KR101326583B1 - 고광학순도의 젖산 생산용 형질전환체 및 이를 이용한 젖산 생산 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 미생물을 이용한 젖산의 생물학적 생산 방법에 관한 것으로, 간편하고 경제적인 방법으로 고광학순도의 젖산을 고수율로 생산할 수 있는 형질전환체, 이의 제조방법 및 이를 이용한 젖산 생산 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따라, pH 조건 등 생산 조건의 엄격한 제한이나 미생물 내 대사 경로의 복잡한 조절 없이도 간편하게 고광학순도의 젖산을 고수율로 생산할 수 있으며, 또한 별도의 부가적인 젖산 분리 정제 공정이 필요하지 않으므로 젖산 생산 단계를 현저히 줄일 수 있어 생산 비용을 크게 절감할 수 있을 뿐만 아니라, 침전 폐기물로 인한 환경적인 문제를 배제할 수 있어 환경 보호 효과 또한 얻을 수 있다.

Description

고광학순도의 젖산 생산용 형질전환체 및 이를 이용한 젖산 생산 방법{TRANSFORMANT FOR PRODUCTION OF LACTATE/LACTIC ACID WITH HIGH OPTICAL PURITY, AND PREPARING METHOD OF LACTATE/LACTIC ACID USING THEREOF}

본 발명은 미생물을 이용한 젖산의 생물학적 생산 방법에 관한 것으로, 간편하고 경제적인 방법으로 고광학순도의 젖산을 고수율로 생산할 수 있는 형질전환체, 이의 제조방법 및 이를 이용한 젖산 생산 방법에 관한 것이다.

폴리젖산(PLA)은 상업적으로 생산되는 바이오플라스틱(bio-plastic)의 원료로서 락타이드(lactide)의 축합중합(condensation)에 의해 생성되는 지방족 폴리에스테르(polyester)이다. PLA는 전자제품 포장재, 생수병, 자동차 내장재, 사무용 가구, 엔지니어링 플라스틱, 섬유 분야 등의 아주 중요한 용도를 갖고 있어 미래의 대표적인 생분해성 바이오플라스틱으로 각광을 받고 있다. 특히 근래에 전세계적으로 활발히 전개되고 있는 「지구환경보호운동」과 더불어 지구온난화, 기후변화에 대한 환경친화적인 차세대 대체 섬유 소재의 필요성이 대두됨에 따라, 천연적으로 재활용이 가능하고 오염물질을 배출하지 않으며, 합성섬유와 유사한 물리화학적 성질 및 기계적 성질을 가지면서 생분해가 가능한 PLA 생분해성 섬유는 무한한 잠재력을 가지고 있다고 볼 수 있다. 이러한 잠재력이 있음에도 불구하고 생분해성 섬유는 아직 일반합성섬유에 비해 5∼10배 정도 생산단가가 높고 대량 생산을 하는데 어려움이 많을 뿐 아니라 특성에 따른 용도개발이 이루어져 있지 않아 그 실용화가 미미한 실정이다.

젖산(lactic acid/lactate)은 의약품(medicine), 식품(food and food processing), 화장품(cosmetics), 화학 제품(chemical substances) 등의 다양한 분야의 실용 가능한 원료 물질(commodity chemical)로 널리 알려져 왔다. 최근에는 생분해성 고분자(biodegradable polymer)인 폴리젖산(polylactic acid, PLA)의 원료로서도 주목을 받고 있으며, 사용량의 급격한 증가 추세와 함께 관련 기술 개발이 활발이 진행되고 있다.

젖산은 생물체내에서 탄수화물이 산화된 피부르산(pyruvate)의 환원으로 lactate dehydrogenase 효소에 의해 생산 된다. 젖산은 L-(+)-Lactic acid와 D-(-)-lactic acid의 광학 이성질체(enantiomer)를 갖는 특성을 갖고 있으며, 화학 합성 방법에 의해 생산되어 왔으나, 최근에는 미생물을 이용한 생물학적 생산 방법으로의 전환 기술을 통해 직접 생산하고 있다.

일반적으로 젖산 발효 생산은 (1) 발효, (2) 세포 균체 및 단백질 제거, (3) 젖산 분리 및 정제, (4) 젖산 농축, (5) 탈색의 5 단계로 구성된다. 젖산 발효 생산 기술은 대부분 신규 젖산 생산 공정 개발과 지속적인 개선을 통해 플랜트(plants)의 규모와 생산 효율 향상 등 생산 기술과 경제적인 증발 농축기(evaporator)와 멤브레인(membrane) 기술과 더불어 탈수 공정의 혁신적 진보와 같은 우수한 분리, 정제 기술 개발을 통한 분리정제 비용 절감과 효율 향상에 집중되어 왔다.

최근에는 다양한 시스템 분석 기술과 대사공학 기술을 활용한 온도, pH, 유기산물 생산에 탁월한 성능을 갖는 보다 우수한 발효 미생물 개발에 연구개발이 집중되고 있다. 그런데 현재 발효 생산되는 젖산은 석유로부터 생산되는 젖산에 비해 높은 광학 선택도(optical purity)와 순도의 젖산을 생산하기 위해 생산 단가가 증가되고, 여러 가지 응용 분야에 적합한 다양한 품질의 젖산 생산을 경제적으로 생산하는데 한계를 갖고 있다.

젖산 발효 생산은 석유화학 공정과 달리 젖산 생산 미생물에 절대적으로 의존적이기 때문에, 젖산을 대량으로 생산할 수 있는 것은 물론 생산 비용을 절감할 수 있도록 높은 광학 순도의 젖산을 생산 할 수 있는 미생물을 확보하는 것이 무엇보다 중요하다. 고순도 광학 선택도의 젖산을 대량 생산하기 위해서는 대량의 젖산 원료가 투입되어야 하고, 여러 단계의 분리 정제 공정이 필수적으로 요구되기 때문에 생산 단가는 급격하게 증가된다. 따라서 젖산을 대량으로 생산하는 것과 더불어 필수적으로 요구되는 기술이 고순도의 광학 선택도를 갖는 젖산 생산 미생물 균주를 개발하는 것이다. 이를 위해서는 우수한 광학 선택도를 갖는 젖산 생산 유전자 확보와 더불어 높은 광학 선택도의 대사 흐름을 최적화 할 수 있는 시스템 분석 기술과 고도의 대사 공학 기술이 필수적으로 요구된다.

일반적으로 미생물의 생존 조건은 중온(30-37℃)과 중성 pH(neutral pH 7.0) 조건이고, 미생물은 특히 pH에 매우 민감하며 협소한 pH 범위에서만 활발한 생존성과 생산성을 나타내는 특성이 있다. 그런데 약산성을 갖는 젖산을 생산하는 젖산 생산 공정에서는 젖산의 생산 자체로서 산도를 저하시켜 산성화하는 특성이 있으므로 최적 pH를 유지 하기 위해, NaOH, (NH₄)OH, Ca(OH)₂와 같은 염기(base) 또는 탄산염(CaCO₃)을 지속적으로 첨가함으로써 중성 발효 pH를 유지하는 것이 요구된다. 산도 7.0의 중성 pH에서의 젖산은 본질적으로 모두 이온화된다. 중성 pH에서 생산된 젖산염(lactate salt) 형태의 젖산을 분리 및 정제 하기 위해, 황산(sulfuric acid)과 같은 강산을 첨가하여 젖산염을 양이온화(protonation) 하는 공정이 필요하다. 이때 첨가된 황산 1몰은 2몰의 젖산을 생산하게 되는 반면, 1몰의 침전물(sulfate precipitant, eg. CaSO₄)을 동시에 생산하게 된다.

결과적으로 생산된 젖산의 양과 동량의 황산이 필요하다. 이는 보다 많은 젖산의 회수, 정제를 위해 투입되어야 하는 황산의 비용이 지속적으로 증가할 뿐만 아니라 그로 인해 생산되는 침전물의 처리 비용과 환경적인 문제를 야기시키는 비경제적인 공정으로 알려져 있다. 이를 개선하고 경제성을 확보하기 위해 높은 산도(산성 pH)에서도 젖산을 생산 할 수 있는 젖산 생산 미생물과 이러한 산성 조건에서 생성된 젖산(lactic acid) 또는 젖산염(lactate salt)의 침전 폐기물 생성 없이 회수, 정제 할 수 있는 기술이 절실히 요구되어 왔다.

이에 본 발명은 상기 종래기술의 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로서 pH 조건의 제한이나 미생물 내 대사 경로의 조절 없이도 고수율로 젖산을 생산할 수 있을 뿐만 아니라, 별도의 젖산 분리 정제 공정 없이도 높은 광학 순도의 젖산을 생산할 수 있는 형질전환체, 이의 제조방법 및 이를 이용한 젖산 생산 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기와 같은 과제를 해결하기 위하여 본 발명자들이 고광학순도의 젖산을 대량 생산 가능한 젖산 생산 미생물을 연구하던 중, 류코노스톡(Leuconostoc) 속 균주 유래의 D-락테이트 디하이드로게나제(D-lactate dehydrogenase)를 코딩하는 유전자를 자이모모나스 모빌리스(Zymomonas mobilis) 균주에 도입함으로써 별도의 복잡한 공정이나 생산 조건의 제약 없이 간편하며 경제적인 방법으로 D-락테이트 디하이드로게나제 효소 활성을 극대화할 수 있고, 나아가 고광학순도의 젖산 생산을 최대화 할 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명은 류코노스톡 속 균주 유래의 D-락테이트 디하이드로게나제를 코딩하는 유전자가 도입된 자이모모나스 모빌리스 형질전환체를 제공한다.

또한 본 발명은 자이모모나스 모빌리스 균주를 준비하는 단계; 및 상기 자이모모나스 모빌리스 균주에 류코노스톡 속 균주 유래의 D-락테이트 디하이드로게나제를 코딩하는 유전자를 도입하는 단계를 포함하는 자이모모나스 모빌리스 형질전환체 제조방법을 제공한다.

또한 본 발명은 류코노스톡 속 균주 유래의 D-락테이트 디하이드로게나제를 코딩하는 유전자를 자이모모나스 모빌리스 균주에 도입하여 자이모모나스 모빌리스 형질전환체를 제조하는 단계; 및

상기 제조된 자이모모나스 모빌리스 형질전환체를 배양하는 단계를 포함하는 젖산 생산 방법을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 젖산 생산 방법에 의해 생산된 고광학순도 젖산을 제공한다.

이하 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

젖산(lactate/lactic acid)은 카복시기·하이드록시기·메틸기·수소의 네 원자단이 결합한 비대칭 탄소원자를 가지는 유기화합물(화학식: C₃H₆O₃)로서 D-, L-, DL- 형의 광학이성질체를 모두 포함하며, 바람직하게는 D-형일 수 있다.

상기 젖산의 생산 수율을 높이기 위해 본 발명의 일 구현예는 류코노스톡(Leuconostoc) 속 균주 유래의 D-락테이트 디하이드로게나제를 코딩하는 유전자가 도입된 자이모모나스 모빌리스(Zymomonas mobilis) 형질전환체를 제공한다.

본 발명은 또한 자이모모나스 모빌리스(Zymomonas mobilis) 균주를 준비하는 단계; 및 상기 자이모모나스 모빌리스 균주에 류코노스톡(Leuconostoc) 속 균주 유래의 D-락테이트 디하이드로게나제를 코딩하는 유전자를 도입하는 단계를 포함하는 자이모모나스 모빌리스 형질전환체 제조방법을 제공한다.

상기 자이모모나스 모빌리스(Zymomonas mobilis) 균주는 알코올 발효균으로서 세포 생장에 비하여 산물 전환율이 우수한 균주이므로, D-락테이트 디하이드로게나제(D-lactate dehydrogenase)를 코딩하는 유전자를 도입하기에 바람직하다.

상기 자이모모나스 모빌리스(Zymomonas mobilis) 형질전환체를 이용함으로써 자이모모나스 모빌리스 균주의 대사 경로 중 어느 특정 대사 경로를 차단하여 상기 특정 대사 경로에서 생성되는 일차 대사산물 이외의 다른 일차 대사산물의 생산을 증가시키는 등의 복잡한 대사 경로의 조절 공정 없이도 매우 간단하고 용이한 공정을 통하여 젖산 생산을 현저히 향상시킬 수 있다.

본 명세서에서 ‘형질전환’은 원래의 세포가 가지고 있던 것과 다른 종류의 유전자가 있는 DNA사슬 조각 또는 플라스미드가 세포들 사이에 침투되어 원래 세포에 존재하던 DNA와 결합, 세포의 유전형질이 변화되는 분자생물학적 현상을 의미한다.

특히 본 발명에서 형질전환은 상기 D-락테이트 디하이드로게나제를 코딩하는 유전자를 자이모모나스 모빌리스 균주 내로 도입하는 것을 의미하고, ‘형질전환체’는 상기 유전자가 도입된 자이모모나스 모빌리스 균주를 의미하며, 바람직하게는 상기 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 유전자(Dldh-Lmes1801)가 도입된 기탁번호 KCTC 11803BP인 형질전환체이다.

상기 D-락테이트 디하이드로게나제를 코딩하는 유전자는 이에 제한되지 않으나 바람직하게는 류코노스톡 속 균주에서 유래된 것일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 펩티드 또는 상기 서열번호 2의 아미노산 서열과 아미노산 일치도(identity,%)가 40% 이상인 펩티드를 코딩하는 유전자일 수 있다.

바람직하게는 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 또는 서열번호 8의 아미노산 서열로 표시되는 펩티드를 코딩하는 유전자일 수 있다.

상기 서열번호 2의 아미노산 서열은 서열번호 1의 염기서열에 의해 암호화되고, 상기 서열번호 4의 아미노산 서열은 서열번호 3의 염기서열에 의해 암호화되고, 상기 서열번호 6의 아미노산 서열은 서열번호 5의 염기서열에 의해 암호화되며, 상기 서열번호 8의 아미노산 서열은 서열번호 7의 염기서열에 의해 암호화되는 것일 수 있다.

따라서 상기 D-락테이트 디하이드로게나제를 코딩하는 유전자는 이에 제한되지 않으나, 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 유전자 또는 상기 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 유전자와 염기서열 유사도(similarity,%)가 85% 이상인 유전자일 수 있다.

바람직하게는 상기 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 유전자(Dldh-Lmes1801), 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 유전자(ldhD-ATCC19254), 서열번호 5의 염기서열로 표시되는 유전자(ldhD1-LMG18811), 또는 서열번호 7의 염기서열로 표시되는 유전자(D-ldh-NBRC3426)일 수 있다.

상기 유전자의 도입은 이에 제한되지 않지만 바람직하게는 접합(conjugation), 전기천공법(electroporation), 및 유전자총 방법(gene gun)으로 이루어진 군에서 선택된 방법을 사용할 수 있다.

상기 접합(conjugation)은 세포간(donor cell, recipient cell)의 세포 표면의 접합성 선모(conjugative pili)를 통한 DNA 전달 기작을 통해 유전자를 도입하는 방법이다(Lederberg and Tatum, Nature. Oct 19;158(4016):pp.558. 1946).

상기 전기천공법(electroporation)은 세포에 전기 충격을 주어 세포막에 일시적으로 작은 구멍이 생기도록 하여 세포의 DNA 흡수를 증가시키는 방법이며(Neumann et al., The EMBO Joumal Vol.1 No.7 pp.841-845, 1982; Cellular & Molecular Biology Letters, pp 849-858, 2002 참조), 상기 유전자총 방법은 유전자를 금속 (텅스텐 또는 금) 입자에 코팅한 후, 고압가스의 힘으로 발사하여 유전자를 도입하는 방법이다(Cellular & Molecular Biology Letters, pp 849-858, 2002 참조).

상기 유전자의 자이모모나스 모빌리스 균주 내 도입 위치는 특별히 제한되지 않고, 도입되는 위치와 무관하게 고광학순도의 젖산을 높은 수율과 효율로 생산할 수 있다. 따라서 매우 간단하고 편리할 뿐 아니라 비용 절감의 효과가 있다.

즉, 자이모모나스 모빌리스 균주의 대사 경로와 관련이 없는 유전자 또는 이의 주변 지역에 도입할 수 있음은 물론이고, 본 발명에 따르면 자이모모나스 모빌리스 균주의 대사 경로의 조절이 필요치 않고 대사 경로에 대한 영향 여부와도 무관하므로 대사 경로와 관련된 유전자 위치에 도입하는 것도 가능하다.

예컨대, 자이모모나스 모빌리스 균주의 게놈 내, ORF ZMO270~ZMO263, ORF ZMO0087~ZMO0089, ORF ZMO0381~ZMO0384, ORF ZMO0390~ZMO0394 또는 ORF ZMO1786~ZMO1789 부위에 도입할 수 있으며, 또는 대사 경로 관련 유전자인 L-락테이트 디하이드로게나제 (ZMO0256) 유전자, D-락테이트 디하이드로게나제 (ZMO1237), 알코올 디하이드로게나제 I (ZMO1236) 유전자, 또는 알코올 디하이드로게나제 II (ZMO1596) 유전자 위치에 도입할 수도 있다.

상기 D-락테이트 디하이드로게나제를 코딩하는 유전자는 자이모모나스 모빌리스 균주의 프로모터와 함께 벡터에 삽입하여 상기 자이모모나스 모빌리스 균주 내에 도입시킬 수 있다.

사용 가능한 벡터로는, 공지의 모든 종류의 벡터를 모두 포함하며, 예컨대 pGMC, pZY507, pZY500, 및 pZymo와 같은 자이모모나스 모빌리스 유전자 발현벡터뿐만 아니라, pUC series, pBluescript series, pGEM series 등과 같은 일반 클로닝용 벡터일 수 있다. 바람직하게는 상기 벡터는, 자이모모나스 모빌리스에서 조절 가능한 프로모터를 포함하며, 선별마커, 컨쥬게이터(conjugator) 등을 더욱 포함할 수 있다.

자이모모나스에서 강력하게 발현되는 프로모터는 통상의 재조합 단백질 발현에 사용되는 모든 종류의 프로모터일 수 있으며, 또는 자이모모나스 모빌리스 ZM4에서 유래한 프로모터를 사용할 수도 있다. 예컨대 ZM4 유래의 adhI (adhA, ZMO1236), pdc (pdc, ZMO1360) 또는 adhII 유전자 (adhB, ZMO1596)의 프로모터가 있으며 그 외에도 자이모모나스 모빌리스 ZM4 각각의 유전자 상위서열 500 bp가 프로모터로서 작용이 가능하다. 한편, 대장균에서 강력하게 발현되는 tac 프로모터 역시 자이모모나스에서 사용할 수 있다(Zhang et al., Science. 1995. Jan 13;267(5195):pp. 240-243).

선별마커는, 항생제 내성 유전자일 수 있으며, 스펙티노마이신 내성 유전자, 클로람페니콜 내성 유전자, 암피실린 내성 유전자, 테트라사이클린 내성 유전자 등이 사용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한 벡터는 숙주세포에 형질전환되어 에피소말(episomal)상태로 존재하는 경우, 복제에 필요한 복제 오리진(replication origin)이 요구된다. 복제 오리진으로는 대부분의 그램(-) 박테리아에서 작용하는 OriV origin이 있으며, 상기 origin에 작용하는 repA, repB 유전자가 더욱 요구될 수 있다.

상기 벡터는 미생물에 형질도입시, 미생물의 염색체에 삽입(integration)되거나 플라스미드 형태로 세포질내 존재할 수 있으며, 이는 벡터의 종류에 따라 적절히 조절할 수 있다. 염색체내에 벡터가 삽입되는 경우는 벡터 내에 자이모모나스 균주에서 복제에 필요한 복제 오리진이 없는 경우로 염색체내에 플라스미드와 상동성을 가지는 부분이 있는 경우 상동성이 있는 부분에 삽입(homologous recombination) 되어 동일한 유전자가 연속적으로 2 copy 존재(single cross over, gene integration)하거나 상동성 부위가 플라스미드의 상동성 부위로 대체되게 된다(double cross over, gene disruption). 만약 염색체내에 플라스미드와 상동성이 있는 부분이 존재하지 않는다면 무작위적인 삽입 (Random recombination)이 일어나게 된다.

또한 본 발명은 류코노스톡 속 균주 유래의 D-락테이트 디하이드로게나제를 코딩하는 유전자를 자이모모나스 모빌리스 균주에 도입하여 자이모모나스 모빌리스 형질전환체를 제조하는 단계; 및 상기 제조된 자이모모나스 모빌리스 형질전환체를 배양하는 단계를 포함하는 젖산 생산 방법을 제공한다.

상기 배양은 정상 발효 조건인 pH 5.0 에서는 물론이고, 산성 발효 조건이나 그 외 pH 비조절 조건에서도 제한 없이 수행할 수 있다. 예컨대, pH 3.0 내지 pH 7.0, 보다 구체적으로 pH 2.0 내지 pH 6.0, 또는 pH 3.0 내지 pH 5.0와 같은 산성 조건하에서도 젖산의 생산이 가능하다.

일반적으로 미생물의 생존 조건은 중온(30-37℃)과 중성 pH(neutral pH 7.0) 조건이고, 미생물은 특히 pH에 매우 민감하며 협소한 pH 범위에서만 활발한 생존성과 생산성을 나타내는 특성이 있는데, 약산성을 갖는 젖산을 생산하는 젖산 생산 공정에서는 젖산의 생산 자체로서 산도를 저하시켜 산성화하는 특성이 있으므로 최적 pH를 유지 하기 위해, NaOH, (NH₄)OH, Ca(OH)₂와 같은 염기(base) 또는 탄산염(CaCO₃)을 지속적으로 첨가함으로써 중성 발효 pH를 유지하는 것이 요구되었다. 그러나 본 발명의 젖산 생산 방법은 이와 같은 pH 조건의 제한 없이 어떠한 pH 조건에서도 높은 광학 순도의 젖산을 고수율로 생산할 수 있는 특징이 있어 매우 경제적이며 간편하게 젖산을 생산할 수 있다.

상기 젖산 방법에 의해 바람직하게는 70% 이상에서 높게는 100% 이상의 현저히 높은 생산 수율로 광학 순도가 높은 우수한 젖산을 대량 생산할 수 있다.

따라서 본 발명은 상기 젖산 생산 방법에 의해 생산된 고광학순도의 젖산을 제공한다.

상기 젖산 생산 방법에 의해 생산되는 젖산은 광학 순도가 95% 이상이며 높게는 99%, 보다 높게는 99.9% 이상의 현저히 우수한 광학 순도를 가질 수 있다.

본 발명에 따라, pH 조건 등 생산 조건의 엄격한 제한이나 미생물 내 대사 경로의 복잡한 조절 없이도 간편하게 고광학순도의 젖산을 고수율로 생산할 수 있는 자이모모나스 모빌리스(Zymomonas mobilis) 형질전환체, 이의 제조방법, 및 이를 이용한 젖산 생산 방법이 제공된다.

상기 형질전환체를 이용하면 별도의 부가적인 젖산 분리 정제 공정이 필요하지 않으므로 젖산 생산 단계를 현저히 줄일 수 있어 생산 비용을 크게 절감할 수 있을 뿐만 아니라, 침전 폐기물로 인한 환경적인 문제를 배제할 수 있어 환경 보호 효과 또한 얻을 수 있다.

도 1은 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 D-락테이트 디하이드로게나제를 코딩하는 유전자의 발현단위를 개략적으로 나타낸 것이다.
도 2는 실시예 1에서 제조된 pBS-del-270::263 벡터의 개열지도이다.
도 3은 실시예 1에서 제조된 pBS-del-270::sp-DlmesC2::263 벡터의 개열지도이다.

이하 본 발명의 이해를 돕기 위해 바람직한 실시예를 통해 더욱 상세히 설명하기로 한다. 다만, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 이에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. D- 락테이트 디하이드로게나제 유전자( DlmesC2 )가 도입된 ZM 형질전환체 제조

실시예 1-1. 플라스미드 pGEM -T- DlmesC2 제조

김치로부터 분리된 류코노스톡 메젠테로이데스(Leuconostoc mesenteroides)균주로부터 D-락테이트 디하이드로게나제 효소를 코딩하는 DlmesC2 유전자(1,068 bp)(서열번호 1)를 PCR 방법(96℃에서 5분간 전변성(pre-denaturation); 96℃에서 30초, 60℃에서 30초, 72℃에서 1분간 총 25 cycles; 72℃에서 7분간 후 신장(post extension))으로 0.1Unit의 High-Fidelity Platinum Taq DNA Polymerase (Roche)와 하기 기재된 프라이머를 사용하여 선택적으로 증폭, 분리하였다.

상기 PCR 공정에 사용된 프라이머는 아래와 같다.

정방향 프라이머 (DLmesC2F)(서열번호 : 9)

5-TGGAGGATCCCATGGTAAAGATTTTTGC-3

역방향 프라이머 (DLmesC2R)(서열번호 : 10)

5-TGTTTGATTATTCCTGCAGAAACCCCTC-3

이후, pGEM-T Easy vector(Promega)에 클로닝하여 DlmesC2 유전자가 클로닝된 플라스미드 pGEM-T-DlmesC2를 제조하고, 염기서열을 확인하였다. PCR 증폭과 클로닝은 제조사의 실험방법을 따랐다.

실시예 1-2. pBS - del -270:: sp - DlmesC2 ::263 벡터 제조

상기 실시예 1-1에서 제조된 플라스미드(pGEM-T-DlmesC2)를 제한효소 NcoI(NEB)와 PstI(NEB)으로 절단한 다음, 자이모모나스 모빌리스 알코올 디하이드로게나제(adh)II 유전자(adhB, ZMO1596)의 프로모터 부위(서열번호 11)와 스펙티노마이신 내성(spectinomycin resistant) 유전자(spec^R, 1,142bp)(서열번호 12)를 갖는 pBS-sp-P1596-spec^R 벡터(마크로젠)에 동일한 제한효소 자리로 클로닝하여 D-락테이트 디하이드로게나제 유전자(DlmesC2)를 포함하는 pBS-sp-DlmesC2 벡터를 얻었다.

D-락테이트 디하이드로게나제 유전자(DlmesC2)를 자이모모나스 모빌리스 유전체에 도입하기 위하여, 상동성 재조합(homologous recombination)(Alberts et al., 2002. "Chapter 5: DNA Replication, Repair, and Recombination". Molecular Biology of the Cell (4th ed.). New York: Garland Science. p. 845.)을 이용하였다.

상동성 재조합에 사용된 유전자는 자이모모나스 모빌리스(ATCC 31821)의 유전체 정보로부터 선별하였으며, 구체적으로 ORF ZMO0263부터 ZMO0270까지의 8개의 반복된 유전자들(서열번호 13~서열번호 20)을 선별하였다. ORF ZMO0263부터 ZMO0270까지의 반복된 유전자들은 특정 대사 효소를 코딩하지 않는 유전자들이었으며, 전체 약 10kb에 달하는 부위이다. 이들 유전자들의 상위 상동부위의 4,468 bp 유전자(서열번호 21)와 하위 상동부위의 4,935 bp 유전자(서열번호 22) 각각을 실시예 1과 동일한 실험 방법을 사용하여 각각 선택적으로 증폭, 분리한 다음, HindIII(NEB), PstI(NEB), PvuI(NEB), ScaI(NEB)으로 절단한 다음, 동일한 제한 효소로 절단된 pBluescriptII vector(Stratagene)에 클로닝하여 최종적으로 pBS-del-270::263 벡터(도 2)를 제조하였다. 사용된 프라이머는 아래와 같다.

상위 유전자 정방향 프라이머 (L-270F)(서열번호 23)

5-GGAAAGTCAAGCTTATCATCTAG-3

상위 유전자 역방향 프라이머 (L-270R) (서열번호 24)

5-GTGAGTTGTTAACCAATTTTATACTCCATTCATC-3

하위 유전자 정방향 프라이머 (R263F) (서열번호 25)

5-GACAATACAAAGTACTGATAAAGGA-3

하위 유전자 역방향 프라이머 (R263R) (서열번호 26)

5-ATAAGCCTGTTAACTTACCCATCTTGTCCGACG-3

앞서 제조된 pBS-sp-DlmesC2 벡터를 제한효소 NotI(NEB)과 PstI(NEB)으로 절단하여, spec^R-DlmesC2 유전자 절편만을 회수하고, T4 DNA polymerase(NEB)와 T4 polynucleotide kinase 효소(NEB) 처리를 통해 평형 말단(blunt end)의 spec^R-DlmesC2 유전자 절편을 제작하였다. 제작된 평형 말단의 spec^R-DlmesC2를 상기 제조된 pBS-del-270::263 벡터의 제한효소 HpaI 자리에 T4 DNA ligase (NEB) 효소로 라이게이션(ligation) 및 클로닝하여 pBS-del-270::sp-DlmesC2::263 벡터(도 3)를 제조하였다.

실시예 1-3. D- 락테이트 디하이드로게나제 유전자( DlmesC2 )가 도입된 ZM 형질전환체 제조

상기 실시예 1-2에서 제조된 pBS-del-270::sp-DlmesC2::263 벡터를 자이모모나스 모빌리스 ZM4 균주(ATCC 31821)에 전기천공법(electroporation)(Neumann et al., The EMBO Joumal Vol.1 No.7 pp.841-845, 1982)으로 형질 전환하였고, RM 배지(글루코오스, 20g/l; 효모추출물(DIFCO), 10g/l; MgSO₄, 1g/l; (NH₄)₂SO₄, 1g/l; KH₂PO₄, 2g/l; agar, 15g/l; pH 5.0) 에 스펙티노마이신을 첨가하여 pBS-del-270::sp-DlmesC2::263 벡터가 형질전환된 균주를 선별하였으며, 최종적으로 ORF ZMO0263부터 ZMO0270 반복 유전자들이 상동성 재조합되고 sp-DlmesC2 유전자가 도입된 형질전환체를 Zymomonas mobilis MG6106 으로 명명하고 2010년 11월 5일자로 한국생명공학연구원 미생물자원센터에 기탁하여 기탁번호 KCTC 11803BP를 부여 받았다.

실시예 2. 다양한 D- 락테이트 디하이드로게나제 유전자가 도입된 젖산 생산 ZM 균주 제조

류코노스톡 크레모리스(Leuconostoc cremoris) ATCC19254, 류코노스톡 메젠테로이데스(Leuconostoc mesenteroides) LMG18811, 및 류코노스톡 메젠테로이데스 (Leuconostoc mesenteroides) NBRC3426 균주로부터 유래된 D-락테이트 디하이드로게나제 유전자인 ldhD-ATCC19254, ldhD1-LMG18811, 및 D-ldh-NBRC3426를 실시예 1과 동일한 방법과 재료를 사용하여 PCR 증폭, 분리하였다. 상기 다양한 D-락테이트 디하이드로게나제 유전자 증폭에 사용된 프라이머는 다음과 같다.

[ldhD-ATCC19254 유전자 증폭 프라이머]

ATCC19254F(서열번호 27)

5-CATATGAAGATTTTTGCTTACGGCATTCGT-3

ATCC19254R(서열번호 28)

5-TTAATATTCAACAGCAATAGCT-3

[ldhD1-LMG18811 유전자 증폭 프라이머]

LMG18811F(서열번호 29)

5-CATATGAAAATTTTTGCTTACGGCATACG-3

LMG18811R(서열번호 30)

5-CTGCAGTCAGTATTTAACAGCGATTGCA-3

[D-ldh-NBRC3426 유전자 증폭 프라이머]

NBRC3426F(서열번호 31)

5-CATATGAAGATTTTTGCTTACGGCATTCG-3

NBRC3426R(서열번호 32)

5-CTGCAGTTAATATTCAACAGCAATAGCT-3

개별 증폭된 PCR 산물은 제한효소 NcoI(NEB)과 PstI(NEB)으로 절단하여 동일한 제한효소로 절단된 pBS-sp-P1596-spec^R 벡터(마크로젠)에 동일한 제한효소 자리로 T4 DNA ligase 효소(NEB)로 라이게이션(ligation) 및 클로닝하였으며, NBRC3426 균주의 D-락테이트 디하이드로게나제 유전자를 포함하는 벡터인 pBS-sp-D-NBRC3426l 벡터, LMG18811 균주의 D-락테이드 디하이드로게나제 유전자를 포함하는 벡터인 pBS-sp-D-LMG18811, 그리고 ATCC15294 균주의 D-락테이드 디하이드로게나제 유전자를 포함하는 벡터인 pBS-sp-D-ATCC15294 벡터를 각각 제작하였다.

상기 벡터들을 제한 효소 NotI(NEB)과 PstI(NEB)으로 절단하여, spec^R-D-NBRC3426l, spec^R-D-LMG18811, 그리고 spec^R-D-ATCC15294 유전자 절편을 회수 하였고, T4 DNA polymerase(NEB)와 T4 polynucleotide kinase 효소(NEB) 처리를 통해 평형 말단(blunt end)의 유전자 절편 각각을 제작하였다. 제작된 평형 말단의 유전자 절편을 상기 실시예 1에서 제조된 pBS-del-270::263 벡터의 제한효소 HpaI 자리에 클로닝하여 pBS-del-270::sp-D-NBRC3426l::263 벡터, pBS-del-270::sp-D-LMG18811::263 벡터, 그리고 pBS-del-270::sp-D-ATCC15294::263 벡터 각각을 제조하였다.

상기에서 제조된 벡터들을 자이모모나스 모빌리스 ZM4 균주(ATCC 31821)에 전기천공법(electroporation)으로 형질 전환하였고, RM 배지(글루코오스, 20g/l; 효모추출물(DIFCO), 10g/l; MgSO₄, 1g/l; (NH₄)₂SO₄, 1g/l; KH₂PO₄, 2g/l; agar, 15g/l; pH 5.0) 에 스펙티노마이신을 첨가하여 형질전환된 균주를 선별하였으며, 최종적으로 ORF ZMO0263부터 ZMO0270 반복 유전자들이 상동성 재조합되고, 류코노스톡 크레모리스 ATCC 19254 균주로부터 D-락테이트 디하이드로게나제 효소를 코딩하는 ldhD-ATCC19254 유전자(996 bp)(서열번호 3)가 도입된 균주를 MG6115, 류코노스톡 메젠테로이데스 LMG 18811 균주로부터 D-락테이트 디하이드로게나제 효소를 코딩하는 ldhD1-LMG18811 유전자(996 bp)(서열번호 5)가 도입된 균주를 MG6116, 그리고 류코노스톡 메젠테로이데스 NBRC 3426로부터 D-락테이트 디하이드로게나제 효소를 코딩하는 D-ldh-NBRC3426 유전자(996 bp)(서열번호 7)가 도입된 균주를 MG6117로 각각 명명하였다.

실시예 3. 유전체내 대사 경로와 무관한 유전자 또는 부위를 제거하고 D- 락테이트 디하이드로게나제 유전자를 도입한 ZM 균주 제조

D-락테이트 디하이드로게나제 유전자의 균주 내 도입 위치 및 이에 따른 젖산 생산 정도에 대한 영향을 알아보기 위해, 자이모모나스 모빌리스 균주(ATCC 31821)내 대사 경로와 무관한 특정 유전체 위치에 해당하는 유전자 또는 부위를 제거함과 동시에 서열번호 1의 염기서열을 갖는 DlmesC2 유전자를 도입한 균주를 제조하였다. 구체적으로, 자이모모나스 모빌리스 유전체에서 특정 효소를 코딩하지 않고, 어떠한 유전자 정보를 갖지 않는 유전자 부위 4종류를 선별하여 각각 제거하는 동시에 DlmesC2 유전자가 도입된 균주를 제조하였다. 균주 제조는 실시예 1과 동일한 방법을 사용하였으며, 대사 경로와 무관한 유전자 각각의 상위 상동 부위 및 하위 상동 부위 약 3,000bp 이상을 상동성 재조합 부위로 클로닝하여 사용하였다.

실시예 3-1. ZMO0087 ~ ZMO0089 의 3가지 ORF 부위를 제거하고 D- 락테이트 디하이드로게나제 유전자를 도입한 벡터 제조

ZMO0087~ZMO0089의 3가지 ORF(open reading frame)들을 5' 말단쪽에 5' 말단에서부터 상위 상동 부위의 3,168 bp(서열번호 33)와 3' 말단쪽에 3' 말단에서부터 하위 상동 부위의 3,159 bp(서열번호 34)를 각각 정방향 프라이머(87F)와 역방향 프라이머(89R) 쌍을 사용하여 실시예 1과 동일한 방법과 조건으로 PCR 증폭하였고, 다만 신장(extension) 시간을 10분으로 조절하였다.

정방향 프라이머 (87F)(서열번호 35)

5-TGAAATGGCCTCTGCGATATATCGAATA-3

역방향 프라이머 (89R)(서열번호 36)

5-GTAAGGGTATCGCTCCGCTCTTTATGGCGGA-3

증폭된 PCR 산물은 제한 효소 NotI(NEB)으로 처리한 다음, 동일한 제한효소로 절단된 pBluescript II 벡터 (Stratagene)에 클로닝하여 pBS-ZMO008789 벡터를 제작하였다.

이후 역방향(reverse) PCR 방법을 응용하여 ORF 유전자 ZMO0087~ZMO0089들을 제외하고 pBluescript II 벡터를 포함하는 상위 상동 부위와 하위 상동 부위만을 선택적으로 PCR 증폭하였다. 역방향 PCR 반응에 사용된 프라이머들(del 89F 및 del 87R)은 아래와 같으며, PCR 증폭 반응은 실시예 1과 동일한 방법과 조건을 사용하였고, 다만 신장(extension) 시간을 10분으로 조절하였다.

정방향 프라이머 (del 89F)(서열번호 37)

5-TAACCCGTTTACCTCTATCATATAATTATA-3

역방향 프라이머 (del 87R)(서열번호 38)

5-CATAAAATTCCTACAAATATGATCTTTTTA-3

증폭된 PCR 산물을 제한효소 PmeI(NEB)을 처리하여 얻은 유전자 절편과 실시예 1의 sp-DlmesC2 유전자 단편을 T4 DNA ligase (NEB) 효소로 라이게이션(ligation)하여 pBS-Del 87::sp-DlmesC2::89 벡터를 제작하였다.

실시예 3-2. ZMO0381 ~ ZMO0384 의 4가지 ORF 부위를 제거하고 D- 락테이트 디하이드로게나제 유전자를 도입한 벡터 제조

ZMO0381~ZMO0384의 4가지 ORF들을 5' 말단쪽에 5' 말단에서부터 상위 상동 부위의 3,140 bp(서열번호 39)와 3' 말단쪽에 3' 말단에서부터 하위 상동 부위의 3,212 bp(서열번호 40)를 각각 정방향 프라이머(381F)와 역방향 프라이머(384R) 쌍을 사용하여 실시예 1과 동일한 방법과 조건으로 PCR 증폭하였고, 다만 신장(extension) 시간을 10분으로 조절하였다.

정방향 프라이머 (381F)(서열번호 41)

5-GAAGAAGCGCAGACCCTATCTCAACGATCTTT-3

역방향 프라이머 (384R) (서열번호 42)

5-CCAAACTGTCCCTTGGCCAGCTTTCAAAAAAAC-3

증폭된 PCR 산물은 제한 효소 NotI(NEB)으로 처리한 다음, 동일한 제한효소로 절단된 pBluescript II 벡터 (Stratagene)에 클로닝하였으며, pBS-ZMO0381384 벡터를 제작하였다.

이후 역방향 PCR 방법을 응용하여 ORF 유전자 ZMO0381~ZMO0384들을 제외하고 pBluescript II 벡터를 포함하는 상위 상동 부위와 하위 상동 부위만을 선택적으로 PCR 증폭하였다. 역방향 PCR 반응에 사용된 프라이머들(del 384F 및 del 381R)은 다음과 같으며, PCR 증폭 반응은 실시예 1과 동일한 방법과 조건을 사용하였고, 다만 신장(extension) 시간을 10분으로 조절하였다.

정방향 프라이머 (del 384F)(서열번호 43)

5-TGTAGTTTATACGCTGCATTAAATGAAAAGG-3

역방향 프라이머 (del 381R)(서열번호 44)

5-TATTTATCCAATGCGCCCCCTGCTTTG-3

증폭된 PCR 산물을 제한효소 PmeI(NEB)을 처리한 다음, 실시예 1의 sp-DlmesC2 유전자 단편을 T4 DNA ligase(NEB) 효소로 라이게이션(ligation)하여 pBS-Del 381::sp-DlmesC2::384 벡터를 제작하였다.

실시예 3-3. ZMO0390 ~ ZMO0394 의 4가지 ORF 부위를 제거하고 D- 락테이트 디하이드로게나제 유전자를 도입한 벡터 제조

ZMO0390~ZMO0394의 5가지 ORF들을 5' 말단쪽에 5' 말단에서부터 상위 상동 부위의 3,280 bp(서열번호 45)와 3' 말단쪽에 3' 말단에서부터 하위 상동 부위의 3,008 bp(서열번호 46)를 각각 정방향 프라이머(390F)와 역방향 프라이머(394F) 쌍을 사용하여 실시예 1과 동일한 방법과 조건으로 PCR 증폭하였고, 다만 신장(extension) 시간을 10분으로 조절하였다.

정방향 프라이머 (390F)(서열번호 47)

5-ATGATCCGATGGCTGGAAATAATGCGGATATG-3

역방향 프라이머 (394R)(서열번호 48)

5-TAGCGGTCTGAGGCTGTGCCTCCGATGTA-3

증폭된 PCR 산물은 제한 효소 NotI (NEB)으로 처리한 다음, 동일한 제한효소로 절단된 pBluescript II 벡터 (Stratagene)에 클로닝하였으며, pBS-ZMO0390394 벡터를 제작하였다.

이후 역방향 PCR 방법을 응용하여 ORF 유전자 ZMO0390~ZMO0394들을 제외하고 pBluescript II 벡터를 포함하는 상위 상동 부위와 하위 상동 부위만을 선택적으로 PCR 증폭하였다. 역방향 PCR 반응에 사용된 프라이머들(del 394F 및 del 390R)은 다음과 같으며, PCR 증폭 반응은 실시예 1과 동일한 방법과 조건을 사용하였고, 다만 신장(extension) 시간을 10분으로 조절하였다.

정방향 프라이머 (del 394F)(서열번호 49)

5-CATCCATTTTGGATATTATTTTTAAATTAATCC-3

역방향 프라이머 (del 390R) (서열번호 50)

5-CGGTAAGTGCCTTTCACCGCTTCCACGACAG-3

증폭된 PCR 산물을 제한효소 PmeI(NEB)을 처리한 다음, 실시예 1의 sp-DlmesC2 유전자 단편을 T4 DNA ligase(NEB) 효소로 라이게이션(ligation)하여 pBS-Del 390::sp-DlmesC2::394 벡터를 제작하였다.

실시예 3-4. ZMO1786 ~ ZMO1789 의 4가지 ORF 부위를 제거하고 D- 락테이트 디하이드로게나제 유전자를 도입한 벡터 제조

ZMO1786~ZMO1789의 4가지 ORF들은 5' 말단쪽에 5' 말단에서부터 상위 상동 부위의 3,450 bp(서열번호 51)와 3' 말단쪽에 3' 말단에서부터 하위 상동 부위의 3,100 bp(서열번호 52)를 각각 정방향 프라이머(1786F)와 역방향 프라이머(1789R) 쌍을 사용하여 실시예 1과 동일한 방법과 조건으로 PCR 증폭하였고, 다만 신장(extension) 시간을 10분으로 조절하였다.

정방향 프라이머 (1786F)(서열번호 53)

5-ACCAAAGCCGAAAAAAGGTCATCAAAAATACC-3

역방향 프라이머 (1789R)(서열번호 54)

5-GTTCAATTGCCACGCTTGAGGCTTTTGAAAATGC-3

증폭된 PCR 산물은 제한 효소 NotI(NEB)으로 처리한 다음, 동일한 제한효소로 절단된 pBluescript II 벡터 (Stratagene)에 클로닝하였으며, pBS-ZMO17861789 벡터를 제작하였다.

이후 역방향 PCR 방법을 응용하여 ORF 유전자 ZMO1786~ZMO1789들을 제외하고 pBluescript II 벡터를 포함하는 상위 상동 부위와 하위 상동 부위만을 선택적으로 PCR 증폭하였다. 역방향 PCR 반응에 사용된 프라이머들(del 1789F 및 del 1786R)은 다음과 같으며, PCR 증폭 반응은 실시예 1과 동일한 방법과 조건을 사용하였고, 다만 신장(extension) 시간을 10분으로 조절하였다.

정방향 프라이머 (del 1789F)(서열번호 55)

5-TATCTCGCTTGCAATAAAACATATTTTCAGG-3

역방향 프라이머 (del 1786R)(서열번호 56)

5-AGATTTTATCCGACAAAATCAATTCTATAAG-3

증폭된 PCR 산물을 제한효소 PmeI(NEB)을 처리한 다음, 실시예 1의 sp-DlmesC2 유전자 단편을 T4 DNA ligase(NEB) 효소로 라이게이션(ligation)하여 pBS-Del 1786::sp-DlmesC2::1789 벡터를 제작하였다.

실시예 3-5. 대사 경로와 무관한 유전자 또는 부위가 D- 락테이트 디하이드로게나제 유전자로 치환된 ZM 균주 제조

상기 실시예 3-1 내지 실시예 3-4에 따라 제조된 벡터들을 자이모모나스 모빌리스 ZM4 균주(ATCC 31821)에 전기천공법 (electroporation)으로 형질전환하여 대사 무관한 유전자들이 제거되고 sp-DlmesC2 유전자가 삽입된 균주들을 다음과 같이 제작하였다.

실시예 3-1의 pBS-Del 87::sp-DlmesC2::89 벡터를 자이모모나스 모빌리스 ZM4 균주에 형질전환하고, 항생제 스펙티노마이신이 포함된 RM 배지(글루코오스, 20g/l; 효모추출물(DIFCO), 10g/l; MgSO₄, 1g/l; (NH₄)₂SO₄, 1g/l; KH₂PO₄, 2g/l; agar, 15g/l; pH 5.0)에 선택적 생장을 보이는 형질전환체들을 선별하는 과정을 통해 ORF 유전자 ZMO0087~ZMO0089가 sp-DlmesC2 유전자로 치환된 Z. mobilis ΔZMO8789::sp-DlmesC2 균주를 제조하고 이를 MG6118 균주로 명명하였다.

이와 마찬가지로, 실시예 3-2 내지 실시예 3-4에 따라 제조된 pBS-Del 381::sp-DlmesC2::384 벡터, pBS-Del 390::sp-DlmesC2::394 벡터 및 pBS-Del 1786::sp-DlmesC2::1789 벡터로 형질전환되어 각각의 유전자 부위가 sp-DlmesC2 유전자로 치환된 Z. mobilis Δ ZMO381384 :: sp - DlmesC2 균주(MG6119 균주), Z. mobilis Δ ZMO390394 :: sp - DlmesC2 균주(MG6120 균주), 및 Z. mobilis ΔZMO390394::sp-DlmesC2 균주(MG6121 균주)를 제조하였다.

실시예 4. 대사 경로 관련 유전자를 제거하고 D- 락테이트 디하이드로게나제 유전자를 도입한 ZM 균주 제조

균주 내 D-락테이트 디하이드로게나제 유전자의 도입과 균주의 대사 경로 조절간의 관계 및 이의 젖산 생산에 대한 영향을 알아보기 위해, 균주 내 다른 대사 경로 유전자(들)를 제거함과 동시에 서열번호 1의 염기서열을 갖는 DlmesC2 유전자를 도입한 균주를 제조하였다. 구체적으로 자이모모나스 모빌리스 균주의 중심 대사 회로에 해당하는 에탄올(ethanol)과 젖산(lactic acid) 생산 유전자가 제거된 균주와 여기에 DlmesC2 유전자가 도입된 균주를 제조하였다. 균주 제조방법은 실시예 1과 동일한 방법을 사용하였으며, 대사 경로 유전자 각각의 상위 상동 부위 및 하위 상동 부위 약 3,000bp 이상을 상동성 재조합 부위로 클로닝하여 사용하였다.

실시예 4-1. 락테이트 디하이드로게나제 ( ZMO0256 ) 유전자를 제거하고 D- 락테이트 디하이드로게나제 유전자( DlmesC2 )를 도입한 벡터 제조

자이모모나스 모빌리스 ZM4(ATCC 31821)의 게놈 유전자 (AE008692)로부터 락테이트 디하이드로게나제(ZMO0256) 유전자 5' 말단쪽에 5' 말단에서부터 상위 상동 부위의 4,879 bp(서열번호 57)와 3' 말단쪽에 3' 말단에서부터 하위 상동 부위의 4,984 bp(서열번호 58)를 각각 정방향 프라이머(ldhAF)와 역방향 프라이머 (ldhAR)쌍을 사용하여 실시예 1과 동일한 방법과 조건으로 PCR 증폭하였고, 다만 신장(extension) 시간을 10분으로 조절하였다.

정방향 프라이머 (ldhAF) (서열번호 59)

5-TGGCAGTCCTCCATCTAGATCGAAGGTGC-3

역방향 프라이머 (ldhAR) (서열번호 60)

5-GTGATCTGACGGTGAGCTCAGCATGCAGG-3

증폭된 PCR 산물은 제한 효소 NotI(NEB)으로 처리한 다음, 동일한 제한효소로 절단된 pBluescript II 벡터 (Stratagene)에 클로닝하였으며, pBS-ZMO0256 벡터를 제작하였다.

이후 역방향 PCR 방법을 응용하여 락테이트 디하이드로게나제(ZMO0256) 유전자를 제외하고 pBluescript II 벡터를 포함하는 상위 상동 부위와 하위 상동 부위만을 선택적으로 PCR 증폭하였다. 역방향 PCR 반응에 사용된 프라이머들(ldhA-PmeI-2F 및 ldhA-PmeI-2R)은 다음과 같으며, PCR 증폭 반응은 실시예 1과 동일한 방법과 조건을 사용하였고, 다만 신장(extension) 시간을 10분으로 조절하였다.

정방향 프라이머 (ldhA-PmeI-2F) (서열번호 61)

5-AACTAGTTTAAACAAGAGCGAAGAATAGCAAAGAAT-3

역방향 프라이머 (ldhA-PmeI-2R) (서열번호 62)

5-CTCTTGTTTAAACTAGTTATGGCATAGGCTATTACG-3

증폭된 PCR 산물을 제한효소 PmeI(NEB)을 처리한 다음, 실시예 1의 sp-DlmesC2 유전자 단편을 T4 DNA ligase(NEB) 효소로 라이게이션(ligation)하여 pBS-Del ZM0256::sp-DlmesC2 벡터를 제작하였다.

실시예 4-2. D- 락테이트 디하이드로게나제 ( ZMO1237 ) 유전자를 제거하고 D- 락테이트 디하이드로게나제 유전자( DlmesC2 )를 도입한 벡터 제조

자이모모나스 모빌리스 ZM4(ATCC 31821)의 게놈 유전자 (AE008692)로부터 락테이트 디하이드로게나제(ZMO1237) 유전자 5' 말단쪽에 5' 말단에서부터 상위 상동 부위의 3,656 bp(서열번호 63)와 3' 말단쪽에 3' 말단에서부터 하위 상동 부위의 3,848 bp(서열번호 64)를 각각 정방향 프라이머(Dldh-F)와 역방향 프라이머(Dldh-R)쌍을 사용하여 실시예 1과 동일한 방법과 조건으로 PCR 증폭하였고, 다만 신장(extension) 시간을 10분으로 조절하였다.

정방향 프라이머 (Dldh-F)(서열번호 65)

5-TGTTTCAGGCGGCCGCTATTTTAAGTC-3

역방향 프라이머 (Dldh-R)(서열번호 66)

5-TCTTTATCGCGGCCGCATCAATCACAA-3

증폭된 PCR 산물은 제한 효소 NotI(NEB)으로 처리한 다음, 동일한 제한효소로 절단된 pBluescript II 벡터 (Stratagene)에 클로닝하였으며, pBS-ZMO1237 벡터를 제작하였다.

이후 역방향 PCR 방법을 응용하여 D-락테이트 디하이드로게나제 (ZMO1237) 유전자를 제외하고 pBluescript II 벡터를 포함하는 상위 상동 부위와 하위 상동 부위만을 선택적으로 PCR 증폭하였다. 역방향 PCR 반응에 사용된 프라이머들(Del-DldF 및 Del-DldR)은 다음과 같으며, PCR 증폭 반응은 실시예 1과 동일한 방법과 조건을 사용하였고, 다만 신장(extension) 시간을 10분으로 조절하였다.

정방향 프라이머 (Del-DldF)(서열번호 67)

5-TTTCTTTTGCAGTTAACTGTCAGCCTGAA-3

역방향 프라이머 (Del-DldR)(서열번호 68)

5-TGATCCTGTATGGTTAACAATTGTTGCC-3

증폭된 PCR 산물을 제한효소 PmeI(NEB)을 처리한 다음, 실시예 1의 sp-DlmesC2 유전자 단편을 T4 DNA ligase(NEB) 효소로 라이게이션(ligation)하여 pBS-Del ZM01237::sp-DlmesC2 벡터를 제작하였다.

실시예 4-3. 알코올 디하이드로게나제 I( ZMO1236 ) 유전자를 제거하고 D- 락테이트 디하이드로게나제 유전자( DlmesC2 )를 도입한 벡터 제조

자이모모나스 모빌리스 ZM4(ATCC 31821)의 게놈 유전자 (AE008692)로부터 알코올 디하이드로게나제 I (ZMO1236) 유전자 5' 말단쪽에 5' 말단에서부터 상위 상동 부위의 3,844 bp(서열번호 69)와 3' 말단쪽에 3' 말단에서부터 하위 상동 부위의 3,861 bp(서열번호 70)를 각각 정방향 프라이머(Adh1-F)와 역방향 프라이머(Adh1-R) 쌍을 사용하여 실시예 1과 동일한 방법과 조건으로 PCR 증폭하였고, 다만 신장(extension) 시간을 10분으로 조절하였다.

정방향 프라이머 (Adh1-F)(서열번호 71)

5-ACTCAATGGAACTGCAGCATGATCTGA-3

역방향 프라이머 (Adh1-R)(서열번호 72)

5-ACCAAAGTAACATCTGCAGTGTTGATAATGG-3

증폭된 PCR 산물은 제한 효소 NotI(NEB)으로 처리한 다음, 동일한 제한효소로 절단된 pBluescript II 벡터 (Stratagene)에 클로닝하였으며, pBS-ZMO1236 벡터를 제작하였다.

이후 역방향 PCR 방법을 응용하여 알코올 디하이드로게나제 I (ZMO1236) 유전자를 제외하고 pBluescript II 벡터를 포함하는 상위 상동 부위와 하위 상동 부위만을 선택적으로 PCR 증폭하였고, 역방향 PCR 반응에 사용된 프라이머들(Del-Adh1F 및 Del-Adh1R)은 다음과 같으며, PCR 증폭 반응은 실시예 1과 동일한 방법과 조건을 사용하였고, 다만 신장(extension) 시간을 10분으로 조절하였다.

정방향 프라이머 (Del-Adh1F)(서열번호 73)

5-TTGCGAATATAGTTTAAACGATTGC-3

역방향 프라이머 (Del-Adh1R)(서열번호 74)

5-ACCAGAAAGGTTTAAACTTTGTCGTC-3

증폭된 PCR 산물을 제한효소 PmeI(NEB)을 처리한 다음, 실시예 1의 sp-DlmesC2 유전자 단편을 T4 DNA ligase(NEB) 효소로 라이게이션(ligation)하여 pBS-Del ZM01236::sp-DlmesC2 벡터를 제작하였다.

실시예 4-4. 알코올 디하이드로게나제 II ( ZMO1596 ) 유전자를 제거하고 D- 락테이트 디하이드로게나제 유전자( DlmesC2 )를 도입한 벡터 제조

자이모모나스 모빌리스 ZM4(ATCC 31821)의 게놈 유전자 (AE008692)로부터 알코올 디하이드로게나제 II (ZMO1596) 유전자 5' 말단쪽에 5' 말단에서부터 상위 상동 부위의 3,986 bp (서열번호 75)와 3' 말단쪽에 3' 말단에서부터 하위 상동 부위의 3,868 bp(서열번호 76)를 각각 정방향 프라이머(Adh2-F)와 역방향 프라이머(Adh2-R) 쌍을 사용하여 실시예 1과 동일한 방법과 조건으로 PCR 증폭하였고, 다만 신장(extension) 시간을 10분으로 조절하였다.

정방향 프라이머 (Adh2-F)(서열번호 77)

5-CATAACCGACCTGCAGAATAGCCA-3

역방향 프라이머 (Adh2-R)(서열번호 78)

5-TGTACCCACTGCAGAAGAATGATG-3

증폭된 PCR 산물은 제한 효소 NotI(NEB)으로 처리한 다음, 동일한 제한효소로 절단된 pBluescript II 벡터 (Stratagene)에 클로닝하였으며, pBS-ZMO1596 벡터를 제작하였다.

이후 역방향 PCR 방법을 응용하여 알코올 디하이드로게나제 II (ZMO1596) 유전자를 제외하고 pBluescript II 벡터를 포함하는 상위 상동 부위와 하위 상동 부위만을 선택적으로 PCR 증폭하였다. 역방향 PCR 반응에 사용된 프라이머들(Del-Adh2F 및 Del-Adh2R)은 다음과 같으며, PCR 증폭 반응은 실시예 1과 동일한 방법과 조건을 사용하였고, extension 시간을 10분으로 조절하였다.

정방향 프라이머 (Del-Adh2F)(서열번호 79)

5-CCTACATACTAGTTTAAACCAACAAC-3

역방향 프라이머 (Del-Adh2R)(서열번호 80)

5-CTGTCTTGATGTTTAAACAAACAATGC-3

증폭된 PCR 산물을 제한효소 PmeI(NEB)을 처리한 다음, 실시예 1의 sp-DlmesC2 유전자 단편을 T4 DNA ligase(NEB) 효소로 라이게이션(ligation)하여 pBS-Del ZM01596::sp-DlmesC2 벡터를 제작하였다.

실시예 4-5. 대사 경로 관련 유전자가 D- 락테이트 디하이드로게나제 유전자로 치환된 ZM 균주 제조

상기 실시예 4-1 내지 실시예 4-4에 따라 제조된 벡터들을 자이모모나스 모빌리스 ZM4 균주(ATCC 31821)에 전기천공법 (electroporation)으로 형질전환하여 대사 경로 관련 유전자들이 제거되고 sp-DlmesC2 유전자가 삽입된 균주들을 다음과 같이 제작하였다.

상기 실시예 4-1에 따라 제조된 pBS-Del ZM0256::sp-DlmesC2 벡터를 자이모모나스 모빌리스 ZM4 균주에 형질전환하고, 항생제 스펙티노마이신이 포함된 RM 배지(글루코오스, 20g/l; 효모추출물(DIFCO), 10g/l; MgSO₄, 1g/l; (NH₄)₂SO₄, 1g/l; KH₂PO₄, 2g/l; agar, 15g/l; pH 5.0)에 선택적 생장을 보이는 형질전환체들을 선별하는 과정을 통해 락테이트 디하이드로게나제(ZMO0256) 유전자가 sp-DlmesC2 유전자로 치환된 Z. mobilis Δ ZMO0256 :: sp - DlmesC2 균주를 MG6111 균주로 명명하였다.

상기 실시예 4-2에 따라 제조된 pBS-Del ZM01237::sp-DlmesC2 벡터를 실시예 4-1에 의해 락테이트 디하이드로게나제(ZMO0256) 유전자가 제거된 자이모모나스 모빌리스 균주(Z. mobilis Δ ZMO0256 :: tet)에 형질전환하여, 락테이트 디하이드로게나제(ZMO0256) 유전자 및 D-락테이트 디하이드로게나제 (ZMO1237)가 모두 제거되고 DlmesC2 유전자가 도입된 Z. mobilis Δ ZMO0256 :: cm , Δ ZMO1237 :: sp - DlmesC2 균주(MG6112 균주)를, 상술한 바와 같이 항생제 스펙티노마이신이 포함된 RM 배지에 선택적 생장을 보이는 형질전환체들을 선별하는 과정을 통해 제조하였다.

상기 실시예 4-3에 따라 제조된 pBS-Del ZM01236::sp-DlmesC2 벡터를 자이모모나스 모빌리스 ZM4 균주에 형질전환하고, 상기 항생제 스펙티노마이신이 포함된 RM 배지에 선택적 생장을 보이는 형질전환체들을 선별하는 과정을 통해 알코올 디하이드로게나제 I (ZMO1236) 유전자가 sp-DlmesC2 유전자로 치환된 Z. mobilis ΔZMO1236::sp-DlmesC2 균주(MG6113 균주)를 제조하였다.

마지막으로, 상기 실시예 4-4에 따라 제조된 pBS-Del ZM01596::sp-DlmesC2 벡터를 자이모모나스 모빌리스 ZM4 균주에 형질전환하고, 상기 항생제 스펙티노마이신이 포함된 RM 배지에 선택적 생장을 보이는 형질전환체들을 선별하는 과정을 통해 알코올 디하이드로게나제 II (ZMO1596) 유전자가 sp-DlmesC2 유전자로 치환된 Z. mobilis Δ ZMO1596 :: sp - DlmesC2 균주(MG6114 균주)를 제조하였다.

실험예 1. D- 락테이트 디하이드로게나제 활성( enzyme activity ) 시험

상기 실시예 1 내지 3에서 제조된 D-락테이트 디하이드로게나제 도입 균주가, pyruvate를 기질로 이용하여 D-lactic acid를 생산하는 효소 반응을 촉진하는 D-락테이트 디하이드로게나제 효소 활성을 나타내는지를 확인하기 위해 효소 활성 측정 실험을 하였다.

대조군으로는 야생형 자이모모나스 모빌리스 균주 ZM4(ATCC 31821)를 사용하였으며, 상기 야생형 ZM4 균주와 D-락테이트 디하이드로게나제 유전자가 도입된 ZM 균주(MG6106, MG6115, MG6116, MG6117 및 MG6118) 각각을 RM 배지(글루코오스, 20g/l; 효모추출물(DIFCO), 10g/l; MgSO₄, 1g/l; (NH₄)₂SO₄, 1g/l; KH₂PO₄, 2g/l; pH 5.0) 에서 대수 생장기까지 인큐베이터(incubator)에서 정치 배양하여 생장시킨 다음 각 세포를 회수하였다(12,000rpm, 5min, 4℃). 회수된 각 세포들을 고주파파쇄(sonication) 방법으로 파쇄 한 다음, 원심분리(15,000rpm, 10min, 4℃)하여 상등액(supernatant)을 회수하여 효소 활성 측정에 사용하였다.

D-락테이트 디하이드로게나제 효소 활성은 2가지 종류의 킷트(Lactic acid assay kit)(Megazyme, Sigma)를 이용하여 제조사의 방법에 따라 측정하였으며, 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다.

상기 표 1에 나타난 바와 같이, 대조군인 상기 야생형 ZM4 균주의 효소 활성은 0.012 U/mg of protein에 불과한 반면, D-락테이트 디하이드로게나제 유전자가 도입된 ZM 균주(MG6106, MG6115, MG6116, MG6117 및 MG6118) 각각의 효소 활성은 모두 1U/mg of protein 이 넘었으며, 높게는 1.556U/mg of protein까지 나타나 D-락테이트 디하이드로게나제 유전자가 도입된 형질전환체의 효소 활성이 야생형 균주에 비해 월등히 뛰어남을 확인할 수 있었다.

실험예 2. 젖산(D- lactic acid /D- lactate ) 생산 능력 시험

실험예 2-1. 젖산(D- lactic acid /D- lactate ) 생산 능력 시험 방법

상기 실시예 1 내지 4에서 제조된 D-락테이트 디하이드로게나제 도입 균주들의 D-lactic acid/D-lactate 생산 능력을 시험하기 위해, 상기 균주들을 각각 pH를 5.0으로 조절한 RM 액체 배지(글루코오스, 20g/l; 효모추출물(DIFCO), 10g/l; MgSO₄, 1g/l; (NH₄)₂SO₄, 1g/l; KH₂PO₄, 2g/l) 에서 각각 30℃에서 20시간 동안 배양한 후, 상기 배양된 배양액으로부터 세포를 제거하고 얻은 배양 상등액을 하기와 같은 조건으로 HPLC (high performance liquid chromatography)를 사용하여 대사산물을 측정하였다. 대조군으로는 상기 실험예 1에서 사용된 야생형 자이모모나스 모빌리스 균주 ZM4(ATCC 31821)를 사용하였으며, 비교예로는 S. cerevisiae (Dequin and Barre, Biotechnology(New York). 1994. Feb;12(2):173-177) 및/또는 S.cerevisiae OC2 균주(Ishida et al., J. Biosci. Bioeng. 2006. Feb;101(2):172-177)를 사용하였다.

<HPLC 측정 조건>

HPLC 시스템 : Hitachi HPLC 시스템 (model D-7000)

컬럼 : Aminex HPX-87H (300mm × 7.8mm)

컬럼온도 : 60 ℃

유속 : 0.6 ml/min

이동상(용매) : 0.0025 N sulfuric acid

검출기 :

D-lactic acid/D-lactate 및 그 외 유기산 - UV 검출기(Hitachi D-4200)(215nm)

당 및 에탄올 - RI (refractive index) 검출기 (D-3300)

실험예 2-2. 다양한 D- 락테이트 디하이드로게나제 유전자가 도입된 균주들의 D-lactic acid /D- lactate 생산 능력 시험

상기 실시예 1 및 실시예2에서 제조된 균주들(MG6106, MG6115, MG6116, 및 MG6117)의 D-lactic acid/D-lactate 생산 능력을 상기 실험예 2-1에 기재된 방법으로 비교해본 결과, 하기 표 2에 나타난 바와 같이 DlmesC2 유전자가 도입된 균주인 MG6106 뿐만 아니라, 이와 유전자 일치도가 95% 이상인 Leuconostoc cremoris ATCC 19254 균주로부터 분리된 D-락테이트 디하이드로게나제 효소를 코딩하는ldhD-ATCC19254 유전자(996 bp)(서열번호 3), Leuconostoc mesenteroides LMG 18811 균주로부터 분리된 D-락테이트 디하이드로게나제 효소를 코딩하는ldhD1-LMG18811 유전자(996 bp)(서열번호 5), 및 Leuconostoc mesenteroides NBRC 3426로부터 분리된 D-락테이트 디하이드로게나제 효소를 코딩하는 D-ldh-NBRC3426 유전자(996 bp)(서열번호 7)가 각각 도입된 균주 MG6115, MG6116, 및 MG6117 또한 매우 높은 수율 및 생산성으로 젖산을 생산할 수 있음을 알 수 있었다.

따라서, 상기 D-락테이트 디하이드로게나제 유전자로는 DlmesC2 외에도 이와 유전자 일치도가 95% 이상인 다양한 D-락테이트 디하이드로게나제 유전자를 사용할 수 있음을 확인할 수 있었다.

실험예 2-3. D- 락테이트 디하이드로게나제 유전자의 도입 위치 및 대사 경로 조절에 따른 D- lactic acid /D- lactate 생산 능력에 대한 영향 시험

상기 실시예 3 및 실시예 4에서 제조된 균주들의 D-lactic acid/D-lactate 생산 능력을 상기 실험예 2-1에 기재된 방법으로 비교해본 결과, 하기 표 3에 나타난 바와 같이, DlmesC2 유전자가 도입되는 특정 유전체 위치에 해당하는 유전자 또는 부위와 무관하게 젖산을 낮게는 약 95.0%, 높게는 99.9% 이상의 현저히 높은 수율과 효율로 생산함을 알 수 있었다. 또한 하기 표 4에 나타난 바와 같이, D-락테이트 디하이드로게나제 유전자 DlmesC2가 도입된 각 균주의 젖산 생산은 다른 대사 경로 흐름에 의존하거나 또는 촉진되지도 않음을 알 수 있었다.

이와 같이 D-락테이트 디하이드로게나제 유전자가 도입된 균주의 젖산 생산은 상기 유전자가 도입되는 유전체의 위치(gene or region) 또는 대사경로 흐름에 의존하거나 또는 촉진되지 않으며, 따라서 D-락테이트 디하이드로게나제 유전자의 도입 위치 또는 대사 경로 조절과 무관하게 D-락테이트 디하이드로게나제 유전자의 존재 자체에 독립 의존적으로 이루어짐을 확인할 수 있었다. 반면, S. cerevisiae의 경우, 대사 경로와 무관하거나 핵심 산물 대사(예. 에탄올 생산 경로들) 경로가 제거되지 않은 상태의 독립적인 D-lactate dehydrognase는 D-lactic acid/lactate 생산에 효율적이지 못하여 대사경로 조절에 의존적임을 확인 할 수 있었다.

따라서, 대사 경로 조절과 무관하게 독립적으로 D-lactic acid/lactate를 효율적으로 생산 할 수 있는 D-락테이트 디하이드로게나제 유전자가 도입된 균주의 젖산 생산 능력이 월등히 뛰어남을 확인할 수 있었다.

실험예 2-4. pH 조건에 따른 젖산(D- lactic acid /D- lactate ) 생산 비교

상기 실시예 1에서 제조된 MG6106 균주의 pH 조건에 따른 젖산 생산 능력을 시험하기 위해, 상기 실험예 2-1에 기재된 방법과 동일한 방법으로 D-lactic acid/D-lactate 생산 능력을 측정하되, pH 비조절에 따른 D-lactic acid/D-lactate 생산 능력은 염기 첨가에 의한 pH 조절 없이 최종 발효 pH를 3.0으로 한 RM 액체 배지에서 상기 균주를 30℃에서 20시간 동안 배양한 후, 상기 배양된 배양액으로부터 세포를 제거하고 얻은 배양 상등액을 사용하여 측정하였다. 그 결과를 하기 표 5에 나타내었다.

상기 표 5에 나타난 바와 같이, D-락테이트 디하이드로게나제 유전자가 도입된 균주의 경우 pH 5.0의 조건은 물론이고 pH 비조절(산성 조건) 발효 조건 하에서도 젖산(D-lactic acid/D-lactate) 생산율이 각각 99.9% 이상 및 99.7%로 매우 높게 나타냈으며, 나아가 pH 5.0 조건 및 pH 비조절의 모든 발효 조건에서 D-lactic acid 생산 효율이 우수한 것으로 보고된 S. cerevisiae OC2와 비교해본 결과, S. cerevisiae OC2의 경우 동일한 조건에서 D-lactic acid/lactate 생산 수율이 각각 61% 및 53%에 불과한 것으로 나타나, 상기 D-락테이트 디하이드로게나제 유전자가 도입된 균주는 pH 조건의 제한 없이 어떠한 pH 조건에서도 현저히 뛰어난 D-lactic acid/lactate 생산 수율을 가짐을 확인할 수 있었다.

실험예 3. pH 조건에 따른 D- lactic acid /D- lactate 의 광학순도( optical purity) 비교

상기 실시예 1에서 제조된 MG6106 균주의 pH 조건에 따른 D-lactic acid/D-lactate 의 광학 순도를 비교분석하기 위해, 상기 균주를 염기(base) 첨가를 통해 pH를 5.0으로 조절한 RM 액체 배지(글루코오스, 20g/l; 효모추출물(DIFCO), 10g/l; MgSO₄, 1g/l; (NH₄)₂SO₄, 1g/l; KH₂PO₄, 2g/l)와, 염기 첨가에 의한 pH 조절 없이 최종 발효 pH를 3.0 으로 한 RM 액체 배지에서 30℃에서 20시간 동안 배양한 후, 상기 배양된 배양액으로부터 세포를 제거하고 얻은 배양 상등액을 하기와 같은 조건으로 HPLC (high performance liquid chromatography)를 수행하여 D-lactic acid/D-lactate의 광학 순도(optical purity, %) 또는 광학초과수치(enantiomeric excess, ee value, %)를 분석하여 그 결과를 하기 표 6에 나타내었다. 상기 실험예 2와 마찬가지로 대조군으로는 야생형 자이모모나스 모빌리스 균주 ZM4(ATCC 31821)를 사용하였으며, 비교예로는 S. cerevisiae OC2 균주(Ishida et al., J. Biosci. Bioeng. 2006. Feb;101(2):172-177)를 사용하였다.

<HPLC 측정 조건>

HPLC 시스템 : Hitachi HPLC 시스템 (model D-7000)

컬럼 : Chirex 3126 컬럼 (Phenomenex)(250mm × 4.6mm)

컬럼온도 : 25 ℃

유속 : 1.5 ml/min

이동상(용매) : 1mM copper sulfate (CuSO₄) 용액

검출기 : UV 검출기(Hitachi D-4200)(254nm)

구체적으로 표준 시약 D(-)-lactic acid (L0625, Sigma), L(+)-lactic acid (L1750, Sigma), 그리고 DL-lactic acid (L1250, Sigma)을 사용하여 D-lactic acid와 L-lactic acid의 광학 이성질체를 구분, 분리하였으며, 광학순도(%)와 광학초과수치(%)는 각각 아래의 수학식 1 및 2를 사용하여 계산하였다.

[수학식 1]

D-lactic acid의 광학순도(%)= D/D+L *100

[수학식 2]

ee value (%)= D+L/D-L * 100

상기 표 6에 나타난 바와 같이, 대조군인 상기 야생형 ZM4 균주에 의해 생산된 젖산의 광학 순도는 약 33.3%로 낮게 나타난 반면, D-락테이트 디하이드로게나제 유전자가 도입된 균주에 의해 생산된 젖산의 광학 순도는 S. cerevisiae OC2와 동등한 정도인 99.9%의 매우 높은 광학 순도를 나타냄을 확인할 수 있었다. 다만 상기 S. cerevisiae OC2의 경우, 상기 실험예 2-3에서 살펴본 바와 같이 대사경로 조절에 의존적인 젖산 생산 효율을 나타내는 반면, D-락테이트 디하이드로게나제가 도입된 형질전환 균주의 경우, 대사 경로 조절 없이도 pH 조건의 제한 없이 매우 높은 수율과 또한 매우 높은 광학 순도로 젖산을 생산할 수 있어 대조군인 상기 야생형 ZM4 균주는 물론이고, 상기 S. cerevisiae OC2에 비하여도 현저히 우수함을 확인할 수 있었다.

한국생명공학연구원 KCTC11803 20101105

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Claims (10)

1. 류코노스톡(Leuconostoc) 속 균주 유래의 D-락테이트 디하이드로게나제를 코딩하는 유전자가 도입된 자이모모나스 모빌리스(Zymomonas mobilis) 형질전환체.
2. 제1항에 있어서,
   상기 D-락테이트 디하이드로게나제를 코딩하는 유전자는 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 또는 서열번호 8의 아미노산 서열로 표시되는 펩티드를 코딩하는 유전자인 형질전환체.
3. 제1항에 있어서,
   상기 D-락테이트 디하이드로게나제를 코딩하는 유전자는 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5, 또는 서열번호 7의 염기서열로 표시되는 것인 형질전환체.
4. 제1항에 있어서,
   상기 형질전환체는 기탁번호 KCTC 11803BP 인 형질전환체.
5. 자이모모나스 모빌리스(Zymomonas mobilis) 균주를 준비하는 단계; 및
   상기 자이모모나스 모빌리스 균주에 류코노스톡(Leuconostoc) 속 균주 유래의 D-락테이트 디하이드로게나제를 코딩하는 유전자를 도입하는 단계를 포함하는
   자이모모나스 모빌리스 형질전환체 제조방법.
6. 제5항에 있어서,
   상기 도입은 접합, 전기천공법, 및 유전자총 방법으로 이루어진 군에서 선택된 방법으로 수행하는 것인 방법.
7. 류코노스톡(Leuconostoc) 속 균주 유래의 D-락테이트 디하이드로게나제를 코딩하는 유전자를 자이모모나스 모빌리스(Zymomonas mobilis) 균주에 도입하여 자이모모나스 모빌리스 형질전환체를 제조하는 단계; 및
   상기 제조된 자이모모나스 모빌리스 형질전환체를 배양하는 단계를 포함하는
   젖산 생산 방법.
8. 제7항에 있어서,
   상기 배양은 pH 3.0 내지 pH 7.0의 조건하에서 수행하는 것인 방법.
9. 삭제
10. 삭제

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