JP2013252057A - モーレラ属細菌の遺伝子組換え法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】オロチジン−5’−リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子(pyrF)を標的遺伝子とし、宿主モーレラ属細菌で発現する抗生物質耐性遺伝子を相同組換えによって前記宿主モーレラ属細菌のゲノムに組み込む工程を備える、モーレラ(Moorella)属細菌の遺伝子組換え方法。
【選択図】なし
Description
すなわち、本発明は以下の(1)〜(30)を提供する。
を備える、モーレラ(Moorella)属細菌の遺伝子組換え方法。
(2)前記相同組換えが、前記宿主モーレラ属細菌のオロチジン−5’−リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子(pyrF)の上流領域の塩基配列および下流領域の塩基配列と、前記抗生物質耐性遺伝子の塩基配列と、前記宿主モーレラ属細菌またはその同一種のモーレラ属細菌に由来するグリセルアルデヒド−3−リン酸デカルボキシラーゼ(G3PD)プロモーター領域の塩基配列とを含み、前記薬剤耐性遺伝子が前記上流領域、前記下流領域または前記上流領域と前記下流領域との間に配置され、かつ、前記薬剤耐性遺伝子および前記G3PDプロモーター領域が前記G3PDプロモーター領域に含まれるG3PDプロモーターによって前記薬剤耐性遺伝子が発現されるように連結された相同組換用ベクターを用いて行われる、上記(1)に記載のモーレラ属細菌の遺伝子組換え方法。
(3)前記相同組換用ベクターが、前記宿主モーレラ属細菌またはその同一種のモーレラ属細菌のオロチジン−5’−リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子(pyrF)の塩基配列をさらに含み、
前記pyrFが前記上流領域と前記下流領域との間に配置され、かつ、
前記pyrFがその本来の発現プロモーターによって発現されるように連結された相同組換えベクターを用いて行われる、上記(2)に記載のモーレラ属細菌の遺伝子組換え方法。
(4)前記相同組換用ベクターが、外来遺伝子の塩基配列をさらに含み、
前記外来遺伝子が前記G3PDプロモーターによって発現される、上記(2)または(3)に記載のモーレラ属細菌の遺伝子組換え方法。
(5)前記相同組換用ベクターが、外来遺伝子の塩基配列と、宿主モーレラ属細菌またはその同一種のモーレラ属細菌に由来する発現プロモーター領域の塩基配列とをさらに含み、
前記外来遺伝子が前記発現プロモーター領域に含まれる発現プロモーターによって発現される、上記(2)または(3)に記載のモーレラ属細菌の遺伝子組換え方法。
(6)前記発現プロモーターが、COデヒドロゲナーゼプロモーター、プロリルtRNAシンターゼプロモーターおよびグリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼプロモーターからなる群から選択されるいずれか一つである、上記(5)に記載の方法。
(7)前記外来遺伝子が、エタノール合成系に関与する遺伝子またはピルビン酸合成系に関与する遺伝子である、上記(4)〜(6)のいずれかに記載の方法。
(8)前記抗生物質耐性遺伝子が、カナマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、エリスロマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子およびピューロマイシン耐性遺伝子からなる群から選択される少なくとも1つである、上記(1)〜(7)のいずれかに記載の方法。
(9)上記(1)〜(8)のいずれかに記載の方法によって得られる遺伝子組換えモーレラ属細菌。
(10)オロチジン−5’−リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子(pyrF)の上流領域、下流領域または上流領域と下流領域との間に、抗生物質耐性遺伝子が配置され、前記抗生物質耐性遺伝子の上流に、宿主モーレラ属細菌またはその同一種のモーレラ属細菌に由来するグリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼ(G3PD)プロモーターが配置され、前記抗生物質耐性遺伝子が前記G3PDプロモーターによって発現される、遺伝子組換えモーレラ属細菌。
(11)さらに、前記G3PDプロモーターの下流、かつ、前記抗生物質耐性遺伝子の上流または下流に、外来遺伝子が位置し、前記G3PDプロモーターによって前記外来遺伝子が発現される、上記(10)に記載の遺伝子組換えモーレラ属細菌。
(12)さらに、前記G3PDプロモーターと前記抗生物質耐性遺伝子との間を除く、前記pyrFの上流または下流に、宿主モーレラ属細菌と同一種のモーレラ属細菌に由来する発現プロモーターと、外来遺伝子とが位置し、前記発現プロモーターによって前記外来遺伝子が発現される、上記(10)に記載の遺伝子組換えモーレラ属細菌。
(13)前記発現プロモーターが、COデヒドロゲナーゼプロモーター、プロリルtRNAシンターゼプロモーターおよびグリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼプロモーターからなる群から選択されるいずれか一つである、上記(12)に記載の遺伝子組換えモーレラ属細菌。
(14)前記外来遺伝子が、エタノール合成系に関与する遺伝子またはピルビン酸合成系に関与する遺伝子である、上記(11)〜(13)のいずれかに記載の遺伝子組換えモーレラ属細菌。
(15)前記抗生物質耐性遺伝子が、カナマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、エリスロマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子およびピューロマイシン耐性遺伝子からなる群から選択される少なくとも1つである、上記(10)〜(14)のいずれかに記載の遺伝子組換えモーレラ属細菌。
(16)オロチジン−5’−リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子(pyrF)を標的遺伝子とし、宿主モーレラ属細菌で発現する抗生物質耐性遺伝子を相同組換えによって前記宿主モーレラ属細菌のゲノムに組み込むための、相同組換用ベクター。
(17)前記宿主モーレラ属細菌のオロチジン−5’−リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子(pyrF)の上流領域の塩基配列および下流領域の塩基配列と、前記抗生物質耐性遺伝子の塩基配列と、前記宿主モーレラ属細菌またはその同一種のモーレラ属細菌に由来するグリセルアルデヒド−3−リン酸デカルボキシラーゼ(G3PD)プロモーター領域の塩基配列とを含み、前記薬剤耐性遺伝子が前記上流領域、前記下流領域または前記上流領域と前記下流領域との間に配置され、かつ、前記薬剤耐性遺伝子および前記G3PDプロモーター領域が前記G3PDプロモーター領域に含まれるG3PDプロモーターによって前記薬剤耐性遺伝子が発現されるように連結された、上記(16)に記載の相同組換用ベクター。
(18)前記相同組換用ベクターが、外来遺伝子をさらに含み、かつ前記外来遺伝子が前記G3PDプロモーターによって発現される、上記(17)に記載のベクター。
(19)前記相同組換用ベクターが、外来遺伝子と、宿主モーレラ属細菌と同一種のモーレラ属細菌に由来する発現プロモーターとをさらに含み、
前記外来遺伝子が前記発現プロモーターによって発現される、上記(17)に記載のベクター。
(20)前記発現プロモーターが、COデヒドロゲナーゼプロモーター、プロリルtRNAシンターゼプロモーターおよびグリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼプロモーターからなる群から選択されるいずれか一つである、上記(19)に記載のベクター。
(21)前記外来遺伝子が、エタノール合成系に関与する遺伝子またはピルビン酸合成系に関与する遺伝子である、上記(18)〜(20)のいずれかに記載のベクター。
(22)前記抗生物質耐性遺伝子が、カナマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、エリスロマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子およびピューロマイシン耐性遺伝子からなる群から選択される少なくとも1つである、上記(16)〜(21)のいずれかに記載のベクター。
(23)宿主モーレラ属細菌と同一株またはその野生株のモーレラ属細菌および大腸菌で増殖可能なシャトルベクターである、上記(16)〜(22)のいずれかに記載のベクター。
(24)オロチジン−5’−リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子(pyrF)、pyrFの上流領域および下流領域、抗生物質耐性遺伝子ならびにグリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター(G3PDプロモーター)を含み、前記G3PDプロモーターおよび前記抗生物質耐性遺伝子が前記抗生物質耐性遺伝子が前記G3PDプロモーターによって発現されるように配置され、前記G3PDプロモーターおよび前記抗生物質耐性遺伝子が前記pyrFの上流領域、下流領域または上流領域と下流領域との間に配置される相同組換え領域を、骨格となるプラスミドベクターに組み込む工程を備える、モーレラ属細菌の遺伝子組換えに用いるための相同組換用ベクターの作製方法。
(25)前記相同組換え領域が、外来遺伝子をさらに含み、
前記外来遺伝子が前記G3PDプロモーターによって発現されるように配置される、上記(24)に記載の相同組換用ベクターの作製方法。
(26)前記相同組換え領域が、外来遺伝子と、宿主モーレラ属細菌と同一種のモーレラ属細菌に由来する発現プロモーターとをさらに含み、
前記外来遺伝子が前記発現プロモーターによって発現されるように配置され、前記外来遺伝子および前記発現プロモーターが前記pyrFの上流または下流に配置される、上記(24)に記載の相同組換用ベクターの作製方法。
(27)前記発現プロモーターが、COデヒドロゲナーゼプロモーター、プロリルtRNAシンターゼプロモーターおよびグリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼプロモーターからなる群から選択されるいずれか一つである、上記(26)に記載の相同組換用ベクターの作製方法。
(28)前記外来遺伝子が、エタノール合成系に関与する遺伝子またはピルビン酸合成系に関与する遺伝子である、上記(25)〜(27)のいずれかに記載の相同組換用ベクターの作製方法。
(29)前記抗生物質耐性遺伝子が、カナマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、エリスロマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子およびピューロマイシン耐性遺伝子からなる群から選択される少なくとも1つである、上記(24)〜(28)のいずれかに記載の相同組換用ベクターの作製方法。
(30)前記プラスミドベクターがシャトルベクターである、上記(24)〜(29)のいずれかに記載の相同組換用ベクターの作製方法。
遺伝子組換えを行うモーレラ属細菌(本発明において「宿主モーレラ属細菌」ともいう。)は、モーレラ・サーモアセティカ(Moorella thermoacetica)、モーレラ・サーモオートトロフィカ(M. thermoautotrophica)、モーレラ・グリセリニ(M. glycerini)もしくはモーレラ・ムルデリ(M. mulderi)に分類される細菌または細菌分類学的にモーレラ属に分類される細菌であれば特に限定されない。
本発明において、モーレラ属細菌の種レベルの分類群に着目する場合、モーレラ属細菌種、宿主モーレラ属細菌種という場合がある。
本発明において、モーレラ属細菌の株レベルの分類群に着目する場合、モーレラ属細菌株、宿主モーレラ属細菌株という場合がある。
宿主モーレラ属細菌のゲノムに導入される抗生物質耐性遺伝子は、特に限定されないが、カナマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、エリスロマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子およびピューロマイシン耐性遺伝子からなる群から選択される少なくとも1つが好ましい。
グリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼ(リン酸化)(GAPDH,EC 1.1.1.12)は、解糖系/糖新生に関与する酵素であり、D−グリセルアルデヒド−3−リン酸と1,3−ビスホスホグリセリン酸との相互変換を触媒し(下記反応式)、常時発現している。
オロチジン−5’−リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子はオロチジン−5’−リン酸デカルボキシラーゼ(OMPデカルボキシラーゼ,EC 4.1.1.23)をコードする遺伝子である。
本発明の遺伝子組換え方法で用いる相同組換用ベクターは、骨格となるプラスミドベクターと相同組換え領域とを有する。
上記相同組換え領域は、オロチジン−5’−リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子(pyrF)、その上流領域および下流領域、抗生物質耐性遺伝子ならびにグリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター(G3PDプロモーター)を含み、上記G3PDプロモーターを含む領域が上記抗生物質耐性遺伝子の上流に上記抗生物質耐性遺伝子を発現するように連結され、上記G3PDプロモーターおよび上記抗生物質耐性遺伝子が、上記pyrFの上流領域、下流領域または上流領域と下流領域との間に配置されたものが好ましく、上流領域または下流領域に配置されたものがより好ましい。
上記エタノール合成系に関与する遺伝子は、特に限定されないが、具体的には、例えば、ピルビン酸の脱炭酸を触媒するピルビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子が挙げられる。
上記ピルビン酸合成系に関与する遺伝子は、特に限定されないが、具体的には、例えば、ピルビン酸と乳酸との相互変換を触媒する乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子が挙げられる。
上記骨格となるプラスミドベクターは特に限定されないが、宿主モーレラ属細菌株および他の細菌の両方で増殖することができるシャトルベクターが好ましい。前記他の細菌としては、例えば、大腸菌を挙げることができる。
上記相同組換用ベクターを上記pyrF破壊株に形質転換をする方法は特に限定されず、相同組換用ベクターの骨格となるプラスミドベクターに合わせて適宜選択することが好ましい。本発明の遺伝子組換え方法においては、エレクトロポレーションが好ましい方法の一つである。
本発明の遺伝子組換えモーレラ属細菌は、本発明の遺伝子組換え方法によって作製される遺伝子組換えモーレラ属細菌であれば特に限定されない。
モーレラ・サーモアセティカ ATCC 39073株のpyrFを破壊し、ウラシル要求性変異株を作製した。
以下の手順でモーレラ・サーモアセティカ ATCC 39073株のオロチジン−5’−リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子pyrFを破壊するためのベクターを構築した。
モーレラ・サーモアセティカ ATCC 39073株を完全合成培地(改変ATCC 1754 PETC Medium、表22Aを参照)に植菌し、55℃で嫌気的に培養した。
培養後、NucleoSpin Tissue(MACHEREY−NAGEL社製)を用いてトータルDNAを抽出した。
上記「遺伝子破壊ベクターpk18−dpyrFの構築」で生育が見られたコロニーを、カナマイシンを添加したLB培地に移植した後、コロニーダイレクトPCRを行い、インサートの確認を行った。プライマーは表1に示すpyrF−up−Fl(配列番号6)、pyrF−dn−R1(配列番号9)を用いた。コロニーダイレクトPCRの反応液組成を表6に、反応条件を表7に示す。コロニーを反応液に入れてPCRを行った。なお、SapphireAmp Fast PCR Master Mix (2×Premix)および滅菌蒸留水は、SapphireAmp(R) PCR Master Mix(タカラバイオ社製)に含まれるものを用いた。
バンドが確認できた株を、カナマイシンを添加したLB液体培地で一晩培養し、プラスミド抽出を行った。
上記(1)で構築した遺伝子破壊ベクターpK18−dpyrFを、以下の手順で、モーレラ・サーモアセティカ ATCC 39073株に導入し、ダブルクロスオーバーの相同性組換えによってpyrFが破壊された株(dpyrF株)を選抜した。
272mMスクロース、16mM HEPESの組成で、水酸化カリウムを用いてpH7に合わせたHS緩衝液を調製し、20分間N2ガスで溶存酸素を置換した。
上記寒天培地に形成された20個のコロニーを、5mLのウラシル10μg/mL、5−FOA 0.2%の終濃度で添加した液体培地に植菌し、培養3日目に培地が濁っていることが確認できた6株を選択し、培養液1mLを集菌した。
(1)pK18−ldhの作製
(1−1)pK18−epyrFの作製
モーレラ・サーモアセティカ ATCC 39073株を完全合成培地(改変ATCC 1754 PETC Medium、表22Aを参照)に植菌し、55℃で嫌気的に培養した。
培養後、NucleoSpin Tissue(MACHEREY−NAGEL社製)を用いてトータルDNAを抽出した。
2μLのSmaI処理をしたプラスミドpK18mobを、8μLのゲル抽出したPCR産物、10μLのLigation high Ver.2(東洋紡製)と混合し、16°Cで1時間インキュベートした。
Escherichia coli HST08 Premiumコンピテントセル(タカラバイオ製)にライゲーション溶液10μLを添加して軽く攪拌した。
氷中に10分静置した。
42℃で1分間ヒートショックを与えた後、すぐに氷中に静置した。
SOC培地を1 ml加え、37℃で1時間インキュベート後、LB寒天培地(カナマイシン、X−gal、IPTG含有)に塗沫した。
37℃で一晩培養後、生えてきたコロニーを取得した。
上記(1)で生育が見られたコロニーをカナマイシン添加LB寒天培地に移植した後、コロニーダイレクトPCRを行い、インサートの確認を行った。プライマーはpyrF−up−F1(配列番号6)、pyrF−dn−R1(配列番号9)を用いた。コロニーダイレクトPCRの条件を以下に示す。なお、KOD FX(PCR酵素)、2× PCR バッファー for KOD FXおよび2mM dNTPsは、KOD FX(東洋紡社製)に含まれるものを用いた。
バンドが確認できた株について、カナマイシンを添加したLB液体培地で一晩培養し、プラスミド抽出を行った。
吸光度による濃度測定、およびEcoRIまたはPstI処理サンプルの電気泳動を行った。
さらに、シーケンスによる塩基配列の解読を行って目的のpyrF遺伝子相補ベクターpK18−epyrFが構築できていることを確認した。
T. pseudethanolicus 39E株の乳酸脱水素酵素遺伝子(T−ldh)を取得し、上記(2)で構築したpyrF遺伝子相補ベクターpK18−epyrFのpyrF遺伝子領域へ挿入し、T−ldh遺伝子導入用相補ベクターpK18−ldhを構築することを目的とした。
希釈したサンプル10μlを形質転換に用いた。
ダイレクトPCRによりコロニーを選択した。
ldh−F−1およびldh−R−1をプライマーとしたコロニーダイレクトPCRの結果、全ての株において目的のバンドが確認できた。それらの株の中から3株ずつを培養し、プラスミドを抽出した。制限酵素(EcoRI、EcoRV、またはPstI)処理、および電気泳動による確認の結果、全ての株においてT−ldhの挿入が確認できた。
(2−1)pK18−ldhを鋳型として、プライマーpyrF−ldh−inv−F(配列番号24)とpyrF−ldh−inv−R(配列番号25)との組合せを用いて、pyrF領域を含む領域をPCR増幅し、線状ベクターを得た。PCRの条件は以下の通りである。なお、KOD FX(PCR酵素)、2× PCR バッファー for KOD FXおよび2mM dNTPsは、KOD FX(東洋紡社製)に含まれるものを用いた。
16時間培養後、出現したコロニーを2×YT液体培地に植菌した。
16時間培養後、Quantum Prep Plasmid Miniprep Kit(バイオラッド)を用いてプラスミド抽出を行った。
抽出したプラスミドが目的のプラスミドであるか否かを、制限酵素処理およびPCR(カナマイシン耐性遺伝子(kanr)の増幅)により確認した。PCR反応液は表26に記載の組成とし、PCR条件は表27に記載の条件とした。
結果を図1のアガロースゲル電気泳動に示す。
また、PCRの結果では、レーン9を除き、kanrの増幅産物のバンドが確認された(レーン6〜10)。これは、予想通りである。
なお、レーン1と6、2と7、3と8、4と9、および5と10は、それぞれ、同一のプラスミドである。
宿主としては、M. thermoacetica ATCC 39073のpyrF破壊株として、先に独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターに寄託したdpyrF株(MTA−D−pF株,受託番号NITE P−1057)を用いた。ここでは、上記3で構築したカナマイシン耐性遺伝子導入用相補ベクターをdpyrF株の細胞内にエレクトロポレーション法によって導入し、ダブルクロスオーバーの相同組換えによって、dpyrF株の染色体にカナマイシン耐性遺伝子を組み込むことを目的とした。
dpyrF株は完全合成培地(表22A)+終濃度0.01g/Lのウラシルに植菌し、H2+CO2を炭素源として55℃で培養した。OD600=0.1前後まで培養した。
培養液を遠心分離(5800×g、10min)し、菌体を集菌した。
上清を捨て、272mMスクロースバッファー10mLに再懸濁し、遠心分離(5800×g、10min)により集菌した。この操作を2回繰り返した。
洗浄終了後、272mMスクロースバッファー5mLに菌体を再懸濁し、そこから400μLをキュベットに分注した。さらにkanr導入用ベクターを加えた。
1.5kV、500Ω、50μFでパルスを与えた。
パルスを与えた懸濁液を、2分間氷上の静置した後、5mlの完全合成培地+終濃度0.01g/Lのウラシル+終濃度5g/Lのフルクトースの入ったバイアルに植菌した。
55℃で48時間キュアリングを行った。
キュアリング後、ロールチューブにより、kanr導入候補株の単離を行った。その結果、kanr導入候補株を1株得た。
kanr導入候補株を液体培養し、十分に増殖したところで、培養液を1mL採取した。
培養液を遠心分離(15000rpm、2min)し、上清を捨てた。
残った菌体ペレットから、NucleoSpin Tissue(タカラバイオ)を用いて、ゲノムを抽出した。抽出方法は添付のマニュアルに従った。
また、野生株である、M. thermoacetica ATCC 39073株からも同様にしてゲノムを抽出した。
(試験1)野生株およびkanr導入候補株(組換株1、組換株2)のゲノムDNAを、それぞれ鋳型として、プライマーpyrF−upup−F(配列番号26)とkanR−into−R(配列番号27)との組合せを用いて、以下の条件によりPCR増幅を行い、pyrF上流領域からカナマイシン耐性遺伝子部分を増幅した。kanr導入株では約3.8kbpのPCR産物が得られるが、野生株ではPCR増幅されない。PCR反応液の組成を表30に、PCR反応条件を表31に示す。なお、KOD FX(PCR酵素)、2× PCR バッファー for KOD FXおよび2mM dNTPsは、KOD FX(東洋紡社製)に含まれるものを用いた。
kanr導入候補株(レーン2,3)では、約3.8kbpのPCR増幅産物のバンドが確認された。一方、野生株(レーン1)ではPCR増幅産物のバンドは確認されなかった。
野生株(レーン4)およびkanr導入候補株(レーン5、6)のすべてで、約2.3kbpのPCR増幅産物のバンドが確認された。
野生株(レーン1)では約4.7kbpの、kanr導入候補株(レーン2、3)では約5.5kbpのPCR産物が得られた。
野生株(レーン4)では、541bp、895bp、956bpおよび2298bpの制限酵素消化断片が得られ、kanr導入候補株(レーン5、6)では、541bp、895bp、956bpおよび3097bpの制限酵素消化断片が得られた。
得られたkanr導入株(MTA−kanr株)のカナマイシン耐性が表現形質として発現しているか否かを確認するため、以下の試験を行った。
(1)材料
野生株1株(ATCC 39073株)および得られたkanr導入株1株(組換株1、組換株2の2連)を用いた。
(2)方法
(前培養)
野生株および組換株(組換株1、組換株2の2連)を、それぞれ、完全合成培地(表22A)にフルクトースを終濃度5g/Lで添加した液体培地で、OD600=0.5〜0.8になるまで、55℃で嫌気培養した。
(試験1)
培養した菌体を、それぞれ、完全合成培地(表22A)にフルクトースを終濃度5g/Lで、カナマイシンを終濃度200μg/mLまたは300μg/mLで、それぞれ添加した液体培地に植菌し、OD600を20時間ごとに計測しながら、55℃で嫌気培養した。
(試験2)
培養した菌体を、完全合成(表22A)にAgar高温用20g/Lおよびカナマイシン200μg/mL(終濃度)で添加した寒天培地を用いて嫌気性ロールチューブ法により、55℃で培養した。
(試験1)
培養時間(hour)に対してOD600測定値をプロットしたグラフを図3(A)(カナマイシン濃度:200μg/mL)および図3(B)(カナマイシン濃度:300μg/mL)に示す。
カナマイシン濃度200μg/mLおよび300μg/mLのいずれにおいても、野生株は増殖が確認されなかったが、kanr導入株(組換株1、組換株2の2連)は増殖が確認された。
(試験2)
野生株ではコロニーの形成が確認できなかったが、kanr導入株(組換株1、組換株2の2連)ではコロニーの形成が確認できた。
kanr導入株(MTA−kanr株)はカナマイシン耐性を表現形質として発現していることが確認できた。
配列番号1:カナマイシン耐性遺伝子産物のアミノ酸配列
配列番号2:カナマイシン耐性遺伝子のDNA塩基配列
配列番号3:G3PDプロモーター領域のDNA塩基配列
配列番号4:pyrF遺伝子産物のアミノ酸配列
配列番号5:pyrF遺伝子のDNA塩基配列
配列番号6:プライマー pyrF−up−F1
配列番号7:プライマー pyrF−up−R1
配列番号8:プライマー pyrF−dn−F1
配列番号9:プライマー pyrF−dn−R1
配列番号10:プライマー pyrF−up−F2
配列番号11:プライマー pyrF−dn−R2
配列番号12:プライマー pyrF−up−F3
配列番号13:プライマー pyrF−dn−R3
配列番号14:プライマー pyrF−F
配列番号15:プライマー pyrF−R
配列番号16:プライマー pyrF−1765−F
配列番号17:プライマー pyrF−1764−R
配列番号18:プライマー G3PD−F11
配列番号19:プライマー G3PD−SD−R12
配列番号20:プライマー ldh−F−1
配列番号21:プライマー ldh−R−1
配列番号22:プライマー kanR−in−F2
配列番号23:プライマー kanR−in−R
配列番号24:プライマー pyrF−ldh−inv−F
配列番号25:プライマー pyrF−ldh−inv−R
配列番号26:プライマー pyrF−upup−F
配列番号27:プライマー kanR−into−R
配列番号28:プライマー pyrF−dndn−R
配列番号29:プライマー M2281−F
配列番号30:プライマー M2281−R
受託番号:NITE P−1057
寄託日:2011年 2月15日
受託機関:独立行政法人製品技術評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター(NPMD)
識別の表示:MTA−kanr
受領番号:NITE AP−1354
受領日:2012年 5月2日
受託機関:独立行政法人製品技術評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター(NPMD)
Claims (30)
- オロチジン−5’−リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子(pyrF)を標的遺伝子とし、宿主モーレラ属細菌で発現する抗生物質耐性遺伝子を相同組換えによって前記宿主モーレラ属細菌のゲノムに組み込む工程
を備える、モーレラ(Moorella)属細菌の遺伝子組換え方法。 - 前記相同組換えが、前記宿主モーレラ属細菌のオロチジン−5’−リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子(pyrF)の上流領域の塩基配列および下流領域の塩基配列と、前記抗生物質耐性遺伝子の塩基配列と、前記宿主モーレラ属細菌またはその同一種のモーレラ属細菌に由来するグリセルアルデヒド−3−リン酸デカルボキシラーゼ(G3PD)プロモーター領域の塩基配列とを含み、前記薬剤耐性遺伝子が前記上流領域、前記下流領域または前記上流領域と前記下流領域との間に配置され、かつ、前記薬剤耐性遺伝子および前記G3PDプロモーター領域が前記G3PDプロモーター領域に含まれるG3PDプロモーターによって前記薬剤耐性遺伝子が発現されるように連結された相同組換用ベクターを用いて行われる、請求項1に記載のモーレラ属細菌の遺伝子組換え方法。
- 前記相同組換用ベクターが、前記宿主モーレラ属細菌またはその同一種のモーレラ属細菌のオロチジン−5’−リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子(pyrF)の塩基配列をさらに含み、
前記pyrFが前記上流領域と前記下流領域との間に配置され、かつ、
前記pyrFがその本来の発現プロモーターによって発現されるように連結された相同組換えベクターを用いて行われる、請求項2に記載のモーレラ属細菌の遺伝子組換え方法。 - 前記相同組換用ベクターが、外来遺伝子の塩基配列をさらに含み、
前記外来遺伝子が前記G3PDプロモーターによって発現される、請求項2または3に記載のモーレラ属細菌の遺伝子組換え方法。 - 前記相同組換用ベクターが、外来遺伝子の塩基配列と、宿主モーレラ属細菌またはその同一種のモーレラ属細菌に由来する発現プロモーター領域の塩基配列とをさらに含み、
前記外来遺伝子が前記発現プロモーター領域に含まれる発現プロモーターによって発現される、請求項2または3に記載のモーレラ属細菌の遺伝子組換え方法。 - 前記発現プロモーターが、COデヒドロゲナーゼプロモーター、プロリルtRNAシンターゼプロモーターおよびグリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼプロモーターからなる群から選択されるいずれか一つである、請求項5に記載の方法。
- 前記外来遺伝子が、エタノール合成系に関与する遺伝子またはピルビン酸合成系に関与する遺伝子である、請求項4〜6のいずれかに記載の方法。
- 前記抗生物質耐性遺伝子が、カナマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、エリスロマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子およびピューロマイシン耐性遺伝子からなる群から選択される少なくとも1つである、請求項1〜7のいずれかに記載の方法。
- 請求項1〜8のいずれかに記載の方法によって得られる遺伝子組換えモーレラ属細菌。
- オロチジン−5’−リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子(pyrF)の上流領域、下流領域または上流領域と下流領域との間に、抗生物質耐性遺伝子が配置され、前記抗生物質耐性遺伝子の上流に、宿主モーレラ属細菌またはその同一種のモーレラ属細菌に由来するグリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼ(G3PD)プロモーターが配置され、前記抗生物質耐性遺伝子が前記G3PDプロモーターによって発現される、遺伝子組換えモーレラ属細菌。
- さらに、前記G3PDプロモーターの下流、かつ、前記抗生物質耐性遺伝子の上流または下流に、外来遺伝子が位置し、前記G3PDプロモーターによって前記外来遺伝子が発現される、請求項10に記載の遺伝子組換えモーレラ属細菌。
- さらに、前記G3PDプロモーターと前記抗生物質耐性遺伝子との間を除く、前記pyrFの上流または下流に、宿主モーレラ属細菌と同一種のモーレラ属細菌に由来する発現プロモーターと、外来遺伝子とが位置し、前記発現プロモーターによって前記外来遺伝子が発現される、請求項10に記載の遺伝子組換えモーレラ属細菌。
- 前記発現プロモーターが、COデヒドロゲナーゼプロモーター、プロリルtRNAシンターゼプロモーターおよびグリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼプロモーターからなる群から選択されるいずれか一つである、請求項12に記載の遺伝子組換えモーレラ属細菌。
- 前記外来遺伝子が、エタノール合成系に関与する遺伝子またはピルビン酸合成系に関与する遺伝子である、請求項11〜13のいずれかに記載の遺伝子組換えモーレラ属細菌。
- 前記抗生物質耐性遺伝子が、カナマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、エリスロマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子およびピューロマイシン耐性遺伝子からなる群から選択される少なくとも1つである、請求項10〜14のいずれかに記載の遺伝子組換えモーレラ属細菌。
- オロチジン−5’−リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子(pyrF)を標的遺伝子とし、宿主モーレラ属細菌で発現する抗生物質耐性遺伝子を相同組換えによって前記宿主モーレラ属細菌のゲノムに組み込むための、相同組換用ベクター。
- 前記宿主モーレラ属細菌のオロチジン−5’−リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子(pyrF)の上流領域の塩基配列および下流領域の塩基配列と、前記抗生物質耐性遺伝子の塩基配列と、前記宿主モーレラ属細菌またはその同一種のモーレラ属細菌に由来するグリセルアルデヒド−3−リン酸デカルボキシラーゼ(G3PD)プロモーター領域の塩基配列とを含み、前記薬剤耐性遺伝子が前記上流領域、前記下流領域または前記上流領域と前記下流領域との間に配置され、かつ、前記薬剤耐性遺伝子および前記G3PDプロモーター領域が前記G3PDプロモーター領域に含まれるG3PDプロモーターによって前記薬剤耐性遺伝子が発現されるように連結された、請求項16に記載のベクター。
- 前記相同組換用ベクターが、外来遺伝子をさらに含み、かつ前記外来遺伝子が前記G3PDプロモーターによって発現される、請求項17に記載のベクター。
- 前記相同組換用ベクターが、外来遺伝子と、宿主モーレラ属細菌と同一種のモーレラ属細菌に由来する発現プロモーターとをさらに含み、
前記外来遺伝子が前記発現プロモーターによって発現される、請求項17に記載のベクター。 - 前記発現プロモーターが、COデヒドロゲナーゼプロモーター、プロリルtRNAシンターゼプロモーターおよびグリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼプロモーターからなる群から選択されるいずれか一つである、請求項19に記載のベクター。
- 前記外来遺伝子が、エタノール合成系に関与する遺伝子またはピルビン酸合成系に関与する遺伝子である、請求項18〜20のいずれかに記載のベクター。
- 前記抗生物質耐性遺伝子が、カナマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、エリスロマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子およびピューロマイシン耐性遺伝子からなる群から選択される少なくとも1つである、請求項16〜21のいずれかに記載のベクター。
- 宿主モーレラ属細菌と同一株またはその野生株のモーレラ属細菌および大腸菌で増殖可能なシャトルベクターである、請求項16〜22のいずれかに記載のベクター。
- オロチジン−5’−リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子(pyrF)、pyrFの上流領域および下流領域、抗生物質耐性遺伝子ならびにグリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター(G3PDプロモーター)を含み、前記G3PDプロモーターおよび前記抗生物質耐性遺伝子が前記抗生物質耐性遺伝子が前記G3PDプロモーターによって発現されるように配置され、前記G3PDプロモーターおよび前記抗生物質耐性遺伝子が前記pyrFの上流領域、下流領域または上流領域と下流領域との間に配置される相同組換え領域を、骨格となるプラスミドベクターに組み込む工程を備える、モーレラ属細菌の遺伝子組換えに用いるための相同組換用ベクターの作製方法。
- 前記相同組換え領域が、外来遺伝子をさらに含み、
前記外来遺伝子が前記G3PDプロモーターによって発現されるように配置される、請求項24に記載の相同組換用ベクターの作製方法。 - 前記相同組換え領域が、外来遺伝子と、宿主モーレラ属細菌と同一種のモーレラ属細菌に由来する発現プロモーターとをさらに含み、
前記外来遺伝子が前記発現プロモーターによって発現されるように配置され、前記外来遺伝子および前記発現プロモーターが前記pyrFの上流または下流に配置される、請求項24に記載の相同組換用ベクターの作製方法。 - 前記発現プロモーターが、COデヒドロゲナーゼプロモーター、プロリルtRNAシンターゼプロモーターおよびグリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼプロモーターからなる群から選択されるいずれか一つである、請求項26に記載の相同組換用ベクターの作製方法。
- 前記外来遺伝子が、エタノール合成系に関与する遺伝子またはピルビン酸合成系に関与する遺伝子である、請求項25〜27のいずれかに記載の相同組換用ベクターの作製方法。
- 前記抗生物質耐性遺伝子が、カナマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、エリスロマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子およびピューロマイシン耐性遺伝子からなる群から選択される少なくとも1つである、請求項24〜28のいずれかに記載の相同組換用ベクターの作製方法。
- 前記プラスミドベクターがシャトルベクターである、請求項24〜29のいずれかに記載の相同組換用ベクターの作製方法。
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Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2001204468A (ja) * | 2000-01-27 | 2001-07-31 | Toyota Motor Corp | 耐酸性乳酸生成微生物 |
WO2005033324A1 (ja) * | 2003-09-30 | 2005-04-14 | Mitsui Chemicals, Inc. | D−乳酸菌生産用生体触媒 |
JP2009536019A (ja) * | 2006-05-08 | 2009-10-08 | サントリーホールディングス株式会社 | 脂肪酸合成酵素及びそれをコードするポリヌクレオチド並びにその利用 |
JP2010017131A (ja) * | 2008-07-10 | 2010-01-28 | Mitsui Eng & Shipbuild Co Ltd | モーレラ属細菌及びプライマー |
WO2011019717A1 (en) * | 2009-08-10 | 2011-02-17 | Mascoma Corporation | Positive and negative selectable markers for use in thermophilic organisms |
WO2011034822A1 (en) * | 2009-09-15 | 2011-03-24 | Bhami Shenoy | Protein a crystals and cross-linked crystals and methods of use thereof |
-
2012
- 2012-05-25 JP JP2012119501A patent/JP5963538B2/ja active Active
Patent Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2001204468A (ja) * | 2000-01-27 | 2001-07-31 | Toyota Motor Corp | 耐酸性乳酸生成微生物 |
WO2005033324A1 (ja) * | 2003-09-30 | 2005-04-14 | Mitsui Chemicals, Inc. | D−乳酸菌生産用生体触媒 |
JP2009536019A (ja) * | 2006-05-08 | 2009-10-08 | サントリーホールディングス株式会社 | 脂肪酸合成酵素及びそれをコードするポリヌクレオチド並びにその利用 |
JP2010017131A (ja) * | 2008-07-10 | 2010-01-28 | Mitsui Eng & Shipbuild Co Ltd | モーレラ属細菌及びプライマー |
WO2011019717A1 (en) * | 2009-08-10 | 2011-02-17 | Mascoma Corporation | Positive and negative selectable markers for use in thermophilic organisms |
WO2011034822A1 (en) * | 2009-09-15 | 2011-03-24 | Bhami Shenoy | Protein a crystals and cross-linked crystals and methods of use thereof |
Non-Patent Citations (4)
Title |
---|
JPN6016006088; '合成ガス資化性好熱性細菌Moorella thermoaceticaにおける遺伝子組換え技術の開発' 日本生物工学会大会講演要旨集(第63回) , 2011, p.149, 2Fa02 * |
JPN6016006089; FEMS Microbiology Letters vol.148, 1997, pp.163-167 * |
JPN6016006091; APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY vol.70 no.2, 2004, pp.883-890 * |
JPN6016006093; '好熱性嫌気性細菌Moorella sp. HUC22-1に対する遺伝子導入系の開発' 日本生物工学会大会講演要旨集(平成20年度) , 2008, p.143, 2Ep12 * |
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Publication number | Publication date |
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