및 5' 돌출부(overhang) 외 영역에서 염기 서열간의 비정교합(non-complementary base-pair)에 의해 벌지(bulge) 구조를 형성할 수 있다.

본 발명의 일 측면에 따른 호밍 엔도뉴클레아제는 DNA 및 RNA에 대한 이원기능적 특성을 보유하며 단일 가닥의 3' 및 5' 돌출부(overhang)를 절단하므로 핵산 검출시 위양성을 효과적으로 제거할 수 있다.

본 발명의 효과는 상기한 효과로 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 상세한 설명 또는 특허청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

도 1은 HIGLE, HYL1 및 SE 간 상호 작용을 나타낸 것이다. (A) 재조합 단백질 및 결실 변이체를 도식화한 것이다. (B) In vitro에서 pull down assay를 수행한 결과이다. (C) GST-융합된 SE의 N-말단, 중간 도메인, C-말단 도메인을 MBP-HIGLE-HA 및 결실 변이체의 미끼(bait)로 사용하였다. (D) HIGLE, HYL1 및 SE 간 공-면역침전 분석을 수행한 결과이다. (E) 묘목의 핵 내에서 HIGLE-YFP 및 HYL1-CFP을 동시-발현(Co-expression)한 결과이다. (F) HYL1-CFP 및 HIGLE-YFP을 공여체 및 수용체 쌍(donor-acceptor pair)으로 사용하여 FRET 분석을 수행한 결과이다.
도 2는 상이하게 표지된 HIGLE, HYL1 및 SE가 핵 내에서 부분적으로 중첩하는 것을 나타낸다. (A) 묘목의 핵 내에서 HIGLE-YFP 및 HYL1-CFP을 동시-발현(Co-expression)한 결과이다. (B) HYL1-CFP 및 HIGLE-YFP을 공여체 및 수용체 쌍(donor-acceptor pair)으로 사용하여 FRET 분석을 수행한 결과이다. (C) HIGLE-RFP 및 HYL1-YFP은 담배의 핵 내에서 공동-국재화(co-localization) 하였다. (D) 담배 핵 내의 스펙클(speckle) 위에 SERRATE-CFP, HYL1-YFP 및 HIGLE-RFP의 상이한 방출 이미지를 중첩한 것이다.
도 3은 재조합 HIGLE의 이원기능적 특성을 나타낸 것이다. (A) HIGLE의 구조-특이적(structure-specific) DNA 가수분해효소 활성을 나타낸 것이다. (B) HIGLE의 구조-특이적(structure-specific) RNA 가수분해효소 활성을 나타낸 것이다. (C) HIGLE이 단일 가닥 RNA에 대한 절단 활성을 보유하지 않음을 나타낸 것이다. (D) RNA 가수분해효소 활성을 가지는 HIGLE의 도메인을 동정한 것이다.
도 4은 pre-miR172a를 기질로 하여 겔 시프트법을 수행한 것이다. (A) 전체-길이의 HIGLE, 도메인 결실 조각 및 HYL1을 첨가한 것이다. (B) HYL1(5 × 10^-9M to 1.3 × 10^-7M)의 pre-miR172a에 대한 해리 상수를 나타낸 것이다. (C) HIGLE(3 × 10^-8M to 3.5 × 10^-7M)의 pre-miR172a에 대한 해리 상수를 나타낸 것이다 (D) R53A/E103A(9 × 10^-8M to 1.5 × 10^-6M)의 pre-miR172a에 대한 해리 상수를 나타낸 것이다.
도 5는 HIGLE이 합성된 pri-miR172a를 pre-miRNA-형 중간체 조각으로 절단하였음을 나타낸 것이다. (A) 합성된 pri-miR172a를 도식화한 것이다. (B) 구조화된 합성 pri-miR172a를 도식화한 것이다. (C) EtBr 스테이닝을 통해 프로세싱된 조각을 분석한 것이다. (D) P3(miR172)를 이용한 RNA 블랏 분석을 통해 miRNA를 포함하는 pre-miRNA-형 중간체를 확인한 것이다. (E) P1(5'-플랩) 프로브를 이용하여 5'-단일 가닥 영역을 확인한 것이다. (F) P4(3'-플랩) 프로브를 이용하여 3'-단일 가닥 영역을 확인한 것이다. (G) 루프 구조에 대응하는 P2 프로브를 이용하여 pre-miRNA-형 중간체의 ~100nt 영역을 확인한 것이다.
도 6은 HIGLE-매개의 pri-miR172 프로세싱에 있어서 HYL1 및 SE의 가이딩 효과를 분석한 것이다. (A) SE 또는 HYL1에 의해 pre-miR172a-형 중간체의 축적이 증가되었음을 확인한 것이다. (B) P1 프로브를 이용하여 5'-단일 가닥 영역을 확인한 것이다. (C) P4 프로브를 이용하여 3'-단일 가닥 영역을 확인한 것이다. (D) P2 프로브를 이용하여 pre-miRNA-형 중간체의 루프 구조를 확인한 것이다.
도 7은 HIGLE이 합성된 pri-miR164a 를 pre-miR164-형 중간체 조각으로 절단하였음을 나타낸 것이다. (A) 프로세싱 분석에서 사용된 합성 pri-miR164a를 도식화한 것이다. (B) 구조화된 합성 pri-miR164a를 도식화한 것이다. (C) EtBr 스테이닝을 통해 프로세싱된 조각을 분석한 것이다. (D) P3(miR164)를 이용한 RNA 블랏 분석을 통해 miRNA를 포함하는 pre-miR164-형 중간체(~100nt)를 확인한 것이다. (E) P1 및 P2 프로브를 이용하여 5'-단일 가닥 영역을 확인한 것이다. (F) P4 프로브를 이용하여 3'-단일 가닥 영역을 확인한 것이다. (G) SE 또는 HYL1에 의해 pre- miR164a-형 중간체의 축적이 증가되었음을 확인한 것이다. (H) P1 및 P2 프로브를 이용하여 5'-단일 가닥 영역을 확인한 것이다. (I) P4 프로브를 이용하여 3'-단일 가닥 영역을 확인한 것이다.
도 8은 pre-miR160a 및 pre-miR164b 을 통해 HIGLE의 절단 활성을 분석한 것이다. (A) pre-miR160a 기질을 도식화 한 것이다. (B) HIGLE이 pre-miR160a 기질을 2개의 조각으로 절단한 것을 확인한 것이다. (C) pre-miR164b 기질을 도식화 한 것이다. (D) HIGLE이 pre-miR164b 기질을 4개의 조각으로 절단한 것을 확인한 것이다.

이하에서는 첨부한 도면을 참조하여 본 발명을 설명하기로 한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며, 따라서 여기에서 설명하는 실시예로 한정되는 것은 아니다. 그리고 도면에서 본 발명을 명확하게 설명하기 위해서 설명과 관계없는 부분은 생략하였으며, 명세서 전체를 통하여 유사한 부분에 대해서는 유사한 도면 부호를 붙였다.

어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 구비할 수 있다는 것을 의미한다.

달리 정의되지 않는 한, 분자 생물학, 미생물학, 단백질 정제, 단백질 공학, 및 DNA 서열 분석 및 당업자의 능력 범위 안에서 재조합 DNA 분야에서 흔히 사용되는 통상적인 기술에 의해 수행될 수 있다. 상기 기술들은 당업자에게 알려져 있고, 많은 표준화된 교재 및 참고저서에 기술되어 있다.

본 명세서에 달리 정의되어 있지 않으면, 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 당업계에 통상의 기술자가 통상적으로 이해하는 바와 같은 의미를 가진다.

본 명세서에 포함되는 용어를 포함하는 다양한 과학적 사전이 잘 알려져 있고, 당업계에서 이용가능하다. 본 명세서에 설명된 것과 유사 또는 등가인 임의의 방법 및 물질이 본원의 실행 또는 시험에 사용되는 것으로 발견되나, 몇몇 방법 및 물질이 설명되어 있다. 당업자가 사용하는 맥락에 따라, 다양하게 사용될 수 있기 때문에, 특정 방법학, 프로토콜 및 시약으로 본 발명이 제한되는 것은 아니다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 단수형은 문맥이 명확하게 달리 지시하지 않으면 복수의 대상을 포함한다. 또한, 달리 지시된 바가 없으면, 핵산은 각각 왼쪽에서 오른쪽, 5'에서 3' 방향으로 씌여지고, 아미노산 서열은 왼쪽에서 오른쪽, 아미노에서 카르복실 방향으로 씌여진다.

이하 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

본 발명의 일 측면에 따르면 (a) GIY-YIG 도메인을 포함하고, (b) RNA 및 DNA를 기질로 하는 이원기능적(bi-functional) 특성을 보유하며, (c) 3' 및 5' 돌출부(overhang)에 대한 구조-특이적 활성을 보유하는 단리된 호밍 엔도뉴클레아제(HIGLE)가 제공된다.

일 실시예에 있어서, 상기 호밍 엔도뉴클레아제는 애기 장대(Arabidopsis thaliana)에서 단리될 수 있다.

상기 “엔도뉴클레아제”는 핵산 골격 내 포스포디에스테르 결합을 가수분해하는 효소를 의미하며, 본 발명은 애기 장대에서 단리된 신규 호밍 엔도뉴클레아제를 제공한다.

본 발명자들은 miRNA의 생물발생에 관여하는 신규의 단백질의 발견하였으며, 상기 단백질은 HIGLE(HYL1 INTERACTING GIY-YIG LIKE ENDONUCLEASE)로 명명되었다. 일반적으로 식물에서 마이크로프로세서는 DCL1(Dicer-like protein 1), HYL1(HYPONASTIC LEAF 1), 및 SE(SERRATE)로 구성될 수 있다. 상기 마이크로프로세서는 miRNA의 성숙 과정에서 적어도 7개의 단백질과 상호 작용할 수 있다.

상기 호밍 엔도뉴클레아제(HIGLE)는 일부 호밍 엔도뉴클레아제에서 공통적으로 발견되는 GIY-YIG 도메인을 포함할 수 있다. 상기 호밍 엔도뉴클레아제(HIGLE)는 sRNA의 대사작용에 관여하는 RNase type III family와 관계가 없음에도 불구하고, 5' 및 3' 돌출부(overhang)를 제거하여 pri-miRNA를 pre-miRNA-형 중간체로 프로세싱할 수 있다.

상기 "호밍 엔도뉴클레아제"는 생물학적 기능상 특정 유전자의 엔도뉴클레아제-코딩 대립유전자를 유전자의 엔도뉴클레아제-결핍 대립유전자에 전파하는 유전자 변환 현상을 촉매하는 엔도뉴클레아제의 일종이다.

예컨대, 상기 호밍 엔도뉴클레아제는 i) LAGLIDADG 호밍 엔도뉴클레아제, ii) HNH 호밍 엔도뉴클레아제, iii) His-Cys box 호밍 엔도뉴클레아제, iv) GIY-YIG 호밍 엔도뉴클레아제, v) 시아노박테리아 호밍 엔도뉴클레아제를 비롯하여 5종 이상의 유형들이 공지된 바 있다.

상기 단리된 호밍 엔도뉴클레아제(HIGLE)는 GIY-YIG 도메인을 포함할 수 있으며, RNA 및 DNA를 기질로 하는 이원기능적(bi-functional) 특성을 보유할 수 있다.

상기 GIY-YIG 도메인은 90 내지 100개의 아미노산 서열을 포함하는 α/β 구조로서, -GIY- 서열에서 -YIG- 서열에 이르는 공간은 약 10 내지 11개의 아미노산으로서 3 요소 역평행 β-병풍구조(three-stranded antiparallel β-sheet)를 형성할 수 있다. 가수분해효소 핵산의 활성에 중요한 잔기는 GIY-YIG 모티프 내의 글리신(glycine), -GIY- 서열 하류의 약 8 내지 10개의 아르기닌 잔기, I-TevI의 75번째에 위치하는 글루탐산과 같은 금속 결합 글루탐산 잔기 및 상기 금속 결합 글루탐산 잔기 상류에 보존된 아스파라진 잔기를 포함할 수 있다.

본 발명자들은 블라스트 분석을 통해, 상기 단리된 호밍 엔도뉴클레아제(HIGLE)의 GIY-YIG 도메인이 고도로 다양화된 GIY-YIG 엔도뉴클레아제 패밀리 내의 SLX1-클러스터에 속하였음을 확인하였다.

일반적으로, 상기 GIY-YIG 호밍 엔도뉴클레아제는 Y-형 접합 구조 DNA의 단일가닥 5'-플랩 및 헤어핀 DNA의 루프 구조를 절단할 수 있으나, 상기 단리된 엔도뉴클레아제(HIGLE)는 핵산의 3' 및 5' 돌출부(overhang)에 대한 구조-특이적 절단 활성을 보유하며, DNA 및 RNA 양자를 기질로 하는 이원기능적(bi-functional) 특성을 보유할 수 있다.

상기 호밍 엔도뉴클레아제(HIGLE)는 통상의 GIY-YIG 호밍 엔도뉴클레아제와 달리 RNA에 대한 절단 활성뿐만 아니라 서열-비특이적 활성을 보유하므로, 최근 질병 진단의 중요한 요소로서 각광 받고 있는 MicroRNA(miRNA) 검출시 유용하게 활용될 수 있다.

구체적으로, 상기 miRNA 검출시 사용되는 혼성화(hybridization) 방법은 핵산 서열 간의 상보성이 완전하게 일치할(perfect match) 때 양성으로 판단할 것이나, 일부 미스매치(mismatch) 염기에도 불구하고 비특이적 혼성화가 야기될 수 있으며, 이로 인해 위양성(false positive)이 유발될 수 있다.

이 때, 상보적이지 않은 일부 염기쌍은 상호간 혼성화되지 못하므로, 비특이적으로 혼성화된 이합체의 일부 영역에서 벌지 구조(bulge loop)가 형성될 수 있다.

상기 호밍 엔도뉴클레아제(HIGLE)는 서열-비특이적이고 구조-특이적 활성을 보유하므로, 서열과 무관하게 상기 3' 및 5' 돌출부를 포함하는 벌지 구조를 절단할 수 있다. 비특이적으로 혼성화된 이합체는 상기 호밍 엔도뉴클레아제(HIGLE)의 활성에 의해 절단되므로, miRNA 검출 시 미스매치(mismatch)로 인해 야기될 수 있는 위양성이 배제될 수 있다.

일 실시예에 있어서, 상기 호밍 엔도뉴클레아제는 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성될 수 있다.

또한, 상기 호밍 엔도뉴클레아제는 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 단백질의 기능적 동등물을 포함할 수 있다.

상기 “기능적 동등물"은 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 1 의 아미노산 서열과 적어도 40% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 것으로, 서열번호 1의 아미노산 서열과 실질적으로 동질의 생리활성을 가지는 단백질을 의미한다. 상기 "실질적으로 동질의 생리활성"은 상기 엔도뉴클레아제의 구조적, 기능적 상동성으로 인한 구조-특이적 절단 활성을 의미한다. 상기 "서열 상동성”은 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 대비하여 결정되며, 비교 영역에서의 일부 핵산 서열이 추가 또는 삭제될 수 있다.

본 발명의 다른 측면에 따르면, 상기 호밍 엔도뉴클레아제를 암호화 하는 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터가 제공된다.

상기 벡터는 연결되어 있는 핵산 단편을 운반하는 데 이용되는 핵산 분자를 의미한다. 상기 벡터는 박테리아, 플라스미드, 파지, 코스미드, 에피솜, 바이러스 및 삽입 가능한 DNA 단편(즉, 상동재조합에 의해 숙주 세포 게놈 안으로 삽입 가능한 단편)이 사용될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 상기 플라스미드는 벡터의 일종으로서 내부에 추가적으로 DNA 단편을 연결시킬 수 있는 환형의 이중 가닥 DNA 루프를 의미한다. 또한, 바이러스 벡터는 추가적인 DNA를 바이러스 게놈 내에 연결시킬 수 있다.

상기 발현 벡터는 작동 가능하도록 연결된 목적 단백질을 암호화하는 유전자의 발현을 지시할 수 있는 벡터를 의미한다. 일반적으로, 재조합 DNA 기술의 사용에서 발현 벡터는 플라스미드 형태이므로, 용어 플라스미드 및 벡터가 상호 교환적으로 사용될 수 있다. 그러나, 바이러스 벡터와 같이 동일한 기능을 수행하는 다른 형태의 발현 벡터들도 포함할 수 있다.

예컨대, 상기 발현 벡터는 pET-3a-d, pET-9a-d, pET-11a-d, pET-12a-c, pET-14b, pET-15b, pET-16b, pET-17b, pET-17xb, pET-19b, pET-20b(+), pET-21a-d(+), pET-22b(+), pET-23a-d(+), pET-24a-d(+), pET-25b(+), pET-26b(+), pET-27b(+), pET-28a-c(+), pET-29a-c(+), pET-30a-c(+), pET-30 Ek/LIC, pET-30 Xa/LIC, pET-31b(+), pET-32a-c(+), pET-32 Ek/LIC, pET-32 Xa/LIC, pET-33b(+), pET-34b(+), pET-35b(+), pET-36b(+), pET-37b(+), pET-38b(+), pET-39b(+), pET-40b(+), pET-41a-c(+), pET-41 Ek/LIC, pET-42a-c(+), pET-43.1a-c(+), pET-43.1 Ek/LIC, pET-44a-c(+), pRSETA, pRSETB, pRSETC, pESC-HIS, pESC-LEU, pESC-TRP, pESC-URA, Gateway pYES-DEST52, pAO815, pGAPZ A, pGAPZ B, pGAPZ C, pGAPα A, pGAPα B, pGAPα C, pPIC3.5K, pPIC6 A, pPIC6 B, pPIC6 C, pPIC6α A, pPIC6α B, pPIC6α C, pPIC9K, pYC2/CT, pYD1 Yeast Display Vector, pYES2, pYES2/CT, pYES2/NT A, pYES2/NT B, pYES2/NT C, pYES2/CT, pYES2.1, pYES-DEST52, pTEF1/Zeo, pFLD1, PichiaPink^TM , p427-TEF, p417-CYC, pGAL-MF, p427-TEF, p417-CYC, PTEF-MF, pBY011, pSGP47, pSGP46, pSGP36, pSGP40, ZM552, pAG303GAL-ccdB, pAG414GAL-ccdB, pAS404, pBridge, pGAD-GH, pGAD T7, pGBK T7, pHIS-2, pOBD2, pRS408, pRS410, pRS418, pRS420, pRS428, yeast micron A form, pRS403, pRS404, pRS405, pRS406, pYJ403, pYJ404, pYJ405 또는 pYJ406일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

한편, 상기 발현 벡터는 숙주 세포 내로 도입되고, 상기 도입된 벡터에 의해 형질 전환된 숙주 세포는 상기 호밍 엔도뉴클레아제를 생산할 수 있다. 이 때, 상기 벡터는 숙주 생물체에 의해 인지되는 프로모터를 포함할 수 있다.

상기 프로모터는 SBE4, 3TP, PAI-1, p15, p21, CAGA12, hINS, A3, NFAT, NFKB, AP1, IFNG, IL4, IL17A, IL10, GPD, TEF, ADH, CYC, INU1, PGK1, PHO5, TRP1, GAL1, GAL10, GUT2, tac, T7, T5, nmt, fbp1, AOX1, AOX2, MOX1 및 FMD1 프로모터로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 숙주 세포 또는 발현 조건 등 다양한 변수를 고려하여 달리할 수 있다.

상기 호밍 엔도뉴클레아제를 암호화하는 핵산 서열은 상기 프로모터 서열과 작동 가능하게 연결될(operably linked) 수 있다. 상기 "작동 가능하게 연결된(operably linked)"은 하나의 핵산 단편이 다른 핵산 단편과 결합되어 그의 기능 또는 발현이 다른 핵산 단편에 의해 영향을 받는 것을 의미한다. 즉, 상기 호밍 엔도뉴클레아제를 암호화하는 유전자는 벡터 내에 있는 프로모터와 작동 가능하게 연결되어 발현이 조절될 수 있다.

한편, 상기 발현 벡터는 추가적인 조절 서열을 더 포함할 수 있다. 상기 조절 서열은 파지 MS-2의 레플리카아제 유전자의 샤인-달가노 서열 및 박테리오파지 람다의 cⅡ의 샤인-달가노 서열일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 상기 발현 벡터는 형질 전환된 숙주 세포를 선별하는데 필요한 적절한 마커 유전자를 포함할 수 있다. 상기 마커 유전자는 항생제 저항성 유전자 또는 형광 단백질 유전자일 수 있으며, 상기 항생제 저항성 유전자는 히그로마이신 저항성 유전자, 카나마이신 저항성 유전자, 클로람페니콜 저항성 유전자 및 테트라사이클린 저항성 유전자로 구성된 군에서 선택될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 형광 단백질 유전자는 효모-강화 녹색 형광 단백질(yeast-enhanced green fluorescent protein; yEGFP) 유전자, 녹색 형광 단백질(green fluorescent protein; GFP) 유전자, 청색 형광 단백질(blue fluorescent protein; BFP) 유전자, 및 적색 형광 단백질(red fluorescent protein; RFP) 유전자로 구성된 군에서 선택될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 다른 측면에 따르면, 상기 호밍 엔도뉴클레아제를 암호화하는 외인성의 핵산 서열을 과발현하는 재조합 숙주 세포가 제공된다.

상기 숙주 세포(host cell)는 형질 전환에 의해 대사 조작될 수 있다. 상기 숙주 세포는 발현 벡터에 의한 형질 전환이 용이한 세포를 지칭하는 것으로 유전 공학적 방법에 의해 형질 전환되어 특정의 유전자를 효율적으로 발현할 수 있으면 그 종류는 특별히 제한되지 않는다.

일 실시예에 있어서, 상기 숙주 세포는 미생물, 동물세포, 식물세포, 동물에서 유래한 배양세포, 또는 식물에서 유래한 배양세포일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 적합한 숙주 세포는 자연적으로 발생하거나 또는 야생형 숙주 세포일 수 있고, 또는 변화된 숙주 세포일 수 있다. 상기 야생형 숙주 세포(wide-type host cell)는 재조합 방법에 의해 유전적으로 변화되지 않은 숙주 세포일 수 있다.

상기 “대사 조작된(metabolically engineered)" 또는 "대사 조작(metabolic engineering)"은 미생물에서 알코올 또는 단백질과 같은 원하는 대사산물의 생산을 위하여, 생합성 유전자, 오페론과 연관된 유전자, 그리고 이들 핵산 서열의 제어 요소(control elements)의 합리적 경로 디자인과 어셈블리를 수반할 수 있다.

상기 "대사 조작된"은 유전자 조작과 적절한 배양 조건을 이용한 전사(transcription), 번역(translation), 단백질 안정성(protein stability)과 단백질 기능성(protein functionality)의 조절과 최적화에 의한 대사 흐름(metabolic flux)의 최적화를 더욱 포함할 수 있다. 생합성 유전자는 숙주에 외래성이거나, 돌연변이유발(mutagenesis), 재조합(recombination) 또는 내인성 숙주 세포에서 이종 발현 제어 서열과의 연관에 의해 변형됨으로써, 숙주(예컨대, 미생물)에 이종성일 수 있다. 적절한 배양 조건은 배양 배지 pH, 이온 강도, 영양 함량 등의 조건, 온도, 산소, 이산화탄소, 질소 함량, 습도, 및 상기 미생물의 물질대사 작용에 의한 화합물의 생산을 가능하게 하는 기타 배양 조건을 포함할 수 있다. 숙주 세포로서 기능할 수 있는 미생물에 적합한 배양 조건은 당해 기술 분야에 널리 알려져 있다.

따라서, 상기 "대사 조작된(engineered)" 또는 "변형된(modified)" 숙주 세포는 유전 물질을 선택된 숙주 또는 부모 미생물 내로 도입하여 세포 생리와 생화학을 변형하거나 변경함으로써 생산될 수 있다. 유전 물질의 도입을 통하여, 부모 미생물은 새로운 성질, 예를 들면, 새로운 세포 내 대사산물 또는 더욱 많은 양의 세포 내 대사산물을 생산하는 능력을 획득할 수 있다.

예컨대, 유전 물질의 부모 미생물 내로의 도입은 화학 물질을 생산하는 새롭거나 변형된 능력을 초래할 수 있다. 부모 미생물에 도입된 유전 물질은 화학 물질 생산을 위한 생합성 경로에 관여하는 하나 이상의 효소를 코딩하는 유전자 또는 유전자의 일부를 포함하고, 이들 유전자의 발현 또는 발현 조절을 위한 추가 구성요소, 예를 들면, 프로모터 서열을 포함할 수도 있다.

상기 "변화된 숙주 세포(altered host cell)"는 유전적으로 설계된 숙주 세포를 의미하며, 여기서 목적 단백질은 발현의 수준으로 생성되거나 발현의 수준보다 더 큰 수준으로 생성되거나 본질적으로 동일한 성장 조건 하에서 성장하는 미변화된 또는 야생형 숙주 세포 내에서의 목적 단백질의 발현의 수준보다 큰 발현의 수준으로 발현될 수 있다. "변형 숙주 세포(modified host cell)"은 목적 단백질을 암호화하는 유전자를 과발현하도록 유전적으로 설계되는 야생형 또는 변화된 숙주 세포를 의미한다. 상기 변형 숙주 세포는 야생형 또는 변화된 모 숙주 세포보다 더 높은 수준으로 목적 단백질을 발현할 수 있다.

한편, 상기 “형질 전환”은 상기 벡터를 미생물 내로 운반하는 방법을 의미하며, 형질 전환 하고자 하는 세포가 원핵세포인 경우에는, CaCl₂ 방법(Cohen, S.N. et al., Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9:2110- 2114(1973)), 하나한 방법(Cohen, S.N. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 9:2110-2114(1973); 및 Hanahan, D., J. Mol. Biol., 166:557-580(1983)) 및 전기 천공 방법(Dower, W.J. et al., Nucleic. Acids Res., 16:6127-6145(1988)) 등에 의해 실시될 수 있다.

형질 전환 하고자 하는 세포가 진핵세포인 경우에는, 미세 주입법(Capecchi, M.R., Cell, 22:479(1980)), 칼슘 포스페이트 침전법(Graham, F.L. et al., Virology, 52:456(1973)), 전기 천공법(Neumann, E. et al., EMBO J., 1:841(1982)), 리포좀-매개 형질감염법(Wong, T.K. et al., Gene, 10:87(1980)), DEAE-덱스트란 처리법(Gopal, Mol. Cell. Biol., 5:1188-1190(1985)), 및 유전자 밤바드먼트(Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 87:9568-9572(1990))등을 이용하여 실시할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

효모와 같은 진균의 형질 전환의 경우에는, 일반적으로 리튬 아세테이트(Lithium acetate, R.D. Gietz, Yeast 11, 355360(1995)) 및 열 충격(Keisuke Matsuura, Journal of Bioscience and Bioengineering, Vol. 100, 5;538-544(2005))을 이용한 형질 전환법과 전기천공법(Nina SkoluckaAsian, Pacific Journal of Tropical Biomedicine, 94-98(2011))에 의해 실시될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 다른 측면에 따르면, 상기 발현 벡터로 숙주 세포를 형질 전환하는 단계; 및 상기 숙주 세포를 배양하여 상기 호밍 엔도뉴클레아제를 발현시키는 단계;를 포함하는 호밍 엔도뉴클레아제의 제조 방법이 제공된다.

상기 형질 전환된 숙주 세포는 배치, 공급-배치 또는 연속 발효 조건 하에서 배양될 수 있으며, 상기 숙주 세포는 형질 전환에 의해 상기 융합 단백질을 발현할 수 있으므로 상기 배양된 숙주 세포로부터 상기 융합 단백질을 수득할 수 있다.

이 때, 고전적인 배치 발효 방법은 폐쇄적인 시스템을 사용할 수 있고, 상기 배양 매질은 발효가 실행되기 전에 제조되며, 상기 매질에 유기체를 접종하고, 상기 매질에 어떠한 성분의 첨가도 없이 발효가 일어날 수 있다. 특정한 경우에서, 성장 매질의 상기 탄소원 내용물이 아닌, 상기 pH 및 산소 함량은 배치 방법 동안 변화될 수 있다. 배치 시스템의 상기 대사물 및 세포 바이오매스는 끊임없이 발효가 정지될 때까지 변화할 수 있다. 배치 시스템에서, 세포는 정지된 지체 상에서 고도성장 로그 상에 걸쳐 진척하고, 성장율이 감소되거나 멈춘 최종적으로 정지 상에 이를 수 있다. 일반적인 기간에서, 로그 상의 상기 세포는 대부분의 단백질을 만들 수 있다.

표준 배치 시스템의 변형은 "공급-배치 발효" 시스템이다. 상기 시스템에서, 영양(예를 들면, 탄소원, 질소원, O2, 및 통상적으로, 다른 영양)은 이들의 배양물의 농도가 한계치 미만으로 떨어질 때 첨가될 수 있다. 공급-배치 시스템은 이화 생성물 억제가 세포의 대사를 억제하고, 매질이 매질 내에서 영양소를 제한된 양으로 갖는 것이 바람직할 때 유용할 수 있다, 공급-배치 시스템에서의 실제 영양 농도의 측정은 pH, 용존 산소 및 CO₂와 같은 폐기가스의 부분압과 같은 측정 가능한 인자의 변화에 기초하여 예측될 수 있다. 배치 및 공급-배치 발효는 일반적인 시스템으로서 당업계에 널리 알려져 있다.

계속적 발효는 정의된 배양 매질이 계속해서 생반응기(bioreactor)에 첨가되고, 조건화된 매질의 동일한 양이 과정 동안 동시에 제거되는 개방 시스템이다. 계속적 발효는 일반적으로 세포가 처음에는 로그 상 성장에 있는 일정한 고 밀도의 배양물을 유지할 수 있다. 계속적 발효는 세포 성장 또는 마지막 생성물 농도에 영향을 미치는 하나의 인자 또는 임의의 수의 인자의 조작이 가능할 수 있다.

예를 들어, 탄소원 또는 질소원과 같은 제한 영양소는 고정된 속도로, 모든 다른 파라미터는 적당하게 유지될 수 있다. 다른 시스템에서, 많은 성장에 영향을 주는 인자는 배지 탁도에 의해 측정되는 세포 농도가 일정하게 유지되는 동안, 계속해서 변화할 수 있다. 계속적 시스템은 일정한 상태의 성장 조건을 유지하려고 한다. 따라서, 매질이 빠져나가는 것에 의한 세포 손실은 발효에서의 세포 성장 속도에 대항하여 균형이 맞을 수 있다. 생성물 형성의 속도를 최대화하는 기술뿐만 아니라, 계속적 발효 과정 동안 영양소 및 성장인자를 유지하는 방법은 당업계에 알려져 있다..

이하 실시예를 통해, 본 발명을 더욱 상술하나 하기 실시예에 의해 본 발명이 제한되지 아니함은 자명하다.

실험예 1 : HIGLE의 진화적(evolutionary) 특성 시험

본 발명자들은 효모 단백질 잡종법(yeast two-hybrid screening)을 통해 HIGLE을 암호화하는 클론을 분리하였다. 서열 분석을 통해 복제된 클론이 368개 서열의 단백질을 암호화하는 로커스(At2g30350)와 완전하게 일치하는 것을 확인하였다. 단백질 동정을 통해 다른 생물체의 GIY-YIG 도메인과 HIGLE간의 구조적 상관 관계를 분석하였다.

블라스트(BLAST) 분석에 의해, HIGLE의 GIY-YIG 도메인이 고도로 다양화된 GIY-YIG 호밍 엔도뉴클레아제 패밀리 내의 SLX1-클러스터에 속하였음을 확인하였다.

효모, 쥐, 인간에 존재하는 SLX1은 크게 2개의 도메인, GIY-YIG(URI) 도메인 및 환형 DNA 결합 도메인을 포함한다. 전자는 Y-형 접합 구조 DNA의 단일가닥 5'-플랩 및 헤어핀 DNA의 루프 구조를 절단하는 구조-특이적 엔도뉴클레아제이고, 후자는 표적 DNA 분자를 인식할 수 있다.

HIGLE은 동물의 SLX1 단백질과 달리 환형 DNA 결합 도메인을 포함하지 않고 GIY-YIG 도메인만을 포함한다. HIGLE의 GIY-YIG 도메인은 일반적으로 다른 SLX1 단백질과 46 내지 83%의 동일성을 공유하고, 옥수수 및 쌀의 미확인 GIY-YIG 도메인과 가장 밀접(약 83%의 동일성)하게 관련되어 있다.

반면, HIGLE의 GIY-YIG 도메인은 인간(약 54%) 및 효모의 SLX1(약 46%) 단백질과 한정적인 상동성을 가진다.

HIGLE의 전체적인 구조는 다른 SLX1 단백질과 다소 상이함에도 불구하고, GIY-YIG 도메인의 높은 유사성은 HIGLE이 구조-특이적 호밍 엔도뉴클레아제로서 기능할 수 있음을 시사한다.

실험예 2 : HIGLE, HYL1 및 SE의 복합체 형성 여부 시험

HIGLE이 HYL1과 직접적으로 단백질 복합체를 형성하는지 분석하기 위해 In vitro에서 pull down assay를 수행하였다.

상기 분석에서, HIGLE 단백질, N-말단, 및 C-말단이 결실된 변이체가 말토스 결합 단백질(MBP)과 융합된 단백질로서 발현되었으며, N말단 및 C-말단 3곳에 각각 HA-tag 되었다. 융합된 단백질은 MBP-친화 크로마토그래피에 의해 정제되었다.

이와 유사하게 HYL1, 및 N-말단에 RNA 결합 도메인 1, 및 RNA 결합 도메인 2를 포함하는 결실 변이체를 발현시키고, 히스톤-친화 크로마토그래피를 이용하여 정제하였다(도 1C). MBP-융합 HIGLE-HA 단백질을 HIS-융합 HYL1 및 결실 변이체 단백질과 혼합하고, 아밀로오스 레진에서 pull down 분석을 수행하였다.

MBP-HIGLE-3HA는 HYL1 및 RBD1+2 도메인을 pull down 하였으나, 개별적인 RNA 결합도메인은 pull down 하지 못하였다. 반면, 음성 대조군 MBP 단백질을 사용한 경우 HYL1뿐만 아니라 결실 변이체도 회수되지 않았다(도 1D).

이와 반대로 HIGLE의 상호 작용 도메인을 확인하기 위해 GST-융합HYL1을 사용하였다. GST-HYL1은 HIGLE의 N-말단 영역과 결합하였다(도 1E).

상기 결과는 HIGLE이 GIY-YIG 도메인을 통해 HYL1의 N-말단 영역과 직접적으로 상호 작용할 수 있음을 시사한다. 또한, HIGLE은 다른 가이딩(guiding) 단백질, SERRATE와 상호 작용할 수 있음이 확인되었다. GST-융합 SE-결실 변이체는 상기 방법과 동일하게 제조되었다.

SE의 N-말단 영역 및 중간 영역은 모두 HIGLE 및 HIGLE의 GIY-YIG 도메인과 상호 작용하였다(도 1D). 두 경우 모두, GST는 단독으로 HIGLE 또는 결실 변이체와 상호 작용하지 않았으며, 이는 결합 측정법의 특이성을 시사한다.

즉, 상기 결과는 HIGLE의 GIY-YIG 도메인이 HYL1의 N-말단, 및 SE의 N-말단 및 중간 영역과의 직접적인 결합을 매개할 수 있음을 시사한다. HIGLE, HYL1, 및 SE 간의 단백질 결합은 in vivo 상의 상호 관련성을 시사하므로, WT/35S-HIGLE-6Myc 또는 hyl1-2/35S-HYL1-6Myc 유전자 이식 식물을 이용하여 공-면역침전법(co-IP)을 수행하였다.

항-HIGLE, 항-HYL1, 항-SE 항체를 이용하여 항-MYC 항체의 침전(Immuno-complexes)을 확인하였다. HYL1-6myc는 내생(endogenous)의 HIGLE과 공-면역침전될 수 있다.

넉다운(knockdown)된 이식 식물 라인(#3)은 결합 특이성을 확인하기 위해 음성 대조군으로 사용되었다(도. 1D).

이와 유사하게, HIGLE-6Myc이 α-Myc 항체와 공-면역침전 할 때, 내생의 SE가 침전된 복합체에서 검출되었다. 넉다운된 이식 식물 라인(#18)을 음성 대조군으로 이용하여 SE 및 HIGLE 간의 상호 작용을 측정하였다(도. 1D).

본 발명자들은 HYL1의 핵 국재화(nuclear localization)는 이미 잘 알려져 있고, HIGLE은 N-말단 및 C-말단 영역에서 핵 국재화 신호를 나타내므로, HIGLE은 핵 내에서 HYL1과 함께 국재화(co-localization) 할 것이라고 추정하였다.

HIGLE-RFP는 주로 WT/35S-HIGLE-RFP 식물 이식 묘목의 핵 내에서 국재화되었다.

또한, HIGLE 및 HYL1 간의 상호 작용을 시각화하기 위하여, WT/35S-HYL1-CFP/35S-HIGLE-YFP 이중(double) 유전자 이식 식물 라인을 사용하였다. HIGLE-YFP은 핵 내에서 HYL1-CFP 와 함께 높은 수준으로 발현되었으며, HIGLE 및 HYL1은 동시에 핵 내에서 국재화되었다(도 2A).

HIGLE 및 HYL1 간의 물리적 근접성을 평가하기 위하여 형광공명 에너지전이(FRET) 분석을 수행하였다.

HYL1-CFP 및 HIGLE-YFP을 공여체 및 수용체 쌍(donor-acceptor pair)으로 사용하여 효율적인 에너지 전달을 관찰하였으며, 이는 상기 단백질이 두 개의 형광원을 연결하고 에너지 전달을 위해 충분히 근접한 거리(100Å 미만)를 유지하고 있음을 시사한다.

상기 상호 작용은 스펙클(speckle) 또는 다이싱체(dicing body)로 분할되기 보다는 핵 전체에 걸쳐 발생하고 있으며, 이는 상기 단백질이 35S 프로모터의 제어 하에 높은 수준으로 발현되고 있는 것에 기인하는 것으로 추정된다.

즉, 상기 결과는 HIGLE 및 SE가 in vivo에서 상호 작용하고, HIGLE이 HYL1 및 SE와 함께 복합체를 형성함을 시사한다.

실험예 3 : HIGLE의 RNA 및 DNA 구조-특이적 활성 시험

SLX1은 구조-특이적 호밍 엔도뉴클레아제의 일종으로, 이중 가닥(DS)/단일 가닥(SS) 접합(junction) 구조를 포함하는 DNA 기질에서 3'-to-5' 뉴클레아제 활성을 통해 단일 가닥을 제거할 수 있다.

DS/SS 접합 구조로서 널리 알려진 헤어핀(stem-loop) 구조의 DNA 및 Y-형 구조의 DNA를 적용한 결과, 효모의 SLX1은 Y-형 DNA의 접합 부위에 근접한 3'-to-5' 단일 가닥을 절단하였다.

HIGLE이 접합-구조 특이적 뉴클레아제 활성을 보유하는지 확인하기 위하여 본 발명자들은 Y-형 DNA를 기질로 하여 프로세싱 분석을 수행하였다.

상기 프로세싱 분석을 위해 DY1 및 DY2으로 표시된 Y형 DNA 기질을 제조하였다.

상기 Y형 DNA 기질의 서열은 동일한 반면, 상이한 위치에 각각 표지되었다. 하나는 이중 가닥의 5' 말단 영역(DY1)에 방사성 인산염을 표지하였으며, 다른 하나는 단일 가닥의 5' 말단 영역(DY2)에 표지하였다.

효모 SLX1의 활성과 유사하게, HIGLE은 DY2의 접합부의 3'-to-5' 돌출부(overhang)를 효율적으로 절단하였다. 반면, DY1의 5'-to-3' 돌출부 가닥의 프로세싱은 지연되었다(도 3A).

상기 결과는 HIGLE이 구조-특이적 DNA 가수분해효소 활성을 가지고 있음을 시사한다.

HIGLE의 DNA 가수분해효소 활성이 확인되었음에도 불구하고, HIGLE 의 DNA 가수분해효소 활성 및 HYL1-상호 작용 특성간의 상관 관계는 확인되지 않았다.

최근 계통 발생적 연구는 GIY-YIG 단백질 및 RNA 가수분해효소 H1(RNaseH1)은 RNA 결합 단백질에서 진화한 것으로 제안한 바 있다. 또한, 많은 연구는 몇몇 호밍 엔도뉴클레아제(homing endonuclease)가 보유한 DNA 및 RNA 모두에 작용하는 이원기능적(bi-functional) 특성을 보고한 바 있다.

본 발명자들은 HIGLE이 이원기능적 특성을 가지는지 확인하기 위해 Y-형 DNA를 RNA로 대체하였으며, RY1 및 RY2로 명명하였다.

동일한 실험 결과 HIGLE은 3'-to-5' 단일 가닥의 RY2를 효과적으로 절단하였으며, 이원기능적(bi-functional) 특성이 확인되었다.

HIGLE은 RY1의 5'-to-3' 가닥을 제거하였으며, DNA 가수분해효소 활성과 비교하여 다소 우수한 활성을 나타냈다(도 3B).

HIGLE의 구조-특이적 RNA 가수분해효소 활성은 단일 가닥의 비구조화(non-structured) RNA를 대조군으로 하여 확인되었다(도 3C).

또한, 본 발명자들은 많은 내생의 엔도뉴클레아제를 포함하는 대장균에서 HIGLE을 발현시키고 정제하였다. 이 때, HIGLE에 의한 뉴클레아제 활성을 확인하기 위하여 GIY-YIG 도메인 내의 아르기닌(R53A) 및 글루탐산 잔기(E103A)에 점돌연변이(point mutation)를 도입하였다. 효모의 SLX1및 대장균의 UvrC 단백질의 동일 잔기는 3'-to-5' 뉴클레아제 활성에 있어 필수적이다.

HIGLE의 N-말단 영역 및 HIGLE 전체 서열은 Y-형 RNA 기질에서 단일 가닥으로 성공적으로 제거하였으나, 이중 점돌연변이(double-point mutant) 및 HIGLE의 C말단 조각은 3'-to-5' 단일 가닥을 제거하지 못하였다(도 3D).

상기 결과는 HIGLE이 GIY-YIG 호밍 엔도뉴클레아제 군에 속하는 최초의 이원기능적 뉴클레아제임을 시사한다.

실험예 4 : HIGLE의 pre-miRNA 결합 활성 시험

HYL1는 pri-miRNA의 폴드백 스템 구조(fold-back stem structure)를 인식하는 이중 가닥의 RNA 결합 단백질이다.

또한, SE의 RNA 결합 도메인은 pri-miRNA의 정확한 프로세싱에 있어서 중요하다.

DCL1은 RNA 결합 도메인을 통해 pri-miRNA와 직접적으로 상호 작용하고, pri-miRNA를 성숙한 miRNA로 프로세싱 할 수 있다. 상기 핵심적인 마이크로프로세싱 단백질은 이중 가닥의 RNA 결합 활성과 공통적인 특성을 공유한다.

따라서, 본 발명자들은 pre-miR172a를 기질로 하여 겔 시프트법(EMSA)을 수행하였으며, HIGLE 및 결실 변이체의 이중 가닥 RNA 결합 활성을 시험하였다.

HIGLE은 GIY-YIG 도메인을 통해 pre-miR172a과 직접적으로 상호 작용할 수 있다(도 4A).

본 발명자들은 pre-miR172a/HIGLE의 결합을 평가하기 위해 HIGLE의 특이적 결합 친화도를 측정하였다.

HIGLE의 해리 상수는 1.5 ± 0.7 X 10^{- 7}으로 HYL1 보다 6배 낮았으나(2.5 ± 0.7 X 10^-8), 일반적으로 상기 값은 강한 단백질-RNA 상호 작용으로 평가될 수 있다(도 4B, 4C).

상기 결과는 HIGLE의 GIY-YIG 도메인이pri-miRNA의 폴드백 스템 구조와 상호 작용하는데 충분함을 시사한다. 또한, HIGLE의 이중 점돌연변이(R53A/E103A) 는 HIGLE과 비교하여 pre-miR172a 에 대해 4배 낮은 친화도를 나타냈다(도 4D).

즉, 이중 점돌연변이에 의해 저하된 RNA 가수분해효소 활성은 결합 친화도 및 촉매 활성의 감소에 기인한 것으로 평가할 수 있다.

실험예 5 : HIGLE의 5' 및 3' 돌출부 절단 활성 시험

최근 연구는 pri-miRNA의 자가 상보적 스템 구조(self-complementary stem)가 성숙한 miRNA로 프로세싱 될 때 중요한 결정 요인임을 보고한 바 있다. 상기 연구는 식물의 miRNA 생물발생에 있어서 miRNA 전구체의 구조적 결정 요인을 최초로 제안하였다.

그러나, 폴드백 스템 구조의 길이 및 특성은 광범위한 다양성이 존재하므로, 식물의 pri-miRNA 프로세싱에 있어서 공통의 구조적 결정 요인은 완전하게 밝혀지지 않았다.

본 발명자들은 상기 연구들로부터 HIGLE이 전형적인 DS/SS 접합 구조(도 5A, 5B, 황색 화살표) 및 폴드백 스템의 벌지와 같은 pri-miRNA의 구조적 특성을 인식할 것으로 가정하고, 이를 검증하였다.

실험 조건에서 온전한 pri-miR172a는 길이로 인해 다루기 어려우므로 결실된 5' 및 3' 돌출부를 포함하는 pri-miR172a 기질을 합성하였다.

합성된 pri-miR172a는 5'- SS(85nt), 3'-SS(78nt), 폴드백 스템(102nt)으로 구성되고, 종래에 보고된 인공 pri-miR172a와 동등하게 기능하였다(도 5A).

상기 기질이 증가된 농도(0 내지 3.0 x 10^-8 g)의 HIGLE과 배양되었을 때, HIGLE은 상기 합성된 pri-miR172a 를 다양한 사이즈(50nt 내지 150nt)의 조각으로 절단하였다(도 5C).

어떤 조각이 pre-miR172a(폴드백 스템, 도 5B) 또는 성숙 miR172에 대응하는지 결정하고자 P1, P2, P3, 및 P4으로 표시된 5'-unpaired 영역(5'-플랩), 루프, miR172 영역, 3'-unpaired 영역(3'-플랩)에 각각 특이적인 프로브를 이용하여 RNA 블랏 분석을 수행하였다(도 6A, 6B).

프로세싱된 조각에 있어서, P3 프로브(miR172)가 적용되었을 때 miR172 영역(~100nt)을 포함하는 조각이 주로 검출되었다(화살표 1). 3.0 x 10^-8 g의 농도에서, miR172 영역과 함께 추가적인 조각(~60nt)이 검출되었다(도 6D).

상기 ~100nt 및 ~60nt 조각은 pre-miR172a-형 중간체, 및 더욱 잘려진 파생물일 것으로 추정되었다.

~100nt 조각이 5'-플랩 및 3'-플랩을 포함하지 않는 pre-miR172a인지 확인하고자, 세포막을 P1(5'-플랩) 또는 P4(3'-플랩)과 재혼성화 하였다. 5'-플랩 및 3'-플랩은 100nt 부근에서 현저히 검출되지 않았으며, 이는 ~100nt 조각이 양 플랩의 부재 하에 합성 pri-miR172a의 폴드백 스템이 될 수 있음을 시사한다(도 5B, 5E, 5F).

또한, P2 프로브를 이용하여 ~100nt 중간체가 루프 구조 및 miR172 영역을 모두 포함하는지 확인하였다(도 5G).

상기 결과는 HIGLE이 pri-miR172a의 DS/SS 접합 구조를 절단할 수 있고, pre-miR172a-형 중간체를 생성할 수 있음을 시사한다(도 5A, 5B, 황색 화살표).

본 발명자들은 프로세싱 분석의 절단된 조각을 복제 및 시퀀싱하였으며, 중간체가 실제로 pri-miR172a의 폴드백인지 검증하였다(도 5A, 적색선).

단일 가닥의 핵산은 HIGLE에 대한 적절치 않은 기질임에도 불구하고, 조각난 5'-플랩은 예상된 사이즈(85 nt)로 거의 검출되지 않은 반면(도 5E, 화살표), 3'-플랩 조각은 예상된 사이즈(78 nt)로 명확하게 확인되었다(도 5F).

상기 결과는 상기 기질의 실제 상태와 완전하게 부합하지는 않지만 M-폴드 컴퓨터 예측 프로그램(M-fold computational prediction program)은 5'-플랩 영역이 작은 폴드백 구조 및 벌지를 형성할 것으로 예측하였다.

따라서, 본 발명자들은 5'-플랩 영역이 HIGLE에 의해 검출되지 않는 작은 조각으로 분해될 것으로 추정하였다.

DCL1에 의한 pri-miRNA의 정교한 프로세싱에 있어서, HYL1 및 SE는 함께 중요한 기능을 수행하는 것으로 보고된 바 있다.

따라서, 본 발명자들은 HIGLE을 일정(3.0 x 10^-8 g)하게 유지하고 HYL1 또는 SE 단백질의 농도를 증가시키면서 프로세싱 분석을 수행하였다.

SE 또는 HYL1의 첨가에 따라 ~100nt 조각의 생성이 증가하였으며, 그 결과로서 ~60nt 조각은 감소하였다(도 6A). SE(4배)는 HYL1(2배)보다 더 효과적으로 ~100nt 중간체 조각을 축적시켰다.

~100nt 조각은 HYL1 및 SE가 모두 첨가되었을 때 대조군(HIGLE 단독 첨가)과 비교하여 약 6배 이상 증가하였으며, 이는 HIGLE의 pri-miRNA 프로세싱에 있어서 HYL1 및 SE이 관여하는 유도 작용을 시사한다(도 6A). 즉, 상기 HYL1 및 SE는 HIGLE 의 활성에 의한 폴드백 스템을 보호할 수 있다.

세포막과 P1, P2, P4 프로브의 재혼성화에 의해 pre-miR172a-형 중간체의 특성이 검증되었다. 5'-플랩 및 3'-플랩 영역은 대체로 중간체(~ 100nt)에서 발견되지 않았으며(도 6B 및 6C), P4 프로브에 의한 신호는 주로 중간체의 동일 영역에서 검출되었으므로 HYL1 및 SE가 중간체의 생성을 촉진할 수 있음이 확인되었다(도 6D).

또한, pri-miRNA의 프로세싱에 있어서 HIGLE의 RNA 가수분해효소 활성을 검증하기 위해, 합성된 pri-miR164a를 이용하여 in vitro 프로세싱 분석을 수행하였다.

합성된 pri-miR164a 기질은 5'-플랩(81 nt), 폴드백 스템으로 구성된다(도 7A, 7B). 상기 기질은 HIGLE과 배양되었을 때, 다양한 사이즈(100nt 내지 250nt)의 조각으로 프로세싱 되었다(도 7C).

상기 조각의 pre-miR164a형 중간체를 확인하기 위해, 5'-플랩(P1 및 P2), miR164 영역(P3), 3'-플랩 영역(P4)에 대응하는 프로브를 이용하여 RNA 블랏 분석을 수행하였다(도 7A, 7B).

P3 프로브를 적용한 결과, HIGLE의 농도의 증가에 의해 miR164를 포함하는 100nt 조각이 생성되었다(도 7D).

~100nt 조각이 pre-miR164a형 중간체인지 검증하기 위하여, P1 및 P2 또는 P4를 상기 동일한 세포막과 재혼성화 하였다. 5'-플랩 및 3'-플랩 영역에 대한 신호가 ~100nt 조각에서 검출되지 않았으며, 상기 결과는 pre-miRNA-형 중간체의 생성에 있어 HIGLE의 역할을 강하게 뒷받침한다(도 7E, 7F).

이 때, pri-miR164a 및 pri-miR172a의 절단 패턴은 다소 상이하였다. 예컨대, RNA 블랏 분석에서 5'-플랩 및 3'-플랩은 모두 예상된 위치(81nt 및 86nt)에서 검출되지 않았다(도 7E, 7F).

또한, 합성 pri-miR164a의 프로세싱에 있어서 HYL1 및 SE의 가이딩 효과를 분석하였다.

HYL1은 pri-miR172a와 달리 pre-miR164a-형 중간체 생성을 효과적으로 촉진하지 못하였다. 뿐만 아니라, pre-miR164a-형 중간체의 수준은 SE의 존재 하에 현저하게 증가하였다(도 7G).

pre-miR164a-형 중간체의 특성은 P1, P2, 및 P4 프로브에 의해 검증되었다(도 7H, 7I). 대장균의 엔도뉴클레아제에 의한 오염을 배제시킨 대조군 실험에 의해 HYL1 및 SE가 pri-miR164a을 프로세싱 할 수 없음이 확인되었다.

상기 합성 pri-miR172a 및 pri-miR164a의 프로세싱 패턴의 차이는 2차 구조, 또는 알려지지 않은 요인의 차이에 기인할 수 있다. HIGLE에 의한 프로세싱에서 HYL1 또는 SE는 HIGLE의 활성으로부터 벌지를 포함하는 폴드백 스템 구조(국소적 Y-형 구조)를 보호하는 것으로 추정되었다(도 5 및 7).

또한, 방사성 표지된 UTP를 포함하는 추가적인 pre-miRNA-형 기질, pre-miR160a 및 pre-miR164b을 이용하여 실험을 더욱 수행하였다. 전자는 폴드백 스템 구조에 2개의 벌지를 포함하고, 후자는 4개의 벌지를 포함한다(도 8A, 8C)

HIGLE의 농도(0 내지 3.0 x 10^-8 g)를 증가시키면서 더 작은 조각으로 프로세싱될 수 있는 폴드백 스템 구조를 관찰하였다.

RNA 가수분해효소 활성에 의해 pre-miR160a에서 2개 조각(~35nt 및 ~40nt)이 생성되었고, pre-miR164b에서 5개의 조각(35nt 내지 50nt 사이에 4개의 조각, 20nt 부근의 단일 조각)이 생성되었다(도 8B, 8D). 호밍 엔도뉴클레아제의 공통적인 특성을 고려할 때, 양 폴드백 스템 기질의 구별되는 패턴은 벌지 개수의 차이에 기인한 것으로 분석되었다(도 8B, 8C).

또한, HIGLE의 RNA 가수분해효소 활성은 HYL1 또는 SE에 의해 차단되었으며(도 8B, 8D), HYL1 및 SE가 폴드백 스템 구조의 보호에 있어서 중요한 역할을 수행할 수 있다. 즉, 상기 결과는 HIGLE이 pri-miRNA의 3' 및 5' 돌출부 양자를 절단하는 신규한 유형의 RNA 가수분해효소이며, HYL1 및 SE의 유도 하에 pre-miRNA-형 중간체를 생성할 수 있음을 시사한다.

일반적으로 식물에서 miRNA는 pri-miRNA(primary miRNA)에서 pre-miRNA(precursor miRNA)를 프로세싱 하며, 상기 과정에서 DCL1(Dicer-like protein 1), HYL1(HYPONASTIC LEAF 1), 및 SE(SERRATE)로 구성된 프로세싱 단백질이 관여한다.

DCL1은 pri-miRNA의 5' 및 3' 돌출부(overhang)를 절단하는 RNase type III slicer로서 pre-miRNA를 생성하고, pre-miRNA의 루프(loop) 영역을 절단하여 궁극적으로 miRNA를 방출한다.

2단계의 절단 과정에서, 단백질인 HYL1 및 SE가 miRNA의 정확한 프로세싱에 필수적으로 관여한다. HYL1은 이중가닥 RNA-결합 단백질로서 이합체 miRNA/miRNA*에 결합한다.

HYL1는 RNA-결합 도메인 2(RBD2)를 통해 DCL1 및 SE와 직접 상호 작용할 수 있으며, 정확한 pri-miRNA 프로세싱을 매개할 수 있다. SE는 pri-miRNA의 프로세싱의 정확성을 향상시키는 아연 집게 단백질(zinc-finger protein)로서 DCL1 및 HYL1와 핵심 마이크로프로세서를 형성한다..

상기 프로세싱된 이합체 miRNA/miRNA*는 HEN1(HUA ENHANCER 1)에 의해 더욱 변형된다. HEN1은 이합체 miRNA/miRNA* 및 siRNA/siRNA*의 2′-OH 위치에 메틸기를 부가시켜, 폴리우리딘(polyuridine)의 접합에 의한 분해를 방지한다. 메틸화된 miRNA/miRNA* 이합체는 HASTY에 의해 세포질로 수송된다.

miRNA는 진핵생물의 무수한 생리학적, 발생적, 대사적 프로세스에 관여한다. pri-miRNA(primary miRNA)는 마이크로프로세서로 알려진 고도로 조직화된 복합체에 의해 21 내지 22 nt의 성숙한 miRNA로 프로세싱 될 수 있다.

HYL1 및 SE는 HIGLE과 직접적으로 상호 작용하여 짝을 이루지 않은 단일 가닥의 절단을 가이딩하고, pri-miRNA의 폴드백 스템(fold-back stem) 영역을 보호하였다. 따라서, 상기 결과는 HIGLE이 식물의 pri-miRNA 프로세싱을 보조 또는 지지하는 RNA 가수분해효소임을 시사한다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.

본 발명의 범위는 후술하는 특허청구범위에 의해 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

<110> YONSEI UNIVERSITY <120> NOVEL HOMING ENDONUCLEASE FROM ARABIDOPSIS THALIANA <130> 2016-PP-10094 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 368 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana <400> 1 Met Arg Glu Lys Arg Gly Asn Arg Lys Ala Leu Asp Pro Val Gly Glu 1 5 10 15 Asp Gly Val Thr Gly Lys Asp Gly Lys Gly Phe Phe Ala Cys Tyr Leu 20 25 30 Leu Thr Ser Leu Ser Pro Arg His Lys Gly Gln Thr Tyr Ile Gly Phe 35 40 45 Thr Val Asn Pro Arg Arg Arg Ile Arg Gln His Asn Gly Glu Ile Thr 50 55 60 Ser Gly Ala Trp Arg Thr Lys Lys Lys Arg Pro Trp Glu Met Val Leu 65 70 75 80 Cys Ile Tyr Gly Phe Pro Thr Asn Val Ser Ala Leu Gln Phe Glu Trp 85 90 95 Ala Trp Gln His Pro Arg Glu Ser Val Ala Val Arg Glu Ala Ala Ala 100 105 110 Ala Phe Lys Ser Phe Ser Gly Val Ala Ser Lys Ile Lys Leu Val Tyr 115 120 125 Thr Met Leu Asn Leu Pro Ala Trp Asn Ser Leu Asn Leu Thr Val Asn 130 135 140 Tyr Phe Ser Ser Lys Tyr Ala His His Gly Gly Lys Ser Pro Ser Leu 145 150 155 160 Pro Leu His Met Lys Val Gln Val Cys Ala Met Glu Asp Leu Gln Tyr 165 170 175 Phe Thr Lys Val Asp Asp Ser Ser Gln Pro Glu Asp Glu Glu Ser Pro 180 185 190 Glu Val Asn Glu Glu Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Ser Ser Asn 195 200 205 Leu Ser Gln Pro Gly Asn Ser Asn Thr Ser Ser Ser Asp Asp Arg His 210 215 220 Phe Glu Lys Ala Lys Glu Pro Val Thr Val Phe Asp Glu Glu Asp Arg 225 230 235 240 Leu Ala Asn Phe Ser Gly Phe Gly Leu Leu Asp Glu Glu Glu Thr Val 245 250 255 Glu Asp Glu Val Ser His Ile Thr Val Gly Ser Ile Arg Ala Thr Glu 260 265 270 Lys Glu Pro Glu Thr Val Phe Asn Asp Arg Leu Ala Ser Phe Thr Cys 275 280 285 Phe Gly Leu Val Glu Ile Val Glu Asp Glu Val Ser His Gly Thr Ile 290 295 300 Gly Ser Thr Glu Ala Met Glu Lys Glu Cys Arg Lys Arg Arg Asn His 305 310 315 320 Ile Thr Ser Thr Thr Thr Glu Val Asp Val Glu Val Ile Asp Leu Met 325 330 335 Thr Pro Ser Pro Ser Cys Arg Ala Gly Ser Ser Met Lys Arg Arg Arg 340 345 350 Val Ser Glu Phe Ile Asp Leu Thr Met Ser Pro Asn Phe Ile Glu Ser 355 360 365

Claims (11)

1. (a) GIY-YIG 도메인을 포함하고, (b) RNA 및 DNA를 기질로 하는 이원기능적(bi-functional) 특성을 보유하며, (c) 3' 및 5' 돌출부(overhang)에 대한 구조-특이적 활성을 보유하는 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 호밍 엔도뉴클레아제(HIGLE)를 포함하는 RNA 절단용 조성물.
2. 제1항에 있어서,
   상기 RNA는 3' 및 5' 돌출부(overhang)를 포함하는 조성물.
3. 삭제
4. 제2항에 있어서,
   염기 서열간의 비정교합(non-complementary base-pair)에 의해 형성된 벌지(bulge) 구조에 대한 특이적 절단 활성을 보유하는 조성물.
5. 삭제
6. 삭제
7. 삭제
8. 삭제
9. 제1항, 제2항 및 제4항 중 어느 한 항의 조성물을 처리하는 단계를 포함하는 RNA의 절단 방법.
10. 제9항에 있어서,
    3' 및 5' 돌출부(overhang)를 포함하는 이중 가닥 RNA의 절단 방법.
11. 제10항에 있어서,
    상기 이중 가닥은 상기 3' 및 5' 돌출부(overhang) 외 영역에서 염기 서열간의 비정교합(non-complementary base-pair)에 의해 벌지(bulge) 구조를 형성하는 RNA의 절단 방법.
    
    

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