CN114616320A - 转化微生物、以及使用了该微生物的聚羟基烷酸酯的制造方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供具有聚羟基烷酸酯合成酶基因、且降低了A1386基因和/或A2405基因的表达的转化微生物。该转化微生物可以还增强了minC基因及minD基因的表达。本发明还提供包括在碳源存在下对该转化微生物进行培养的工序的PHA的制造方法。

Description

转化微生物、以及使用了该微生物的聚羟基烷酸酯的制造 方法

技术领域

本发明涉及转化微生物、以及使用了该微生物的聚羟基烷酸酯的制造方法。

背景技术

在对环境问题、粮食问题、健康及安全的意识增高、天然或自然意愿增高等的背景下，利用微生物的物质制造(发酵生产、生物转化等)的意义及重要性日益增加，蛋白质医药品、基因治疗用的核酸等的制造也应用了基于微生物的物质生产。例如，利用了酵母、细菌等微生物的乙醇、乙酸、医疗用蛋白质的生产等在工业上得到了积极地应用。

作为其一例，可以举出聚羟基烷酸酯(以下也称为PHA)的基于微生物的生产，所述聚羟基烷酸酯被期待作为生物降解性塑料而进行工业利用(参照非专利文献1)。PHA是在多个微生物种类的细胞中作为能量储存物质而产生、蓄积的热塑性聚酯，具有生物降解性。目前，随着环保意识的提高，来源于非石油的塑料备受关注，特别是微生物在菌体内产生并蓄积的PHA会被纳入自然界的碳循环过程，因此预计对生态系统的不良影响小，迫切希望它的实用化。在利用微生物的PHA生产中，已知例如对贪铜菌属细菌给予作为碳源的糖、植物油脂、脂肪酸，使PHA在细胞内蓄积，从而生产PHA(参照非专利文献2及3)。

然而，在利用了微生物的物质生产中，存在微生物细胞、目标产物的分离回收工序繁杂、生产成本增高成为问题的情况。因此，提高分离回收效率是降低生产成本的一大课题。

已知，在生产PHA的微生物中的细胞的大型化中，例如，通过使抑制细胞分裂的蛋白质minCD过表达、或者破坏作为肽聚糖合成酶之一的单功能性肽聚糖糖基转移酶，从而使生产PHA的微生物细胞大型化(参照非专利文献4及专利文献1)。然而，关于肽聚糖的水解酶与生产PHA的微生物的细胞形态的关联性至今未见报道。

现有技术文献

非专利文献

非专利文献1：Anderson AJ.,et al.,Int.J.Biol.Macromol.,12,201-105(1990)

非专利文献2：Sato S.,et al.,J.Biosci.Bioeng.,120(3),246-251(2015)

非专利文献3：Insomphun C.,et al.,Metab.Eng.,27,38-45(2015)

非专利文献4：Shen R.,et al.,Metab.Eng.,54,117-126(2019)

专利文献1：国际公开第2016/194771号

发明内容

发明要解决的课题

PHA蓄积在微生物细胞内。为了将微生物细胞内蓄积的PHA用作生物降解性塑料，首先从培养液中分离回收微生物细胞。在微生物细胞的分离回收时，可以使用离心分离机、分离膜等，分离回收的容易程度、效率取决于微生物细胞的大小。即，微生物细胞越大，越能够容易效率良好地实施使用了离心分离机、分离膜等的分离回收，使生产成本降低。

鉴于上述现状，本发明的目的在于提供蓄积PHA、且能够大型化的转化微生物、以及使用了该转化微生物的PHA的制造方法。

解决课题的方法

本发明人等发现，通过降低被推定为贪铜菌属细菌中肽聚糖的水解酶的A0302基因、A0597基因、A1386基因、A2272基因、A2405基因中的任意基因的表达，结果会使A1386基因或A2405基因的表达降低，由此可以在保持工业上希望的PHA蓄积量的同时使微生物细胞大型化，从而完成了本发明。进一步发现，通过除了使上述A1386基因或A2405基因的表达降低以外，还增加minC基因及minD基因的表达，由此能够使微生物细胞更加大型化，从而完成了本发明。

即，本发明涉及具有聚羟基烷酸酯合成酶基因、且降低了A1386基因和/或A2405基因的表达的转化微生物。优选A1386基因是编码相对于序列号1所述的氨基酸序列具有85％以上序列同源性的氨基酸序列的基因，A2405基因是编码相对于序列号2所述的氨基酸序列具有85％以上的序列同源性的氨基酸序列的基因。该转化微生物可以还增强了minC基因及minD基因的表达。优选上述minC基因是编码相对于序列号3所述的氨基酸序列具有85％以上的序列同源性的氨基酸序列的基因，上述minD基因是编码相对于序列号4所述的氨基酸序列具有85％以上的序列同源性的氨基酸序列的基因。上述转化微生物优选属于贪铜菌属，更优选为钩虫贪铜菌的转化微生物。此外，本发明也涉及聚羟基烷酸酯的制造方法，该方法包括：在碳源的存在下对上述转化微生物进行培养的工序。上述聚羟基烷酸酯优选为2种以上的羟基烷酸的共聚物，更优选为含有3-羟基己酸作为单体单元的共聚物，进一步优选为3-羟基丁酸与3-羟基己酸的共聚物。

发明的效果

根据本发明，可以提供蓄积PHA且能够大型化的转化微生物、以及使用了该转化微生物的PHA的制造方法。根据本发明，由于蓄积PHA的微生物细胞大型化，因此，从培养液中分离回收微生物细胞变得容易，能够实现生产成本的降低。

附图说明

图1是拍摄培养后的KNK-005株(比较例1)得到的显微镜照片(照片中的比例尺表示10μm。图2～11相同。)

图2是拍摄培养后的A0597缺失破坏株(比较例2)得到的显微镜照片

图3是拍摄培养后的A0302缺失破坏株(比较例3)得到的显微镜照片

图4是拍摄培养后的A2272插入破坏株(比较例4)得到的显微镜照片

图5是拍摄培养后的A1386缺失破坏株(实施例1)得到的显微镜照片

图6是拍摄培养后的A2405插入破坏株(实施例2)得到的显微镜照片

图7是拍摄培养后的A2405缺失破坏株(实施例3)得到的显微镜照片

图8是拍摄培养后的A1386/A2405双重破坏株(实施例4)得到的显微镜照片

图9是拍摄培养后的minCD表达A1386破坏株(实施例5)得到的显微镜照片

图10是拍摄培养后的minCD表达A2405破坏株(实施例6)得到的显微镜照片

图11是拍摄培养后的minCD表达A2405·A1386破坏株(实施例7)得到的显微镜照片

具体实施方式

以下，对本发明的实施方式详细地进行说明。

本实施方式的转化微生物是具有PHA合成酶基因、且降低了A1386基因和/或A2405基因的表达的转化微生物。该转化生物可以还增强了minC基因及minD基因的表达。

(微生物)

本实施方式的转化微生物可以是以具有PHA合成酶基因且降低了A1386基因的表达的方式进行了转化的微生物。另外，可以是以具有PHA合成酶基因且降低了A2405基因的表达的方式进行了转化的微生物。另外，可以是以具有PHA合成酶基因、且降低A1386基因的表达而增强minC基因及minD基因的表达的方式进行了转化的微生物。另外，可以是以具有PHA合成酶基因、且降低A2405基因的表达而增强minC基因及minD基因的表达的方式进行了转化的微生物。另外，可以是以具有PHA合成酶基因、且降低了A1386基因及A2405基因的表达的方式进行了转化的微生物。另外，可以是以具有PHA合成酶基因、且降低A1386基因及A2405基因的表达而增强minC基因及minD基因的表达的方式进行了转化的微生物。

本实施方式的转化微生物的宿主没有特别限定，优选为具有A1386基因、A2405基因、minC基因或minD基因的细菌。作为该细菌，可以列举属于例如罗尔斯通氏菌(Ralstonia)属、贪铜菌(Cupriavidus)属、沃特斯氏菌(Wautersia)属、伯克氏菌(Burkholderia)属等伯克氏菌(Burkholderiaceae)科的细菌类作为优选的例子。从安全性及PHA生产性的观点考虑，更优选为属于罗尔斯通氏菌属、贪铜菌属的细菌，进一步优选为属于贪铜菌属的细菌，特别优选为钩虫贪铜菌(Cupriavidus necator)。

本实施方式的转化微生物的宿主可以是原本具有PHA合成酶基因的野生株，也可以是将这样的野生株人工进行突变处理而得到的突变株、或者通过基因工程方法导入了外来的PHA合成酶基因的菌株。导入外来的PHA合成酶基因的方法没有特别限定，可以选择在宿主的染色体上直接插入或置换基因的方法、在宿主所保有的巨大质粒上直接插入或置换基因的方法、或在质粒、噬菌体、噬菌粒等载体上配置基因并导入的方法等，也可以组合使用这些方法中的2种以上。考虑到导入基因的稳定性，优选为在宿主的染色体上或宿主所保有的巨大质粒上直接插入或置换基因的方法，更优选为在宿主的染色体上直接插入或置换基因的方法。

(PHA合成酶基因)

作为PHA合成酶基因，没有特别限定，可以列举属于罗尔斯通氏菌属、贪铜菌属、沃特斯氏菌属、产碱杆菌属、气单胞菌属、假单胞菌属、诺卡菌属、色素杆菌属的生物来源的PHA合成酶基因、它们的变体等。作为上述变体，可以使用编码1个以上的氨基酸残基发生了缺失、添加、插入或置换的PHA合成酶的碱基序列等。可以列举例如：具有编码序列号5～9中任一项所述的氨基酸序列所示的多肽的碱基序列的基因、以及具有编码相对于该氨基酸序列具有85％以上的序列同源性的氨基酸序列所示且具有PHA合成酶活性的多肽的碱基序列的基因等。作为上述序列同源性，优选为90％以上、更优选为95％以上、进一步优选为97％以上、特别优选为99％以上。

(PHA)

作为本实施方式的转化微生物生产的PHA的种类，只要是微生物能够生产的PHA即可，没有特别限定，优选为选自碳原子数4～16的3-羟基烷酸的1种单体的均聚物、选自碳原子数4～16的3-羟基烷酸的1种单体与其它羟基烷酸(例如，碳原子数4～16的2-羟基烷酸、4-羟基烷酸、5-羟基烷酸、6-羟基烷酸等)的共聚物、以及选自碳原子数4～16的3-羟基烷酸的2种以上单体的共聚物。可以列举例如：作为3-羟基丁酸(简称：3HB)的均聚物的P(3HB)、3HB与3-羟基戊酸(简称：3HV)的共聚物P(3HB-共-3HV)、3HB与3-羟基己酸(简称：3HH)的共聚物P(3HB-共-3HH)(简称：PHBH)、3HB与4-羟基丁酸(简称：4HB)的共聚物P(3HB-共-4HB)、包含乳酸(简称：LA)作为构成成分的PHA、例如3HB与LA的共聚物P(LA-共-3HB)等，但并不限定于此。其中，从作为聚合物的应用范围广的观点考虑，优选为PHBH。需要说明的是，根据目的，生产的PHA的种类可以通过待使用的微生物所保有或另行导入的PHA合成酶基因的种类、与其合成相关的代谢体系的基因的种类、培养条件等而适当选择。

(肽聚糖)

肽聚糖是主要构成细菌的细胞壁的包含肽和糖的高分子化合物的一种。肽聚糖的结构因菌种而不同，作为代表性的例子，在大肠杆菌中，由以N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)和N-乙酰胞壁酸(MurNAc)这2种氨基糖的交替重复作为单元的糖链和L-丙氨酸(L-Ala)-γ-D-谷氨酸(Glu)-间二氨基庚二酸(m-DAP)-D-丙氨酸(D-Ala)-D-Ala的五肽构成。五肽的L-Ala通过肽键键合于糖链的MurNAc。从五肽中去除D-Ala，成为四肽后，四肽的m-DAP与其它糖链的四肽的D-Ala键合，2个糖链发生交联，由此形成牢固的结构。

(肽聚糖水解酶)

多数细菌具有N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶、D-丙氨酰-D-丙氨酸-内肽酶、D-丙氨酰-D-丙氨酸-羧肽酶等多种肽聚糖水解酶。N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶切断肽聚糖的MurNAc与L-Ala的N末端的键。D-丙氨酰-D-丙氨酸-内肽酶切断四肽彼此的交联部分中存在的m-DAP与D-Ala的键等。D-丙氨酰-D-丙氨酸-羧肽酶切断五肽的D-Ala与D-Ala的键，去除末端的D-Ala。

在UniProtKB数据库中，编码钩虫贪铜菌的A0597基因(UniProtKB ID Q0KEW8)的蛋白质推定为N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶。

在UniProtKB数据库中，编码钩虫贪铜菌的A0302基因(UniProtKB ID Q0KE26)及A1386基因(UniProtKB ID Q0KBU9)的蛋白质推定为D-丙氨酰-D-丙氨酸-羧肽酶。

在UniProtKB数据库中，钩虫贪铜菌的A2272基因及A2405基因被推定编码与细胞壁相关的水解酶，但没有报告详细的功能。

上述A1386基因是具有编码以下多肽的碱基序列的基因，所述多肽为序列号1所述的氨基酸序列所示的多肽、或者相对于该氨基酸序列具有85％以上的序列同源性的氨基酸序列所示的多肽。作为上述序列同源性，优选为90％以上、更优选为95％以上、进一步优选为97％以上、特别优选为99％以上。需要说明的是，序列号1所述的氨基酸序列与A0302基因所编码的蛋白质的氨基酸序列的序列同源性为约30％。

上述A2405基因是具有编码以下多肽的碱基序列的基因，所述多肽为序列号2所述的氨基酸序列所示的多肽、或者相对于该氨基酸序列具有85％以上的序列同源性的氨基酸序列所示的多肽。作为上述序列同源性，优选为90％以上、更优选为95％以上、进一步优选为97％以上、特别优选为99％以上。需要说明的是，序列号2所述的氨基酸序列与A2272基因所编码的蛋白质的氨基酸序列的序列同源性为约40％。

(minC基因、minD基因)

minC基因、minD基因及minE基因所编码的蛋白质MinC、MinD及MinE是在细菌中具有协调并控制细胞分裂的功能的蛋白质(MinCDE系统)。例如，已知在大肠杆菌细胞内中，MinD以ATP依赖性的方式形成聚合物，进一步与MinC形成复合体，从细胞的一极至另一极快速振动。MinC具有已知细胞分裂时的隔膜形成的作用。另外，已知MinE和MinC竞争性地与MinD结合，具有调节为仅在细胞中央发生隔膜形成的作用。

本发明中的minC基因是具有编码以下多肽的碱基序列的基因，所述多肽为序列号3所述的氨基酸序列所示的多肽(UniProtKB ID Q0KFI3)、或者相对于该氨基酸序列具有85％以上的序列同源性的氨基酸序列所示的多肽。作为上述序列同源性，优选为90％以上、更优选为95％以上、进一步优选为97％以上、特别优选为99％以上。

本发明中的minD基因是具有编码以下多肽的碱基序列的基因，所述多肽为序列号4所述的氨基酸序列所示的多肽(UniProtKB ID Q0KFI4)、或者相对于该氨基酸序列具有85％以上的序列同源性的氨基酸序列所示的多肽。作为上述序列同源性，优选为90％以上、更优选为95％以上、进一步优选为97％以上、特别优选为99％以上。

(基因表达的降低)

本发明中的“基因表达的降低”是指，与未使对象基因的表达降低的菌株相比，对象基因的转录量或对象基因所编码的多肽的表达量减少的状态。该减少量没有特别限定，相对于未使对象基因的表达降低的菌株的表达量，只要少于1倍即可，优选为0.8倍以下、更优选为0.5倍以下、进一步优选为0.3倍以下、更进一步优选为0.2倍以下。对象基因的转录量或对象基因所编码的多肽的表达量可以为零。另外，通过修饰对象基因的碱基序列等而使该基因所编码的多肽不显示原本的功能的情况也可以视为该基因表达降低。另外，通过对具有PHA合成酶基因的微生物进行基因修饰，以使其生产抑制该多肽的功能的代谢产物、蛋白质，由此也可以使对象基因的表达降低。

在本实施方式中，使基因的表达降低的方法没有特别限定，可以列举：使对象基因的一部分或全长缺失的方法、对与对象基因的表达相关的“基因表达调节序列”进行修饰的方法、通过对对象基因和/或其周边的碱基序列进行修饰而使转录的信使RNA的稳定性降低的方法等。修饰碱基序列的方法没有特别限定，可以通过对象基因和/或其周边的碱基序列的至少一部分的置换、缺失、插入和/或添加等而实施，可以通过本领域技术人员公知的方法进行。此外，通过对具有PHA合成酶基因的转化微生物使用反义RNA、RNA干扰法(RNAi)、CRISPR干扰法(CRISPRi)等，也可以在不修饰对象基因和/或其周边的碱基序列的情况下使对象基因的表达降低。

(基因表达增强)

本发明中的基因表达的增强是指，与未增强对象基因的表达的菌株相比，对象基因的转录量或对象基因所编码的多肽的表达量增加的状态。该增加量没有特别限定，与未增强对象基因的表达的菌株相比，只要超过1倍即可，优选为1.1倍以上、更优选为1.2倍以上、进一步优选为1.5倍以上、更进一步优选为2倍以上的增加。

在本实施方式中，增强minC基因及minD基因的表达的方法没有特别限定，可以选择将对象基因导入宿主的方法、增强宿主在基因组DNA上原本具有的对象基因的表达量的方法、或者这两者。

作为将对象基因导入宿主的方法，没有特别限定，可以选择在宿主的染色体上直接插入或置换对象基因的方法、在宿主所保有的巨大质粒上直接插入或置换对象基因的方法、或者在质粒、噬菌体、噬菌粒等载体上配置对象基因并导入的方法等，也可以组合使用这些方法中的2种以上。

考虑到导入基因的稳定性，优选为在宿主的染色体上或宿主所保有的巨大质粒上直接插入或置换对象基因的方法，更优选为在宿主的染色体上直接插入或置换对象基因的方法。为了使导入的基因可靠地表达，优选以对象基因位于宿主原本具有的“基因表达调节序列”的下游的方式导入、或者以对象基因位于外来的“基因表达调节序列”的下游的形式导入。本发明中的“基因表达调节序列”是指包含控制该基因的转录量的碱基序列(例如启动子序列)、和/或调节由该基因转录的信使RNA的翻译量的碱基序列(例如Shine-Dalgarno序列)的DNA序列。作为“基因表达调节序列”，可以利用自然界存在的任意的碱基序列，也可以利用人工构建或修饰的碱基序列。

另外，作为增强宿主在基因组DNA上原本具有的对象基因的表达量的方法，没有特别限定，可以列举：修饰位于对象基因的上游的“基因表达调节序列”的方法、在对象基因的上游导入外来的“基因表达调节序列”的方法、或者通过修饰对象基因和/或其周边的碱基序列而使转录的信使RNA的稳定性提高的方法等。

作为“基因表达调节序列”中包含的启动子序列、Shine-Dalgarno序列，可以列举例如：序列号10～16中任一项所示的碱基序列、或包含这些碱基序列的一部分的碱基序列等，没有特别限定。

基因组DNA的至少一部分的置换、缺失、插入和/或添加可以通过本领域技术人员公知的方法进行。作为代表性的方法，有利用与转位子同源重组的机制的方法(Ohman etal.,J.Bacteriol.,162:1068-1074(1985))、以由同源重组的机制引起的位点特异性的引入和由第二阶段的同源重组所致的脱落作为原理的方法(Noti et al.,MethodsEnzymol.,154:197-217(1987))等。另外，也可以利用使来自于枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)的sacB基因共存，并通过第二阶段的同源重组将基因脱落的微生物株作为蔗糖抗性菌株而容易地分离的方法(Schweizer,Mol.Microbiol.,6:1195-1204(1992)、Lenz etal.,J.Bacteriol.,176:4385-4393(1994))。此外，作为其它方法，也可以利用用于修饰靶DNA的基于CRISPR/Cas9系统的基因组编辑技术(Y.Wang et al.,ACS Synth Biol.2016,5(7):721-732)。在CRISPR/Cas9系统中，向导RNA(gRNA)具有能够与待修饰的基因组DNA的碱基序列的一部分结合的序列，具有将Cas9运送至靶点的作用。

作为向细胞导入载体的方法，没有特别限定，可以列举例如：氯化钙法、电穿孔法、聚乙二醇法、原生质球法等。

通过培养本实施方式的转化微生物，可以使PHA蓄积在菌体内。作为培养本实施方式的转化微生物的方法，可以依照通常的微生物培养法，只要在存在适当碳源的培养基中进行培养即可。培养基组成、碳源的添加方法、培养规模、通气搅拌条件、培养温度、培养时间等没有特别限定。碳源优选连续或间歇地添加于培养基。

作为培养时的碳源，只要本实施方式的转化微生物能够同化即可，可以使用任意碳源。可以列举：葡萄糖、果糖、蔗糖等糖类；棕榈油、棕榈仁油(也包括作为将它们分离而得到的低熔点级分的棕榈油精、棕榈双油精、棕榈仁油精等)、玉米油、椰子油、橄榄油、大豆油、菜籽油、麻疯树油(Jatropha oil)等油脂、其分离油类、或其纯化副产物；月桂酸、油酸、硬脂酸、棕榈酸、肉豆蔻酸等脂肪酸、其衍生物、或甘油等，没有特别限定。另外，在本实施方式的转化微生物能够利用二氧化碳、一氧化碳、甲烷、甲醇、乙醇等气体、醇类的情况下，也可以使用它们作为碳源。

在本实施方式的PHA的制造中，优选使用包含作为上述碳源、碳源以外的营养源的氮源、无机盐类、其它有机营养源的培养基对上述微生物进行培养。作为氮源，可以列举例如：氨；氯化铵、硫酸铵、磷酸铵等铵盐；蛋白胨、肉提取物、酵母提取物等，但并不限定于此。作为无机盐类，可以列举例如：磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、磷酸镁、硫酸镁、氯化钠等。作为其它有机营养源，可以列举例如：甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、脯氨酸等氨基酸、维生素B1、维生素B12、维生素C等维生素等。

在进行适当时间的培养而使PHA蓄积在菌体内后，使用公知的方法从菌体中回收PHA。对于回收方法，没有特别限定，例如，可以在培养结束后，用离心分离机、分离膜等将菌体从培养液中分离，使其干燥后，使用氯仿等有机溶剂从干燥菌体中提取PHA，通过过滤等从包含该PHA的有机溶剂溶液中除去细胞成分，向其滤液中加入甲醇、己烷等不良溶剂而使PHA沉淀，通过过滤、离心分离将上清液除去，使其干燥，回收PHA。另外，也可以使用表面活性剂、碱、酶等使PHA以外的细胞成分溶解于水后，通过过滤、离心分离将PHA粒子与水相分离，使其干燥并回收。

根据本实施方式，可以得到蓄积有PHA的大粒径的微生物细胞，因此能够容易效率良好地实施从培养液中分离微生物细胞。

实施例

以下，通过实施例对本发明更具体地进行说明。但是，本发明并不受这些实施例的限定。需要说明的是，全部基因操作例如可以如Molecular Cloning(Cold Spring HarborLaboratory Press(1989))中记载的那样进行。另外，基因操作所使用的酶、克隆宿主等可以从市场的供应商购入，按照其说明使用。需要说明的是，作为酶，只要能够用于基因操作即可，没有特别限定。

(制造例1)A0597缺失破坏株的制备

首先，进行了基因缺失用质粒的制备。如下所述进行了制备。通过使用了合成寡聚DNA的PCR，得到了具有A0597结构基因的上游及下游的碱基序列的DNA片段(序列号17)。用限制性内切酶SwaI消化该DNA片段，将得到的DNA片段与同样经SwaI消化的日本特开2007-259708号公报中记载的载体pNS2X-sacB和DNA连接酶(Ligation High(东洋纺株式会社制))连接，制备了具有A0597结构基因的上游及下游的碱基序列的基因缺失用质粒载体pNS2X-sacB+A0597UD。

接下来，使用基因缺失破坏用质粒载体pNS2X-sacB+A0597UD，如下所述进行了A0597缺失破坏株的制备。

用基因插入破坏用质粒载体pNS2X-sacB+A0597UD对大肠杆菌S17-1株(ATCC47055)进行转化，将由此得到的转化微生物和KNK-005株在Nutrient Agar培养基(Difco公司制)上进行混合培养，进行了接合转移(conjugation transfer)。KNK-005株是在钩虫贪铜菌H16株的染色体上导入了豚鼠气单胞菌来源的PHA合成酶基因(编码具有序列号7所述的氨基酸序列的PHA合成酶的基因)的转化体，可以基于美国专利第7384766号说明书中记载的方法制备。

将得到的培养液接种于包含250mg/L的卡那霉素的Simmons’琼脂培养基(柠檬酸钠2g/L、氯化钠5g/L、七水硫酸镁0.2g/L、磷酸二氢铵1g/L、磷酸氢二钾1g/L、琼脂15g/L、pH6.8)，选择能够在琼脂培养基上生长的菌株，获得了在KNK-005株的染色体上导入了质粒的菌株。将该菌株用Nutrient Broth培养基(Difco公司制)进行两代培养后，稀释并涂布在包含15％的蔗糖的Nutrient Agar培养基上，获得了能够生长的菌株作为质粒脱落后的菌株。进一步通过基于PCR及DNA测序仪的分析，分离出了将染色体上的A0597结构基因的起始密码子至终止密码子缺失的1个菌株。将该A0597基因缺失株命名为A0597缺失破坏株。

(制造例2)A0302缺失破坏株的制备

首先，进行了基因缺失用质粒的制备。如下所述进行了制备。通过使用了合成寡聚DNA的PCR，得到了具有A0302结构基因的上游及下游的碱基序列的DNA片段(序列号18)。用限制性内切酶SwaI消化该DNA片段，将得到的DNA片段与同样经SwaI消化的日本特开2007-259708号公报中记载的载体pNS2X-sacB和DNA连接酶(Ligation High(东洋纺株式会社制))连接，制备了具有A0302结构基因的上游及下游的碱基序列的基因缺失用质粒载体pNS2X-sacB+A0302UD。

接下来，通过与制造例1相同的方法将A0302基因缺失用质粒载体pNS2X-sacB+A0302UD导入KNK-005株。进一步，通过与制造例1相同的方法，分离出了将染色体上的A0302结构基因的起始密码子至终止密码子缺失的1个菌株。将该A0302基因缺失株命名为A0302缺失破坏株。

(制造例3)A1386缺失破坏株的制备

首先，进行了基因缺失用质粒的制备。如下所述进行了制备。通过使用了合成寡聚DNA的PCR，得到了具有A1386结构基因的上游及下游的碱基序列的DNA片段(序列号19)。用限制性内切酶SwaI消化该DNA片段，将得到的DNA片段与同样经SwaI消化的日本特开2007-259708号公报中记载的载体pNS2X-sacB和DNA连接酶(Ligation High(东洋纺株式会社制))连接，制备了具有A1386结构基因的上游及下游的碱基序列的基因缺失用质粒载体pNS2X-sacB+A1386UD。

接下来，通过与制造例1相同的方法将A1386基因缺失用质粒载体pNS2X-sacB+A1386UD导入KNK-005株。进一步，通过与制造例1相同的方法，分离出了将染色体上的A1386结构基因的起始密码子至终止密码子缺失的1个菌株。将该A1386基因缺失株命名为A1386缺失破坏株。

(制造例4)A2272插入破坏株的制备

首先，进行了A2272基因插入破坏用质粒的制备。如下所述进行了制备。通过使用了合成寡聚DNA的PCR，得到了具有A2272结构基因的第47～231位碱基序列的DNA片段(序列号20)。用限制性内切酶SwaI消化得到的DNA片段。将该DNA片段与同样经SwaI消化的日本特开2007-259708号公报中记载的载体pNS2X-sacB和DNA连接酶(Ligation High(东洋纺株式会社制))连接，制备了具有A2272结构基因的第47～231位碱基序列的基因插入破坏用质粒载体pNS2X-sacB-A2272-indel。

接下来，通过与制造例1相同的方法将基因插入破坏用质粒载体pNS2X-sacB-A2272-indel导入KNK-005株。进一步，通过基于PCR及DNA测序仪的分析，分离出了通过在染色体上的A2272结构基因序列内插入质粒而将A2272基因破坏的1个菌株。将该A2272基因破坏株命名为A2272插入破坏株。

(制造例5)A2405插入破坏株的制备

首先，进行了A2405基因插入破坏用质粒的制备。如下所述进行了制备。通过使用了合成寡聚DNA的PCR，得到了具有A2405结构基因的第7～204位碱基序列的DNA片段(序列号21)。用限制性内切酶SwaI消化得到的DNA片段。将该DNA片段与同样经SwaI消化的日本特开2007-259708号公报中记载的载体pNS2X-sacB和DNA连接酶(Ligation High(东洋纺株式会社制))连接，制备了具有A2405结构基因的第7～204位碱基序列的A2405基因插入破坏用质粒载体pNS2X-sacB-A2405-indel。

接下来，通过与制造例1相同的方法将基因插入破坏用质粒载体pNS2X-sacB-A2405-indel导入KNK-005株。进一步，通过基于PCR及DNA测序仪的分析，分离出了通过在染色体上的A2405结构基因序列内插入质粒而将A2405基因破坏的1个菌株。将该A2405基因破坏株命名为A2405插入破坏株。

(制造例6)A2405缺失破坏株的制备

首先，进行了基因缺失用质粒的制备。如下所述进行了制备。通过使用了合成寡聚DNA的PCR，得到了具有A2405结构基因的上游及下游的碱基序列的DNA片段(序列号22)。用限制性内切酶SwaI消化该DNA片段，将得到的DNA片段与同样经SwaI消化的日本特开2007-259708号公报中记载的载体pNS2X-sacB和DNA连接酶(Ligation High(东洋纺株式会社制))连接，制备了具有A2405结构基因的上游及下游的碱基序列的基因缺失用质粒载体pNS2X-sacB+A2405UD。

接下来，通过与制造例1相同的方法将A2405基因缺失用质粒载体pNS2X-sacB+A2405UD导入KNK-005株。进一步，通过与制造例1相同的方法，分离出了将染色体上的A2405结构基因的起始密码子至终止密码子缺失的1个菌株。将该A2405基因缺失株命名为A2405缺失破坏株。

(制造例8)A1386/A2405双重破坏株的制备

通过与制造例1相同的方法将A2405基因缺失用质粒载体pNS2X-sacB+A2405UD导入A1386缺失破坏株。进一步，通过与制造例1相同的方法，分离出了将染色体上的A2405结构基因的起始密码子至终止密码子缺失的1个菌株。将该缺失了A1386基因及A2405基因的菌株命名为A1386/A2405双重破坏株。

(制造例9)minCD表达A1386缺失破坏株的制备

进行了minCD基因表达用质粒载体pNS2X-sacB-PA-minCD的制备。如下所述进行了制备。通过使用了合成寡聚DNA的PCR，得到了具有启动子序列和minCD基因序列及基因组上的引入区域的碱基序列的DNA片段(序列号23)。用限制性内切酶SwaI消化该DNA片段，将得到的DNA片段与同样经SwaI消化的日本特开2007-259708号公报中记载的载体pNS2X-sacB和DNA连接酶(Ligation High(东洋纺株式会社制))连接，制备了minCD基因表达用质粒载体pNS2X-PA-minCD。

接下来，通过与制造例1相同的方法将minCD基因表达用质粒载体pNS2X-sacB-PA-minCD导入A1386缺失破坏株。进一步，通过与制造例1相同的方法，分离出了在染色体上插入有启动子序列和minCD基因序列的1个菌株。将该minCD基因表达A1386缺失株命名为minCD表达A1386破坏株。

(制造例10)minCD表达A2405破坏株的制备

通过与制造例1相同的方法将minCD基因表达用质粒载体pNS2X-sacB-PA-minCD导入A2405缺失破坏株。进一步，通过与制造例1相同的方法，分离出了在染色体上插入有启动子序列和minCD基因序列的1个菌株。将该minCD基因表达A2405缺失株命名为minCD表达A2405破坏株。

(制造例11)minCD表达A2405/A1386破坏株的制备

通过与制造例1相同的方法将A1386基因缺失用质粒载体pNS2X-sacB+A1386UD导入minCD表达A2405破坏株。进一步，通过与制造例1相同的方法，分离出了将染色体上的A1386结构基因的起始密码子至终止密码子缺失的1个菌株。将该minCD基因表达A2405/A1386缺失株命名为minCD表达A2405/A1386破坏株。

(比较例1)基于KNK-005株进行的PHA生产

在下述的条件下进行了使用KNK-005株的培养研究。

(培养基)

种子培养基的组成设为1w/v％肉提取物、1w/v％细菌用胰蛋白胨(Bacto-Tryptone)、0.2w/v％酵母提取物、0.9w/v％Na₂HPO₄·12H₂O、0.15w/v％KH₂PO₄、(pH6.8)。

前培养培养基的组成设为1.1w/v％Na₂HPO₄·12H₂O、0.19w/v％KH₂PO₄、1.29w/v％(NH₄)₂SO₄、0.1w/v％MgSO₄·7H₂O、2.5w/v％棕榈油精油、0.5v/v％微量金属盐溶液(在0.1N盐酸中溶有1.6w/v％FeCl₃·6H₂O、1w/v％CaCl₂·2H₂O、0.02w/v％CoCl₂·6H₂O、0.016w/v％CuSO₄·5H₂O、0.012w/v％NiCl₂·6H₂O)。作为碳源，以10g/L的浓度一次性添加了棕榈油精油。

PHA生产培养基的组成设为0.385w/v％Na₂HPO₄·12H₂O、0.067w/v％KH₂PO₄、0.291w/v％(NH₄)₂SO₄、0.1w/v％MgSO₄·7H₂O、0.5v/v％微量金属盐溶液(在0.1N盐酸中溶有1.6w/v％FeCl₃·6H₂O、1w/v％CaCl₂·2H₂O、0.02w/v％CoCl₂·6H₂O、0.016w/v％CuSO₄·5H₂O、0.012w/v％NiCl₂·6H₂O)。

(PHA蓄积量相对于干燥菌体的比例的测定方法)

如下所述测定了PHA蓄积量相对于干燥菌体的比例。通过离心分离，从培养液中回收菌体，用乙醇进行清洗，冷冻干燥，得到了干燥菌体。向得到的干燥菌体1g中加入100ml的氯仿，在室温下搅拌一昼夜，提取出菌体内的PHA。滤去菌体残渣后，用蒸发器浓缩至总容量为30ml后，逐渐加入90ml的己烷，一边缓慢搅拌，一边放置1小时。将析出的PHA滤去后，在50℃下真空干燥3小时。测定干燥PHA的重量，计算出菌体内的PHA蓄积量相对于干燥菌体的比例。

(细胞直径的测定方法)

如下所述测定了细胞直径。将培养结束后的培养液在65℃下处理60分钟，使菌体细胞失活后，通过激光衍射/散射式粒径分布测定装置(MicrotracBEL公司制MicrotracMT3300EXII)进行分析，测定了细胞的体积平均直径(MV)。测定在标准设定(粒子透过性：透过，粒子折射率：1.81，粒子形状：非球形，溶剂折射率：1.333)下进行。

(细胞的显微镜观察)

如下所述进行了细胞的显微镜观察。将培养结束后的培养液适当稀释，置于载玻片使其干燥后，用品红进行了染色。通过光学显微镜观察了染色后的细胞。

(PHA生产培养)

如下所述进行了PHA生产培养。首先，将KNK-005株的甘油原液(50μl)接种于种子培养基(10ml)，培养24小时，进行了种子培养。接下来，将种子培养液以1.0v/v％接种于加入有1.8L前培养培养基的3L发酵罐(Jar fermentor)(Marubishi Bioengineering公司制MDL-300型)。运行条件设为培养温度33℃、搅拌速度500rpm、通气量1.8L/min，在将pH控制为6.7～6.8之间的同时培养28小时，进行了前培养。pH控制使用了14％氢氧化铵水溶液。

接下来，将前培养液以5.0v/v％接种于加入有2.5L的PHA生产培养基的5L发酵罐(Marubishi Bioengineering公司制MDS-U50型)。运行条件设为培养温度33℃、搅拌速度420rpm、通气量2.1L/min，将pH控制为6.7～6.8之间。pH控制使用了25％氢氧化铵水溶液。间断地添加了碳源。作为碳源，使用了棕榈油精油。培养进行至PHA蓄积量达到90％左右。如上所述测定了PHA蓄积量的比例及细胞直径。将结果示于表1。另外，将如上所述进行细胞的显微镜观察时拍摄的照片示于图1。

(比较例2)基于A0597缺失破坏株进行的PHA生产

在与比较例1相同的条件下进行了使用A0597缺失破坏株的培养研究。将PHA蓄积量的比例及细胞直径的测定结果示于表1。另外，将如上所述进行的细胞的显微镜观察的照片示于图2。

培养研究的结果是，在上述的条件下测得的A0597缺失破坏株的细胞直径比作为亲本菌株的KNK-005株减少了10％以上。PHA的生产性与KNK-005株相同。

(比较例3)基于A0302缺失破坏株进行的PHA生产

在与比较例1相同的条件下进行了使用A0302缺失破坏株的培养研究。将PHA蓄积量的比例及细胞直径的测定结果示于表1。另外，将如上所述进行的细胞的显微镜观察的照片示于图3。

培养研究的结果是，在上述的条件下测得的A0302缺失破坏株的细胞直径比作为亲本菌株的KNK-005株减少了10％以上。PHA的生产性与KNK-005株相同。

(比较例4)基于A2272插入破坏株进行的PHA生产

在与比较例1相同的条件下进行了使用A2272插入破坏株的培养研究。将PHA蓄积量的比例及细胞直径的测定结果示于表1。另外，将如上所述进行的细胞的显微镜观察的照片示于图4。

培养研究的结果是，在上述的条件下测得的A2272插入破坏株的细胞直径与作为亲本菌株的KNK-005株相同。PHA的生产性与KNK-005株相同。

(实施例1)基于A1386缺失破坏株进行的PHA生产

在与比较例1相同的条件下进行了使用A1386缺失破坏株的培养研究。将PHA蓄积量的比例及细胞直径的测定结果示于表1。另外，将如上所述进行的细胞的显微镜观察的照片示于图5。

培养研究的结果是，在上述的条件下测得的A1386缺失破坏株的细胞直径比作为亲本菌株的KNK-005株增大了20％以上。PHA的生产性与KNK-005株相同。

(实施例2)基于A2405插入破坏株进行的PHA生产

在与比较例1相同的条件下进行了使用A2405插入破坏株的培养研究。将PHA蓄积量的比例及细胞直径的测定结果示于表1。另外，将如上所述进行的细胞的显微镜观察的照片示于图6。

培养研究的结果是，在上述的条件下测得的A2405插入破坏株的细胞直径比作为亲本菌株的KNK-005株增大了20％以上。PHA的生产性与KNK-005株相同。

(实施例3)基于A2405缺失破坏株进行的PHA生产

在与比较例1相同的条件下进行了使用A2405缺失破坏株的培养研究。将PHA蓄积量的比例及细胞直径的测定结果示于表1。另外，将如上所述进行的细胞的显微镜观察的照片示于图7。

培养研究的结果是，在上述的条件下测得的A2405缺失破坏株的细胞直径比作为亲本菌株的KNK-005株增大了20％以上。PHA的生产性与KNK-005株相同。

(实施例4)基于A1386/A2405双重破坏株进行的PHA生产

在与比较例1相同的条件下进行了使用A1386/A2405双重破坏株的培养研究。将PHA蓄积量的比例及细胞直径的测定结果示于表1。另外，将如上所述进行的细胞的显微镜观察的照片示于图8。

培养研究的结果是，在上述的条件下测得的A1386/A2405双重破坏株的细胞直径比作为亲本菌株的KNK-005株增大了40％以上。即，A1386破坏和A2405破坏对细胞直径增大具有协同效果或叠加效果。PHA的生产性与KNK-005株相同。

(实施例5)基于minCD表达A1386破坏株进行的PHA生产

在与比较例1相同的条件下进行了使用minCD表达A1386破坏株的培养研究。将PHA蓄积量的比例及细胞直径的测定结果示于表1。另外，将如上所述进行的细胞的显微镜观察的照片示于图9。

培养研究的结果是，在上述的条件下测得的minCD表达A1386破坏株的细胞直径比作为亲本菌株的KNK-005株增大了20％以上。PHA的生产性与KNK-005株相同。

(实施例6)基于minCD表达A2405破坏株进行的PHA生产

在与比较例1相同的条件下进行了使用minCD表达A2405破坏株的培养研究。将PHA蓄积量的比例及细胞直径的测定结果示于表1。另外，将如上所述进行的细胞的显微镜观察的照片示于图10。

培养研究的结果是，在上述的条件下测得的minCD表达A2405破坏株的细胞直径比作为亲本菌株的KNK-005株增大40％以上。即，A2405破坏和minCD表达对细胞直径增大具有协同效果或叠加效果。PHA的生产性与KNK-005株相同。

(实施例7)基于minCD表达A2405/A1386破坏株进行的PHA生产

在与比较例1相同的条件下进行了使用minCD表达A2405/A1386破坏株的培养研究。将PHA蓄积量的比例及细胞直径的测定结果示于表1。另外，将如上所述进行的细胞的显微镜观察的照片示于图11。

培养研究的结果是，在上述的条件下测得的minCD表达A2405/A1386破坏株的细胞直径比作为亲本菌株的KNK-005株增大了50％以上。即，A1386破坏、A2405破坏及minCD表达对细胞直径增大具有协同效果或叠加效果。PHA的生产性与KNK-005株相同。

需要说明的是，通过HPLC分析确认了比较例及实施例的培养研究所生产的PHA为PHBH。

[表1]

序列表

<110> 株式会社钟化（KANEKA CORPORATION）

<120> 转化微生物、以及使用了该微生物的聚羟基烷酸酯的制造方法

<130> B190307WO01

<160> 23

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 380

<212> PRT

<213> 钩虫贪铜菌(Cupriavidus necator)

<400> 1

Met Ser Met Val Ala Ala Pro Val Ala Glu Ala Ala Thr Lys Ser Ala

1 5 10 15

Thr Thr Gln Lys Thr Ser Lys Lys Gln Val Lys Ser Val Asn Ala Glu

20 25 30

Lys Lys Gly Ala Ser Lys Ile Val Ala Lys Ser Ser Arg Ser Gly Lys

35 40 45

Val Ala Lys Arg Glu Ala Ser Ser Thr Arg Lys Val Val Val Leu Lys

50 55 60

Asn Gly Lys Arg His Thr Val Val Ala Gln Arg Ala Ala Pro Val Arg

65 70 75 80

Ala Ala Phe Thr Pro Ala Lys Pro Ser Leu Gly Glu Ala Met Gly Leu

85 90 95

Arg Asp Thr Asp Asp Ala Leu Ala Leu Arg Ser Ser Val Ala Leu Val

100 105 110

Met Asp Gln Asn Ser Asn Glu Val Leu Phe Gln Lys Asn Ala Ser Ala

115 120 125

Val Leu Pro Ile Ala Ser Ile Thr Lys Leu Met Thr Ala Leu Val Val

130 135 140

Met Asp Ala Arg Leu Pro Met Asp Glu Val Leu Thr Ile Ser Glu Glu

145 150 155 160

Asp Arg Asp Thr Glu Lys His Ser Gly Ser Arg Leu Arg Phe Gly Thr

165 170 175

Gln Leu Thr Arg Gln Glu Leu Leu Leu Leu Ala Leu Met Ser Ser Glu

180 185 190

Asn Arg Ala Ala Ser Ala Leu Gly Arg Asn Tyr Pro Gly Gly Leu Pro

195 200 205

Ala Phe Val Gln Ala Met Asn Arg Lys Ala Arg Glu Leu Gly Met Asn

210 215 220

Asp Ser His Phe Val Asp Ser Ser Gly Leu Ser Ser Ser Asn Val Ser

225 230 235 240

Ser Ala Thr Asp Leu Val Arg Met Val Asn Ala Ala Tyr Arg Asn Pro

245 250 255

Thr Ile Arg Glu Phe Ser Thr Gln Thr Glu His Glu Val Asn Val Leu

260 265 270

Gly Arg Thr Gln His Tyr Val Ser Thr Asn Arg Leu Val Arg Gly Gly

275 280 285

Asn Trp Glu Ile Gly Leu Gln Lys Thr Gly Phe Ile Ser Glu Ala Gly

290 295 300

Gln Cys Leu Val Met Gln Ala Lys Val Gln Gly Arg Asn Val Val Met

305 310 315 320

Val Phe Leu Asp Ser Ala Gly Lys Leu Ser Arg Phe Ala Asp Ala Asn

325 330 335

Arg Val Lys Asp Trp Leu Glu His Ala Pro Ser Pro Ser Ser Pro Gln

340 345 350

Arg Gly Phe Pro Ser Ser Pro Asn Leu Thr Gln Ala Pro Gly Gly Ala

355 360 365

His Ala Ile Leu Ala Ser Gln Gln Ser Arg Gly Ile

370 375 380

<210> 2

<211> 226

<212> PRT

<213> 钩虫贪铜菌(Cupriavidus necator)

<400> 2

Met Gln Arg Ser Val Leu His Ser Leu Ala Arg Ala Ala Val Gly Ile

1 5 10 15

Ala Ile Val Cys Gly Ala Thr Val Ser Asn Gly Val Leu Ala Asp Thr

20 25 30

Val Phe Lys Asp Ala Asp Ala Arg Ile Asp Ala Thr Ala His Ala Ala

35 40 45

Asp Ser His Ala Glu Gly Lys Arg Gly Leu Leu Ser Ser Val Val Asn

50 55 60

Ser Thr Ser Asn Val Ala Ser Lys Ala Gly Asp Leu Val Met Asn Ala

65 70 75 80

Leu Gly Leu Ile Gly Val Arg Tyr Arg Phe Gly Gly Asn Ser Pro Glu

85 90 95

Ser Gly Leu Asp Cys Ser Gly Phe Val Arg Tyr Val Phe Gln Asp Thr

100 105 110

Phe Gly Phe Met Leu Pro Arg Arg Ser Val Glu Ile Ser Arg Val Gly

115 120 125

Thr Thr Val Ala Ala Thr Asp Leu Arg Pro Gly Asp Leu Val Phe Phe

130 135 140

Asn Thr Met Arg Gln Thr Phe Ser His Val Gly Ile Tyr Ile Gly Asp

145 150 155 160

Asn Lys Phe Val His Ala Pro Ser Thr Gly Ser Lys Ile Arg Val Asp

165 170 175

Asp Met Arg Ala Ser Tyr Trp Val Thr Arg Tyr Asn Gly Ala Arg Arg

180 185 190

Ile Glu Asp Gly Lys Glu Gly Gly Ala Asp Gly Leu Gly Asp Met Val

195 200 205

Glu Thr Leu Lys Arg Tyr Asp Pro Lys Val Val Arg Ala Ser Met Tyr

210 215 220

Gly Gly

225

<210> 3

<211> 270

<212> PRT

<213> 钩虫贪铜菌(Cupriavidus necator)

<400> 3

Met Ser Gln Lys Lys Ser Pro Arg Phe Glu Leu Arg Ser Gly Asn Val

1 5 10 15

Asp Ala Leu Leu Leu Ala Leu Gln Thr Ala Asp Met Ala Ala Leu Arg

20 25 30

Asp Asp Leu Leu Ala Arg Phe Glu Ala Thr Pro Asp Phe Phe Ser Asn

35 40 45

Asp Val Ile Ala Leu Asp Leu Arg Ala Leu Glu Asp Asp Ser Glu Val

50 55 60

Ala Leu Gly Thr Val Ile Glu Thr Leu Ala Thr Leu Arg Ala Arg Ala

65 70 75 80

Ile Gly Val Val Ala Arg Pro Gly Gln Arg Glu Trp Ala Glu Arg Phe

85 90 95

Gly Leu Pro Leu Leu Asp Ser Gln Ala Arg Arg Gly Ser Gly Ala Asp

100 105 110

Arg Ala Thr Asp Arg Ala Ala Glu Ala Arg Ala Ala Ala Ala Ala Glu

115 120 125

Gln Ala Ala Ala Asp Gln Ala Ala Arg Glu Glu Ser Ile Arg Ala Ala

130 135 140

Ala Gln Ala Thr Thr Asp Ala Ala Val Ala Ala Ala Ile Arg Gln Thr

145 150 155 160

Gln Thr Met Leu Ile Asp Lys Pro Leu Arg Ser Gly Gln Gln Val Tyr

165 170 175

Ala Gln Gly Asp Val Val Ile Leu Asp Val Val Ser Tyr Gly Ala Glu

180 185 190

Val Ile Ala Glu Gly Asn Ile His Ile Tyr Ala Pro Leu Arg Gly Arg

195 200 205

Ala Leu Ala Gly Val Lys Gly Asn Thr Gly Ala Arg Ile Phe Ser Thr

210 215 220

Cys Met Glu Pro Glu Leu Ile Ser Ile Ala Gly Ile Tyr Arg Thr Ala

225 230 235 240

Glu Gln Thr Leu Pro Ala Asp Val Leu Gly Lys Thr Ala Gln Val Arg

245 250 255

Leu Ala Asp Glu Lys Leu Ile Leu Glu Ala Leu Arg Leu Lys

260 265 270

<210> 4

<211> 271

<212> PRT

<213> 钩虫贪铜菌(Cupriavidus necator)

<400> 4

Met Ala Lys Ile Ile Val Val Thr Ser Gly Lys Gly Gly Val Gly Lys

1 5 10 15

Thr Thr Thr Ser Ala Ser Phe Ala Ala Gly Leu Ala Leu Arg Gly His

20 25 30

Lys Thr Ala Val Ile Asp Phe Asp Val Gly Leu Arg Asn Leu Asp Leu

35 40 45

Ile Met Gly Cys Glu Arg Arg Val Val Tyr Asp Leu Ile Asn Val Val

50 55 60

Gln Gly Glu Ala Asn Leu Arg Gln Ala Leu Ile Lys Asp Lys Lys Cys

65 70 75 80

Glu Asn Leu Phe Ile Leu Pro Ala Ser Gln Thr Arg Asp Lys Asp Ala

85 90 95

Leu Thr Arg Glu Gly Val Glu Lys Val Ile Asn Gly Leu Ile Glu Met

100 105 110

Asp Phe Glu Phe Ile Ile Cys Asp Ser Pro Ala Gly Ile Glu Ser Gly

115 120 125

Ala Leu Met Ala Met Tyr Phe Ala Asp Glu Ala Leu Ile Val Thr Asn

130 135 140

Pro Glu Val Ser Ser Val Arg Asp Ser Asp Arg Ile Leu Gly Ile Leu

145 150 155 160

Ala Ser Lys Thr Lys Arg Ala Ser Glu Gly Gly Asp Pro Ile Lys Glu

165 170 175

His Leu Leu Ile Thr Arg Tyr Asn Pro Lys Arg Val His Gly Gly Glu

180 185 190

Met Leu Ser Leu Thr Asp Ile Gln Glu Ile Leu Arg Ile Lys Leu Ile

195 200 205

Gly Val Val Pro Glu Ser Glu Ala Val Leu His Ala Ser Asn Gln Gly

210 215 220

Thr Pro Ala Ile His Leu Glu Gly Ser Asp Val Ala Asp Ala Tyr Gly

225 230 235 240

Asp Val Val Asp Arg Phe Leu Gly Lys Asp Lys Pro Met Arg Phe Thr

245 250 255

Asp Tyr Gln Lys Pro Gly Leu Leu Ser Arg Ile Phe Gly Asn Lys

260 265 270

<210> 5

<211> 589

<212> PRT

<213> 钩虫贪铜菌(Cupriavidus necator)

<400> 5

Met Ala Thr Gly Lys Gly Ala Ala Ala Ser Thr Gln Glu Gly Lys Ser

1 5 10 15

Gln Pro Phe Lys Val Thr Pro Gly Pro Phe Asp Pro Ala Thr Trp Leu

20 25 30

Glu Trp Ser Arg Gln Trp Gln Gly Thr Glu Gly Asn Gly His Ala Ala

35 40 45

Ala Ser Gly Ile Pro Gly Leu Asp Ala Leu Ala Gly Val Lys Ile Ala

50 55 60

Pro Ala Gln Leu Gly Asp Ile Gln Gln Arg Tyr Met Lys Asp Phe Ser

65 70 75 80

Ala Leu Trp Gln Ala Met Ala Glu Gly Lys Ala Glu Ala Thr Gly Pro

85 90 95

Leu His Asp Arg Arg Phe Ala Gly Asp Ala Trp Arg Thr Asn Leu Pro

100 105 110

Tyr Arg Phe Ala Ala Ala Phe Tyr Leu Leu Asn Ala Arg Ala Leu Thr

115 120 125

Glu Leu Ala Asp Ala Val Glu Ala Asp Ala Lys Thr Arg Gln Arg Ile

130 135 140

Arg Phe Ala Ile Ser Gln Trp Val Asp Ala Met Ser Pro Ala Asn Phe

145 150 155 160

Leu Ala Thr Asn Pro Glu Ala Gln Arg Leu Leu Ile Glu Ser Gly Gly

165 170 175

Glu Ser Leu Arg Ala Gly Val Arg Asn Met Met Glu Asp Leu Thr Arg

180 185 190

Gly Lys Ile Ser Gln Thr Asp Glu Ser Ala Phe Glu Val Gly Arg Asn

195 200 205

Val Ala Val Thr Glu Gly Ala Val Val Phe Glu Asn Glu Tyr Phe Gln

210 215 220

Leu Leu Gln Tyr Lys Pro Leu Thr Asp Lys Val His Ala Arg Pro Leu

225 230 235 240

Leu Met Val Pro Pro Cys Ile Asn Lys Tyr Tyr Ile Leu Asp Leu Gln

245 250 255

Pro Glu Ser Ser Leu Val Arg His Val Val Glu Gln Gly His Thr Val

260 265 270

Phe Leu Val Ser Trp Arg Asn Pro Asp Ala Ser Met Ala Gly Ser Thr

275 280 285

Trp Asp Asp Tyr Ile Glu His Ala Ala Ile Arg Ala Ile Glu Val Ala

290 295 300

Arg Asp Ile Ser Gly Gln Asp Lys Ile Asn Val Leu Gly Phe Cys Val

305 310 315 320

Gly Gly Thr Ile Val Ser Thr Ala Leu Ala Val Leu Ala Ala Arg Gly

325 330 335

Glu His Pro Ala Ala Ser Val Thr Leu Leu Thr Thr Leu Leu Asp Phe

340 345 350

Ala Asp Thr Gly Ile Leu Asp Val Phe Val Asp Glu Gly His Val Gln

355 360 365

Leu Arg Glu Ala Thr Leu Gly Gly Gly Ala Gly Ala Pro Cys Ala Leu

370 375 380

Leu Arg Gly Leu Glu Leu Ala Asn Thr Phe Ser Phe Leu Arg Pro Asn

385 390 395 400

Asp Leu Val Trp Asn Tyr Val Val Asp Asn Tyr Leu Lys Gly Asn Thr

405 410 415

Pro Val Pro Phe Asp Leu Leu Phe Trp Asn Gly Asp Ala Thr Asn Leu

420 425 430

Pro Gly Pro Trp Tyr Cys Trp Tyr Leu Arg His Thr Tyr Leu Gln Asn

435 440 445

Glu Leu Lys Val Pro Gly Lys Leu Thr Val Cys Gly Val Pro Val Asp

450 455 460

Leu Ala Ser Ile Asp Val Pro Thr Tyr Ile Tyr Gly Ser Arg Glu Asp

465 470 475 480

His Ile Val Pro Trp Thr Ala Ala Tyr Ala Ser Thr Ala Leu Leu Ala

485 490 495

Asn Lys Leu Arg Phe Val Leu Gly Ala Ser Gly His Ile Ala Gly Val

500 505 510

Ile Asn Pro Pro Ala Lys Asn Lys Arg Ser His Trp Thr Asn Asp Ala

515 520 525

Leu Pro Glu Ser Pro Gln Gln Trp Leu Ala Gly Ala Ile Glu His His

530 535 540

Gly Ser Trp Trp Pro Asp Trp Thr Ala Trp Leu Ala Gly Gln Ala Gly

545 550 555 560

Ala Lys Arg Ala Ala Pro Ala Asn Tyr Gly Asn Ala Arg Tyr Arg Ala

565 570 575

Ile Glu Pro Ala Pro Gly Arg Tyr Val Lys Ala Lys Ala

580 585

<210> 6

<211> 594

<212> PRT

<213> 豚鼠气单胞菌(Aeromonas caviae)

<400> 6

Met Ser Gln Pro Ser Tyr Gly Pro Leu Phe Glu Ala Leu Ala His Tyr

1 5 10 15

Asn Asp Lys Leu Leu Ala Met Ala Lys Ala Gln Thr Glu Arg Thr Ala

20 25 30

Gln Ala Leu Leu Gln Thr Asn Leu Asp Asp Leu Gly Gln Val Leu Glu

35 40 45

Gln Gly Ser Gln Gln Pro Trp Gln Leu Ile Gln Ala Gln Met Asn Trp

50 55 60

Trp Gln Asp Gln Leu Lys Leu Met Gln His Thr Leu Leu Lys Ser Ala

65 70 75 80

Gly Gln Pro Ser Glu Pro Val Ile Thr Pro Glu Arg Ser Asp Arg Arg

85 90 95

Phe Lys Ala Glu Ala Trp Ser Glu Gln Pro Ile Tyr Asp Tyr Leu Lys

100 105 110

Gln Ser Tyr Leu Leu Thr Ala Arg His Leu Leu Ala Ser Val Asp Ala

115 120 125

Leu Glu Gly Val Pro Gln Lys Ser Arg Glu Arg Leu Arg Phe Phe Thr

130 135 140

Arg Gln Tyr Val Asn Ala Met Ala Pro Ser Asn Phe Leu Ala Thr Asn

145 150 155 160

Pro Glu Leu Leu Lys Leu Thr Leu Glu Ser Asp Gly Gln Asn Leu Val

165 170 175

Arg Gly Leu Ala Leu Leu Ala Glu Asp Leu Glu Arg Ser Ala Asp Gln

180 185 190

Leu Asn Ile Arg Leu Thr Asp Glu Ser Ala Phe Glu Leu Gly Arg Asp

195 200 205

Leu Ala Leu Thr Pro Gly Arg Val Val Gln Arg Thr Glu Leu Tyr Glu

210 215 220

Leu Ile Gln Tyr Ser Pro Thr Thr Glu Thr Val Gly Lys Thr Pro Val

225 230 235 240

Leu Ile Val Pro Pro Phe Ile Asn Lys Tyr Tyr Ile Met Asp Met Arg

245 250 255

Pro Gln Asn Ser Leu Val Ala Trp Leu Val Ala Gln Gly Gln Thr Val

260 265 270

Phe Met Ile Ser Trp Arg Asn Pro Gly Val Ala Gln Ala Gln Ile Asp

275 280 285

Leu Asp Asp Tyr Val Val Asp Gly Val Ile Ala Ala Leu Asp Gly Val

290 295 300

Glu Ala Ala Thr Gly Glu Arg Glu Val His Gly Ile Gly Tyr Cys Ile

305 310 315 320

Gly Gly Thr Ala Leu Ser Leu Ala Met Gly Trp Leu Ala Ala Arg Arg

325 330 335

Gln Lys Gln Arg Val Arg Thr Ala Thr Leu Phe Thr Thr Leu Leu Asp

340 345 350

Phe Ser Gln Pro Gly Glu Leu Gly Ile Phe Ile His Glu Pro Ile Ile

355 360 365

Ala Ala Leu Glu Ala Gln Asn Glu Ala Lys Gly Ile Met Asp Gly Arg

370 375 380

Gln Leu Ala Val Ser Phe Ser Leu Leu Arg Glu Asn Ser Leu Tyr Trp

385 390 395 400

Asn Tyr Tyr Ile Asp Ser Tyr Leu Lys Gly Gln Ser Pro Val Ala Phe

405 410 415

Asp Leu Leu His Trp Asn Ser Asp Ser Thr Asn Val Ala Gly Lys Thr

420 425 430

His Asn Ser Leu Leu Arg Arg Leu Tyr Leu Glu Asn Gln Leu Val Lys

435 440 445

Gly Glu Leu Lys Ile Arg Asn Thr Arg Ile Asp Leu Gly Lys Val Lys

450 455 460

Thr Pro Val Leu Leu Val Ser Ala Val Asp Asp His Ile Ala Leu Trp

465 470 475 480

Gln Gly Thr Trp Gln Gly Met Lys Leu Phe Gly Gly Glu Gln Arg Phe

485 490 495

Leu Leu Ala Glu Ser Gly His Ile Ala Gly Ile Ile Asn Pro Pro Ala

500 505 510

Ala Asn Lys Tyr Gly Phe Trp His Asn Gly Ala Glu Ala Glu Ser Pro

515 520 525

Glu Ser Trp Leu Ala Gly Ala Thr His Gln Gly Gly Ser Trp Trp Pro

530 535 540

Glu Met Met Gly Phe Ile Gln Asn Arg Asp Glu Gly Ser Glu Pro Val

545 550 555 560

Pro Ala Arg Val Pro Glu Glu Gly Leu Ala Pro Ala Pro Gly His Tyr

565 570 575

Val Lys Val Arg Leu Asn Pro Val Phe Ala Cys Pro Thr Glu Glu Asp

580 585 590

Ala Ala

<210> 7

<211> 594

<212> PRT

<213> 豚鼠气单胞菌(Aeromonas caviae)

<400> 7

Met Ser Gln Pro Ser Tyr Gly Pro Leu Phe Glu Ala Leu Ala His Tyr

1 5 10 15

Asn Asp Lys Leu Leu Ala Met Ala Lys Ala Gln Thr Glu Arg Thr Ala

20 25 30

Gln Ala Leu Leu Gln Thr Asn Leu Asp Asp Leu Gly Gln Val Leu Glu

35 40 45

Gln Gly Ser Gln Gln Pro Trp Gln Leu Ile Gln Ala Gln Met Asn Trp

50 55 60

Trp Gln Asp Gln Leu Lys Leu Met Gln His Thr Leu Leu Lys Ser Ala

65 70 75 80

Gly Gln Pro Ser Glu Pro Val Ile Thr Pro Glu Arg Ser Asp Arg Arg

85 90 95

Phe Lys Ala Glu Ala Trp Ser Glu Gln Pro Ile Tyr Asp Tyr Leu Lys

100 105 110

Gln Ser Tyr Leu Leu Thr Ala Arg His Leu Leu Ala Ser Val Asp Ala

115 120 125

Leu Glu Gly Val Pro Gln Lys Ser Arg Glu Arg Leu Arg Phe Phe Thr

130 135 140

Arg Gln Tyr Val Ser Ala Met Ala Pro Ser Asn Phe Leu Ala Thr Asn

145 150 155 160

Pro Glu Leu Leu Lys Leu Thr Leu Glu Ser Gly Gly Gln Asn Leu Val

165 170 175

Arg Gly Leu Ala Leu Leu Ala Glu Asp Leu Glu Arg Ser Ala Asp Gln

180 185 190

Leu Asn Ile Arg Leu Thr Asp Glu Ser Ala Phe Glu Leu Gly Arg Asp

195 200 205

Leu Ala Leu Thr Pro Gly Arg Val Val Gln Arg Thr Glu Leu Tyr Glu

210 215 220

Leu Ile Gln Tyr Ser Pro Thr Thr Glu Thr Val Gly Lys Thr Pro Val

225 230 235 240

Leu Ile Val Pro Pro Phe Ile Asn Lys Tyr Tyr Ile Met Asp Met Arg

245 250 255

Pro Gln Asn Ser Leu Val Ala Trp Leu Val Ala Gln Gly Gln Thr Val

260 265 270

Phe Met Ile Ser Trp Arg Asn Pro Gly Val Ala Gln Ala Gln Ile Asp

275 280 285

Leu Asp Asp Tyr Val Val Asp Gly Val Ile Ala Ala Leu Asp Gly Val

290 295 300

Glu Ala Ala Thr Gly Glu Arg Glu Val His Gly Ile Gly Tyr Cys Ile

305 310 315 320

Gly Gly Thr Ala Leu Ser Leu Ala Met Gly Trp Leu Ala Ala Arg Arg

325 330 335

Gln Lys Gln Arg Val Arg Thr Ala Thr Leu Phe Thr Thr Leu Leu Asp

340 345 350

Phe Ser Gln Pro Gly Glu Leu Gly Ile Phe Ile His Glu Pro Ile Ile

355 360 365

Ala Ala Leu Glu Ala Gln Asn Glu Ala Lys Gly Ile Met Asp Gly Arg

370 375 380

Gln Leu Ala Val Ser Phe Ser Leu Leu Arg Glu Asn Ser Leu Tyr Trp

385 390 395 400

Asn Tyr Tyr Ile Asp Ser Tyr Leu Lys Gly Gln Ser Pro Val Ala Phe

405 410 415

Asp Leu Leu His Trp Asn Ser Asp Ser Thr Asn Val Ala Gly Lys Thr

420 425 430

His Asn Ser Leu Leu Arg Arg Leu Tyr Leu Glu Asn Gln Leu Val Lys

435 440 445

Gly Glu Leu Lys Ile Arg Asn Thr Arg Ile Asp Leu Gly Lys Val Lys

450 455 460

Thr Pro Val Leu Leu Val Ser Ala Val Asp Asp His Ile Ala Leu Trp

465 470 475 480

Gln Gly Thr Trp Gln Gly Met Lys Leu Phe Gly Gly Glu Gln Arg Phe

485 490 495

Leu Leu Ala Glu Ser Gly His Ile Ala Gly Ile Ile Asn Pro Pro Ala

500 505 510

Ala Asn Lys Tyr Gly Phe Trp His Asn Gly Ala Glu Ala Glu Ser Pro

515 520 525

Glu Ser Trp Leu Ala Gly Ala Thr His Gln Gly Gly Ser Trp Trp Pro

530 535 540

Glu Met Met Gly Phe Ile Gln Asn Arg Asp Glu Gly Ser Glu Pro Val

545 550 555 560

Pro Ala Arg Val Pro Glu Glu Gly Leu Ala Pro Ala Pro Gly His Tyr

565 570 575

Val Lys Val Arg Leu Asn Pro Val Phe Ala Cys Pro Thr Glu Glu Asp

580 585 590

Ala Ala

<210> 8

<211> 567

<212> PRT

<213> 色素杆菌sp.(Chromobacterium sp.)

<400> 8

Met Gln Gln Phe Val Asn Ser Leu Ser Leu Gly Gln Asp Gln Ser Asp

1 5 10 15

Ala Pro His Pro Leu Thr Gly Ala Trp Ser Gln Leu Met Ser Gln Thr

20 25 30

Asn Gln Leu Leu Gln Leu Gln Ser Ser Leu Tyr Gln Gln Gln Leu Gly

35 40 45

Leu Trp Thr Gln Phe Leu Gly Gln Thr Ala Gly Asn Asp Ala Ser Ala

50 55 60

Pro Ser Ala Lys Pro Ser Asp Arg Arg Phe Ala Ser Pro Glu Trp Asp

65 70 75 80

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85 90 95

Lys Trp Met Met Glu Leu Val Asp Lys Thr Gln Ile Asp Glu Ser Ala

100 105 110

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115 120 125

Pro Ser Asn Phe Met Leu Thr Asn Pro Asp Val Val Lys Arg Ala Ile

130 135 140

Glu Thr Gln Gly Glu Ser Leu Val Glu Gly Met Lys Asn Met Met Glu

145 150 155 160

Asp Ile Gln Lys Gly His Ile Ser Met Ser Asp Glu Ser Lys Phe Gln

165 170 175

Ile Gly Lys Asn Leu Val Val Thr Pro Gly Glu Val Val Phe Arg Asn

180 185 190

Glu Leu Ile Glu Leu Ile Gln Tyr Thr Pro Thr Thr Glu Lys Val His

195 200 205

Glu Lys Pro Leu Leu Phe Val Pro Pro Cys Ile Asn Lys Tyr Tyr Leu

210 215 220

Met Asp Leu Gln Pro Asp Asn Ser Met Val Arg His Phe Val Gly Gln

225 230 235 240

Gly Tyr Arg Val Phe Leu Val Ser Trp Arg Ser Ala Val Pro Glu Met

245 250 255

Lys Asn Phe Thr Trp Glu Thr Tyr Ile Glu Lys Gly Val Phe Ala Ala

260 265 270

Ala Glu Ala Val Gln Lys Ile Thr Lys Gln Pro Thr Met Asn Ala Leu

275 280 285

Gly Phe Cys Val Gly Gly Val Ile Leu Thr Thr Ala Leu Cys Val Ala

290 295 300

Gln Ala Lys Gly Leu Lys Tyr Phe Asp Ser Ala Thr Phe Met Thr Ser

305 310 315 320

Leu Ile Asp His Ala Glu Pro Gly Glu Ile Ser Phe Phe Ile Asp Glu

325 330 335

Ala Leu Val Ala Ser Arg Glu Ala Lys Met Ala Ala Gly Gly Ile Ile

340 345 350

Ser Gly Lys Glu Ile Gly Arg Thr Phe Ala Ser Leu Arg Ala Asn Asp

355 360 365

Leu Val Trp Asn Tyr Val Val Asn Asn Tyr Leu Leu Gly Lys Thr Pro

370 375 380

Ala Pro Phe Asp Leu Leu Tyr Trp Asn Asn Asp Ala Val Asp Leu Pro

385 390 395 400

Leu Pro Met His Thr Phe Met Leu Arg Gln Phe Tyr Ile Asn Asn Ala

405 410 415

Leu Ile Thr Pro Gly Ala Ile Thr Leu Cys Gly Val Pro Ile Asp Ile

420 425 430

Ser Lys Ile Asp Ile Pro Val Tyr Met Phe Ala Ala Arg Glu Asp His

435 440 445

Ile Val Leu Trp Ser Ser Ala Tyr Ser Gly Leu Lys Tyr Leu Ser Gly

450 455 460

Thr Pro Ser Arg Arg Phe Val Leu Gly Ala Ser Gly His Ile Ala Gly

465 470 475 480

Ser Ile Asn Pro Val Thr Lys Asp Lys Arg Asn Tyr Trp Thr Asn Glu

485 490 495

Gln Leu Pro Val Asn Pro Glu Glu Trp Leu Glu Gly Ala Gln Ser His

500 505 510

Pro Gly Ser Trp Trp Lys Asp Trp Asp Ala Trp Leu Ala Pro Gln Ser

515 520 525

Gly Lys Gln Val Pro Ala Pro Lys Met Leu Gly Ser Lys Glu Phe Pro

530 535 540

Pro Leu Gln Pro Ala Pro Gly Ser Tyr Val Leu Ala Lys Ala Met Pro

545 550 555 560

Pro Val Ala Ala Ala Leu Asn

565

<210> 9

<211> 559

<212> PRT

<213> 假单胞菌sp.(Pseudomonas sp.)

<400> 9

Met Ser Asn Lys Asn Ser Asp Asp Leu Asn Arg Gln Ala Ser Glu Asn

1 5 10 15

Thr Leu Gly Leu Asn Pro Val Ile Gly Leu Arg Gly Lys Asp Leu Leu

20 25 30

Thr Ser Ala Arg Met Val Leu Thr Gln Ala Ile Lys Gln Pro Ile His

35 40 45

Ser Val Lys His Val Ala His Phe Gly Ile Glu Leu Lys Asn Val Met

50 55 60

Phe Gly Lys Ser Lys Leu Gln Pro Glu Ser Asp Asp Arg Arg Phe Asn

65 70 75 80

Asp Pro Ala Trp Ser Gln Asn Pro Leu Tyr Lys Arg Tyr Leu Gln Thr

85 90 95

Tyr Leu Ala Trp Arg Lys Glu Leu His Asp Trp Ile Gly Asn Ser Lys

100 105 110

Leu Ser Glu Gln Asp Ile Asn Arg Ala His Phe Val Ile Thr Leu Met

115 120 125

Thr Glu Ala Met Ala Pro Thr Asn Ser Ala Ala Asn Pro Ala Ala Val

130 135 140

Lys Arg Phe Phe Glu Thr Gly Gly Lys Ser Leu Leu Asp Gly Leu Thr

145 150 155 160

His Leu Ala Lys Asp Leu Val Asn Asn Gly Gly Met Pro Ser Gln Val

165 170 175

Asp Met Gly Ala Phe Glu Val Gly Lys Ser Leu Gly Thr Thr Glu Gly

180 185 190

Ala Val Val Phe Arg Asn Asp Val Leu Glu Leu Ile Gln Tyr Arg Pro

195 200 205

Thr Thr Glu Gln Val His Glu Arg Pro Leu Leu Val Val Pro Pro Gln

210 215 220

Ile Asn Lys Phe Tyr Val Phe Asp Leu Ser Pro Asp Lys Ser Leu Ala

225 230 235 240

Arg Phe Cys Leu Ser Asn Asn Gln Gln Thr Phe Ile Val Ser Trp Arg

245 250 255

Asn Pro Thr Lys Ala Gln Arg Glu Trp Gly Leu Ser Thr Tyr Ile Asp

260 265 270

Ala Leu Lys Glu Ala Val Asp Val Val Ser Ala Ile Thr Gly Ser Lys

275 280 285

Asp Ile Asn Met Leu Gly Ala Cys Ser Gly Gly Ile Thr Cys Thr Ala

290 295 300

Leu Leu Gly His Tyr Ala Ala Leu Gly Glu Lys Lys Val Asn Ala Leu

305 310 315 320

Thr Leu Leu Val Ser Val Leu Asp Thr Thr Leu Asp Ser Gln Val Ala

325 330 335

Leu Phe Val Asp Glu Lys Thr Leu Glu Ala Ala Lys Arg His Ser Tyr

340 345 350

Gln Ala Gly Val Leu Glu Gly Arg Asp Met Ala Lys Val Phe Ala Trp

355 360 365

Met Arg Pro Asn Asp Leu Ile Trp Asn Tyr Trp Val Asn Asn Tyr Leu

370 375 380

Leu Gly Asn Glu Pro Pro Val Phe Asp Ile Leu Phe Trp Asn Asn Asp

385 390 395 400

Thr Thr Arg Leu Pro Ala Ala Phe His Gly Asp Leu Ile Glu Met Phe

405 410 415

Lys Asn Asn Pro Leu Val Arg Ala Asn Ala Leu Glu Val Ser Gly Thr

420 425 430

Pro Ile Asp Leu Lys Gln Val Thr Ala Asp Ile Tyr Ser Leu Ala Gly

435 440 445

Thr Asn Asp His Ile Thr Pro Trp Lys Ser Cys Tyr Lys Ser Ala Gln

450 455 460

Leu Phe Gly Gly Lys Val Glu Phe Val Leu Ser Ser Ser Gly His Ile

465 470 475 480

Gln Ser Ile Leu Asn Pro Pro Gly Asn Pro Lys Ser Arg Tyr Met Thr

485 490 495

Ser Thr Asp Met Pro Ala Thr Ala Asn Glu Trp Gln Glu Asn Ser Thr

500 505 510

Lys His Thr Asp Ser Trp Trp Leu His Trp Gln Ala Trp Gln Ala Glu

515 520 525

Arg Ser Gly Lys Leu Lys Lys Ser Pro Thr Ser Leu Gly Asn Lys Ala

530 535 540

Tyr Pro Ser Gly Glu Ala Ala Pro Gly Thr Tyr Val His Glu Arg

545 550 555

<210> 10

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工DNA

<400> 10

ttgacaatta atcatccggc tcgtataat 29

<210> 11

<211> 30

<212> DNA

<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)

<400> 11

tttacacttt atgcttccgg ctcgtataat 30

<210> 12

<211> 30

<212> DNA

<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)

<400> 12

ttgacaatta atcatcgaac tagttaacta 30

<210> 13

<211> 30

<212> DNA

<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)

<400> 13

tttacacttt atgcttccgg ctcgtatgtt 30

<210> 14

<211> 30

<212> DNA

<213> 钩虫贪铜菌(Cupriavidus necator)

<400> 14

ttgacagcgc gtgcgttgca aggcaacaat 30

<210> 15

<211> 231

<212> DNA

<213> 钩虫贪铜菌(Cupriavidus necator)

<400> 15

tacgccgccc cctgaccagg aacgccgggc cagtcccggc gtttttttat tctatagcgc 60

aattaaccgc cgtcatattg cgtcaccatg attgccggat ggccgcggcg atcccttgct 120

ggaggccggt tccaagaaga tttaaagatg tcacggaatt gtcatacagg gagcatagag 180

ttcgtcttgt caaaaatttg tcattcccaa ccaatgttct ctggaggaca t 231

<210> 16

<211> 17

<212> DNA

<213> 钩虫贪铜菌(Cupriavidus necator)

<400> 16

agagagacaa tcaaatc 17

<210> 17

<211> 890

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工DNA

<400> 17

agtgaattcg gatttaaatt gcatgtgcag ctgtccggcg acctgggcgc cggcaagacc 60

acgctgacgc gcacgatcct gcgcgcgctc ggccatgcgg gcaaggtccg cagccccacc 120

tacacgctgt gcgagcccta cgaggtggcc cgcgccgacg gctcgccgct gaccgtctac 180

cacttcgacc tgtaccgctt tgccgatccc gaagagtgga tcgacgcggg ttttcgcgac 240

tgcttcgccg aaccggcctt caacctggtc gagtggccgg aaaaggccgg ccgcctgctc 300

ggggaaccgg atctccatat gttgctccaa tcggacatgg ccggggcgga tgatgccggc 360

gagcggcgga tcgcgacgat gcgcgcctat actcacactg gacttaccct gctgaacgca 420

tgctgagtct ggcgggcaca aaaaaaccgg ggcatgcccc ggttttttca tggctgcgtg 480

cctcaggccc gcgccgcggc ctggtcctcc tgcaaggcat cgcggtcggc atagcgcgac 540

gcgatcaccg agcacacgat cagctgcagc tggtgataga ccatcagcgg cagcaccagc 600

aggcccagcg ccggatggcc ggcaaacagg atcttggcca tcgggatgcc gttggccagg 660

ctcttcttgg agccgcagaa caccgccgtg atctcgtcct cgacagagaa gccaaggcgg 720

cgcgcggtca gcgtggtaaa gcccagcacc acgaacagca gcaccgcggc gatcagcatc 780

actgcgccga tggtctgcca ctggtactgg tgccacaggc cctgggcggt ggcatcgcag 840

aatgaggaat agacgatcag cacgatcacg catttaaatg gatagctcgg 890

<210> 18

<211> 769

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工DNA

<400> 18

ccgagctatc catttaaatg gacgaccttc accatcggat gcgaagtcag cgcccgatac 60

aagtcgtcga gctgctcgcg gctggtgacc cacaccgtca cggtcaggcc caggtagttg 120

ccgccgctgg aggggcgcat ttccatcttg ccggcgtgga agtcgggatc gaactcctgc 180

accagcgtga cgatggcctc ggcaaagccg tcctgcatcg cgcccatcac cttgatggga 240

aagtggctgg ggtattcgat cagcgactgc tccggcggga tgtcgcccgg cttgttgctg 300

ccttgcttgt cggttgtcat gtcggattct ccggcacgaa accggcgcgc cgcatggcgc 360

gccggcttac gcgcattcag ggtttctgtt ttccgacagt aagaaggtgg cgcggggatg 420

gtccgggtgg cggcgtgccg gcctcaccgg tcccacgcat tgacgacgag ctgcttgatc 480

aggtgcagct tgcggtgaaa gaaatggtcg gcgccgggga tcacgatcac cggcagctcc 540

tgcgggcggg cccagtcgaa cacgctggcc agcggcacgg tgtcgtcctg ttcgccatgg 600

atcacgatgg tgtcggccgg cacctcggct acctgccagc ggctggcggc ggtgcccacc 660

agcaccaggc gctgcgcggg cgtgccggcc tcggccaggc ggcgcgccac gtgggtggtg 720

acgaagctgc cgaacgagaa cccgcccatg atttaaatcc gaattcact 769

<210> 19

<211> 956

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工DNA

<400> 19

agtgaattcg gatttaaatg tatgcggcat gtcactgggt tttgccgacc cggaagcgat 60

cgagaaccag ctgaccacgg aacgtgagcc ggtcagcggg ttcgcgcgtt tcctctcata 120

gcaaagtttg agaaaagttt gtatcaatgt gtaacgatga gtgccgatat acaagacgac 180

gtccgtgtat tggctgggag tgttccaagg ggcagcaagg tgaacccggg tacgcctggg 240

gcaagccaga ggcggttcgc atgcaaacgt gaccttttgg ttgctttttc cgcaatgtgg 300

aaatgtttgc aaatcgaact ttaaggagcg tctgtaagtc tttaatcttg ctaacaattt 360

ctttctttcc tacactagcg ccattcctat gcgctgaacg aatcatgttc cggtctgatt 420

ccattttttc cagattcttc ggctccgcac ccctgtccgc tgttgccacc gcggtcctgg 480

tatcgtacgg aacgcctgac cgggaaaaaa cgcgccgtgc cacggcgcgt ttttcgttct 540

ggcggccgcg gccgtcagag cagcttgcct gggttcatga tcccggccgg gtcgaacacg 600

gccttgatct cgcgcatcag ccgcagttcc agcgggtcct tcatggtcag gaaggcatgg 660

cgcttgagct ggccgatgcc atgctcggcg ctgatgctgc cgccgtagcg catcacttcg 720

tccagcaccg cgtcggtcac cgcatcgcct tgcgtggccg cccagtcctt gggcgcgccg 780

gccgggcgcg acaggttgta gtgcaggttg ccgtcgccga agtgcccgaa gataaagggc 840

cggatggcgg gatcgagccc acgcagccgc gtttccatcg aggtcatgaa ggccggaatc 900

tgctcgatcg ggagcgagat gtcgtgcttc aggtgcgatt taaatggata gctcgg 956

<210> 20

<211> 223

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工DNA

<400> 20

agtgaattcg gatttaaata gggcctgctt gcccaggtcc ggctgccgct gctctgcgcc 60

accgccctgc tgctggcggc ctgcgccagt tccccgtctt cgcgccacgc cggcctgccg 120

cggacgccgg gcaaacccat gatcgacccc agcgccggac tggaagagat ttcgatccag 180

gcgatgtccc tggtcggcac acccatttaa atggatagct cgg 223

<210> 21

<211> 238

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工DNA

<400> 21

agtgaattcg gatttaaata gcgatcggta cttcattccc tggcgcgtgc cgccgtcgga 60

attgccattg tctgcggtgc gactgtgtcg aatggagtgc tggcggatac ggtattcaag 120

gatgccgacg cccgtatcga tgccacggcc cacgccgcgg attcgcatgc ggaaggcaag 180

cgcggcttgc tgtcgtcggt ggtgaattcc accagcaaca tttaaatgga tagctcgg 238

<210> 22

<211> 926

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工DNA

<400> 22

agtgaattcg gatttaaata cccctatacg cgcaagctga tggcggcggc gcaggtcggc 60

gctggctgac ccggaggtgt gcggcgcagc aacgccgcgg ccccgcctgg ctagcatccg 120

gttgttcgga tcaatccgat aaacaaggtg cgaattcccg cctatatcct tgattcgcca 180

gtcaaatccg gcgaatttgt aacgaacttt gacatgtgaa tgacaaccct ttaccatccc 240

gcgagaacta gttttggggg tggtccgtcc gacgcattgg atcgtgcata gcacgtttgc 300

ggtgcaagac aggcccggaa agcctggtgc ggatgttgca tagggttcac cccgcaggtt 360

cacatgaatt tctcgcgaag ttcacgcgaa tttcacatat aaccagctgc cccggacttg 420

tgccggggct tgctttggaa cgatcaacgg gagaaccagt ttccggcgcg ctacaagcaa 480

aaaggactgc tgcgacagtc cttttttctt tggcggggcg tgctccccgg gctattgcac 540

tgcgaccgtt ccggccggtg ccaggcgggc ctgttccagc cgctgccgca gcgttgccat 600

caccgccgtg gtggcctgtt cgccggccag tatggctcgg ttgcgggcgt tgaagtcgct 660

gccgcccata tcgggcagct cggggcggat caccacgtcg gcgcgcgcca gtgccatctt 720

gttgatcgac tggcccatga tcgcggtggt ctgcagcagc acgccgctct ggcccgcgtt 780

cttctgcgcc gacgggtcgg ccgagatgtt gaccgcgatg acaaagtccg cgcccatgcc 840

gcgcgcggaa tccaccggca ccggctcgac caggccgccg tcgacatagt cgtgaccctg 900

gatcgacatt taaatggata gctcgg 926

<210> 23

<211> 2478

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工DNA

<400> 23

agtgaattcg gatttaaatg ctaatggtga gtgtggtctt ggacatcgcg cctcctttac 60

tgcttgttgc cgctaatggc cgcgcaccta tgcagtgcat ccggcaggca ccagtctgaa 120

gccgctgcgc gcaacgcgcc gcgaagcggc gccatgccca tgcgccaggc gcatgcctcg 180

ctacttgcgc ggcattgtcc gcccgctcac agcacaatgc gcaaggcgcg tgccaggcat 240

aaactgatgg ccaattgtac gccgccccct gaccaggaac gccgggccag tcccggcgtt 300

tttttattct atagcgcaat taaccgccgt catattgcgt caccatgatt gccggatggc 360

cgcggcgatc ccttgctgga ggccggttcc aagaagattt aaagatgtca cggaattgtc 420

atacagggag catagagttc gtcttgtcaa aaatttgtca ttcccaacca atgttctctg 480

gaggacatat gtcccagaag aaatcgccac gcttcgagct gcgcagtggc aacgtagacg 540

ccctccttct cgccctccag accgccgaca tggctgcgct gcgggatgac ctcctcgccc 600

gctttgaagc cacccccgac ttcttttcca atgacgtgat tgcgctggac ctgcgcgcgc 660

tggaagatga cagcgaagtc gcgcttggca ccgtgatcga gacgctggcc acgctcaggg 720

cccgcgccat cggcgtggtg gcccgccccg gccagcgcga gtgggccgag cgcttcggcc 780

tgccgctgct ggacagccag gcccgccgcg gcagtggcgc cgatcgcgcc accgaccgtg 840

ccgccgaggc cagggccgca gccgcggcgg aacaggccgc agccgaccag gccgcgcgcg 900

aggaatccat ccgcgccgcc gcgcaggcca ccaccgacgc cgccgtggcc gctgccatcc 960

gccagaccca gaccatgctg atcgacaagc cgcttcgctc gggccagcag gtctacgcgc 1020

agggcgacgt ggtcatcctg gacgtggtca gctacggcgc cgaggtgatc gccgaaggca 1080

acatccatat ctatgccccg ctgcgcggcc gtgcgctggc gggcgtcaag ggcaacaccg 1140

gcgcgcgcat tttcagcacg tgcatggagc ctgaactgat ttccatcgcc ggcatctacc 1200

ggaccgcgga gcagacgctt ccggccgacg tgctcggcaa gaccgcccag gtgcgcctgg 1260

ccgatgaaaa actgatcctg gaagcgctgc ggctcaagta accgcggcag cccccgggac 1320

cgaattgcag agagcgcaag cttcaactta ttactggacc aaagagccat ggcaaaaatc 1380

atcgttgtga cctccggcaa gggaggcgtc ggcaagacca ccaccagcgc cagctttgcc 1440

gccggcctgg ccctgcgcgg ccacaagact gccgtgatcg acttcgacgt cggcctgcgc 1500

aaccttgacc tgatcatggg ttgcgagcgc cgcgtggtgt acgacctgat caacgtggtg 1560

cagggcgaag ccaacctgcg ccaggcgctg atcaaggaca agaagtgcga gaacctgttc 1620

atcctgccgg cctcgcagac gcgcgacaag gacgcgctca cgcgcgaagg cgtcgagaag 1680

gtcatcaacg gcctgatcga gatggatttc gaattcatca tctgcgactc gccggccggc 1740

atcgagtcgg gcgcgctgat ggcgatgtac ttcgccgacg aggcgctgat cgtgaccaac 1800

ccggaagtgt cgtcggtgcg cgattcggac cgcatcctgg gcatcctggc ctccaagacc 1860

aagcgcgcca gcgaaggcgg cgacccgatc aaggaacacc tgctgatcac ccgctacaac 1920

cccaagcgtg tgcatggcgg cgaaatgctg tcgctgaccg acatccagga aatcctgcgc 1980

atcaagctga tcggcgtggt gccggagtct gaagccgtgc tgcacgcctc gaaccagggc 2040

acgcccgcca tccacctgga aggcagcgac gtggccgacg cctatggcga cgtggtggac 2100

cgcttcctcg gcaaggacaa gccgatgcgt ttcaccgact accagaagcc gggtctgctc 2160

tcccgcatct tcggcaacaa gtaacctgcc ggcctggttc aaccagtcgg cagccgacta 2220

gtcccggcag ccgccagcgc gctggcctcg cttatcatgg cagctgcgcc gggcggcacg 2280

cgaacggcgc ggcaccaacg atcaacatgc cattgctacc gacacaagac ttccagggcc 2340

agccgctggt ccggatcggc gatgccgaca cgttcctgct gctcgccccg caacacggcg 2400

ggcggctggt ccgctgggtg caccgcggac aggacatcct ctactggccg gacgctgcca 2460

tttaaatgga tagctcgg 2478

Claims (12)

1.一种转化微生物，其具有聚羟基烷酸酯合成酶基因，且降低了A1386基因和/或A2405基因的表达。

2.根据权利要求1所述的转化微生物，其中，

所述A1386基因是编码相对于序列号1所述的氨基酸序列具有85％以上序列同源性的氨基酸序列的基因。

3.根据权利要求1所述的转化微生物，其中，

所述A2405基因是编码相对于序列号2所述的氨基酸序列具有85％以上序列同源性的氨基酸序列的基因。

4.根据权利要求1～3中任一项所述的转化微生物，其还增强了minC基因及minD基因的表达。

5.根据权利要求4所述的转化微生物，其中，

所述minC基因是编码相对于序列号3所述的氨基酸序列具有85％以上序列同源性的氨基酸序列的基因。

6.根据权利要求4所述的转化微生物，其中，

所述minD基因是编码相对于序列号4所述的氨基酸序列具有85％以上序列同源性的氨基酸序列的基因。

7.根据权利要求1～6中任一项所述的转化微生物，其属于贪铜菌属。

8.根据权利要求7所述的转化微生物，其是钩虫贪铜菌的转化微生物。

9.一种聚羟基烷酸酯的制造方法，该方法包括：

在碳源的存在下对权利要求1～8中任一项所述的转化微生物进行培养的工序。

10.根据权利要求9所述的聚羟基烷酸酯的制造方法，其中，

聚羟基烷酸酯是2种以上羟基烷酸的共聚物。

11.根据权利要求10所述的聚羟基烷酸酯的制造方法，其中，

所述聚羟基烷酸酯是含有3-羟基己酸作为单体单元的共聚物。

12.根据权利要求11所述的聚羟基烷酸酯的制造方法，其中，

所述聚羟基烷酸酯是3-羟基丁酸与3-羟基己酸的共聚物。

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