KR20120096684A - 고광학순도의 젖산 생산용 형질전환체 및 이를 이용한 젖산 생산 방법 - Google Patents
고광학순도의 젖산 생산용 형질전환체 및 이를 이용한 젖산 생산 방법 Download PDFInfo
- Publication number
- KR20120096684A KR20120096684A KR1020110015911A KR20110015911A KR20120096684A KR 20120096684 A KR20120096684 A KR 20120096684A KR 1020110015911 A KR1020110015911 A KR 1020110015911A KR 20110015911 A KR20110015911 A KR 20110015911A KR 20120096684 A KR20120096684 A KR 20120096684A
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- gene
- lactic acid
- seq
- ala
- strain
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
- C12P7/56—Lactic acid
Landscapes
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
본 발명은 미생물을 이용한 젖산의 생물학적 생산 방법에 관한 것으로, 간편하고 경제적인 방법으로 고광학순도의 젖산을 고수율로 생산할 수 있는 형질전환체, 이의 제조방법 및 이를 이용한 젖산 생산 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따라, pH 조건 등 생산 조건의 엄격한 제한이나 미생물 내 대사 경로의 복잡한 조절 없이도 간편하게 고광학순도의 젖산을 고수율로 생산할 수 있으며, 또한 별도의 부가적인 젖산 분리 정제 공정이 필요하지 않으므로 젖산 생산 단계를 현저히 줄일 수 있어 생산 비용을 크게 절감할 수 있을 뿐만 아니라, 침전 폐기물로 인한 환경적인 문제를 배제할 수 있어 환경 보호 효과 또한 얻을 수 있다.
본 발명에 따라, pH 조건 등 생산 조건의 엄격한 제한이나 미생물 내 대사 경로의 복잡한 조절 없이도 간편하게 고광학순도의 젖산을 고수율로 생산할 수 있으며, 또한 별도의 부가적인 젖산 분리 정제 공정이 필요하지 않으므로 젖산 생산 단계를 현저히 줄일 수 있어 생산 비용을 크게 절감할 수 있을 뿐만 아니라, 침전 폐기물로 인한 환경적인 문제를 배제할 수 있어 환경 보호 효과 또한 얻을 수 있다.
Description
본 발명은 미생물을 이용한 젖산의 생물학적 생산 방법에 관한 것으로, 간편하고 경제적인 방법으로 고광학순도의 젖산을 고수율로 생산할 수 있는 형질전환체, 이의 제조방법 및 이를 이용한 젖산 생산 방법에 관한 것이다.
폴리젖산(PLA)은 상업적으로 생산되는 바이오플라스틱(bio-plastic)의 원료로서 락타이드(lactide)의 축합중합(condensation)에 의해 생성되는 지방족 폴리에스테르(polyester)이다. PLA는 전자제품 포장재, 생수병, 자동차 내장재, 사무용 가구, 엔지니어링 플라스틱, 섬유 분야 등의 아주 중요한 용도를 갖고 있어 미래의 대표적인 생분해성 바이오플라스틱으로 각광을 받고 있다. 특히 근래에 전세계적으로 활발히 전개되고 있는 「지구환경보호운동」과 더불어 지구온난화, 기후변화에 대한 환경친화적인 차세대 대체 섬유 소재의 필요성이 대두됨에 따라, 천연적으로 재활용이 가능하고 오염물질을 배출하지 않으며, 합성섬유와 유사한 물리화학적 성질 및 기계적 성질을 가지면서 생분해가 가능한 PLA 생분해성 섬유는 무한한 잠재력을 가지고 있다고 볼 수 있다. 이러한 잠재력이 있음에도 불구하고 생분해성 섬유는 아직 일반합성섬유에 비해 5?10배 정도 생산단가가 높고 대량 생산을 하는데 어려움이 많을 뿐 아니라 특성에 따른 용도개발이 이루어져 있지 않아 그 실용화가 미미한 실정이다.
젖산(lactic acid/lactate)은 의약품(medicine), 식품(food and food processing), 화장품(cosmetics), 화학 제품(chemical substances) 등의 다양한 분야의 실용 가능한 원료 물질(commodity chemical)로 널리 알려져 왔다. 최근에는 생분해성 고분자(biodegradable polymer)인 폴리젖산(polylactic acid, PLA)의 원료로서도 주목을 받고 있으며, 사용량의 급격한 증가 추세와 함께 관련 기술 개발이 활발이 진행되고 있다.
젖산은 생물체내에서 탄수화물이 산화된 피부르산(pyruvate)의 환원으로 lactate dehydrogenase 효소에 의해 생산 된다. 젖산은 L-(+)-Lactic acid와 D-(-)-lactic acid의 광학 이성질체(enantiomer)를 갖는 특성을 갖고 있으며, 화학 합성 방법에 의해 생산되어 왔으나, 최근에는 미생물을 이용한 생물학적 생산 방법으로의 전환 기술을 통해 직접 생산하고 있다.
일반적으로 젖산 발효 생산은 (1) 발효, (2) 세포 균체 및 단백질 제거, (3) 젖산 분리 및 정제, (4) 젖산 농축, (5) 탈색의 5 단계로 구성된다. 젖산 발효 생산 기술은 대부분 신규 젖산 생산 공정 개발과 지속적인 개선을 통해 플랜트(plants)의 규모와 생산 효율 향상 등 생산 기술과 경제적인 증발 농축기(evaporator)와 멤브레인(membrane) 기술과 더불어 탈수 공정의 혁신적 진보와 같은 우수한 분리, 정제 기술 개발을 통한 분리정제 비용 절감과 효율 향상에 집중되어 왔다.
최근에는 다양한 시스템 분석 기술과 대사공학 기술을 활용한 온도, pH, 유기산물 생산에 탁월한 성능을 갖는 보다 우수한 발효 미생물 개발에 연구개발이 집중되고 있다. 그런데 현재 발효 생산되는 젖산은 석유로부터 생산되는 젖산에 비해 높은 광학 선택도(optical purity)와 순도의 젖산을 생산하기 위해 생산 단가가 증가되고, 여러 가지 응용 분야에 적합한 다양한 품질의 젖산 생산을 경제적으로 생산하는데 한계를 갖고 있다.
젖산 발효 생산은 석유화학 공정과 달리 젖산 생산 미생물에 절대적으로 의존적이기 때문에, 젖산을 대량으로 생산할 수 있는 것은 물론 생산 비용을 절감할 수 있도록 높은 광학 순도의 젖산을 생산 할 수 있는 미생물을 확보하는 것이 무엇보다 중요하다. 고순도 광학 선택도의 젖산을 대량 생산하기 위해서는 대량의 젖산 원료가 투입되어야 하고, 여러 단계의 분리 정제 공정이 필수적으로 요구되기 때문에 생산 단가는 급격하게 증가된다. 따라서 젖산을 대량으로 생산하는 것과 더불어 필수적으로 요구되는 기술이 고순도의 광학 선택도를 갖는 젖산 생산 미생물 균주를 개발하는 것이다. 이를 위해서는 우수한 광학 선택도를 갖는 젖산 생산 유전자 확보와 더불어 높은 광학 선택도의 대사 흐름을 최적화 할 수 있는 시스템 분석 기술과 고도의 대사 공학 기술이 필수적으로 요구된다.
일반적으로 미생물의 생존 조건은 중온(30-37℃)과 중성 pH(neutral pH 7.0) 조건이고, 미생물은 특히 pH에 매우 민감하며 협소한 pH 범위에서만 활발한 생존성과 생산성을 나타내는 특성이 있다. 그런데 약산성을 갖는 젖산을 생산하는 젖산 생산 공정에서는 젖산의 생산 자체로서 산도를 저하시켜 산성화하는 특성이 있으므로 최적 pH를 유지 하기 위해, NaOH, (NH4)OH, Ca(OH)2와 같은 염기(base) 또는 탄산염(CaCO3)을 지속적으로 첨가함으로써 중성 발효 pH를 유지하는 것이 요구된다. 산도 7.0의 중성 pH에서의 젖산은 본질적으로 모두 이온화된다. 중성 pH에서 생산된 젖산염(lactate salt) 형태의 젖산을 분리 및 정제 하기 위해, 황산(sulfuric acid)과 같은 강산을 첨가하여 젖산염을 양이온화(protonation) 하는 공정이 필요하다. 이때 첨가된 황산 1몰은 2몰의 젖산을 생산하게 되는 반면, 1몰의 침전물(sulfate precipitant, eg. CaSO4)을 동시에 생산하게 된다.
결과적으로 생산된 젖산의 양과 동량의 황산이 필요하다. 이는 보다 많은 젖산의 회수, 정제를 위해 투입되어야 하는 황산의 비용이 지속적으로 증가할 뿐만 아니라 그로 인해 생산되는 침전물의 처리 비용과 환경적인 문제를 야기시키는 비경제적인 공정으로 알려져 있다. 이를 개선하고 경제성을 확보하기 위해 높은 산도(산성 pH)에서도 젖산을 생산 할 수 있는 젖산 생산 미생물과 이러한 산성 조건에서 생성된 젖산(lactic acid) 또는 젖산염(lactate salt)의 침전 폐기물 생성 없이 회수, 정제 할 수 있는 기술이 절실히 요구되어 왔다.
이에 본 발명은 상기 종래기술의 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로서 pH 조건의 제한이나 미생물 내 대사 경로의 조절 없이도 고수율로 젖산을 생산할 수 있을 뿐만 아니라, 별도의 젖산 분리 정제 공정 없이도 높은 광학 순도의 젖산을 생산할 수 있는 형질전환체, 이의 제조방법 및 이를 이용한 젖산 생산 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기와 같은 과제를 해결하기 위하여 본 발명자들이 고광학순도의 젖산을 대량 생산 가능한 젖산 생산 미생물을 연구하던 중, 류코노스톡(Leuconostoc) 속 균주 유래의 D-락테이트 디하이드로게나제(D-lactate dehydrogenase)를 코딩하는 유전자를 자이모모나스 모빌리스(Zymomonas mobilis) 균주에 도입함으로써 별도의 복잡한 공정이나 생산 조건의 제약 없이 간편하며 경제적인 방법으로 D-락테이트 디하이드로게나제 효소 활성을 극대화할 수 있고, 나아가 고광학순도의 젖산 생산을 최대화 할 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명은 류코노스톡 속 균주 유래의 D-락테이트 디하이드로게나제를 코딩하는 유전자가 도입된 자이모모나스 모빌리스 형질전환체를 제공한다.
또한 본 발명은 자이모모나스 모빌리스 균주를 준비하는 단계; 및 상기 자이모모나스 모빌리스 균주에 류코노스톡 속 균주 유래의 D-락테이트 디하이드로게나제를 코딩하는 유전자를 도입하는 단계를 포함하는 자이모모나스 모빌리스 형질전환체 제조방법을 제공한다.
또한 본 발명은 류코노스톡 속 균주 유래의 D-락테이트 디하이드로게나제를 코딩하는 유전자를 자이모모나스 모빌리스 균주에 도입하여 자이모모나스 모빌리스 형질전환체를 제조하는 단계; 및
상기 제조된 자이모모나스 모빌리스 형질전환체를 배양하는 단계를 포함하는 젖산 생산 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 젖산 생산 방법에 의해 생산된 고광학순도 젖산을 제공한다.
이하 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
젖산(lactate/lactic acid)은 카복시기?하이드록시기?메틸기?수소의 네 원자단이 결합한 비대칭 탄소원자를 가지는 유기화합물(화학식: C3H6O3)로서 D-, L-, DL- 형의 광학이성질체를 모두 포함하며, 바람직하게는 D-형일 수 있다.
상기 젖산의 생산 수율을 높이기 위해 본 발명의 일 구현예는 류코노스톡(Leuconostoc) 속 균주 유래의 D-락테이트 디하이드로게나제를 코딩하는 유전자가 도입된 자이모모나스 모빌리스(Zymomonas mobilis) 형질전환체를 제공한다.
본 발명은 또한 자이모모나스 모빌리스(Zymomonas mobilis) 균주를 준비하는 단계; 및 상기 자이모모나스 모빌리스 균주에 류코노스톡(Leuconostoc) 속 균주 유래의 D-락테이트 디하이드로게나제를 코딩하는 유전자를 도입하는 단계를 포함하는 자이모모나스 모빌리스 형질전환체 제조방법을 제공한다.
상기 자이모모나스 모빌리스(Zymomonas mobilis) 균주는 알코올 발효균으로서 세포 생장에 비하여 산물 전환율이 우수한 균주이므로, D-락테이트 디하이드로게나제(D-lactate dehydrogenase)를 코딩하는 유전자를 도입하기에 바람직하다.
상기 자이모모나스 모빌리스(Zymomonas mobilis) 형질전환체를 이용함으로써 자이모모나스 모빌리스 균주의 대사 경로 중 어느 특정 대사 경로를 차단하여 상기 특정 대사 경로에서 생성되는 일차 대사산물 이외의 다른 일차 대사산물의 생산을 증가시키는 등의 복잡한 대사 경로의 조절 공정 없이도 매우 간단하고 용이한 공정을 통하여 젖산 생산을 현저히 향상시킬 수 있다.
본 명세서에서 ‘형질전환’은 원래의 세포가 가지고 있던 것과 다른 종류의 유전자가 있는 DNA사슬 조각 또는 플라스미드가 세포들 사이에 침투되어 원래 세포에 존재하던 DNA와 결합, 세포의 유전형질이 변화되는 분자생물학적 현상을 의미한다.
특히 본 발명에서 형질전환은 상기 D-락테이트 디하이드로게나제를 코딩하는 유전자를 자이모모나스 모빌리스 균주 내로 도입하는 것을 의미하고, ‘형질전환체’는 상기 유전자가 도입된 자이모모나스 모빌리스 균주를 의미하며, 바람직하게는 상기 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 유전자(Dldh-Lmes1801)가 도입된 기탁번호 KCTC 11803BP인 형질전환체이다.
상기 D-락테이트 디하이드로게나제를 코딩하는 유전자는 이에 제한되지 않으나 바람직하게는 류코노스톡 속 균주에서 유래된 것일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 펩티드 또는 상기 서열번호 2의 아미노산 서열과 아미노산 일치도(identity,%)가 40% 이상인 펩티드를 코딩하는 유전자일 수 있다.
바람직하게는 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 또는 서열번호 8의 아미노산 서열로 표시되는 펩티드를 코딩하는 유전자일 수 있다.
상기 서열번호 2의 아미노산 서열은 서열번호 1의 염기서열에 의해 암호화되고, 상기 서열번호 4의 아미노산 서열은 서열번호 3의 염기서열에 의해 암호화되고, 상기 서열번호 6의 아미노산 서열은 서열번호 5의 염기서열에 의해 암호화되며, 상기 서열번호 8의 아미노산 서열은 서열번호 7의 염기서열에 의해 암호화되는 것일 수 있다.
따라서 상기 D-락테이트 디하이드로게나제를 코딩하는 유전자는 이에 제한되지 않으나, 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 유전자 또는 상기 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 유전자와 염기서열 유사도(similarity,%)가 85% 이상인 유전자일 수 있다.
바람직하게는 상기 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 유전자(Dldh-Lmes1801), 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 유전자(ldhD-ATCC19254), 서열번호 5의 염기서열로 표시되는 유전자(ldhD1-LMG18811), 또는 서열번호 7의 염기서열로 표시되는 유전자(D-ldh-NBRC3426)일 수 있다.
상기 유전자의 도입은 이에 제한되지 않지만 바람직하게는 접합(conjugation), 전기천공법(electroporation), 및 유전자총 방법(gene gun)으로 이루어진 군에서 선택된 방법을 사용할 수 있다.
상기 접합(conjugation)은 세포간(donor cell, recipient cell)의 세포 표면의 접합성 선모(conjugative pili)를 통한 DNA 전달 기작을 통해 유전자를 도입하는 방법이다(Lederberg and Tatum, Nature. Oct 19;158(4016):pp.558. 1946).
상기 전기천공법(electroporation)은 세포에 전기 충격을 주어 세포막에 일시적으로 작은 구멍이 생기도록 하여 세포의 DNA 흡수를 증가시키는 방법이며(Neumann et al., The EMBO Joumal Vol.1 No.7 pp.841-845, 1982; Cellular & Molecular Biology Letters, pp 849-858, 2002 참조), 상기 유전자총 방법은 유전자를 금속 (텅스텐 또는 금) 입자에 코팅한 후, 고압가스의 힘으로 발사하여 유전자를 도입하는 방법이다(Cellular & Molecular Biology Letters, pp 849-858, 2002 참조).
상기 유전자의 자이모모나스 모빌리스 균주 내 도입 위치는 특별히 제한되지 않고, 도입되는 위치와 무관하게 고광학순도의 젖산을 높은 수율과 효율로 생산할 수 있다. 따라서 매우 간단하고 편리할 뿐 아니라 비용 절감의 효과가 있다.
즉, 자이모모나스 모빌리스 균주의 대사 경로와 관련이 없는 유전자 또는 이의 주변 지역에 도입할 수 있음은 물론이고, 본 발명에 따르면 자이모모나스 모빌리스 균주의 대사 경로의 조절이 필요치 않고 대사 경로에 대한 영향 여부와도 무관하므로 대사 경로와 관련된 유전자 위치에 도입하는 것도 가능하다.
예컨대, 자이모모나스 모빌리스 균주의 게놈 내, ORF ZMO270~ZMO263, ORF ZMO0087~ZMO0089, ORF ZMO0381~ZMO0384, ORF ZMO0390~ZMO0394 또는 ORF ZMO1786~ZMO1789 부위에 도입할 수 있으며, 또는 대사 경로 관련 유전자인 L-락테이트 디하이드로게나제 (ZMO0256) 유전자, D-락테이트 디하이드로게나제 (ZMO1237), 알코올 디하이드로게나제 I (ZMO1236) 유전자, 또는 알코올 디하이드로게나제 II (ZMO1596) 유전자 위치에 도입할 수도 있다.
상기 D-락테이트 디하이드로게나제를 코딩하는 유전자는 자이모모나스 모빌리스 균주의 프로모터와 함께 벡터에 삽입하여 상기 자이모모나스 모빌리스 균주 내에 도입시킬 수 있다.
사용 가능한 벡터로는, 공지의 모든 종류의 벡터를 모두 포함하며, 예컨대 pGMC, pZY507, pZY500, 및 pZymo와 같은 자이모모나스 모빌리스 유전자 발현벡터뿐만 아니라, pUC series, pBluescript series, pGEM series 등과 같은 일반 클로닝용 벡터일 수 있다. 바람직하게는 상기 벡터는, 자이모모나스 모빌리스에서 조절 가능한 프로모터를 포함하며, 선별마커, 컨쥬게이터(conjugator) 등을 더욱 포함할 수 있다.
자이모모나스에서 강력하게 발현되는 프로모터는 통상의 재조합 단백질 발현에 사용되는 모든 종류의 프로모터일 수 있으며, 또는 자이모모나스 모빌리스 ZM4에서 유래한 프로모터를 사용할 수도 있다. 예컨대 ZM4 유래의 adhI (adhA, ZMO1236), pdc (pdc, ZMO1360) 또는 adhII 유전자 (adhB, ZMO1596)의 프로모터가 있으며 그 외에도 자이모모나스 모빌리스 ZM4 각각의 유전자 상위서열 500 bp가 프로모터로서 작용이 가능하다. 한편, 대장균에서 강력하게 발현되는 tac 프로모터 역시 자이모모나스에서 사용할 수 있다(Zhang et al., Science. 1995. Jan 13;267(5195):pp. 240-243).
선별마커는, 항생제 내성 유전자일 수 있으며, 스펙티노마이신 내성 유전자, 클로람페니콜 내성 유전자, 암피실린 내성 유전자, 테트라사이클린 내성 유전자 등이 사용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한 벡터는 숙주세포에 형질전환되어 에피소말(episomal)상태로 존재하는 경우, 복제에 필요한 복제 오리진(replication origin)이 요구된다. 복제 오리진으로는 대부분의 그램(-) 박테리아에서 작용하는 OriV origin이 있으며, 상기 origin에 작용하는 repA, repB 유전자가 더욱 요구될 수 있다.
상기 벡터는 미생물에 형질도입시, 미생물의 염색체에 삽입(integration)되거나 플라스미드 형태로 세포질내 존재할 수 있으며, 이는 벡터의 종류에 따라 적절히 조절할 수 있다. 염색체내에 벡터가 삽입되는 경우는 벡터 내에 자이모모나스 균주에서 복제에 필요한 복제 오리진이 없는 경우로 염색체내에 플라스미드와 상동성을 가지는 부분이 있는 경우 상동성이 있는 부분에 삽입(homologous recombination) 되어 동일한 유전자가 연속적으로 2 copy 존재(single cross over, gene integration)하거나 상동성 부위가 플라스미드의 상동성 부위로 대체되게 된다(double cross over, gene disruption). 만약 염색체내에 플라스미드와 상동성이 있는 부분이 존재하지 않는다면 무작위적인 삽입 (Random recombination)이 일어나게 된다.
또한 본 발명은 류코노스톡 속 균주 유래의 D-락테이트 디하이드로게나제를 코딩하는 유전자를 자이모모나스 모빌리스 균주에 도입하여 자이모모나스 모빌리스 형질전환체를 제조하는 단계; 및 상기 제조된 자이모모나스 모빌리스 형질전환체를 배양하는 단계를 포함하는 젖산 생산 방법을 제공한다.
상기 배양은 정상 발효 조건인 pH 5.0 에서는 물론이고, 산성 발효 조건이나 그 외 pH 비조절 조건에서도 제한 없이 수행할 수 있다. 예컨대, pH 3.0 내지 pH 7.0, 보다 구체적으로 pH 2.0 내지 pH 6.0, 또는 pH 3.0 내지 pH 5.0와 같은 산성 조건하에서도 젖산의 생산이 가능하다.
일반적으로 미생물의 생존 조건은 중온(30-37℃)과 중성 pH(neutral pH 7.0) 조건이고, 미생물은 특히 pH에 매우 민감하며 협소한 pH 범위에서만 활발한 생존성과 생산성을 나타내는 특성이 있는데, 약산성을 갖는 젖산을 생산하는 젖산 생산 공정에서는 젖산의 생산 자체로서 산도를 저하시켜 산성화하는 특성이 있으므로 최적 pH를 유지 하기 위해, NaOH, (NH4)OH, Ca(OH)2와 같은 염기(base) 또는 탄산염(CaCO3)을 지속적으로 첨가함으로써 중성 발효 pH를 유지하는 것이 요구되었다. 그러나 본 발명의 젖산 생산 방법은 이와 같은 pH 조건의 제한 없이 어떠한 pH 조건에서도 높은 광학 순도의 젖산을 고수율로 생산할 수 있는 특징이 있어 매우 경제적이며 간편하게 젖산을 생산할 수 있다.
상기 젖산 방법에 의해 바람직하게는 70% 이상에서 높게는 100% 이상의 현저히 높은 생산 수율로 광학 순도가 높은 우수한 젖산을 대량 생산할 수 있다.
따라서 본 발명은 상기 젖산 생산 방법에 의해 생산된 고광학순도의 젖산을 제공한다.
상기 젖산 생산 방법에 의해 생산되는 젖산은 광학 순도가 95% 이상이며 높게는 99%, 보다 높게는 99.9% 이상의 현저히 우수한 광학 순도를 가질 수 있다.
본 발명에 따라, pH 조건 등 생산 조건의 엄격한 제한이나 미생물 내 대사 경로의 복잡한 조절 없이도 간편하게 고광학순도의 젖산을 고수율로 생산할 수 있는 자이모모나스 모빌리스(Zymomonas mobilis) 형질전환체, 이의 제조방법, 및 이를 이용한 젖산 생산 방법이 제공된다.
상기 형질전환체를 이용하면 별도의 부가적인 젖산 분리 정제 공정이 필요하지 않으므로 젖산 생산 단계를 현저히 줄일 수 있어 생산 비용을 크게 절감할 수 있을 뿐만 아니라, 침전 폐기물로 인한 환경적인 문제를 배제할 수 있어 환경 보호 효과 또한 얻을 수 있다.
도 1은 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 D-락테이트 디하이드로게나제를 코딩하는 유전자의 발현단위를 개략적으로 나타낸 것이다.
도 2는 실시예 1에서 제조된 pBS-del-270::263 벡터의 개열지도이다.
도 3은 실시예 1에서 제조된 pBS-del-270::sp-DlmesC2::263 벡터의 개열지도이다.
도 2는 실시예 1에서 제조된 pBS-del-270::263 벡터의 개열지도이다.
도 3은 실시예 1에서 제조된 pBS-del-270::sp-DlmesC2::263 벡터의 개열지도이다.
이하 본 발명의 이해를 돕기 위해 바람직한 실시예를 통해 더욱 상세히 설명하기로 한다. 다만, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 이에 한정되는 것은 아니다.
실시예
1. D-
락테이트
디하이드로게나제
유전자(
DlmesC2
)가 도입된
ZM
형질전환체 제조
실시예
1-1. 플라스미드
pGEM
-T-
DlmesC2
제조
김치로부터 분리된 류코노스톡 메젠테로이데스(Leuconostoc mesenteroides)균주로부터 D-락테이트 디하이드로게나제 효소를 코딩하는 DlmesC2 유전자(1,068 bp)(서열번호 1)를 PCR 방법(96℃에서 5분간 전변성(pre-denaturation); 96℃에서 30초, 60℃에서 30초, 72℃에서 1분간 총 25 cycles; 72℃에서 7분간 후 신장(post extension))으로 0.1Unit의 High-Fidelity Platinum Taq DNA Polymerase (Roche)와 하기 기재된 프라이머를 사용하여 선택적으로 증폭, 분리하였다.
상기 PCR 공정에 사용된 프라이머는 아래와 같다.
정방향 프라이머 (DLmesC2F)(서열번호 : 9)
5-TGGAGGATCCCATGGTAAAGATTTTTGC-3
역방향 프라이머 (DLmesC2R)(서열번호 : 10)
5-TGTTTGATTATTCCTGCAGAAACCCCTC-3
이후, pGEM-T Easy vector(Promega)에 클로닝하여 DlmesC2 유전자가 클로닝된 플라스미드 pGEM-T-DlmesC2를 제조하고, 염기서열을 확인하였다. PCR 증폭과 클로닝은 제조사의 실험방법을 따랐다.
실시예
1-2.
pBS
-
del
-270::
sp
-
DlmesC2
::263 벡터 제조
상기 실시예 1-1에서 제조된 플라스미드(pGEM-T-DlmesC2)를 제한효소 NcoI(NEB)와 PstI(NEB)으로 절단한 다음, 자이모모나스 모빌리스 알코올 디하이드로게나제(adh)II 유전자(adhB, ZMO1596)의 프로모터 부위(서열번호 11)와 스펙티노마이신 내성(spectinomycin resistant) 유전자(specR, 1,142bp)(서열번호 12)를 갖는 pBS-sp-P1596-specR 벡터(마크로젠)에 동일한 제한효소 자리로 클로닝하여 D-락테이트 디하이드로게나제 유전자(DlmesC2)를 포함하는 pBS-sp-DlmesC2 벡터를 얻었다.
D-락테이트 디하이드로게나제 유전자(DlmesC2)를 자이모모나스 모빌리스 유전체에 도입하기 위하여, 상동성 재조합(homologous recombination)(Alberts et al., 2002. "Chapter 5: DNA Replication, Repair, and Recombination". Molecular Biology of the Cell (4th ed.). New York: Garland Science. p. 845.)을 이용하였다.
상동성 재조합에 사용된 유전자는 자이모모나스 모빌리스(ATCC 31821)의 유전체 정보로부터 선별하였으며, 구체적으로 ORF ZMO0263부터 ZMO0270까지의 8개의 반복된 유전자들(서열번호 13~서열번호 20)을 선별하였다. ORF ZMO0263부터 ZMO0270까지의 반복된 유전자들은 특정 대사 효소를 코딩하지 않는 유전자들이었으며, 전체 약 10kb에 달하는 부위이다. 이들 유전자들의 상위 상동부위의 4,468 bp 유전자(서열번호 21)와 하위 상동부위의 4,935 bp 유전자(서열번호 22) 각각을 실시예 1과 동일한 실험 방법을 사용하여 각각 선택적으로 증폭, 분리한 다음, HindIII(NEB), PstI(NEB), PvuI(NEB), ScaI(NEB)으로 절단한 다음, 동일한 제한 효소로 절단된 pBluescriptII vector(Stratagene)에 클로닝하여 최종적으로 pBS-del-270::263 벡터(도 2)를 제조하였다. 사용된 프라이머는 아래와 같다.
상위 유전자 정방향 프라이머 (L-270F)(서열번호 23)
5-GGAAAGTCAAGCTTATCATCTAG-3
상위 유전자 역방향 프라이머 (L-270R) (서열번호 24)
5-GTGAGTTGTTAACCAATTTTATACTCCATTCATC-3
하위 유전자 정방향 프라이머 (R263F) (서열번호 25)
5-GACAATACAAAGTACTGATAAAGGA-3
하위 유전자 역방향 프라이머 (R263R) (서열번호 26)
5-ATAAGCCTGTTAACTTACCCATCTTGTCCGACG-3
앞서 제조된 pBS-sp-DlmesC2 벡터를 제한효소 NotI(NEB)과 PstI(NEB)으로 절단하여, specR-DlmesC2 유전자 절편만을 회수하고, T4 DNA polymerase(NEB)와 T4 polynucleotide kinase 효소(NEB) 처리를 통해 평형 말단(blunt end)의 specR-DlmesC2 유전자 절편을 제작하였다. 제작된 평형 말단의 specR-DlmesC2를 상기 제조된 pBS-del-270::263 벡터의 제한효소 HpaI 자리에 T4 DNA ligase (NEB) 효소로 라이게이션(ligation) 및 클로닝하여 pBS-del-270::sp-DlmesC2::263 벡터(도 3)를 제조하였다.
실시예
1-3. D-
락테이트
디하이드로게나제
유전자(
DlmesC2
)가 도입된
ZM
형질전환체 제조
상기 실시예 1-2에서 제조된 pBS-del-270::sp-DlmesC2::263 벡터를 자이모모나스 모빌리스 ZM4 균주(ATCC 31821)에 전기천공법(electroporation)(Neumann et al., The EMBO Joumal Vol.1 No.7 pp.841-845, 1982)으로 형질 전환하였고, RM 배지(글루코오스, 20g/l; 효모추출물(DIFCO), 10g/l; MgSO4, 1g/l; (NH4)2SO4, 1g/l; KH2PO4, 2g/l; agar, 15g/l; pH 5.0) 에 스펙티노마이신을 첨가하여 pBS-del-270::sp-DlmesC2::263 벡터가 형질전환된 균주를 선별하였으며, 최종적으로 ORF ZMO0263부터 ZMO0270 반복 유전자들이 상동성 재조합되고 sp-DlmesC2 유전자가 도입된 형질전환체를 Zymomonas mobilis MG6106 으로 명명하고 2010년 11월 5일자로 한국생명공학연구원 미생물자원센터에 기탁하여 기탁번호 KCTC 11803BP를 부여 받았다.
실시예
2. 다양한 D-
락테이트
디하이드로게나제
유전자가 도입된 젖산 생산 ZM 균주 제조
류코노스톡 크레모리스(Leuconostoc cremoris) ATCC19254, 류코노스톡 메젠테로이데스(Leuconostoc mesenteroides) LMG18811, 및 류코노스톡 메젠테로이데스 (Leuconostoc mesenteroides) NBRC3426 균주로부터 유래된 D-락테이트 디하이드로게나제 유전자인 ldhD-ATCC19254, ldhD1-LMG18811, 및 D-ldh-NBRC3426를 실시예 1과 동일한 방법과 재료를 사용하여 PCR 증폭, 분리하였다. 상기 다양한 D-락테이트 디하이드로게나제 유전자 증폭에 사용된 프라이머는 다음과 같다.
[ldhD-ATCC19254 유전자 증폭 프라이머]
ATCC19254F(서열번호 27)
5-CATATGAAGATTTTTGCTTACGGCATTCGT-3
ATCC19254R(서열번호 28)
5-TTAATATTCAACAGCAATAGCT-3
[ldhD1-LMG18811 유전자 증폭 프라이머]
LMG18811F(서열번호 29)
5-CATATGAAAATTTTTGCTTACGGCATACG-3
LMG18811R(서열번호 30)
5-CTGCAGTCAGTATTTAACAGCGATTGCA-3
[D-ldh-NBRC3426 유전자 증폭 프라이머]
NBRC3426F(서열번호 31)
5-CATATGAAGATTTTTGCTTACGGCATTCG-3
NBRC3426R(서열번호 32)
5-CTGCAGTTAATATTCAACAGCAATAGCT-3
개별 증폭된 PCR 산물은 제한효소 NcoI(NEB)과 PstI(NEB)으로 절단하여 동일한 제한효소로 절단된 pBS-sp-P1596-specR 벡터(마크로젠)에 동일한 제한효소 자리로 T4 DNA ligase 효소(NEB)로 라이게이션(ligation) 및 클로닝하였으며, NBRC3426 균주의 D-락테이트 디하이드로게나제 유전자를 포함하는 벡터인 pBS-sp-D-NBRC3426l 벡터, LMG18811 균주의 D-락테이드 디하이드로게나제 유전자를 포함하는 벡터인 pBS-sp-D-LMG18811, 그리고 ATCC15294 균주의 D-락테이드 디하이드로게나제 유전자를 포함하는 벡터인 pBS-sp-D-ATCC15294 벡터를 각각 제작하였다.
상기 벡터들을 제한 효소 NotI(NEB)과 PstI(NEB)으로 절단하여, specR-D-NBRC3426l, specR-D-LMG18811, 그리고 specR-D-ATCC15294 유전자 절편을 회수 하였고, T4 DNA polymerase(NEB)와 T4 polynucleotide kinase 효소(NEB) 처리를 통해 평형 말단(blunt end)의 유전자 절편 각각을 제작하였다. 제작된 평형 말단의 유전자 절편을 상기 실시예 1에서 제조된 pBS-del-270::263 벡터의 제한효소 HpaI 자리에 클로닝하여 pBS-del-270::sp-D-NBRC3426l::263 벡터, pBS-del-270::sp-D-LMG18811::263 벡터, 그리고 pBS-del-270::sp-D-ATCC15294::263 벡터 각각을 제조하였다.
상기에서 제조된 벡터들을 자이모모나스 모빌리스 ZM4 균주(ATCC 31821)에 전기천공법(electroporation)으로 형질 전환하였고, RM 배지(글루코오스, 20g/l; 효모추출물(DIFCO), 10g/l; MgSO4, 1g/l; (NH4)2SO4, 1g/l; KH2PO4, 2g/l; agar, 15g/l; pH 5.0) 에 스펙티노마이신을 첨가하여 형질전환된 균주를 선별하였으며, 최종적으로 ORF ZMO0263부터 ZMO0270 반복 유전자들이 상동성 재조합되고, 류코노스톡 크레모리스 ATCC 19254 균주로부터 D-락테이트 디하이드로게나제 효소를 코딩하는 ldhD-ATCC19254 유전자(996 bp)(서열번호 3)가 도입된 균주를 MG6115, 류코노스톡 메젠테로이데스 LMG 18811 균주로부터 D-락테이트 디하이드로게나제 효소를 코딩하는 ldhD1-LMG18811 유전자(996 bp)(서열번호 5)가 도입된 균주를 MG6116, 그리고 류코노스톡 메젠테로이데스 NBRC 3426로부터 D-락테이트 디하이드로게나제 효소를 코딩하는 D-ldh-NBRC3426 유전자(996 bp)(서열번호 7)가 도입된 균주를 MG6117로 각각 명명하였다.
실시예
3.
유전체내
대사 경로와 무관한 유전자 또는 부위를 제거하고 D-
락테이트
디하이드로게나제
유전자를 도입한
ZM
균주 제조
D-락테이트 디하이드로게나제 유전자의 균주 내 도입 위치 및 이에 따른 젖산 생산 정도에 대한 영향을 알아보기 위해, 자이모모나스 모빌리스 균주(ATCC 31821)내 대사 경로와 무관한 특정 유전체 위치에 해당하는 유전자 또는 부위를 제거함과 동시에 서열번호 1의 염기서열을 갖는 DlmesC2 유전자를 도입한 균주를 제조하였다. 구체적으로, 자이모모나스 모빌리스 유전체에서 특정 효소를 코딩하지 않고, 어떠한 유전자 정보를 갖지 않는 유전자 부위 4종류를 선별하여 각각 제거하는 동시에 DlmesC2 유전자가 도입된 균주를 제조하였다. 균주 제조는 실시예 1과 동일한 방법을 사용하였으며, 대사 경로와 무관한 유전자 각각의 상위 상동 부위 및 하위 상동 부위 약 3,000bp 이상을 상동성 재조합 부위로 클로닝하여 사용하였다.
실시예
3-1.
ZMO0087
~
ZMO0089
의 3가지
ORF
부위를 제거하고 D-
락테이트
디하이드로게나제
유전자를 도입한 벡터 제조
ZMO0087~ZMO0089의 3가지 ORF(open reading frame)들을 5' 말단쪽에 5' 말단에서부터 상위 상동 부위의 3,168 bp(서열번호 33)와 3' 말단쪽에 3' 말단에서부터 하위 상동 부위의 3,159 bp(서열번호 34)를 각각 정방향 프라이머(87F)와 역방향 프라이머(89R) 쌍을 사용하여 실시예 1과 동일한 방법과 조건으로 PCR 증폭하였고, 다만 신장(extension) 시간을 10분으로 조절하였다.
정방향 프라이머 (87F)(서열번호 35)
5-TGAAATGGCCTCTGCGATATATCGAATA-3
역방향 프라이머 (89R)(서열번호 36)
5-GTAAGGGTATCGCTCCGCTCTTTATGGCGGA-3
증폭된 PCR 산물은 제한 효소 NotI(NEB)으로 처리한 다음, 동일한 제한효소로 절단된 pBluescript II 벡터 (Stratagene)에 클로닝하여 pBS-ZMO008789 벡터를 제작하였다.
이후 역방향(reverse) PCR 방법을 응용하여 ORF 유전자 ZMO0087~ZMO0089들을 제외하고 pBluescript II 벡터를 포함하는 상위 상동 부위와 하위 상동 부위만을 선택적으로 PCR 증폭하였다. 역방향 PCR 반응에 사용된 프라이머들(del 89F 및 del 87R)은 아래와 같으며, PCR 증폭 반응은 실시예 1과 동일한 방법과 조건을 사용하였고, 다만 신장(extension) 시간을 10분으로 조절하였다.
정방향 프라이머 (del 89F)(서열번호 37)
5-TAACCCGTTTACCTCTATCATATAATTATA-3
역방향 프라이머 (del 87R)(서열번호 38)
5-CATAAAATTCCTACAAATATGATCTTTTTA-3
증폭된 PCR 산물을 제한효소 PmeI(NEB)을 처리하여 얻은 유전자 절편과 실시예 1의 sp-DlmesC2 유전자 단편을 T4 DNA ligase (NEB) 효소로 라이게이션(ligation)하여 pBS-Del 87::sp-DlmesC2::89 벡터를 제작하였다.
실시예
3-2.
ZMO0381
~
ZMO0384
의 4가지
ORF
부위를 제거하고 D-
락테이트
디하이드로게나제
유전자를 도입한 벡터 제조
ZMO0381~ZMO0384의 4가지 ORF들을 5' 말단쪽에 5' 말단에서부터 상위 상동 부위의 3,140 bp(서열번호 39)와 3' 말단쪽에 3' 말단에서부터 하위 상동 부위의 3,212 bp(서열번호 40)를 각각 정방향 프라이머(381F)와 역방향 프라이머(384R) 쌍을 사용하여 실시예 1과 동일한 방법과 조건으로 PCR 증폭하였고, 다만 신장(extension) 시간을 10분으로 조절하였다.
정방향 프라이머 (381F)(서열번호 41)
5-GAAGAAGCGCAGACCCTATCTCAACGATCTTT-3
역방향 프라이머 (384R) (서열번호 42)
5-CCAAACTGTCCCTTGGCCAGCTTTCAAAAAAAC-3
증폭된 PCR 산물은 제한 효소 NotI(NEB)으로 처리한 다음, 동일한 제한효소로 절단된 pBluescript II 벡터 (Stratagene)에 클로닝하였으며, pBS-ZMO0381384 벡터를 제작하였다.
이후 역방향 PCR 방법을 응용하여 ORF 유전자 ZMO0381~ZMO0384들을 제외하고 pBluescript II 벡터를 포함하는 상위 상동 부위와 하위 상동 부위만을 선택적으로 PCR 증폭하였다. 역방향 PCR 반응에 사용된 프라이머들(del 384F 및 del 381R)은 다음과 같으며, PCR 증폭 반응은 실시예 1과 동일한 방법과 조건을 사용하였고, 다만 신장(extension) 시간을 10분으로 조절하였다.
정방향 프라이머 (del 384F)(서열번호 43)
5-TGTAGTTTATACGCTGCATTAAATGAAAAGG-3
역방향 프라이머 (del 381R)(서열번호 44)
5-TATTTATCCAATGCGCCCCCTGCTTTG-3
증폭된 PCR 산물을 제한효소 PmeI(NEB)을 처리한 다음, 실시예 1의 sp-DlmesC2 유전자 단편을 T4 DNA ligase(NEB) 효소로 라이게이션(ligation)하여 pBS-Del 381::sp-DlmesC2::384 벡터를 제작하였다.
실시예
3-3.
ZMO0390
~
ZMO0394
의 4가지
ORF
부위를 제거하고 D-
락테이트
디하이드로게나제
유전자를 도입한 벡터 제조
ZMO0390~ZMO0394의 5가지 ORF들을 5' 말단쪽에 5' 말단에서부터 상위 상동 부위의 3,280 bp(서열번호 45)와 3' 말단쪽에 3' 말단에서부터 하위 상동 부위의 3,008 bp(서열번호 46)를 각각 정방향 프라이머(390F)와 역방향 프라이머(394F) 쌍을 사용하여 실시예 1과 동일한 방법과 조건으로 PCR 증폭하였고, 다만 신장(extension) 시간을 10분으로 조절하였다.
정방향 프라이머 (390F)(서열번호 47)
5-ATGATCCGATGGCTGGAAATAATGCGGATATG-3
역방향 프라이머 (394R)(서열번호 48)
5-TAGCGGTCTGAGGCTGTGCCTCCGATGTA-3
증폭된 PCR 산물은 제한 효소 NotI (NEB)으로 처리한 다음, 동일한 제한효소로 절단된 pBluescript II 벡터 (Stratagene)에 클로닝하였으며, pBS-ZMO0390394 벡터를 제작하였다.
이후 역방향 PCR 방법을 응용하여 ORF 유전자 ZMO0390~ZMO0394들을 제외하고 pBluescript II 벡터를 포함하는 상위 상동 부위와 하위 상동 부위만을 선택적으로 PCR 증폭하였다. 역방향 PCR 반응에 사용된 프라이머들(del 394F 및 del 390R)은 다음과 같으며, PCR 증폭 반응은 실시예 1과 동일한 방법과 조건을 사용하였고, 다만 신장(extension) 시간을 10분으로 조절하였다.
정방향 프라이머 (del 394F)(서열번호 49)
5-CATCCATTTTGGATATTATTTTTAAATTAATCC-3
역방향 프라이머 (del 390R) (서열번호 50)
5-CGGTAAGTGCCTTTCACCGCTTCCACGACAG-3
증폭된 PCR 산물을 제한효소 PmeI(NEB)을 처리한 다음, 실시예 1의 sp-DlmesC2 유전자 단편을 T4 DNA ligase(NEB) 효소로 라이게이션(ligation)하여 pBS-Del 390::sp-DlmesC2::394 벡터를 제작하였다.
실시예
3-4.
ZMO1786
~
ZMO1789
의 4가지
ORF
부위를 제거하고 D-
락테이트
디하이드로게나제
유전자를 도입한 벡터 제조
ZMO1786~ZMO1789의 4가지 ORF들은 5' 말단쪽에 5' 말단에서부터 상위 상동 부위의 3,450 bp(서열번호 51)와 3' 말단쪽에 3' 말단에서부터 하위 상동 부위의 3,100 bp(서열번호 52)를 각각 정방향 프라이머(1786F)와 역방향 프라이머(1789R) 쌍을 사용하여 실시예 1과 동일한 방법과 조건으로 PCR 증폭하였고, 다만 신장(extension) 시간을 10분으로 조절하였다.
정방향 프라이머 (1786F)(서열번호 53)
5-ACCAAAGCCGAAAAAAGGTCATCAAAAATACC-3
역방향 프라이머 (1789R)(서열번호 54)
5-GTTCAATTGCCACGCTTGAGGCTTTTGAAAATGC-3
증폭된 PCR 산물은 제한 효소 NotI(NEB)으로 처리한 다음, 동일한 제한효소로 절단된 pBluescript II 벡터 (Stratagene)에 클로닝하였으며, pBS-ZMO17861789 벡터를 제작하였다.
이후 역방향 PCR 방법을 응용하여 ORF 유전자 ZMO1786~ZMO1789들을 제외하고 pBluescript II 벡터를 포함하는 상위 상동 부위와 하위 상동 부위만을 선택적으로 PCR 증폭하였다. 역방향 PCR 반응에 사용된 프라이머들(del 1789F 및 del 1786R)은 다음과 같으며, PCR 증폭 반응은 실시예 1과 동일한 방법과 조건을 사용하였고, 다만 신장(extension) 시간을 10분으로 조절하였다.
정방향 프라이머 (del 1789F)(서열번호 55)
5-TATCTCGCTTGCAATAAAACATATTTTCAGG-3
역방향 프라이머 (del 1786R)(서열번호 56)
5-AGATTTTATCCGACAAAATCAATTCTATAAG-3
증폭된 PCR 산물을 제한효소 PmeI(NEB)을 처리한 다음, 실시예 1의 sp-DlmesC2 유전자 단편을 T4 DNA ligase(NEB) 효소로 라이게이션(ligation)하여 pBS-Del 1786::sp-DlmesC2::1789 벡터를 제작하였다.
실시예
3-5. 대사 경로와 무관한 유전자 또는 부위가 D-
락테이트
디하이드로게나제
유전자로 치환된
ZM
균주 제조
상기 실시예 3-1 내지 실시예 3-4에 따라 제조된 벡터들을 자이모모나스 모빌리스 ZM4 균주(ATCC 31821)에 전기천공법 (electroporation)으로 형질전환하여 대사 무관한 유전자들이 제거되고 sp-DlmesC2 유전자가 삽입된 균주들을 다음과 같이 제작하였다.
실시예 3-1의 pBS-Del 87::sp-DlmesC2::89 벡터를 자이모모나스 모빌리스 ZM4 균주에 형질전환하고, 항생제 스펙티노마이신이 포함된 RM 배지(글루코오스, 20g/l; 효모추출물(DIFCO), 10g/l; MgSO4, 1g/l; (NH4)2SO4, 1g/l; KH2PO4, 2g/l; agar, 15g/l; pH 5.0)에 선택적 생장을 보이는 형질전환체들을 선별하는 과정을 통해 ORF 유전자 ZMO0087~ZMO0089가 sp-DlmesC2 유전자로 치환된 Z. mobilis ΔZMO8789::sp-DlmesC2 균주를 제조하고 이를 MG6118 균주로 명명하였다.
이와 마찬가지로, 실시예 3-2 내지 실시예 3-4에 따라 제조된 pBS-Del 381::sp-DlmesC2::384 벡터, pBS-Del 390::sp-DlmesC2::394 벡터 및 pBS-Del 1786::sp-DlmesC2::1789 벡터로 형질전환되어 각각의 유전자 부위가 sp-DlmesC2 유전자로 치환된 Z. mobilis Δ ZMO381384 :: sp - DlmesC2 균주(MG6119 균주), Z. mobilis Δ ZMO390394 :: sp - DlmesC2 균주(MG6120 균주), 및 Z. mobilis ΔZMO390394::sp-DlmesC2 균주(MG6121 균주)를 제조하였다.
실시예
4. 대사 경로 관련 유전자를 제거하고 D-
락테이트
디하이드로게나제
유전자를 도입한
ZM
균주 제조
균주 내 D-락테이트 디하이드로게나제 유전자의 도입과 균주의 대사 경로 조절간의 관계 및 이의 젖산 생산에 대한 영향을 알아보기 위해, 균주 내 다른 대사 경로 유전자(들)를 제거함과 동시에 서열번호 1의 염기서열을 갖는 DlmesC2 유전자를 도입한 균주를 제조하였다. 구체적으로 자이모모나스 모빌리스 균주의 중심 대사 회로에 해당하는 에탄올(ethanol)과 젖산(lactic acid) 생산 유전자가 제거된 균주와 여기에 DlmesC2 유전자가 도입된 균주를 제조하였다. 균주 제조방법은 실시예 1과 동일한 방법을 사용하였으며, 대사 경로 유전자 각각의 상위 상동 부위 및 하위 상동 부위 약 3,000bp 이상을 상동성 재조합 부위로 클로닝하여 사용하였다.
실시예
4-1.
락테이트
디하이드로게나제
(
ZMO0256
) 유전자를 제거하고 D-
락테이트
디하이드로게나제
유전자(
DlmesC2
)를 도입한 벡터 제조
자이모모나스 모빌리스 ZM4(ATCC 31821)의 게놈 유전자 (AE008692)로부터 락테이트 디하이드로게나제(ZMO0256) 유전자 5' 말단쪽에 5' 말단에서부터 상위 상동 부위의 4,879 bp(서열번호 57)와 3' 말단쪽에 3' 말단에서부터 하위 상동 부위의 4,984 bp(서열번호 58)를 각각 정방향 프라이머(ldhAF)와 역방향 프라이머 (ldhAR)쌍을 사용하여 실시예 1과 동일한 방법과 조건으로 PCR 증폭하였고, 다만 신장(extension) 시간을 10분으로 조절하였다.
정방향 프라이머 (ldhAF) (서열번호 59)
5-TGGCAGTCCTCCATCTAGATCGAAGGTGC-3
역방향 프라이머 (ldhAR) (서열번호 60)
5-GTGATCTGACGGTGAGCTCAGCATGCAGG-3
증폭된 PCR 산물은 제한 효소 NotI(NEB)으로 처리한 다음, 동일한 제한효소로 절단된 pBluescript II 벡터 (Stratagene)에 클로닝하였으며, pBS-ZMO0256 벡터를 제작하였다.
이후 역방향 PCR 방법을 응용하여 락테이트 디하이드로게나제(ZMO0256) 유전자를 제외하고 pBluescript II 벡터를 포함하는 상위 상동 부위와 하위 상동 부위만을 선택적으로 PCR 증폭하였다. 역방향 PCR 반응에 사용된 프라이머들(ldhA-PmeI-2F 및 ldhA-PmeI-2R)은 다음과 같으며, PCR 증폭 반응은 실시예 1과 동일한 방법과 조건을 사용하였고, 다만 신장(extension) 시간을 10분으로 조절하였다.
정방향 프라이머 (ldhA-PmeI-2F) (서열번호 61)
5-AACTAGTTTAAACAAGAGCGAAGAATAGCAAAGAAT-3
역방향 프라이머 (ldhA-PmeI-2R) (서열번호 62)
5-CTCTTGTTTAAACTAGTTATGGCATAGGCTATTACG-3
증폭된 PCR 산물을 제한효소 PmeI(NEB)을 처리한 다음, 실시예 1의 sp-DlmesC2 유전자 단편을 T4 DNA ligase(NEB) 효소로 라이게이션(ligation)하여 pBS-Del ZM0256::sp-DlmesC2 벡터를 제작하였다.
실시예
4-2. D-
락테이트
디하이드로게나제
(
ZMO1237
) 유전자를 제거하고 D-
락테이트
디하이드로게나제
유전자(
DlmesC2
)를 도입한 벡터 제조
자이모모나스 모빌리스 ZM4(ATCC 31821)의 게놈 유전자 (AE008692)로부터 락테이트 디하이드로게나제(ZMO1237) 유전자 5' 말단쪽에 5' 말단에서부터 상위 상동 부위의 3,656 bp(서열번호 63)와 3' 말단쪽에 3' 말단에서부터 하위 상동 부위의 3,848 bp(서열번호 64)를 각각 정방향 프라이머(Dldh-F)와 역방향 프라이머(Dldh-R)쌍을 사용하여 실시예 1과 동일한 방법과 조건으로 PCR 증폭하였고, 다만 신장(extension) 시간을 10분으로 조절하였다.
정방향 프라이머 (Dldh-F)(서열번호 65)
5-TGTTTCAGGCGGCCGCTATTTTAAGTC-3
역방향 프라이머 (Dldh-R)(서열번호 66)
5-TCTTTATCGCGGCCGCATCAATCACAA-3
증폭된 PCR 산물은 제한 효소 NotI(NEB)으로 처리한 다음, 동일한 제한효소로 절단된 pBluescript II 벡터 (Stratagene)에 클로닝하였으며, pBS-ZMO1237 벡터를 제작하였다.
이후 역방향 PCR 방법을 응용하여 D-락테이트 디하이드로게나제 (ZMO1237) 유전자를 제외하고 pBluescript II 벡터를 포함하는 상위 상동 부위와 하위 상동 부위만을 선택적으로 PCR 증폭하였다. 역방향 PCR 반응에 사용된 프라이머들(Del-DldF 및 Del-DldR)은 다음과 같으며, PCR 증폭 반응은 실시예 1과 동일한 방법과 조건을 사용하였고, 다만 신장(extension) 시간을 10분으로 조절하였다.
정방향 프라이머 (Del-DldF)(서열번호 67)
5-TTTCTTTTGCAGTTAACTGTCAGCCTGAA-3
역방향 프라이머 (Del-DldR)(서열번호 68)
5-TGATCCTGTATGGTTAACAATTGTTGCC-3
증폭된 PCR 산물을 제한효소 PmeI(NEB)을 처리한 다음, 실시예 1의 sp-DlmesC2 유전자 단편을 T4 DNA ligase(NEB) 효소로 라이게이션(ligation)하여 pBS-Del ZM01237::sp-DlmesC2 벡터를 제작하였다.
실시예
4-3. 알코올
디하이드로게나제
I(
ZMO1236
) 유전자를 제거하고 D-
락테이트
디하이드로게나제
유전자(
DlmesC2
)를 도입한 벡터 제조
자이모모나스 모빌리스 ZM4(ATCC 31821)의 게놈 유전자 (AE008692)로부터 알코올 디하이드로게나제 I (ZMO1236) 유전자 5' 말단쪽에 5' 말단에서부터 상위 상동 부위의 3,844 bp(서열번호 69)와 3' 말단쪽에 3' 말단에서부터 하위 상동 부위의 3,861 bp(서열번호 70)를 각각 정방향 프라이머(Adh1-F)와 역방향 프라이머(Adh1-R) 쌍을 사용하여 실시예 1과 동일한 방법과 조건으로 PCR 증폭하였고, 다만 신장(extension) 시간을 10분으로 조절하였다.
정방향 프라이머 (Adh1-F)(서열번호 71)
5-ACTCAATGGAACTGCAGCATGATCTGA-3
역방향 프라이머 (Adh1-R)(서열번호 72)
5-ACCAAAGTAACATCTGCAGTGTTGATAATGG-3
증폭된 PCR 산물은 제한 효소 NotI(NEB)으로 처리한 다음, 동일한 제한효소로 절단된 pBluescript II 벡터 (Stratagene)에 클로닝하였으며, pBS-ZMO1236 벡터를 제작하였다.
이후 역방향 PCR 방법을 응용하여 알코올 디하이드로게나제 I (ZMO1236) 유전자를 제외하고 pBluescript II 벡터를 포함하는 상위 상동 부위와 하위 상동 부위만을 선택적으로 PCR 증폭하였고, 역방향 PCR 반응에 사용된 프라이머들(Del-Adh1F 및 Del-Adh1R)은 다음과 같으며, PCR 증폭 반응은 실시예 1과 동일한 방법과 조건을 사용하였고, 다만 신장(extension) 시간을 10분으로 조절하였다.
정방향 프라이머 (Del-Adh1F)(서열번호 73)
5-TTGCGAATATAGTTTAAACGATTGC-3
역방향 프라이머 (Del-Adh1R)(서열번호 74)
5-ACCAGAAAGGTTTAAACTTTGTCGTC-3
증폭된 PCR 산물을 제한효소 PmeI(NEB)을 처리한 다음, 실시예 1의 sp-DlmesC2 유전자 단편을 T4 DNA ligase(NEB) 효소로 라이게이션(ligation)하여 pBS-Del ZM01236::sp-DlmesC2 벡터를 제작하였다.
실시예
4-4. 알코올
디하이드로게나제
II
(
ZMO1596
) 유전자를 제거하고 D-
락테이트
디하이드로게나제
유전자(
DlmesC2
)를 도입한 벡터 제조
자이모모나스 모빌리스 ZM4(ATCC 31821)의 게놈 유전자 (AE008692)로부터 알코올 디하이드로게나제 II (ZMO1596) 유전자 5' 말단쪽에 5' 말단에서부터 상위 상동 부위의 3,986 bp (서열번호 75)와 3' 말단쪽에 3' 말단에서부터 하위 상동 부위의 3,868 bp(서열번호 76)를 각각 정방향 프라이머(Adh2-F)와 역방향 프라이머(Adh2-R) 쌍을 사용하여 실시예 1과 동일한 방법과 조건으로 PCR 증폭하였고, 다만 신장(extension) 시간을 10분으로 조절하였다.
정방향 프라이머 (Adh2-F)(서열번호 77)
5-CATAACCGACCTGCAGAATAGCCA-3
역방향 프라이머 (Adh2-R)(서열번호 78)
5-TGTACCCACTGCAGAAGAATGATG-3
증폭된 PCR 산물은 제한 효소 NotI(NEB)으로 처리한 다음, 동일한 제한효소로 절단된 pBluescript II 벡터 (Stratagene)에 클로닝하였으며, pBS-ZMO1596 벡터를 제작하였다.
이후 역방향 PCR 방법을 응용하여 알코올 디하이드로게나제 II (ZMO1596) 유전자를 제외하고 pBluescript II 벡터를 포함하는 상위 상동 부위와 하위 상동 부위만을 선택적으로 PCR 증폭하였다. 역방향 PCR 반응에 사용된 프라이머들(Del-Adh2F 및 Del-Adh2R)은 다음과 같으며, PCR 증폭 반응은 실시예 1과 동일한 방법과 조건을 사용하였고, extension 시간을 10분으로 조절하였다.
정방향 프라이머 (Del-Adh2F)(서열번호 79)
5-CCTACATACTAGTTTAAACCAACAAC-3
역방향 프라이머 (Del-Adh2R)(서열번호 80)
5-CTGTCTTGATGTTTAAACAAACAATGC-3
증폭된 PCR 산물을 제한효소 PmeI(NEB)을 처리한 다음, 실시예 1의 sp-DlmesC2 유전자 단편을 T4 DNA ligase(NEB) 효소로 라이게이션(ligation)하여 pBS-Del ZM01596::sp-DlmesC2 벡터를 제작하였다.
실시예
4-5. 대사 경로 관련 유전자가 D-
락테이트
디하이드로게나제
유전자로 치환된
ZM
균주 제조
상기 실시예 4-1 내지 실시예 4-4에 따라 제조된 벡터들을 자이모모나스 모빌리스 ZM4 균주(ATCC 31821)에 전기천공법 (electroporation)으로 형질전환하여 대사 경로 관련 유전자들이 제거되고 sp-DlmesC2 유전자가 삽입된 균주들을 다음과 같이 제작하였다.
상기 실시예 4-1에 따라 제조된 pBS-Del ZM0256::sp-DlmesC2 벡터를 자이모모나스 모빌리스 ZM4 균주에 형질전환하고, 항생제 스펙티노마이신이 포함된 RM 배지(글루코오스, 20g/l; 효모추출물(DIFCO), 10g/l; MgSO4, 1g/l; (NH4)2SO4, 1g/l; KH2PO4, 2g/l; agar, 15g/l; pH 5.0)에 선택적 생장을 보이는 형질전환체들을 선별하는 과정을 통해 락테이트 디하이드로게나제(ZMO0256) 유전자가 sp-DlmesC2 유전자로 치환된 Z. mobilis Δ ZMO0256 :: sp - DlmesC2 균주를 MG6111 균주로 명명하였다.
상기 실시예 4-2에 따라 제조된 pBS-Del ZM01237::sp-DlmesC2 벡터를 실시예 4-1에 의해 락테이트 디하이드로게나제(ZMO0256) 유전자가 제거된 자이모모나스 모빌리스 균주(Z. mobilis Δ ZMO0256 :: tet)에 형질전환하여, 락테이트 디하이드로게나제(ZMO0256) 유전자 및 D-락테이트 디하이드로게나제 (ZMO1237)가 모두 제거되고 DlmesC2 유전자가 도입된 Z. mobilis Δ ZMO0256 :: cm , Δ ZMO1237 :: sp - DlmesC2 균주(MG6112 균주)를, 상술한 바와 같이 항생제 스펙티노마이신이 포함된 RM 배지에 선택적 생장을 보이는 형질전환체들을 선별하는 과정을 통해 제조하였다.
상기 실시예 4-3에 따라 제조된 pBS-Del ZM01236::sp-DlmesC2 벡터를 자이모모나스 모빌리스 ZM4 균주에 형질전환하고, 상기 항생제 스펙티노마이신이 포함된 RM 배지에 선택적 생장을 보이는 형질전환체들을 선별하는 과정을 통해 알코올 디하이드로게나제 I (ZMO1236) 유전자가 sp-DlmesC2 유전자로 치환된 Z. mobilis ΔZMO1236::sp-DlmesC2 균주(MG6113 균주)를 제조하였다.
마지막으로, 상기 실시예 4-4에 따라 제조된 pBS-Del ZM01596::sp-DlmesC2 벡터를 자이모모나스 모빌리스 ZM4 균주에 형질전환하고, 상기 항생제 스펙티노마이신이 포함된 RM 배지에 선택적 생장을 보이는 형질전환체들을 선별하는 과정을 통해 알코올 디하이드로게나제 II (ZMO1596) 유전자가 sp-DlmesC2 유전자로 치환된 Z. mobilis Δ ZMO1596 :: sp - DlmesC2 균주(MG6114 균주)를 제조하였다.
실험예
1. D-
락테이트
디하이드로게나제
활성(
enzyme
activity
) 시험
상기 실시예 1 내지 3에서 제조된 D-락테이트 디하이드로게나제 도입 균주가, pyruvate를 기질로 이용하여 D-lactic acid를 생산하는 효소 반응을 촉진하는 D-락테이트 디하이드로게나제 효소 활성을 나타내는지를 확인하기 위해 효소 활성 측정 실험을 하였다.
대조군으로는 야생형 자이모모나스 모빌리스 균주 ZM4(ATCC 31821)를 사용하였으며, 상기 야생형 ZM4 균주와 D-락테이트 디하이드로게나제 유전자가 도입된 ZM 균주(MG6106, MG6115, MG6116, MG6117 및 MG6118) 각각을 RM 배지(글루코오스, 20g/l; 효모추출물(DIFCO), 10g/l; MgSO4, 1g/l; (NH4)2SO4, 1g/l; KH2PO4, 2g/l; pH 5.0) 에서 대수 생장기까지 인큐베이터(incubator)에서 정치 배양하여 생장시킨 다음 각 세포를 회수하였다(12,000rpm, 5min, 4℃). 회수된 각 세포들을 고주파파쇄(sonication) 방법으로 파쇄 한 다음, 원심분리(15,000rpm, 10min, 4℃)하여 상등액(supernatant)을 회수하여 효소 활성 측정에 사용하였다.
D-락테이트 디하이드로게나제 효소 활성은 2가지 종류의 킷트(Lactic acid assay kit)(Megazyme, Sigma)를 이용하여 제조사의 방법에 따라 측정하였으며, 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다.
상기 표 1에 나타난 바와 같이, 대조군인 상기 야생형 ZM4 균주의 효소 활성은 0.012 U/mg of protein에 불과한 반면, D-락테이트 디하이드로게나제 유전자가 도입된 ZM 균주(MG6106, MG6115, MG6116, MG6117 및 MG6118) 각각의 효소 활성은 모두 1U/mg of protein 이 넘었으며, 높게는 1.556U/mg of protein까지 나타나 D-락테이트 디하이드로게나제 유전자가 도입된 형질전환체의 효소 활성이 야생형 균주에 비해 월등히 뛰어남을 확인할 수 있었다.
실험예
2. 젖산(D-
lactic
acid
/D-
lactate
) 생산 능력 시험
실험예
2-1. 젖산(D-
lactic
acid
/D-
lactate
) 생산 능력 시험 방법
상기 실시예 1 내지 4에서 제조된 D-락테이트 디하이드로게나제 도입 균주들의 D-lactic acid/D-lactate 생산 능력을 시험하기 위해, 상기 균주들을 각각 pH를 5.0으로 조절한 RM 액체 배지(글루코오스, 20g/l; 효모추출물(DIFCO), 10g/l; MgSO4, 1g/l; (NH4)2SO4, 1g/l; KH2PO4, 2g/l) 에서 각각 30℃에서 20시간 동안 배양한 후, 상기 배양된 배양액으로부터 세포를 제거하고 얻은 배양 상등액을 하기와 같은 조건으로 HPLC (high performance liquid chromatography)를 사용하여 대사산물을 측정하였다. 대조군으로는 상기 실험예 1에서 사용된 야생형 자이모모나스 모빌리스 균주 ZM4(ATCC 31821)를 사용하였으며, 비교예로는 S. cerevisiae (Dequin and Barre, Biotechnology(New York). 1994. Feb;12(2):173-177) 및/또는 S.cerevisiae OC2 균주(Ishida et al., J. Biosci. Bioeng. 2006. Feb;101(2):172-177)를 사용하였다.
<HPLC 측정 조건>
HPLC 시스템 : Hitachi HPLC 시스템 (model D-7000)
컬럼 : Aminex HPX-87H (300mm × 7.8mm)
컬럼온도 : 60 ℃
유속 : 0.6 ml/min
이동상(용매) : 0.0025 N sulfuric acid
검출기 :
D-lactic acid/D-lactate 및 그 외 유기산 - UV 검출기(Hitachi D-4200)(215nm)
당 및 에탄올 - RI (refractive index) 검출기 (D-3300)
실험예
2-2. 다양한 D-
락테이트
디하이드로게나제
유전자가 도입된 균주들의 D-lactic
acid
/D-
lactate
생산 능력 시험
상기 실시예 1 및 실시예2에서 제조된 균주들(MG6106, MG6115, MG6116, 및 MG6117)의 D-lactic acid/D-lactate 생산 능력을 상기 실험예 2-1에 기재된 방법으로 비교해본 결과, 하기 표 2에 나타난 바와 같이 DlmesC2 유전자가 도입된 균주인 MG6106 뿐만 아니라, 이와 유전자 일치도가 95% 이상인 Leuconostoc cremoris ATCC 19254 균주로부터 분리된 D-락테이트 디하이드로게나제 효소를 코딩하는ldhD-ATCC19254 유전자(996 bp)(서열번호 3), Leuconostoc mesenteroides LMG 18811 균주로부터 분리된 D-락테이트 디하이드로게나제 효소를 코딩하는ldhD1-LMG18811 유전자(996 bp)(서열번호 5), 및 Leuconostoc mesenteroides NBRC 3426로부터 분리된 D-락테이트 디하이드로게나제 효소를 코딩하는 D-ldh-NBRC3426 유전자(996 bp)(서열번호 7)가 각각 도입된 균주 MG6115, MG6116, 및 MG6117 또한 매우 높은 수율 및 생산성으로 젖산을 생산할 수 있음을 알 수 있었다.
따라서, 상기 D-락테이트 디하이드로게나제 유전자로는 DlmesC2 외에도 이와 유전자 일치도가 95% 이상인 다양한 D-락테이트 디하이드로게나제 유전자를 사용할 수 있음을 확인할 수 있었다.
실험예
2-3. D-
락테이트
디하이드로게나제
유전자의 도입 위치 및 대사 경로 조절에 따른 D-
lactic
acid
/D-
lactate
생산 능력에 대한 영향 시험
상기 실시예 3 및 실시예 4에서 제조된 균주들의 D-lactic acid/D-lactate 생산 능력을 상기 실험예 2-1에 기재된 방법으로 비교해본 결과, 하기 표 3에 나타난 바와 같이, DlmesC2 유전자가 도입되는 특정 유전체 위치에 해당하는 유전자 또는 부위와 무관하게 젖산을 낮게는 약 95.0%, 높게는 99.9% 이상의 현저히 높은 수율과 효율로 생산함을 알 수 있었다. 또한 하기 표 4에 나타난 바와 같이, D-락테이트 디하이드로게나제 유전자 DlmesC2가 도입된 각 균주의 젖산 생산은 다른 대사 경로 흐름에 의존하거나 또는 촉진되지도 않음을 알 수 있었다.
이와 같이 D-락테이트 디하이드로게나제 유전자가 도입된 균주의 젖산 생산은 상기 유전자가 도입되는 유전체의 위치(gene or region) 또는 대사경로 흐름에 의존하거나 또는 촉진되지 않으며, 따라서 D-락테이트 디하이드로게나제 유전자의 도입 위치 또는 대사 경로 조절과 무관하게 D-락테이트 디하이드로게나제 유전자의 존재 자체에 독립 의존적으로 이루어짐을 확인할 수 있었다. 반면, S. cerevisiae의 경우, 대사 경로와 무관하거나 핵심 산물 대사(예. 에탄올 생산 경로들) 경로가 제거되지 않은 상태의 독립적인 D-lactate dehydrognase는 D-lactic acid/lactate 생산에 효율적이지 못하여 대사경로 조절에 의존적임을 확인 할 수 있었다.
따라서, 대사 경로 조절과 무관하게 독립적으로 D-lactic acid/lactate를 효율적으로 생산 할 수 있는 D-락테이트 디하이드로게나제 유전자가 도입된 균주의 젖산 생산 능력이 월등히 뛰어남을 확인할 수 있었다.
실험예
2-4.
pH
조건에 따른 젖산(D-
lactic
acid
/D-
lactate
) 생산 비교
상기 실시예 1에서 제조된 MG6106 균주의 pH 조건에 따른 젖산 생산 능력을 시험하기 위해, 상기 실험예 2-1에 기재된 방법과 동일한 방법으로 D-lactic acid/D-lactate 생산 능력을 측정하되, pH 비조절에 따른 D-lactic acid/D-lactate 생산 능력은 염기 첨가에 의한 pH 조절 없이 최종 발효 pH를 3.0으로 한 RM 액체 배지에서 상기 균주를 30℃에서 20시간 동안 배양한 후, 상기 배양된 배양액으로부터 세포를 제거하고 얻은 배양 상등액을 사용하여 측정하였다. 그 결과를 하기 표 5에 나타내었다.
상기 표 5에 나타난 바와 같이, D-락테이트 디하이드로게나제 유전자가 도입된 균주의 경우 pH 5.0의 조건은 물론이고 pH 비조절(산성 조건) 발효 조건 하에서도 젖산(D-lactic acid/D-lactate) 생산율이 각각 99.9% 이상 및 99.7%로 매우 높게 나타냈으며, 나아가 pH 5.0 조건 및 pH 비조절의 모든 발효 조건에서 D-lactic acid 생산 효율이 우수한 것으로 보고된 S. cerevisiae OC2와 비교해본 결과, S. cerevisiae OC2의 경우 동일한 조건에서 D-lactic acid/lactate 생산 수율이 각각 61% 및 53%에 불과한 것으로 나타나, 상기 D-락테이트 디하이드로게나제 유전자가 도입된 균주는 pH 조건의 제한 없이 어떠한 pH 조건에서도 현저히 뛰어난 D-lactic acid/lactate 생산 수율을 가짐을 확인할 수 있었다.
실험예
3.
pH
조건에 따른 D-
lactic
acid
/D-
lactate
의 광학순도(
optical
purity) 비교
상기 실시예 1에서 제조된 MG6106 균주의 pH 조건에 따른 D-lactic acid/D-lactate 의 광학 순도를 비교분석하기 위해, 상기 균주를 염기(base) 첨가를 통해 pH를 5.0으로 조절한 RM 액체 배지(글루코오스, 20g/l; 효모추출물(DIFCO), 10g/l; MgSO4, 1g/l; (NH4)2SO4, 1g/l; KH2PO4, 2g/l)와, 염기 첨가에 의한 pH 조절 없이 최종 발효 pH를 3.0 으로 한 RM 액체 배지에서 30℃에서 20시간 동안 배양한 후, 상기 배양된 배양액으로부터 세포를 제거하고 얻은 배양 상등액을 하기와 같은 조건으로 HPLC (high performance liquid chromatography)를 수행하여 D-lactic acid/D-lactate의 광학 순도(optical purity, %) 또는 광학초과수치(enantiomeric excess, ee value, %)를 분석하여 그 결과를 하기 표 6에 나타내었다. 상기 실험예 2와 마찬가지로 대조군으로는 야생형 자이모모나스 모빌리스 균주 ZM4(ATCC 31821)를 사용하였으며, 비교예로는 S. cerevisiae OC2 균주(Ishida et al., J. Biosci. Bioeng. 2006. Feb;101(2):172-177)를 사용하였다.
<HPLC 측정 조건>
HPLC 시스템 : Hitachi HPLC 시스템 (model D-7000)
컬럼 : Chirex 3126 컬럼 (Phenomenex)(250mm × 4.6mm)
컬럼온도 : 25 ℃
유속 : 1.5 ml/min
이동상(용매) : 1mM copper sulfate (CuSO4) 용액
검출기 : UV 검출기(Hitachi D-4200)(254nm)
구체적으로 표준 시약 D(-)-lactic acid (L0625, Sigma), L(+)-lactic acid (L1750, Sigma), 그리고 DL-lactic acid (L1250, Sigma)을 사용하여 D-lactic acid와 L-lactic acid의 광학 이성질체를 구분, 분리하였으며, 광학순도(%)와 광학초과수치(%)는 각각 아래의 수학식 1 및 2를 사용하여 계산하였다.
[수학식 1]
D-lactic acid의 광학순도(%)= D/D+L *100
[수학식 2]
ee value (%)= D+L/D-L * 100
상기 표 6에 나타난 바와 같이, 대조군인 상기 야생형 ZM4 균주에 의해 생산된 젖산의 광학 순도는 약 33.3%로 낮게 나타난 반면, D-락테이트 디하이드로게나제 유전자가 도입된 균주에 의해 생산된 젖산의 광학 순도는 S. cerevisiae OC2와 동등한 정도인 99.9%의 매우 높은 광학 순도를 나타냄을 확인할 수 있었다. 다만 상기 S. cerevisiae OC2의 경우, 상기 실험예 2-3에서 살펴본 바와 같이 대사경로 조절에 의존적인 젖산 생산 효율을 나타내는 반면, D-락테이트 디하이드로게나제가 도입된 형질전환 균주의 경우, 대사 경로 조절 없이도 pH 조건의 제한 없이 매우 높은 수율과 또한 매우 높은 광학 순도로 젖산을 생산할 수 있어 대조군인 상기 야생형 ZM4 균주는 물론이고, 상기 S. cerevisiae OC2에 비하여도 현저히 우수함을 확인할 수 있었다.
<110> MACROGEN INC.
<120> TRANSFORMANT FOR PRODUCTION OF LACTATE/LACTIC ACID WITH HIGH
OPTICAL PURITY, AND PREPARING METHOD OF LACTATE/LACTIC ACID USING
THEREOF
<130> DPP20110294KR
<160> 80
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 996
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Nucleotide sequence of D-lactate dehydrogenase gene (DlmesC2) of
Leuconostoc mesenteroides
<400> 1
atgaagattt ttgcttacgg cattcgtgat gatgaaaagc catcacttga agaatggaaa 60
gcggctaacc cagagattga agtggactac acacaagaat tattgacacc tgaaacagct 120
aagttggctg agggatcaga ttcagctgtt gtttatcaac aattggacta tacacgtgaa 180
acattgacag ctttagctaa cgttggtgtt actaacttgt cattgcgtaa cgttggtaca 240
gataacattg attttgatgc agcacgtgaa tttaacttta acatttcaaa tgttcctgtt 300
tattcaccaa atgctattgc agaacactca atgattcaat tatctcgttt gctacgtcgc 360
acgaaagcat tggatgccaa aattgctaag cacgacttgc gttgggcacc aacaattgga 420
cgtgaaatgc gtatgcaaac agttggtgtt attggtacag gtcatattgg ccgtgttgct 480
attaacattt tgaaaggctt tggggccaag gttattgctt atgacaagta cccaaatgct 540
gaattacaag cagaaggttt gtacgttgac acattagacg aattatatgc acaagctgat 600
gcaatttcat tgtatgttcc tggtgtacct gaaaaccatc atctaatcaa tgcagatgct 660
attgctaaga tgaaggatgg tgtggttatc atgaacgctg cgcgtggtaa tttgatggac 720
attgacgcta ttattgatgg tttgaattct ggtaagattt cagacttcgg tatggacgtt 780
tatgaaaatg aagttggctt gttcaatgaa gattggtctg gtaaagaatt cccagatgct 840
aagattgctg acttgattgc acgtgaaaat gtattggtta cgccacacac ggctttctat 900
acaactaaag ctgttctaga aatggttcac caatcatttg atgcagcagt tgctttcgcc 960
aagggtgaga agccagctat tgctgttgaa tattaa 996
<210> 2
<211> 331
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid sequence of D-lactate dehydrogenase gene (DlmesC2) of
Leuconostoc mesenteroides
<400> 2
Met Lys Ile Phe Ala Tyr Gly Ile Arg Asp Asp Glu Lys Pro Ser Leu
1 5 10 15
Glu Glu Trp Lys Ala Ala Asn Pro Glu Ile Glu Val Asp Tyr Thr Gln
20 25 30
Glu Leu Leu Thr Pro Glu Thr Ala Lys Leu Ala Glu Gly Ser Asp Ser
35 40 45
Ala Val Val Tyr Gln Gln Leu Asp Tyr Thr Arg Glu Thr Leu Thr Ala
50 55 60
Leu Ala Asn Val Gly Val Thr Asn Leu Ser Leu Arg Asn Val Gly Thr
65 70 75 80
Asp Asn Ile Asp Phe Asp Ala Ala Arg Glu Phe Asn Phe Asn Ile Ser
85 90 95
Asn Val Pro Val Tyr Ser Pro Asn Ala Ile Ala Glu His Ser Met Ile
100 105 110
Gln Leu Ser Arg Leu Leu Arg Arg Thr Lys Ala Leu Asp Ala Lys Ile
115 120 125
Ala Lys His Asp Leu Arg Trp Ala Pro Thr Ile Gly Arg Glu Met Arg
130 135 140
Met Gln Thr Val Gly Val Ile Gly Thr Gly His Ile Gly Arg Val Ala
145 150 155 160
Ile Asn Ile Leu Lys Gly Phe Gly Ala Lys Val Ile Ala Tyr Asp Lys
165 170 175
Tyr Pro Asn Ala Glu Leu Gln Ala Glu Gly Leu Tyr Val Asp Thr Leu
180 185 190
Asp Glu Leu Tyr Ala Gln Ala Asp Ala Ile Ser Leu Tyr Val Pro Gly
195 200 205
Val Pro Glu Asn His His Leu Ile Asn Ala Asp Ala Ile Ala Lys Met
210 215 220
Lys Asp Gly Val Val Ile Met Asn Ala Ala Arg Gly Asn Leu Met Asp
225 230 235 240
Ile Asp Ala Ile Ile Asp Gly Leu Asn Ser Gly Lys Ile Ser Asp Phe
245 250 255
Gly Met Asp Val Tyr Glu Asn Glu Val Gly Leu Phe Asn Glu Asp Trp
260 265 270
Ser Gly Lys Glu Phe Pro Asp Ala Lys Ile Ala Asp Leu Ile Ala Arg
275 280 285
Glu Asn Val Leu Val Thr Pro His Thr Ala Phe Tyr Thr Thr Lys Ala
290 295 300
Val Leu Glu Met Val His Gln Ser Phe Asp Ala Ala Val Ala Phe Ala
305 310 315 320
Lys Gly Glu Lys Pro Ala Ile Ala Val Glu Tyr
325 330
<210> 3
<211> 996
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Nucleotide sequence of D-lactate dehydrogenase gene
(ldhD-ATCC19254) of Leuconostoc cremoris ATCC19254
<400> 3
atgaagattt ttgcttacgg cattcgtgat gatgaaaagc catcacttga agaatggaaa 60
gcggctaacc cagaggttga agtggactac acacaagaat tattgacacc tgaaacagct 120
aagttggctg agggatcaga ttcagctgtt gtttatcaac aattggacta tacacgtgaa 180
acattgacag ctttagctaa cgttggtgtt actaacttgt cattgcgtaa cgttggtaca 240
gataacattg attttgatgc agcacgtgaa tttaacttta acatttcaaa tgttcctgtt 300
tattcaccaa atgctattgc agaacactca atgattcaat tatctcgttt gctacgtcgc 360
acgaaagcat tggatgccaa aattgctaag cacgacttgc gttgggcacc aacaattgga 420
cgtgaaatgc gtatgcaaac agttggtgtt attggtacag gtcatattgg ccgtgttgct 480
attaacattt tgaaaggctt tggggccaag gttattgctt atgacaagta cccaaatgct 540
gaattacaag cagaaggttt gtacgttgac acattagacg aattatatgc acaagctgat 600
gcaatttcat tgtatgttcc tggtgtacct gaaaaccatc atctaatcaa tgcagatgct 660
attgctaaga tgaaggatgg tgtggttatc atgaacgctg cgcgtggtaa tttgatggac 720
attgacgcta ttattgatgg tttgaattct ggtaagattt cagacttcgg tatggacgtt 780
tatgaaaatg aagttggctt gttcaatgaa gattggtctg gtaaagaatt cccagatgct 840
aagattgctg acttgattgc acgcgaaaat gtattggtta cgccacacac ggctttctat 900
acaactaaag ctgttctaga aatggttcac caatcatttg atgcagcagt tgctttcgcc 960
aagggtgaga agccagctat tgctgttgaa tattaa 996
<210> 4
<211> 331
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid sequence of D-lactate dehydrogenase gene
(ldhD-ATCC19254) of Leuconostoc cremoris ATCC19254
<400> 4
Met Lys Ile Phe Ala Tyr Gly Ile Arg Asp Asp Glu Lys Pro Ser Leu
1 5 10 15
Glu Glu Trp Lys Ala Ala Asn Pro Glu Val Glu Val Asp Tyr Thr Gln
20 25 30
Glu Leu Leu Thr Pro Glu Thr Ala Lys Leu Ala Glu Gly Ser Asp Ser
35 40 45
Ala Val Val Tyr Gln Gln Leu Asp Tyr Thr Arg Glu Thr Leu Thr Ala
50 55 60
Leu Ala Asn Val Gly Val Thr Asn Leu Ser Leu Arg Asn Val Gly Thr
65 70 75 80
Asp Asn Ile Asp Phe Asp Ala Ala Arg Glu Phe Asn Phe Asn Ile Ser
85 90 95
Asn Val Pro Val Tyr Ser Pro Asn Ala Ile Ala Glu His Ser Met Ile
100 105 110
Gln Leu Ser Arg Leu Leu Arg Arg Thr Lys Ala Leu Asp Ala Lys Ile
115 120 125
Ala Lys His Asp Leu Arg Trp Ala Pro Thr Ile Gly Arg Glu Met Arg
130 135 140
Met Gln Thr Val Gly Val Ile Gly Thr Gly His Ile Gly Arg Val Ala
145 150 155 160
Ile Asn Ile Leu Lys Gly Phe Gly Ala Lys Val Ile Ala Tyr Asp Lys
165 170 175
Tyr Pro Asn Ala Glu Leu Gln Ala Glu Gly Leu Tyr Val Asp Thr Leu
180 185 190
Asp Glu Leu Tyr Ala Gln Ala Asp Ala Ile Ser Leu Tyr Val Pro Gly
195 200 205
Val Pro Glu Asn His His Leu Ile Asn Ala Asp Ala Ile Ala Lys Met
210 215 220
Lys Asp Gly Val Val Ile Met Asn Ala Ala Arg Gly Asn Leu Met Asp
225 230 235 240
Ile Asp Ala Ile Ile Asp Gly Leu Asn Ser Gly Lys Ile Ser Asp Phe
245 250 255
Gly Met Asp Val Tyr Glu Asn Glu Val Gly Leu Phe Asn Glu Asp Trp
260 265 270
Ser Gly Lys Glu Phe Pro Asp Ala Lys Ile Ala Asp Leu Ile Ala Arg
275 280 285
Glu Asn Val Leu Val Thr Pro His Thr Ala Phe Tyr Thr Thr Lys Ala
290 295 300
Val Leu Glu Met Val His Gln Ser Phe Asp Ala Ala Val Ala Phe Ala
305 310 315 320
Lys Gly Glu Lys Pro Ala Ile Ala Val Glu Tyr
325 330
<210> 5
<211> 996
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Nucleotide sequence of D-lactate dehydrogenase gene
(ldhD1-LMG18811) of Leuconostoc mesenteroides LMG18811
<400> 5
atgaaaattt ttgcttacgg catacgtgac gacgaaaagc catcacttga agattggaag 60
tcagctcatc caaatattga ggttggctat acacaagaat tgttaacagc tgaaacagca 120
acgttggcta agggttcagt ttcagctgtg gtctatcaac aacttgatta tacacgtgaa 180
gctttgacag ctttggctga ggtgggcgtt actaacttgt cattaagaaa tgttggtact 240
gataatattg atttcgaagc agcaaaagaa tttaatttta acatctcaaa cgttccagta 300
tattcaccaa atgctattgc ggaacactca atgattcaat tatcacgctt attacgtcgt 360
acaaaagcac ttgatgcaaa gattgctaag cacgatctac gttgggcacc cacaattggt 420
cgcgaaatgc gcatgcaaac agttggtgtt attggcactg gtaacattgg tcgtgttgca 480
attaaaattt tacaaggctt tggcgcaaaa gtagttgcct acgacaaatt tccaaatgct 540
gaaattgcgg aacagggttt gtatgttgac tcattagatg aactatatgc acaagctgat 600
gcggtttcac tatacgtacc aggtgtacct gaaaatcacc acatgattga tgcagcagcc 660
atttcaaaga tgaaagatgg tgttgttatt atgaacgcat cacgtggtaa cctaatggat 720
atcgatgcta ttatcgatgg cttaaattct ggtaaaattt ctgattttgg tatggatgtt 780
tatgaagaag aagttggttt gttcaatgag gattggtcag gtaaagattt tcctgatgcc 840
aaaatcgctg atttgatttc acgtgagaat gttttggtta caccccacac ggctttttat 900
acaacgaaag ctgttcttga gatggttcat caatcaatgg atgctgctgt tgcttttgct 960
aacggtgaaa cacctgcaat cgctgttaaa tactga 996
<210> 6
<211> 331
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid sequence of D-lactate dehydrogenase gene
(ldhD1-LMG18811) of Leuconostoc mesenteroides LMG18811
<400> 6
Met Lys Ile Phe Ala Tyr Gly Ile Arg Asp Asp Glu Lys Pro Ser Leu
1 5 10 15
Glu Asp Trp Lys Ser Ala His Pro Asn Ile Glu Val Gly Tyr Thr Gln
20 25 30
Glu Leu Leu Thr Ala Glu Thr Ala Thr Leu Ala Lys Gly Ser Val Ser
35 40 45
Ala Val Val Tyr Gln Gln Leu Asp Tyr Thr Arg Glu Ala Leu Thr Ala
50 55 60
Leu Ala Glu Val Gly Val Thr Asn Leu Ser Leu Arg Asn Val Gly Thr
65 70 75 80
Asp Asn Ile Asp Phe Glu Ala Ala Lys Glu Phe Asn Phe Asn Ile Ser
85 90 95
Asn Val Pro Val Tyr Ser Pro Asn Ala Ile Ala Glu His Ser Met Ile
100 105 110
Gln Leu Ser Arg Leu Leu Arg Arg Thr Lys Ala Leu Asp Ala Lys Ile
115 120 125
Ala Lys His Asp Leu Arg Trp Ala Pro Thr Ile Gly Arg Glu Met Arg
130 135 140
Met Gln Thr Val Gly Val Ile Gly Thr Gly Asn Ile Gly Arg Val Ala
145 150 155 160
Ile Lys Ile Leu Gln Gly Phe Gly Ala Lys Val Val Ala Tyr Asp Lys
165 170 175
Phe Pro Asn Ala Glu Ile Ala Glu Gln Gly Leu Tyr Val Asp Ser Leu
180 185 190
Asp Glu Leu Tyr Ala Gln Ala Asp Ala Val Ser Leu Tyr Val Pro Gly
195 200 205
Val Pro Glu Asn His His Met Ile Asp Ala Ala Ala Ile Ser Lys Met
210 215 220
Lys Asp Gly Val Val Ile Met Asn Ala Ser Arg Gly Asn Leu Met Asp
225 230 235 240
Ile Asp Ala Ile Ile Asp Gly Leu Asn Ser Gly Lys Ile Ser Asp Phe
245 250 255
Gly Met Asp Val Tyr Glu Glu Glu Val Gly Leu Phe Asn Glu Asp Trp
260 265 270
Ser Gly Lys Asp Phe Pro Asp Ala Lys Ile Ala Asp Leu Ile Ser Arg
275 280 285
Glu Asn Val Leu Val Thr Pro His Thr Ala Phe Tyr Thr Thr Lys Ala
290 295 300
Val Leu Glu Met Val His Gln Ser Met Asp Ala Ala Val Ala Phe Ala
305 310 315 320
Asn Gly Glu Thr Pro Ala Ile Ala Val Lys Tyr
325 330
<210> 7
<211> 996
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Nucleotide sequence of D-lactate dehydrogenase gene
(D-ldh-NBRC3426) of Leuconostoc mesenteroides NBRC3426
<400> 7
atgaagattt ttgcttacgg cattcgtgat gatgaaaagc catcacttga agaatggaaa 60
gcggctaacc cagagattga agtggactac acacaagagc tattgacacc tgaaacagtt 120
aagttggctg agggatcaga ttcagctgtt gtttaccaac aactggacta tacacgtgaa 180
acattgacag ctttagctaa cgttggtgtt actaacttgt cattgcgtaa cgttggtaca 240
gataacattg attttgatgc agcacgtgaa tttaacttta acatttcaaa tgttcctgtt 300
tattcaccaa atgctattgc agaacactca atgattcaat tatctcgttt gctacgtcgc 360
acgaaagcat tggatgccaa aattgctaag cacgacttgc gctgggcacc aacaattgga 420
cgtgaaatgc gtatgcaaac agttggtgtt attggtacag gccatattgg ccgtgttgct 480
attaacattt tgaaaggctt tggggcaaag gttattgctt atgataagta cccaaatgct 540
gaattgcaag cagaaggttt gtacgttgac acattagacg aattatatgc acaagctgat 600
gcaatttcat tgtatgttcc tggtgtgcct gaaaaccatc atctaatcaa tgcagaggct 660
attgctaaga tgaaggatgg cgtggttatc atgaatgctg cgcgtggtaa tttgatggac 720
attgatgcta ttattgatgg tttgaattct ggtaagattt cagacttcgg tatggacgtt 780
tatgaaaatg aagttggctt gttcaatgaa gattggtctg gtaaagaatt cccagatgct 840
aagattgctg acttgatttc acgcgaaaat gtattggtta cgccacatac ggctttctat 900
acaactaaag ctgttctaga aatggttcac caatcatttg atgcagcagt tgctttcgcc 960
aaaggtgaga agccagctat tgctgttgaa tattaa 996
<210> 8
<211> 331
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid sequence of D-lactate dehydrogenase gene
(D-ldh-NBRC3426) of Leuconostoc mesenteroides NBRC3426
<400> 8
Met Lys Ile Phe Ala Tyr Gly Ile Arg Asp Asp Glu Lys Pro Ser Leu
1 5 10 15
Glu Glu Trp Lys Ala Ala Asn Pro Glu Ile Glu Val Asp Tyr Thr Gln
20 25 30
Glu Leu Leu Thr Pro Glu Thr Val Lys Leu Ala Glu Gly Ser Asp Ser
35 40 45
Ala Val Val Tyr Gln Gln Leu Asp Tyr Thr Arg Glu Thr Leu Thr Ala
50 55 60
Leu Ala Asn Val Gly Val Thr Asn Leu Ser Leu Arg Asn Val Gly Thr
65 70 75 80
Asp Asn Ile Asp Phe Asp Ala Ala Arg Glu Phe Asn Phe Asn Ile Ser
85 90 95
Asn Val Pro Val Tyr Ser Pro Asn Ala Ile Ala Glu His Ser Met Ile
100 105 110
Gln Leu Ser Arg Leu Leu Arg Arg Thr Lys Ala Leu Asp Ala Lys Ile
115 120 125
Ala Lys His Asp Leu Arg Trp Ala Pro Thr Ile Gly Arg Glu Met Arg
130 135 140
Met Gln Thr Val Gly Val Ile Gly Thr Gly His Ile Gly Arg Val Ala
145 150 155 160
Ile Asn Ile Leu Lys Gly Phe Gly Ala Lys Val Ile Ala Tyr Asp Lys
165 170 175
Tyr Pro Asn Ala Glu Leu Gln Ala Glu Gly Leu Tyr Val Asp Thr Leu
180 185 190
Asp Glu Leu Tyr Ala Gln Ala Asp Ala Ile Ser Leu Tyr Val Pro Gly
195 200 205
Val Pro Glu Asn His His Leu Ile Asn Ala Glu Ala Ile Ala Lys Met
210 215 220
Lys Asp Gly Val Val Ile Met Asn Ala Ala Arg Gly Asn Leu Met Asp
225 230 235 240
Ile Asp Ala Ile Ile Asp Gly Leu Asn Ser Gly Lys Ile Ser Asp Phe
245 250 255
Gly Met Asp Val Tyr Glu Asn Glu Val Gly Leu Phe Asn Glu Asp Trp
260 265 270
Ser Gly Lys Glu Phe Pro Asp Ala Lys Ile Ala Asp Leu Ile Ser Arg
275 280 285
Glu Asn Val Leu Val Thr Pro His Thr Ala Phe Tyr Thr Thr Lys Ala
290 295 300
Val Leu Glu Met Val His Gln Ser Phe Asp Ala Ala Val Ala Phe Ala
305 310 315 320
Lys Gly Glu Lys Pro Ala Ile Ala Val Glu Tyr
325 330
<210> 9
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DLmesC2F
<400> 9
tggaggatcc catggtaaag atttttgc 28
<210> 10
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DLmesC2R
<400> 10
tgtttgatta ttcctgcaga aacccctc 28
<210> 11
<211> 370
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> promoter region of adhB, ZMO1596
<400> 11
ttcataattt gcataagtct tgatgtaaaa aatacatatt tagaaagaac aagcagcctt 60
gctcatcacc gctgtcgcga gtagaaaaat ctcggctttc agaaaataga ggtcgcttcg 120
ttaaacagac tataaatgtg ctggaataaa gcgaacccct tgatctgata aaactgatag 180
acatattgct tttgcgctgc ccgattgctg aaaatgcgta aaattggtga ttttactcgt 240
tttcaggaaa aactttgaga aaacgtctcg aaaacgggat taaaacgcaa aaacaataga 300
aagcgatttc tcgaaaatgg ttgttttcgg gttgttgctt taaactagta tgtagggtga 360
ggttatagct 370
<210> 12
<211> 1142
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> spectinomycin resistant gene
<400> 12
gaaccctttg gcaaaatcct gtatatcgtg cgaaaaagga tggatatacc gaaaaaatcg 60
ctataatgac cccgaagcag ggttatgcag cggaaaatgc agctcacggt aactgatgcc 120
gtatttgcag taccagcgta cggcccacag aatgatgtca cgctgaaaat gccggccttt 180
gaatgggttc atgtgcagct ccatcagcaa aaggggatga taagtttatc accaccgact 240
atttgcaaca gtgccgttga tcgtgctatg atcgactgat gtcatcagcg gtggagtgca 300
atgtcatgag ggaagcggtg atcgccgaag tatcgactca actatcagag gtagttggcg 360
tcatcgagcg ccatctcgaa ccgacgttgc tggccgtaca tttgtacggc tccgcagtgg 420
atggcggcct gaagccacac agtgatattg atttgctggt tacggtgacc gtaaggcttg 480
atgaaacaac gcggcgagct ttgatcaacg accttttgga aacttcggct tcccctggag 540
agagcgagat tctccgcgct gtagaagtca ccattgttgt gcacgacgac atcattccgt 600
ggcgttatcc agctaagcgc gaactgcaat ttggagaatg gcagcgcaat gacattcttg 660
caggtatctt cgagccagcc acgatcgaca ttgatctggc tatcttgctg acaaaagcaa 720
gagaacatag cgttgccttg gtaggtccag cggcggagga actctttgat ccggttcctg 780
aacaggatct atttgaggcg ctaaatgaaa ccttaacgct atggaactcg ccgcccgact 840
gggctggcga tgagcgaaat gtagtgctta cgttgtcccg catttggtac agcgcagtaa 900
ccggcaaaat cgcgccgaag gatgtcgctg ccgactgggc aatggagcgc ctgccggccc 960
agtatcagcc cgtcatactt gaagctagac aggcttatct tggacaagaa gaagatcgct 1020
tggcctcgcg cgcagatcag ttggaagaat ttgtccacta cgtgaaaggc gagatcacca 1080
aggtagtcgg caaatagatg ccgctcgcca gtcgattggc tgagctcatg aagttcctat 1140
tc 1142
<210> 13
<211> 1401
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Nucleotide sequence of ORF ZMO0263
<400> 13
atgcctaaaa aataccaatt tcttctctac ccccttcttc taaacagcgt ccttctgtca 60
gaattaaaag ctgacaagcc tctcgtttct ccaaaattga tcgaacttct caagcaacaa 120
acacctgaag cgttaaaaaa cggtattgaa attcgaccag gtggagatga gatgcaaaag 180
ggactgttag agggaaatga cctactcatc gacaaagccg ccagtgaact agaaggcaat 240
aaccccatca gaatattcgc tgatatagat aaattacgcg tcaaaggcga ttaccagaat 300
gccaataaat tgctggatat atgcggtaaa actttttttc aaaaacccga tgatcctaat 360
ccattgcccc ctgtcagtgg cgtaggtatg acatgccaac aaattttagc gggtaattac 420
ttcttagatg gtaatctcaa agattggggt aaaattcttc attttgttag aaatgtctat 480
tatcccccca tccgaaaaat ttcaggatta gagcagttct cgcttacaga tattgaaatg 540
gggaggttgt ccgtttctcc ggattctata cccccattca ccattacagg catagatcac 600
cagcaaagca ttccactaca atacaatgta cagataaagg aagatcatcg gcgttttgct 660
gaaaatgttc cttccgcaat ggtttcgttg aacgggaaag aggtgccttt cttcttagaa 720
accggtgccg ctattggcaa actacctaaa gcatggagtc attcccctca tgtccatatt 780
atcggacatc tcgatagatc aaccaatgct gcatctgaat tttttagtgg cgatctcggc 840
atcgttgatg agctcaaaat tggaaaagcc gttttaaaga acgttccctt cctttttacc 900
gatgtcagcc aatcctatct gggactcatg attttacaaa aattaggtaa aatcaaaata 960
gataaacagc agatgacctt tggcaaggat atcaattgta attgtcagca agatatccat 1020
cttggcagcg cattaggggg cgatttccaa accctcaaat atccgattac gtggcaaggt 1080
aaaaccagtc tagtcgcaat tgaccttact gaggataaca gcgactttac gctatggaca 1140
tttaaaccag atttcacaaa agaagaacaa gaaaccacat tccagttccc cacaaaagaa 1200
aataacaaaa ctgttctaag tcaaggacgc gttgtaaaat ctgatttatc cattgatggg 1260
atcaactatg gagcaagaaa agagcttatt ataaaagata ctatccgaaa tccagctacc 1320
gttatgggct tgtttatcct caacaaagtc actctttatc tcgacttcat caatcacaaa 1380
gcctgcctta aatcgataca g 1401
<210> 14
<211> 1452
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Nucleotide sequence of ORF ZMO0264
<400> 14
ttgttttatc ggaagcctat catgcctaaa aaataccgat ttcttctcta tccccttctt 60
ctaaacagcg tcctcctgcc gccattgaaa gctgacaagc ctctcatttc tgaaaaatta 120
atcgaatttc taaggagtac aacagcagaa gaacaacaaa agggtgtaga gctcaaccct 180
gggaataaaa ggcttgtaga tgcccttttc gaaggagaca gtctccttat tgaaaagatt 240
gctaatgagc cagaaacaac aaatatcgtc aaaaaattta caaaaattga agcgttgctc 300
gtcaaaggca attatgaaga ggtcaatcga caattagcaa tatgtaaaaa aaccttcttc 360
caagacccaa acacgcctac tctacttcct ccgattaata atgtggtgat gacctgcgac 420
cagatttctg ctggtaatta ttttttggaa ggtaatcttc ccgcttgggg tgaaaaactc 480
aacaacatca acaatactta ttatcctgtc atccgaaaat tcaagggact agaaaatttt 540
tccctttcag caacaaaaat gggaagtcta actgtatttc cctctttaat acccgctttt 600
acggttaccg gaatagatca taaacaatca ttaccgataa aatatcaaga tataaataag 660
aacaaaacct ggaagattcc ttatattaac gcctctttaa atggcaaaaa gacgattctt 720
cttctggata cggaatccgc gattagtaaa ttacccatag atttaaaaga ttcgccccat 780
gtccatattg ttggacatat caactatgcg gataatggga ctgctgaaat ttttagtggc 840
gatctcggta ttgttgatga actcaaaatc ggaacagccg ttttaaaaaa cgttcccttt 900
ctctttacta ctacaaaaaa agcctatttg gggctgatgg ttcttcaaaa actgggtaaa 960
atcaaaataa ataaacagca gatgaccttt ggcaaaaata tcaactgtaa ctgtcaacag 1020
gacattcatc ttggaagtac atttgaagga gattaccaag cactcaaata tcccattaca 1080
tggcaaggta gaaccgatct agttgccata gatctttctg aagaaaacat cgattttaat 1140
ttactacagt tcaaatctga atttacgcca gaagaacaaa tattatttga aaaacaaaag 1200
aaaattattg atgaattcac cgacattact aaagataaaa taactgatcc agcctatatc 1260
gtggaatcag atttatctat tgatgggatc aattatagaa aaagacaaaa attagtcctc 1320
aaagatacta gacggcgtcc tacgatgact atcggagcat ccatcctcga aaaagctgac 1380
ctctatctcg actttatcaa ccacaaagcc tgtctcatgc cgaacaactc ggacacacag 1440
cctatgccac ag 1452
<210> 15
<211> 1428
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Nucleotide sequence of ORF ZMO0265
<400> 15
atgcctaaga aataccgatt tcttctttac tcctttcttc taaacagtgc tctcctgcca 60
gaattaaagg ctgaagagcc ccttgtttcg ccaaaactga ttgaacttct taagcaaaaa 120
acgcctgaag atttaaaaaa tggtatcgaa ttgcgatcag gcggtaatga aatgcgaaaa 180
gggttatctg agggagacga cctgcttatt gacaaagtcg ctaaagattt aagcaacagt 240
caccttgtcc aaaaatatgc tgaaataaac aagcttcgca ttaaaggtga ttatcaaaat 300
gccaataaat tacttgatat atgcgataag actttctttc aaaaacccga tgcccccaac 360
ccacttccgc ccatcagtgg cgtagggata atatgcaaac aaacattggt cggtaattac 420
tttttggatg gtaatctgaa agattggggt aaaagtctta attttgttag aaatgtctat 480
tatccaccca tccgaaaaat ttcaggatta gaagaattct ctcttacgga tgctgaaatg 540
ggtagattgt cggtctctcc gaattcgata ccccccttca aggttactgg gacagatcac 600
cagcaacgca ttcaactgca atttgatgtt gctatagacg aagaacatag gcggagtgct 660
actaactacg ttccccacat aaccgcatcc ctaaacggaa agaacattcc tttctttttg 720
gaaaccagtg ccgccattgg caaattgcca gaagaatggc gtcattctcc ccatgttcat 780
atcgtcgggc atctcgatcg ggcaaagaat ggagcttctg aattttttag tggtgacatt 840
ggcattgtcg atgaaatcaa aatcggaaaa gccgttttaa aaaacgttcc cttccttctt 900
accaatgtca atcaggctta tctgggactc atgattttac aaaaactggg taaaatcaaa 960
ataaataaac agcagatgac ctttggcaaa aatatcaact gtaactgtca acaggacatt 1020
catcttggca gcgcattggg gggcgatttc caatcggtcc aatatccaat tacatggcag 1080
gggtacacgc gtttagtggt agttgacttc actcaagatg ataccgttta taatttaaca 1140
acttataagt cagaatttac gccacaagag aaagaacaat ctttcgaaga aagaccagac 1200
cccaataaca aagaattgaa gttttcagtt tatttcaata aaggcaattt gttcgtggat 1260
aatatggatt atgggcaaaa aaaagaaata gttatagaag atagtcgatc tcgattagcc 1320
acaatcatcg gattatctat cctcgaaaaa gctgatctct atctcgactt catcaatcac 1380
aaagcctgcc tcaagccgaa caattcggac gctacgccta taccgcag 1428
<210> 16
<211> 1425
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Nucleotide sequence of ORF ZMO0266
<400> 16
atgtctaaga aataccgatt tcttctctat gcccttcttc taaacagctt ttgcctaccg 60
ccattgaaag ctgacaagcc tcttatctct ccaaggctca tcgaacttct caagcaacaa 120
acacctgaaa cgttaaaaaa cggtattgaa attcgactgg gtggcgatga aatacaagaa 180
ggggtattgg agggcgacag ccttctcatc gacaaagcca tcaatgcgct ggaaagcaat 240
aatcttgcca gccaatatgc tgaaataaac aagctccgca tcaaaggaga ctatcaaagc 300
gccaataaat tacttgatat ctgtgataag actttctttc aaaaaccaga cacctcagct 360
tcgttaccgc ctatcaatgc cataggcatg gtatgcaaac agattttagc cggtaattat 420
tttctggacg gtaatctcaa agattggggt aaaagcctcg attttattaa aaatatctat 480
tacccacccg ttcgaaaaat ctcaggatta caacaattct cccttgcgga tgttaagatg 540
ggagggctat ctgtctcccc gaacccaata caacccttta ctattacaga catagagtac 600
caacaaagca ttccactaca gtatcaaatt cctataaaag aaaactttag gcgtaatgcg 660
gaacatgtcc cttatgtaat agcctcccta aacgagaaag aagttccttt ctttttggaa 720
accagcgcag ctattggcaa attacccaaa gcatggagcc attcccctca tgtccatatc 780
gtcggacata ttgagagagc aaccaatgct gcatctgaat tttatagcgg tgatctcggc 840
atcgttgatg agctcaaaat tgggaaggct gttttaaaaa acgttccctt ccttttcacc 900
aatgtcagcc aagcctatct gggactcatg attttacaaa agctcggtaa aatcaagata 960
gataaacagc agatgatctt tggcaaggat atcaattgca attgtcaaca agatatccac 1020
cttggcagcg cgttagcggg cgacttccaa gcccttaaat atccgattac ttggcaaggc 1080
aaaactaatt tagttgccgt agactttact caagataata ccatattcaa cttattaacc 1140
tttaagcccc aatttacagc tgaagaaaaa aaacaatctt tcgaagaaga tgtgaattca 1200
aataaaaaaa cgattaaaat tgtcggttat ttgaataacg aaaatttatt tattgatgga 1260
atagaccatg gaaaaataaa ggcacttgcc gaagaagata atagacgcaa gccagtaata 1320
attataagta catctatcct agacaaaggc agtcttcatc tcgacttcat caatcataaa 1380
gcctgtctta aaccaaatat ttcggacaca cagcctatgc cgcag 1425
<210> 17
<211> 1446
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Nucleotide sequence of ORF ZMO0267
<400> 17
ttgttttatc gaaagccttt tatgttcaaa aaataccgat ctcttctcta cccccttctt 60
ctaaacagcg ttctcctgcc acaattaaag gctgacaagc ctcttatttc tccaaggctc 120
atcgaacttc tcaagcaaca aacacctgaa acgttaaaaa atggtattga aattcgaccg 180
ggtgacgaag aaatgcaaag gggagtatta gagggagatg acctactcat cgacaaagcc 240
gccaatgcac taaaaggcaa taatctcgtc agccaatatg ctaaaataga taaattacgc 300
gtcaaaggcg actatcaaaa cgccaataaa ctgctggata tctgcggtaa aacttttttt 360
caaaaacccg atgatcctaa tccattgccc cctgtcagtg gcgtaggtat gacatgccaa 420
caaattttag cgggtaatta cttcttagat ggtaatctca aagattgggg taaaattctt 480
cattttgtta gaaatgtcta ttatcccccc atccgaaaaa tttcaggatt agagcagttc 540
tcgcttacag atattgaaat ggggaggttg tccgtttctc cggattctat acccctattc 600
accattacag gcatagatca ccagcaaagc attccactac aatacaatgt acagataaag 660
gaagatcatc ggcgttttgc tgaaaatgtt ccttccgcaa tgatttcgtt gaataggaaa 720
gaggtgcctt tctttttaga aaccggtgcc gctattggaa aactacccaa agcatggagt 780
cattcccctc atgtccatat tatcggacat ctcgatagat caaccaatgc tgcatctgaa 840
ttttttagtg gcgatctcgg catcgttgat gagctcaaaa ttggaaaagc tgttttaaag 900
aacgttccct tcctttttac cgatgtcagc caagcctatc tggggctcat gattttacaa 960
aaattaggta aaatcaaaat agataaacag caaatgacct ttggcaagga tatcaattgt 1020
aattgtcagc aagatatcca tcttggcagc gcattggggg gcgatttcca aaccctcaaa 1080
tacccaatta cgtggcaagg taaaaccagt ctagtcgcaa ttgaccttac tgaggataat 1140
agcgacttta cgctatggac atttaaacca gatttcacaa aagaagaaca agaaaccaca 1200
ttccaattcc ccacaaaaga aaataacaaa actgttctaa gtcaagggcg cattgtaaaa 1260
tctgacttat ccattgatgg gatcaattat ggagtaagag aagagtttat tgcaaaagat 1320
actatccaag atccagctac cattatgggc ttgtttatcc tcaacaaagt cactctctat 1380
ctcgacttca tcaatcacaa ggcctgcctc aagccgaaca attcggatgc tacgcctata 1440
tcgcag 1446
<210> 18
<211> 1422
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Nucleotide sequence of ORF ZMO0268
<400> 18
atgcctaaga aataccgatt ttttctctac ccccttcttc taaacagctt tttcctgccg 60
ccattgaaag caacaaagag cctcccctct tccaaactgg ttgattttct aaaacagcaa 120
agccctcaaa ctttaaagga agggctaaag gtagcccccg gtggcgatga aagcacttta 180
gccctttacg aaggagatag ccttcatctc caaaaaatga tcgatgatcc caagcgcacc 240
agctttgaaa aaaaatttat aaatacagac ttactaagaa ccaaaggcga cttcaaagaa 300
gcggataggc agctcgagat ttgccataaa acctatttta tggagggaag cgggatacat 360
ctttcgccta taaatctggg cgcaatgatc tgtgatcaaa ttttggcagg aaattatttt 420
cttgaaggca atcttgctgc ttggggcaaa aaaattgatg acatcaaaaa tacttactac 480
cctccgatcc gaaaatttgt aggattagag caattttctc ttttcgatat taaaatgggt 540
agcctgtcag ttgccccaaa ttcaataccc cccttcaccg ttaccggaat agatcagcag 600
caaacactgc cactacaatc tcagaaactt acccaagaag gctataggcg cagcacttgg 660
aatgtccctt atttaacagc gtctttaaac ggaaccgatt tctcgttttt cttaggaaca 720
gataccgcaa ttagtttctt acccaaagcc ttaagccatt cgtctcacgt ccatatcgtc 780
ggacatattg aaatagcgac caatggacgt ggcgaagcct ataacggcga tcttggtatt 840
gttgatgagc taaaaatcgg gacgacggtt ttaaaaaatg tcccgttcct gtttacaaat 900
acagatgaag cttctcttgg cctgatggtt cttcaaaaat taggcaaaat aaaaataaat 960
cgacaacatt tcactttcgg aaaagatatt gactgtcact gccagaaaga cattcaactc 1020
ggcagcatat ttgacggccg tttttatgcc ctaagatatc cgatcacatg gcaaggaaag 1080
accgagatgg ctgctattga tcttagccag agcgatgccc gttttagctt tatgctcttc 1140
caacctgatt ttacccctga agaagaaaaa caatcttttg aaattagtaa agaaattgac 1200
ggaacgaaag taaccgcttc tatttattta aaagatggca atctttccat tgatggcatt 1260
gactacggta aaagacaaaa atctgtacaa aaagataaat tacgcatatt ttctaaagtc 1320
atgacaatta caattcttga aaaagctgac ctctatctcg acttcatcaa tcacaaagcc 1380
tgcctcaagc cgaacaattc ggacgctacg cctataccgc ag 1422
<210> 19
<211> 1419
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Nucleotide sequence of ORF ZMO0269
<400> 19
atgcctaaaa aatacagatt tcttctctac ccccttcttc taaacagtct tgtcctgcca 60
cccttaaaag caacaaagag ccttccctct cccagactag tcgatttact taaacagcaa 120
tcgcctcagg cgctacagga agggcttaaa ctatcgcctg gcggagatga atccgcagac 180
gctctttttg aaggtaatac ccttcgtctc cagagaatga ctggcgattc tagaatagaa 240
aactttgcca agaaatttgc cagtatagaa gccttgcgga taaaaggtga cttcgaagag 300
gcgaataagc agctttccat ctgtcataaa acttttttta gagaagctgg cgaaccgccc 360
atttctccca tcaatctttc tgcaatggtc tgtgaccaac ttttggcagg aaattacttt 420
cttgaaggca atcttgccgc ttggggtaaa gaaattgatg gcatcaaaaa cacctattac 480
cccgctgtcc gaaaatttgc tggcctcgaa caattttccc ttttcgatat taaaatgggt 540
aacctgtcag ttgccccaaa ttcaataccc cccttcaccg ttaccggaat aaaccgccag 600
caaacattgc cactagaata tcgagaacct acggctaaag actgttgccg cacgttgaac 660
agcccttctc tcacagcctc tttaaacaag aaagatttac ctttcttcct agaaaccgat 720
acagccattg gcaaactacc caaagaatta agccgatcgc ctcatattca tattgttgga 780
catatagaga tagcaggcaa tggacgtggg gaggctttta atggcgacct tggcgttgtc 840
gatgaactca agatcgggga tgctgttcta aaaaatgttc cttttctctt cacgaataca 900
aaagaagcct ctcttggtct gatggttttc caaaaattag ggaaaatcaa aatagaccgg 960
caacatttca ctttcggaaa agatattgac tgccactgcc agcgagatat caagctaggt 1020
agcagcttta gcggtagcta ccacatgcta agatatccga tcacatggca aggcaacacc 1080
gaactggcgg ctattgatct tagccaaact gatgcgcgct ttagcctcat gactttccag 1140
cctaatttca cgccagaaga agaaaaacaa tcttttgaaa ttaacggcga gattgagggc 1200
gaaaaaataa ctgcccgcgc ctatttagaa gaaggcaatc tttctatcga cggtatcgac 1260
tatggtaaaa aacaaaaatt cgtagaaaaa gctagctcgc gcgtcccttc taagctcgta 1320
actattacaa tcctagataa agcaagcctc tatctcgact ttattaatca caaagcctgc 1380
ctcaagccga acaattcgga cgaacagccc ataccgcag 1419
<210> 20
<211> 1479
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Nucleotide sequence of ORF ZMO0270
<400> 20
atgtaccttt ctagaatgca gcatgaatgc ttcattgctc taaaaacgga aatatttatg 60
ctaaaaaaat atctatttct tactctattt cttttttctg aacttttagc cttttctaaa 120
ggcaaagcag cagagagtct tccctcttcc aaactggttg attttctaaa acagcaaagc 180
cctcaaactt taaaggaagg gctaaaggta gcccccggtg gcgatgaaag cactttagcc 240
ctttacgaag gagatagcct tcatctccaa aaaatgatcg atgatcccaa gcgcaccagc 300
tttgaaaaaa aatttataaa tacagactta ctaagaacca aaggcgactt caaagaagcg 360
gatagacagc tcaagatttg ccataaaacc tatttcatgg agggcagcgg gatacatctt 420
tcgcctataa atctgggtgc catgatctgt gatcagctct tggcgggaaa ttacttcctc 480
gaaggcaatc ttgctgcatg gggtaaagaa attgatgaca tcaaaaacac ctactaccct 540
ccgatccgaa aatttgcagg attagagcaa ttttctcttt tcgatattaa aatgggtagc 600
ctgtcagttg ccccaaattc aatacccccc ttcaccgtta ccggaataga tcagcagcaa 660
acactgccgc tacaatctca gaaacttacc caagaaggca ataaaagtat tacttggaat 720
gtcccttatt taacagcgtc tttaaacgga accgatttct catttttctt aggaacagat 780
accgcgatta gtttcttacc caaagcccta agccattcgc ctcatgtcca tatcgtcgga 840
catattgaaa tagcgaccaa tggacgtggc gaagcctata atggcgatct tggtattgtt 900
gatgagctaa aaatcgggac ggcgattcta aaaaatgtcc cgttcctgtt tacaaataca 960
gatgaagcgt cccttagcct gatggttctt caaaaattag gcaaaataaa aatagatcgg 1020
caatatttca ctttcggaaa agatattgat tgtcactgcc agaaagacat ccaacttggc 1080
agcatatttg acggccgttt tcatgcttta agatatccaa tcacatggca aggaaagacc 1140
gagatggctg ccattaatct tagactcact gatgcccatc ttagttttat ggtcttccaa 1200
cctgacttca cccccgaaga ggaaaaacaa tcttttgaaa tggatcgcga aataaatgga 1260
aagaaaataa tttcttctat ttatttaacg gatggtaatc tttccattga tggcatcgac 1320
tacggcaaaa gactaaaatc tgtagaaaaa gacgaattac atatcccggc taaagttata 1380
ggcgtgtcga tcctagacaa aggcagcctc tatctcgact tcatcaatca caaggcctgt 1440
cttaaaccta atacttcgga cactacgcct atgccgcag 1479
<210> 21
<211> 4468
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Nucleotide sequence of upstream of ORF ZMO0263 - ZMO0270
<400> 21
ggaatcagga aagtctagcc gatcatctag aacatcaagc cagattatgc ctaacgggtg 60
aaaagctggc gattgcctgt catctgatcg acctgattga cgaagccgga tatctgaccg 120
agcctttatc ttccatcgcc tcgcatctta atattacaga agacgaaacg ttggaggttt 180
taaaggtcat tcagggcttt gacccgaccg gtgttggcgc tcgcaatctg gcagaatgtc 240
tgatgcttca agcggaagaa gccgacaggc ttgatccggc gatgcgaaaa ctgattacca 300
atctcgaatg gttgtcacgc ggagcattgc cccgtttaaa aaagctctgt caggtcgatg 360
acgaagactt cgccgacatg attcaggaat tacgaaatta caaccctaaa ccggggctaa 420
aatttggttc cgcaccgatc cagtcggtta caccggatat ttatattaaa cggatgaaag 480
acggctgggc gatcgaactc aataatgcca cacttccgaa attgctggtc aatcgtgctt 540
attattccga attaaaagcc cagaaaaccg acaaagccga acaaaaaagc tggctagatg 600
aaaaattggc gagcgccaac tggctggtaa gggcattgga tcaacgcgcc cgcacgatca 660
tcaaggtaac agaagccatt gtccaatatc aggaaggctt ttttctaaaa ggtatcgaac 720
agctcaaacc gctgacgcta cggcaggtag ccgaaaccat caacatgcat gaatcaacgg 780
tcagtcgggt taccaacaac aaatattttt cctgcgaaca gggaatattc gaattaaaat 840
atctcttctc cagcgggata caatccagcg gttccgaaga aggtgctgcg gccgaagccg 900
ttaaaagcca tattgcccgc ttcatcgctc aagaaggcgc agaaatccta tccgatgaca 960
agctggttga acttctaaaa gccaaaggct tcgccatcgc tcgccgaaca gtcgccaaat 1020
atcgagaagc tatcggccta ggctcctcag tgcaacgccg ccgccaaaaa gcgatcagcg 1080
cttcacaaaa agcctaacct gcaaaaaagc ctgcctcctt ttttaggaaa caggcttttt 1140
caaaggataa tgtcaaaaga caattccaag atcaggcaaa agccgctttc agcttatcaa 1200
ccagatcgag tttttcccac gggaagaaat caccatcggc tttacgaccg aaatgaccat 1260
aagcggcaga aggcttatag atcggcttgt tcaacttcag atgggtgcga atacccttcg 1320
gtgtcaaacg gatcagcttc ggcaagactt cttcaatctt ggcttcatca accgtgccgg 1380
tgccatgggt atcgacataa agcgacaaag gttcagaaac accaatggca taagaaagct 1440
ggatcgtcac tttcttggcc aaaccggcgg ccacgatgtt tttggcaaga tagcgggcaa 1500
cataagcggc agaacgatcg accttggtcg gatctttacc ggagaaagca ccaccaccat 1560
gaggcgctgc accgccatag gtatcaacga taatcttacg acccgttaaa ccggcatcac 1620
catcagggcc cccgatttca aacaagccgg tcggattaac gaaaatggct ttgtcatccg 1680
gcatccagcc tttaggcaga acatcttcat aaaccgattt gacatagtcg cgcagcttag 1740
cctgaccttc tttcgagctc aaagctggac tatgctgggt ggacagaacc aaagcagaag 1800
ctctgaccgg cacaccattt tcataaacca aagtcacctg acttttggca tcaggttcca 1860
gaaaatcgac ttttttctgg tgacggtctt cagccagacg ttccagaata cgatgggcat 1920
aataaagggt cgctggcata tagtcaggcg tttcatcggt agcaaaaccg aacataatac 1980
cctgatcgcc cgcgccttcg tctttatctt caccggcatc gacaccttgg gcgatatcgg 2040
cagactgcgc atggagatgg ttagcgaatt cagccgttct ccaatcaaat ccggtctgct 2100
cgtaaccaat ttcacgtacg gtttcacgaa ccgtcttttc gatttcttct tcactgaccg 2160
gaacagccga acggacttca ccgccgataa tgatgcgctg tgtggtaacc agcgtttcac 2220
aggcgacgcg ggcttccggg tcacgggaaa gatacaaatc gacgatggca tcagaaattt 2280
ggtcagcaac cttatcggga tggccttcgg acacgctctc ggacgtaaac aggtagttgc 2340
tacgcataga aaaaggattt tccttatctg ttaaacctaa aaatgaagct ggcctgacag 2400
tttcccgatc agaaagagga aaaaataaac atctcgccct ttatggcaga tttttcttcc 2460
ccaaagccaa tccccatcta aaagtgacac gctatagaaa gatagaatat aaagatataa 2520
atctttcctt atatcaagac tagcgtaact taatacgccc aaacagggca atgagcaaca 2580
gagccgtggc aaaaagcaca ctaatcaggt tgccgtagcg ggcaaaaaag gtcggttgca 2640
acgctttcgg catcaccgct aaaagccgtc cttcggtatt ttcaggcaaa aattgcagga 2700
tacgcccttc tgcatcaatc accgcagaaa taccggtaga agtggctcgc gcgataggca 2760
gcccctcttc aatcgcccgc aatcgcgctt gtgccaaatg ttggggcggg cccgatcgac 2820
caaaccagct atcattggac aaattgaaaa tgaaatcggg gcgatgggtg cgatcaacta 2880
ctcgaccgga aaaaacgatt tcataacaaa tctgaatccc gaccagacca aaaggcacca 2940
gatcaagact ttcaggctgc gccccttcgg tgaattctat atcaccagcg accaaccgcc 3000
ctaatccgac ataggccgcc catttccgaa aaggcatata ttccccaaac ggcaccagat 3060
gggctttgtc atagcggtct aaaatatcgc ccttggcatc aaggacaaat aaactattcc 3120
gaaccgaagc gatatgaccg gaattatcgg ggatcaaagc atcgcccccc gtcaacaaca 3180
gatcattttt gcccaataaa cggctcaaag ccgcccgtgc caaaggctct tcttcaagat 3240
agctttgaac cgcatcttcc ggccataaaa tcaggcgggg atgatgggga tcacccttcc 3300
ctgacaattt ctcgaaaata gcatcatgac gagatttata acggagatcg tatttttcat 3360
cctgcgggat attcggctgg acaatcacca catgagcagg cggtcgctcg gctttttgcc 3420
aatggatgtc atgaccatcg accaacgccc atcctaaaaa aggtaaagcc atccagaacg 3480
ccggaaggag cgaccggata gcctgcctcg cctgtctttt ctctatggct aacttgattc 3540
cgtcataaca agataatcct ataccggcgg caataaccac aagagccgac aaaccgtaac 3600
tcccgatcca tcgggcgata tgcgctatgg gcaggatatt cagccagatt gcccctaatg 3660
gactccatgg gaatccagta aaaacccatg attttatcca ttcgccccat gtcaaacatc 3720
ccgccaaggc cagcgtcaaa cgccaaagcg gtatttgcga caaagatata ttgaaaacag 3780
gcacagacca aaaagcagca gacccagcaa aaaaacggct tttcatcgtc ccttcacgcg 3840
ctaccgccgc gtcattctca acaggaaaaa gacgggaagg aatagcatcg atatcctcgg 3900
aatccgcacc atccccaatc ccatcagacg actgaaaaga atccactctt ttttcgcctc 3960
gccggaaaga aagacataag aaacgaaggg gcaaagtaaa aagagaaata taacaggcca 4020
aataacagga taataaaggt accgcgaccc aacccaacca tgacggcatc gcagcctgat 4080
gggtaaaaga agtcgcaatc cagtccagcc ctaaccagaa aaagccgaaa gcaaagagcc 4140
aactaagggc aaaaatctgc caagtctttt gggtttgtcg caataaggcc agccatccag 4200
ccacagccac aagactgcat ccccaaagat tataaggctg taatcccaag gccgcgacca 4260
atccggccag aaatgcaaaa atccaagtca caaaattggc tatctcaata gaataagaaa 4320
aaggcaagcc agttcagcca cccatcacca catgaaccaa tatctcaaat aaaaatgtta 4380
tttcatataa taattgttgg ataaaaacag atacaccact ccatatcact tttattgatg 4440
aatggagtat aaaattggac aacaactc 4468
<210> 22
<211> 4935
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Nucleotide sequence of downstream of ORF ZMO0263 - ZMO0270
<400> 22
ataagccttt tacccatctt gtccgacgcg caaagcggca ccgatgacaa aaggcgcgac 60
agcgagcaaa aacaacgaac aagccgccaa taataggaag gccccaggct gatgaccatc 120
aacagccccc gcgccaaata taaggagcgg cacggccaaa ggcaataaaa gtaaagcagc 180
caacccactt ccggacttta tccttgccgt caaagcggca atcataaccc ccaaagaggc 240
cagtccagga gtagccaata aaaatccggc ttccaatttc cagaaaacag accaatccaa 300
agatagcaaa gccgaggcgg gtaacaacgc caccattaaa gggacagcaa aactcaccca 360
atgggcgata atacgcgcca cagctatcca ttcttcgcta atcccgcgca ccgcataatg 420
atcgaaaaag ccattttcga catcgggaat aatcaaacgg tcaatgggta acaaagaagc 480
caacagagct gcaacccata atattccgct accagtacgc gataaaatta tagcgtcact 540
gcccaccgcg aaagggaata gaacggcaac caataaaaaa aacaagacag gtagaaatac 600
ccctgccccg atcaaaatcg agcaatcccg acgaattaac aaaacaagcc ggatcaagag 660
aaatgacttt catccaaaag gtcaaagaaa cctgatgact ggccagaatt cgctacgaaa 720
ttttctaaag acaaggtttt ataatcagcc atatcaagcc cttgatgact aacagccaaa 780
ataatcccgc ccttttggcg atggtgctct atcatttcga tcaaagccct aacagaagcc 840
gcatcaagcc cgtttgccgg ttcatccaac aaccagatag cagcctggct tgccaacaaa 900
cgcgccaaca cagctctttt acgctgccca gtggagagca aacggacagg tgaatccgcc 960
aatatatcaa gagccatcac cgccattgct tctttttcag cgcccaaaac accatctaaa 1020
gccgcccaat aagccaaggc tttttctaaa ggcaaatgcc gatccattgc caaagcctca 1080
tccgcaaaag ccacccgacc ccatttttca atatgacccg aaaaaggttt cagaaaaccc 1140
gccaacagac gcaaaaggct gcttttacca ataccatttg cccccgttat taaaacggcc 1200
tcaccagcct tcacttcaaa agacaaatgg gtaaacagta agcggtcgcc tctcaaacaa 1260
ctcacgtcat gacacgccag ccttgcattc ccgaaatcgg acagcctttt tctccccaac 1320
aagatcccgt caaagggata gaaaacaata tcaaaaatct atgtcttcac actaccccaa 1380
gctaaagcac tttaacgcca cagaaaaacc aagagagcaa aaagataccg tttcaaaata 1440
atactttgtc tatcagaaca gacaaatagc agggctatgc aaaacccttt atgcggatcc 1500
catcaaatcg tgaatttaat gtactgatgg caatgccaga cggacaaaca ggccacctaa 1560
atcttcactt tcttccaaag taacactgcc gccataaatt tcgaccacat cgcgaacaat 1620
tgccaacccc aacccagtcc cgggtttatc tgtatccaaa cgcgccccgc gtttaaacaa 1680
ctgcccacgg agattttcag gaatacccgt gccatcatct tcaatcagga tttcaaccga 1740
cttaccctgt ttttctaccg taacaaaaac gcgtccctga ccatatttag cagcattttc 1800
tataagattt cccaaaatct cgtccagatc ttgtctttct attctgacaa cagcgtcctt 1860
aactcctgca agatcaatcg ttgcatgagg ataaagccga gtaaccgcgc gttctaccgc 1920
cagtaaagca ggccatacct ctgcttggct ttgggcattg ccccgccgtc caatagcccg 1980
cgctcgcgcc aaatgatgat cgacatgccg ccgcatggtc atcacctccc gcaaaacaac 2040
ttctttcaag gcatcgctat tggcattcgc ctcattagtc acaaccgtta atggcgtttt 2100
caaggcatga gccagattac cagcatgtcg cctagcctct tcggcttgcc gttcgttatg 2160
agacaacaaa gcgttcaatt cttcaatcaa aggggcgact tcattcggca tccggtcatg 2220
aatacgcgaa gcctgaccat tacggacagc actaatctcg cgccttaatt tccgcagcgg 2280
ccataatccg atcgtcacct gtaaaacggt aataacaatc aaccccgtgc ctaaaatcaa 2340
aaaggctttc acaagggtat ggcgtaattt tttaatctga ttgtctaaag aagtacgaat 2400
ttcagcgact tggaatcgcc ataaaacaga cgaaccgggt aagcggacat cccgttccat 2460
cactcgcaaa gtgccatcag aaaattcgtc gctatcatat gtccgcacca attgcccttt 2520
aggcatcgga ttgacttgta gcgagcgatc ccaaagtgaa ggggacggaa atctttcata 2580
tccgctaccg ctcacctgaa aataaagccc gctatgggct tccaaaaaac gctggtcacc 2640
caaaggccga ttcagtcgaa ccgccccttc gggatcaatt tcagaagaag cgatcatcgc 2700
cgccaaaaca taatcaagct ggctgtcaaa attatcggtg acggcttggg tcagcacccg 2760
atccaaggtt acgccgccgc ccgatagcag gataaatatc cacaaagccg aaatagcaat 2820
caaccggcgg gtcaaagaac cggtaggacg tattaccggc tcctgactgt tattttctcc 2880
gaccggattt ccgctttttt cgattttttt ccggcgaaag aaacgactaa aaaaacgctt 2940
tcggccaccg ctaggggaag aagcggaagc cataatcagc cgttattccg atcctctggg 3000
tcgttcaaag cataacccaa accgcgaata gtcgtaataa catcctgccc cagtttctta 3060
cgaatacggg ttacaaagac ttcgatcgta ttagaatcgc gatcaaaatc ctgatcgtaa 3120
atatgctcga tcatttcggt gcgactgaca actttgcctt tatgatgcat cagataggaa 3180
agcagcttat attcctgcgc cgtcaatttg acaggctcac ccgctaaagt cactttgccg 3240
gaacgagtgt caagccggac atcacctgcc gtcaattcag aagacgcatt accggaagcc 3300
cgtcggatca aagcccgcaa acgggcaatc aattcttcgg tctggaaagg cttggtcaga 3360
taatcatcag caccagcatc aagaccagca actttatcag accagctatc ccgtgcagtc 3420
agaaccagaa ctggcatttc gcggccttct ttgcgccaac gatcaagaac ggtgagaccg 3480
tcgacttcgg gcaaaccgag atcaaggaca acggcatcat aattttcgct cgagcctagg 3540
aaatggccat cttcgccatc tgtcgccaga tcgacagcat agccagcccc ttccaaagtt 3600
gttcgcaact gacgggaaag cgtcggctca tcctcaacga ttaaaacgcg cataccgttc 3660
tctttctcgc ttccttcttt ttattcttgc aaggctaaac cccaagcctc gttttcggtt 3720
gcatgcgtta ggaaaaggca acctgaaaac agctattata gatattttca ggctgacaga 3780
acactgcaaa agaaaagaaa ggtcggaata acctttttcc ccgaaatcaa tcagaaagca 3840
ttattttgta aaatataata tttatagcag cttaactatc tccaataagc ggccttgctg 3900
gtatgaccaa ttcccggatt aaaagaattc gtcgggtcta attcgtgata atgcgtcttc 3960
aggctgtctt tggcgtaata gagatgcccg acattatgtt ctgctggata ttcggcatgg 4020
cggctgtcca aaattttcca catagcatgt tcgatatcag cgcaatttcc accttttttg 4080
acgatataat cctgatggaa cacctgacaa aagaaatggc cataatataa aatatggctg 4140
attttatcag taatttcaga cgggagatgc tcttcccacg ccctgttatt acgcggcaaa 4200
gcaatatcca acgcaacgat atcttcgact tcatcctgat gaacgtcacg atagcggata 4260
gccgccccag cggcggcaaa acgatgcaga aaagcctttt tcccttcttc atcgctacat 4320
tcaaaataac caccacttgc cttttcgaaa aagtctttca gaaaactgcg cgcttcttca 4380
gttccttctt cggacacttt caaaatcaga tgatgttcat agcggtcacg gaaatcatcc 4440
attcgcttag gcagatgatg cgggaacaga gtggacgcaa attgcatcac ccgatcgctc 4500
aaataacgcg gcaagaaact gacacggttg tttaaaccat caaaccaacc cttcatggcg 4560
aaaagctgcg gcaagcgatc ggtgccgaga tattcaatcg ctaagaaagt atcttttccg 4620
tatttcgccg caatatcata agcatggcga tgcatatatt cgcctgaaat tggcaaatat 4680
ttgaaagact tcaacacctg ccgtcgaagc tcggttaatt catcaggatc attggtgccg 4740
atataaaaaa ccttggcatt tttttgctgc ggaaaagtat caagtcgcac cgcaaaaacc 4800
gccacttttc cggcactacc agaagattca taaagacgag acgggtcagc attaaagcgc 4860
gcgggtgtct ctgcctcaat atcgcgaata tgattatgat attcacagtc ggaagcatgt 4920
ttgctttcgt cattg 4935
<210> 23
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> L-270F
<400> 23
ggaaagtcaa gcttatcatc tag 23
<210> 24
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> L-270R
<400> 24
gtgagttgtt aaccaatttt atactccatt catc 34
<210> 25
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> R263F
<400> 25
gacaatacaa agtactgata aagga 25
<210> 26
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> R263R
<400> 26
ataagcctgt taacttaccc atcttgtccg acg 33
<210> 27
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ATCC19254F
<400> 27
catatgaaga tttttgctta cggcattcgt 30
<210> 28
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ATCC19254R
<400> 28
ttaatattca acagcaatag ct 22
<210> 29
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> LMG18811F
<400> 29
catatgaaaa tttttgctta cggcatacg 29
<210> 30
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> LMG18811R
<400> 30
ctgcagtcag tatttaacag cgattgca 28
<210> 31
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> NBRC3426F
<400> 31
catatgaaga tttttgctta cggcattcg 29
<210> 32
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> NBRC3426R
<400> 32
ctgcagttaa tattcaacag caatagct 28
<210> 33
<211> 3168
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Nucleotide sequence of upstream of ORF ZMO0087 - ZMO0089
<400> 33
tgaaatggcc tctgcgatat atcgaataaa ccgataaaga cgcttttttt tatctgaata 60
atcacccgca aaaactcgga aattctttgc agagcaatcg tttccttatc aaaactaccc 120
tcgcccctaa tcaaaaggca acgtcctcag gacagattgc tttctctttc gggcatagag 180
gattcaatga aaggaagaag atggttaaaa ttgatctcac cggcaaaaca gctattgtca 240
ccggatcatc cgaaggcatc ggcctaggca ttgctattcg tctcgccgaa gcaggtgcaa 300
aggtcattgt taatggccgt catcaagaaa aattgaatag tgcaattgcc gaagtcaaaa 360
aagccgctcc agaagccgaa gttgttggct tcgtcggtga tcttggacag gccgaaggct 420
gcgatgcctt ggtcaaagcg catccggctt gcgatattct ggtcaataac gtgggtattt 480
tcagccccca aggcaatttc ttcgatatcg gcgatgattg ctggcagaat ttctttgaca 540
tcaatgtaat gtccggcgtt cgtctctccc gtgcctatgc caagaaaatg gctgaaaaag 600
gctggggtcg ggtgctgttt atttcgtcgg aatctggctt caatattcca gaagaaatgg 660
tgcattacgg cttcagcaaa accgcccaga ttgcaatcgc ccgtggcctt gccaaaacgc 720
tggcaggaac cggcgttacc gtcaattctg tcctacctgg gcccacgctc tcggatggct 780
tgaaaaaaat gctggaaccg gaagtcaaaa aaaccggaaa aagctacgaa gaagcggcag 840
ccgattttac caaaaacctt cgcccttctt ccattattga acgcgccgct agtgtcgaag 900
aggtcgccaa tatggtgctc tacgccgcct cacctttggc ttctgccacg accggagccg 960
ctctccgcgt tgaaggcggt atcctcaatt atctctaaaa atacagcgat aaccgcaaaa 1020
agggctgccc tttagcagcc ctttttttta cctcacatct caataactcg atagcctgaa 1080
aaaggcataa tggcttcggc ctcttccact acgcagaaag ctatttctat tttacattca 1140
caaaaaccgt cattcgatca tcacctactc tcaaataacg ttccatcgac ctccgcatct 1200
cctcgagacc taaagactac ctaacgacaa tctctcactc tcctctaatc acctctacat 1260
tagagaactc tttacttctg tttcaaagta taaatgaatt aaatattcag tcaccagtga 1320
cgttattaaa aatataaata attaccacaa aataatgcac ttaatatcca atgatttttc 1380
atgggtaaat aatatcatat tatcaaaatc attggatttt taaaggatac agcaatgcct 1440
ttatccaata tcacctactg gccgagcatc aatctcactc tatataaagg gaatacagca 1500
tccacccaaa aaaccgataa tgcggcttca aatacgacgt cacaaaatca ggaaaactct 1560
gtccagatat cagataaagc ccaatctctc tctgatacag aaaatgcaca gccctctctt 1620
aaatcaagaa ttaacgccct tttcaaagaa gcccgcgatg aaggttcctt catcactttt 1680
gactcttcca aaggaggcga atggatcgat ttttcttctt ttacagatga cgaattagct 1740
caaattggaa aagatagaaa tcacgatttt tcagaagcgt tatcaaaaca tgccatcgcc 1800
acattggcag agcgcgtcac catatccttg gaaccatttg aggctacgat tggatatggc 1860
gattttcgag gcgatgcaaa ggctataaga accttatata gccatatgag tcaggatgtc 1920
cgtgatgttc tggggtggac agaaagcatg gtagaagccg cagaaaagtt agccgaaaag 1980
aatacagaaa aatcagacga ttttaatatg gatgccctct gggaaatgtt gatggaggcc 2040
gctaaaaaag gcggcatttt gctccctaaa aagaacatcc tatcgacctc ggcggcatcc 2100
tttgaagatt taaacactca acaataaccc gtttacctct atcatataat tatatctaag 2160
ttataggccc ctttacttct gtttcaaagt ataaatgaat taaatattca gtcaccagtg 2220
acgttattaa aaacataaac acttaccaca aaataataca cttaatatcc aatgattttt 2280
catgggtaaa taatatcata ttgcccaaat cattggattc ttaaaggata catcaatgcc 2340
tttatccaat atcaccccgg gaccaaggga taacttactt ttatataagg ctagccaaaa 2400
tataaatgtc agaacaacag cttcaaaggt aatccaaccc acatcgaatt catcagaaaa 2460
tagcgtccaa atatcagaag aggccaaagc cgcttttaaa agccagaaaa tgtctaatac 2520
tgaaaacgct gacaattcta tcaaatcaag acttaacaag ctcttccaag aagcccgcga 2580
tgaaggttcc ttcatcacct ttgactcttc taaaggcggc gagtggcttg atgtatcgtc 2640
tttcacagat gatgaattgg ctcaaataac gaataataag gaaggcagct tttcaaaaga 2700
tttgtcaata tatgcccaag ccatgctagc tcaacgtgca aaactgtctt tggaaccgtt 2760
tgaagccgcg attggatatg gagattttcg gggagaggca gcggcaatca ggacattata 2820
taaccatatg agccaaaatg tccgcgatgc tctcggatgg acagagagca tggttgaagt 2880
cggtgaggaa atggccagcc attccggcaa agcccttaat aaatcacatt taaaaacgct 2940
ctgggacatt ctgctagaag tcgcccaaca aggcggatta tctattcaaa atagccctaa 3000
tcaagacaac ctacaaaaat ccgatgataa agctatatag cagcgttaaa ataataccct 3060
gaacatcatt acatcatttg ttacgattat tactcaaatg gacaatttac aaacaatctt 3120
atctcaccct atatctccta aaaagatcat atttgtagga attttatg 3168
<210> 34
<211> 3159
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Nucleotide sequence of downstream of ORF ZMO0087 - ZMO0089
<400> 34
taacccgttt acctctatca tataattata tctaagttat aggccccttt acttctgttt 60
caaagtataa atgaattaaa tattcagtca ccagtgacgt tattaaaaac ataaacactt 120
accacaaaat aatacactta atatccaatg atttttcatg ggtaaataat atcatattgc 180
ccaaatcatt ggattcttaa aggatacatc aatgccttta tccaatatca ccccgggacc 240
aagggataac ttacttttat ataaggctag ccaaaatata aatgtcagaa caacagcttc 300
aaaggtaatc caacccacat cgaattcatc agaaaatagc gtccaaatat cagaagaggc 360
caaagccgct tttaaaagcc agaaaatgtc taatactgaa aacgctgaca attctatcaa 420
atcaagactt aacaagctct tccaagaagc ccgcgatgaa ggttccttca tcacctttga 480
ctcttctaaa ggcggcgagt ggcttgatgt atcgtctttc acagatgatg aattggctca 540
aataacgaat aataaggaag gcagcttttc aaaagatttg tcaatatatg cccaagccat 600
gctagctcaa cgtgcaaaac tgtctttgga accgtttgaa gccgcgattg gatatggaga 660
ttttcgggga gaggcagcgg caatcaggac attatataac catatgagcc aaaatgtccg 720
cgatgctctc ggatggacag agagcatggt tgaagtcggt gaggaaatgg ccagccattc 780
cggcaaagcc cttaataaat cacatttaaa aacgctctgg gacattctgc tagaagtcgc 840
ccaacaaggc ggattatcta ttcaaaatag ccctaatcaa gacaacctac aaaaatccga 900
tgataaagct atatagcagc gttaaaataa taccctgaac atcattacat catttgttac 960
gattattact caaatggaca atttacaaac aatcttatct caccctatat ctcctaaaaa 1020
gatcatattt gtaggaattt tatggataat atcatcaaca tcatcgcagg cgtgattgca 1080
ctctatttca tcgccgcgat gctcatgttt ttctactggc tctattttca taaaggcagc 1140
ctgaaaaagg ccttaatcca tatcgttgtt tccttgggat tactttgcct tctggtgggg 1200
ggtcaaatgc tccgctggaa aagcatcaat gcccaaaatg cagcagaaca ggcagcaaaa 1260
atgccaaaag ctgttaccat tcagcctgac cttttagcga tattgcaggc taatcccgat 1320
cctgcttccg ttgaaccgac aaaactcgct gccatcgcta atttagccga gcaacattta 1380
ggcgaagctg gtaaagaata tgaagcgcct ttgaagaaat atttcgtcta ttacaacagc 1440
catattgcat ccgaaaaact gcctgacaca atggccgcta tcaaattcga tgcacaacgc 1500
cgcaatgctg aacgcggttt ttaatctccc aatttcaaga taatcagcga tgatatagcc 1560
tcggaaagcg ccctcaatcg cttccgaggc gaattgatag attacccgac aataacagcc 1620
tttcaaaaag acagatttcg gcctcacaaa aaaaattgcg cttcatgtga atgaaggctt 1680
gcaatatgtt gaaatcctcc gcaattttat ctccgtgttg agacaatatg aactagtcga 1740
tcgggtttta agctacgatc caaacgccga tgaagcgttg ataaaccgcg cctatgtttt 1800
cgccatgaaa gcgcatggca atcaaaaaag ggcaagcggc gatccctatt tcagccaccc 1860
gctagaggtg gccggaatcc tgaccgatat ccatatggat gccgaaacga tcataacggc 1920
catcctgcat gatactgtcg aagacactgg aacgaccagc gaagagctgg caaaactctt 1980
tggttcagcg gtggctcgtc tagttgatgg tgtcacgaaa ttatcgcgaa tcgaggcaca 2040
atccgtcacc gaacgcgcgg ctgaaaatct cagaaaattc ctgctcgcca tgtcagacga 2100
catccgcgtt cttctggtca agctggcaga ccgtctgcat aatatgcgga cattgcattt 2160
cattaaaaag gaagaaaaac gccgccgtat cgcgcgtgaa accatggata tctacgcccc 2220
gttggcagaa cggatcggca tgtatgaatt catgcgtgag atgcagacac tttccttcca 2280
atttttggaa ccggaagcct atgcttcgat cacaaaaagg ctggaacaac tcaacaaggg 2340
tgatacgggt caaatcaaac gtatcatcaa tggcatcgag gaattacttg agaaagccgg 2400
tatcaaagcc aaggtctcag gccgccaaaa acacccctat tctatctgga aaaaactgga 2460
agaacgccat atcagctttg accagctttc agatgtcatg gcctttcggg tcattgtcga 2520
taatacagaa gattgctatc gggcattagg cattttgcat ggcaaatggc caatggtgcc 2580
ggggcgtttc aaagactata tttcgacacc gcgccgcaac ggttacagct cgcttcatac 2640
tgcggtcatt cacaatgaaa atctccgtat cgaaatccag atacggtcac aagcgatgca 2700
cgaacaggcc gaatatggcc ttgctgccca ttgggcgtat aaacagaaaa cggtgccgga 2760
caaattccag caaagcggct ggattcgcga tttggtcgaa attctggaca atgctgaaag 2820
cccagaagag ctactcgagc ataccaaaat ggcgatgtat aaagaccgta tcttcgcctt 2880
caccccaaca ggtgagctta tacagcttcc cttgggggca acaccggtcg attttgccta 2940
tgccgttcac acggatttgg gcgaccaaac cgtgggtgcc aaagtcaatg gccgcgtggt 3000
gccattaggc acgcgcgttg aaaatggcga tcaagtcgaa attctgcgtt cagccgcgca 3060
aacgccccaa atttcatggc tcaattttat taccacaggt aaagcccgcg cggctattcg 3120
ccgttttgtc cgccataaag agcggagcga tacccttac 3159
<210> 35
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 87F
<400> 35
tgaaatggcc tctgcgatat atcgaata 28
<210> 36
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 89R
<400> 36
gtaagggtat cgctccgctc tttatggcgg a 31
<210> 37
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> del 89F
<400> 37
taacccgttt acctctatca tataattata 30
<210> 38
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> del 87R
<400> 38
cataaaattc ctacaaatat gatcttttta 30
<210> 39
<211> 3140
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Nucleotide sequence of upstream of ORF ZMO0381 - ZMO0384
<400> 39
gaagaagcgc agaccctatc tcaacgatct ttggagcttt taaggccaac catcagaacg 60
attgattcag aattatggtt ttcgtggaat cctcgtttca aaactgatcc ggttgaccgg 120
atgttgcgcg gcgaaacgcc accgaccggt gcggttgtgg ttcaagctaa ttgggaaaat 180
aatccgtggt ttccctcgcc gttggatcaa gaaagacggg attgcctgac gaatgatcct 240
gataaatacc gccatatatg ggaaggggga tatgcggaga taaccgaggg ggcttattat 300
gcccaagcct tggccaaagc ccgatctgaa aaacggatag ctgtcgttgc cgctgacccg 360
ttaatgacct tgcgggcggt ttgggatatc ggcggcacgg gtgccaaagc tgatgctacc 420
gcgatatgga ttgtccaata tgtcggacgg gaaatccgtt tcctcgatca ttatgaagcg 480
caagggcagc ccttatctgc ccatcttcat tggttgcgtt cgcatgatta tggcggggct 540
ttatgtatct tacctcatga tggcgcgcag catgataaaa tcgcctcaac aacctatgaa 600
ggcgcgttgc gtgaagccgg attttcggtg cgggttattc ctaatcaggg agccggagcc 660
gcaatgcagc ggattgaagc agctcgtcgg ttatttcccc agatgtggtt tgatgaaaat 720
cactgccgtg gcggtttgga agcccttgga tggtatcacg aaaaacggga cgaaatacga 780
gggatagggt taggacccga tcatgattgg tcaagtcatt ccgcggatgc tttcggtttg 840
gcggctattg cttgggaacc gcccgtaacg agccggaaaa tcacctatag caataaagga 900
atattttaat gaaacgggct gaaaagagct ttctgccccg aagggggcgc tatgtctttg 960
gatattgata gcaatataga tttgaaagaa aaacagacgg atttcttgct ttctaaccat 1020
gagttattag cggtcttgca cgaaaaagcc gatcaagcag aaagctggca taatagttta 1080
ctggctgaag atcaggccaa tgctatcgat ttttatgaag cgcgaccctt tggggatgaa 1140
gaggacggtc ggagtcaggt cgttagtccc gatgtcgccg aggtagtcga ttatatgacg 1200
atcagcctgt tacggacgat tgtgtcaggc gatcgcgtga ttgaatttga gccgatagcc 1260
gccgagcaag cgcaagatgc cgatgatgcg accgaggcgg tcagctatgc ttttatgcat 1320
gggcaggacg gctataaaat cctgcatgac tggatccagt cgggattgat tgaaaaaata 1380
ggcattatca aaaccgcagt cctatcggaa agacgtgcta caatccgcca tattactgtc 1440
gatgatgatg ccttggcggc tttgttgatg gaggccgagg ataatcccga tattcagatt 1500
accttgaata atgacgatgg tagcggccaa tatgaggtaa ccgttacccg ttatcagctt 1560
caaaaacgct atgtcgatat gccgattccg tccgaagaat atcgcgtttc ggccagaact 1620
cgccatgaag atgatgctga ttatcaggcg catgtcagtt ataaaacgct gtctgatctt 1680
atttcgatgg ggttcgatcg cgatattgtc gagagcctgc caagtgataa gagttttccc 1740
aatagcgatg gccgttctga tgccagatgg cgggatgaat cctttctgtc cggcagtagc 1800
gatcaagcca atcgcgaagt tctcttatat gaagaatatg tccgcatcga tcgggatggc 1860
gatggcattg ctgaattatt gcagattttt cgggtaaaag atgtcttact ttcgattgaa 1920
gaagtagacg aagcgccctt tgtcgtttgg acacctttcc cgcgcgccca tcggatgatt 1980
ggtaattctt tggccgagaa ggttatggat atccagcggg ttaagtcagt gctgatgcgt 2040
caggctttgg atggggttta ccagaccaat gcgccccgta tggcggtaaa tgtcgatggt 2100
ttaaccgaag atacttttga cgatttattg acaattagac ccggggcgat tgtccgttat 2160
cggggtggca ttccaccaac gccgttaaat gccggtttcg atatccaaaa atctttgggt 2220
atgatcgaat atatgcagtc ggctcaggaa agccggacgg ggattacccg tcttaatcag 2280
ggattggatg ctgacagtct taataaaacc gcgaccggtc aggccttgct tcaggcgcaa 2340
gggcagcaaa tggaagaata tgttgcccgc aattttgcac aaagtcttgg gcggttattc 2400
caaaagaaat tatggctgat gattgcatcg ggcgatccga tggcgatcaa ggttgaaggt 2460
ctgtataaaa cggttgatcc ggctttgtgg ccgccggata tgcgcgtgcg tgtcacggtc 2520
ggattgggat cggggcgaaa agatcagcgt ttggcctatc gtcagcagtt gttatcgatt 2580
cagcaacagg cgttggccgt tggtttaacc ggttccaagc agatttataa taatatcgcc 2640
gcaatgatcc gagattgtgg tttgggtaat ccgactgatt atttgattga tcctgatatt 2700
cgcttggcag gtaatcaggc tgaaaatcct gtgaataata attcggctgc ggcgcaaaat 2760
tcttctggca gtgtaggaaa taatcccgat tatacagagt tgaaagcccg acaagatatc 2820
aatcttcaag ggcagaaaat ggctgctgat caggaacgga gtatggccga atttgctttg 2880
aaaaagcagg aaaccgaggc caagctggcg atgcaacagg aagagcataa acagcgtttg 2940
gccttggtgc gcgaaaaagc cgaagaagag gccattttag caaggcaacg ttccgatttt 3000
gaagcctcgc ttgccaagga aacagccgat cgtaattacc agatcgcttt gaaattggca 3060
gaagctggga aaaatattcc agcggataaa aagggggata gggtgccgca aaacaaagca 3120
gggggcgcat tggataaata 3140
<210> 40
<211> 3212
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Nucleotide sequence of downstream of ORF ZMO0381 - ZMO0384
<400> 40
tgtagtttat acgctgcatt aaatgaaaag gcggtgaatt cgggggacgt ccaaccgtca 60
tagacgagga taatcccgag ccaagcttga ggtgaaaatc tcttgaaggt gtaacgacta 120
acagccgagc ctaccgacaa aaaacgataa aactgatgcc gttatttctg aaaaagaagc 180
gggtatgatt ctttgcattt ttactgaaaa tgccggaaat ttcggaagaa atatttcagt 240
cttttttgtc catggcagta atgctgacac gagtgccgcc cgcgaaagcg atgatatagt 300
ctgagccttg caggaatgta aggaagcaag ggataaagag cctttgcggt aacaatctgg 360
aaacaccttt tgtaacagct atcggtcaaa cgacagccaa aaatacctat accgaatggc 420
agaccgacaa tcttgccagc gctaatgccc agaataaaca ggtcgaagga gctgatcttg 480
ccaatgaaag ccgccagcca acggttcggg tcggcaatta tacccagatc atgaccaaag 540
ttgtcgggac atcgacgacc gatcgggcgg tgcataatgc cggacgcggt gatgaacatg 600
cctatcagtt ggcacgtgct ggtcaggaat tgaaacgcga tattgaggcg cgctttactg 660
gtaattttgc agccattccc ggagatgggg cagtcgtcgc gcgtgaaaca gcaggagctt 720
tggcatggct gcgcagtaat gcccatcgtg gcgacggcgg tgccaatccg gtgatgtccg 780
gtggcgacaa tggcagcggt tatccgacaa cagcggcgac cacaggtaag gcgcggcttt 840
ataccgaggc tttgttaaaa gaagttttgg gcgatatctg ggtcagtggt ggtcagccaa 900
atatggtgat tacctctttg aaactgaaac agacagcggc agcctttccg gggttggctt 960
ccaaccggcg cgatacgggc gaccagaaag cgcgtattat tgccggtgcg gatatctatg 1020
tttccgatgt cggcgaagtc cagtttgtac ctgatcgttt ttgcgacaat agcagcgctt 1080
tggtcattga ccctgaatat tggtcggttg cgaccttaga tccgattcag aaacggtctt 1140
tggcaacaac ggggctggct gatcgtgatg ccctttatac tgaaattgcc ttgcgctgcc 1200
ataatgaagc agcctccggt gttttggcag atttaagcgc tgcctgattt tcgtgatcgg 1260
gaggatgtct tcttgcaaga catcttcccg taaaaattcg gaaagggaat attccatggc 1320
tttttcttct gccttggtcg cctttttcaa aaaaaaggtc gggctgggct tgaaatgcgg 1380
ctttgatatt cgagggcatg atggctgctg aacgcttgtt atcctataat ccggtgacgg 1440
ggcttaaaag ttggttttcc tcttcagagg agaatcaggg cagttggcat atccgctatg 1500
aacaggattg ttctgcggct ttggaagcca ataaacaggc acaaaatgaa gattttgatc 1560
ggcgttcttc gatgtggcac gccgcccatg ttccagccgt cgttttgatg gaatggctgg 1620
tgaaatatgg tgtccgatat tgggacaaaa atcacgcgcc tgccgttcgc cgtttactca 1680
atcatcctga ttatcgctat ttgcgcgtta atcactttat tatgtgagca tggctgatgg 1740
ctctttttat tgatgcccaa aatctggaca gtctcacccg ttatgatggc ctcttaaagg 1800
cgattgcctt gtggttggaa cgcgatgatc tggccgatga aatcccttat ttcgtgcaac 1860
tggcagaagc ccgttttcgg cgattgttga ctaatcccga attggaaacc gaaataacgg 1920
tagcggcagg ctgtcctgtt acgttgccgg atgattttga ggccttgcgc ctgctttatc 1980
cggcaggcgg tcgtcgcgat cgggcttttt tgcagctgtc gccagatgtt tttcagcagg 2040
gcaagcatca gaataaatct gttttcaccc tgatggcagg gcaattatgg atatcgcctc 2100
ttcctgaaac agaaacggct ttttcgttgg tctatcgtgc ggctttgccg tctttatcct 2160
tgaatcgcca gagtaactgg ctgttggcct cccatcccga tatttattta ttcgggtcgt 2220
tattacaggc cgagttcttc ggatggaatg acagccgttt gccggtcatt aaatcggcgc 2280
tggatgaagc cttgggcgag ttaaataaag caggattgcg caagcgttat gcagaaagca 2340
ccttggttgc gccatcgcct gtcgtggaag cggtgaaagg cacttaccga tggtaagtca 2400
gcgtctttta ttcggggctt atgaacccga tcaaccaccg tatatgagtg gatcactgcg 2460
ccatttaagc aatgcctatg ccacgacaaa tggatatcgt ccagtcggag gcttcaagcc 2520
ttttgcggcg gcgttgccag atatttttat gggggctgcg gcttttttag ggtcagatgg 2580
ttcgacttta ttggtcgctg gcaccaaaga cagtctttac cgctatgttt ccggtaattg 2640
ggaggccttg gtaacagcct tgccggctta tggacgatgg catttcaccc aatttgggga 2700
tcgcattatt gccgttaacg gcagtgccac ccgaaaaata gatatcctta ctggaaaagc 2760
cgacagcata gcagatgccc cgacagctga aatggtgacg actattcggg attttgtggt 2820
gtatggccgc gcttctgccc agaagaatct aatccaatgg tcgggcttta ataacgaaaa 2880
cagcaatgtc atcggcacca atcaggccgg ttatcaaccg atgctgactg gtggcgacat 2940
aatgggcatt atgggcggcg aatatggcgt tattatccag cgttcccgca ttgtccgtat 3000
gagttacacg ggggacagct atatctggca gtttgatgag atcagcgcca atatcggggc 3060
gattgcgtca ggctctatag cacaagctgg gcatcaggtt ttctttctgt ctgatcgggg 3120
tttcatgatg acagacggcg tttctgtcac accgatcggc aatgaacggg ttgaccggtg 3180
tttttttgaa agctggccaa gggacagttt gg 3212
<210> 41
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 381F
<400> 41
gaagaagcgc agaccctatc tcaacgatct tt 32
<210> 42
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 384R
<400> 42
ccaaactgtc ccttggccag ctttcaaaaa aac 33
<210> 43
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> del 384F
<400> 43
tgtagtttat acgctgcatt aaatgaaaag g 31
<210> 44
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> del 381R
<400> 44
tatttatcca atgcgccccc tgctttg 27
<210> 45
<211> 3280
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Nucleotide sequence of upstream of ORF ZMO0390 - ZMO0394
<400> 45
atgatccgat ggctggaaat aatgcggata tgccgccatc cgatcaggca tccgacgatc 60
agagcaatat gggcgcaacg gcagcaggaa atggtgccaa tcaaggaaat ggtcagccgg 120
atatgagtgc ggcttggcaa gaacattgtc gggccttgca ttaccattat gccgaccagc 180
ttgctaaata tgccgaagcg attaccccga aaaaacctga tccgcagtta ttggtcagtg 240
atccggcaag ctatgccgca caattggcaa gttatgaaga cttaacggcc aagcgtgacc 300
aaattgttca ggaagttatc cagatttctc gccagaatga aatggctgaa ctggctgcca 360
gaagggcatg ggcgcagggc gaacatcagc gtttgatatc gcttttgcct gaatggggcg 420
atgataatca gagaccggct atcttggcgg cttttgaaga aacgggacgg catctcggtt 480
atccagatca tgttttggcc gaggctgatt ccaacgacat tatggctttg aaaaaagccc 540
atgaatggcg aagaaaatcc gaaaaatggg atgccctaca acagggtaag gcggcggcta 600
tcaaatcagc caaaacatcg agaaaaaccg cagttccagg aacgtcccag ccttatggcg 660
cggccaaaag ccggaaacta aatgaatcat tggggcagct tcgcgaaact ggcgatgtcc 720
ggtcagccgc tgcggcgatg aacgcccttt ttaaataatc tacttttcaa ggaattttga 780
attatgtctg ttgcctctaa taccgtccaa acctattcgc gtgtcggtat tcgtgaagat 840
ctttccgata ttatttataa tatcagcccg actggagtct tggtccgtta atgtagttta 900
tacgctgcat taaatgaaaa ggcggtgaat tcgggggacg tccaaccgtc atagacgagg 960
ataatcccga gccaagcttg aggtgaaaat ctcttgaagg tgtaacgact aacagccgag 1020
cctaccgaca aaaaacgata aaactgatgc cgttatttct gaaaaagaag cgggtatgat 1080
tctttgcatt tttactgaaa atgccggaaa tttcggaaga aatatttcag tcttttttgt 1140
ccatggcagt aatgctgaca cgagtgccgc ccgcgaaagc gatgatatag tctgagcctt 1200
gcaggaatgt aaggaagcaa gggataaaga gcctttgcgg taacaatctg gaaacacctt 1260
ttgtaacagc tatcggtcaa acgacagcca aaaataccta taccgaatgg cagaccgaca 1320
atcttgccag cgctaatgcc cagaataaac aggtcgaagg agctgatctt gccaatgaaa 1380
gccgccagcc aacggttcgg gtcggcaatt atacccagat catgaccaaa gttgtcggga 1440
catcgacgac cgatcgggcg gtgcataatg ccggacgcgg tgatgaacat gcctatcagt 1500
tggcacgtgc tggtcaggaa ttgaaacgcg atattgaggc gcgctttact ggtaattttg 1560
cagccattcc cggagatggg gcagtcgtcg cgcgtgaaac agcaggagct ttggcatggc 1620
tgcgcagtaa tgcccatcgt ggcgacggcg gtgccaatcc ggtgatgtcc ggtggcgaca 1680
atggcagcgg ttatccgaca acagcggcga ccacaggtaa ggcgcggctt tataccgagg 1740
ctttgttaaa agaagttttg ggcgatatct gggtcagtgg tggtcagcca aatatggtga 1800
ttacctcttt gaaactgaaa cagacagcgg cagcctttcc ggggttggct tccaaccggc 1860
gcgatacggg cgaccagaaa gcgcgtatta ttgccggtgc ggatatctat gtttccgatg 1920
tcggcgaagt ccagtttgta cctgatcgtt tttgcgacaa tagcagcgct ttggtcattg 1980
accctgaata ttggtcggtt gcgaccttag atccgattca gaaacggtct ttggcaacaa 2040
cggggctggc tgatcgtgat gccctttata ctgaaattgc cttgcgctgc cataatgaag 2100
cagcctccgg tgttttggca gatttaagcg ctgcctgatt ttcgtgatcg ggaggatgtc 2160
ttcttgcaag acatcttccc gtaaaaattc ggaaagggaa tattccatgg ctttttcttc 2220
tgccttggtc gcctttttca aaaaaaaggt cgggctgggc ttgaaatgcg gctttgatat 2280
tcgagggcat gatggctgct gaacgcttgt tatcctataa tccggtgacg gggcttaaaa 2340
gttggttttc ctcttcagag gagaatcagg gcagttggca tatccgctat gaacaggatt 2400
gttctgcggc tttggaagcc aataaacagg cacaaaatga agattttgat cggcgttctt 2460
cgatgtggca cgccgcccat gttccagccg tcgttttgat ggaatggctg gtgaaatatg 2520
gtgtccgata ttgggacaaa aatcacgcgc ctgccgttcg ccgtttactc aatcatcctg 2580
attatcgcta tttgcgcgtt aatcacttta ttatgtgagc atggctgatg gctcttttta 2640
ttgatgccca aaatctggac agtctcaccc gttatgatgg cctcttaaag gcgattgcct 2700
tgtggttgga acgcgatgat ctggccgatg aaatccctta tttcgtgcaa ctggcagaag 2760
cccgttttcg gcgattgttg actaatcccg aattggaaac cgaaataacg gtagcggcag 2820
gctgtcctgt tacgttgccg gatgattttg aggccttgcg cctgctttat ccggcaggcg 2880
gtcgtcgcga tcgggctttt ttgcagctgt cgccagatgt ttttcagcag ggcaagcatc 2940
agaataaatc tgttttcacc ctgatggcag ggcaattatg gatatcgcct cttcctgaaa 3000
cagaaacggc tttttcgttg gtctatcgtg cggctttgcc gtctttatcc ttgaatcgcc 3060
agagtaactg gctgttggcc tcccatcccg atatttattt attcgggtcg ttattacagg 3120
ccgagttctt cggatggaat gacagccgtt tgccggtcat taaatcggcg ctggatgaag 3180
ccttgggcga gttaaataaa gcaggattgc gcaagcgtta tgcagaaagc accttggttg 3240
cgccatcgcc tgtcgtggaa gcggtgaaag gcacttaccg 3280
<210> 46
<211> 3008
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Nucleotide sequence of downstream of ORF ZMO0390 - ZMO0394
<400> 46
catccatttt ggatattatt tttaaattaa tccttaaaat gttggattta ttataagaat 60
atcacaatag atactttggg tatcgggatt ttttgtaagt aaaatccaat gtaatcgaaa 120
tgtaatcatt aaaatattta tttattttat gctcttataa ggaggggtag ggctgcgcta 180
tgtctttttc ggactggtcg caaaatgcag atagtaacag caatattggc gggatcagta 240
ttgctgaagg ctgtccaccg ggcaatctta acaatgcctt gcgcgagata atggctgaaa 300
tgcggtctgc tatcaatcag gctatggata cggccttgag ctcggctgat atggcgagtt 360
ttcgtcaggc tattggggct ttggcgaata gtggtgacac tattgacggc gttttgcgcc 420
gtaaaggtca gggggttttc ccttattttg ccgatggttc tttttccggt ggccggattt 480
atgtgaccaa tagtcaagcg gctgacccga caagtcagcc gggggatatc tggttggtct 540
atgtatgact atcagcctta aagatcagga taatttttcc cgcgagataa gagctgtttc 600
aatcagggga gccgatggcg tgcttcattc tgtcggatct attcgtatcc gtgggcagga 660
tgaaagcttg catgaggtct tttgccacaa gctggatgtc tcggtttctg acgctttgat 720
agaaagctat tcccgtcata atcctgtgat ttcttctgcg gtgacggttc aggtttcggg 780
cggtgttccg ccttatcaac atcgctggtc tttggtgagt agcgatagag ccgatagcgt 840
gatggctctt tctccttttt cggcaacaac gacttttcga gccgatggcg tgcctcatca 900
ccatgccgca tcagcctatt tgcgtgacga tgttaccgat cagaatggct ttgccggttc 960
ggttgaagtc cattgtattt ttacgaggta atttcatgcg taaatatttt gacagcgtgg 1020
cgagcgcgct tgacgggaag ccggtcatgg gtgccttgat tttcgtctat aaaacagacg 1080
gtagtctggc ttcccttttt tctgatgatg gaacgaccgc tatttcccag cctttgcgga 1140
cggatagtct cggatatttc gaattttatg ttgcggatgg tctttatgat ttgaccattt 1200
cctatggcgg caaaattcgg acgcgccttt ctggcgttca aatttatgat gaatcccatc 1260
tgcaaggggg cggggcagcc ttgcccgacg gcacccgtat tgccgaattg ccggtcgcag 1320
ccatgaacaa ggctttgggt gcggccggaa acttagccca atttatcaaa aactattcta 1380
ataattctat ggagtgatgc catgtctact ttaacgattt cggaaatgac cgatgcagga 1440
tcggttaccg aagatgattt gattgaaatt tcccgtccgg ttgccaatgg ttatgcaacc 1500
tataaagcca aaatcggcta tattaaaaat ctgacgacca attatgattc cgtcattgcc 1560
gctttggggc atgaaccggt gagcgttgat ttaagcaatt ttaacgccgc aactttccag 1620
cagaaagtag cgatttctta cggccagatt accaaaggcc tcggctatga gccgatgaat 1680
gtcgatttca gtaatttcaa cggatccact ttccagcaga aagtgacgct gtcctatggc 1740
cagattaccg gtggtctggg atatgaaccg gccaataaag acttgtctaa tattgatggt 1800
atgggtctgg tttcaaaaat caatgctgtc cgaggtgctg caccggtttt gacgaccggg 1860
ggtgaactga ctggtaatct caatccggct tcagatggtg tgattacctt gggacagccc 1920
aaccgaaaat gggctgaaat ctatgcttcg aatggggcaa ttaacacctc ggatgcccgt 1980
cagaagatgg atattgcttc tgtccctgat gaggttctgg atgtctgggg caatctgtca 2040
tggcggcagt ttaaattcag aaaagcggtt gagaccaaag gctttgataa ggcgcgctgg 2100
catttcggtc tgatcgctca agaagtcgaa gatgcctata aaaatgcggg cttggatgcc 2160
gaaagtctgg gcatgatttg tcatgaccat tgggaagccc atactcgccg tgaaaaaact 2220
ggtaatatgg gtaaaaatgg caagccggtc tatcgcgatg tcttggtgcc agccggtgaa 2280
gcctatggtt tgcgctatag cgaatgtcag gcgatcgaag ccgcatggca gcggcgtgaa 2340
atcattcggc agcaggctga aattgacgct ttgaaagcgc agctcaccca agcacaggct 2400
taagataatg acagcttctc cggcaccttt tattcctgac catcctgata tctatctgct 2460
ttccggcgat gggctggttc gcaataacat gcatgtcgaa gacgggcggg caggctatct 2520
gcctaatgat acttcgacca gtgaaagtca ggctttgtta gcgcgtggat atgcccgtta 2580
ttatctcgct tcgggggata taaaagccct caataatgct cgaaaattgg cggacgccgc 2640
attgagttac ttctttgccg gaaaaacgcc ccctgcaagc gggttatggt atcatcattg 2700
ggtggtgaat gcagggcagg gctttaacgt caaaggcccc tctaatccca atggtcatgc 2760
ctatgacggg aatgtcggag aaactgttac ctttaaggac gggaaggctc aacttcccgc 2820
cagtcttgcc aatgtttata atgtttttca gggagaacta agctggcaaa atgtctatgc 2880
cgatctatcc aaagggcagt tttttgatat agattatttt gttgatcgtg atggctatat 2940
tttccgctgg caaagcggat atgcggcgga tgttgttttt acatcggagg cacagcctca 3000
gaccgcta 3008
<210> 47
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 390F
<400> 47
atgatccgat ggctggaaat aatgcggata tg 32
<210> 48
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 394R
<400> 48
tagcggtctg aggctgtgcc tccgatgta 29
<210> 49
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> del 394F
<400> 49
catccatttt ggatattatt tttaaattaa tcc 33
<210> 50
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> del 390R
<400> 50
cggtaagtgc ctttcaccgc ttccacgaca g 31
<210> 51
<211> 3450
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Nucleotide sequence of upstream of ORF ZMO1786 - ZMO1789
<400> 51
accaaagccg aaaaaaggtc atcaaaaata cctttggcag caagaccaat cgcgatacca 60
ccgataccaa gaccggcaac caatccagtg acattcacac ctagattatc gagaacgaca 120
acagaggcga tagcgaagag agccaccgtt acaagaagcc ggataagatt aagcgcgcta 180
tccaaattgc ggttgctatt attcgattgc tcgacccgat agctaatgag tcctaaaatg 240
agctgacgcg cccaagtcgc aaattggaaa gtgctggcaa tgacccataa gaactggaca 300
acatccgaaa ggcgcgagct atggtcaaaa tatgcggtga ccaatcgaat ggtcagaata 360
gccaagaaaa aagcatgagt ccgaccaatg gcttcaccgg caagagtcgt ccattcactt 420
aaaaaggcac tgcgcttcaa aaaattttcg gcaaagcgtc taaaggaaag caaagcgaaa 480
aagagaacaa cccctacccc aatagcgcag agtagctgga tataatgtcc taaaaaccat 540
tcactgattt gatggttcaa agcggctatc tcctgaggcg aagtcagaat agcggcatga 600
ttttgttcct gcattctttt tcctgaaaaa aattatccgg taaaatcagc tttcaagtga 660
aggaatattc acgttagaaa atctttatca cagcaggata atagattttt tcttaaatac 720
gccagaatgc aatgttaatt atttaatcgt ttttatccgc tagacttata gaattgattt 780
tgtcggataa aatctatgga gaaagctgaa atggcaggct caacgccaat ggaaggaaaa 840
aaggaaaaac gtcttatcgt tctttcttcc gctatgtttt ctatagctgt catttttttc 900
tggatggcta tgccgcctga aatttttacc cgactgaccc atgatactgc cattacttgg 960
ctgacaggag aggacggcag tgcgccttta ttatccagag cgcggctggc ctttcccctt 1020
ggtattgttt taggcgggat tatcgccttc atcgaacagt tctgactaga agaaaattaa 1080
agttaaataa agcatagcat ctaaatacta ttgagtttta aaaattaaaa tttctaatta 1140
ttttttgata tatcactcaa atattgctct actagaatat gagtgatact agcatggctt 1200
taattttatc tgactaattg agcttggtaa atcaagagat aatggctatc atatctatcc 1260
cagtgaacac gctatggaat cgtctaaata aagcggcatc aacatcttcc acggcgttgt 1320
ttgcaattat taccggatgt tatgcgcctt atctcggatt gctagctatt ctagcaattc 1380
ctttcggtga tattgttacc gcatcatgtc aatgggattg ctactggtat cttgatatca 1440
gtcggaatgg ttattcatct tttcccttga ttgttaaaaa tgctattggt gaagcaaact 1500
gggcattctt cccgctttac cctttacttg tgcgtgaagc atctgggata acaggcattt 1560
cagtcgagaa tatggcattc ttattgaatg ctttaggatt tccagtagtc atttttatgg 1620
cagtgaagac tcttattaaa cgagatctta cgcgcgagcc gattgcatgc atactgattt 1680
ttttactctt cccctttaat gtttggtaca cagctcaata ttcagaatgt atctatgcgt 1740
taataatact tgtttatact agtgctattc ataaaaatca gattagcacg gcagcattct 1800
ccagtttttg tcttgcttta acccgtccaa caggattaat tgtgtcaatt gctggttcag 1860
tctggcaaat atttttttca agaaaggaaa tactttctag tcgatttgca aatgctattc 1920
ttatcatagg atgtgctggc tttgcggtat caatctttgc attacatctt caccatgtaa 1980
tgggtgatgg tttagccttt gctcatgtgc aaattgcatg gaaacgccat tccagcatta 2040
tatttgttca tatcattcgc tttatgacaa agttgcaccg aattcctttt cttatctatt 2100
tcattatgtc atgttttctt cttaaagaaa tggcaagaga cgccaaatgg cgacttgaat 2160
ttattatttt gctttcaacg ctactaattt ccgtaacaac cagccttatt tctattgaaa 2220
gaattatttt tggaaaccct ttggctatac aatacattgc cacacgcttg accgatcgat 2280
ttaaaaatcg cctgccgcga ctcctcatca tattagcaat cattcacacc cttgggaccc 2340
ttgcgtggta ctgtggatac agggtactgt tgtaatgcgg cgtacagtaa ttataataaa 2400
ggccaccata gggttattgc tggtcttatt cgatgcttat agctttttta cttgcaaatc 2460
tgctcaagta aacagctgct accgacaata ttatctcgaa caatcgataa acgccgcctc 2520
ttttgcgcgc tgtgaacaaa aaatgctgcc gccagaggag gtcaaaaacc aagcaaagca 2580
gaatccttcg cggtagcctt agtatccttc cagctgatca aatcgccctt catgaagggc 2640
tgatcaaaga taatcaccaa agccgaaaaa aggtcatcaa aaataccttt ggcagcaaga 2700
ccaatcgcga taccaccgat accaagaccg gcaaccaatc cagtgacatt cacacctaga 2760
ttatcgagaa cgacaacaga ggcgatagcg aagagagcca ccgttacaag aagccggata 2820
agattaagcg cgctatccaa attgcggttg ctattattcg attgctcgac ccgatagcta 2880
atgagtccta aaatgagctg acgcgcccaa gtcgcaaatt ggaaagtgct ggcaatgacc 2940
cataagaact ggacaacatc cgaaaggcgc gagctatggt caaaatatgc ggtgaccaat 3000
cgaatggtca gaatagccaa gaaaaaagca tgagtccgac caatggcttc accggcaaga 3060
gtcgtccatt cacttaaaaa ggcactgcgc ttcaaaaaat tttcggcaaa gcgtctaaag 3120
gaaagcaaag cgaaaaagag aacaacccct accccaatag cgcagagtag ctggatataa 3180
tgtcctaaaa accattcact gatttgatgg ttcaaagcgg ctatctcctg aggcgaagtc 3240
agaatagcgg catgattttg ttcctgcatt ctttttcctg aaaaaaatta tccggtaaaa 3300
tcagctttca agtgaaggaa tattcacgtt agaaaatctt tatcacagca ggataataga 3360
ttttttctta aatacgccag aatgcaatgt taattattta atcgttttta tccgctagac 3420
ttatagaatt gattttgtcg gataaaatct 3450
<210> 52
<211> 3100
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Nucleotide sequence of downstream of ORF ZMO1786 - ZMO1789
<400> 52
tatctcgctt gcaataaaac atattttcag gcttttcagc gcaagccggt tttaaaggga 60
ctcttcataa atatctttat cgaaggggca aaagaatcag ggataaaatc gtgaagcaag 120
cgacaaaagc aacgccgaaa aagagaaaga cgcttggcca gctccgaatg ctttggcaat 180
ttgccagccg ttatccgata tggattttcg gggctctgtt ggctttgctc ctttcttcga 240
cagcaacgat tgcgatacct gccgctttca aaatggtgat tgatcgcggt tttggcggcg 300
atagtggcgc ccatgatatc aatctttatt tttgctatat gctgggcatc attcttttac 360
tggcgcttgc aactgctgcc cgattttatt gtgtttcatg gttgggtgag cgggttattg 420
ccgatattcg gatggctatc agccgccatt taatgcaaat gccccctgct ttttttgaag 480
agaatcggcc ttctgaaatt gcttcccgct taaccactga tacgactctg attgaccaga 540
ttgtcagttc tacggcgtcg gtcgctcttc gtaatttgat tactggcctt ggcggcaccg 600
cctatctttt tatgctggcc cctcatttaa ccgccatgtt gttgggcggt attccgattg 660
tggtcttccc tattattttt atcgggcggc gattacagcg attgtcccga aaaagtcagg 720
atcggatagc tgatctcagc agcctgatta ccgaaacctt gggcgcgatg aaaattgttc 780
aggcttttgg tcaggaagat cgggaatccg accgttttgg tcaggctgtt caactcactt 840
ttgagacagc aaaaaaacgg attacgctgc gggctttcat gaccgctttg gtcattttgc 900
tgatttttac ggcgattatc ctgattatgt ggcgtggtgc gctagatgtc gccgcgggtt 960
tggtgtcagg cggcaccatt gctgcttttg tgctgacagg cggggtcgtt gccggtgcgt 1020
ttggtgcgtt aagcgaggtc tatggtgatt tacttagggg tgccggtgcc gccagccgat 1080
tgaatgatct gctcgctgaa aaaccggcta ttctttctcc tgctcatccc aaggccttac 1140
cccacagcac agagggatgt ttaacttttc aggatgtctc tttccgctat ccctcgcgtc 1200
ctgatacaga agccttaagc cattttagtc ttgaactgaa agccggcgaa cggctggctg 1260
tcgttggctc ttcgggtgcc ggaaaaacaa cattatttca gcttatccaa cgcttttacg 1320
atccgacatc aggcgtgatt tctatggaag gtgtggattt aaaagaagcc gatttaagcg 1380
atatccgctc tcatatcgcg gttgtgcccc aagaaacggt tatttttgcc gcctctgccc 1440
gcgacaattt aagatatggg cgatgggatg ccagcgacga agagctatgg caggcggctc 1500
gtgcggctca tgccgaagaa tttttaaaag cccttccaga aggactggat agctttcttg 1560
gtgaaggcgg cgcacgcctt tcggggggac aacggcaacg gattgcaatt gcccgcgcta 1620
ttctacggga tgctccgctg ttactattgg atgaggccac ctctgcactg gacgcagaat 1680
cagaacaagc ggttcaacag gctttagaaa aactgatgaa aggacgtagt tcgatcatca 1740
ttgcccatcg tctggcgact gtccgccatg cggacagaat catcgttatg gataaaggta 1800
agattgtcga ggaaggcagc catgaccagc ttatccaaaa aaatggtctc tatgcccgtc 1860
tcgcacagct ccaattcagc gatcagaaaa tagcttaatt actcattcaa aaaaacatga 1920
ccaataaaat aatcgggtaa ggcgtgaaac ttctttcaaa tttacagcga tctgccagca 1980
tctcataatg ctggcagaac aggctgataa ctttaacgcc gttcgagctg attgacatct 2040
cgaactgccc cacgggcagc gtttgtcgtc aaagctgcat aggctttcaa agccgaagaa 2100
atcggacgat tacggttttg cggtttccat gctgccgccc ccttggcttc catgcgggca 2160
tgacgatcgg caataacagc atcatcaaca tccagatgga taatccgttc aggaatatcg 2220
ataacaattg tatcaccggt ttcgaccaaa gcgatcaagc cgccctcggc cgcttcagga 2280
gaaacatggc cgatggataa accagagcta ccaccagaaa aacgaccatc ggtaatcaga 2340
gcgcagagtt tacccaaacc tttcgatttc agatagctgg tcggatacag catttcctgc 2400
ataccggggc cacctttggg accttcatag cgaacgatca ccacttcacc agcttcgaca 2460
tcattgccaa gaataccggc aacggcggct tcctgacttt cgtaaacctt ggctttaccg 2520
gtgaatttca gaatagactc atccacaccg gcagttttga caatactgcc ttcaggagca 2580
agattgccaa ataagacggc cagaccacca tccgtcgaaa aagcatgatt tttagaacga 2640
atcacacctt tttcgcggtc agtatccagc gcttcatagc gagaagactg gctgaaagcc 2700
ttttgagtcg gaacaccccc cggagccgcg cgatagaata actgcgcttc ttcagaacaa 2760
ctgtcacggc tgatatccca tgcgtccaat gctgcgccta aagtcggaga atgaatggtg 2820
cgcaagctgg tattgatcaa tccggcacga tcaagctggc ctaaaatggc cataacgccc 2880
cctgcccgat gaacatcttc catatggaca tcatttttgg ccggtgcgac cttgcataag 2940
caagggacat gacgggaaag acgatcaata tccgccatag tgaaaggcac gttgccttcc 3000
tgcgcgaccg ccaacagatg caaaaccgta ttggtggaac cacccatggc gatatcaaga 3060
ctcatcgcat tttcaaaagc ctcaagcgtg gcaattgaac 3100
<210> 53
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 1786F
<400> 53
accaaagccg aaaaaaggtc atcaaaaata cc 32
<210> 54
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 1789R
<400> 54
gttcaattgc cacgcttgag gcttttgaaa atgc 34
<210> 55
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> del 1789F
<400> 55
tatctcgctt gcaataaaac atattttcag g 31
<210> 56
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> del 1786R
<400> 56
agattttatc cgacaaaatc aattctataa g 31
<210> 57
<211> 4879
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Nucleotide sequence of upstream of Lactate dehydrogenase
(ZMO0256)
<400> 57
tggcagtcct ccattcagat cgaaggtgcc agccttgacg ggaaagaatt gccagtcaaa 60
gagctcccga cattacagcc gccacgctgt gtcaaaaata ccgaaaacaa accgatgacc 120
ttctttgcct attcggaaga ccccgaatgt cagactttat cgcttaatgc cggaaaaggg 180
caggtgacta tgtcgggtgt ttgtcagaaa aatggtaaaa atctgacaac cattgaagcc 240
aaaggcgact atcacctccg cgattattct atggcctata ttatgcgaag tgaagaaaac 300
ggccataaat tagaagtccg tggacatatg tctgggcatt ctatcggctt atgccctgcc 360
aaagatagca atgccgatga tatcaccttg gggaacaaaa accactaata cgggtgttcg 420
tttggcgata agactattta gcaatcatag gcttccgtca taaccgctaa aatcatggca 480
gggatcgacc ttacggactt cttccatgcc tttctttgat agcaaggcat tgtaggggca 540
tatcggggca aaatatatcc cgatcacaag gggcgacctt tgtaggacag atatgcctaa 600
aactctaatg acgacaggcg taaaatccta aagactttcc gtttccgata tctgatttat 660
cattttttct gatgagtagt tgctgcgtcc aattcgctga tttcaggatt ggagtcaggt 720
cagggtataa ccctataatg atagctacgg gatagaacgc ttatcatcag cttctatctt 780
tgtggcagat tcctgtcgca gggaaagata gtgcagaagc tatcttgacc atatccctgt 840
catgatagca ccccgttcca gatgccagat gccagatgcc agatgccaga tgccagatgc 900
cagatgccag atgccagatg ccagatgcca gatgccagat gccagatgcc agatgctcga 960
attatatctg gcaaaaccct ctcacagaaa aagggcatca cccctcaatc gcagacccga 1020
aatagatctg acgcagacat taaaaaaggc caatggaaac ccattaggcc ttttttattc 1080
tatcaggaaa ggatccggtt aaaaccggat acccttatta accctgacgg gctttaaagc 1140
ggcgaaccgt tttattgatg atataagtgc ggccacgccg gcgaatcacc cgattgtcgc 1200
gatggcgccc ctttaaggat ttgagcgagt tgcggatttt catggccgga ctacctgcct 1260
tcatcttaaa aattgggaaa gaaaatgagg cctctgccta tgcgctgaat tattataagt 1320
caaggaaaat tctgatatat cggaaatatc cttgaaagaa aaatccgata tctcttcatc 1380
aaaacagcca aagaccattg gaatacaggc ttttttcgtt acttttttca cgattacaaa 1440
aaaggctata attctttttt gaaatattat gatatccgtt aaagatcata gccacagcaa 1500
ccacccttca taaccggatg gcttgacgga gactatcttg aggcatctca tcacgatatc 1560
acagcccgca ataccgcaag acgtgaccaa taaagacggt cacaaggcaa aaaaacagct 1620
ccggtgcaaa ggcatctatc cctttttatg gatgtttttc tttgcggcgg cgcttccgtt 1680
acaggcgacc cagccgatag aagtcactcg ctttcacaaa agcgatatgg ctacaaccgg 1740
catcgtcaac attatgcctc atgacccgac cttacggaat acgctggaat atcagcgcta 1800
cacggccagc atcgcccgca atctcacaag aatcggtttc caagtcacgg acaacccgca 1860
acaagccgaa tatacgatga tgtatgacgt gatgcgggga acgcattaca gagacaacgg 1920
ccaaacgccc ccgcgtgata ctcgccctca tggtggcatc agccttggcg gtggttatgg 1980
tggcggaggc ggctttggag gcggcggtgt cggctggggc ggcggcggaa gtggtatcag 2040
tatcggaggc ggtggcgggg gtggccgcgg cttcggaggt ggcggaggcg gtatcagtgc 2100
cggtatttct gtccctgtcg gtaacggcta tcataccagc aacaaggtcg aaaccattct 2160
aacggcacaa ctcagccgca gggatacgca tcaggctatc tgggaaggcc gcgcccgaac 2220
ggaagctaaa agtaacaaag ccgaaagcac gcccgatatt gcggtggaca gattagccac 2280
agccatgttc ggccagtttc ccggtgaatc aggtgaaacg gaaaaagtaa aatgaccctt 2340
caaatcaatg ccgcctttga tggcggaaat atccatgttg tcgaacaaga cggaaaccgg 2400
atttatctgg aaattatcaa agataaccag tcggatttct tccaatggtt ctatttcaag 2460
gtaaccggtg ccaaagatca ggccttggaa ctggttgtca ccaatgccag cgattccgcc 2520
tatccggccg gctggcctga ttatcaggct cgcgtttccg aagaccgcca agactggcaa 2580
atgacagaaa cggattatcg cgacgggatg ctgaccatcc gttatacgcc gcgtagtaat 2640
atcgcttatt ttgcctattt cgccccttac tcaatggaac ggcaccatga tctgattgcc 2700
cgtatggctg gcaagtcagg ggtcggttac gaaatgttgg gtaaaagcct cgatggtcaa 2760
agcatggatt gcctgacgat gggggaaggg cggcgctcta tctggttgat cgcacggcaa 2820
catccgggcg aaaccatggc cgaatggtgg atggaaggcg ctttggaaag gttaaccgat 2880
gaaaatgact cggttgcgcg cctgcttcgc caaaaagccc gctttcatat catgcctaat 2940
atgaatccgg acggttcttg ccgtggtcat ttgcggacga atgcttgtgg tgccaatctc 3000
aatcgtgaat gggcagaacc cacggctgaa cgcagccccg aagtgttgga cgttcgcaat 3060
catatggaca aaacgggcgt tgattttgtc atggatgttc atggcgatga agctattccg 3120
catgtattcc ttgccggttt tgaaggtatc cccgatctcg acaaggcaca ggataaatta 3180
ttccgccgct accggaataa attggccaaa tacacgcccg attttcaacg tcattacggt 3240
tatgaaaatg acgagccggg gcaggccaat ctagccttgg cgactaacca attagcctat 3300
cgttacaagg cggtttcgat gacgcttgaa atgcctttca aagatcatga cgatatgcct 3360
gatttgaaaa aaggttggtc accggaaagg tcaaaacaat taggccgcga ttgtctcgct 3420
atcttggctg aaatgattga tcagctcccg atctctggca aagatctcgc gtaataaaac 3480
tatcaggcgc aatcgtaatt ttgcgtctga tagagctttt cataaaggct ataaccgcta 3540
ttgccaaaag ccataggcct gcataatctg acggcgaata attttcctga aagattggcg 3600
gccatttttg ctgaccgcac agattgtcag cgttaattat acatggcttc ttttgttgat 3660
tcgggaactg caagcgttta ccggaacaac acataacgaa gagatattga aaaggagtgg 3720
aatatgccca cgctcgtttt gtcccgtcac ggacagtccg aatggaacct tgaaaaccgt 3780
ttcaccggtt ggtgggatgt taacctgact gaacagggtg ttcaggaagc aacggccggt 3840
ggtaaagctc tggctgaaaa gggttttgaa ttcgatatcg ctttcaccag cgttctgacc 3900
cgcgccatca aaaccaccaa tcttattctc gaagccggta aaaccctttg ggttccgacc 3960
gaaaaagatt ggcgtttgaa tgaacgtcac tatggtggtc tgaccggtct gaacaaggct 4020
gaaaccgccg ctaaacatgg tgaagaacag gttcatattt ggcgccgttc ttatgacgtt 4080
ccgccgcccc cgatggaaaa aggcagcaag ttcgatctgt ctggcgatcg ccgttatgat 4140
ggtgtcaaga ttcctgaaac ggaaagcctg aaagacaccg ttgctcgcgt gctgccttat 4200
tgggaagaac gcattgcccc tgaactgaag gctggcaagc gcgtcctgat cggtgcgcat 4260
ggtaactcac tgcgcgctct cgttaagcat ctgtcgaaat tgtcggacga agaaatcgtc 4320
aaattcgaat tgcccaccgg tcagccgttg gtctacgaat tgaatgatga tctgactccg 4380
aaagatcgtt acttccttaa cgaacgttaa tagccttggg cttttaaagc cttttggttt 4440
gttaaccgtt ttttcggcca gagttttctc tggccgaaaa tttatgtcta tccctttgtt 4500
tttctatccc catcacctcg gttttgttga caaaaaaagg tggccactaa attggctttc 4560
cgcaccgatg ggatgatttt tattctttgc tattcttcgc tctttgccca attcattaaa 4620
agcggaaatc atcaccaaag atagaagacg cagccttcac catttcagat tgcccttctc 4680
gggcattttc tgctgctaga atcctcttaa aaatattaaa ttccactcta ttggtaatat 4740
gtttccctct ttagggaaca aataaagccc ttctttgttc tataaaagtt agcttaccga 4800
ttttacaaaa aataataccg cttcattcaa tcggtaatac atatcttttt tcttcaaaaa 4860
acttttcaag agggtgtct 4879
<210> 58
<211> 4984
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Nucleotide sequence of downstream of Lactate dehydrogenase
(ZMO0256)
<400> 58
tagacaagcg acaattaacc ttttgaagat cataatgatc aaatttttgg gttaattcgg 60
tagttatggc ataggctatt acgcgctaat tgatatcaaa aaaaagcata gccggacatc 120
ataccggcta tgttttttat taggaaaaaa tttcctttca ccttgcttag ccatcgccgc 180
attatttaat caatatgccg agtttttctt gaaatcccta tcttacacca aggccaacaa 240
gggaatcatc catactcggt gtcctatcct atgacttttt aaattttctc caaatttact 300
aaaatcacgc catctcagcg gctgctattt tcaaaaagcg cctctcaaaa ccgctttttc 360
ctgctcaaat atcggatccc aaaattccct caaaaaaggc agggtatttt ttacaaaatc 420
gcccctaata tctctcaatc cgctgccttg ttcatatgtt tttgcaaatg atttttatta 480
aactttttta ggcgtatttt tatcaagaaa atttaaataa tcacattttt attattttag 540
atttaagtat tgatacaagt gatatctata aatgttttta taactttctg gatcgtaatc 600
ggctggcaat cgttttccct atattcgcaa gatgtatgtc agccgcagat ttgtcgactg 660
acctctatct ctccgagata tatcaacaaa aggtagtcac catgaaagca gccgtcataa 720
ctaaagatca tacgatcgaa gtgaaagaca ccaaattacg ccctctgaaa tacggggaag 780
cgcttttgga aatggaatat tgcggggtat gtcataccga tctccacgtg aaaaacgggg 840
attttggcga tgaaaccggc agaattaccg gccatgaagg catcggtatc gtcaagcagg 900
tcggggaagg ggttacttct ctgaaagtcg gtgaccgtgc cagtgttgca tggttcttca 960
aaggctgcgg ccattgcgaa tattgtgtca gtggaaatga aacgctttgc cgcaacgttg 1020
aaaatgccgg ttatacggtt gacggcgcta tggcagaaga atgcatcgtc gttgccgatt 1080
actcggtcaa agtgccagat ggtcttgatc ctgcggttgc cagcagcatc acttgcgcgg 1140
gtgtaaccac ctataaagca gtcaaagttt ctcagataca gccgggacaa tggctggcta 1200
tctatggctt gggcggttta ggcaatctag cccttcaata tgccaagaat gttttcaacg 1260
ccaaagtgat cgcgatcgat gtcaatgatg aacagctcgc ttttgccaaa gagctgggcg 1320
cagatatggt catcaatccg aaaaacgaag atgctgccaa aatcattcag gaaaaagtcg 1380
gcggcgcaca tgcgacggtg gtgacagctg ttgccaaatc cgcctttaac tcggctgttg 1440
aggctatccg cgcgggtggc cgtgttgtcg ccgttggtct gcctcctgaa aaaatggatt 1500
tgagcattcc tcgcttggtg cttgacggta tcgaagtctt aggttctttg gtcggaacgc 1560
gggaagattt gaaagaagcc ttccagtttg cagccgaagg taaggtcaaa ccgaaagtca 1620
ccaagcgtaa agtcgaagaa atcaaccaaa tctttgacga aatggaacat ggtaaattca 1680
caggccgtat ggttgttgat tttacccatc actaggtttc cgtgaaggcg gaagcataaa 1740
cggaaaaagc ctttctctta ccagaaaggc tttttctttg tcgtctgata aaaattttca 1800
tacagaattt aatacagcaa tcggtgctat aagccgctat ccaagctttt ttcttctcat 1860
gccttctatt cggcaatcgc tatttaaagg ctgtttttat ggggcattcg ccctatatat 1920
aaggatatta gcgtttatat ataatagaag gaaatctggc cttgggtgaa acaaccctcc 1980
aagcagcgcc ccatgcccat attcaacata gcggctccga tttattggaa gcggccaagg 2040
cggctttatt gaaatcgggt gagcaatgga cagccatgcg tgcctccgtt tacaaagcct 2100
tggcacaaac caacaagcca agttcagcct atgatattgc cgatattgtc tctcaatccg 2160
aaggacgcag agtagctgcc aacagcgttt atcgcatcct cgacatcttc gtcagtagca 2220
atctcgcgca tcgggtcgaa agcgctaacg cctatatcgt caacgcccat cctgaatgtc 2280
gtcatgactg cctttttctc gtctgcgacc aatgtggggg tgtgattcat atagatgatg 2340
acaagatcag ccgcttttta aaagaatcgg cagaaaaaaa cgattttgtt gcagaaaggt 2400
ctgttttaga aatacggggt aaatgttcac attgtctttc ccattaacct aaatgtacct 2460
caggttaacc tgttgcaatg actctattac ctgctatgat tttgtaactt ttatgtcgca 2520
gtcagggctt atcttggcta atttgggttc ctgctgttca cctttagggc gaattgtttt 2580
actaaacagg cttaaatttc ggtttgattt aaggccctaa gcttatgttt ccgaatgaca 2640
agacgccgct gttagacaag atcaagacac cggcagaatt gcgtcaatta gatcgcaaca 2700
gcctccggca attggcggat gaattacgga aagagaccat ctcggcagtg ggtgtgaccg 2760
gcggacatct cggttccggt ctgggggtta tcgaattaac ggtagccctt cactatgttt 2820
tcaacacgcc caaagacgct ttagtctggg atgttgggca tcaaacctat cctcacaaga 2880
ttttaacagg tcgccgcgat cgtattcgga cattgcggca acgtgacggc ttatcgggct 2940
ttacgcagcg cgcggagagc gaatatgacg cttttggagc cgcgcatagt tcgacttcta 3000
tttctgcggc gctcggcttt gcgatggcca gcaaattatc cgacagcgac gacaaagcgg 3060
ttgcgattat cggtgatggc tcgatgacgg caggcatggc ttatgaagcc atgaataacg 3120
ccaaggcggc gggtaagcgc ctgattgtca ttttgaatga caatgaaatg tcgatttcac 3180
cgccggtggg tgccttatcg tcttatttga gccgcctgat ttcctcacgg cctttcatga 3240
atttgcgcga tatcatgcgc ggcgttgtta accggatgcc aaaaggcttg gcaacggctg 3300
cccgcaaggc tgatgaatat gcgcgtggta tggcaaccgg tggcaccttc tttgaagagc 3360
tgggctttta ctatgttggc cccgtggatg gtcataattt agatcagctc attccagttt 3420
tagaaaatgt ccgcgatgcc aaggacggcc ccattttggt gcatgtcgtc actcgcaaag 3480
gccaaggcta tgctccggct gaagcggcca aggacaaata tcacgccgtg cagcgcttgg 3540
atgtggtttc cggtaagcag gcgaaagcgc ccccgggacc tcccagctat acctctgttt 3600
tttcggaaca gctgatcaag gaagctaagc aagacgataa gattgtgacc attacggcag 3660
ctatgccgac tggcaccggt cttgatcgtt ttcagcaata ttttcctgaa agaatgtttg 3720
atgtcggtat tgccgaacaa catgccgtaa cctttgcggc tggtttggcg gctgccggtt 3780
acaagccttt ctgttgtctc tattcgacct tcttgcagcg cggctatgac cagttggtgc 3840
atgatgtcgc tatccagaat ttgccggtgc gcttcgccgt cgatcgtgcg ggtcttgtcg 3900
gtgccgatgg ggcaacccat gcgggtagct tcgacctcgc ctttatggtt aatctcccga 3960
atatggtcgt gatggcgcct tccgatgaac gggaattggc caatatggtg catagcatgg 4020
cgcattatga ccaaggcccg atctcggtgc gttatccgcg tggtaatggt gtgggtgtct 4080
ccttggaagg tgaaaaggaa attctgccta tcgggaaagg tcgcctgatc cgtcgcggta 4140
aaaaggttgc tatcctatct ctcggcactc gattggaaga atccttgaag gctgctgatc 4200
ggcttgatgc tcaaggtttg tcgacatcgg ttgctgatat gcgttttgct aagcccttgg 4260
atgaagcgct gacccgccaa cttttgaaaa gccatcaggt cattattacc attgaagaag 4320
gcgctttggg tggttttgca acccaagtcc tgacgatggc ttcggatgaa ggcctgatgg 4380
atgacggatt gaaaatccgc accctgcgtc tgccggatcg gttccagccg caagacaagc 4440
aagaacggca atatgccgaa gccggtcttg atgctgatgg catcgttgct gcggttatct 4500
ccgcattgca tcgtaattct aaacccgtgg aagtcgtcga aatggcgaat atgggtagca 4560
tcgctcgcgc ttaatttgct attagggagc ctcggctccc gacaatagta aagagatcat 4620
atataatgct acatccggtt gttttgtgtg gtggttcagg tacacgtctt ttcccgttat 4680
cccgccggag ccatcccaaa caactcctca gcttgatggg cgaaaatagc ctgtttcagg 4740
acgctgtcgc acgtgtaaca gattcttctc tattcacggc acctcttgtt atctgcaatg 4800
aagaataccg ttttactatt gcagaacagt tgcaggaaat gggcgttaag gctcaagaga 4860
ttgtccttga gccagaaggc cggaacacag cgcccgcgat tgctttagcg gcgtcaatga 4920
ttgcagataa agatcctgat gcctgcatgc tgatcttacc gtcagatcac gttatccggg 4980
atgt 4984
<210> 59
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ldhAF
<400> 59
tggcagtcct ccatctagat cgaaggtgc 29
<210> 60
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ldhAR
<400> 60
gtgatctgac ggtgagctca gcatgcagg 29
<210> 61
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ldhA-PmeI-2F
<400> 61
aactagttta aacaagagcg aagaatagca aagaat 36
<210> 62
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ldhA-PmeI-2R
<400> 62
ctcttgttta aactagttat ggcataggct attacg 36
<210> 63
<211> 3656
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Nucleotide sequence of upstream of D-lactate dehydrogenase
(ZMO1237)
<400> 63
tgtttcaggg aaccggtatt ttaagtcaat taaaagccgc cagccatgct gtcgatgccg 60
cccatgcgcg gcaacaaacc gctttattgg aagcccataa caagctccgt tcgattcatg 120
cggcggcgat gggttctatg gcaagaatag gtgttctgca aagtcgtctg aaaaccatta 180
tcgaagcccg cgatctttat cgcgatcaat atcgtttggg ctctcgttct ttggttgatc 240
tgctgaatag tgagcaggaa atttatcagg cgcgcaccga aaatatcaat gcaaggcatg 300
atttgtgggt gagtgaagcc gatcaggtcg ccgcatccgg tcgggcaaga gccgtctatg 360
gcattgacca caccgtcgtt cagggattgg agatattgcc atgatggcgc agggtggaga 420
agaaaaacgc caatcccttc ttttatggga agcctggctg gatgccatga ttgcgattgc 480
ccgtcattat acccttccgg tttcagtcga gcatgttcgg aatatcatgt catgggataa 540
ggctgaatct gatgaaggtc gcctatccgt tatggcgcgt catttaggtt taggattccg 600
tttggaatcc ggcgaaaaag ccgaaggcgc cgtgcgttcg ggtgtcgcgt taccctttat 660
tgcccattgg gatgatggcc gtattggttg tgtgatgacc aatgatggtg acgggcattt 720
agcggttcgc ttttcgggcg aaggcgatct ggaaacgccg gttgaaattg actggttagc 780
cgatcacgtt attgaaatcg cttatttgcg gccattgcgc tctatacccg atgggcgggt 840
cgatgattat atccagcctt atcgtcccca ttggttccgc cgtttggcct tggctgattg 900
gcgacgtttc ggggaagtta ttgtcgcctc gctttttatc aaccttttgg ctttgtcttc 960
gactctgttt tcaatgcaga tttacgatcg cgttgtgcct gcccaatcag agccaacctt 1020
atgggttttg ttttcgggcg tgatgatggc ggtctttttt ggattactgt taaaggttgc 1080
ccgcacccga ttattggatg tgatcgggaa aaaagccgat ttgcggattt cagagcatgt 1140
ctttggtcat gcgatccgtc tggtttacga tgcccgtccg aaagtcgccg gtagttttat 1200
tgcccagctt cgcgaattgg aacatgtccg cgaattattg accgcgacca gtatcgccat 1260
gattaccgat ctacccttct tttgcctgtt tttaggtatt ttatggatgg ttggcggtaa 1320
tttgatttgg gtggcgttgg ccgctgtgcc tttgttgctt atccccggta ttctggtgca 1380
atatccgctt gcccgcctgt cacaacaggg aatgcgtgaa tccgctttac gcaatgcttt 1440
gctgatcgaa gcggttgatg gttttgaaga tattaaattg atgcgtgccg aacctcgttt 1500
tgaaagacgg tggaaccatg tccattcggt ggccgcctcc attgccatgc ggcagcgttt 1560
ctataccgga ttgatggtga catggagtca ggaaatccaa accatcattt atgccctgat 1620
tttattggtc ggctgtttcc aagtcatgaa gggaacgatg acaacgggtg ctttggtcgg 1680
atgttctatt ttgacttccc gcatgattgc ccctttggca caattagcgg gtttcttttt 1740
gcgttttcaa caagcacgcg ttgcccgtga agggctggat tctttgatga gccgtccggc 1800
ggatcgtgcg gatcaggcgc aattagtgca attacccagc attcgcgggc aatatcaatt 1860
tgaaggcgtt cgtttcctgc atgacccaaa atcgggacga cctgatctcg atattcctaa 1920
gctggttatc cgtcccggtg aaaaaatcgc cttattaggt cggaatggcg cgggtaaatc 1980
gacctttctg cggatgttat ctggcctcca tcagccttcc aatggccgga ttatgttaga 2040
tggtatcgct ttaccgacga tagatcccgc ggatttgcgg cgtgacattg gcttgatgac 2100
ccaagaagcc aaaatctttt atggtagttt gcgcgataac ctgaccatgg gcgcgccttt 2160
ggcgagtgat agtcaggttt tggcggcttt ggatatggtt ggattgaaaa ccattttgga 2220
tcagcgagcc gatggtctcg atatgttatt gaaagagggc ggtggtgaat tatccagagg 2280
acaacgccaa tcaatccttt tagcgcgttt gattttatca gagccttctg tcgttttatt 2340
ggatgagccg accgctcatt ttgatgaaat gtcagagcat catctgatta acaatctgac 2400
cccttgggtg aaaacccgca gcttgatcgt ggcaacccat cgtcaaagta ttttgcgctg 2460
ggtcaatcgt attatcatcc ttgataaagg ccatatcgtt atggacggtg atcgggattc 2520
tgttctgaaa aggctgacca atggctaacc tttccttgtc cacccagagc atggtcgatg 2580
atcgtgaccc tttgcatctt ccggcacgga ttgtctgggt cgttgtggtg atgttgctgt 2640
gcttttttat ttgggcagcc tgctttacgc ttgaagaagt ttcaaccgga acagggaagg 2700
tggtgccgtc ctcgcatgaa cagaccatcc aatctttaga aggtgggatt cttgtccgat 2760
tgaatgtcaa agagggcgat attgttcagg ccggacaaat gttggcgcag cttgatcgca 2820
cccgcaccca atcttcggtt gaagaaacgg ctgcgcgtgc tgtggccgca gaggcaacgg 2880
cggctcggtt gcgggcagag gtgaataata ccccgatttc ctttcccgat tctgtgaaag 2940
cctatcctgc tttggtgaaa tcagagactg atctttatcg ctctcgccgc aatagtttgg 3000
ctatgggatt gagcgatctt catcagcaat tggctttgat taaaaatgaa ttgacgatga 3060
ccgagccact ggtggcaagg ggggcggcta gtgatgtcga ggttttgcgt ttgaaacggc 3120
aggtaagcga aatcgacact cgcgccgatg atatgcaaaa tcaatatatg gtgaaggcca 3180
gagaagacct tgaaaaagcc gaggcagagg cgaaagccca gcaatcggtt acgaaagggc 3240
gttctgatat gttagatcgc ttgaccttta cttcgcccgt aaggggcatc gttaaggata 3300
tcgaagttac cacgaaaggc ggcgttattc cgcctaatgg tcgtttgatg acgattgtgc 3360
ctttggatga acaattattg gtcgaggcac ggatatcacc tcgggatatt gcttttattc 3420
atcccggtca gcgggcaacg gtcaaattga ccgcctatga ttacgctatt tatgggggct 3480
tgcctgcaaa agtgacggtt atctcaccgg ataccgtgca ggatgatgtc aggaaagata 3540
gctattatta tcgcgtctgg gtacgcacgg attccgatca tctaaccaat aaatctggcc 3600
ataaatttcc tattgttccc ggtatggtgg caacaattga tattcataca ggatca 3656
<210> 64
<211> 3848
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Nucleotide sequence of downstream of D-lactate dehydrogenase
(ZMO1237)
<400> 64
tttcttttgc agtgttctgt cagcctgaaa atatctataa tagctgtttt caggttgcct 60
tttcctaacg catgcaaccg aaaacgaggc ttggggttta gccttgcaag aataaaaaga 120
aggaagcgag aaagagaacg gtatgcgcgt tttaatcgtt gaggatgagc cgacgctttc 180
ccgtcagttg cgaacaactt tggaaggggc tggctatgct gtcgatctgg cgacagatgg 240
cgaagatggc catttcctag gctcgagcga aaattatgat gccgttgtcc ttgatctcgg 300
tttgcccgaa gtcgacggtc tcaccgttct tgatcgttgg cgcaaagaag gccgcgaaat 360
gccagttctg gttctgactg cacgggatag ctggtctgat aaagttgctg gtcttgatgc 420
tggtgctgat gattatctga ccaagccttt ccagaccgaa gaattgattg cccgtttgcg 480
ggctttgatc cgacgggctt ccggtaatgc gtcttctgaa ttgacggcag gtgatgtccg 540
gcttgacact cgttccggca aagtgacttt agcgggtgag cctgtcaaat tgacggcgca 600
ggaatataag ctgctttcct atctgatgca tcataaaggc aaagttgtca gtcgcaccga 660
aatgatcgag catatttacg atcaggattt tgatcgcgat tctaatacga tcgaagtctt 720
tgtaacccgt attcgtaaga aactggggca ggatgttatt acgactattc gcggtttggg 780
ttatgctttg aacgacccag aggatcggaa taacggctga ttatggcttc cgcttcttcc 840
cctagcggtg gccgaaagcg tttttttagt cgtttctttc gccggaaaaa aatcgaaaaa 900
agcggaaatc cggtcggaga aaataacagt caggagccgg taatacgtcc taccggttct 960
ttgacccgcc ggttgattgc tatttcggct ttgtggatat ttatcctgct atcgggcggc 1020
ggcgtaacct tggatcgggt gctgacccaa gccgtcaccg ataattttga cagccagctt 1080
gattatgttt tggcggcgat gatcgcttct tctgaaattg atcccgaagg ggcggttcga 1140
ctgaatcggc ctttgggtga ccagcgtttt ttggaagccc atagcgggct ttattttcag 1200
gtgagcggta gcggatatga aagatttccg tccccttcac tttgggatcg ctcgctacaa 1260
gtcaatccga tgcctaaagg gcaattggtg cggacatatg atagcgacga attttctgat 1320
ggcactttgc gagtgatgga acgggatgtc cgcttacccg gttcgtctgt tttatggcga 1380
ttccaagtcg ctgaaattcg tacttcttta gacaatcaga ttaaaaaatt acgccatacc 1440
cttgtgaaag cctttttgat tttaggcacg gggttgattg ttattaccgt tttacaggtg 1500
acgatcggat tatggccgct gcggaaatta aggcgcgaga ttagtgctgt ccgtaatggt 1560
caggcttcgc gtattcatga ccggatgccg aatgaagtcg cccctttgat tgaagaattg 1620
aacgctttgt tgtctcataa cgaacggcaa gccgaagagg ctaggcgaca tgctggtaat 1680
ctggctcatg ccttgaaaac gccattaacg gttgtgacta atgaggcgaa tgccaatagc 1740
gatgccttga aagaagttgt tttgcgggag gtgatgacca tgcggcggca tgtcgatcat 1800
catttggcgc gagcgcgggc tattggacgg cggggcaatg cccaaagcca agcagaggta 1860
tggcctgctt tactggcggt agaacgcgcg gttactcggc tttatcctca tgcaacgatt 1920
gatcttgcag gagttaagga cgctgttgtc agaatagaaa gacaagatct ggacgagatt 1980
ttgggaaatc ttatagaaaa tgctgctaaa tatggtcagg gacgcgtttt tgttacggta 2040
gaaaaacagg gtaagtcggt tgaaatcctg attgaagatg atggcacggg tattcctgaa 2100
aatctccgtg ggcagttgtt taaacgcggg gcgcgtttgg atacagataa acccgggact 2160
gggttggggt tggcaattgt tcgcgatgtg gtcgaaattt atggcggcag tgttactttg 2220
gaagaaagtg aagatttagg tggcctgttt gtccgtctgg cattgccatc agtacattaa 2280
attcacgatt tgatgggatc cgcataaagg gttttgcata gccctgctat ttgtctgttc 2340
tgatagacaa agtattattt tgaaacggta tctttttgct ctcttggttt ttctgtggcg 2400
ttaaagtgct ttagcttggg gtagtgtgaa gacatagatt tttgatattg ttttctatcc 2460
ctttgacggg atcttgttgg ggagaaaaag gctgtccgat ttcgggaatg caaggctggc 2520
gtgtcatgac gtgagttgtt tgagaggcga ccgcttactg tttacccatt tgtcttttga 2580
agtgaaggct ggtgaggccg ttttaataac gggggcaaat ggtattggta aaagcagcct 2640
tttgcgtctg ttggcgggtt ttctgaaacc tttttcgggt catattgaaa aatggggtcg 2700
ggtggctttt gcggatgagg ctttggcaat ggatcggcat ttgcctttag aaaaagcctt 2760
ggcttattgg gcggctttag atggtgtttt gggcgctgaa aaagaagcaa tggcggtgat 2820
ggctcttgat atattggcgg attcacctgt ccgtttgctc tccactgggc agcgtaaaag 2880
agctgtgttg gcgcgtttgt tggcaagcca ggctgctatc tggttgttgg atgaaccggc 2940
aaacgggctt gatgcggctt ctgttagggc tttgatcgaa atgatagagc accatcgcca 3000
aaagggcggg attattttgg ctgttagtca tcaagggctt gatatggctg attataaaac 3060
cttgtcttta gaaaatttcg tagcgaattc tggccagtca tcaggtttct ttgacctttt 3120
ggatgaaagt catttctctt gatccggctt gttttgttaa ttcgtcggga ttgctcgatt 3180
ttgatcgggg caggggtatt tctacctgtc ttgttttttt tattggttgc cgttctattc 3240
cctttcgcgg tgggcagtga cgctataatt ttatcgcgta ctggtagcgg aatattatgg 3300
gttgcagctc tgttggcttc tttgttaccc attgaccgtt tgattattcc cgatgtcgaa 3360
aatggctttt tcgatcatta tgcggtgcgc gggattagcg aagaatggat agctgtggcg 3420
cgtattatcg cccattgggt gagttttgct gtccctttaa tggtggcgtt gttacccgcc 3480
tcggctttgc tatctttgga ttggtctgtt ttctggaaat tggaagccgg atttttattg 3540
gctactcctg gactggcctc tttgggggtt atgattgccg ctttgacggc aaggataaag 3600
tccggaagtg ggttggctgc tttactttta ttgcctttgg ccgtgccgct ccttatattt 3660
ggcgcggggg ctgttgatgg tcatcagcct ggggccttcc tattattggc ggcttgttcg 3720
ttgtttttgc tcgctgtcgc gccttttgtc atcggtgccg ctttgcgcgt cggacaagat 3780
gggtaaaagg cttactgtat cgatttaagg caggctttgt gattgatgaa gtcgagataa 3840
agagtgac 3848
<210> 65
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Dldh-F
<400> 65
tgtttcaggc ggccgctatt ttaagtc 27
<210> 66
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Dldh-R
<400> 66
tctttatcgc ggccgcatca atcacaa 27
<210> 67
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Del-DldF
<400> 67
tttcttttgc agttaactgt cagcctgaa 29
<210> 68
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Del-DldR
<400> 68
tgatcctgta tggttaacaa ttgttgcc 28
<210> 69
<211> 3844
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Nucleotide sequence of upstream of Alcohol dehydrogenase I
(ZMO1236)
<400> 69
cttactcaat ggaacggcac catgatctga ttgcccgtat ggctggcaag tcaggggtcg 60
gttacgaaat gttgggtaaa agcctcgatg gtcaaagcat ggattgcctg acgatggggg 120
aagggcggcg ctctatctgg ttgatcgcac ggcaacatcc gggcgaaacc atggccgaat 180
ggtggatgga aggcgctttg gaaaggttaa ccgatgaaaa tgactcggtt gcgcgcctgc 240
ttcgccaaaa agcccgcttt catatcatgc ctaatatgaa tccggacggt tcttgccgtg 300
gtcatttgcg gacgaatgct tgtggtgcca atctcaatcg tgaatgggca gaacccacgg 360
ctgaacgcag ccccgaagtg ttggacgttc gcaatcatat ggacaaaacg ggcgttgatt 420
ttgtcatgga tgttcatggc gatgaagcta ttccgcatgt attccttgcc ggttttgaag 480
gtatccccga tctcgacaag gcacaggata aattattccg ccgctaccgg aataaattgg 540
ccaaatacac gcccgatttt caacgtcatt acggttatga aaatgacgag ccggggcagg 600
ccaatctagc cttggcgact aaccaattag cctatcgtta caaggcggtt tcgatgacgc 660
ttgaaatgcc tttcaaagat catgacgata tgcctgattt gaaaaaaggt tggtcaccgg 720
aaaggtcaaa acaattaggc cgcgattgtc tcgctatctt ggctgaaatg attgatcagc 780
tcccgatctc tggcaaagat ctcgcgtaat aaaactatca ggcgcaatcg taattttgcg 840
tctgatagag cttttcataa aggctataac cgctattgcc aaaagccata ggcctgcata 900
atctgacggc gaataatttt cctgaaagat tggcggccat ttttgctgac cgcacagatt 960
gtcagcgtta attatacatg gcttcttttg ttgattcggg aactgcaagc gtttaccgga 1020
acaacacata acgaagagat attgaaaagg agtggaatat gcccacgctc gttttgtccc 1080
gtcacggaca gtccgaatgg aaccttgaaa accgtttcac cggttggtgg gatgttaacc 1140
tgactgaaca gggtgttcag gaagcaacgg ccggtggtaa agctctggct gaaaagggtt 1200
ttgaattcga tatcgctttc accagcgttc tgacccgcgc catcaaaacc accaatctta 1260
ttctcgaagc cggtaaaacc ctttgggttc cgaccgaaaa agattggcgt ttgaatgaac 1320
gtcactatgg tggtctgacc ggtctgaaca aggctgaaac cgccgctaaa catggtgaag 1380
aacaggttca tatttggcgc cgttcttatg acgttccgcc gcccccgatg gaaaaaggca 1440
gcaagttcga tctgtctggc gatcgccgtt atgatggtgt caagattcct gaaacggaaa 1500
gcctgaaaga caccgttgct cgcgtgctgc cttattggga agaacgcatt gcccctgaac 1560
tgaaggctgg caagcgcgtc ctgatcggtg cgcatggtaa ctcactgcgc gctctcgtta 1620
agcatctgtc gaaattgtcg gacgaagaaa tcgtcaaatt cgaattgccc accggtcagc 1680
cgttggtcta cgaattgaat gatgatctga ctccgaaaga tcgttacttc cttaacgaac 1740
gttaatagcc ttgggctttt aaagcctttt ggtttgttaa ccgttttttc ggccagagtt 1800
ttctctggcc gaaaatttat gtctatccct ttgtttttct atccccatca cctcggtttt 1860
gttgacaaaa aaaggtggcc actaaattgg ctttccgcac cgatgggatg atttttattc 1920
tttgctattc ttcgctcttt gcccaattca ttaaaagcgg aaatcatcac caaagataga 1980
agacgcagcc ttcaccattt cagattgccc ttctcgggca ttttctgctg ctagaatcct 2040
cttaaaaata ttaaattcca ctctattggt aatatgtttc cctctttagg gaacaaataa 2100
agcccttctt tgttctataa aagttagctt accgatttta caaaaaataa taccgcttca 2160
ttcaatcggt aatacatatc ttttttcttc aaaaaacttt tcaagagggt gtctatgcgc 2220
gtcgcaatat tcagttccaa aaactatgac catcattcta ttgaaaaaga aaatgaacat 2280
tatggccatg accttgtttt tctgaatgag cggcttacca aagagacagc agaaaaagcc 2340
aaagacgcag aagctgtttg tatctttgtg aatgacgaag ccaatgccga agtgctggaa 2400
attttggcag gcttaggcat caagttggtt gctcttcgtt gcgccggtta taacaatgtc 2460
gatctcgatg cggccaaaaa gctgaatatc aaggttgtgc gcgtgcctgc ctattcgccc 2520
tattcggttg ccgaatatgc agtagggatg ttgctcaccc tgaatcggca aatttcacgc 2580
ggtttgaagc gggttcggga aaataacttc tccttggaag gtttgattgg ccttgatgtg 2640
catgacaaaa cagtcggcat tatcggtgtt ggtcatatcg ggagcgtctt tgcccatatt 2700
atgacccatg gttttggtgc caatgttatc gcctataaac cgcatccaga ccccgaattg 2760
gcgaaaaagg tcggtttccg cttcacctct ctcgatgaag tgatcgagac cagcgacatc 2820
atttcgcttc actgtccgct cacgccagaa aatcatcaca tgattaatga agaaacactg 2880
gcaagggcaa aaaaaggctt ttacctcgtc aataccagtc gcggcggctt ggttgatacc 2940
aaggcggtga ttaaatcgct gaaagccaaa catctcggcg gttatgcggc ggatgtttac 3000
gaagaggagg ggcctttatt cttcgaaaat cacgctgacg atattatcga agatgatatt 3060
ctcgaaaggt tgatcgcttt cccgaatgtg gttttcacgg gacatcaggc ctttttgacg 3120
aaagaggcct tatcaaacat tgctcacagt attctacaag atatcagcga tgccgaagct 3180
ggaaaagaaa tgccggatgc gcttgtttag tagacaagcg acaattaacc ttttgaagat 3240
cataatgatc aaatttttgg gttaattcgg tagttatggc ataggctatt acgcgctaat 3300
tgatatcaaa aaaaagcata gccggacatc ataccggcta tgttttttat taggaaaaaa 3360
tttcctttca ccttgcttag ccatcgccgc attatttaat caatatgccg agtttttctt 3420
gaaatcccta tcttacacca aggccaacaa gggaatcatc catactcggt gtcctatcct 3480
atgacttttt aaattttctc caaatttact aaaatcacgc catctcagcg gctgctattt 3540
tcaaaaagcg cctctcaaaa ccgctttttc ctgctcaaat atcggatccc aaaattccct 3600
caaaaaaggc agggtatttt ttacaaaatc gcccctaata tctctcaatc cgctgccttg 3660
ttcatatgtt tttgcaaatg atttttatta aactttttta ggcgtatttt tatcaagaaa 3720
atttaaataa tcacattttt attattttag atttaagtat tgatacaagt gatatctata 3780
aatgttttta taactttctg gatcgtaatc ggctggcaat cgttttccct atattcgcaa 3840
gatg 3844
<210> 70
<211> 3861
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Nucleotide sequence of downstream of Alcohol dehydrogenase I
(ZMO1236)
<400> 70
accagaaagg ctttttcttt gtcgtctgat aaaaattttc atacagaatt taatacagca 60
atcggtgcta taagccgcta tccaagcttt tttcttctca tgccttctat tcggcaatcg 120
ctatttaaag gctgttttta tggggcattc gccctatata taaggatatt agcgtttata 180
tataatagaa ggaaatctgg ccttgggtga aacaaccctc caagcagcgc cccatgccca 240
tattcaacat agcggctccg atttattgga agcggccaag gcggctttat tgaaatcggg 300
tgagcaatgg acagccatgc gtgcctccgt ttacaaagcc ttggcacaaa ccaacaagcc 360
aagttcagcc tatgatattg ccgatattgt ctctcaatcc gaaggacgca gagtagctgc 420
caacagcgtt tatcgcatcc tcgacatctt cgtcagtagc aatctcgcgc atcgggtcga 480
aagcgctaac gcctatatcg tcaacgccca tcctgaatgt cgtcatgact gcctttttct 540
cgtctgcgac caatgtgggg gtgtgattca tatagatgat gacaagatca gccgcttttt 600
aaaagaatcg gcagaaaaaa acgattttgt tgcagaaagg tctgttttag aaatacgggg 660
taaatgttca cattgtcttt cccattaacc taaatgtacc tcaggttaac ctgttgcaat 720
gactctatta cctgctatga ttttgtaact tttatgtcgc agtcagggct tatcttggct 780
aatttgggtt cctgctgttc acctttaggg cgaattgttt tactaaacag gcttaaattt 840
cggtttgatt taaggcccta agcttatgtt tccgaatgac aagacgccgc tgttagacaa 900
gatcaagaca ccggcagaat tgcgtcaatt agatcgcaac agcctccggc aattggcgga 960
tgaattacgg aaagagacca tctcggcagt gggtgtgacc ggcggacatc tcggttccgg 1020
tctgggggtt atcgaattaa cggtagccct tcactatgtt ttcaacacgc ccaaagacgc 1080
tttagtctgg gatgttgggc atcaaaccta tcctcacaag attttaacag gtcgccgcga 1140
tcgtattcgg acattgcggc aacgtgacgg cttatcgggc tttacgcagc gcgcggagag 1200
cgaatatgac gcttttggag ccgcgcatag ttcgacttct atttctgcgg cgctcggctt 1260
tgcgatggcc agcaaattat ccgacagcga cgacaaagcg gttgcgatta tcggtgatgg 1320
ctcgatgacg gcaggcatgg cttatgaagc catgaataac gccaaggcgg cgggtaagcg 1380
cctgattgtc attttgaatg acaatgaaat gtcgatttca ccgccggtgg gtgccttatc 1440
gtcttatttg agccgcctga tttcctcacg gcctttcatg aatttgcgcg atatcatgcg 1500
cggcgttgtt aaccggatgc caaaaggctt ggcaacggct gcccgcaagg ctgatgaata 1560
tgcgcgtggt atggcaaccg gtggcacctt ctttgaagag ctgggctttt actatgttgg 1620
ccccgtggat ggtcataatt tagatcagct cattccagtt ttagaaaatg tccgcgatgc 1680
caaggacggc cccattttgg tgcatgtcgt cactcgcaaa ggccaaggct atgctccggc 1740
tgaagcggcc aaggacaaat atcacgccgt gcagcgcttg gatgtggttt ccggtaagca 1800
ggcgaaagcg cccccgggac ctcccagcta tacctctgtt ttttcggaac agctgatcaa 1860
ggaagctaag caagacgata agattgtgac cattacggca gctatgccga ctggcaccgg 1920
tcttgatcgt tttcagcaat attttcctga aagaatgttt gatgtcggta ttgccgaaca 1980
acatgccgta acctttgcgg ctggtttggc ggctgccggt tacaagcctt tctgttgtct 2040
ctattcgacc ttcttgcagc gcggctatga ccagttggtg catgatgtcg ctatccagaa 2100
tttgccggtg cgcttcgccg tcgatcgtgc gggtcttgtc ggtgccgatg gggcaaccca 2160
tgcgggtagc ttcgacctcg cctttatggt taatctcccg aatatggtcg tgatggcgcc 2220
ttccgatgaa cgggaattgg ccaatatggt gcatagcatg gcgcattatg accaaggccc 2280
gatctcggtg cgttatccgc gtggtaatgg tgtgggtgtc tccttggaag gtgaaaagga 2340
aattctgcct atcgggaaag gtcgcctgat ccgtcgcggt aaaaaggttg ctatcctatc 2400
tctcggcact cgattggaag aatccttgaa ggctgctgat cggcttgatg ctcaaggttt 2460
gtcgacatcg gttgctgata tgcgttttgc taagcccttg gatgaagcgc tgacccgcca 2520
acttttgaaa agccatcagg tcattattac cattgaagaa ggcgctttgg gtggttttgc 2580
aacccaagtc ctgacgatgg cttcggatga aggcctgatg gatgacggat tgaaaatccg 2640
caccctgcgt ctgccggatc ggttccagcc gcaagacaag caagaacggc aatatgccga 2700
agccggtctt gatgctgatg gcatcgttgc tgcggttatc tccgcattgc atcgtaattc 2760
taaacccgtg gaagtcgtcg aaatggcgaa tatgggtagc atcgctcgcg cttaatttgc 2820
tattagggag cctcggctcc cgacaatagt aaagagatca tatataatgc tacatccggt 2880
tgttttgtgt ggtggttcag gtacacgtct tttcccgtta tcccgccgga gccatcccaa 2940
acaactcctc agcttgatgg gcgaaaatag cctgtttcag gacgctgtcg cacgtgtaac 3000
agattcttct ctattcacgg cacctcttgt tatctgcaat gaagaatacc gttttactat 3060
tgcagaacag ttgcaggaaa tgggcgttaa ggctcaagag attgtccttg agccagaagg 3120
ccggaacaca gcgcccgcga ttgctttagc ggcgtcaatg attgcagata aagatcctga 3180
tgcctgcatg ctgatcttac cgtcagatca cgttatccgg gatgtcaaag cattccatga 3240
agcaatcaaa gatgccgaaa ctattgcccg taaagcaaag gcacttgtga cttttggcgt 3300
acgcccaacc tctcctgaaa caggttacgg ttatatcgaa atgggtgaag cgctacctat 3360
agcgggtggc tatcatatcg acagattccg tgaaaaaccg gatatcaaga cggctgaaga 3420
ttacttagcc agtggtcgtt ttctctggaa tagcgggatg tttctttttc ccgtatcgcg 3480
gatattagaa gattttgcgc tttatcaatc cgatattttg gatgccgtta aagcctcttt 3540
acgcaagagc caaaaagacc tcgattttac gcgcctagat gcagaatcct ttgcgaaagc 3600
gccctctatt tcaatagatt atgcgatcat ggaaccggcc cataacagag ccgttgtccc 3660
cgttaatatc ggatggagtg atgtcggatc atggtcgtcc ctttgggcaa tcagtgatca 3720
tgacgataat ggtaatgttt taatgggcga tgtggtcgcc gaagattctt ctaattgtct 3780
tatccgctct gaaaacggct tggtcgcgac acttggcgtt aaagacctaa ccattatcaa 3840
cacttcagat gttactttgg t 3861
<210> 71
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Adh1-F
<400> 71
actcaatgga actgcagcat gatctga 27
<210> 72
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Adh1-R
<400> 72
accaaagtaa catctgcagt gttgataatg g 31
<210> 73
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Del-Adh1F
<400> 73
ttgcgaatat agtttaaacg attgc 25
<210> 74
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Del-Adh1R
<400> 74
accagaaagg tttaaacttt gtcgtc 26
<210> 75
<211> 3986
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Nucleotide sequence of upstream of Alcohol dehydrogenase II
(ZMO1596)
<400> 75
cataaccgac atgcaaaata gccacccgca tttttttggg cgtgacaaaa caagcaccat 60
agccaatcgc ctcaccggcg ctgacttctc ttacctgaat ggcttgggcg gcaatagcaa 120
cgacgggttt cagaatatct ttggattgcg gaacaggcag gccgccgtaa agcgccaagc 180
ccggacgcgc cagatcaaaa tgatagtctt tgctgagaaa aataccggca gaattagcca 240
aactatagcg ttttgcctgt tttctggcgg ctaaaatccg aaagcgttca agctgctttt 300
gattaagcgg gtgatctgcc tcgtctgcac aggccagatg gctcaaaata ttgtcgatag 360
aaagaccatc cagcaggcct gaacccgcct cttccatcga aagacccagc cgattcattc 420
cagtatcgac catgacatcg cagggacggt tcggcgcgtg agctttccag cgggcaatca 480
tcgctggact acataaaacc ggcttgaccg aagaattcag agcatagccg aggtcatctt 540
cccttaggcc atggagaaca gaaagggaga aatccttttc cgaactatcg agtaagcgag 600
cttcatccca actggaaaca aaaaaatcgc gacatccggc ctgtgccaga taatgacgaa 660
cgcgttcagc ccctaaacca tagccattag ccttgatcgc ggcaccacaa tgaccagccg 720
ttatccggtt caaactttgc cagtttgcca tcagggctga tttgtctaat tccagacgga 780
gaggagaaga aatctgcact cttttttaat aagactgaaa aagcagtcag gcaagcaccg 840
aaatcggctt tatacctgac tgcttttcat catggatcaa aattagtttt tggctgcgag 900
taaatcctcg agatagctat gggttttatc gattttctca aggcgcgggt aacgcaagcc 960
gtcataataa ggaatcgcga catcccgata attatcgcct tgcttgatga gcaatttgat 1020
cggcgtttta ttggccttgg catttttgat cgctgttttt agcagatcat tgctaaaggc 1080
atgaccatca accgcgacca attcacttcc tacggtcaat ccagcgttaa aggcagggct 1140
atcccacatc accgaagaga ctttgccttt ttcagaagtc gataatccca aagagaaaga 1200
caactcggcc atatggcgtg cgccttcaac acctttgatc cagtcggttg gctcatcact 1260
gtaaaccagt ttgtaaccgc cacggctgat ccagtccaaa ggcgcatggg tcgaacgctg 1320
attcaaacgc tggttaaaga aggctgccca gtcataaggc atgatgtcat ttaaggtttt 1380
gacgacatcg tcaaaattat aggttaactc accccaatca cggtcacgca ttccgaaaaa 1440
ggcttttgca aaatcgtcaa gcgaatgttt gccatgagtt tgttgccgga gcaggctatc 1500
aacatcaagc cagatcaact gaccttcact gtagtaatct tcggaacgtt gccagcttag 1560
ccagcctttg gggcggcgtt gcgaaataat cggatcatta gtggtatctt ccaccggacg 1620
ccaacggcgg cctgcccgat tgtcgtaagt ggcggccacc aaagccaagg cttccaaggc 1680
atctttttgc tgccacagac cggaacgcgc ggccaataca taaccccaaa actgggtttg 1740
accttcataa acccaaagga ggctatcccg catcggcgtt ttatagtccg gtgtccaaag 1800
atcagcgggg cggcgatatt taccattcca gctatggtta tattcatggg cgaggagatc 1860
acgaccaacg gctgatttat cccatttcga gaagtaatca gccccttccc catcttcgga 1920
agattggtga tgttctaaac caataccacc gagcttttcg gacaaagcca gcaagaaatc 1980
ataatggcta taatgttgtg cgccgtaaag ttttacggct tgggttatga gctggcgatg 2040
cgcgttaagc tgtttgtccg tcatcaccat atcttcgggt ttgtctgcta taagattgag 2100
acgaaccccg ggggcgagcg tttctgtccg cgtataacga cccgccatta ccggcgaatc 2160
aattagcgta tcaaaatcgg tagttttata ttggacgaca ttgggtgtct gtccatcagg 2220
cgtgatacca gaaatttcta aggcagaagc cgatttccaa cccgttggat aaataacggt 2280
cggctgtatc tggatttggc gggtaaaata tccggccgga tataaagcca gcgtattcca 2340
ctgcaaattg accatttccg gtgtggactg gattcttccc tgcgactccg aagtcgggga 2400
gagatattga tattgggcgg tgatttcggt cacgcctgcc ggaatatcaa gatgaaaggc 2460
ataaacatcg acagaatcgc gttgccaagg aataacctga ttattggcgg taacaatcaa 2520
acctgccaat ttttcgatgg gacctgatgg actatgatgt cccggcaacc attcaggata 2580
gagcaaagtc agcgcaccag cctgaacagg aatcgtttcc gttacccgaa caataccgcg 2640
ctgcgtgtct gtggcatcga cattaagacg aatgagaccg ctataaggtt tatcaaccgc 2700
agccggaatc gtttcagata tcgccatagg ttgaggtgca gaatttccag ctggtatcgc 2760
ttgtgcctgc caagcgatgg cactggtcgc tagcaaaaat agcaaggaac gcttcataaa 2820
aatatatccc cccgttgaat cattgtttcc aaaacagcat catcttactg atttttgttt 2880
aaaaacaaca aagattgtct cgtcgagact gtaaatagat aaaatatccg cttccacata 2940
aaagcggcaa aaattttcaa aatttctttt attttttcat taccgctgca attttttttg 3000
tctttttgcg ttttttgagg aaagcctgat ctgccatttt gagcagaaga aagaacaagc 3060
tgcttttgat gcagcgtttg agacaattga ttagatcaaa aatggaaacg ataattttct 3120
tttttttcta tttttattat ggatgaatat ccctatttcg gcagagcggg tggcggtagc 3180
acttcccccc cctcctcctc aagctaccgc gacccccata gcttcttttc ctgactattc 3240
ccctgcatcc ttacaaatta ttcttttatt tctttttcac aatctatttg gatatctgaa 3300
aatgtcttta ttttaatgtt gtgcaattta tacagtatat ttcgccatat acgatatttt 3360
cttgttttct atttacaatt tggcttttaa tatttgaaca ataaattgga atgaatacct 3420
aacaactatg ttatttttag tcttatcttt ctctaaaaag cctcaaaaac gaacaaaata 3480
acagattctt caaaatttcc tttcttaaaa tttaacataa atgttttatt ttaaaatatt 3540
tcgcctgaaa tttattattt taatttaaag gcaaaatcgg taaccacatc tcaattatta 3600
aacaatactt cataataaaa agacaacttt ttcataattt gcataagtct tgatgtaaaa 3660
aatacatatt tagaaagaac aagcagcctt gctcatcacc gctgtcgcga gtagaaaaat 3720
ctcggctttc agaaaataga ggtcgcttcg ttaaacagac tataaatgtg ctggaataaa 3780
gcgaacccct tgatctgata aaactgatag acatattgct tttgcgctgc ccgattgctg 3840
aaaatgcgta aaattggtga ttttactcgt tttcaggaaa aactttgaga aaacgtctcg 3900
aaaacgggat taaaacgcaa aaacaataga aagcgatttc tcgaaaatgg ttgttttcgg 3960
gttgttgctt taaactagta tgtagg 3986
<210> 76
<211> 3868
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Nucleotide sequence of downstream of Alcohol dehydrogenase II
(ZMO1596)
<400> 76
ctgtcttgat tttcaagcaa acaatgcctc cgatttctaa tcggaggcat ttgtttttgt 60
ttattgcaaa aacaaaaaat attgttacaa atttttacag gctattaagc ctaccgtcat 120
aaataatttg ccatttaaag cctattatca ggattttcgc cccgatttca gccatggcag 180
aaatcttttc gggtttaata gcgggaaatt ctttgatagc tggccttttg ctcgcctgct 240
ttattatttt tacatccagg cggtgaaagt gtacagaaaa gccgcgtttg ccttatgaag 300
gcgacgaaat atttttcaga taaagtcttt accttgttaa aaccgctttt cgttttatcg 360
ggtaaatgcc taatgcagag tttgatttca ggcctatgtt tccgaataaa aagacgccgt 420
tgttagacaa gatcaagaca ccggcagaat tgcgtcaatt agatcgcaac agcctccggc 480
aattggcgga tgaattacgg aaagagacca tctcggcagt gggtgtgacc ggcggacatc 540
tcggttccgg tctgggggtt atcgaattaa cggtagctct tcattatgtt ttcaacacgc 600
ccaaagacgc tttggtctgg gatgttgggc atcaaaccta tcctcacaag attttaacag 660
gtcgccgtga tcgtattcgg acattgcggc aacgtgacgg cttatcgggc tttacgcagc 720
gcgcggagag cgaatatgac gcttttggag cagcgcatag ttcgacttct atttctgcgg 780
cgctcggctt tgcgatggcc agcaaattat ccgacagcga cgacaaagcg gttgcgatta 840
tcggtgatgg ctcgatgacg gcaggcatgg cttatgaagc catgaataac gccaaggcgg 900
cgggtaagcg cctgattgtc attttgaatg acaatgaaat gtcgatttca ccgccggtgg 960
gtgccttatc gtcttatttg agccgcctga tttcctcacg gcctttcatg aatttgcgcg 1020
atatcatgcg cggtgttgtc aaccggatgc caaaaggctt ggcaacggct gcccgcaagg 1080
ctgatgaata tgcgcgtggt atggcaaccg gtggcacctt ctttgaagag ctgggctttt 1140
actatgttgg ccccgtagat ggtcataatt tagatcagct cattccggtt ttggaaaatg 1200
tccgcgatgc caaggacggc cccattttgg tgcatgtcgt cacccgcaaa ggccaaggct 1260
atgctccggc tgaagcggcc aaggacaaat atcacgccgt gcagcgcttg gatgtggttt 1320
ccggcaagca ggcgaaagcg cccccagggc ctcccagcta tacctctgtt ttctcggaac 1380
agctgatcaa ggaagctaag caagacgata agattgtgac cattacggca gctatgccga 1440
ctggcaccgg tcttgatcgc ttccagcaat attttcctga aagaatgttt gatgtcggta 1500
ttgccgaaca acatgccgta acctttgcgg ctggtttggc ggctgccggt tacaagcctt 1560
tctgttgtct ctattcgacc ttcttgcagc gcggctatga ccagttagtg catgatgtcg 1620
ctatccagaa tttgccggtg cgcttcgccg tcgatcgtgc gggtcttgtc ggtgccgatg 1680
gggcaaccca tgcgggtagc ttcgacctcg cctttatggt taatctaccg aatatggtcg 1740
tgatggcgcc ttccgatgaa cgggaattgg ccaatatggt gcatagcatg gcgcattatg 1800
accaaggccc gatctcggtg cgttatccgc gtggtaatgg tgtgggtgtc tccttggaag 1860
gcgaaaagga aattctgcct atcgggaaag gtcgcctgat ccgtcgcggt aaaaaggttg 1920
ctatcctatc tctcggcact cgattggaag aatccttgaa ggctgctgat cggcttgatg 1980
ctcaaggttt gtcgacatcg gttgctgata tgcgttttgc taagcccttg gatgaagcgc 2040
tgacccgcca acttctaaaa agccatcagg tcattattac cattgaagaa ggcgctttgg 2100
gtggttttgc aacccaagtc ctgacgatgg cttcggatga aggcctgatg gatgacggat 2160
tgaaaatccg caccctgcgt ctgccggatc ggttccagcc gcaagacaag caagaacggc 2220
aatatgccga agctggtctt gatgctgatg gcatcgttgc tgccgtaacg gctgcattac 2280
aacggaactc aaagcctgtc gaagtcgttg agctgactac aaaagtaaca gaagatatga 2340
ctttatgatc caagttatct tttattctga atcgtccggt tgtaacagct aaggcgcttg 2400
ggctagccat acggattgat ctcgtgatat cggacacatc atgcatcgtt ttcttgtaac 2460
gcgtctcgca ggtataagct gtcgctttcc tctgcctgtt ctcgccttca cccttttctt 2520
aacgctggtc tctgcctatt tcgcggcgag ccattttgcg atcaatacgg atacggcgac 2580
ccttatttct cccaaggtaa cctatcgcgt caatgaagat agatttgccg atgcttttcc 2640
atctacaggg gggacaaccc tgatcgttgt ggaaggacaa acaccggaat tggcagaatc 2700
tgctgccgcc cgattaagcg agaaattggg acaggataaa aagcattttc tgacggtgac 2760
gcgacctgat ggcggcgaat tttttgcccg tgaaggtatc ttgttcggcc agttgccgga 2820
tgttcaagat acgatgcaac agctgatttc agcacagcct tttttaggcc ctctggcttc 2880
cgatccttct ttacgaggga ttaataacgc cctgaatacc atgttgatgg gggtcaaccg 2940
ccatatggct aatctggatc aaatccagac cccaatccgt tcgattgata aggctatccg 3000
tgaccagctt tctggaaaac agacatggtt ttcttggcaa ctgcttttct caagcaaaaa 3060
tccagcactg aaaccgcctc taaaacggtt aattttggca cagcctgttc ttgatctaag 3120
tgctttgatg ccggggattg aggccagcaa tgctattcat aaggccgcta gtgatctgaa 3180
attggatgcc gatcatggcg tcgatatccg tttaaccgga tctgtgcctt tggcggatga 3240
agaatttgct tctttagcgg ataaaatctg gttggttgca ggcgcaatga ttggcgcgat 3300
gcttatcacc ctgtggttgg cggtgcgttc ccccagtatt gttgcggcaa ttatgttgac 3360
gaccattgcc ggattgattg tgacggctgc ggttggtctg ataacagtcg ggcgatttaa 3420
ccttatttct gtcgccttta ttccgctttt tgtcggttta ggggtggatt ttgggattca 3480
gctttcggta cgttttttag ctgaattgga aacagaaccc aatcagccca cggcactttt 3540
gaacgctgcc aatgcgttgg gtcattcctt gttattggca gccggtgccg tttgccttgg 3600
ttttctgtcc tttttgccga cagcctatat cgggatttcc gaattaggga tgattgccgg 3660
tgtcggtatt ttgattgcct tgttcttctc ggtaacgatg ctgcccgcct ttttaatgct 3720
gtttcgccct cgtccaccgc ggcatcatgt gggttggcgc aatatggcgc cagtcgatca 3780
ttttctggtt aaagaaagac gttgggttat cggaagcttt ttggggctga ccctgattag 3840
catcattctt ctgccttggg tacaattc 3868
<210> 77
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Adh2-F
<400> 77
cataaccgac ctgcagaata gcca 24
<210> 78
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Adh2-R
<400> 78
tgtacccact gcagaagaat gatg 24
<210> 79
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Del-Adh2F
<400> 79
cctacatact agtttaaacc aacaac 26
<210> 80
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Del-Adh2R
<400> 80
ctgtcttgat gtttaaacaa acaatgc 27
Claims (10)
- 류코노스톡(Leuconostoc) 속 균주 유래의 D-락테이트 디하이드로게나제를 코딩하는 유전자가 도입된 자이모모나스 모빌리스(Zymomonas mobilis) 형질전환체.
- 제1항에 있어서,
상기 D-락테이트 디하이드로게나제를 코딩하는 유전자는 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 또는 서열번호 8의 아미노산 서열로 표시되는 펩티드를 코딩하는 유전자인 형질전환체. - 제1항에 있어서,
상기 D-락테이트 디하이드로게나제를 코딩하는 유전자는 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5, 또는 서열번호 7의 염기서열로 표시되는 것인 형질전환체. - 제1항에 있어서,
상기 형질전환체는 기탁번호 KCTC 11803BP 인 형질전환체. - 자이모모나스 모빌리스(Zymomonas mobilis) 균주를 준비하는 단계; 및
상기 자이모모나스 모빌리스 균주에 류코노스톡(Leuconostoc) 속 균주 유래의 D-락테이트 디하이드로게나제를 코딩하는 유전자를 도입하는 단계를 포함하는
자이모모나스 모빌리스 형질전환체 제조방법. - 제5항에 있어서,
상기 도입은 접합, 전기천공법, 및 유전자총 방법으로 이루어진 군에서 선택된 방법으로 수행하는 것인 방법. - 류코노스톡(Leuconostoc) 속 균주 유래의 D-락테이트 디하이드로게나제를 코딩하는 유전자를 자이모모나스 모빌리스(Zymomonas mobilis) 균주에 도입하여 자이모모나스 모빌리스 형질전환체를 제조하는 단계; 및
상기 제조된 자이모모나스 모빌리스 형질전환체를 배양하는 단계를 포함하는
젖산 생산 방법. - 제7항에 있어서,
상기 배양은 pH 3.0 내지 pH 7.0의 조건하에서 수행하는 것인 방법. - 제7항 또는 제8항의 방법에 의해 생산된 광학 순도가 95% 이상인 젖산.
- 제9항에 있어서, 광학 순도가 99% 이상인 젖산.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
KR1020110015911A KR101326583B1 (ko) | 2011-02-23 | 2011-02-23 | 고광학순도의 젖산 생산용 형질전환체 및 이를 이용한 젖산 생산 방법 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
KR1020110015911A KR101326583B1 (ko) | 2011-02-23 | 2011-02-23 | 고광학순도의 젖산 생산용 형질전환체 및 이를 이용한 젖산 생산 방법 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
KR20120096684A true KR20120096684A (ko) | 2012-08-31 |
KR101326583B1 KR101326583B1 (ko) | 2013-11-07 |
Family
ID=46886523
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
KR1020110015911A KR101326583B1 (ko) | 2011-02-23 | 2011-02-23 | 고광학순도의 젖산 생산용 형질전환체 및 이를 이용한 젖산 생산 방법 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
KR (1) | KR101326583B1 (ko) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN117778291A (zh) * | 2024-01-26 | 2024-03-29 | 武汉睿嘉康生物科技有限公司 | 运动发酵单胞菌的工程菌株、制备方法及应用 |
CN117778291B (en) * | 2024-01-26 | 2024-07-09 | 武汉睿嘉康生物科技有限公司 | Engineering strain of zymomonas mobilis, preparation method and application |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP3773283B2 (ja) * | 1995-06-22 | 2006-05-10 | ユニチカ株式会社 | D−乳酸脱水素酵素およびその製造法 |
KR100725021B1 (ko) | 2006-02-16 | 2007-06-07 | 주식회사 마크로젠 | 일차 대사산물의 대량 생산 방법, 대량 생산 균주 및 이의제조 방법 |
-
2011
- 2011-02-23 KR KR1020110015911A patent/KR101326583B1/ko active IP Right Grant
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN117778291A (zh) * | 2024-01-26 | 2024-03-29 | 武汉睿嘉康生物科技有限公司 | 运动发酵单胞菌的工程菌株、制备方法及应用 |
CN117778291B (en) * | 2024-01-26 | 2024-07-09 | 武汉睿嘉康生物科技有限公司 | Engineering strain of zymomonas mobilis, preparation method and application |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
KR101326583B1 (ko) | 2013-11-07 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
AU2018203835B2 (en) | Recombinant dna constructs and methods for modulating expression of a target gene | |
AU2020223680B2 (en) | Plant regulatory elements and uses thereof | |
AU2021221448B2 (en) | Modified plant | |
AU2022202248A1 (en) | Nucleic acid-guided nucleases | |
DK2588616T3 (en) | PROCEDURE FOR MAKING A RELATIONSHIP OF INTEREST | |
KR101511639B1 (ko) | 재조합 미생물 및 이의 사용 방법 | |
TW201144442A (en) | Production of DHA and other LC-PUFAs in plants | |
AU2021204330A1 (en) | Materials and methods for PUFA production, and PUFA-containing compositions | |
JP2018522569A (ja) | 組換え宿主内でのステビオールグリコシドの産生 | |
KR20070056002A (ko) | 울케니아의 pufa―pks 유전자 | |
CN113366009A (zh) | 用于生物合成大麻素的双向多酶支架 | |
KR20170116034A (ko) | 성 결정 유전자들 및 육종에 이들의 이용 | |
KR20200111172A (ko) | 네페탈락톨 산화 환원 효소, 네페탈락톨 합성 효소, 및 네페탈락톤을 생산할 수 있는 미생물 | |
CN111527211B (zh) | 生产霉孢菌素样氨基酸的微生物及利用其生产霉孢菌素样氨基酸的方法 | |
KR102003911B1 (ko) | 마이코스포린 유사 아미노산을 생산하는 미생물 및 이를 이용한 마이코스포린 유사 아미노산의 생산방법 | |
KR20210018219A (ko) | 발효 및 생산 중 곰팡이 형태를 제어하기 위한 신호 전달에 포함된 유전자의 조작 | |
KR20200026261A (ko) | 엑토인-생산 효모 | |
KR20170032317A (ko) | 담배 프로테아제 유전자 | |
CN113832043A (zh) | 具有提高的乳酸产生能力的重组耐酸酵母 | |
KR20210144816A (ko) | 키메라 플라스미드 라이브러리의 구축 방법 | |
KR20230078639A (ko) | 발효를 통한 4-아미노페닐에틸아민의 생산을 위해 조작된 생합성 경로 | |
WO2018211032A1 (en) | Production of steviol glycosides in recombinant hosts | |
KR102558303B1 (ko) | 재조합 실크 제조를 위한 변형 균주 | |
KR20120096684A (ko) | 고광학순도의 젖산 생산용 형질전환체 및 이를 이용한 젖산 생산 방법 | |
KR101243903B1 (ko) | 에탄올―저항성 효모 균주 및 이의 유전자 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A201 | Request for examination | ||
E902 | Notification of reason for refusal | ||
E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
GRNT | Written decision to grant | ||
FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20161028 Year of fee payment: 4 |
|
FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20171101 Year of fee payment: 5 |
|
FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20181031 Year of fee payment: 6 |
|
FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20191031 Year of fee payment: 7 |