KR20220004130A - 고분자량 코폴리머를 합성하기 위한 유전자 - Google Patents

고분자량 코폴리머를 합성하기 위한 유전자 Download PDF

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KR20220004130A
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카나파티 필라이 케이 수데쉬 쿠마르 에이/엘 씨
마노즈 쿠마르 락슈마난
후아 티앙 탄
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Abstract

[과제] 본 발명은 맹그로브 토양 메타게놈 유래의 폴리머 합성 효소 유전자, 및 이 폴리머 합성 효소를 사용한 유용한 코폴리머의 제조 방법을 제공하는 것에 있다. 또한, 본 발명의 다른 목적은 스트렙토마이세스종 CFMR7 유래의 에노일-CoA 히드라타아제 유전자, 및 이 에노일-CoA 히드라타아제의 발현에 의해 3HHx의 조성이 증대하는 유용한 코폴리머 P(3HB-co-3HHx)의 제조 방법을 제공하는 것이다. [해결수단] 이들 과제를 해결하기 위해서, 서열 번호 1 또는 3에 기재된 아미노산 서열, 또는 1개 이상의 아미노산이 치환, 결실 혹은 부가된 서열 번호 1 또는 3에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, 또한 폴리머 합성 효소 활성 또는 히드라타아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

Description

고분자량 코폴리머를 합성하기 위한 유전자
본 발명은 맹그로브 토양 메타게놈 유래의 폴리머 합성 효소를 코드하는 유전자 및 스트렙토마이세스(Streptomyces)종 CFMR7(수탁 번호: CP011522) 유래의 에노일-CoA 히드라타아제를 코드하는 유전자에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 함께 사용하면 고분자량의 코폴리머의 합성을 초래하는 폴리머 합성 효소 및 에노일-CoA 히드라타아제를 각각 코드하는 기능적 유전자에 대하여 상세하게 설명한다.
폴리히드록시알카노에이트(PHAs)는 영양 제한 및 스트레스 조건 하에서, 저장 화합물(예비 탄소)로서 미생물(세균 및 고세균)로부터 생성되는 바이오 폴리에스테르이다. 합성 플라스틱과 비교한 PHA의 주된 이점은 석유 화학 유래의 플라스틱과 마찬가지의 물리화학적 특성을 갖는 것에 더하여, 그의 생분해성, 생체 적합성 및 지속성이다. PHA의 중합에 관여하는 중요한 효소는 PHA 합성 효소(PhaC)이다. PhaC는 세포질의 친수성 환경에 있어서 고분자량의 소수성 PHA쇄를 중합할 수 있으므로 흥미 깊은 효소이다.
PHA의 다양성에 관한 현재의 지견에 있어서, PHA 프로듀서 및 PhaC는 주로 배양 의존적 어프로치를 사용한 순수한 미생물의 단리물에 관한 연구로부터 얻어진 것이다. 속에 기초하는 합계 4종의 PhaC 및 167PHA 프로듀서는 기존의 배양 가능한 토양 미생물로부터 보고되어 있고, 그 기존의 배양 가능한 토양 미생물은 토양 미생물 전체의 15％ 이하라고 생각되고 있다. 나머지 85％는 아직 조사되어 있지 않다. 따라서, 이 조사되어 있지 않은 미생물군의 풀로부터, PHA 프로듀서의 다양성을 이해하기 위해서는 큰 지견의 격차가 있다.
맹그로브 토양 생물군계는 높은 미생물의 다양성을 포함하고, 생리 식염수 및 무산소 상태 등의 여러가지 비생물적 스트레스에 연속적으로 노출된다. 몇 가지의 연구에서는, 맹그로브 환경으로부터의 PHA 프로듀서의 분리가 보고되어 있다. 그러나, 맹그로브 토양 메타게놈 유래의 PhaC에 관한 연구는 보고되어 있지 않다. 따라서, 맹그로브 토양 메타게놈에 있어서의 새로운 미생물속, 특히 연구실에서 배양하는 것이 곤란한 혐기성 미생물로부터 다수의 신규 PhaC를 발견할 가능성이 높다.
PHA의 특성은 2차 모노머의 도입 및/또는 조성을 제어함으로써, 여러가지 용도에 적합시킬 수 있다. 세균의 PHA는 단쇄 길이(scl), 중쇄 길이(mcl) 및 scl-mcl의 조합과 같이, 모노머 단위 중의 탄소 원자의 수에 의존하여 3가지의 주된 형으로 나눌 수 있다. scl-PHA는 3 내지 5개의 탄소 원자를 포함하고, mcl-PHA는 6 내지 14개의 탄소 원자를 갖는데, scl-mcl-PHA 중의 탄소 원자의 수는 모노머당 3 내지 14개의 범위일 수 있다. 생성되는 PHA의 종류는 폴리머 합성 효소의 기질 특이성에 의존한다. 주로 scl 모노머를 포함하는 PHA는 종종 딱딱하고 취성이지만, 주로 mcl 모노머를 포함하는 PHA는 본질적으로 탄성이다. Scl-mcl PHA 코폴리머는 코폴리머 중의 scl 모노머와 mcl 모노머의 비에 의존하여, 2개의 상태 사이의 특성을 가질 수 있다.
phaJ에 의해 코드되는 에노일-CoA 히드라타아제는 생합성 중에, (R)-3-히드록시아실-CoA 모노머 단위, 예를 들어 지방산 β산화로부터의 3-히드록시헥사노에이트 조효소 A(3HHx-CoA)를 폴리(3-히드록시부티레이트-co-3-히드록시헥사노에이트)[P(3HB-co-3HHx)] 코폴리머에 공급하는, (R) 특이적 히드라타아제 활성을 나타낸다.
폴리머 합성 효소 및 그것을 코드하는 유전자에 관한 선행 기술로서, 몇 가지의 특허 기술이 보고되어 있다. 특허문헌 1(미국 특허 제6,812,013호)은 PHA의 조제 프로세스에 있어서 유용한 PHA 합성 효소, 해당 효소를 코드하는 유전자, 해당 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 해당 벡터에 의해 형질 전환된 형질 전환체, 해당 형질 전환체를 이용한 PHA 합성 효소의 생성 프로세스 및 해당 형질 전환체를 이용한 PHA의 조제 프로세스에 관한 것이다. 이 발명의 특징은, 배양하여 PHA 합성 효소 또는 PHA를 생성하는 숙주 미생물에 슈도모나스 푸티다(슈도모나스 putida) 유래의 PHA 합성 효소 유전자를 도입한 형질 전환체인 것이다.
또한, 특허문헌 2(미국 특허 제2004-146998호)는 형질 전환체 및 해당 형질 전환체를 사용한 폴리머의 생성 프로세스에 관한 것이다. 이 발명은 코폴리머 합성 효소를 코드하는 유전자, 해당 유전자를 이용한 폴리머의 발효 합성용 미생물, 및 미생물에 의한 폴리머의 생성 방법에 대하여 개시하고 있다. 이 발명은 폴리에스테르 합성 관련 효소 유전자, 프로모터 및 터미네이터를 포함하고, 효모에 도입된 형질 전환체의 구축에 착안하고 있다.
개량된 형질 전환체 및 해당 형질 전환체를 사용한 폴리머의 생성 프로세스는 특허문헌 3(유럽 특허 제1626087호)에 개시되어 있다. 이 발명은 에어로모나스 카비애(Aeromonas caviae) 유래 PHA 합성 효소를 코드하는 유전자를 포함하는 유전자 발현 카세트를 개시하고 있다. 효모는 숙주로서도 사용되고, 프로모터 및 터미네이터에 변이가 도입되어 있으므로, 유전자 카세트가 효모 내에서 기능하는 것이 가능해진다.
기타 특허 기술로서, 폴리머 합성 효소를 코드하는 유전자와 다른 유전자의 조합이 개시되어 있다. 특허문헌 4(미국 특허 제2008-233620호)는 효모에 있어서 유전자 발현 산물을 산생하기 위한 형질 전환체 및 프로세스를 개시한다. 형질 전환체는 PHA 합성에 관여하는 복수의 효소 유전자, 예를 들어 PHA 합성 효소와 아세토아세틸 CoA 환원 효소 유전자의 조합을 도입함으로써 얻어진다. 특허문헌 5(미국 특허 제2003-146703호)에는, PHA 합성 효소와 세포 내 PHA 데폴리메라아제의 양쪽을 발현하는 재조합 미생물이 개시되어 있다. 이 발명은 PHA의 동시 합성 및 분해를 가능하게 하는 발명이다.
특허문헌 6(미국 특허 제2012-088280호)에는 크로모박테리움(Chromobacterium)속 유래의 신규한 폴리머 합성 효소와, 해당 효소를 코드하는 유전자, 해당 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 해당 벡터에 의해 형질 전환된 형질 전환체와, 이 형질 전환체를 사용한 플라스틱 폴리머의 제조 공정이 개시되어 있다.
대부분의 특허 기술은 형질 전환체 및 개시된 형질 전환체를 사용하여 폴리머 또는 PHA를 생성하는 프로세스에 관한 것이다. 그러나 이들 특허 기술은, 다른 생물종의 게놈의 상이한 영역에서 유래되는 PHA 합성 효소 유전자를 포함하고 있었다. 지금까지 메타게놈 DNA로부터의 폴리머 합성 효소의 단리를 개시하는 특허 기술은 존재하고 있지 않다. 따라서, 본 발명은 폴리머 합성 효소 유전자의 개량된 DNA 단편을 제공하여, 재조합 벡터 및 형질 전환체를 생성하는 것이 바람직하다. 이 형질 전환체는 PHA 생성을 위한 기질 특이성이 넓은 폴리머 합성 효소에, 여러가지 용도에 적합시킬 수 있는 특성을 부여함에 있어서 유용할 수 있다.
미국 특허 제6,812,013호 미국 특허 제2004-146998호 유럽 특허 제1626087호 미국 특허 제2008-233620호 미국 특허 제2003-146703호 미국 특허 제2012-088280호
본 발명의 주목적은, 맹그로브 토양 메타게놈 유래의 폴리머 합성 효소 유전자, 및 이 폴리머 합성 효소를 사용한 유용한 코폴리머의 제조 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은, 스트렙토마이세스종 CFMR7 유래의 에노일-CoA 히드라타아제 유전자, 및 이 에노일-CoA 히드라타아제의 발현에 의해 3HHx의 조성이 증대하는 유용한 코폴리머 P(3HB-co-3HHx)의 제조 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은, 폴리머 합성 효소를 함유하는 형질 전환체를 사용함으로써 보다 고분자량의 3HHx 코폴리머를 보다 효율적으로 제조하는 방법을 개발하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은, 폴리머 합성 효소를 함유하는 형질 전환체를 사용함으로써, 4HB 및 5HV 등의 리파아제 분해성 모노머 서열을 갖는 코폴리머를 보다 효율적으로 제조하는 방법을 개발하는 것이다.
본 발명은 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열, 또는 1개 이상의 아미노산이 치환, 결실 혹은 부가된 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, 또한 폴리머 합성 효소 활성을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 개시한다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드의 일 실시 형태에 의하면, 단리된 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 2에 기재된 뉴클레오티드 서열, 혹은 1개 이상의 뉴클레오티드가 치환된 서열 번호 2에 기재된 뉴클레오티드 서열, 또는 그의 상보 서열을 포함한다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드의 일 실시 형태에 의하면, 서열 번호 2에 기재된 뉴클레오티드 서열에 있어서, 티민이 우라실에 의해 치환되어 있는 뉴클레오티드 서열 또는 그의 상보 서열을 포함한다.
다른 발명은, 서열 번호 3에 기재된 아미노산 서열, 또는 1개 이상의 아미노산이 치환, 결실 혹은 부가된 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, 또한 히드라타아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 개시한다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드의 일 실시 형태에 의하면, 서열 번호 4에 기재된 뉴클레오티드 서열, 혹은 1개 이상의 뉴클레오티드가 치환된 서열 번호 2에 기재된 뉴클레오티드 서열, 또는 그의 상보 서열을 포함한다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드의 일 실시 형태에 의하면, 서열 번호 4에 기재된 뉴클레오티드 서열에 있어서, 티민이 우라실에 의해 치환되어 있는 뉴클레오티드 서열, 또는 그의 상보 서열을 포함한다.
본 발명의 또다른 실시 형태는, 상기 실시 형태에 기재된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터이다. 바람직하게는, 재조합 벡터는 플라스미드 또는 파지이다.
본 발명의 추가적인 실시 형태에서는, 상기 실시 형태에 기재된 벡터에 의한 형질 전환체가 개시된다.
본 발명의 추가적인 실시 형태에서는, 상기 실시 형태에 기재된 폴리뉴클레오티드를 게놈에 갖는 재조합주이다.
본 발명의 다른 추가적인 실시 형태는, 중합성 재료를 함유하는 매체에 있어서, 상기 실시 형태의 형질 전환체 또는 재조합주를 배양하는 것; 및 배양된 배지로부터 폴리머를 회수하는 것을 포함하는 폴리머의 제조 방법이다. 바람직하게는, 폴리머는 PHA이다.
도 1은 본 발명의 바람직한 실시 형태의 하나에 기재되는 폴리머 합성 효소의 폴리펩티드의 아미노산 서열이다.
도 2는 본 발명의 바람직한 실시 형태의 하나에 기재되는 폴리머 합성 효소를 코드하는 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열이다.
도 3은 본 발명의 바람직한 실시 형태의 하나에 기재된 에노일-CoA 히드라타아제의 폴리펩티드의 아미노산 서열이다.
도 4는 본 발명의 바람직한 실시 형태의 하나에 기재된 에노일-CoA 히드라타아제를 코드하는 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열이다.
도 5는 본 발명의 바람직한 실시 형태의 하나에 기재된 폴리머 합성 효소의 PCR 증폭을 위하여 사용되는 증폭 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열이다.
도 6은 (a) 본 발명의 실시 형태의 하나에 기재된 형질 전환체에 의해 합성된 코폴리머의 하나인 P(3-히드록시부티레이트-co-4-히드록시부티레이트)의 1H NMR 스펙트럼이다. (b) 본 발명의 실시 형태의 하나에 기재된 형질 전환체에 의해 합성된 코폴리머의 하나인 P(3-히드록시부티레이트-co-3-히드록시헥사노에이트)의 1H NMR 스펙트럼이다.
도 7은 본 발명의 실시 형태의 하나에 기재된 형질 전환체에 의해 합성된 코폴리머의 하나인 P(3-히드록시부티레이트-co-5-히드록시발레레이트)의 1H NMR 스펙트럼이다.
도 8은 phaJ를 포함하지 않는 형질 전환체(PHB-4/pBBRMCS2_CBP-M-CPF4)와, 탄소원으로서 (a) PO 또는 (b) CPKO를 사용하여 생성된 폴리머의 1H NMR 분광법에 의한 분석 결과이다.
도 9는 phaJ를 포함하는 형질 전환체(PHB-4/pBBR1MCS2_CBP-M-CPF4_JSs)와, 탄소원으로서 (a) PO 또는 (b) CPKO를 사용하여 생성된 폴리머의 1H NMR 분광법에 의한 분석 결과이다.
이어서, 본 발명의 실시 형태에 대하여 상세하게 설명한다.
또한, 본 명세서에 기재된 실시 형태는 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니고, 당업자이면 본 발명이 목적을 실행하고, 상술한 목적 및 이점, 그리고 그들에 고유한 목적 및 이점을 얻기 위하여 잘 적합하고 있는 것을 용이하게 이해할 것이다.
또한, 본 발명의 이해를 용이하게 할 목적에서 첨부된 도면에는 바람직한 실시 형태가 나타내져 있고, 이하의 설명에 관련하여 고려되는 경우, 그 검토로부터 본 발명, 그의 구성 및 동작, 그리고 그의 많은 이점이 용이하게 이해되고, 평가된다.
본 발명은 맹그로브 토양 메타게놈 유래의 폴리머 합성 효소를 코드하는 유전자, 및 스트렙토마이세스종 CFMR7 유래의 에노일-CoA 히드라타아제를 코드하는 유전자에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 폴리머 합성 효소 및 에노일-CoA 히드라타아제를 각각 코드하는 이들 기능적 유전자, 폴리머 합성 효소 유전자 혹은 에노일-CoA 히드라타아제만, 또는 그의 양쪽의 유전자를 갖는 재조합 벡터, 이들 벡터를 발현하는 형질 전환 세균주, 및 이들 기능적 유전자를 통하여 폴리머를 생성하는 프로세스에 대하여 상세하게 설명한다.
본 발명은 발릭 풀라우(Balik Pulau)(말레이시아, 페낭) 맹그로브 토양으로부터 발견된 극히 넓은 기질 특이성을 갖는 신규의 PhaC[PhaCBP-M-CPF4(수탁 번호: AXB72506)]에 대하여 기재한다. 그 PhaC는 scl-PHA 코폴리머, 폴리(3-히드록시부티레이트-co-3-히드록시발레레이트) 랜덤 코폴리머[P(3HB-co-3HV)], 폴리(3-히드록시부티레이트-co-3-히드록시-4-메틸발레레이트) 랜덤 코폴리머[P(3HB-co-3H4MV)], 폴리(3-히드록시부티레이트-co-4-히드록시부티레이트) 랜덤 코폴리머[P(3HB-co-4HB)] 및 폴리(3-히드록시부티레이트-co-5-히드록시발레레이트) 랜덤 코폴리머[P(3HB-co-5HV)]를 생성할 수 있었다. 이 PHA 합성 효소는 그의 4HB 및 5HV의 리파아제 분해성 모노머 서열을 도입하는 능력에 의해, 여러가지 생물 의학적 용도로 사용 가능한 PHA의 생합성에 적합하다. 또한, 이 PHA 합성 효소는 P(3HB-co-3HHx)를 생성하고 있고, 폴리프로필렌(PP) 및 저밀도 폴리에틸렌(LDPE) 등의 범용 플라스틱과 마찬가지의 성질을 갖는 상업적으로 유용한 PHA 코폴리머로서 평가되고 있다.
본 발명은 PHA 중합을 위한 mcl 모노머를 공급할 수 있는 PhaJ[PhaJSs(수탁 번호: ALC30197)]에 대해서도 기재한다. 이 PhaJ는 스트렙토마이세스종 CFMR7주로부터 발견되었다. 그것은 생합성 중에 지방산 β산화로부터의 3HHx-CoA를 P(3HB-co-3HHx)에 공급하는 (R) 특이적 히드라타아제 활성을 나타낸다.
이하, 본 발명의 바람직한 실시 형태에 따라서 첨부된 설명 및 도면을 참조하여 본 발명을 설명한다. 그러나, 설명을 본 발명의 바람직한 실시 형태 및 도면으로 한정하는 것은, 단지 본 발명의 논의를 용이하게 하는 것에 지나지 않는 것을 이해해야 하며, 당업자는 첨부된 특허 청구 범위로부터 일탈하지 않고 여러가지 변경을 상기할 수 있는 것이 상정된다.
본 발명은 폴리머 합성 효소 활성을 갖는 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 코드하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 개시한다. 서열 번호 1이 도 1에 도시되어 있다.
본 발명의 바람직한 실시 형태에 따르면, 단리된 폴리뉴클레오티드는 폴리머 합성 효소 유전자이다. 또한, 이 폴리머 합성 효소 유전자는 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 또는 1개 이상의 아미노산이 서열 번호 1의 아미노산 서열로부터 결실, 서열 번호 1의 아미노산 서열로 치환 혹은 서열 번호 1의 아미노산 서열에 부가된 서열을 포함하는 폴리펩티드를 코드할 수 있다. 서열 번호 1의 서열 중의 1개 이상의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가 등의 변이를 받고 있더라도, 그 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드는, 이 폴리펩티드가 폴리머 합성 효소 활성을 갖고 있는 한, 본 발명의 유전자에 포함된다. 예를 들어, 제1 위치의 메티오닌이 결실된 서열 번호 1의 아미노산 서열을 코드하는 폴리뉴클레오티드도 본 발명의 유전자에 포함된다. 바꾸어 말하면, 본 발명의 유전자는 서열 번호 2의 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열뿐만 아니라, 축중 코돈을 제외하고 동일한 폴리펩티드를 코드하는 그 축중 서열도 포함한다. 결실, 치환 또는 부가 등의 상기 변이는 공지된 부위 특이적 돌연변이 유발에 의해 유도할 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시 형태에서는, 서열 번호 2에 기재된 뉴클레오티드 서열 또는 그의 상보적 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드가 개시된다. 서열 번호 2를 도 2에 도시하였다. 본 발명의 또다른 실시 형태는, T가 U로 치환된 서열 번호 2에 기재된 뉴클레오티드 서열 또는 그의 상보 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드이다. 이들 폴리뉴클레오티드는 폴리머 합성 효소 활성을 갖는 폴리펩티드를 코드하고 있다.
이 폴리머 합성 효소 유전자는 바람직하게는 맹그로브 토양 메타게놈으로부터 클론화된다. 본 발명의 바람직한 실시 형태에 따르면, 폴리머 합성 효소 유전자는 맹그로브 토양으로부터 얻어진 전체 토양 DNA로부터 단리된다. 본 발명의 유전자는 맹그로브 토양 메타게놈 DNA를 주형으로 한 폴리메라아제 연쇄 반응(PCR) 증폭법, 또는 그 뉴클레오티드 서열을 갖는 DNA 단편을 프로브로서 사용하는 하이브리다이제이션법에 의해 얻을 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시 형태에 따르면, 주형으로서 전체 맹그로브 토양 메타게놈 DNA를 사용하여 폴리머 합성 효소 유전자의 DNA 단편을 얻는 바람직한 방법으로서 PCR이 사용된다. 처음에, 메타게놈 DNA를 신선한 맹그로브 토양 샘플로부터 추출한다. 메타게놈 DNA의 단리에는, MoBio PowerSoil DNA 단리 키트 등의 시판 키트의 사용, 및 샷건 메타게놈 시퀀싱을 사용한 전체 메타게놈 DNA 서열의 결정이 포함되는 것은 당 기술분야에서 공지이다. 토양 메타게놈 유래의 폴리머 합성 효소 유전자를 포함하는 DNA 단편을 얻기 위해서는, 프로브를 조제하는 것이 바람직하다. 폴리머 합성 효소 유전자의 잘 보존된 영역은 기지의 아미노산 서열로부터 선택되고, 그들을 코드하는 뉴클레오티드 서열을 사용하여 올리고뉴클레오티드를 설계할 수 있다. 이 목적을 달성하기 위해서, 증폭 뉴클레오티드의 프라이머쌍이 설계된다. 프라이머쌍의 서열은 도 5에 도시되어 있고, 이 도면에서는 서열 번호 5가 순방향 프라이머로서 사용되고, 서열 번호 6이 역방향 프라이머로서 사용되고 있다.
벡터 중에 폴리머 합성 효소 유전자를 클로닝하기 위해서, 폴리머 합성 효소 유전자 서열의 뒤의 종지 코돈 및 ApaI 제한 부위 앞에 SwaI 제한 부위를 갖는 프라이머를 설계함으로써, 제한 부위 SwaI를 벡터 중의 폴리머 합성 효소 유전자의 뒤에 부가하였다. 이 목적을 달성하기 위해서, 증폭 뉴클레오티드의 프라이머쌍이 설계된다. 프라이머쌍의 서열은 도 5에 도시되어 있고, 이 도면에서는 서열 번호 7이 순방향 프라이머로서 사용되고, 서열 번호 8이 역방향 프라이머로서 사용되고 있다.
증폭된 DNA 단편은 HindIII 및 ApaI와 같은 적절한 제한 효소로 소화할 수 있다. 이어서, DNA 단편을 HindIII 및 ApaI일 수 있는 제한 효소로 미리 절단된 적절한 벡터에 연결한다. 이 벡터는 라이게이션 전에 알칼리성 포스파타아제에 의한 처리에 의해 탈인산화된다.
본 발명의 또다른 실시 형태는, 단리된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터이다. 이 재조합 벡터는, 단리된 폴리뉴클레오티드가 폴리머 합성 효소 활성을 갖는 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 또는 1개 혹은 복수의 아미노산이 치환, 결실, 치환 또는 부가되어 있는, 폴리머 합성 효소 활성을 갖는 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 코드하는 재조합 벡터이다.
본 발명의 바람직한 실시 형태에 따르면, 숙주 미생물에 있어서 자율적으로 복제할 수 있는 플라스미드가 벡터로서 사용된다. 벡터로서 적용할 수 있는 플라스미드로서는, pBBR1MCS2 및 pBBR1-I-GG18(pBBR1MCS2 유도체 클로닝 벡터)을 들 수 있다. 이들 벡터는 시판하고 있는 벡터의 개변으로부터 얻어진다. 대장균(Escherichia coli) 또는 바실러스 브레비스(바실러스 brevis)와 같은 2가지 이상의 숙주 세포 및 여러가지 셔틀 벡터에 있어서 자율적으로 복제할 수 있는 벡터도 또한 사용할 수 있다. 이러한 벡터도 제한 효소로 절단되어, 그들의 단편이 얻어진다.
따라서, 종래의 DNA 리가아제 키트를 사용하여 DNA 단편을 벡터 단편과 연결시킨다. DNA 단편을 어닐하고, 벡터 단편과 연결하여 재조합 벡터를 제작한다.
다른 본 발명은, 서열 번호 3 (R) 특이적 히드라타아제 활성에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 코드하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 개시한다. 서열 번호 3이 도 3에 도시되어 있다.
제2 발명의 바람직한 실시 형태에 따르면, 단리된 폴리뉴클레오티드는 에노일-CoA 히드라타아제 유전자이다. 또한, 이 에노일-CoA 히드라타아제 유전자는 서열 번호 3에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 또는 1개 혹은 복수의 아미노산이 서열 번호 3에 기재된 아미노산 서열로부터 결실, 서열 번호 3에 기재된 아미노산 서열로 치환 또는 서열 번호 3에 기재된 아미노산 서열에 부가된 서열을 포함하는 폴리펩티드를 코드할 수 있다. 서열 번호 3의 서열 중의 1개 이상의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가 등의 변이를 받고 있더라도, 그 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드는, 폴리펩티드가 (R) 특이적 히드라타아제 활성을 갖는 한 본 발명의 유전자에 포함된다. 예를 들어, 제1 위치의 메티오닌이 결실된 서열 번호 3의 아미노산 서열을 코드하는 폴리뉴클레오티드도 본 발명의 유전자에 포함된다. 바꾸어 말하면, 본 발명의 유전자는 서열 번호 4의 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열뿐만 아니라, 축중 코돈을 제외하고 동일한 폴리펩티드를 코드하는 그 축중 서열도 포함한다. 결실, 치환 또는 부가 등의 상기 변이는 공지된 부위 특이적 돌연변이 유발에 의해 유도할 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시 형태에서는, 서열 번호 4에 기재된 뉴클레오티드 서열 또는 그의 상보적 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드가 개시된다. 서열 번호 4를 도 4에 도시한다. 본 발명의 또다른 실시 형태는, T가 U로 치환된 서열 번호 4에 기재된 뉴클레오티드 서열 또는 그의 상보 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드이다. 이들 폴리뉴클레오티드는, (R) 특이적 히드라타아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코드하고 있다.
이 에노일-CoA 히드라타아제 유전자는 바람직하게는 스트렙토마이세스종 CFMR7로부터 클론화된다. 이 본 발명의 유전자는 스트렙토마이세스종 CFMR7 게놈 DNA를 주형으로서 사용하는 폴리메라아제 연쇄 반응(PCR) 증폭 기술에 의해 얻을 수 있다. 이 목적을 달성하기 위해서, 증폭 뉴클레오티드의 프라이머쌍이 설계된다. 프라이머쌍의 서열은 도 5에 도시되어 있고, 이 도면에서는 서열 번호 9가 순방향 프라이머로서 사용되고, 서열 번호 10이 역방향 프라이머로서 사용되고 있다.
증폭된 DNA 단편은 SwaI 등의 적절한 제한 효소로 소화할 수 있다. 이어서 DNA 단편을, SwaI일 수 있는 제한 효소로 미리 절단된 적절한 벡터에 연결한다. 이 벡터는 라이게이션 전에 알칼리성 포스파타아제에 의한 처리에 의해 탈인산화된다.
본 발명의 또다른 실시 형태는 단리된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터이며, 단리된 폴리뉴클레오티드가 서열 번호 3에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, 또한 (R) 특이적 히드라타아제 활성을 갖는 폴리펩티드, 또는 1개 이상의 아미노산이 치환, 결실, 치환 또는 부가된, 서열 번호 3에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, 또한 (R) 특이적 히드라타아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코드하는, 단리된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터이다.
본 발명의 바람직한 실시 형태에 따르면, 숙주 미생물에 있어서 자율적으로 복제할 수 있는 플라스미드가 벡터로서 사용된다. 벡터로서 적용할 수 있는 플라스미드로서는, pBBR1MCS2 및 pBBR1-I-GG18(pBBR1MCS2 유도체 클로닝 벡터)을 들 수 있다. 이들 벡터는 시판하고 있는 벡터의 개변으로부터 얻어진다. 대장균(Escherichia coli) 또는 바실러스 브레비스(바실러스 brevis)와 같은 둘 이상의 숙주 세포 및 여러가지 셔틀 벡터에 있어서 자율적으로 복제할 수 있는 벡터도 또한 사용할 수 있다. 이러한 벡터도 제한 효소로 절단되어, 그들의 단편이 얻어진다.
따라서, 종래의 DNA 리가아제 키트를 사용하여 DNA 단편을 벡터 단편과 연결시킨다. DNA 단편을 어닐하고, 벡터 단편과 연결하여 재조합 벡터를 제작한다.
본 발명의 추가적인 실시 형태에 있어서, 형질 전환체는 상기 재조합 벡터를 사용하여 구축된 발현 벡터와 적합한, 적절한 숙주주에 재조합 벡터를 도입함으로써 얻어진다. 본 발명은 재조합 벡터에 있어서 표적 유전자를 발현하는 것이 가능한 한, 특정한 숙주주의 사용에 한정되지 않는다. 이것에 적합한 미생물의 몇 가지의 예는 쿠프리아비두스(Cupriavidus)속, 바실러스(Bacillus)속, 슈도모나스(Pseudomonas)속(세균), 사카로미세스(Saccharomyces)속 및 칸디다(Candida)속(효모), COS 및 CHO 세포주(동물 세포)에 속하는 것이다.
본 발명의 재조합 DNA는 쿠프리아비두스속 또는 슈도모나스속에 속하는 세균을 숙주주로서 사용하는 경우에, 적절한 프로모터, 본 발명의 DNA 단편, 및 숙주에 있어서의 자율 복제를 확실하게 하기 위한 전사 종결 서열을 포함하도록 구축되어 있는 것이 바람직하다. 바람직하게는, 발현 벡터는 pGEM-T 및 pBBR1MCS-2 유도체를 포함하지만, 이들에 한정되지 않는다. 마찬가지로, 프로모터는 그것이 숙주 중에서 발현될 수 있다면, 어느 타입이어도 된다. 쿠프리아비두스 네카토르(Cupriavidus necator), 대장균 또는 파지에서 유래되는 프로모터의 예로서는, 추정 쿠프리아비두스 네카토르(C. necator) 프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터, PL 프로모터, pR 프로모터 및 T7 프로모터를 들 수 있다.
확립된 방법을 사용하여 재조합 벡터를 숙주 미생물에 도입할 수 있다. 예를 들어 숙주 미생물이 대장균일 경우, 칼슘법 및 일렉트로포레이션법을 사용할 수 있다. 또한, 파지 DNA를 사용하는 경우에는, 인비트로 패키징법을 채용할 수 있다.
효모가 숙주로서 사용되는 경우, Yep13 또는 YCp50과 같은 발현 벡터가 사용된다. 따라서, 프로모터에는 gal1 프로모터 또는 gal10 프로모터를 사용할 수 있다. 재조합 DNA를 효모에 도입하는 방법으로서는, 일렉트로포레이션법, 스페로플라스트법, 아세트산리튬법 등을 들 수 있다. 동물 세포가 숙주로서 사용되는 경우, pcDNAI 또는 pcDNAI/Amp와 같은 발현 벡터가 사용된다. 따라서, 재조합 DNA를 동물 세포에 도입하는 방법으로서는, 일렉트로포레이션법 또는 인산칼륨법을 사용할 수 있다.
또한, 본 발명은 중합성 화합물을 포함하는 매체 중에서, 상기 실시 형태의 어느 것에 기재된 DNA를 갖는 형질 전환체를 배양하는 공정과, 형질 전환체에 있어서 형성되어 축적된 폴리머를 회수하는 공정을 포함하는 폴리머를 생성하기 위한 프로세스를 개시한다.
숙주를 배양하기 위하여 사용되는 종래의 방법도, 형질 전환체를 배양하기 위하여 사용된다. 형질 전환체의 배지는 또한 숙주로서의 쿠프리아비두스속 및 슈도모나스속에 속하는 미생물을 위하여 사용된다. 이들 배지는 질소원, 무기염류 또는 다른 유기 영양원이 제한된 미생물과 동화 가능한 탄소원을 포함하는 배지, 예를 들어 영양원이 배지의 0.01중량％ 내지 0.1중량％의 범위에 있는 배지를 포함한다.
탄소원은 미생물의 증식에 필요하고, 동시에 글루코오스, 프룩토오스 , 수크로오스 또는 말토오스 등의 탄소의 출발 원료이기도 하다. 또한 탄소원으로서, 탄소 원자수가 2 이상인 유지 관련 물질을 사용할 수도 있다. 유지 관련 물질에는, 콘유, 대두유, 홍화유, 해바라기유, 올리브유, 야자유, 팜유, 채종유, 어유, 경유, 돼지 기름, 소 등의 천연 유지; 아세트산, 프로피온산, 부탄산, 펜탄산, 헥산(hexoic)산, 옥탄산, 데칸산, 라우르산, 올레산, 팔미트산, 리놀렌산, 리놀레산, 미리스트산 등의 지방산; 에탄올, 프로판올, 부탄올, 펜탄올, 헥산올, 옥탄올, 라우릴알코올, 올레일알코올, 팔미틸알코올 등의 알코올 및 그들의 에스테르를 들 수 있다. 한편, 염, 펩톤, 육 추출물, 효모 추출물 또는 옥수수 침지액. 무기물은 인산이수소나트륨, 인산수소이나트륨, 인산이수소칼륨, 황산칼륨, 인산일칼륨, 인산이칼륨, 인산마그네슘, 염화칼슘, 황산마그네슘 및 염화암모늄을 포함한다.
배양은 발현이 유도된 후, 30℃ 내지 34℃에서 24시간 이상, 바람직하게는 1 내지 3일간 진탕하면서 호기성 조건 하에서 행하는 것이 바람직하다. 배양 중에, 암피실린, 카나마이신, 겐타마이신, 안티피린 또는 테트라사이클린 등의 항생 물질을 배양물에 첨가할 수 있다. 이에 의해 폴리머를 미생물에 축적시켜, 폴리머를 회수할 수 있다.
유도성 프로모터를 사용하여 발현 벡터에서 형질 전환된 미생물을 배양하기 위해서, 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노시드(IPTG)나 인돌아크릴산(IAA) 등의 그의 유도 물질을 배지에 첨가할 수도 있다. 동물 세포로부터 형질 전환체를 숙주로서 배양하기 위해서는, RPMI-1640이나 소태아 혈청을 보충한 DMEM 등의 배지를 사용할 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시 형태에 따르면, 배양은 통상적으로 5％ CO2의 존재 하, 30℃ 내지 37℃에서 14 내지 28일간 실시된다. 배양 중에 있어서는, 카나마이신 또는 페니실린 등의 항생 물질을 배지에 첨가할 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시 형태에 따르면, 폴리머 정제 공정도 실시할 수 있다. 바람직하게는, 형질 전환체를 원심 분리에 의해 배양물로부터 회수하고, 증류수 및 헥산으로 세정하고, 건조시킨다. 그 후, 건조시킨 형질 전환체를 클로로포름에 현탁하고, 가열하여 폴리머를 추출한다. 잔사는 여과에 의해 제거할 수 있다. 바람직하게는, 이 클로로포름 용액에 메탄올을 첨가하여 폴리머를 침전시킨다. 여과 또는 원심 분리에 의해 상청을 제거한 후, 침전물을 건조시켜서 정제 폴리머를 얻는다. 얻어진 폴리머는 통상의 방법, 예를 들어 가스 크로마토그래피, 핵자기 공명법 등에 의해 원하는 것임이 확인된다.
이 폴리머 합성 효소는, 식 (I)(식 중, R은 수소 원자 또는 탄소수 1 내지 4의 알킬기를 나타낸다)로 표시되는 모노머 단위 3-히드록시알칸산(3-hydroxyalkanoic acid)을 포함하는 코폴리머(폴리머)를 합성할 수 있다.
Figure pct00001
바람직하게는, 폴리머는 폴리히드록시알카노에이트이다. 폴리머는 [P(3HB-co-3HV)] 랜덤 코폴리머, [P(3HB-co-3HHx)] 랜덤 코폴리머, [P(3HB-co-3H4MV)] 랜덤 코폴리머, [P(3HB-co-4HB)] 랜덤 코폴리머 및 [P(3HB-co-5HV)] 랜덤 코폴리머를 포함하는 코폴리머일 수 있다.
폴리(3-히드록시부티레이트)[P(3HB)]를 생성하기 위한 종래부터의 프로세스는, 이 폴리머가 고결정성 폴리머이기 때문에 내충격성이 부족하다고 하는 물리적 성질의 문제를 야기한다. 탄소수 5의 3-히드록시발레레이트 또는 탄소수 6의 3-히드록시헥사노에이트를 폴리머쇄에 도입함으로써 결정화도가 저하된다. 폴리머는 열 안정성 및 성형성도 우수한 가요성 폴리머 재료로서 작용한다.
본 발명에 있어서는 BPM-CPF-4의 폴리머 합성 효소를 사용함으로써, P(3HB-co-3HHx) 코폴리머를 고수율로 생성할 수 있다. 상기 수단을 사용하여 원하는 폴리머를 대량으로 얻을 수 있기 때문에, 실이나 필름 등의 생분해성 재료로서 사용할 수 있다. 또한, 본 발명의 유전자는 P(3HB-co-3HHx) 코폴리머를 고생성하는 주의 육종에도 사용할 수 있다.
본 발명에서는, 폴리머 합성 효소(이 경우에는 BPM-CPF-4의 폴리머 합성 효소)와 에노일-CoA 히드라타아제를 공발현시킴으로써, P(3HB-co-3HHx) 코폴리머를 더 높은 3HHx 조성으로 생성할 수 있다. 상기 수단을 사용하여 원하는 폴리머를 대량으로 얻을 수 있기 때문에, 실이나 필름 등의 생분해성 재료로서 사용할 수 있다. 또한, 본 발명의 유전자는 더 높은 3HHx 조성을 갖는 P(3HB-co-3HHx) 코폴리머를 생성하는 주를 육종하기 위하여 사용할 수 있다.
본 발명에 있어서는 BPM-CPF-4의 폴리머 합성 효소를 사용함으로써, P(3HB-co-4HB) 및 P(3HB-co-5HV) 코폴리머를 고수율로 생성할 수 있다. 이들 코폴리머는 4HB 및 5HV의 리파아제 분해성 모노머 서열을 도입하는 그 능력을 때문에, 여러가지 생물 의학적 용도로 사용된다.
출원인의 개시는 첨부된 특허 청구 범위에 포함되는 것, 및 전술한 설명의 것을 포함한다. 이것은 어느 정도의 상세성으로부터 그의 바람직한 것으로서 기재되어 있지만, 바람직한 형태의 본 개시는 예로서만 이루어진 것이며, 구성의 상세 그리고 부품의 조합 및 배치에 있어서의 많은 변경이 본 발명의 범위로부터 일탈하지 않고 행하여질 가능성이 있음을 이해해야 한다.
실시예
이하, 본 발명의 다른 양태 및 실시 형태를 예시하기 위하여 실시예를 나타낸다. 이들 실시예는 개시된 발명을 한정하는 것이 의도되는 것은 아니고, 당해 발명은 특허 청구 범위에 의해서만 한정된다.
[실시예 1]
맹그로브 토양 메타게놈으로부터의 폴리머 합성 효소 유전자의 클로닝
처음에, 메타게놈 DNA를 MoBio PowerSoil DNA 단리 키트를 사용하여 직접 맹그로브 토양으로부터 단리하였다.
샷건 메타게놈 시퀀싱은 Illumina HiSeq 2000 플랫폼을 사용한 125bp의 페어 엔드 시퀀싱을 사용하여 행하였다. 자동 서열 전처리(품질 체크) 및 유전자 주석을 위해서, 미가공 서열(필터 없음)을 메타게노믹스 RAST 서버(MG-RAST)에 제출하였다. 메타게놈 데이터는 ID: mgm4512801.3(Balik Pulau_mangrove) 하에서 MG-RAST 데이터베이스에 기탁되었다. PHA 합성 효소의 인실리코 유전자 마이닝을 위해서, NCBI 참조 서열(RefSeq) 데이터베이스에 대한 「PHA 합성 효소」로서 주석된 모든 서열 또는 판독(∼120∼260bp)을 MGRAST 서버 버전 3으로부터, 5개의 컨센서스 키워드: 히드록시부티레이트, 히드록시알카노에이트, 히드록시알칸산, PHA 및 PHB를 사용하여 검색하였다. 모든 주석 및 서열 정보는 MG-RAST RESTful API(Application Programming Interface(애플리케이션·프로그래밍·인터페이스))를 통하여 MG-RAST 데이터베이스로부터 검색하였다. 맹그로브 토양 메타게놈 데이터로부터의 완전 전체 길이 또는 거의 전체 길이의 PHA 합성 효소 유전자는, PHA 합성 효소로서 이전에 주석된 서열의 서브세트에 대하여 SPAdes 3.5.0-Darwin(St. Petersburg 게놈 어셈블러)을 사용하여 드노보 DNA 서열 어셈블리를 행함으로써 얻어졌다. 그 후의 분석을 위해서, 1kb를 초과하는 크기의 콘티그 집합체를 선택하였다. GenBank 비중복 단백질 서열 데이터베이스에 대하여 BLASTX를 실시하여 유사한 서열을 검색하고, 부분적 또는 완전한 PHA 합성 효소의 올바른 리딩 프레임을 결정하였다.
이어서, 메타게놈 DNA로부터 폴리머 합성 효소 유전자를 포함하는 DNA 단편을 얻기 위해서 프로브를 조제하였다. 참조로서 NCBI 데이터베이스를 사용하여 설계되는 2개의 도메인 특이적 올리고뉴클레오티드(서열 번호 5 및 서열 번호 6)를 합성하였다.
이들 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 하고, 맹그로브 토양의 메타게놈 DNA를 주형으로 한 PCR에 의해 폴리머 합성 효소 유전자를 증폭하였다. PCR 조건은 이하와 같았다: 94℃에서 3분간; 94℃에서 30초간, 57℃에서 30초간 및 72℃에서 2분간의 30사이클; 그리고 72℃에서 10분간의 최종 공정.
이 단편으로부터의 1.7kbp의 HindIII-ApaI의 뉴클레오티드 서열을 생어(Sanger)법에 의해 결정하였다. 서열 번호 1의 뉴클레오티드 서열(1656)을 포함하는 폴리머 합성 효소 유전자를 취득하였다.
[실시예 2]
쿠프리아비두스 네카토르 형질 전환체의 조제
HindIII-ApaI 폴리머 합성 효소 유전자 단편을, 먼저 동일한 제한 효소로 절단한 클로닝 벡터 pCR(등록 상표) 4-TOPO(등록 상표)(미국, Invitrogen)에 처음에 삽입하였다. 이어서, 단편을 HindIII 및 ApaI 제한 효소로 다시 소화하고, 얻어진 HindIII-ApaI 폴리머 합성 효소 유전자 단편을 쿠프리아비두스속에 속하는 미생물에 있어서 발현 가능한 재조합 벡터 pBBR1MCS-2에 삽입하고, 얻어진 재조합 플라스미드를 콘주게이션 전사법에 의해 쿠프리아비두스 네카토르 PHB-4(DSM541)(폴리머의 합성 능력이 결손된 주)로 형질 전환하였다.
먼저, 재조합 플라스미드를 사용하여 대장균 S17-1을 염화칼슘법으로 형질 전환하였다. 이와 같이 하여 얻어진 재조합 대장균 및 쿠프리아비두스 네카토르 PHB-4를 트랜스콘쥬게이트하였다. 재조합 대장균 및 쿠프리아비두스 네카토르 PHB-4를 1.5mL의 LB 배지 및 30℃의 영양 풍부한 배지 중에서 밤새 배양하고, 각각의 배양물(각각 0.1mL)을 합치고, 실온에서 1시간 셰이커 상에서 배양하였다. 이어서, 혼합물을 진탕하지 않고 30분간 인큐베이트하고, 그 후 30분간 다시 진탕하였다. 이 미생물 혼합물을 300mg/L의 카나마이신을 함유하는 시몬즈 시트르산한천 상에 파종하고, 30℃에서 2일간 배양하였다.
쿠프리아비두스 네카토르 PHB-4는 재조합 대장균 중의 플라스미드를 그것에 이입함으로써 카나마이신에 대하여 내성이 되므로, 시몬즈 시트르산한천 상에서 증식한 콜로니는 쿠프리아비두스 네카토르의 형질 전환체이다.
[실시예 3]
쿠프리아비두스 네카토르 형질 전환체에 의한 폴리머의 합성
쿠프리아비두스 네카토르 형질 전환체를, 1ml/L의 미량 원소를 함유하는 50mL의 미네랄 배지(0.25g/L 황산마그네슘 7수화물, 3.32g/L 인산수소이나트륨, 2.8g/L 인산이수소칼륨, 0.5g/L 염화암모늄)에 접종하고, 플라스크 내에서 30℃에서 인큐베이트하였다. 50mg/L의 카나마이신을 쿠프리아비두스 네카토르 형질 전환체용의 배지에 첨가하고, 미생물을 48시간 배양하였다.
쿠프리아비두스 네카토르 형질 전환체 및 PHB-4의 균주를 각각 프룩토오스 10g/L 및 조 팜핵유(CPKO) 6g/L를 첨가한 상기 미네랄 배지에 접종하고, 각 주를 250mL 플라스크 중에서 30℃에서 48시간 배양하였다. 전구체 탄소원을 코폴리머 생성을 위하여 첨가하였다. 50mg/L의 카나마이신을 쿠프리아비두스 네카토르 형질 전환체의 배지에 첨가하였다.
배양물을 원심 분리에 의해 회수하고, 증류수 및 헥산으로 (CPKO의 존재 하) 세정하고, 동결 건조하고, 건조시킨 미생물의 중량을 측정하였다. 건조 미생물 15 내지 20mg에 2mL의 황산/메탄올 혼합물(15:85)과 2mL의 클로로포름을 첨가하고, 단체를 밀봉하고, 100℃에서 140분간 가열하여 미생물 중의 폴리머를 메틸에스테르에 분해시켰다. 이것에 1mL의 증류수를 첨가하고, 격렬하게 와동시켰다. 이것을 방치하여 2층으로 분리하고, 하측의 유기층을 취출하고, 캐필러리 칼럼을 통한 캐필러리 가스 크로마토그래피에 의해 성분을 분석하였다. PHA 함량은, SPB-1 칼럼(미국, Supelco)을 구비한 Shimadzu GC-2010 시스템을 사용한 가스 크로마토그래피(GC)에 의해 측정하였다. 칼럼 온도는 70℃에서 개시하고, 이어서 10℃/분의 연속 스텝으로 280℃로 상승시켰다. 내부 표준으로서 카프릴산메틸에스테르(CME)를 사용하여 PHA 함량 및 조성을 정량하였다. 결과를 표 1에 도시하였다.
표 1은 프룩토오스로부터의 쿠프리아비두스 네카토르 형질 전환체, 다른 전구체 탄소원을 첨가한 프룩토오스의 혼합물 및 CPKO에 의한 PHA의 생합성을 나타낸다.
Figure pct00002
출발 배양물로부터의 3％ 접종물(O.D=4.5 까지)을 250mL 삼각 플라스크 중의 50mL의 MM에 옮기고, 30℃, 48시간, 200rpm으로 인큐베이트하였다. 보고된 값은 3회 배양의 평균값±SD이다.
a 동결 건조 세포에 있어서의 PHA 함량
3HB: 3-히드록시부티레이트; 3HV: 3-히드록시발레레이트; 5HV: 5-히드록시발레레이트; 4HB: 4-히드록시부티레이트; 3H4MV: 3-히드록시-4-메틸발레레이트; 3HHx: 3-히드록시헥사노에이트
표 1의 결과에 기초하여, 형질 전환체는 P(3HB) 호모폴리머의 생성에 프룩토오스를 이용할 수 있었다. 세포 건조 중량: 3.7±0.1g/L 및 폴리머 함유량: 미생물의 75±9중량％. CPKO를 유일한 탄소원으로서 사용한 경우, 더 낮은 세포 건조 중량이 얻어졌다. 형질 전환체의 세포 바이오매스는 2.8±0.2g/L이며, 폴리머 함량은 미생물의 62±5중량％였다. 흥미 깊은 것은, CPKO의 존재 하에서 형질 전환체 중에 7몰％의 3HHx를 갖는 P(3HB-co-3HHx) 코폴리머의 축적이 관찰되었다.
P(3HB-co-3HV) 코폴리머의 생성을 조사하기 위해서, 프룩토오스를 보충한 배양물에 발레르산나트륨을 첨가하였다. 형질 전환체에 의해 생성된 3HV 조성은 13±1mol％였다. 형질 전환체의 세포 바이오매스는 2.5±0.1g/L이며, 이 형질 전환체에 의해 생성된 폴리머 함량은 미생물의 58±7중량％였다.
P(3HB-co-5HV) 코폴리머의 생성을 조사하기 위해서, 5-히드록시발레르산나트륨을 프룩토오스를 보충한 배양물에 첨가하였다. 형질 전환체가 생성하는 5HV 조성은 23±0mol％였다. 형질 전환체의 세포 바이오매스는 3.8±0.9g/L이며, 이 형질 전환체에 의해 생성되는 폴리머 함량은 미생물의 67±8중량％였다.
P(3HB-co-4HB) 코폴리머의 생성을 조사하기 위해서, 프룩토오스를 보충한 배양물에 4-히드록시부티르산나트륨을 첨가하였다. 형질 전환체가 생성한 4HB 조성은 14±1mol％였다. 형질 전환체의 세포 바이오매스는 2.8±0.1g/L이며, 이 형질 전환체에 의해 생성된 폴리머 함량은 미생물의 58±1중량％였다.
또한, P(3HB-co-4HB) 코폴리머의 생성을 조사하기 위해서, 프룩토오스를 보충한 배양물에 γ-부티로락톤을 첨가하였다. 형질 전환체는 호모폴리머 P(3HB)만을 생성하였다. 형질 전환체의 세포 바이오매스는 3.7±0.1g/L이며, 이 형질 전환체에 의해 생성된 폴리머 함량은 미생물의 66±2중량％였다
P(3HB-co-3H4MV) 코폴리머의 생성을 조사하기 위해서, 프룩토오스를 보충한 배양물에 이소카프로산을 첨가하였다. 형질 전환체가 생성하는 3HV 조성은 10±1mol％였다. 형질 전환체의 세포 바이오매스는 1.6±0.0g/L이며, 이 형질 전환체에 의해 생성된 폴리머 함량은 미생물의 45±5중량％였다.
P(3HB-co-3HHx) 코폴리머의 생성을 조사하기 위해서, 프룩토오스를 보충한 배양물에 헥산산나트륨을 첨가하였다. 형질 전환체에 의해 생성된 3HHx 조성은 18±2mol％였다. 형질 전환체의 세포 바이오매스는 1.9±0.1g/L이며, 이 형질 전환체에 의해 생성된 폴리머 함량은 미생물의 44±1중량％였다.
약 1그램의 동결 건조 세포를 50mL의 클로로포름과 혼합하고, 실온에서 3일간 교반하였다. 이 혼합물을 와트만 No.1 여과지를 사용하여 여과하여 세포 파편을 제거하였다. 이어서, 얻어진 투명 용액을 격렬하게 교반하고 있는 빙랭한 메탄올 중에 적하하여 PHA 폴리머를 침전시켰다. 침전된 폴리머를 진공 여과를 사용하여 메탄올 용액으로부터 분리하고, 이어서 실온에서 밤새 건조시켰다. 세균 세포로부터의 PHA의 용매 추출은 통상적으로 최고 순도(95 내지 100％)의 PHA 폴리머를 생성할 수 있었다.
얻어진 폴리머를 핵자기 공명에 의해 확인한다. 합계 25mg의 폴리머 시료를 1mL의 중수소화클로로포름(CDCL3)에 용해한다. PHA 폴리머는 500MHz로 조작하는 Bruker AVANCE 500(미국)을 사용하여 1H NMR 분광법에 의해 분석하였다. 그 결과를 도 6 및 도 7에 도시하였다.
[실시예 4]
스트렙토마이세스종 CFMR7 유래의 에노일-CoA 히드라타아제 유전자의 클로닝
처음에 게놈 DNA를 단리하였다. 스트렙토마이세스종 CFMR7 QIAamp DNA 미니 키트.
서열 번호 5 및 서열 번호 6을 치환하기 위하여 서열 번호 7 및 8의 프라이머를 사용하여 반복 실험을 행해서([0079] 내지 [0083]), SwaI 제한 부위를 갖는 BP-M-CPF4의 폴리머 합성 효소를 갖는 벡터를 조제하였다.
스트렙토마이세스종 CFMR7의 게놈 DNA로부터 에노일-CoA 히드라타아제 유전자를 증폭하기 위해서, 2개의 특이적 올리고뉴클레오티드(서열 번호 9 및 서열 번호 10)를 합성하였다.
이들 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 하고, 스트렙토마이세스종 CFMR7 유래의 게놈 DNA를 사용하여, PCR에 의해 에노일-CoA 히드라타아제 유전자를 증폭하였다. PCR 조건은 이하와 같았다: 94℃에서 3분간; 94℃에서 30초간, 57℃에서 30초간 및 72℃에서 2분간의 30사이클; 그리고 72℃에서 10분간의 최종 공정.
이 단편으로부터의 850bp의 SwaI-SwaI의 뉴클레오티드 서열을 생어법에 의해 결정하였다.
[실시예 5]
쿠프리아비두스 네카토르 형질 전환체의 조제
SwaI-SwaI 에노일-CoA 히드라타아제 유전자 단편을, 이전에 구축한([0099]) BP-M-CPF4의 폴리머 합성 효소를 갖는 재조합 벡터 pBBR1MCS-2에 삽입하고, 얻어진 재조합 플라스미드를 콘주게이션 전사법에 의해 쿠프리아비두스 네카토르 PHB-4(DSM541)(폴리머의 합성 능력이 결손된 주)로 형질 전환하였다. [0099]의 재조합 벡터 구축물도 에노일-CoA 히드라타아제의 효과를 비교하기 위한 음성 대조로서 사용하였다.
처음에, 재조합 플라스미드를 사용하여 대장균 S17-1을 염화칼슘법에 의해 형질 전환하였다. 이와 같이 하여 얻어진 재조합 대장균 및 쿠프리아비두스 네카토르 PHB-4를 트랜스콘쥬게이트하였다. 재조합 대장균 및 쿠프리아비두스 네카토르 PHB-4를 1.5mL의 LB 배지 및 30℃의 영양 풍부한 배지 중에서 밤새 배양하고, 각각의 배양물(각각 0.1mL)을 합치고, 실온에서 1시간 셰이커 상에서 배양하였다. 이어서, 혼합물을 진탕하지 않고 30분간 인큐베이트하고, 그 후 30분간 다시 진탕하였다. 이 미생물 혼합물을 300mg/L의 카나마이신을 함유하는 시몬즈 시트르산한천 상에 파종하고, 30℃에서 2일간 배양하였다.
쿠프리아비두스 네카토르 PHB-4는 재조합 대장균 중의 플라스미드를 그것에 이입함으로써 카나마이신에 대하여 내성이 되므로, 시몬즈 시트르산한천 상에서 증식한 콜로니는 쿠프리아비두스 네카토르의 형질 전환체이다.
[실시예 6]
쿠프리아비두스 네카토르 형질 전환체에 의한 폴리머의 합성
쿠프리아비두스 네카토르 형질 전환체의 각각을 50mL의 미네랄 배지(4.0g/L NaH2PO4, 4.6g/L Na2HPO4, 0.45g/L K2SO4, 0.54g/L 요소, 0.39g/L MgSO4, 0.062g/L CaCl2 및 1ml/L의 미량 원소)에 접종하고, 플라스크 내에서 30℃에서 인큐베이트하였다. 미량 원소 용액은, 0.1M 염산에 용해한 15g/L FeSO4·7H2O, 2.4g/L MnSO4·H2O, 2.4g/L ZnSO4·7H2O 및 0.48g/L CuSO4·5H2O를 포함하는 것이었다. 50mg/L의 카나마이신을 쿠프리아비두스 네카토르 형질 전환체용의 배지에 첨가하고, 미생물을 48시간 배양하였다.
쿠프리아비두스 네카토르 형질 전환체의 각 주를 6g/L의 팜올레인(PO) 조 팜핵유(CPKO)를 첨가한 상기 미네랄 배지에 접종하고, 각 주를 250mL 플라스크 내에서 30℃에서 48시간 배양하였다. 50mg/L의 카나마이신을 쿠프리아비두스 네카토르 형질 전환체의 배지에 첨가하였다.
배양물을 원심 분리에 의해 회수하고, 증류수 및 헥산으로 (CPKO의 존재 하) 세정하고, 동결 건조하고, 건조시킨 미생물의 중량을 측정하였다. 건조 미생물 15 내지 20mg에 2mL의 황산/메탄올 혼합물(15:85)과 2mL의 클로로포름을 첨가하고, 단체를 밀봉하고, 100℃에서 140분간 가열하여 미생물 중의 폴리머를 메틸에스테르에 분해시켰다. 이것에 1mL의 증류수를 첨가하고, 격렬하게 교반시켰다. 이것을 방치하여 2층으로 분리하고, 하측의 유기층을 취출하고, 캐필러리 칼럼을 통한 캐필러리 가스 크로마토그래피에 의해 성분을 분석하였다. PHA 함량은, SPB-1 칼럼(미국, Supelco)을 구비한 Shimadzu GC-2010 시스템을 사용한 가스 크로마토그래피(GC)에 의해 측정하였다. 칼럼 온도는 70℃에서 개시하고, 이어서 10℃/분의 연속 스텝으로 280℃로 상승시켰다. 내부 표준으로서 카프릴산메틸에스테르(CME)를 사용하여 PHA 함량 및 조성을 정량하였다. 결과를 표 1에 나타내었다.
약 1그램의 동결 건조 세포를 50mL의 클로로포름과 혼합하고, 실온에서 3일간 교반하였다. 이 혼합물을 와트만 No.1 여과지를 사용하여 여과하여 세포 파편을 제거하였다. 이어서, 얻어진 투명 용액을 격렬하게 교반하고 있는 빙랭한 메탄올 중에 적하하여 PHA 폴리머를 침전시켰다. 침전된 폴리머를 진공 여과를 사용하여 메탄올 용액으로부터 분리하고, 이어서 실온에서 밤새 건조시켰다. 세균 세포로부터의 PHA의 용매 추출은 통상적으로 최고 순도(95 내지 100％)의 PHA 폴리머를 생성할 수 있었다.
얻어진 폴리머를 사용하고, Shodex K806-M 및 K802 칼럼(일본)을 구비한 Agilent Technologies 1200 시리즈 GPC(미국)를 사용하여, 겔 침투 크로마토그래피(GPC)에 의해 수 평균 분자량(Mn) 및 중량 평균 분자량(Mw)을 측정하였다. 클로로포름을 40℃에서 0.8mL/분의 유속으로 이동상의 용매로서 사용하였다. PHA 폴리머를 클로로포름에 용해하여 최종 농도 약 1.0mg/mL로 하고, 분석 전에 여과했다(PTFE막, 0.22㎛).
얻어진 폴리머를 핵자기 공명에 의해 확인한다. 합계 25mg의 폴리머 시료를 1mL의 중수소화클로로포름(CDCL3)에 용해한다. PHA 폴리머는 500MHz로 조작하는 Bruker AVANCE 500(미국)을 사용하여 1H NMR 분광법에 의해 분석하였다.
표 2는, PO 및 CPKO 유래의 phaJSs를 사용한 쿠프리아비두스 네카토르 형질 전환체에 의한 PHA의 생합성을 나타낸다.
Figure pct00003
출발 배양물로부터의 3％ 접종물(O.D=4.5까지)을 250mL 삼각 플라스크 중의 50mL의 MM에 옮기고, 30℃, 48시간, 200rpm으로 인큐베이트하였다. 표 중에 GC 및 GPC에 의한 분석에 의해 얻어진 결과를 나타냈다. 이 수치는 3회 배양의 평균값±SD이다.
a 동결 건조 세포에 있어서의 PHA 함량
3HB: 3-히드록시부티레이트; 3HHx: 3-히드록시헥사노에이트
표 2의 결과로부터 phaJ를 갖는 형질 전환체(PHB-4/pBBRMCS2_CBP-M-CPF4_JSs)는 phaJ를 포함하지 않는 형질 전환체(PHB-4/pBB1RMCS2_CBP-M-CPF4)와 비교하여 높은 3HHx 조성을 나타냈다.
PO에 있어서, PHB-4/pBBR1MCS2_CBP-M-CPF4의 세포 바이오매스는 4.9±0.5g/L이며, 폴리머 함량은 미생물의 53±6중량％였다. 4몰％의 3HHx를 갖는 P(3HB-co-3HHx) 코폴리머의 축적이 관찰되고, 코폴리머의 분자량(Mw)은 9.9×105Da였다.
CPKO에서 PHB-4/pBBR1MCS2_CBP-M-CPF4의 세포 바이오매스는 5.6±0.3g/L이며, 폴리머 함량은 미생물의 58±2중량％였다. 3HHx를 7mol％ 포함하는 P(3HB-co-3HHx) 코폴리머의 축적이 관찰되고, 코폴리머의 분자량(Mw)은 12.3×105Da였다.
PO에서 PHB-4/pBBRMCS2_CBP-M-CPF4_JSs의 세포 바이오매스는 5.0±0.1g/L이며, 폴리머 함량은 미생물의 54±4중량％였다. 3HHx 12mol％의 P(3HB-co-3HHx) 코폴리머의 축적이 관찰되고, 코폴리머의 분자량(Mw)은 8.0×105Da였다.
CPKO에 있어서 PHB-4/pBBRMCS2_CBP-M-CPF4_JSs의 세포 바이오매스는 5.6±0.1g/L이며, 폴리머 함유량은 미생물의 62±4중량％였다. 3HHx의 18mol％의 P(3HB-co-3HHx) 코폴리머의 축적이 관찰되고, 코폴리머의 분자량(Mw)은 8.9×105Da였다.
표 2에 나타낸 결과와 같이, 생성된 폴리머의 구조는 P(3HB-co-3HHx)와 3HHx 모노머의 혼합물인 것을 1H NMR 분광법에 의해 확인할 수 있었다. 그 혼합물의 조성은, phaJ를 사용하지 않은 형질 전환체(PHB-4/pBBRMCS2_CBP-M-CPF4) 또는 phaJ를 사용한 형질 전환체(PHB-4/pBBR1MCS2_CBP-M-CPF4_JSs)에 의한 생합성에 있어서, 탄소원을 각각 CPO로 한 경우, CPKO로 한 경우에, 3HHx 모노머로서 5mol％, 10mol％ 또는 13mol％, 20mol％였다. 결과를 도 8 및 도 9에 도시하였다.
도 8은, phaJ를 포함하지 않는 형질 전환체(PHB-4/pBBRMCS2_CBP-M-CPF4)와, 탄소원으로서 (a) PO 또는 (b) CPKO를 사용하여 생성된 폴리머의 1H NMR 분광법에 의한 분석 결과이다. 1H NMR 분광법에 의해 산출한 3HHx 모노머의 함유량은 각각 (a) 5mol％, (b) 10mol％였다.
도 9는, phaJ를 포함하는 형질 전환체(PHB-4/pBBR1MCS2_CBP-M-CPF4_JSs)와, 탄소원으로서 (a) PO 또는 (b) CPKO를 사용하여 생성된 폴리머의 1H NMR 분광법에 의한 분석 결과이다. 1H NMR 분광법에 의해 산출한 3HHx 모노머의 함유량은 각각 (a) 13mol％, (b) 20mol％였다.
SEQUENCE LISTING <110> FUENCE Co., LTD. <120> GENE ENCODING POLYMER SYNTHASE AND A PROCESS FOR PRODUCING POLYMER <130> 19P0083WO <160> 10 <210> 1 <211> 544 <212> PRT <213> mangrove soil metagenome <400> 1 Met Ala Ser Lys Asp Ser Phe Gly Lys Thr Gly Asp Leu Trp Ser Ser 1 5 10 15 Met Phe Asn Trp Met Ser Gly Thr Met Thr Ala Ala Ala Gln Ile Gln 20 25 30 Gln Ala Asn Met Arg Ala Phe Ala Gln Ser Met Glu Leu Ala Thr Ser 35 40 45 Ala Tyr Ala Arg Met Trp Gly Gln Pro Val Glu Gln Val Val Pro Ala 50 55 60 Asp Arg Arg Phe Lys Asp Glu Ala Trp Thr Glu Asn Met Ala Ala Asp 65 70 75 80 Leu Leu Lys Gln Ser Tyr Leu Ile Thr Ser Gln Leu Met Glu Ile Ala 85 90 95 Asp Gly Trp Gln Ala Ile Asp Pro Asp Leu His Glu Arg Thr Arg Phe 100 105 110 Trp Thr Gln Gln Leu Val Asp Ala Thr Ser Pro Ala Asn Phe Ala Met 115 120 125 Thr Asn Pro Val Val Met Gln Glu Ile Ala Arg Thr Gly Gly Met Asn 130 135 140 Leu Ile Gln Gly Ala Gln Asn Leu Leu Lys Asp Ala Gln Ser Gly Arg 145 150 155 160 Leu Thr Gln Val Pro Glu Asp Ala Phe Glu Val Gly Lys Asp Leu Ala 165 170 175 Ile Thr Pro Gly Lys Val Val Tyr Arg Asn Arg Leu Glu Leu Ile Gln 180 185 190 Tyr Thr Pro Ala Thr Glu Thr Val His Glu Ile Pro Ile Leu Val Val 195 200 205 Pro Pro Trp Ile Asn Lys Tyr Tyr Val Met Asp Met Gln Pro Glu Asn 210 215 220 Ser Leu Phe Lys Tyr Leu Val Asp Ala Gly Phe Leu Phe Thr Ile Ser 225 230 235 240 Trp Lys Asn Pro Asp Glu Thr Val Leu Asp Leu Glu Trp Asp Asp Tyr 245 250 255 Leu Asp Leu Gly Thr Leu Glu Ala Leu Arg Met Val Lys Glu Ile Met 260 265 270 Gly Val Glu Gln Val Asn Leu Val Gly Tyr Cys Leu Gly Ile Ile Ser 275 280 285 Gln Val Thr Leu Ala Tyr Leu Ala Ala Thr Gly Asp Asp Ala Gln Ile 290 295 300 Asn Ser Ala Thr Tyr Phe Thr Thr His Gln Asp Phe Ser Asp Ala Gly 305 310 315 320 Glu Ile Ser Val Phe Ile Ser Arg Leu Asp Val Met Phe Leu Glu Met 325 330 335 Lys Ile Ser Gly Gly Tyr Leu Asp Gly Arg Asn Leu Ala Ala Thr Phe 340 345 350 Asn Met Leu Arg Ala Asn Asp Leu Leu Trp Asn Tyr Val Val His Asn 355 360 365 Tyr Leu Leu Gly Gln Glu Pro Ala Ser Phe Asp Leu Leu Tyr Trp Asn 370 375 380 Asn Asp Gly Thr Arg Val Pro Gly Lys Val His Ser Phe Leu Leu Arg 385 390 395 400 Glu Phe Phe Leu Asp Asn Lys Leu Lys Glu Pro Glu Gly Ile Gln Val 405 410 415 Lys Gly Val Gly Ile Asp Leu Gly Lys Ile Thr Thr Pro Thr Val Val 420 425 430 Thr Ala Asp Arg Asp His Ile Val Pro Trp Arg Gly Ala Phe Leu Val 435 440 445 Arg Gln Leu Gln Ser Gly Pro Val Arg Phe Ile Leu Ser Gly Gly Gly 450 455 460 His Ile Ala Gly Val Ile Ser Pro Pro Thr Lys Asn Arg Gly Phe Trp 465 470 475 480 Ile Asn Glu Glu Glu Lys Asp Asp Ala Asp Ala Trp Leu Ala Gly Ala 485 490 495 Thr Lys His Asp Gly Ser Trp Trp Val Asp Trp Ile Pro Trp Leu Glu 500 505 510 Glu Arg Ser Gly Arg Arg Val Lys Pro Pro Thr Ala Ala Gly Ser Asp 515 520 525 Glu Phe Lys Pro Leu Met Asp Ala Pro Gly Thr Tyr Val Leu Glu Lys 530 535 540 <210> 2 <211> 1656 <212> DNA <213> mangrove soil metagenome <400> 2 atggcgtcaa aggatagctt cgggaaaaca ggtgatttgt ggtcatcgat gttcaactgg 60 atgagcggga cgatgacggc cgcggcacag attcagcagg ctaatatgcg ggccttcgcc 120 caaagcatgg aactggcaac cagcgcctat gccaggatgt ggggtcagcc ggtcgaacag 180 gtcgtgccgg ccgatcgacg cttcaaggat gaggcctgga cggaaaacat ggccgccgat 240 ttgctcaaac agagctacct gatcaccagt cagtggctaa tggaaatcgc cgatggttgg 300 caggctatcg atcccgatct gcacgaacgg acccgcttct ggacacagca actcgtcgac 360 gccaccagcc cggctaactt cgccatgacc aacccggtgg tgatgcaaga gatagcccgc 420 actggcggca tgaacctgat ccagggggcg cagaatctat tgaaggatgc ccaaagtggc 480 cggctaaccc aagttcctga ggatgccttt gaggtaggta aggacctggc gatcacgccg 540 ggcaaggtcg tatatcgcaa ccgcctgatt gagttgatcc agtacacgcc ggccacagag 600 acggtccatg aaatccccat cttggtcgtg ccgccatgga tcaataagta ctacgtgatg 660 gacatgcagc cggagaattc gctgttcaag tacctggtgg atgccggctt caccctgttc 720 accatcagct ggaaaaaccc tgatgaaaca gttcttgacc tggaatggga cgactatctg 780 gatctgggca cgctggaagc gctgcgaatg gtcaaggaaa tcatgggtgt cgagcaggtg 840 aacctggtcg gctactgtct aggcgggatc atctcccagg taactttggc ctatctggcg 900 gccactggag acgacgcgca gataaacagc gcgacctatt tcaccaccca ccaggatttc 960 agcgatgcgg gcgagatctc ggtcttcatc agccggctgg acgtgatgtt cctggaatgg 1020 ttgatgaaga tcagcggcgg ctacctggat ggccggaacc tggcggctac cttcaacatg 1080 ctgcgggcca atgacctgct atggaattac gtggtccaca attatctctt gggccaggaa 1140 ccggcgtcct ttgatctact ctactggaat aatgacggca ccagggtacc gggcaaggtg 1200 cattcattcc tgctgcgcga attcttcctg gataacaaac tgaaggagcc cgagggtatt 1260 caggtgaagg gcgtgggcat tgacctcggt aaaatcacaa cgccaaccta tgtggtgacg 1320 gccgaccggg atcacatcgt gccctggcgg ggcgcattct tggtgcgcca gttgcagagc 1380 gggccggtgc gcttcatctt gagcggcggc ggacatatcg ccggggtcat tagcccaccc 1440 actaagaacc gcggcttttg gatcaacgaa gaagagaagg atgatgctga tgcctggctg 1500 gccggagcga ccaagcatga cggtagttgg tgggtagatt ggattccatg gctcgaggag 1560 cgctcgggaa gaagggtgaa gccaccgacg gccgccggca gcgacgagtt caaacccctc 1620 atggacgcgc caggcacgta cgttttggag aagtag 1656 <210> 3 <211> 285 <212> PRT <213> Streptomyces sp. <400> 3 Met Pro Ile Asp Ala Arg Ala Ala Leu Ala Ala Ala Pro Arg Arg Ala 1 5 10 15 Glu Ile Ala Trp Asn His Lys Asp Val Gln Leu Tyr His Leu Gly Leu 20 25 30 Gly Ala Gly Ile Pro Ala Thr Asp Pro Asp Glu Leu Arg Tyr Thr Leu 35 40 45 Glu Ser Arg Leu Gln Val Leu Pro Ser Phe Ala Thr Val Ala Gly Ala 50 55 60 Gly Thr Ala Ala Phe Gly Gly Met Gly Ala Asp Gly Ile Asp Val Asp 65 70 75 80 Leu Ala Ala Val Leu His Gly Gly Gln Ser Val Arg Val His Arg Pro 85 90 95 Ile Pro Val Thr Gly Arg Ala Val Gln Thr Ser Lys Val Ala Ala Val 100 105 110 Tyr Asp Lys Gly Lys Ala Ala Val Ile Val Leu Arg Thr Glu Ala His 115 120 125 Asp Asp Glu Gly Pro Leu Trp Thr Asn Asp Ala Gln Ile Phe Val Arg 130 135 140 Gly Glu Gly Gly Phe Gly Gly Glu Arg Gly Pro Ala Asp Arg Leu Ala 145 150 155 160 Leu Pro Asp Arg Ala Pro Asp Arg Thr Ala Glu Arg Pro Ile Arg Glu 165 170 175 Asp Gln Ala Leu Leu Tyr Arg Leu Ser Gly Asp Trp Asn Pro Leu His 180 185 190 Ala Asp Pro Ala Phe Ala Lys Leu Ala Gly Phe Asp Arg Pro Ile Leu 195 200 205 His Gly Leu Cys Thr Tyr Gly Met Val Leu Lys Ala Val Thr Asp Thr 210 215 220 Leu Leu Asp Gly Asp Val Ser Arg Ile Ala Ala Tyr Arg Thr Arg Phe 225 230 235 240 Ala Gly Val Val Phe Pro Gly Glu Thr Leu Arg Ile Arg Met Trp Gln 245 250 255 Val Gly Asp Gly Arg Val Gln Val Ala Val Thr Ala Ala Gly Arg Asp 260 265 270 Asp Ala Pro Val Leu Ala Asp Thr Leu Val Glu His Ser 275 280 285 <210> 4 <211> 855 <212> DNA <213> Streptomyces sp. <400> 4 atgcccatcg atgcccgagc ggccctcgcc gcagcccccc gccgagccga gatcgcctgg 60 aaccacaagg acgtccagct ctaccacctg ggcctcggcg cggggatccc cgccaccgac 120 ccggacgagc tgcgctacac cctggagtcc cggctccagg tgctgccgag cttcgccacc 180 gtcgcgggcg ccgggacggc cgccttcggc gggatgggcg cggacgggat cgacgtggac 240 ctcgccgccg tcctgcacgg cggccagtcc gtccgcgtcc accgcccgat ccccgtcacc 300 ggccgggccg tgcagacctc gaaggtcgcg gccgtgtacg acaagggcaa ggccgccgtc 360 atcgtgctcc gtaccgaggc gcacgacgat gaggggccgc tctggaccaa cgacgcgcag 420 atcttcgtac ggggagaggg cggattcggc ggcgagcgcg ggcccgccga ccgcctcgcc 480 ctgcccgacc gggcccccga ccgcaccgcc gaacgcccga tccgcgagga ccaggcgctg 540 ctctaccgcc tctccgggga ctggaacccg ctccacgccg acccggcctt cgccaagctc 600 gccggcttcg accggccgat cctgcacgga ctgtgcacgt acggcatggt cctcaaggcc 660 gtcaccgaca ccctgctgga cggcgacgtc tcccggatcg ccgcctaccg cacccgcttc 720 gccggagtgg tcttccccgg cgagaccctc cgcatccgga tgtggcaggt cggggacggg 780 cgcgtccagg tggccgtgac cgccgccgga cgggacgacg ccccggtcct cgcggacacg 840 ctcgtcgaac actcc 855 <210> 5 <211> 46 <212> DNA <213> mangrove soil metagenome <400> 5 agtaagcttc aaaggaggga aagtatggcg tcaaaggata gcttcg 46 <210> 6 <211> 32 <212> DNA <213> mangrove soil metagenome <400> 6 attgggccct tcgctcatca gtctacttct cc 32 <210> 7 <211> 44 <212> DNA <213> Streptomyces sp. <400> 7 agtaagcttc aaaggaggga aagtatggcg tcaaaggata gctt 44 <210> 8 <211> 37 <212> DNA <213> Streptomyces sp. <400> 8 tatgggccca tttaaatcta cttctccaaa acgtacg 37 <210> 9 <211> 43 <212> DNA <213> Streptomyces sp. <400> 9 atcatttaaa taggagggaa agtatgccca tcgatgcccg agc 43 <210> 10 <211> 35 <212> DNA <213> Streptomyces sp. <400> 10 agcatttaaa ttcaggagtg ttcgacgagc gtgtc 35

Claims (20)

  1. 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열, 또는 1개 이상의 아미노산이 치환, 결실 혹은 부가된 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, 또한 폴리머 합성 효소 활성을 갖는 폴리펩티드를 코드하는, 단리된 폴리뉴클레오티드.
  2. 제1항에 있어서, 서열 번호 2에 기재된 뉴클레오티드 서열, 혹은 1개 이상의 뉴클레오티드가 치환된 서열 번호 2에 기재된 뉴클레오티드 서열, 또는 그의 상보 서열을 포함하는, 단리된 폴리뉴클레오티드.
  3. 제1항에 있어서, 서열 번호 2에 기재된 뉴클레오티드 서열에 있어서, 티민이 우라실에 의해 치환되어 있는 뉴클레오티드 서열 또는 그의 상보 서열을 포함하는, 단리된 폴리뉴클레오티드.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 기재된 단리된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터.
  5. 제4항에 있어서, 플라스미드 또는 파지인, 재조합 벡터.
  6. 제4항에 기재된 재조합 벡터에 의해 형질 전환된 형질 전환체.
  7. 중합성 재료를 포함하는 배지에서, 제6항에 기재된 형질 전환체를 배양하는 공정과,
    상기 배양된 배지로부터 폴리머를 회수하는 공정
    을 포함하는, 폴리머의 제조 방법.
  8. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 기재된 단리된 폴리뉴클레오티드를 게놈에 갖는 재조합주.
  9. 중합성 재료를 포함하는 배지에서, 제8항에 기재된 재조합주를 배양하는 공정과,
    상기 배양된 배지로부터 폴리머를 회수하는 공정
    을 포함하는, 폴리머의 제조 방법.
  10. 제7항 또는 제9항에 있어서, 상기 폴리머가 폴리히드록시알카노에이트인, 폴리머의 제조 방법.
  11. 서열 번호 3에 기재된 아미노산 서열, 또는 1개 이상의 아미노산이 치환, 결실 혹은 부가된 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, 또한 히드라타아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코드하는, 단리된 폴리뉴클레오티드.
  12. 제11항에 있어서, 서열 번호 4에 기재된 뉴클레오티드 서열, 혹은 1개 이상의 뉴클레오티드가 치환된 서열 번호 2에 기재된 뉴클레오티드 서열, 또는 그의 상보 서열을 포함하는, 단리된 폴리뉴클레오티드.
  13. 제11항에 있어서, 서열 번호 4에 기재된 뉴클레오티드 서열에 있어서, 티민이 우라실에 의해 치환되어 있는 뉴클레오티드 서열, 또는 그의 상보 서열을 포함하는, 단리된 폴리뉴클레오티드.
  14. 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 기재된 단리된 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 그리고 폴리머 합성 효소 활성을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드를 더 포함하는 재조합 벡터.
  15. 제14항에 있어서, 플라스미드 또는 파지인, 재조합 벡터.
  16. 제14항에 기재된 재조합 벡터에 의해 형질 전환된 형질 전환체.
  17. 중합성 재료를 포함하는 배지에서, 제14항에 기재된 형질 전환체를 배양하는 공정과,
    상기 배양된 배지로부터 폴리머를 회수하는 공정
    을 포함하는, 폴리머의 제조 방법.
  18. 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 기재된 단리된 폴리뉴클레오티드를 게놈에 갖는 재조합주.
  19. 중합성 재료를 포함하는 배지에서, 제18항에 기재된 재조합주를 배양하는 공정과,
    상기 배양된 배지로부터 폴리머를 회수하는 공정
    을 포함하는, 폴리머의 제조 방법.
  20. 제17항 또는 제19항에 있어서, 상기 폴리머가 폴리히드록시알카노에이트인, 폴리머의 제조 방법.
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