JP6092501B2 - ウラシル要求性モーレラ属細菌及び形質転換遺伝子導入モーレラ属細菌 - Google Patents
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Description
モーレラ属細菌における染色体上のpyrFが破壊されてなるMTA−D−pF株(受託番号:NITE P−1057)であるウラシル要求性モーレラ属細菌のpyrFが破壊された部位に、pyrFと形質転換遺伝子とを導入してなることを特徴とする形質転換遺伝子導入モーレラ属細菌。
改変型ATCC 1754 PETC 寒天培地(※1)において、嫌気的、55℃、
培養日数3〜5日で直径3〜5mmの円形コロニーを形成する。
ii)表面の形状:スムーズ
iii)透明度:不透明
NH4Cl 1.0g
KCl 0.1g
MgSO4 0.2g
NaCl 0.8g
KH2PO4 0.1g
CaCl2 0.02g
Yeast Extract 1.0g
(Yeast Extract無添加の場合 Uracil 0.01g)
NaHCO3 2.0g
Cysteine−HCl 0.3g
Trace element solution(I) 10ml
Vitamin solution (II) 10ml
Distilled water 1000ml
(Agar(高温用) 20g)
(Fructose 5.0g)
pH 5.9(滅菌前)
滅菌温度・時間 121℃ 15分
Nitrilotriacetic acid 2.0g
MnSO4・H2O 1.0g
Fe(SO4)2(NH4)2・6H2O 0.8g
CoCl2・6H2O 0.2g
ZnSO4・7H2O 0.0002g
CuCl2・2H2O 0.02g
NiCl2・6H2O 0.02g
Na2MoO4・2H2O 0.02g
Na2SeO4 0.02g
Na2WO4 0.02g
Distilled water 1000ml
(II)Vitamin solution
Biotin 2.0mg
Folic acid 2.0mg
Pyridoxine−HCl 10mg
Thiamine−HCl 5.0mg
Riboflavin 5.0mg
Nicotinic acid 5.0mg
D−Ca−pantothenate 5.0mg
Vitamin B12 0.1mg
p−Aminobenzoic acid 5.0mg
Thioctic acid 5.0mg
Distilled water 1000ml
以下、モーレラ属細菌に対して使用する培地、試薬等は全て嫌気的、無菌的に調製したものを用い、また操作は嫌気雰囲気下で行った。
以下の手順で、Moorella thermoacetica ATCC 39073株のorotidine-5'-phosphate decarboxylase遺伝子pyrFを破壊するためのベクターを構築した。
まず、表1に示したプライマーpyrF-up-F1(配列番号1)及びpyrF-up-R1(配列番号2)、並びに、pyrF-dn-F1(配列番号3)及びpyrF-dn-R1(配列番号4)の組み合わせを用いて、表2に示す条件でPCRを行い、pyrF遺伝子の上流及び下流それぞれ約1000 bpを増幅した。
上記(pyrF遺伝子破壊ベクターpk18-dpryFの構築)で生育が見られたコロニーを、カナマイシンを添加したLB培地に移植した後、コロニーダイレクトPCRを行い、インサートの確認を行った。プライマーは表1に示すpyrF-up-F1(配列番号1)、pyrF-dn-R1(配列番号4)を用いた。コロニーダイレクトPCRの条件を表4に示す。
1.1.で構築したpyrF遺伝子破壊ベクターpk18-dpryFを、以下の手順で、M. thermoacetica ATCC 39073株に導入し、ダブルクロスオーバーの相同性組換えによってpyrF遺伝子が破壊された株(ΔpyrF株)を選抜した。
272mMスクロース、16mM HEPESの組成で、水酸化カリウムを用いてpH 7に合わせたHS bufferを調製し、20分間煮沸した後、さらに20分間N2ガスで置換した。
上記寒天培地に形成された20個のコロニーを、5 mlのウラシル10μg/ml、5−FOA 0.2%の終濃度で添加した液体培地に植菌し、培養3日目に培地が濁っていることが確認できた6株を選択し、培養液1mlを集菌した。
ロールチューブ法によるコロニー形成を試みた結果、多数のコロニーを得た。そこで、コロニーを20株選択し、液体培地(10μg/mlウラシル、0.2% 5−FOA)にて培養した。菌体の生育が確認できた培養液から菌体を集菌し、ダイレクトPCRによる確認を行った。
以下の手順で、M. thermoacetica ATCC 39073 pyrF遺伝子破壊株(ΔpyrF株)の相補試験を行うために、pyrF遺伝子相補ベクターを構築した。
表1に示したプライマーpyrF-up-F1(配列番号1)とpyrF-dn-R1(配列番号4)の組み合わせを用いて、表7に示す条件でPCRを行い、pyrF遺伝子翻訳領域とその5’側の約1000bp、3’側の約1000bpを含む約2.7kbpの遺伝子断片を増幅した。
上記で生育が見られたコロニーをアンピシリン、あるいはカナマイシンを添加したLB寒天培地に移植した後、コロニーダイレクトPCRを行い、インサートの確認を行った。プライマーは表1に示すpyrF-up-F1(配列番号1)、pyrF-dn-R1(配列番号4)を用いた。コロニーダイレクトPCRの条件を表8に示す。
以下の手順で、1.2.で構築したM. thermoacetica ATCC 39073 pyrF遺伝子破壊株(ΔpyrF株)に、2.1.で構築したpyrF遺伝子相補ベクターpBS-epyrFを導入し、相同組換えによる相補試験を行った。
272mMスクロース、16mM HEPESの組成で、水酸化カリウムを用いてpH 6.7に合わせたHS bufferを調製し、20分間煮沸した後、さらに20分間N2ガスで置換した。
上記で得られたコロニーを5mlの完全合成培地に植菌し、培養4日目に培地が濁っているサンプルを選択し、培養液1mlを集菌した。
培養4日目で培養液が白く濁っていたサンプル4株についてダイレクトPCRによる確認を実施した。結果を図4に示す。
ΔpyrF株に対するpyrF遺伝子相補試験を行う際に、pyrF上流に形質転換遺伝子の一部を挿入し、相同組換えによる染色体加工が可能であることを示すためのプラスミドを構築する。具体的には、Thermoanaerobacter ethanolicus 39E株のlacZ遺伝子の一部(約500bp)を2.1.で構築したpyrF遺伝子相補ベクターpK18-epyrFのpyrF遺伝子上流へ挿入した。手順を以下に示す。
表10に示すプライマーpyrF-1-R(配列番号11)及びpyrF-1-F(配列番号12)、pyrF-2-R(配列番号13)及びpyrF-2-F(配列番号14)、又は、pyrF-3-R(配列番号15)及びpyrF-3-F(配列番号16)の各組み合わせを用いて、pyrF遺伝子領域を含むベクター領域をPCR増幅した。何れの組合せにおいても、PCRの条件は表11に示した通りである。
pyrFの上流領域へlacZ遺伝子の一部を挿入するために、2.1.で構築したpK18-epyrFを鋳型とし、プライマーpyrF-1-R及びpyrF-1-F、pyrF-2-R及びpyrF-2-F、又は、pyrF-3-R及びpyrF-3-Fの組み合わせを用いてインバースPCRを行った。その際に、プロモーター領域が300bp、203bp、147bpとなるようにプライマーの位置をずらして3パターンのPCR産物を得た(図5及び図6)。さらに、In−Fusion PCRを用いてプラスミドへlacZ遺伝子を挿入するため、プライマーにはlacZ遺伝子と相同配列を付加しておいた。表10において配列番号11〜16のSequence下線部はプロモーター領域である。下線以外の部分がプライマーの位置を決める配列であり、配列番号11は図6における丸囲み数字1、配列番号12は図6における丸囲み数字2、配列番号13は図6における丸囲み数字3、配列番号14は図6における丸囲み数字4、配列番号15は図6における丸囲み数字5、配列番号16は図6における丸囲み数字6に、矢印の向きで対応している。
以下の手順で、1.2.で構築したM. thermoacetica ATCC 39073 pyrF遺伝子破壊株(ΔpyrF株)に、3.1.で構築した形質転換DNA挿入用相補ベクターpK18-pyz-1、pK18-pyz-2、pK18-pyz-3を導入し、相同組換えによる相補試験を行った。
272mMスクロース、16mM HEPESの組成で、水酸化カリウムを用いてpH 6.7に合わせたHS bufferを調製し、20分間煮沸した後、さらに20分間N2ガスで置換した。
上記で得られたコロニーを5mlの完全合成培地に植菌し、培養後に培地が濁っているサンプルを選択し、培養液1mlを集菌した。
計20コロニー取得し、そのうち8株についてダイレクトPCRによる確認を実施した(図8)。
Claims (1)
- モーレラ属細菌における染色体上のpyrFが破壊されてなるMTA−D−pF株(受託番号:NITE P−1057)であるウラシル要求性モーレラ属細菌のpyrFが破壊された部位に、pyrFと形質転換遺伝子とを導入してなることを特徴とする形質転換遺伝子導入モーレラ属細菌。
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