JPWO2004101796A1 - 改良された形質転換体およびそれを用いたポリエステルの製造方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、変異の導入されたアエロモナス・キャビエ由来のポリヒドロキシアルカン酸（ＰＨＡ）合成酵素遺伝子と、酵母で機能するプロモーター及びターミネーターからなる遺伝子発現カセット；該遺伝子発現カセットを酵母に導入してなる形質転換体；該形質転換体を用いたポリエステルの製造方法である。本発明により、生分解性及び優れた物性を有する、３−ヒドロキシアルカン酸を共重合してなる共重合ポリエステルを、酵母において効率的に生産することが可能になった。

Description

本発明は、共重合ポリエステルを酵素合成するために必要な遺伝子、同遺伝子を利用してポリエステルを発酵合成する微生物、及び、その微生物を用いたポリエステルの製造方法に関する。

現在までに数多くの微生物において、エネルギー貯蔵物質としてポリヒドロキシアルカン酸（以下、ＰＨＡと略す）等のポリエステルを菌体内に蓄積することが知られている。その代表例としては３−ヒドロキシ酪酸（以下、３ＨＢと略す）のホモポリマーであるポリ−３−ヒドロキシ酪酸（以下、Ｐ（３ＨＢ）と略す）であり、１９２５年にバシラス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）で最初に発見された（非特許文献１参照）。Ｐ（３ＨＢ）は熱可塑性高分子であり、自然環境中で生物的に分解されることから、環境にやさしいプラスチックとして注目されてきた。しかし、Ｐ（３ＨＢ）は結晶性が高いため、硬くて脆い性質を持っていることから実用的には応用範囲が限られる。この為、この性質の改良を目的とした研究がなされてきた。

その中で、３−ヒドロキシ酪酸（３ＨＢ）と３−ヒドロキシ吉草酸（以下、３ＨＶと略す）とからなる共重合体（以下、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＶ）という）の製造方法が開示されている（特許文献１、２参照）。このＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＶ）はＰ（３ＨＢ）に比べると柔軟性に富むため、幅広い用途に応用できると考えられた。しかしながら、実際のところＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＶ）は３ＨＶモル分率を増加させても、それに伴う物性の変化が乏しく、特にフィルム等に使用するのに要求される程、柔軟性が向上しないため、シャンプーボトルや使い捨て剃刀の取っ手等硬質成型体の分野にしか利用されなかった。

近年、３ＨＢと３−ヒドロキシヘキサン酸（以下、３ＨＨと略す）との２成分共重合ポリエステル（以下、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）という）及びその製造方法について研究がなされた（特許文献３、４参照）。これら特許文献のＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）の製造方法は、土壌より単離されたアエロモナス・キャビエ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｃａｖｉａｅ）を用いて、オレイン酸等の脂肪酸やオリーブオイル等の油脂から発酵生産するものであった。また、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）の性質に関する研究もなされている（非特許文献２参照）。この報告では炭素数が１２個以上の脂肪酸を唯一の炭素源としてＡ．ｃａｖｉａｅを培養し、３ＨＨが１１〜１９ｍｏｌ％のＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）を発酵生産している。このＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）は３ＨＨモル分率の増加にしたがって、Ｐ（３ＨＢ）の硬くて脆い性質から次第に柔軟な性質を示すようになり、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＶ）を上回る柔軟性を示すことが明らかにされた。しかしながら、上記製造方法では菌体生産量４ｇ／Ｌ、ポリマー含量３０％であり、ポリマー生産性が低いことから、実用化に向けさらに高い生産性が得られる方法が探索された。

Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）を生産するアエロモナス・キャビエ（Ａ．ｃａｖｉａｅ）よりＰＨＡ合成酵素遺伝子がクローニングされた（特許文献５、非特許文献３参照）。本遺伝子をラルストニア・ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ、旧Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ）に導入した形質転換株を用いて、炭素源として植物油脂を用いて培養した結果、菌体含量４ｇ／Ｌ、ポリマー含量８０％が達成された（非特許文献４参照）。また、大腸菌等の細菌や植物を宿主としたＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）の製造方法も開示されているが、その生産性は記載されていない（特許文献６参照）。

上記ポリマーＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）は３ＨＨモル分率を変えることで、硬質ポリマーから軟質ポリマーまで幅広い物性を持つため、テレビの筐体等のように硬さを要求されるものから、糸やフィルム等のような柔軟性を要求されるものまで、幅広い分野への応用が期待できる。しかしながら、先に述べた製造方法ではＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）の生産性が依然として低く、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）の実用化に向けた生産方法としては未だ不十分といわざるを得ない。

最近、吉瀬らによりＡ．ｃａｖｉａｅ由来のＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）合成酵素を進化工学的に改変し、大腸菌に遺伝子導入することで、野生型の遺伝子を導入した大腸菌に比べ、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）を高蓄積する大腸菌を作製する方法が示された（非特許文献５参照）。その中でＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）合成酵素比活性が向上した株としてＥ２−５０株及びＴ３−１１株が得られている。Ｅ２−５０株はＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）合成酵素の１４９番目のアミノ酸であるアスパラギンがセリンに置換され、Ｔ３−１１株は１７１番目のアスパラギン酸がグリシンに置換された変異株である。Ｅ２−５０株の変異酵素比活性は天然型の約１．５倍、Ｔ３−１１株では約１．２倍に向上している。しかし、通常大腸菌は、炭素源として安価な油脂を資化することができず、またＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）の構成単位を合成する経路に必要なアセチルＣｏ−Ａの２量化酵素を有しないため、別途油脂分解系や基質供給系の遺伝子を導入する等しなければ、安価で効率的な生産系が得られない。またアマラらも比活性が５倍に向上する変異体を取得しているが、グルコースを炭素源としたときのポリマー生産性は僅かに向上したにすぎなかった（非特許文献６参照）。大腸菌においては、活性の向上した変異型ポリマー合成酵素は、十分にその能力を発揮できないし、また大腸菌は安価な植物油脂を炭素源として直接利用することは出来ない等、経済性の面でポリマー生産宿主としての実用性に乏しい。

菌体生産性の高い酵母を宿主とした生分解性ポリエステルの生産研究がＬｅａｆらによって行われた（非特許文献７参照）。酵母の一種であるサッカロマイセス・セルビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）にラルストニア・ユートロファ（Ｒ．ｅｕｔｒｏｐｈａ）のポリエステル合成酵素遺伝子を導入して形質転換体を作製し、グルコースを炭素源として培養することによってＰ（３ＨＢ）の蓄積を確認している。しかし、上記研究で生産されるポリマー含量は０．５％に留まり、そのポリマーは硬くて脆い性質を有するＰ（３ＨＢ）であった。脂肪酸を炭素源として、酵母サッカロマイセス・セルビシエにシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）由来のポリエステル合成酵素遺伝子を発現させ、炭素数５以上のモノマーを含む共重合ポリマーを生産する検討もなされた。この場合も生産されるポリマー含量は０．５％に留まった（非特許文献８参照）。さらに、酵母ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ Ｐａｓｔｏｒｉｓ）のペルオキソームに、同シュードモナス種由来のポリエステル合成酵素遺伝子を配向発現させ、オレイン酸を炭素源としてポリエステルを生産させる検討もなされている。この研究によれば乾燥菌体当たり１％重量のポリマーを蓄積することが示されている（非特許文献９参照）。しかしこの程度の蓄積量では、全く不十分である。

酵母は増殖が早く菌体生産性が高いことで知られている。その中でもキャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属に属する酵母は、過去Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｔｅｉｎとして注目され、ノルマルパラフィンを炭素源とした飼料用菌体生産が研究されてきた。また、近年キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属の宿主ベクター系が開発され、遺伝子組換え技術を用いた物質生産が報告されている（非特許文献１０参照）。キャンディダ・ユーティリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓ）を宿主としたαアミラーゼの生産性は約１２．３ｇ／Ｌと高く、このように高い物質生産能力を有するキャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属は、ポリマー生産用宿主として期待される。さらに、細菌と比べて菌体と培養液との分離が容易であることから、ポリマーの抽出精製工程をより簡単にすることも可能である。

そこで、優れた物性を有するＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）をキャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属酵母等を用いて生産する方法が開発されているが、ポリマー生産性の点でさらに改良を加える必要があった（特許文献７参照）。菌体当たりのポリマー生産量を向上させる方法の一つとして、ポリマー合成酵素の菌体内量を増加させる方法が挙げられる。ポリマー合成酵素の菌体内量を増加させる方法としては、強力なプロモーターを用いる方法やコピー数の多いプラスミドを用いる方法、プラスミドあるいは染色体に酵素発現ユニットを多数導入する方法等がある。しかしながら、菌体当たりの酵素の分子数を増すと、生産されるポリマーの分子量低下が起こることが知られている（非特許文献１１、１２参照）。ポリマーの分子量は生分解性ポリマーの物性に多大な影響を与えるため、分子量の低下を招くことなく、生産性を向上させる方法の開発が望まれていた。

：特開昭５７−１５０３９３号公報 ：特開昭５９−２２０１９２号公報 ：特開平５−９３０４９号公報 ：特開平７−２６５０６５号公報 ：特開平１０−１０８６８２号公報 ：国際公開第００／４３５２５号パンフレット ：国際公開第０１／８８１４４号パンフレット ：Ｍ．Ｌｅｍｏｉｇｎｅ，Ａｎｎ．Ｉｎｓｔ．Ｐａｓｔｅｕｒ，３９，１４４（１９２５） ：Ｙ．Ｄｏｉ，Ｓ．Ｋｉｔａｍｕｒａ，Ｈ．Ａｂｅ，Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２８，４８２２−４８２３（１９９５） ：Ｔ．Ｆｕｋｕｉ，Ｙ．Ｄｏｉ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，ｖｏｌ．１７９，Ｎｏ．１５，４８２１−４８３０（１９９７） ：Ｔ．Ｆｕｋｕｉ等Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４９，３３３（１９９８） ：Ｔ．Ｋｉｃｈｉｓｅ等Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６８，２４１１−２４１９（２００２） ：Ａｍａｒａ ＡＡ．等Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５９，４７７−４８２（２００２） ：Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１４２，ｐｐ１１６９−１１８０（１９９６） ：Ｐｏｉｒｉｅｒ Ｙ．等Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６７，５２５４−５２６０（２００１） ：Ｐｏｉｒｉｅｒ Ｙ．等ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔ．，ｖｏｌ．２０７，ｐｐ９７−１０２（２００２） ：化学と生物ｖｏｌ．３８，Ｎｏ．９，６１４（２０００） ：Ｓｉｍ Ｓ．Ｊ．等Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１５，ｐｐ６３−６７（１９９７） ：Ｇｅｒｎｇｒｏｓｓ Ｔ．Ｕ．，Ｍａｒｔｉｎ Ｄ．Ｐ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，ｖｏｌ．９２，ｐｐ６２７９−６２８３（１９９５）

本発明は、上記現状に鑑み、酵母で機能的かつ効率よく発現できるＰＨＡ合成酵素変異遺伝子、同変異遺伝子から成る遺伝子発現カセットを酵母に形質転換した形質転換体、及び得られた形質転換体を培養することにより、生分解性及び優れた物性を有するＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）等のポリエステルを製造する方法を提供することを目的とする。

本発明者らは様々な検討を行った結果、アエロモナス・キャビエ由来のＰＨＡ合成酵素のアミノ酸配列に特定の変異を導入した変異体のアミノ酸配列をコードする遺伝子を作製し、これら遺伝子のそれぞれに、酵母で実質的に機能するプロモーター、ターミネーターを連結することにより遺伝子発現カセットを作製し、さらに本遺伝子発現カセットを酵母に導入して形質転換株を作製し、本形質転換株を培養することにより、その培養物から極めて高い生産性が期待できる方法でポリエステルを製造できることを見いだした。

即ち、本発明は、酵母におけるアエロモナス・キャビエ由来ＰＨＡ合成酵素変異体の遺伝子の利用に関する。
具体的には、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるアエロモナス・キャビエ由来のＰＨＡ合成酵素に、以下の（ａ）〜（ｈ）のアミノ酸置換を少なくとも１つ行ってなるＰＨＡ合成酵素変異体をコードするＰＨＡ合成酵素変異遺伝子と、酵母で機能するプロモーター及びターミネーターからなる遺伝子発現カセットに関する。
（ａ）Ａｓｎ−１４９をＳｅｒに
（ｂ）Ａｓｐ−１７１をＧｌｙに
（ｃ）Ｐｈｅ−２４６をＳｅｒ又はＧｌｎに
（ｄ）Ｔｙｒ−３１８をＡｌａに
（ｅ）Ｉｌｅ−３２０をＳｅｒ、Ａｌａ又はＶａｌに
（ｆ）Ｌｅｕ−３５０をＶａｌに
（ｇ）Ｐｈｅ−３５３をＴｈｒ、Ｓｅｒ又はＨｉｓに
（ｈ）Ｐｈｅ−５１８をＩｌｅに

また、本発明は、上記ＰＨＡ合成酵素変異体をコードするＰＨＡ合成酵素変異遺伝子に、ペルオキシソーム配向シグナルをコードするＤＮＡが付加されてなる遺伝子に関する。
その好ましい実施態様としては、ペルオキシソーム配向シグナルが、配列番号２又は配列番号３によって示されるアミノ酸配列からなる上記遺伝子；さらに好ましくは、ペルオキシソーム配向シグナルをコードするＤＮＡの塩基配列が、配列番号４又は配列番号５によって示されるものである上記遺伝子に関する。
別の好ましい実施態様としては、アエロモナス・キャビエ由来のＰＨＡ合成酵素をコードする遺伝子の遺伝暗号ＣＴＧの少なくとも１つが、ＴＴＡ、ＴＴＧ、ＣＴＴ、ＣＴＣ又はＣＴＡに変換されているものである上記遺伝子に関する。

さらに、本発明は、上記遺伝子と、酵母で機能するプロモーター及びターミネーターからなる遺伝子発現カセットに関する。
また、本発明は、該遺伝子発現カセットが、酵母に１つ以上導入されてなることを特徴とする形質転換体；好ましくは、酵母がキャンディダ・マルトーサである上記形質転換体に関する。

さらに、本発明は、該形質転換体を培養して得られる培養物から、ポリエステルを採取することを特徴とするポリエステルの製造方法に関し；好ましくは、ポリエステルが、下記式（１）で示される３−ヒドロキシ酪酸と下記式（２）で示される３−ヒドロキシヘキサン酸とを共重合してなる共重合ポリエステルである上記ポリエステルの製造方法に関する。

以下に、本発明を詳細に説明する。
（１）ポリエステル合成酵素の有用な変異体
本発明においては、配列番号１で表されるアエロモナス・キャビエ由来のＰＨＡ合成酵素のアミノ酸配列に、以下の（ａ）〜（ｈ）のアミノ酸置換を少なくとも１つ行って得られるＰＨＡ合成酵素変異体を、有用な変異体として用いる。
（ａ）Ａｓｎ−１４９をＳｅｒに
（ｂ）Ａｓｐ−１７１をＧｌｙに
（ｃ）Ｐｈｅ−２４６をＳｅｒ又はＧｌｎに
（ｄ）Ｔｙｒ−３１８をＡｌａに
（ｅ）Ｉｌｅ−３２０をＳｅｒ、Ａｌａ又はＶａｌに
（ｆ）Ｌｅｕ−３５０をＶａｌに
（ｇ）Ｐｈｅ−３５３をＴｈｒ、Ｓｅｒ又はＨｉｓに
（ｈ）Ｐｈｅ−５１８をＩｌｅに

ここで、例えば、「Ａｓｎ−１４９」というのは、アミノ酸配列において１４９番目のアスパラギンを意味し、（ａ）のアミノ酸置換は１４９番目のアスパラギンをセリンに変換することを意味する。

上記変異体を得る方法としては、例えば以下のような方法等が挙げられる。アエロモナス・キャビエ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｃａｖｉａｅ）等の細菌由来のポリエステル合成酵素のアミノ酸配列を改変し、酵素活性・基質特異性・熱安定性等の性質の改良された変異体を取得する方法は種々知られているが、特に分子進化工学的手法（特開２００２−１９９８９０号公報）等が、迅速に所望の変異体を得られることから有用性が高い。また、コンピュータ上で酵素の立体構造又は予想される立体構造を基に、有用なアミノ酸変異を特定することも、例えばプログラムＳｈｒｉｋｅ（特開２００１−１８４８３１号公報）等を用いて可能である。

このようにして特定されたアミノ酸置換（変異）が、目的宿主に対して予想通りの効果を示すものであるか否かは、実際に適応してみて初めて確認が出来る。なぜならば、前述のＴ．Ｋｉｃｈｉｓｅ等Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６８，２４１１−２４１９（２００２）や、Ａｍａｒａ ＡＡ．等Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５９，４７７−４８２（２００２）の大腸菌を用いた分子進化工学的手法で得られる変異体は、その変異体を取得するのに用いた大腸菌生育条件において最も適応した変異体であり、異なる生育条件やましてや別の菌種において適応する保証はなく、また、コンピュータ上で作製される変異体は確度が未だ十分では無いからである。

また、分子進化工学的手法等によって得られた変異は、それらを組み合わせることでさらに好適な変異体を得ることができ、本発明においては、上記（ａ）〜（ｈ）のアミノ酸置換を２つ以上行って得られた変異体も好ましく用いられる。

（２）酵母用変異遺伝子の作製
上記（１）に記載の方法によって得られた変異体をコードする遺伝子としては、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるアエロモナス・キャビエ由来のＰＨＡ合成酵素遺伝子に、上記（１）のアミノ酸置換に対応するＤＮＡ変異を行ったもの等が挙げられる。また、酵母に適応したＰＨＡ合成酵素遺伝子中に、上記（１）のアミノ酸置換に対応するＤＮＡ変異を導入したものが好ましい。

酵母に適応したＰＨＡ合成酵素遺伝子としては、特に限定されないが、例えば、アエロモナス・キャビエ由来のＰＨＡ合成酵素遺伝子と同じアミノ酸配列をキャンディダ・マルトーサにおいてコードする遺伝子であるＯＲＦ２（ＷＯ０１／８８１４４の配列番号３に記載）等が挙げられる。

即ち、細菌由来の遺伝子をそのまま用いると、宿主酵母の中には遺伝暗号読みとりに異常を示す場合があり、例えば、キャンディダ・マルトーサ（Ｃａｎｄｉｄａ ｍａｌｔｏｓａ）（Ｈ．Ｓｕｇｉｙａｍａ ｅｔ ａｌ，Ｙｅａｓｔ １１ ４３−５２（１９９５））では遺伝暗号ＣＴＧが、ロイシンではなくセリンに翻訳される。このような問題は、予め遺伝子内に含まれる遺伝暗号ＣＴＧの少なくとも１つを、ロイシンに対応する他の遺伝暗号（ＴＴＡ，ＴＴＧ，ＣＴＴ，ＣＴＣ，ＣＴＡ）に変換した遺伝子を使用することによって解決することができる。さらに、使用宿主における遺伝子を構成する遺伝暗号使用頻度を考慮し、使用頻度の高い遺伝暗号に変更した遺伝子を作製・利用することが出来る。

上記（１）に記載のアミノ酸置換（変異）を、上述の酵母に適応したＰＨＡ合成酵素遺伝子中に導入するためには、部位特異的変異法を用いて所望の部位に、遺伝子暗号の変異を導入することができる。遺伝子のアミノ酸配列を部位特異的に変異させる方法は、組換えＤＮＡ法、ＰＣＲ法等を用いて行うことが出来る。例えば、ＰＨＡ合成酵素遺伝子中の変異導入を希望する目的の部位の両側に適当な制限酵素認識配列が存在する場合に、そこを前記制限酵素で切断し、変異導入を希望する部位を含む領域を除去した後、化学合成等によって目的の部位のみに変異導入したＤＮＡ断片を挿入するカセット変異法によって行うことが出来る。また、ＰＣＲによる部位特異的変異の導入は、ＰＨＡ合成酵素遺伝子中の変異導入を希望する目的の部位に目的の変異を導入した変異用プライマーと、前記遺伝子の末端部位の配列を含む変異を有しない増幅用プライマーとで、前記遺伝子の片側を増幅し、前記変異用プライマーに対して相補的な配列を有する変異用プライマーと、前記遺伝子のもう一方の末端部位の配列を含む変異を有しない増幅用プライマーとで、もう片方を増幅し、得られた２つの増幅断片をアニール後、さらに前記２種類の増幅用プライマーでＰＣＲをする事により行うことが出来る。得られた部位特異的構築物について、塩基配列を決定することにより確認を行う。塩基配列の決定は、当該技術分野で公知の手法により、自動塩基配列決定器等を用いて行うことが出来る。

一般に、酵母を用いてポリエステルを発酵生産させる場合、炭素源はブドウ糖や油脂類、脂肪酸類等、酵母が利用できるものであれば特に制限なく利用することができる。特に、油脂類、脂肪酸類あるいはｎ−パラフィン等を炭素源としてポリエステルを発酵生産する場合、これらの炭素源はβ酸化経路を経て代謝されるが、β酸化経路の代謝中間体は効率よくポリエステル合成の基質として利用される（Ｔ．Ｆｕｋｕｉ，Ｙ．Ｄｏｉ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７９，Ｎｏ．１５，４８２１−４８３０（１９９７）；Ｑ．Ｒｅｎ等，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１８２，Ｎｏ．１０，２９７８−２９８１（２０００））。ここで、酵母におけるβ酸化は細胞内小器官であるペルオキシソーム内で行われることから、ポリエステルの効率の良い合成のためには、ポリエステル合成に関与する酵素がペルオキシソームに局在することが好ましい。

ペルオキシソームへ輸送されるタンパク質は、遊離のリボソーム上で合成され、そのタンパク質配列中にあるペルオキシソーム配向シグナルの働きにより、ペルオキシソームへ輸送される（Ｓ．Ｓｕｂｒａｍａｎｉ，Ｊ．Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｂｉｏｌ．，１２５，９９−１０６（１９９２）、板井康能，化学と生物，３５，Ｎｏ．１０，６８７−６９５（１９９７）、Ｅ．Ｈ．Ｈｅｔｔｅｍａ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１４５１，１７−３４（１９９９））。

従って、本発明においては、これらペルオキシソーム配向シグナルをコードするＤＮＡを、ポリエステルの合成に関与する酵素をコードする遺伝子、即ち上記ＰＨＡ合成酵素変異遺伝子に付加させるのが好ましく、このことにより、ポリエステルの合成に関与する酵素、即ちＰＨＡ合成酵素変異体をペルオキシソームに局在化させることができ、ポリエステルを効率よく合成することができる。

カルボキシル末端にあるペルオキシソーム配向シグナルとして、３つのアミノ酸配列から成る「（セリン／アラニン／システイン）−（リジン／アルギニン／ヒスチジン）−ロイシン」が知られている。ここで、例えば、（セリン／アラニン／システイン）とは、セリン、アラニン又はシステインのいずれかであるということを意味する。ＰＨＡ合成酵素変異体をペルオキシソームに配向させるためには、前記３アミノ酸を同酵素のカルボキシル末端に付加すればよい。このうち、一般的なカルボキシル末端ペルオキシソーム配向シグナルとして知られている「セリン−リジン−ロイシン」（以下ＳＫＬと略す）（配列番号２）や、キャンディダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）でカルボキシル末端ペルオキシソーム配向シグナルとして知られている（Ｊ．Ｄ．Ａｉｔｃｈｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６，２３１９７−２３２０３（１９９１））「アラニン−リジン−イソロイシン」（以下ＡＫＩと略す）（配列番号３）をカルボキシル末端に付加するのが好ましい。
上記アミノ酸に対応する塩基配列に特に制限はなく、例えばＳＫＬであれば配列番号４、ＡＫＩであれば配列番号５の塩基配列を使用することができる。

また、Ｎ末端付近に存在する９つのアミノ酸配列「（アルギニン／リジン）−（ロイシン／バリン／イソロイシン）−（５アミノ酸）−（ヒスチジン／グルタミン）−（ロイシン／アラニン）」もペルオキシソーム配向シグナルとして知られている。これらの配列をＰＨＡ合成酵素変異体に挿入、付加することによっても、同酵素をペルオキシソームに局在させることができる。

上記ペルオキシソーム配向シグナルをコードするＤＮＡをＰＨＡ合成酵素変異遺伝子に付加させるためには、化学合成法、ＰＣＲ法等を用いることが出来る。

（３）遺伝子発現カセットの構築
本発明の遺伝子発現カセットは、上記（２）の変異遺伝子と、酵母で機能するプロモーター及びターミネーターからなるものである。

上記（２）の変異遺伝子を酵母で発現させるには、当該遺伝子の５′上流にプロモーター、上流活性化領域（ＵＡＳ）等のＤＮＡ配列が、当該遺伝子の３′下流にポリＡ付加シグナル、ターミネーター等のＤＮＡ配列が必要である。酵母の染色体上に上記条件を満たす適当な部位があれば、当該遺伝子を直接挿入しても良いし、また、適当なプロモーター及びターミネーターを有するプラスミドに当該遺伝子を挿入し、このプラスミドを酵母に形質転換させることもできる。
本発明においては、当該遺伝子の５’上流にプロモーター、３’下流にターミネーターを連結した遺伝子発現カセットを構築し、これを酵母に形質転換するのが好ましい。

使用するプロモーター、ターミネーターは、宿主となる酵母で機能するものであればどのような配列でも利用できる。プロモーターには構成的に発現を行うものや誘導的に発現を行うものがあるが、いずれのプロモーターも用いてもよい。本発明において、宿主としてキャンディダ・マルトーサを使用する場合には、上記プロモーター、ターミネーターが、キャンディダ・マルトーサで機能するものであることが好ましく、上記プロモーター、ターミネーターがキャンディダ・マルトーサ由来であることが好ましい。より好ましくは、キャンディダ・マルトーサのＡＬＫ１、ＡＬＫ２、ＡＬＫ５遺伝子由来のプロモーター、ＡＬＫ１遺伝子由来のターミネーターを利用する。

例えば、プロモーターとしてはキャンディダ・マルトーサのＡＬＫ１遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ Ｄ００４８１）のプロモーターＡＬＫ１ｐ（ＷＯ０１／８８１４４）、ＡＬＫ５遺伝子のプロモーターＡＬＫ５ｐ（配列番号６）等を用いることができる。さらに、これらのプロモーターの上流にＡＲＲ（アルカン レスポンシブル リージョン）配列を複数個付加することによりプロモーター活性を向上させたプロモーター（木暮ら２００２年日本農芸化学大会講演要旨集ｐ１９１）を利用することもできる（配列番号７）。また、ターミネーターとしてはキャンディダ・マルトーサのＡＬＫ１遺伝子のターミネーターＡＬＫ１ｔ（ＷＯ０１／８８１４４）等を用いることができる。

なお、上記プロモーター、ターミネーターの塩基配列は、キャンディダ・マルトーサで機能する配列であれば、１つ若しくは複数個の塩基が欠失、置換及び／又は、付加された塩基配列であってもよい。ここで、「１つ若しくは複数個の塩基が欠失、置換および／または付加された塩基配列」とは、蛋白核酸酵素 増刊 遺伝子増幅ＰＣＲ法 ＴＡＫＫＡＪ ３５（１７），２９５１−３１７８（１９９０）又はＨｅｎｒｙ Ａ．Ｅｒｌｉｃｈ編 加藤郁之進鑑訳 ＰＣＲテクノロジー（１９９０）等に記載の当業者に周知の方法により、欠失、置換および／または付加できる程度の数の塩基が、欠失、置換および／または付加されてなる塩基配列を意味する。

上記プロモーターは、ペルオキシソーム配向シグナルをコードするＤＮＡが付加されたアエロモナス・キャビエ由来のＰＨＡ合成酵素変異体をコードする遺伝子の５’上流に、ターミネーターは、ペルオキシソーム配向シグナルをコードするＤＮＡが付加されたＰＨＡ合成酵素変異体をコードする遺伝子の３’下流に、それぞれ連結される。

遺伝子発現カセットの構築に用いられるベクターは、大腸菌において自律増殖するプラスミドであればどのようなベクターでもよく、さらに酵母において自律増殖可能な領域を合わせ持っていてもよい。酵母において自律増殖できるベクターは、菌体内に保持される。また、遺伝子発現カセットを染色体上に組み込むこともできる。ベクターの一例として、キャンディダ・マルトーサにおいて自律増殖可能なｐＵＴＵ１を用いることができる（Ｍ．Ｏｈｋｕｍａ，ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．２７３，３９４８−３９５３（１９９８））。

プロモーター及びターミネーターと構造遺伝子を連結し、本発明の遺伝子発現カセットを構築する方法は、特に限定されるものではない。後述の本実施例に記載の方法の他に、制限酵素部位を作製するためにＰＣＲ法も利用できる。例えば、ＷＯ０１／８８１４４に記載の方法が使用できる。

（４）宿主
本発明でいう酵母には特に制限はなく、菌株の寄託機関（例えばＩＦＯ、ＡＴＣＣ等）に寄託されている、アシクロコニディウム属（Ａｃｉｃｕｌｏｃｏｎｉｄｉｕｍ属），アンブロシオザイマ属（Ａｍｂｒｏｓｉｏｚｙｍａ属），アルスロアスカス属（Ａｒｔｈｒｏａｓｃｕｓ属），アルキシオザイマ属（Ａｒｘｉｏｚｙｍａ属），アシュビア属（Ａｓｈｂｙａ属），バブジェビア属（Ｂａｂｊｅｖｉａ属），ベンシングトニア属（Ｂｅｎｓｉｎｇｔｏｎｉａ属），ボトリオアスカス属（Ｂｏｔｒｙｏａｓｃｕｓ属），ボトリオザイマ属（Ｂｏｔｒｙｏｚｙｍａ属），ブレッタノマイセス属（Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ属），ビュレラ属（Ｂｕｌｌｅｒａ属），ビュレロマイセス属（Ｂｕｌｌｅｒｏｍｙｃｅｓ属），キャンディダ属（Ｃａｎｄｉｄａ属）、シテロマイセス属（Ｃｉｔｅｒｏｍｙｃｅｓ属），クラビスポラ属（Ｃｌａｖｉｓｐｏｒａ属），クリプトコッカス属（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属），シストフィロバシディウム属（Ｃｙｓｔｏｆｉｌｏｂａｓｉｄｉｕｍ属），デバリオマイセス属（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ属），デッケラ属（Ｄｅｋｋａｒａ属），ディポダスコプシス属（Ｄｉｐｏｄａｓｃｏｐｓｉｓ属），ディポダスカス属（Ｄｉｐｏｄａｓｃｕｓ属），エニエラ属（Ｅｅｎｉｅｌｌａ属），エンドマイコプセラ属（Ｅｎｄｏｍｙｃｏｐｓｅｌｌａ属），エレマスカス属（Ｅｒｅｍａｓｃｕｓ属），エレモセシウム属（Ｅｒｅｍｏｔｈｅｃｉｕｍ属），エリスロバシディウム属（Ｅｒｙｔｈｒｏｂａｓｉｄｉｕｍ属），フェロマイセス属（Ｆｅｌｌｏｍｙｃｅｓ属），フィロバシディウム属（Ｆｉｌｏｂａｓｉｄｉｕｍ属），ガラクトマイセス属（Ｇａｌａｃｔｏｍｙｃｅｓ属），ゲオトリクム属（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ属），ガイラーモンデラ属（Ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｅｌｌａ属），ハンセニアスポラ属（Ｈａｎｓｅｎｉａｓｐｏｒａ属），ハンセヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ属），ハセガワエア属（Ｈａｓｅｇａｗａｅａ属），ホルターマンニア属（Ｈｏｌｔｅｒｍａｎｎｉａ属），ホルモアスカス属（Ｈｏｒｍｏａｓｃｕｓ属），ハイフォピキア属（Ｈｙｐｈｏｐｉｃｈｉａ属），イサットヘンキア属（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ属），クロエケラ属（Ｋｌｏｅｃｋｅｒａ属），クロエケラスポラ属（Ｋｌｏｅｃｋｅｒａｓｐｏｒａ属），クルイベロマイセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属），コンドア属（Ｋｏｎｄｏａ属），クライシア属（Ｋｕｒａｉｓｈｉａ属），クルツマノマイセス属（Ｋｕｒｔｚｍａｎｏｍｙｃｅｓ属），ロイコスポリディウム属（Ｌｅｕｃｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ属），リポマイセス属（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ属），ロデロマイセス属（Ｌｏｄｄｅｒｏｍｙｃｅｓ属），マラセジア属（Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ属），メトシュニコウィア属（Ｍｅｔｓｃｈｎｉｋｏｗｉａ属），ムラキア属（Ｍｒａｋｉａ属），マイクソザイマ属（Ｍｙｘｏｚｙｍａ属），ナドソニア属（Ｎａｄｓｏｎｉａ属），ナカザワエア属（Ｎａｋａｚａｗａｅａ属），ネマトスポラ属（Ｎｅｍａｔｏｓｐｏｒａ属），オガタエア属（Ｏｇａｔａｅａ属），オースポリディウム属（Ｏｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ属），パチソレン属（Ｐａｃｈｙｓｏｌｅｎ属），ファチコスポラ属（Ｐｈａｃｈｙｔｉｃｈｏｓｐｏｒａ属），ファフィア属（Ｐｈａｆｆｉａ属），ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ属），ロドスポリディウム属（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ属），ロドトルラ属（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ属），サッカロマイセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属），サッカロマイコーデス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｄｅｓ属），サッカロマイコプシス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｐｓｉｓ属），サイトエラ属（Ｓａｉｔｏｅｌｌａ属），サカグチア属（Ｓａｋａｇｕｃｈｉａ属），サターノスポラ属（Ｓａｔｕｒｎｏｓｐｏｒａ属），シゾブラストスポリオン属（Ｓｃｈｉｚｏｂｌａｓｔｏｓｐｏｒｉｏｎ属），シゾサッカロマイセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属），シュワニオマイセス属（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ属），スポリディオボラス属（Ｓｐｏｒｉｄｉｏｂｏｌｕｓ属），スポロボロマイセス属（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ属），スポロパキデミア属（Ｓｐｏｒｏｐａｃｈｙｄｅｒｍｉａ属），ステファノアスカス属（Ｓｔｅｐｈａｎｏａｓｃｕｓ属），ステリグマトマイセス属（Ｓｔｅｒｉｇｍａｔｏｍｙｃｅｓ属），ステリグマトスポリディウム属（Ｓｔｅｒｉｇｍａｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ属），シンビオタフリナ属（Ｓｙｍｂｉｏｔａｐｈｒｉｎａ属），シンポディオマイセス属（Ｓｙｍｐｏｄｉｏｍｙｃｅｓ属），シンポディオマイコプシス属（Ｓｙｍｐｏｄｉｏｍｙｃｏｐｓｉｓ属），トルラスポラ属（Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ属），トリコスポリエラ属（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｉｅｌｌａ属），トリコスポロン属（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ属），トリゴノプシス属（Ｔｒｉｇｏｎｏｐｓｉｓ属），ツチヤエア属（Ｔｓｕｃｈｉｙａｅａ属），ウデニオマイセス属（Ｕｄｅｎｉｏｍｙｃｅｓ属），ワルトマイセス属（Ｗａｌｔｏｍｙｃｅｓ属），ウィカーハミア属（Ｗｉｃｋｅｒｈａｍｉａ属），ウィカーハミエラ属（Ｗｉｃｋｅｒｈａｍｉｅｌｌａ属），ウィリオプシス属（Ｗｉｌｌｉｏｐｓｉｓ属），ヤマダザイマ属（Ｙａｍａｄａｚｙｍａ属），ヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ属），ザイゴアスカス属（Ｚｙｇｏａｓｃｕｓ属），ザイゴサッカロマイセス属（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属），ザイゴウィリオプシス属（Ｚｙｇｏｗｉｌｌｉｏｐｓｉｓ属），ザイゴザイマ属（Ｚｙｇｏｚｙｍａ属）等の酵母を使用することができる。

また、本発明の形質転換体の宿主として用いられる酵母としては、特に限定されないが、上記のなかでも、キャンディダ属、ヤロウィア属のものが好ましく、キャンディダ・マルトーサ（Ｃａｎｄｉｄａ ｍａｌｔｏｓａ）、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）がより好ましく、キャンディダ・マルトーサが特に好ましい。

なお、宿主として用いられる酵母のうち、Ｃａｎｄｉｄａ ｍａｌｔｏｓａ ＡＣ１６株は、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７３６６として、平成１２年１１月１５日に、日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６にある独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに国際寄託されている。

（５）形質転換体の作製
本発明の形質転換体は、上記（３）の遺伝子発現カセットが、酵母に１つ以上導入されてなるものである。

ポリマー合成に関与する遺伝子発現カセット組換えベクターを酵母に導入するためには、公知の方法により行うことができる。例えば、カルシウム法（Ｌｅｄｅｒｂｅｒｇ．Ｅ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１１９．１０７２（１９７４））やエレクトロポレーション法（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｒｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、１巻、１．８．４頁、１９９４年）等を用いることができる。また、Ｆａｓｔ ＴｒａｃｋＴＭ−Ｙｅａｓｔ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ＫｉｔＳＭ（Ｇｅｎｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）のような市販の形質転換キットを利用することもできる。

一例として宿主として、キャンディダ・マルトーサＣＨＡ１株（Ｓ．Ｋａｗａｉ，ｅｔ ａｌ，Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．５５，５９−６５（１９９１））を用いることができる。上記の形質転換法を用いて、ポリマー合成に関与する遺伝子発現カセットを含むプラスミドベクター等で、本菌株を形質転換し、後述の実施例に示すようなｐＡＲＲ−ＯＲＦ２Ｓ等のプラスミドを有するキャンディダ・マルトーサ形質転換体を作製することができる。

なお、プラスミドｐＡＲＲ−１４９ＮＳｘ２が導入された形質転換体であるＡＣ１６ ｐＵＴＡ−１４９ＮＳｘ２（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１００１９、原寄託日平成１５年５月８日の国内寄託をブダペスト条約に基づく国際寄託に移管）、
プラスミドｐＡＲＲ−１４９ＮＳ／１７１ＤＧｘ２（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１００１７、寄託日平成１６年４月２７日、ブダペスト条約に基づく国際寄託）、
はそれぞれ、日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６にある独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに国際寄託されている。

（６）ポリエステルの製造
本発明のポリエステルの製造方法では、本発明の上記形質転換体を培養して得られる培養物から、ポリエステルを採取する。
つまり、本発明のポリエステルの製造は、培養培地に上記形質転換体を添加して培養した後、得られた当該培養菌体又は培養物からポリエステルを回収することにより行うことができる。ここで、培養温度は、その菌の生育可能な温度、好ましくは１５℃〜４０℃、より好ましくは２０℃〜４０℃、さらに好ましくは２８℃〜３４℃である。また、培養時間は、特に限定されないが、例えばバッチ培養では１〜７日間が好ましく、また連続培養も可能である。

培養培地は、酵母が利用できるものである限り特に限定されない。例えば、炭素源、窒素源、無機塩類、その他の有機栄養源等を含有する培地を使用することができる。

炭素源としては、酵母が資化できるものである限り特に限定されず、例えば炭水化物、油脂類、脂肪酸類、ｎ−パラフィン等を用いることができる。炭水化物としては、例えばグルコース、シュークロース、グリセリン等が挙げられる。油脂類としては、例えばナタネ油、ヤシ油、パーム油、パーム核油等が挙げられる。脂肪酸類としては、例えばヘキサン酸、オクタン酸、デカン酸、ラウリン酸、オレイン酸、パルミチン酸、リノール酸、リノレン酸、ミリスチン酸等の飽和・不飽和脂肪酸、あるいはこれら脂肪酸のエステルや塩等の脂肪酸誘導体が挙げられる。ｎ−パラフィンとしては、例えばドデカン、テトラデカン等が挙げられる。
また、プロモーターの発現が誘導型である場合には、適時誘導物質（例えば、アルコール等）を添加すればよい。誘導物質が主要炭素源である場合もある。

一例として、キャンディダ・マルトーサの培養において、炭素源として油脂類を用いて培養することもできる。また、油脂を資化できないかまたは効率よく資化できない酵母では、培地中にリパーゼを添加することによって改善することもできる。さらに、リパーゼ遺伝子を形質転換することにより、油脂資化能を付与することもできる。

窒素源としては、例えばアンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等のアンモニウム塩の他、ペプトン、肉エキス、酵母エキス等が挙げられる。
無機塩類としては、例えばリン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム等が挙げられる。
その他の有機栄養源としては、例えばグリシン、アラニン、セリン、スレオニン、プロリン等のアミノ酸類；ビタミンＢ１、ビタミンＢ１２、ビオチン、ニコチン酸アミド、パントテン酸、ビタミンＣ等のビタミン類等が挙げられる。

本発明において、ポリエステルの菌体からの回収は、例えば次のような方法が使用できる。培養終了後、培養液から遠心分離器等で菌体を分離し、その菌体を蒸留水及びメタノール等により洗浄した後、乾燥させる。この乾燥菌体からクロロホルム等の有機溶剤を用いてポリエステルを抽出する。このポリエステルを含んだ有機溶剤溶液から濾過等によって菌体成分を除去し、その濾液にメタノールやヘキサン等の貧溶媒を加えてポリエステルを沈殿させる。沈殿したポリエステルから濾過や遠心分離によって上澄み液を除去し、乾燥させてポリエステルを回収することができる。本発明では、ポリエステルを生産する菌体として酵母を使用するため、上記のような簡便な分離回収方法が利用可能である。

得られたポリエステルの分析は、例えば、ガスクロマトグラフ法や核磁気共鳴法等により行う。分子量の測定には、ＧＰＣ法が利用できる。回収した乾燥ポリマーをクロロホルムで溶解したのち、この溶液を、Ｓｈｏｄｅｘ Ｋ８０５Ｌ（昭和電工社製）を装着した島津製作所製ＧＰＣシステムを用い、クロロホルムを移動相として分析する事が出来る。分子量標準サンプルには市販の標準ポリスチレン等が使用できる。

上述したように、本発明においては、酵素活性の改良されたアエロモナス・キャビエ由来のＰＨＡ合成酵素変異体をコードする遺伝子、又は、酵素活性の改良されたアエロモナス・キャビエ由来のＰＨＡ合成酵素変異体をコードする遺伝子に、ペルオキシソーム配向シグナルをコードするＤＮＡを付加した遺伝子と、酵母で機能するプロモーター及びターミネーターを有する遺伝子発現カセットを用いて、キャンディダ・マルトーサ組み換え株を作製し、該形質転換体を培養する方法により、ポリエステルを効率よく合成することができる。

また、本発明においては、ポリエステルとして、式（１）で示される３−ヒドロキシ酪酸と式（２）で示される３−ヒドロキシヘキサン酸とを共重合してなる共重合ポリエステルＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）が好ましく製造できる。

本発明により、生分解性及び優れた物性を有する、上記式（１）、（２）で示される３−ヒドロキシ酪酸や３−ヒドロキシヘキサン酸をはじめとする３−ヒドロキシアルカン酸を共重合してなる共重合ポリエステルを、酵母において効率的に生産することが可能になった。

以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。ただし、本発明は、これら実施例にその技術範囲を限定するものではない。

（実施例１）ＰＨＡ合成酵素遺伝子の合成と改変
配列番号１に示されるアエロモナス・キャビエの由来のＰＨＡ合成酵素（Ｔ．Ｆｕｋｕｉ，ｅｔ ａｌ，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ，ｖｏｌ．１７０，６９−７５（１９９９））のアミノ酸配列をもとに、当該ＰＨＡ合成酵素遺伝子を合成した。
また、キャンディダ・マルトーサは、ＣＴＧコドンをロイシンではなくセリンに翻訳する酵母である。このため、ロイシンコドンにはＣＴＧを割り当てなかった。各アミノ酸に対応するコドンは、キャンディダ・マルトーサにおいて使用頻度の高いコドンを優先的に選択した。コドンの使用頻度は、Ｋｌａｕｓ Ｗｏｌｆ著のＮｏｎｃｏｎｖｅｎｄｔｉｏｎａｌ Ｙｅａｓｔ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ出版）を参考にした。このようにしてＰＨＡ合成酵素遺伝子ＯＲＦ２（ＷＯ０１／８８１４４の配列番号３）を設計し、化学合成した後、ベクターｐＵＣＮＴ（ＷＯ９４／０３６１３に記載）にクローニングした。

次に、該ＰＨＡ合成酵素の１４９番目のアミノ酸であるアスパラギンをセリンに置換するため、ＰＣＲ用プライマーとして配列番号８と配列番号９を用いてＰＨＡ合成酵素遺伝子のクローニングされているｐＵＣＮＴを増幅した。増幅にはＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社製Ｐｆｕポリメラーゼを用いた。ＰＣＲの条件は９６℃で１分、６０℃で１分、６８℃で１１分を１サイクルとし、これを１８回繰り返した後、制限酵素ＤｐｎＩを加え、鋳型としたプラスミドを切断し、大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、形質転換体よりプラスミドを得た。配列番号１０から１４のプライマーを使用し、塩基配列を確認した。塩基配列決定は、ＰＥＲＫＩＮ ＥＬＭＥＲ ＡＰＰＬＩＥＤ ＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳ社製のＤＮＡシークエンサー３１０ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒを用いた。このようにして遺伝子変異が目的部位のみに導入されたＰＨＡ合成酵素変異遺伝子ＯＲＦ２−１４９ＮＳを作製した。

（実施例２）ＰＨＡ合成酵素変異遺伝子発現カセットの構築
キャンディダ・マルトーサでＰＨＡ合成酵素を発現させるために、実施例１に記載のＰＨＡ合成酵素変異遺伝子ＯＲＦ２、ＯＲＦ２−１４９ＮＳにおける、それぞれの５’上流にキャンディダ・マルトーサ由来プロモーターを、３’下流にターミネーターを連結することにした。プロモーターとしては、Ａｌｋ２遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ Ｘ５５８８１）のプロモーターの上流にＡＲＲ配列を付加したプロモーターＡＲＲｐを用い、３’下流には共にキャンディダ・マルトーサのＡｌｋ１遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ Ｄ００４８１）のターミネーターＡＬＫ１ｔを連結することにした。ＡＲＲｐは、東京大学より分与された遺伝子（配列番号１５）のＰｓｔＩサイトにＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩリンカーを結合させ、ＥｃｏＴ１４Ｉサイトに配列番号１６に示した合成ＤＮＡを結合させることにより、ＸｈｏＩ及びＮｄｅＩで切り出すことの出来る形に変換した。ベクターｐＵＡＬ１（ＷＯ０１／８８１４４に記載）をＥｃｏＲＩで切断後、平滑末端化しライゲーションを行うことにより、ＥｃｏＲＩ切断部位を除去したｐＵＡＬ２を作製した。ｐＵＡＬ２をＰｖｕＩ／ＰｖｕＩＩで切断し、ｐＳＴＶ２８（宝酒造社製）のＰｖｕＩ／ＳｍａＩサイトに結合させ、ｐＳＴＡＬ１を作製した。このｐＳＴＡＬ１をＥｃｏＲＩ／ＮｄｅＩで切断し、先に述べたＡＲＲｐと結合させ、ｐＳＴＡＲＲを作製した。図１にｐＵＡＬ１からｐＳＴＡＲＲを作製した模式と、それぞれのプラスミドの模式図を示した。

実施例１に記載のＯＲＦ２、ＯＲＦ２−１４９ＮＳがキャンディダ・マルトーサで発現し、ペルオキシソームに配向するように、カルボキシル末端にペルオキシソーム配向シグナルを付加することにした。付加するペルオキシソーム配向シグナルとしては、カルボキシル末端にＳｅｒ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ（ＳＫＬ）のアミノ酸を使用することにした。ｐＵＣＮＴにクローニングされたＯＲＦ２及びＯＲＦ２−１４９ＮＳを鋳型にして、配列番号１７と１８をプライマーとして使用して、ＯＲＦ２Ｓ及びＯＲＦ２Ｓ−１４９ＮＳを作製した。ｐＳＴＡＲＲのＮｄｅＩ、ＰｓｔＩサイトに、これらＰＨＡ合成酵素変異遺伝子を結合させ、ｐＳＴＡＲＲ−ＯＲＦ２Ｓ、ｐＳＴＡＲＲ−ＯＲＦ２Ｓ１４９ＮＳを構築した。

最終的にＰＨＡ合成酵素変異遺伝子を連結するベクターには、ｐＵＴＡ−１（ＷＯ０１／８８１４４に記載）を使用した。ｐＳＴＡＲＲ−ＯＲＦ２Ｓ、ｐＳＴＡＲＲ−ＯＲＦ２Ｓ１４９ＮＳより、ＸｈｏＩ／ＳａｌＩで発現カセットを切り出し、ｐＵＴＡ−１のＳａｌＩサイトを結合させ、ｐＡＲＲ−ＯＲＦ２Ｓ及びｐＡＲＲ−１４９ＮＳを構築した。さらに、作製したｐＡＲＲ−ＯＲＦ２Ｓ及びｐＡＲＲ−１４９ＮＳをＳａｌＩで切断し、ｐＳＴＡＲＲ−ＯＲＦ２ＳとｐＳＴＡＲＲ−ＯＲＦ２Ｓ１４９ＮＳより切り出したＸｈｏＩ／ＳａｌＩの発現カセットを結合させ、ｐＡＲＲ−ＯＲＦ２Ｓｘ２及びｐＡＲＲ−１４９ＮＳｘ２を構築した。図２に、ｐＳＴＡＲＲからｐＡＲＲ−１４９ＮＳｘ２等を作製した模式と、それぞれのプラスミドの簡単な図を示した。

（実施例３）形質転換体の構築
酵母菌の培養用に使用した試薬は、特に断らない限り和光純薬から販売されているものを用いた。宿主には、ＡＤＥ１遺伝子破壊株であり、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに国際寄託されているキャンディダ・マルトーサＡＣ１６株（ＦＥＲＭ ＢＰ−７３６６）を使用し、上記の本発明の遺伝子発現カセットを含むプラスミドｐＡＲＲ−ＯＲＦ２Ｓ、ｐＡＲＲ−１４９ＮＳ、ｐＡＲＲ−ＯＲＦ２Ｓｘ２及びｐＡＲＲ−１４９ＮＳｘ２をそれぞれ導入した。宿主に構築したプラスミドを導入する方法は、電気パルス法で行った。遺伝子導入装置はＢＴＸ社製のＥＬＥＣＴＲＯ ＣＥＬＬ ＭＡＮＩＰＵＬＡＴＯＲ６００を用いた。キュベットはＢＩＯ ＭＥＤＩＣＡＬ ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ ＣＯ．ＬＴＤ製のＢＭ６２００を用いた。コンピテント細胞１００μｌにプラスミド１μｌを加え、調製したコンピテント細胞／プラスミド溶液を１００μｌ取り、キュベットに注入し、パルス装置にセットした。続いて、静電容量４０μＦ、抵抗値２４６ｏｈｍ、電圧１．９ＫＶの条件で電気パルスをかけた。パルス後、それぞれのキュベットに１Ｍソルビトールを１ｍｌ加え、穏やかに混合し、室温で１時間放置した。プラスミドを導入後、選択プレート（０．６７ｗ／ｖ％Ｙｅａｓｔ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｂａｓｅ ｗｉｔｈｏｕｔ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ（Ｄｉｆｃｏ社製）、２ｗ／ｖ％グルコース、２ｗ／ｖ％寒天）で培養し、形質転換体を取得した。このうち、プラスミドｐＡＲＲ−１４９ＮＳｘ２が導入された形質転換体は、ＡＣ１６ ｐＵＴＡ−１４９ＮＳｘ２（ＦＥＲＭ ＢＰ−１００１９）として、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに国際寄託されている。

（実施例４）形質転換体を使用したポリマー生産
ポリマー生産に必要な遺伝子を導入したキャンディダ・マルトーサ形質転換体を次のように培養した。培地は、ＹＮＢ培地（０．６７ｗ／ｖ％Ｙｅａｓｔ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｂａｓｅ ｗｉｔｈｏｕｔ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ、２ｗ／ｖ％Ｇｌｕｃｏｓｅ）を前培養用培地として用い、Ｍ２培地（１２．７５ｇ／Ｌ硫酸アンモニウム、１．５６ｇ／Ｌリン酸２水素カリウム、０．３３ｇ／Ｌリン酸１水素カリウム・３水和物、０．０８ｇ／Ｌ塩化カリウム、０．５ｇ／Ｌ塩化ナトリウム、０．４１ｇ／Ｌ硫酸マグネシウム・７水和物、０．４ｇ／Ｌ硝酸カルシウム・７水和物、０．０１ｇ／Ｌ塩化鉄（ＩＩＩ）・４水和物）に、２ｗ／ｖ％パームオイルと塩酸に溶解したトレースエレメント（１ｇ／ｍＬ硫酸鉄（ＩＩ）・７水和物、８ｇ／ｍＬ硫酸亜鉛（ＩＩ）・７水和物、６．４ｇ／ｍＬ硫酸マンガン（ＩＩ）・４水和物、０．８ｇ／ｍＬ硫酸銅（ＩＩ）・５水和物）０．４５ｍｌ／Ｌを添加した培地を生産培地として使用した。

各形質転換体のグリセロールストック５００μｌを、５０ｍｌの前培養用培地が入った５００ｍｌ坂口フラスコに接種して２０時間培養し、３００ｍＬの生産培地を入れた２Ｌ坂口フラスコに１０ｖ／ｖ％接種した。これを培養温度３０℃、振盪速度９０ｒｐｍ、２日間培養という条件で培養した。培養液から遠心分離によって菌体を回収し、８０ｍｌの蒸留水に懸濁して、超高圧ホモジナイザー（ＡＰＶ社製Ｒａｎｎｉｅ２０００；１５０００Ｐｓｉで１５分間）で破砕した後、遠心分離を行い、得られた沈殿物をメタノールで洗浄した後、凍結乾燥した。

得られた乾燥菌体を粉砕し、クロロホルムを１００ｍｌ添加し、一晩攪拌して抽出した。濾過して菌体を除去し、濾液をエバポレーターで１−２ｍｌにまで濃縮し、濃縮液に約１０ｍｌのヘキサンを添加して、ポリマーを析出させた。このときの培養結果を表１に示す。分子量の測定は、以下のようにして行った。回収した乾燥ポリマー１０ｍｇを、クロロホルム５ｍｌに溶解したのち、不溶物を濾過により除いた。この溶液をＳｈｏｄｅｘ Ｋ８０５Ｌ（３００ｘ８ｍｍ、２本連結）（昭和電工社製）を装着した島津製作所製ＧＰＣシステムを用い、クロロホルムを移動相として分析した。分子量標準サンプルには市販の標準ポリスチレンを用い、重量平均分子量として求めた。３ＨＨモル分率は、ＮＭＲ分析（ＪＯＥＬ、ＪＮＭ−ＥＸ４００）により測定した。

上記結果が示すように、野生型のＰＨＡ合成酵素をコードする遺伝子からなる発現カセットを含むプラスミドｐＡＲＲ−ＯＲＦ２Ｓ、ｐＡＲＲ−ＯＲＦ２Ｓｘ２によって形質転換された酵母に比べて、本発明のＰＨＡ合成酵素変異体をコードする変異遺伝子からなる発現カセットを含むプラスミドｐＡＲＲ−１４９ＮＳ、及びｐＡＲＲ−１４９ＮＳｘ２によって形質転換された酵母では、ポリマー含有量及び３ＨＨ分率が向上し、本発明のＰＨＡ合成酵素変異体の活性向上効果が確認できただけではなく、得られるＰＨＡの分子量も増加する傾向が見られた。このように、本発明のＰＨＡ合成酵素変異体の有用性が確認された。

（実施例５）二重変異体
ＰＨＡ合成酵素の１７１番目のアミノ酸であるアスパラギン酸をグリシンに置換した変異体を、実施例１に記載の方法を用いて作製した。変異を導入するためのプライマーとしては配列番号１９と配列番号２０を用いた。また、１４９番目のアミノ酸であるアスパラギンをセリンに、１７１番目のアミノ酸であるアスパラギン酸をグリシンに置換した二重変異体を、実施例１で作製したＰＨＡ合成酵素変異遺伝子ＯＲＦ２−１４９ＮＳを鋳型として、実施例１と同様の手法で作製した。このようにして、ＰＨＡ合成酵素変異遺伝子ＯＲＦ２−１７１ＤＧ及びＰＨＡ合成酵素二重変異遺伝子ＯＲＦ２−１４９ＮＳ／１７１ＤＧを完成した。

次に、これらの変異遺伝子を用いて、実施例２に記載の方法により、配列番号１７と１８をプライマーとして使用してシグナル配列を付加し、プラスミドｐＳＴＡＲＲにクローニングして、ｐＳＴＡＲＲ−ＯＲＦ２Ｓ１７１ＤＧ、ｐＳＴＡＲＲ−ＯＲＦ２Ｓ１４９ＮＳ／１７１ＤＧを構築した。この変異遺伝子発現カセットを、実施例２に記載の方法によりｐＵＴＡ−１に導入し、プラスミドｐＡＲＲ−１７１ＤＧ及びｐＡＲＲ−１４９ＮＳ／１７１ＤＧを作製した。次に、ターミネーターとしてＡＬＫ１ｔの代わりにＬＡＣ４遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ Ｍ８４４１０）のターミネーターＬＡＣｔ（配列番号２１）を用いた発現カセットを作製した。ｐＳＴＡＲＲ−ＯＲＦ２Ｓ１７１ＤＧ及びｐＳＴＡＲＲ−ＯＲＦ２Ｓ１４９ＮＳ／１７１ＤＧのＡＬＫ１ｔをＰｓｔＩ／ＳａｌＩで除去し、代わりに配列番号２２と２３に示すプライマーで増幅したＬＡＣ４ｔを導入したプラスミドを作製した。このターミネーターの置換されたＰＨＡ合成酵素変異体発現カセットを、それぞれＸｈｏＩ／ＳａｌＩで切り出し、プラスミドｐＡＲＲ−１７１ＤＧ及びｐＡＲＲ−１４９ＮＳ／１７１ＤＧのＳａｌＩサイトに結合させ、ＰＨＡ合成酵素変異遺伝子カセットの２個導入されたプラスミドｐＡＲＲ−１７１ＤＧｘ２及びｐＡＲＲ−１４９ＮＳ／１７１ＤＧｘ２を完成した。このうち、プラスミドｐＡＲＲ−１４９ＮＳ／１７１ＤＧｘ２（ＦＥＲＭ ＢＰ−１００１７）は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに国際寄託されている。
これらのプラスミドを実施例３に記載の方法で、キャンディダ・マルトーサＡＣ１６株（ＦＥＲＭ ＢＰ−７３６６）に導入し、実施例４に記載の方法でポリマー生産とポリマー分析を行い、その結果を表２に示し、実施例４の結果と比較した。

上記結果が示すように、野生型のＰＨＡ合成酵素をコードする遺伝子からなる発現カセットを含むプラスミドｐＡＲＲ−ＯＲＦ２Ｓｘ２によって形質転換された酵母に比べて、本発明のＰＨＡ合成酵素変異体をコードする変異遺伝子からなる発現カセットを含むプラスミドｐＡＲＲ−１７１ＤＧｘ２によって形質転換された酵母では、ポリマー含有量が向上し、ＰＨＡ合成酵素二重変異体をコードする二重変異遺伝子からなる発現カセットを含むプラスミドｐＡＲＲ−１４９ＮＳ／１７１ＤＧｘ２によって形質転換された酵母では、ポリマー含有量がさらに向上すると共に３ＨＨ分率が向上する事が明らかとなった。このように、本発明のＰＨＡ合成酵素変異体の有用性が確認された。

本発明により、生分解性及び優れた物性を有する、上記式（１）、（２）で示される３−ヒドロキシ酪酸や３−ヒドロキシヘキサン酸をはじめとする３−ヒドロキシアルカン酸を共重合してなる共重合ポリエステルを、酵母において効率的に生産することが可能になった。

［図１］実施例において、ｐＵＡＬ１からｐＳＴＡＲＲを作製した模式と、それぞれのプラスミドの簡単な図である。
［図２］実施例において、ｐＳＴＡＲＲからｐＡＲＲ−１４９ＮＳｘ２等を作製した模式と、それぞれのプラスミドの簡単な図である。

Claims (10)

1. 配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるアエロモナス・キャビエ由来のポリヒドロキシアルカン酸合成酵素に、以下の（ａ）〜（ｈ）のアミノ酸置換を少なくとも１つ行ってなるポリヒドロキシアルカン酸合成酵素変異体をコードするポリヒドロキシアルカン酸合成酵素変異遺伝子と、酵母で機能するプロモーター及びターミネーターからなる遺伝子発現カセット。
   （ａ）Ａｓｎ−１４９をＳｅｒに
   （ｂ）Ａｓｐ−１７１をＧｌｙに
   （ｃ）Ｐｈｅ−２４６をＳｅｒ又はＧｌｎに
   （ｄ）Ｔｙｒ−３１８をＡｌａに
   （ｅ）Ｉｌｅ−３２０をＳｅｒ、Ａｌａ又はＶａｌに
   （ｆ）Ｌｅｕ−３５０をＶａｌに
   （ｇ）Ｐｈｅ−３５３をＴｈｒ、Ｓｅｒ又はＨｉｓに
   （ｈ）Ｐｈｅ−５１８をＩｌｅに
2. 配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるアエロモナス・キャビエ由来のポリヒドロキシアルカン酸合成酵素に、以下の（ａ）〜（ｈ）のアミノ酸置換を少なくとも１つ行ってなるポリヒドロキシアルカン酸合成酵素変異体をコードするポリヒドロキシアルカン酸合成酵素変異遺伝子に、ペルオキシソーム配向シグナルをコードするＤＮＡが付加されてなる遺伝子。
   （ａ）Ａｓｎ−１４９をＳｅｒに
   （ｂ）Ａｓｐ−１７１をＧｌｙに
   （ｃ）Ｐｈｅ−２４６をＳｅｒ又はＧｌｎに
   （ｄ）Ｔｙｒ−３１８をＡｌａに
   （ｅ）Ｉｌｅ−３２０をＳｅｒ、Ａｌａ又はＶａｌに
   （ｆ）Ｌｅｕ−３５０をＶａｌに
   （ｇ）Ｐｈｅ−３５３をＴｈｒ、Ｓｅｒ又はＨｉｓに
   （ｈ）Ｐｈｅ−５１８をＩｌｅに
3. ペルオキシソーム配向シグナルが、配列番号２又は配列番号３によって示されるアミノ酸配列からなる請求項２記載の遺伝子。
4. ペルオキシソーム配向シグナルをコードするＤＮＡの塩基配列が、配列番号４又は配列番号５によって示されるものである請求項３記載の遺伝子。
5. アエロモナス・キャビエ由来のポリヒドロキシアルカン酸合成酵素をコードする遺伝子の遺伝暗号ＣＴＧの少なくとも１つが、ＴＴＡ、ＴＴＧ、ＣＴＴ、ＣＴＣ又はＣＴＡに変換されているものである請求項２〜４のいずれかに記載の遺伝子。
6. 請求項２〜５のいずれかに記載の遺伝子と、酵母で機能するプロモーター及びターミネーターからなる遺伝子発現カセット。
7. 請求項１又は６記載の遺伝子発現カセットが、酵母に１つ以上導入されてなることを特徴とする形質転換体。
8. 酵母がキャンディダ・マルトーサである請求項７記載の形質転換体。
9. 請求項７又は８記載の形質転換体を培養して得られる培養物から、ポリエステルを採取することを特徴とするポリエステルの製造方法。
10. ポリエステルが、下記式（１）で示される３−ヒドロキシ酪酸と下記式（２）で示される３−ヒドロキシヘキサン酸とを共重合してなる共重合ポリエステルである請求項９記載のポリエステルの製造方法。
    

    

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