KR100725021B1 - 일차 대사산물의 대량 생산 방법, 대량 생산 균주 및 이의제조 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 미생물의 대사 경로 중 특정 대사 경로를 차단하여 다른 일차 대사산물의 생산을 증가시키는 방법, 상기 특정 대사 경로에 관여하는 물질의 코딩 유전자가 변형되어 다른 일차 대사산물의 대량 생산이 가능한 형질전환체, 및 이러한 형질전환체의 제조 방법에 관한 것이다. 상기 일차 대사산물은 친환경적 생물 화학 물질로서 산업적 효용성이 높은 에탄올 등의 알코올, 락테이트 또는 숙시네이트 등일 수 있다.

Description

일차 대사산물의 대량 생산 방법, 대량 생산 균주 및 이의 제조 방법{METHOD FOR MASS PRODUCTION OF PRIMARY METABOLITES, STRAIN FOR MASS PRODUCTION OF PRIMARY METABOLITES, AND METHOD FOR PREPARATION THEREOF}
도 1은 본 발명의 실시예 1 및 3에서의 자이모모나스 모빌리스 (Z. mobilis) ZM4에서의 pdc (pyruvate decarboxylase) 유전자의 제거 과정을 보여주는 모식도이다.
도 2는 본 발명의 실시예 1에서 제작된 ZM4 형질전환체에서의 pdc 유전자 제거를 확인하기 위한 설계를 나타낸 모식도이다.
도 3은 본 발명의 실시예 1에서 제작된 ZM4 형질전환체와 야생형 ZM4 균주에 대한 전기영동 결과를 보여주는 것이다.
도 4는 본 발명의 실시예 2 및 3에서의 자이모모나스 모빌리스 (Z. mobilis) ZM4에서의 ldhA (lactate dehydrogenase) 유전자의 제거 과정을 보여주는 모식도이다.
도 5는 본 발명의 실시예 2에서 제작된 ZM4 형질전환체에서의 ldhA 유전자 제거를 확인하기 위한 설계를 나타낸 모식도이다.
도 6은 본 발명의 실시예 2에서 제작된 ZM4 형질전환체와 야생형 ZM4 균주에 대한 전기영동 결과를 보여주는 것이다.
도 7a 및 7b는 수소 공급 없이 배양한 경우의 pdc 유전자가 제거된 형질전환체(Δpdc)의 생장률 (균체량: g/L)과 일차 대사산물 생성 능력을 야생형 ZM4 균주와 비교하여 보여주는 그래프로서, 7a는 생장률을, 7b는 일차 대사산물 생성 능력을 비교하여 보여준다.
도 8a 및 8b는 수소 공급 없이 배양한 경우의 pdc 유전자가 제거된 형질전환체의 생장률(균체량: g/L)과 일차 대사산물 생성 능력을 pdc 유전자와 ldhA 유전자가 모두 제거된 형질전환체와 비교하여 보여주는 그래프로서, 8a는 생장률을, 8b는 일차 대사산물 생성 능력을 비교하여 보여준다.
도 9a 및 9b는 수소 공급하여 배양한 경우와 수소 공급 없는 경우의 pdc 유전자가 제거된 형질전환체 (KCTC 11012BP)의 생장률(균체량: g/L)과 일차 대사산물 생성 능력을 비교하여 보여주는 그래프이다.
도 10a 및 10b는 수소 공급하여 배양한 경우와 수소 공급 없는 경우의 pdc 유전자와 ldhA 유전자가 제거된 형질전환체 (KCTC 10908BP)의 생장률(균체량: g/L)과 일차 대사산물 생성 능력을 비교하여 보여주는 그래프이다.
도 11a 내지 11c는 ldhA 유전자가 제거된 형질전환체의 세포생장, 당소모 및 대사산물 생산 능력을 Z. mobilis ZM4와 비교하여 보여주는 그래프로, 11a는 세포 생장을, 11b는 당소모량을, 11c는 대사산물 생산 능력을 보여주는 것이다.
본 발명은 미생물의 대사 경로 중 특정 대사 경로를 차단하여 다른 일차 대사산물의 생산을 증가시키는 방법, 상기 특정 대사 경로에 관여하는 물질의 코딩 유전자가 변형되어 다른 일차 대사산물의 대량 생산이 가능한 형질전환체, 및 이러한 형질전환체의 제조 방법에 관한 것이다. 상기 일차 대사산물은 친환경적 생물 화학 물질로서 산업적 효용성이 높은 락테이트, 숙시네이트 또는 에탄올 등의 알코올 등일 수 있다.
산업혁명 이후, 인류는 석유화학공업의 발달을 기반으로 엄청난 발전을 이루었으나, 이로 인한 부작용을 간과한 무분별한 개발과 남용으로 초래된 환경 파괴라는 커다란 문제점을 남겼으며, 이는 반드시 해결해야할 문제가 되고 있다.
오존층 파괴 등 환경 파괴로 나타나는 이상 기후 등에 대한 인식의 변화로 말미암아, 전 세계는 이에 대한 자구책으로 더 이상의 지구 환경 파괴를 막기 위하여 환경 보호 대책인 기후변화협약 및 교토 의정서 (Kyoto Protocol)의 채택 및 발효 등의 노력을 기울이고 있다. 그러나, 이러한 일련의 환경 보호 대책들은 전 세계적으로 에너지를 많이 사용하는 석유화학공업의 광범위한 발달과 석유의존도가 높은 국가에 대한 경제적 및 사회적 파장이 클 것으로 예상된다. 특히 우리나라의 경우는 석유 의존도가 거의 100%에 달하기 때문에, 대체 에너지 및 자원의 개발이 시급한 실정이다. 또한, 현재 화학 합성법으로 생산되고 있는 대부분의 화학 물질들에 대한 생산 단가가 에너지 및 탄소세 등의 부과로 상당히 많이 상승될 것으로 전망되어 이에 대한 대체 생산법의 연구 및 개발이 요구되고 있다 (Illman, 1993; Takiyama et al., 1994; Yasukatsu et al., 1996).
현재, 미국을 비롯한 선진국의 경우, 이러한 일련의 급변하는 환경 변화에 대한 대비책으로, 이미 재생 자원을 이용한 화학 물질의 생산에 대한 연구 및 재정적 지원을 범정부적인 차원에서 시행하고 있는 실정이다. 구체적으로, 미국은 정부 주도하에 "The vision for plant/crop-based renewables in 2020" 이라는 프로젝트를 시행하여, 2020년까지 석유 및 가스로부터 생산되는 화학 물질 중 10% 이상을 발효법 등에 의한 재생 자원으로부터 생산되는 화학물질로, 2050년까지는 50%이상을 대체하려는 계획을 수립하고 있다. 이러한 미국의 장기적 대책은 환경 문제 뿐만 아니라 자국내의 안보 및 경제적 측면을 고려한 것이라 할 수 있다. 즉, 외국에서 수입하는 석유 의존도를 줄여 자국의 안보를 확고히 하면서, 자국의 농업 및 축산 산업의 활성화를 꾀하여 경제적인 안정성을 추구하려는 것이다.
이에 비해, 우리나라의 경우에는 정부 주도하에 재생 자원을 이용한 화학 물질의 생산에 대한 연구 및 재정적 지원 등을 준비하고 시작하는 단계이며, 장기적인 대책에 대한 청사진이 확립되어 있지 않은 상태이다. 특히 대체 에너지 개발 분야에서 활발한 연구가 진행되고 있지만, 선진국들과의 기술력의 차이로 인하여 단기간 내의 제품화는 힘든 실정이다. 그러나, 꾸준한 연구, 개발 및 이에 대한 투자와 환경 변화에 따른 기업들의 인식의 변화로 인해서 몇 가지 장기적인 대책이 수립되고 있는 것으로 보고되고 있으나, 아직 미미한 실정이다. 또한, 이러한 장기적인 대책은 우리나라 기업들의 투자 규모 및 환경에 미치는 영향이 크기 때문에, 선진국의 경우와 같이 정부 주도하의 민간 기업 연구 개발이 이루어져야 하며, 이에 대한 장기적인 대책 마련이 빠른 시일 내에 필요한 실정이다.
이러한 요구에 따라, 현재 재생 자원으로부터 생산 할 수 있는 대체 화학 제품에 대한 연구들이 진행 중이며, 이 중에서도 락트산과 숙신산이 유용한 생물 화학 제품으로써 그 가능성을 인정받고 있다. 락트산의 경우, 이미 생분해성 플라스틱으로 개발이 완료되어 생산에 돌입한 상태이며, 곧 시장을 형성할 것으로 보고 되고 있다. 선진국에서는 이미 정부 주도하의 연구가 활발히 진행되고 있으며, 미국의 Cargill사와 Dow사가 합작하여 락트산 중합체(PLA; polylactic acid) 생산 기술이 락트산의 발효 생산 연구와 더불어 개발되었고, DuPont사와 Denocor사가 합작하여 PTT(polytrimethylene terephthalate)의 원료가 되는 PDO (1,3-propanediol)의 생산 기술이 개발되었다. PLA은, 기존 개발된 섬유들과 비교하여, 습기 회복율, 탄성 회복율 및 자외선 흡수 면에서 우수한 성능을 갖는 것으로 조사되어, 생분해성 환경친화적 고분자로서의 가능성을 확보하였다. 기존 개발된 섬유로서 대표적인 나일론과 폴리에스테르와 친환경적 고분자인 PLA의 물성을 아래의 표 1에 나타내었다.
[표 1]
물성 Nylon Polyester Polylactic acid
비 중 (g/ml) 1.14 1.39 1.25
강 도 (cN/tex) 6.05 6.6 6.6
습기회복율 (%) 4.1 0.2-0.4 0.4-0.6
탄성회복 (5%인장시) 89 65 93
방염도 중간 우수 낮음
UV 차단 낮음 중간 우수
상기 표 1에 나타난 바와 같이, PLA는 나일론과 폴리에스테르 등의 기존의 합섬과 비교하여 대등하거나 우수한 물성을 갖는다는 것을 알 수 있으며, 이는 PLA가 화학적 합섬 제품을 대체할 수 있다는 훌륭한 대체재임을 의미하는 것이다.
또한, 또 하나의 유용한 생물 화학 제품인 숙신산 폴리머는 PLA 보다 높은 유연성을 갖는 것으로 알려져 있다. 2004년 미국 에너지국 (Department of Energy; DOE)은 미래의 바이오매스 유래의 고부가가치 화합물을 선정하여 발표하였다 (NREL, 2004). 당으로부터 생산할 수 있고 다양한 응용분야를 갖는 12개의 빌딩블록(building block)을 선별하였는데, 이들은 빌딩블록으로써 뿐 아니라, 생물학적 또는 화학적 방법에 의해서 보다 고부가가치를 갖는 화합물로 변환시킬 수 있는 응용성을 갖는다. 이들 후보 물질들에는 숙신산, 말산, 푸마르산, 글루탐산, 아스파르트산, 레불린산, 글루카릭산(glucaric acid), 3-하이드록시부티로락톤(3-hydroxylbutyrolactone), 글리세롤, 소르비톨, 자일리톨 및 2,5-푸란 디카르복시산(2,5-furan dicarboxylic acid, FDCA) 등이 있다. 이들 단량체들은 중합 반응으로 중합체를 만들 수 있으며, 이렇게 만들어진 중합체의 응용분야는 플라스틱 및 수지 분야, 의약 분야, 식품 분야, 화장품 분야, 농업 분야, 세제/유화제 분야, 직물 분야, 사진 분야, 촉매 분야, 방식 분야 및 도금 분야 등에 다양한 활용성을 갖는다.
상기 후보물질들 중에서 숙신산은 4개의 탄소로 이루어진 TCA 회로의 중간 생성물인 디카르복시산으로서, 비록 낮은 농도로 존재하지만 모든 식물 세포 및 동물 세포에서 발견되는 화학 물질이다. 숙신산 및 그 유도체들은 플라스틱, 식품, 의약품 및 화장품 산업 등에서 광범위하게 이용되고 있다. 숙신산의 다양한 이용 분야는 다음과 같다:
- 플라스틱 및 수지 분야: 아크릴 필름용 가교제, 수계 페인트에 사용되는 폴리머 성분, 전기 절연 테이프에 사용되는 폴리머 성분, 접착제용 수지 성분, 방사선 경화성 수지 성분, 페놀-포름알데히드 수지용 가교 촉진제, 등;
- 의약 분야: 독성 물질에 대한 해독제, 혈장 대체물로서의 숙신화 젤라틴, 제약 분야의 숙신산 유도체, 등;
- 식품 분야: 살모넬라에 대한 방부제, 향미료로서의 숙신산나트륨, 식용 계면활성제, 제과 연화제, 향유의 마이크로인캡슐레이션, 단백질 젤라틴화, 식품 조미제 제조용 촉매, 등;
- 화장품 분야: 탈모제 성분, 치약 및 세정제의 산성 성분 등;
- 농업 분야: 발아, 성장 및 생산량 증진을 위한 종자 처리, 식물 성장 촉진제, 토양 킬레이트제, 절화 방지제, 식물 성장 조절제, 등;
- 세제/유화제 분야: 페인트 분산제로서의 녹말 에스테르, 에스테르 계면활성제, 비닐 중합용 유화제 제조용 시약, 등;
- 직물 분야: 사이즈 제조, 방축 모직, 염색성 향상을 위한 폴리에스테르 수지 가공, UV 흡수제로서의 아라미드 섬유 가공, 정전기 방지제 및 방유제 제조, 등;
- 사진 분야: 현상 촉진제, 방무제 (antifoggant), 사진 스트리핑층, 등;
- 촉매 분야: 합성 고무의 기계적 안정성 강화제, 브레이크 오일의 고무 프로텍터, 모노카르복시산의 무수물화 촉매, 등;
- 방식 분야: 숙시네이트 이온 용액, 숙시네이트+숙신이미드, 지방산과 알카놀아민과의 반응 산물의 숙시닐화로 유도된 오일, 등; 및
- 도금 분야: 화학적 금속 도금, 애노다이징 알루미늄, Ni, Ag, Cr, Fe 및 Au 용 전기 도금조, 등.
숙신산은 석유 화학 공업의 발달과 함께 생산이 증가되고 있는 합성 고분자의 취약점인 난분해성을 극복할 수 있는 생분해성 고분자의 모노머 (monomer)로서의 이용 가치가 증가하고 있다. 현재 사용되고 있는 플라스틱의 1/3 정도가 비교적 단기간에 사용되는 일회 포장 용도로 사용되고 있어서, 이들의 폐기물에 의한 환경 오염 문제가 심각히 대두되고 있으며, 이들 플라스틱의 상당 부분이 생분해성으로 대체되어야 한다는 환경 규제 때문에 생분해성 플라스틱 사업은 각국의 비상한 관심거리가 되어왔다. 최근 차세대 생분해성 고분자로 여겨지고 있는 생분해성 지방족 폴리에스테르인 폴리부틸렌 숙시네이트에 대한 연구가 활발히 진행중이며, 그 주원료가 숙신산이다 (Kirk-other, 1979).
그러나, 현재 생산되고 있는 숙신산의 판매단가는 산업체가 요구하는 단가와 비교하여 비싼 상태이고, 또한 생산 및 정제가 효율적이지 못한 실정이다. 이러한 요인들로 인하여 숙신산은 현재 대부분이 화학적 합성 방법에 의하여 생산되어지고 있다. 즉, 말레산 무수화물(maleic anhydride)를 수소화(hydrogenation)하여 숙신산 무수화물(succinic anhydride)을 생산한 후, 다시 이를 수화(hydration)하여 숙신산을 생산한다.
그러나, 이미 언급한 바와 같이, 급변하는 환경 규제 강화에 따른 공정 환경의 변화에 따라, 상기와 같은 화학적 합성 방법이 아닌 생물학적인 방법의 개발이 필요하게 되었고, 미생물 배양 기술과 유전 공학적인 기술 방법의 발달에 힘입어 발효법에 의한 숙신산의 생산에 대한 연구가 관심을 끌고 있다. 특히 발효법에 의한 숙신산 생산법은 사용원료가 값싼 재생자원 (renewable resource)을 이용한다는 점에서 경제적 이점이 있다. 더욱이 대부분의 재생자원은 식물체에서 유래하는데, 식물체는 대기 중에 존재하는 과량의 이산화탄소를 흡수하여 성장하기 때문에 이를 이용한 발효법은 환경 친화적 공정으로 그 가치가 높다. 또한, 숙신산 발효는 폐 이산화탄소를 생산하는 것이 아니라 발효 중에 소비하는 공정이기 때문에, 새로운 청정기술 (clean technology)로도 그 가치가 높아지고 있다. 발효법에 의하여 재생자원으로부터 숙신산을 생산할 경우, 전 공정 (모든 단위공정에 필요한 에너지에 해당하는 이산화탄소 발생까지 고려)에 걸친 이산화탄소 생산량이 기존의 화학 합성법에 의한 경우의 약 20% 정도 수준일 것으로 예측되며, 이는 발효에 의한 숙신산 생산 공정이 화학 합성 공정과 비교하여 시장 경쟁력을 갖출 수 있다는 것을 보여주는 것이다.
발효법에 의한 숙신산 생산을 위해서는 고효율의 균주 개발이 요구되어진다. 대부분의 숙신산 발효 미생물은 절대 혐기성 또는 통성 혐기성 균주인 것으로 알려져 있다. 이러한 혐기성 미생물들은 호기성 미생물보다 외부 조건의 변화에 따라 세포 성장이 상당히 큰 영향을 받을 뿐 아니라 대사산물의 생성도 영향을 받기 때문에 숙신산 생산 미생물의 생리학적 및 환경적인 연구가 중요하다. 또한 이러한 생리학적 및 환경적인 연구 자료를 기초로 하여 숙신산 생산 대사 회로의 분석을 통하여 숙신산이 과량 생성되도록 최적의 발효 조건을 확립하는 것이 요구된다 (Cynthia et al., 1996).
한편, 2004년 미국 재생 알코올 협회 (RFA, Renewable Fuel Association)의 조사에 따르면, 미국내 약 80 여개의 알코올 생산업체로부터 약 3,500,000,000 갤론(gallon)의 알코올이 생산되었으며, 원료자원이 풍부한 브라질에서도 역시 4,000,000,000 갤론에 달하는 알코올이 생산되었다. 미국내 알코올 수요의 대부분은 연료분야에 사용되었으며 그 규모는 약 3,000,000,000 갤론에 달하였다. 게다가 이들 생산량의 대부분은 옥수수 등의 원료물질을 사용해서 생산되었다. 옥수수 등의 원료(feedstock)를 이용한 알코올 생산이 갖는 가장 큰 장점은 환경친화적 공정이라는 것이다. 이와 같은 천연물질을 알코올 생산 원료로 사용함으로써 알코올 생산시에 적은 에너지를 이용하며 적은 이산화탄소를 발생시킬 수 있다. 또한, 재생 에너지를 이용하기 때문에 폐기물처리 등으로 발생되는 별도의 비용 부담과 에너지 소모가 적다는 이점도 있다. 이는 우리나라와 같은 높은 석유 의존도를 갖는 국가일 수 록 반드시 해결해야 할 문제도 대두되고 있다.
대표적인 알코올 종류인 에탄올은 주류, 산업용 또는 실험실용 용매, 변성 알코올 제조, 제약, 화장품 제조, 유기합성용 기질 등의 다양한 용도로 사용 가능하며, 이에 따른 수요 또한 매우 크다. 최근 들어 에탄올은 가솔린 연료의 노-킹 제어성을 개선시키고 배연에서의 일산화탄소 저감효과를 갖는 가솔린 첨가제 또는 대체 에너지원으로 그 이용성이 확대되고 있다. 음료용 알코올을 제외한 대부분의 에탄올은 주로 화학합성에 의해 생산되었으나, 원유가의 상승으로 제조가격이 상승하여, 미생물에 의한 발효생산으로 대체하고자 하는 노력이 필요한 실정이다.
상기의 요구에 부응하기 위하여, 본 발명은 산업적으로 유용하고 환경친화적인 생물 화학 물질인 에탄올 등의 알코올, 락트산 및 숙신산 등의 일차 대사산물의 생산을 위한 최적의 균주와 최적의 조건을 제공하고, 이를 이용한 일차 대사산물의 대량 생산 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 미생물의 대사 경로 중 특정 대사산물의 대사 경로를 차단하여 다른 일차 대사산물의 생산을 증가시키는 방법; 상기 특정 대사산물의 대사 경로에 관여하는 물질의 코딩 유전자가 변형되어 다른 일차 대사산물의 대량 생산이 가능한 형질전환체; 및 이러한 형질전환체의 제조 방법에 관한 것이다. 상기 일차 대사산물은 친환경적 생물 화학 물질로서 산업적 효용성이 높은 알코올, 락테이트 또는 숙시네이트일 수 있다.
본 발명에서는 일차 대사산물의 대량 생산을 위한 균주로서 자이모모나스 모빌리스 (Zymomonas mobilis)를 선택하였다. 자이모모나스 모빌리스는 알코올 발효균으로서 세포 생장에 비하여 산물 전환율이 우수한 균주로 알려져 있다. 자이모모나스 모빌리스는 이론 산물 생산 수율이 약 98% 이상이며, 에탄올 생산성이 5g/g/l이고, 10g/g/h이상의 포도당 대사속도로 1 몰의 포도당으로부터 2 몰의 에탄올을 생산한다.
자이모모나스 모빌리스의 물질 대사 경로를 보면, 해당과정에 의하여 생성된 피루베이트가 아세트알데하이드로 전환되고, 다시 알코올 탈수소효소에 의하여 최종적으로 에탄올을 생산하는 것이 주된 경로이다. 이러한 고효율 에탄올 생산에 관여하는 주된 효소는 피루베이트 디카르복시라아제 (Pyruvate Decarboxylase)로서 피루베이트로부터 아세트알데하이드로의 전환을 매개한다. 따라서, 이러한 피루베이트 디카르복시라아제의 생산이 저해되면 피루베이트에서 아세트알데하이드로의 전환이 차단되어 알코올이 생산될 수 없으며, 숙주세포는 에너지 생성을 위하여 알코올 생산 이외의 다른 경로를 이용하여 알코올 이외의 다른 일차 대사산물을 생산하게 된다.
상기 일차 대사산물로는 C2 대사산물인 에탄올, C3 대사산물인 락테이트와 피루베이트, C6 대사산물인 시트레이트와 글루타메이트, C4 대사산물인 숙시네이트, 푸마레이트 및 말레이트 등이 있다. 따라서, 상기와 같이 에탄올 대사 경로가 차단되면, 이 외의 대사산물인 락테이트, 피루베이트, 시트레이트, 글루타메이트, 숙시네이트, 푸마레이트 및 말레이트 등의 생산이 증가하게 되며, 특히 락테이트와 숙시네이트의 생산량이 현저하게 증가하는 것을 관찰할 수 있다. 이 때, 락테이트 생성 경로에 있어서, 피루베이트에서 락테이트로의 전환을 매개하는 락테이트 탈수소효소(Lactate Dehydrogenase)의 생성을 저해하여, 락테이트 생성을 차단함으로써, 숙시네이트의 생산을 보다 증가시킬 수 있게 된다.
또한, 자이모모나스 모빌리스는 기존에 알려지지 않은 부분적인 호흡회로를 갖고 락테이트를 전자 공여체로 이용하는 것으로 나타났으며, 락테이트 생산을 차단하여 보다 혐기성 발효를 유도함으로써, 세포생장을 촉진하고 에탄올 생산 속도를 향상시킬 수 있게 되며, 나아가 향후 피루베이트 디카르복실라아제의 기질 특이성을 변화시켜 부탄디올(butanediol) 등을 생산할 수 있다.
이와 같이, 미생물의 대사 경로 중 특정 대사 경로를 차단시킴으로써, 상기 특정 대사 경로에서 생성되는 일차 대사산물 이외의 다른 일차 대사산물의 생산을 증가시킬 수 있는 것이다.
이러한 점에 기초하여, 본 발명은 자이모모나스 모빌리스에서의 피루베이트 디카르복시라아제 생성 및/또는 락테이트 탈수소효소의 생성을 저해하여, 알코올 생성 및/또는 락테이트의 생산을 억제함으로써, 다른 일차 대사산물, 특히, 에탄올 등의 알코올, 숙시네이트 및 락테이트의 생산을 증가시키는 기술을 제공한다.
보다 구체적으로, 본 발명은 피루베이트 디카르복시라아제의 코딩 유전자인 pdc (pyruvate decarboxylase) 유전자 (SEQ ID NO: 1) 및/또는 락테이트 탈수소효소 코딩 유전자인 ldhA (lactate dehydrogenase) 유전자 (SEQ ID NO: 2)를 제거하여 피루베이트 디카르복시라아제 및/또는 락테이트 탈수소효소의 생성을 저해하여 알코올 이외의 일차 대사산물을 대량 생산하는 기술을 제공한다.
알코올 발효에 의하여 에너지를 얻는 자이모모나스에 있어서, pdc 유전자는 생존에 필수적인 유전자로 알려져 있었으며, 이를 제거하면 자이모모나스 모빌리스 균주가 생존하지 못할 것으로 예측되어 왔다. 그러나, 본 발명에서는 pdc 유전자를 제거한 경우 정상 균주와 비교하여 약 2 배 정도의 생장 지연은 있지만 생존 가능하며, 알코올 이외의 일차 대사산물, 예컨대 락테이트, 피루베이트, 시트레이트, 글루타메이트, 숙시네이트, 푸마레이트 및 말레이트의 생산이 증가하는 것을 확인하였다.
즉, 본 발명에 있어서, 자이모모나스 모빌리스의 게놈에서 pdc 유전자가 제 거되면, 에탄올 생산능이 제거됨으로써 빠른 속도로 대량 축적된 피루베이트를 유용산물의 대량 생산에 이용할 수 있는 가능성을 갖게 되며, 에탄올이 아닌 다양한 유용산물을 생산할 수 있는 "Cell Factory Z. mobilis"로서 개발 및 활용될 수 있다. 이와 같이 자이모모나스 모빌리스가 대량 생산할 수 있는 유용물질에는 피루베이트, 글리세롤, 및 아세틸-coA로부터 얻어지는 락트산, 하이드록시프로피온산(3-hydroxypropionic acid), 하이드록시부탄산(3-hydroxybutanoic acid), 프로판디올(1,3-propanediol), 글루탐산, 폴리글루탐산, 아스파르트산, 말산, 푸마르산, 숙신산, 시트르산, 아디프산, 피루베이트, 글리세롤, 자일리톨, 소르비톨, 아라비니톨(arabinitol) 등이 있다. 또한, 코엔자임 Q10, 폴리프레닐 디포스페이트(polyprenyl diphosphates), 및 폴리테르펜(polyterpene), 디테르펜(diterpene), 모노테르펜(monoterpene), 트리테르펜(triterpene), 세스퀴테르펜(sesquiterpene) 등의 이소프레노이드 화합물(isoprenoid compounds) 등의 대량 생산도 가능하며, 이들은 화장품 첨가제, 보호제, 의약품의 전구체 등으로 매우 유용하다.
이 중에서도 숙시네이트의 경우에는 약 100% 이상의 생산 향상을 나타내는 것을 확인하였다. 종래에 C2, C3 및 C3 대사산물과 달리 C4 대사산물의 경우 대량 생산 균주가 거의 개발되어 있지 않았다는 점과, 상기한 바와 같이 숙시네이트가 플라스틱 및 수지 분야, 의약 분야, 식품 분야, 화장품 분야, 농업 분야, 세제/유화제 분야, 직물 분야, 사진 분야, 촉매 분야, 방식 분야 및 도금 분야 등 다양한 적용 분야에 적용이 가능한 산업상 유용한 물질이라는 점을 고려할 때, 본 발명에 있어서의 C4 대사산물인 숙시네이트의 생산량 향상은 매우 의미있는 것이라 할 수 있다.
자이모모나스 모빌리스의 대사 경로는 다음의 반응식 1과 같다:
[반응식 1]
본 발명의 한 가지 측면은 자이모모나스 모빌리스의 게놈 (Accession No.: AE008692)으로부터 pdc 유전자(SEQ ID NO:1) 및 ldhA 유전자 (SEQ ID NO:2 )로 이루어진 군 중에서 선택된 하나 이상의 유전자를 제거하여 자이모모나스 모빌리스에서의 일차 대사산물의 생산을 증가시키는 방법에 관한 것이다. 상기 일차 대사산물은 에탄올, 락테이트, 피루베이트, 시트레이트, 글루타메이트, 숙시네이트, 푸마 레이트 및 말레이트로 이루어진 군 중에서 선택된 한 가지 이상의 것일 수 있다.
보다 구체적으로, 본 발명은 자이모모나스 모빌리스의 게놈으로부터 pdc 유전자 (SEQ ID NO: 1)를 제거하여 알코올의 생성 경로를 차단함으로써, 알코올 이외의 일차 대사산물의 생산을 향상시키는 방법을 제공한다. 상기 일차 대사산물은 락테이트, 피루베이트, 시트레이트, 글루타메이트, 숙시네이트, 푸마레이트 및 말레이트로 이루어진 군 중에서 선택된 한 가지 이상의 것일 수 있으며, 보다 바람직하게는 락테이트 및 숙시네이트로 이루어진 군 중에서 선택된 한 가지 이상의 것일 수 있다. 상기 pdc 유전자가 제거된 자이모모나스 모빌리스에서의 대사 경로는 다음의 반응식 2와 같다:
[반응식 2]
Figure 112007010943378-pat00002
또한, 본 발명은 자이모모나스 모빌리스의 게놈으로부터 ldhA 유전자 (SEQ ID NO: 2)를 제거하여 락테이트 생성 경로를 차단함으로써, 락테이트 이외의 일차 대사산물의 생산을 향상시키는 방법을 제공한다. 상기 일차 대사산물은 에탄올, 피루베이트, 시트레이트, 글루타메이트, 숙시네이트, 푸마레이트 및 말레이트로 이루어진 군 중에서 선택된 한 가지 이상의 것일 수 있으며, 보다 바람직하게는 에탄올 및/또는 숙시네이트일 수 있다. 상기 ldhA 유전자가 제거된 자이모모나스 모빌리스에서의 대사 경로는 다음의 반응식 3과 같다:
[반응식 3]
Figure 112007010943378-pat00003
또한, 본 발명은 자이모모나스 모빌리스의 게놈으로부터 pdc 유전자(SEQ ID NO: 1)와 ldhA 유전자 (SEQ ID NO: 2)를 동시에 제거하여 알코올 및 락테이트 생성 경로를 모두 차단함으로써, 알코올 및 락테이트 이외의 일차 대사산물의 생산을 향상시키는 방법을 제공한다. 상기 일차 대사산물은 피루베이트, 시트레이트, 글루타메이트, 숙시네이트, 푸마레이트 및 말레이트로 이루어진 군 중에서 선택된 한 가지 이상의 것일 수 있으며, 보다 바람직하게는 숙시네이트일 수 있다. 상기 pdc 유전자 및 ldhA 유전자가 모두 제거된 자이모모나스 모빌리스에서의 대사 경로는 다음의 반응식 4와 같다:
[반응식 4]
Figure 112007010943378-pat00004
본 발명의 또 다른 측면은 pdc 유전자(SEQ ID NO: 1) 및 ldhA 유전자 (SEQ ID NO: 1)로 이루어진 군 중에서 선택된 하나 이상의 유전자가 제거된 것을 특징으로 하는 자이모모나스 모빌리스 형질전환체에 관한 것이다.
보다 구체적으로, 본 발명은 pdc 유전자 (SEQ ID NO: 1)가 제거된 자이모모나스 모빌리스의 형질전환체를 제공한다. 상기 형질전환체는 락테이트, 피루베이트, 시트레이트, 글루타메이트, 숙시네이트, 푸마레이트 및 말레이트로 이루어진 군 중에서 선택된 한 가지 이상의 대량 생산이 가능한 것일 수 있으며, 보다 바람직하게는 락테이트 및 숙시네이트로 이루어진 군 중에서 선택된 한 가지 이상의 대량 생산이 가능한 것일 수 있다. 본 발명의 구체예에 있어서, 상기 pdc 유전자 (SEQ ID NO: 1)가 제거된 형질전환체는 KCTC 11012BP일 수 있다.
또한, 본 발명은 ldhA 유전자 (SEQ ID NO: 2)가 제거된 자이모모나스 모빌리스의 형질전환체를 제공한다. 상기 형질전환체는 에탄올, 피루베이트, 시트레이트, 글루타메이트, 숙시네이트, 푸마레이트 및 말레이트로 이루어진 군 중에서 선택된 한 가지 이상의 대량 생산이 가능한 것일 수 있으며, 보다 바람직하게는 에탄올, 및/또는 숙시네이트의 대량 생산이 가능한 것일 수 있다. 본 발명의 구체예에 있어서, 상기 ldhA 유전자(SEQ ID NO: 2)가 제거된 형질전환체는 KCTC 11013BP 일 수 있다.
또한, 본 발명은 pdc 유전자 (SEQ ID NO: 1) 및 ldhA 유전자 (SEQ ID NO: 2)가 모두 제거된 자이모모나스 모빌리스의 형질전환체를 제공한다. 상기 형질전환체는 피루베이트, 시트레이트, 글루타메이트, 숙시네이트, 푸마레이트 및 말레이트로 이루어진 군 중에서 선택된 한 가지 이상의 대량 생산이 가능한 것일 수 있으며, 보다 바람직하게는 숙시네이트의 대량 생산이 가능한 것일 수 있다. 본 발명의 구체예에 있어서, 상기 pdc 유전자 (SEQ ID NO: 1)와 ldhA 유전자(SEQ ID NO: 2)가 제거된 형질전환체는 KCTC 10908BP 일 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은 자이모모나스 모빌리스의 게놈으로부터 pdc 유전자 (SEQ ID NO: 1) 및 ldhA 유전자 (SEQ ID NO: 2)로 이루어진 군 중에서 선택된 하나 이상의 유전자를 제거하는 단계를 포함하는, 상기의 자이모모나스 모빌리스 형질전환체의 제조 방법을 제공한다.
보다 구체적으로, 본 발명의 pdc 유전자가 제거된 자이모모나스 모빌리스 형질전환체의 제조 방법은
- 자이모모나스 모빌리스의 pdc 유전자 (SEQ ID NO: 1)를 갖는 유전자 단편을 적절한 플라스미드에 클로닝하고;
- 상기 플라스미드로부터 pdc 유전자를 제거하고;
- 상기 pdc 유전자가 제거된 플라스미드를 이용하여 자이모모나스 모빌리스 균주를 형질전환시키는 단계를 포함한다.
상기 pdc 유전자 클로닝 단계에 있어서, 상기 pdc 유전자를 갖는 유전자 단편은 자이모모나스 모빌리스 게놈의 pdc 유전자와 그 양쪽으로 위치하는 동성 재조합(homologous recombination)을 위한 상동 부위를 갖는 것이고, 상기 형전전환단계가 상기 동성 재조합을 위한 상동 부위에 의한 동성 재조합에 의하여 상기 자이모모나스 모빌리스 균주의 pdc 유전자 함유 부위를 플라스미드의 pdc 유전자가 제거된 부위로 대체시키는 것일 수 있다. 상기 동성 재조합을 위한 상동 부위는 자이모모나스 모빌리스 게놈의 pdc 유전자의 양말단에 위치하는 1500 내지 5000 bp의 폴리뉴클레오타이드일 수 있으며, 본 발명의 구체예에서는 pdc 유전자의 5' 말단으로부터 상류(upstream) 방향의 SacI 부위까지의 2933 bp의 폴리뉴클레오타이드와 pdc 유전자의 3' 말단으로부터 하류 (downstream) 방향의 XbaI 부위까지의 2873 bp의 폴리뉴클레오타이드일 수 있다.
이 때, pdc가 제거된 자이모모나스 모빌리스 형질전환체의 선별을 용이하게 하기 위하여, 상기 pdc 유전자 제거 단계에 있어서, pdc 유전자를 제거하고, 그 자리에 적절한 선별 마커를 대체시킬 수 있다. 상기 선별 마커로서 클로람페니콜 저항 유전자 (cmR), 테트라사이클린 저항 유전자 (tetR), 암피실린 저항 유전자 (ampR) 또는 가나마이신 저항 유전자 (kmR)를 사용할 수 있다.
본 발명의 한 구체예에 따른 pdc 유전자가 제거된 자이모모나스 모빌리스 형질전환체의 제조 방법을 도 1에 모식적으로 나타내었다.
또한, 본 발명의 ldhA 유전자가 제거된 자이모모나스 모빌리스 형질전환체의 제조 방법은
- 자이모모나스 모빌리스의 ldhA 유전자(SEQ ID NO: 2)를 갖는 유전자 단편을 적절한 플라스미드에 클로닝하고;
- 상기 플라스미드로부터 ldhA 유전자를 제거하고;
- 상기 ldhA 유전자가 제거된 플라스미드를 이용하여 자이모모나스 모빌리스 균주를 형질전환시키는 단계를 포함한다.
상기 ldhA 유전자 클로닝 단계에 있어서, 상기 ldhA 유전자를 갖는 유전자 단편은 자이모모나스 모빌리스 게놈의 ldhA 유전자와 그 양쪽으로 위치하는 동성 재조합을 위한 상동 부위를 갖는 것이고, 상기 형전전환단계가 상기 동성 재조합을 위한 상동 부위에 의한 동성 재조합에 의하여 상기 자이모모나스 모빌리스 균주의 pdc 유전자 함유 부위를 플라스미드의 pdc 유전자가 제거된 부위로 대체시키는 것 일 수 있다. 상기 동성 재조합을 위한 상동 부위는 자이모모나스 모빌리스 게놈의 ldhA 유전자의 양말단에 위치하는 1500 내지 5000 bp의 폴리뉴클레오타이드일 수 있으며, 본 발명의 구체예에서는 ldhA 유전자의 5' 말단으로부터 상류 방향의 SacI 부위까지의 4879 bp의 폴리뉴클레오타이드와 ldhA 유전자의 3' 말단으로부터 하류 방향의 XbaI 부위까지의 4984 bp의 폴리뉴클레오타이드일 수 있다.
이 때, ldhA가 제거된 자이모모나스 모빌리스 형질전환체의 선별을 용이하게 하기 위하여, 상기 ldhA 유전자 제거 단계에 있어서, ldhA 유전자를 제거하고, 그 자리에 적절한 선별 마커를 대체시킬 수 있다. 상기 선별 마커로서 클로람페니콜 저항 유전자, 테트라사이클린 저항 유전자, 암피실린 저항 유전자 또는 가나마이신 저항 유전자를 사용할 수 있다.
본 발명의 한 구체예에 따른 ldhA 유전자가 제거된 자이모모나스 모빌리스 형질전환체의 제조 방법을 도 4에 모식적으로 나타내었다.
또한, 본 발명은 상기 pdc 유전자가 제거된 자이모모나스 모빌리스 형질전환체의 제조 방법과 ldhA 유전자가 제거된 자이모모나스 모빌리스 형질전환체의 제조 방법을 연속 수행하여, pdc 유전자 및 ldhA 유전자가 모두 제거된 자이모모나스 모빌리스 형질전환체를 제조하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기의 pdc 유전자 및/또는 ldhA 유전자가 제거된 자이모모나스 모빌리스 형질전환체를 배양하여 에탄올, 락테이트, 피루베이트, 시트레이트, 글루타메이트, 숙시네이트, 푸마레이트 및 말레이트로 이루어진 군 중에서 선택된 한 가지 이상의 일차 대사산물을 대량으로 생산하는 방법을 제공한다. 이때, 배양 온도는 30 내지 34 ℃로하고, 배양 시간은 10 내지 14시간 정도로 하는 것이 좋다.
본 발명의 대량 생산 방법은 상기 자이모모나스 모빌리스 형질전환체의 배양시 배양 배지에 CO2 공급원을 추가로 첨가하여, 상기 일차 대사산물로의 전환시 탄소 공급원으로서 작용하여 일차 대사산물의 생산량을 증가시킬 수 있다. 예컨대, Z. mobilis의 숙신산 생산은 주로 말산 효소 (malic enzyme)에 의해 이루어지는데, 피루베이트(C3)로부터 말레이트(C4)가 생성되기 위해서는 카르복실화되어야 하기 때문에, 탄소를 공급해 줌으로써 숙신산 생산 효율 증가 효과를 얻을 수 있다. 상기 탄소 공급원으로서, CO2 기체, 또는 탄산염 등을 사용할 수 있다. 상기 탄산염으로서 통상적인 모든 탄산염이 사용 가능하며, NaHCO3, Na2CO3 및 CaCO3로 이루어진 중에서 선택된 것일 수 있다. 대사 경로에서의 상기 일차 대사산물로의 전이효소와의 효과적인 작용을 고려할 때, CO2 기체의 경우 0.2 내지 1 vvm (aeration volume/medium volume/minute), 탄산염의 경우 1 내지 50 mM, 바람직하게는 5 내지 20 mM의 양으로 첨가할 수 있다.
또한 탄소원 (CO2) 공급과 함께, 수소 공급 또한 숙신산 등의 일차 대사산물의 생산에 중요한 요소이다. 수소공급은 세포내 전자 전달을 촉진시켜 푸마레이트 환원효소 (fumarate reductase)에 의한 숙시네이트 등의 일차 대사 산물의 생산 효율을 증가시키는 역할을 한다. 예를 들어, Z. mobilis는 혐기성 세균으로써 세포내 NADH를 이용해서 ATP를 생성할 수 없기 때문에, 세포내 NADH (NADH+H+)는 대부분 NADH 탈수소효소에 의해서 NAD로 산화되고, 이때 생성된 프로톤(H+)은 ΔpH 유지에 사용되며, 전자는 퀴논(quinone), 사이토크롬 등의 전자 전달 경로를 거쳐 푸마레이트로 전달되며, 푸마레이트 환원효소에 의하여 숙시네이트를 생성하게 된다. 외부로부터 공급된 수소(H2)는 세포막에 존재하는 퀴논을 통해서 세포내로 유입되는데, 퀴논은 세포막에서 퀴논회로 (quinone cycle)를 통해서 수소를 프로톤과 전자로 바꾸면서 전자 전달 중계 역할을 담당하여, 수소로부터 프로톤을 세포내로 공급하고 전자를 사이토크롬으로 전달한다. 따라서, 배양 배지에 수소를 공급함으로써 NADH가 NAD로 산화되면서 생성되는 proton (H+)의 공급과 동일한 효과를 얻을 수 있어서 전자 전달 촉진에 의한 숙신산 등의 일차 대사산물의 생산 효율을 증진시키는 효과를 얻을 수 있다. 이 때, 수소는 가스 상태로 첨가할 수 있으며, 0.2 내지 1 vvm (aeration volume/medium volume/minute)의 양으로 첨가하는 것이 좋다.
본 발명의 구체예에 있어서, 상기 자이모모나스 모빌리스 형질전환체를 RM 배지 (글루코오스, 50g/l; 효모 추출물, 10g/l; MgSO4, 1g/l; (NH4)2SO4, 1g/l; KH2PO4, 2g/l; pH 5.2)에 NaHCO3 10mM를 첨가하거나, CO2 기체 1vvm를 첨가하여 30℃에서 14시간동안 회분 배양하여 보다 증가된 숙시네이트 생산 효과를 얻을 수 있다. 이러한 경우 숙시네이트의 생산 효율이 최대 5g/g/h 까지 향상된다.
이하, 본 발명을 하기의 실시예들에 의하여 보다 상세히 설명하고자 한다. 하기의 실시예들은 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 제한되는 것은 아니다.
[ 실시예 ]
실시예 1: pdc 유전자가 제거된 자이모모나스 모빌리스 형질전환체의 제조
도 1에 도시된 방법에 따라서 pdc 유전자가 제거된 자이모모나스 모빌리스 형질전환체를 제조하였다. 이하 도 1을 참조하여 설명한다.
1-1. pdc 유전자 클로닝
자이모모나스 모빌리스(Z. mobilis)의 게놈 유전자 (AE008692)로부터 pdc 유전자를 포함하며 7513 bp에 해당되는 유전자 단편을 중합 효소 연쇄반응 (polymerase chain reaction; PCR) 방법을 이용하여 얻었다. 여기에 사용된 프라이머들은 다음과 같다.
정방향 프라이머 (pdcF): 5-CCTGAATAGCTGGATCTAGAGCCCGTCAAAGC-3 (SEQ ID NO: 7)
역방향 프라이머 (pdcR): 5-CTGATCAAGGAGAGCTCGGCCTCCAAGC-3 (SEQ ID NO: 8)
SacI 제한효소 (NEB, New England Biolabs)와 XbaI 제한효소(NEB, New England Biolabs)를 처리하여 얻어진 유전자 단편을 동일한 제한 효소들로 처리된 pHSG398 벡터 (코아바이오시스템, TAKARA)에 리가아제(NEB, New England Biolabs)를 사용하여 삽입하였다. 도 1의 단계 a)에서 알 수 있는 바와 같이, 상기 유전자 단편은 pdc 유전자 (1707 bp), 상기 pdc 유전자의 5' 말단쪽에 5' 말단에서부터 상류 방향의 SacI 부위까지의 폴리뉴클레오타이드 (상류 상동 부위, 2933 bp, SEQ ID NO: 3), 및 상기 pdc 유전자의 3' 말단쪽에 3' 말단에서부터 하류 방향의 XbaI 부위까지의 폴리뉴클레오타이드 (하류 상동 부위, 2873 bp, SEQ ID NO: 4)를 갖는다. 상기 5' 상동 부위와 3' 상동 부위는 Z. mobilis 균주의 형질전환시 Z. mobilis의 게놈과의 동성 재조합에 사용된다.
1-2. pdc 유전자가 tet R 유전자로 치환된 ( Δpdc::tet R ) 플라스미드 제작
상기 단계 1-1에서 얻어진 플라스미드에 KpnI 제한효소(NEB, New England Biolabs)와 MluI 제한효소(NEB, New England Biolabs)를 처리한 후, 리가아제(NEB, New England Biolabs)를 사용하여 pBR322 벡터 (코아바이오시스템, TAKARA)로부터 중합효소 연쇄 반응으로 증폭된 tetR 유전자(J01749)를 삽입하여, pdc 유전자가 tetR 유전자로 치환된 플라스미드를 제작하였다.
1-3. Z. mobilis 의 형질전환
상기 단계 1-2에서 얻어진 플라스미드를 사용하여 Z. mobilis ZM4(ATCC 31821)를 electroporation 방법으로 형질전환하였다. Z. mobilis ZM4를 RM 액체 배지 (글루코오스, 50g/l; 효모 추출물, 10g/l; MgSO4, 1g/l; (NH4)2SO4, 1g/l; KH2PO4, 2g/l; pH 5.2)에서 10시간동안 배양한 후, 새로운 RM 액체 배지에 옮겨 600nm 가시광선에서 0.3 - 0.4의 흡광도를 갖도록 4시간 배양한다. 배양액을 20분간 얼음에 방치하고, 원심분리 (5000rpm, 5분)하여 상등액을 제거하고 10% glycerol로 세척하였다. 3번의 세척과정을 거친 후, 100μl 부피로 농축된 Z. mobilis ZM4를 상기 플라스미드로 형질전환 하였다. GenePulser 시스템 (Bio-Rad)을 사용하였으며, 사용된 electroporation 조건은 3.0kV, 25μF, 그리고 400Ω이 었으며, 시간상수 (time constant)는 8.8 - 9.9 였다. 형질전환시 상기 플라스미드에 포함된 5' 상동부위 및 3' 상동부위와 이에 대한 Z. mobilis ZM4 게놈의 각각의 상동 부위 간의 동성 재조합에 의하여 Z. mobilis ZM4 게놈의 pdc 유전자가 제거되고, 대신에 상기 플라스미드에 존재하는 tetR 유전자가 삽입되어, pdc 유전자가 tetR 유전자로 치환된 Z. mobilis Δpdc::tet R 형질전환체가 얻어졌다. 이와 같이 얻어진 Z. mobilis Δpdc::tet R 형질전환체를 2006년 10월 26일자로 대한민국 대전시 유성구 어은동에 소재하는 한국생명공학연구원 내 생물자원센터에 기탁하여 기탁번호 KCTC 11012BP를 부여 받았다.
1-4. Z. mobilis Δpdc::tet R 형질전환체의 선별 및 확인
상기 단계 1-3에서 얻어진 형질전환체를 테트라사이클린과 에탄올이 포함하는 RM 고체 배지 (ethanol, 20g/l; 글루코오스, 50g/l; 효모 추출물, 10g/l; MgSO4, 1g/l; (NH4)2SO4, 1g/l; KH2PO4, 2g/l; pH 5.2)에서 30℃에서 5일 동안 배양 후, 생존 세포를 수집하였다.
상기에서 수집된 생존 세포가 Z. mobilis Δpdc::tet R 형질전환체임을 확인하기 위하여 도 2에 나타난 방법을 이용하였다. 도 2에서 알 수 있는 바와 같이, pdc 유전자를 포함하는 야생형 Z. mobilis 게놈의 경우, pdc 유전자 상류쪽에 위치하는 프라이머 (pr-pdcF) 부위와 pdc 유전자 하류쪽에 위치하는 프라이머 (dn- pdcR) 부위 간의 염기 길이가 2536 bp인 반면, 상기 pdc 유전자가 tetR 유전자로 치환된 Z. mobilis 형질전환체의 경우에는, 상기 프라이머들간의 염기 길이가 2642 bp가 된다. 따라서, 수집된 생존 세포의 게놈을 상기 프라이머들을 이용하여 중합 효소 연쇄반응으로 증폭된 길이를 확인하면 Z. mobilis Δpdc::tet R 형질전환체 여부를 확인할 수 있다.
이를 구체적으로 설명하면, 상기 수집된 생존 세포로부터 DNA Easy Tissue Kit (엘알에스랩, QIAGEN)을 이용하여 제조사의 방법에 따라 게놈 (genomic) DNA를 분리하였다. 생존 세포들의 게놈 DNA를 주형으로 다음과 같은 프라이머를 사용하여 PCR 반응을 수행하였다.
정방향 프라이머 (pr-pdcF): 5'-GAGGGAAAGGCTTTGTCAGTGTTGCG-3'
(SEQ ID NO: 9)
역방향 프라이머 (dn-pdcR): 5'-TGACGCGGTTACCGTTAATTTCAGCGC-3'
(SEQ ID NO: 10)
대조군으로서 야생형 Z. mobilis를 동일하게 처리하였다.
상기의 결과를 도 3에 나타내었다. 도 3에 있어서, WT는 대조군의 야생형 Z. mobilis를 나타내는 것이고, M1 및 M2는 본 발명의 Z. mobilis Δpdc::tet R 형질전환체들을 나타내는 것이다. 도 3에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 경우 2536 bp 뉴클레오타이드 단편이 얻어졌으며, 이를 통하여 pdc 유전자가 제거되었음을 확인할 수 있었다.
실시예 2: ldhA 유전자가 제거된 자이모모나스 모빌리스 형질전환체의 제조
도 4에 도시된 방법에 따라서 ldhA 유전자가 제거된 자이모모나스 모빌리스 형질전환체를 제조하였다. 이하 도 4를 참조하여 설명한다.
2-1. ldhA 유전자 클로닝
자이모모나스 모빌리스(Z. mobilis)의 게놈 유전자 (AE008692)로부터 ldh 유전자를 포함하며 10859 bp에 해당되는 유전자 단편을 중합 효소 연쇄반응 (polymerase chain reaction) 방법을 이용하여 얻었다. 사용된 프라이머들은 다음과 같다.
정방향 프라이머 (ldhAF) 5-TGGCAGTCCTCCATCTAGATCGAAGGTGC-3 (SEQ ID NO: 11)
역방향 프라이머 (ldhAR) 5-GTGATCTGACGGTGAGCTCAGCATGCAGG-3 (SEQ ID NO: 12)
SacI 제한효소 (NEB, New England Biolabs)와 XbaI 제한효소(NEB, New England Biolabs)를 처리하여 얻어진 유전자 단편을 동일한 제한 효소들로 처리된 pGEM-T Easy 벡터 (서린바이오, Promega)에 리가아제(NEB, New England Biolabs)를 사용하여 삽입하였다. 도 1의 단계 a)에서 알 수 있는 바와 같이, 상기 유전자 단편은 ldhA 유전자 (996 bp), 상기 ldhA 유전자의 5' 말단쪽에 5' 말단에서부터 상류 방향의 SacI 부위까지의 폴리뉴클레오타이드 (상류 상동 부위, 4879 bp, SEQ ID NO: 5), 및 상기 ldhA 유전자의 3' 말단쪽에 3' 말단에서부터 하류 방향의 XbaI 부위까지의 폴리뉴클레오타이드 (하류 상동 부위, 4984 bp, SEQ ID NO: 6)를 갖는다. 상기 5' 상동 부위와 3' 상동 부위는 Z. mobilis 균주의 형질전환시 Z. mobilis의 게놈과의 동성 재조합에 사용된다.
2-2. ldhA 유전자가 cm R 유전자로 치환된 ( ΔldhA::cm R ) 플라스미드 제작
상기 단계 2-1에서 얻어진 플라스미드를 주형으로 ldhA 상류 및 하류쪽만을 동시에 증폭하는 프라이머를 제작하여 중합 효소 연쇄 반응으로 유전자 단편을 얻었다. 사용된 프라이머들은 다음과 같다.
정방향 프라이머 (ldhA-PmeI-2F) 5-AACTAGTTTAAACAAGAGCGAAGAATAGCAAAGAAT-3 (SEQ ID NO: 13)
역방향 프라이머 (ldhA-PmeI-2R) 5-CTCTTGTTTAAACTAGTTATGGCATAGGCTATTACG-3 (SEQ ID NO: 14)
상기 유전자 단편을 PmeI 제한효소(NEB, New England Biolabs)처리한 후, 리가아제(NEB, New England Biolabs)를 사용하여 pHSG398 벡터 (코아바이오시스템, TAKARA)로부터 중합효소 연쇄 반응으로 증폭된 cmR 유전자(U08461)를 삽입하여, ldhA 유전자가 cmR 유전자로 치환된 플라스미드를 제작하였다.
2-3. Z. mobilis 의 형질전환
상기 단계 2-2에서 얻어진 플라스미드를 사용하여 Z. mobilis ZM4(ATCC 31821)를 형질전환하였다. Z. mobilis ZM4를 RM 액체 배지 (글루코오스, 50g/l; 효모 추출물, 10g/l; MgSO4, 1g/l; (NH4)2SO4, 1g/l; KH2PO4, 2g/l; pH 5.2)에서 10시 간동안 배양한 후, 새로운 RM 액체 배지에 옮겨 600nm 가시광선에서 0.3 - 0.4의 흡광도를 갖도록 4시간 배양한다. 배양액을 20분간 얼음에 방치하고, 원심분리 (5000rpm, 5분)하여 상등액을 제거하고 10% glycerol로 세척하였다. 3번의 세척과정을 거친 후, 100μl 부피로 농축된 Z. mobilis ZM4를 상기 플라스미드로 형질전환 하였다. 형질전환시 상기 플라스미드에 포함된 5' 상동부위 및 3' 상동부위와 이에 대한 Z. mobilis ZM4 게놈의 각각의 상동 부위 간의 동성 재조합에 의하여 Z. mobilis ZM4 게놈의 ldhA 유전자가 제거되고, 대신에 상기 플라스미드에 존재하는 cmR 유전자가 삽입되어, ldhA 유전자가 cmR 유전자로 치환된 Z. mobilis ΔldhA::cm R 형질전환체가 얻어졌다. 이와 같이 얻어진 Z. mobilis ΔldhA::cm R 형질전환체를 2006년 10월 26일자로 대한민국 대전시 유성구 어은동에 소재하는 한국생명공학연구원 내 생물자원센터에 기탁하여 기탁번호 KCTC 11013BP를 부여 받았다.
2-4. Z. mobilis ΔldhA::cm R 형질전환체의 선별 및 확인
상기 단계 1-3에서 얻어진 형질전환체를 클로람페니콜을 포함하는 RM 고체 배지 (글루코오스, 50g/l; 효모 추출물, 10g/l; MgSO4, 1g/l; (NH4)2SO4, 1g/l; KH2PO4, 2g/l; 클로람페니콜, 75 μg/ml; pH 5.2)를 활용하여 30℃에서 5일 동안 배양하여, 클로람페니콜에 저항성을 나타내는 생존 세포를 수집하였다.
상기에서 수집된 생존 세포가 Z. mobilis ΔldhA::cm R 형질전환체임을 확인하기 위하여 도 5에 나타난 방법을 이용하였다. 클로람페니콜에 저항성을 나타내는 생존 세포를 RM 액체 배지 (글루코오스, 50g/l; 효모 추출물, 10g/l; MgSO4, 1g/l; (NH4)2SO4, 1g/l; KH2PO4, 2g/l; 클로람페니콜, 75 μg/ml; pH 5.2)에 30℃에서 16시간 동안 배양한 다음, 원심분리 (10,000ㅧ g, 5분)하여 상등액을 제거한 후 세포를 수집하였다. 도 5에서 알 수 있는 바와 같이, ldhA 유전자를 포함하는 야생형 Z. mobilis 게놈의 경우, ldhA 유전자 상류쪽에 위치하는 프라이머 (pr-ldhAF) 부위와 ldhA 유전자 하류쪽에 위치하는 프라이머 (dn-ldhAR) 부위 간의 염기 길이가 1861 bp인 반면, 상기 ldhA 유전자가 cmR 유전자로 치환된 Z. mobilis 형질전환체의 경우에는, 상기 프라이머들간의 염기 길이가 1493 bp가 된다. 따라서, 수집된 생존 세포의 게놈을 상기 프라이머들을 이용하여 중합 효소 연쇄반응으로 증폭된 길이를 확인하면 Z. mobilis ΔldhA::cm R 형질전환체 여부를 확인할 수 있다.
이를 구체적으로 설명하면, 상기 수집된 생존 세포로부터 DNA Easy Tissue Kit (엘알에스랩, QIAGEN)을 이용하여 제조사의 방법에 따라 게놈 (genomic) DNA를 분리하였다. 생존 세포들의 게놈 DNA를 주형으로 다음과 같은 프라이머를 사용하여 PCR 반응을 수행하였다.
정방향 프라이머 (npr-ldhAF): 5'-CAGCAAGTTCGATCTGTCTGGCGATCG-3'
(SEQ ID NO: 15)
역방향 프라이머 (dn-ldhAR): 5'-GATTAAATAATGCGGCGATGGCTAAGCAAGG-3'
(SEQ ID NO: 16)
대조군으로서 야생형 Z. mobilis를 동일하게 처리하였다.
상기의 결과를 도 6에 나타내었다. 도 6에 있어서, WT는 대조군의 야생형 Z. mobilis를 나타내는 것이고, M1, M2, 그리고 M3는 본 발명의 Z. mobilis ΔldhA::cm R 형질전환체를 나타내는 것이다. 도 6에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 경우 1493 bp 뉴클레오타이드 단편이 얻어졌으며, 이를 통하여 ldhA 유전자가 제거되었음을 확인할 수 있었다.
실시예 3: pdc 유전자 및 ldhA 유전자가 모두 제거된 Z. mobilis 형질전환체의 제조
상기 실시예 1과 실시예 2의 과정을 연속적으로 수행하여 pdc 유전자와 ldhA 유전자가 모두 제거된 Z. mobilis Δpdc::tet R /ΔldhA::cm R 형질전환체를 제조하였다. 이와 같이 얻어진 Z. mobilis Δpdc::tet R /ΔldhA::cm R 형질전환체를 2006년 2월 15일자로 대한민국 대전시 유성구 어은동에 소재하는 한국생명공학연구원 내 생물자원센터에 기탁하여 기탁번호 KCTC 10908BP를 부여 받았다.
실시예 4: 일차 대사산물의 생산성 시험
상기 실시예 1 내지 3에서 제조된 Z. mobilis 형질전환체를 이용하여 이들의 일차 대사산물 생산 능력을 시험하였다. 대조군으로서 야생형 Z. mobilis ZM4를 사용하였다.
야생형 Z. mobilis ZM4 (ATCC 31821), 실시예 1 내지 3에서 제조된 Z. mobilis Δpdc::tet R 형질전환체, Z. mobilis ΔldhA::cm R 형질전환체 및 Z. mobilis Δpdc::tet R /ΔldhA::cm R 형질전환체를 NaHCO3 10mM가 첨가된 RM 액체 배지 (글루코오스, 50g/l; 효모 추출물, 10g/l; MgSO4, 1g/l; (NH4)2SO4, 1g/l; KH2PO4, 2g/l; tetracycline, 15 μg/ml; pH 5.2)에서 30℃에서 16시간 동안 배양하였다. 상기 배양된 배양액으로부터 세포를 제거하고 얻은 배양 상등액을 HPLC (high performance liquid chromatography)를 이용하여 대사산물을 측정하였다. 상기 측정에 있어서, Hitachi HPLC 시스템 (model D-7000)이 사용되었으며, Aminex HPX-87H 컬럼으로 대사산물들을 분리하였다. 유기산은 UV 검출기 (Hitachi D-4200)로 당과 에탄올은 RI (refractive index) 검출기 (D-3300)에서 확인 및 정량하였다. 0.0025 N sulfuric acid를 이동상(용매)으로 사용하였고, 컬럼 온도는 60℃였으며, 유속은 0.6 ml/min 이었다.
상기의 방법을 3번 수행하여 얻어진 결과값의 평균을 아래의 표 2와 도 7a 내지 10b에 나타내었다.
[표 2]
Z. mobilis 균주 글루코 오스 (g/l) 에탄올 (g/l) 숙시네이트 (g/l) 락테이트 (g/l) 포르메이트 (g/l) 아세테이트 (g/l) 수율 (%) 숙시네이트 몰수율
ZM4 100.00 46.20 9.60 6.40 - 1.20 10 0.15
ΔldhA 106.88 58.01 17.82 - 3.32 3.13 17 0.25
*Δpdc 62.30 - 56.46 8.54 3.43 3.86 90 1.38
*Δpdc/ ΔldhA-NaHCO3 67.02 0.00 63.93 - 2.15 > 2.0 95 1.46
**Δpdc/ΔldhA-Gas 55.56 0.00 51.95 - 3.57 3.39 94 1.43
*: RM 배지에 NaHCO3 10mM를 첨가하여 배양
**: 이산화탄소-수소 혼합가스 (혼합비: 1:1)를 첨가하여 배양 (1vvm)
상기 표 2에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 실시예 1 내지 3에서 제작된 형질전환체는 야생형과 비교하여 증가된 숙시네이트 생산 능력을 보였다.
또한, ΔldhA::cm R 형질전환체는 매우 우수한 에탄올 생산 능력을 보이며, Δpdc::tet R 형질전환체는 매우 우수한 숙시네이트 및 락테이트 생산 능력을 보이는 것으로 나타났다.
실시예 5: 세포 생장률 및 일차 대사산물의 생산성 시험
상기 실시예 4와 동일한 방법으로 배양하여, 시간에 따른 균체 생장 및 산물 생산을 나타내는 척도로 활용하기 위해서 동력학 분석을 수행하였으며, 대수 생장기, 즉 최대 균체 생장 및 산물 생산 구간에서 측정된 수치들로부터 다음과 같은 방법으로 얻었다.
1. 비 생장 속도 (specific growth rate, μmax (h-1))
dx =μ x dt (μ=specific growth rate)........................식 1.1
μ = 1/t x ln (X/X0) ..........................................식 1.2
t = 시간 (time, h);
X = 균체량 (biomass, g);
dx = 균체량 차이 (biomass difference);
dt = 시간 차이 (time difference)
2. 균체 수율 (biomass yield, Yx/s)) 및 산물 생산 수율 (product yield (Yp/s))
Yx/s = -dx/ds ..................................................식 1.3
Yx/s = (X-X0)/(S0-S) ............................................식 1.4
dx = 균체량 차이 (biomass difference);
ds = 기질량 차이 [substrate (glucose) difference]
Yp/s = dp/ds ...................................................식 1.5
Yp/s = (P-P0)/(S0-S) ............................................식 1.6
dp = 생산량 차이 (product difference);
ds = 기질량 차이 [substrate (glucose) difference]
3. 비 기질 소모 속도 (specific glucose consumption rate, qs (g g-1 h-1))
ds = -qs x dt (qs = specific glucose consumption rate) ........식 1.7
식 1.1과 1.3로부터,
qs = (1/Yx/s) x μ ............................................식 1.8
4. 비 산물 생산 속도 (specific succinate production rate, qp (g g-1 h-1))
dp = qp x dt (qs = specific succinate production rate) ........식 1.9
식 1.1과 1.4로부터,
qp = (Yp/x) x μ ............................................식 1.10
5. 생산성 (productivity (g l-1 h-1))
생산성의 kinetic parameter는 존재하지 않기 때문에 생산이 가장 활발한 대수 생장기 동안 생산될 수 있는 최대 산물 농도를 나타내는 것이다.
P (Productivity) = dP/dt ......................................식 1.11
dP = product difference during exponential growth (g l-1)
dt = time difference during exponential growth (h)
또한, 다음과 같은 방법으로 대략적인 수치를 계산할 수도 있다.
P = (Yp/s)/(Yx/s) x μ ......................................식 1.12
6. 숙신산 몰 생산비 (succinic acid molar yield)
산물 생산 수율과 같은 의미를 갖으나, 백분율(%)이 아닌 몰 수율(molar yield)로 표현된 것이다. 이론적으로 포도당 1몰(180g)로부터 생산될 수 있는 숙신산은 2몰 (236g)이기 때문에, 실제 생산된 숙신산(g)을 몰 농도로 변환한 뒤 실험에 사용된 포도당 (g)을 몰 농도로 변환하여 나누어 그 수치를 얻었다.
[숙신산 (g)/포도당 (g)] ....................................식 1.13
이와 같이 얻어진 야생형 (ZM4), Δpdc 형질전환체 및 Δpdc/Δ ldhA 형질전환체의 동력학 분석 (kinetic analysis) 결과를 하기의 표 3에 나타내었고, 세포생장, 당소모량 및 대사산물 생산량을 각각 도 11a 내지 11c에 나타내었다.
[표 3]
Figure 112007010943378-pat00005
본 발명은 미생물의 대사 경로 중 특정 경로를 차단하여 친환경적이고 산업적으로 유용한 다양한 일차 산물 유기산을 대량으로 생산하는 기술을 제공하며, 본 발명에 의하여 대량 생산된 유기산들은 기존의 화학 합성 물질의 대체하여 다양한 분야에 적용되어 비용 절감 효과와 환경 보호 효과를 얻을 수 있다.
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Claims (19)

  1. 자이모모나스 모빌리스(Zymomonas mobilis)의 게놈으로부터 피루베이트 디카르복시라아제를 코딩하는 pdc 유전자(SEQ ID NO: 1) 및 락테이트 탈수소효소를 코딩하는 ldhA 유전자 (SEQ ID NO: 2)로 이루어진 군 중에서 선택된 하나 이상의 유전자를 제거하여, 자이모모나스 모빌리스에 의한 에탄올, 락테이트, 피루베이트, 시트레이트, 글루타메이트, 숙시네이트, 푸마레이트 및 말레이트로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상의 일차 대사산물의 생산을 증가시키는 방법.
  2. 제1항에 있어서, pdc 유전자 (SEQ ID NO: 1)를 제거하여 숙시네이트 및 락테이트로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상의 일차 대사산물의 생산을 증가시키는 방법.
  3. 제1항에 있어서, ldhA 유전자 (SEQ ID NO:2)를 제거하여 에탄올 및 숙시네이트로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상의 일차 대사산물의 생산을 증가시키는 방법
  4. 제1항에 있어서, pdc 유전자 (SEQ ID NO: 1) 및 ldhA 유전자 (SEQ ID NO:2)를 모두 제거하여 숙시네이트의 생산을 증가시키는 방법.
  5. 게놈으로부터 pdc 유전자(SEQ ID NO: 1) 및 ldhA 유전자 (SEQ ID NO: 2)로 이루어진 군 중에서 선택된 하나 이상의 유전자가 제거되어, 에탄올, 락테이트, 피루베이트, 시트레이트, 글루타메이트, 숙시네이트, 푸마레이트 및 말레이트로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상의 일차 대사산물의 대량 생산이 가능한 자이모모나스 모빌리스 (Zymomonas mobilis) 형질전환체.
  6. 제5항에 있어서, pdc 유전자 (SEQ ID NO: 1)가 제거되어, 숙시네이트 및 락테이트로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상의 일차 대사산물의 대량 생산이 가능한 형질전환체.
  7. 제5항에 있어서, ldhA 유전자 (SEQ ID NO: 2)가 제거되어, 에탄올 및 숙시네이트로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상의 일차 대사산물의 대량 생산이 가능한 형질전환체.
  8. 제5항에 있어서, pdc 유전자 (SEQ ID NO: 1)와 ldhA 유전자 (SEQ ID NO: 2)가 모두 제거되어 숙시네이트의 대량 생산이 가능한 형질전환체.
  9. 제5항에 있어서, KCTC 11012BP, KCTC 11013BP 및 KCTC 10908BP로 이루어진 군 중에서 선택된 형질전환체.
  10. 자이모모나스 모빌리스(Zymomonas mobilis)의 게놈으로부터 pdc 유전자 (SEQ ID NO: 1) 및 ldhA 유전자 (SEQ ID NO: 2)로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상의 유전자를 제거하는 단계를 포함하는, 제5항에 따른 자이모모나스 모빌리스 형질전환체의 제조 방법.
  11. 제10항에 있어서,
    자이모모나스 모빌리스의 pdc 유전자 (SEQ ID NO: 1)를 갖는 유전자 단편을 플라스미드에 클로닝하고;
    상기 pdc 유전자가 클로닝된 플라스미드로부터 pdc 유전자를 제거하고;
    상기 pdc 유전자가 제거된 플라스미드를 이용하여 자이모모나스 모빌리스를 형질전환시키는 단계를 포함하는,
    자이모모나스 모빌리스 형질전환체의 제조 방법.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 pdc 유전자를 갖는 유전자 단편은 자이모모나스 모빌리스의 pdc 유전자와 그 양쪽으로 위치하는 동성 재조합 (homologous recombination)을 위한 1500 내지 5000 bp의 상동 부위를 갖는 것인,
    자이모모나스 모빌리스 형질전환체의 제조 방법.
  13. 제10항에 있어서,
    자이모모나스 모빌리스의 ldhA 유전자(SEQ ID NO: 1)를 갖는 유전자 단편을 플라스미드에 클로닝하고;
    상기 ldhA 유전자가 클로닝된 플라스미드로부터 ldhA 유전자를 제거하고;
    상기 ldhA 유전자가 제거된 플라스미드를 이용하여 자이모모나스 모빌리스를 형질전환시키는 단계를 포함하는,
    자이모모나스 모빌리스 형질전환체의 제조 방법.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 ldhA 유전자를 갖는 유전자 단편은 자이모모나스 모빌리스의 ldhA 유전자와 그 양쪽으로 위치하는 동성 재조합 (homologous recombination)을 위한 1500 내지 5000 bp의 상동 부위를 갖는 것인,
    자이모모나스 모빌리스 형질전환체의 제조 방법.
  15. 제10항에 있어서,
    자이모모나스 모빌리스의 pdc 유전자 (SEQ ID NO: 1)를 갖는 유전자 단편을 플라스미드에 클로닝하고;
    상기 pdc 유전자가 클로닝된 플라스미드로부터 pdc 유전자를 제거하고;
    상기 pdc 유전자가 제거된 플라스미드를 이용하여 자이모모나스 모빌리스를 형질전환시키는 단계; 및
    자이모모나스 모빌리스의 ldhA 유전자(SEQ ID NO: 1)를 갖는 유전자 단편을 플라스미드에 클로닝하고;
    상기 ldhA 유전자가 클로닝된 플라스미드로부터 ldhA 유전자를 제거하고;
    상기 ldhA 유전자가 제거된 플라스미드를 이용하여 자이모모나스 모빌리스를 형질전환시키는 단계
    를 연속하여 수행하는 것을 특징으로 하는,
    자이모모나스 모빌리스 형질전환체의 제조 방법.
  16. pdc 유전자 (SEQ ID NO: 1) 및 ldhA 유전자 (SEQ ID NO: 2)로 이루어진 군 중에서 선택된 하나 이상의 유전자가 제거된 자이모모나스 모빌리스 형질전환체를 제작하는 단계; 및
    상기 자이모모나스 모빌리스 형질전환체를 30 내지 34 ℃에서 10 내지 14 시간동안 배양하는 단계를 포함하는,
    에탄올, 락테이트, 피루베이트, 시트레이트, 글루타메이트, 숙시네이트, 푸마레이트 및 말레이트로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상의 일차 대사산물의 생산 방법.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 자이모모나스 모빌리스 형질전환체의 배양시에 CO2 기체를 0.2 내지 1 vvm의 양으로 첨가하거나, 배양 배지에 탄산염을 1 내지 50 mM의 농도 추가로 첨가 하여 배양하는 것을 특징으로 하는,
    일차 대사산물의 생산 방법.
  18. 제17항에 있어서,
    상기 탄산염이 NAHCO3, NA2CO3 및 CaCO3로 이루어진 군 중에서 선택된 것인,
    일차 대사산물의 생산 방법.
  19. 제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 자이모모나스 모빌리스 형질전환체의 배양시에 수소 기체를 0.2 내지 1 vvm의 양으로 추가로 첨가하여 배양하는 것을 특징으로 하는,
    일차 대사산물의 생산 방법.
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101326583B1 (ko) 2011-02-23 2013-11-07 주식회사 마크로젠 고광학순도의 젖산 생산용 형질전환체 및 이를 이용한 젖산 생산 방법
US9428775B2 (en) 2011-02-23 2016-08-30 Macrogen Inc. Transformant for production of lactic acid of high optical purity and method for producing lactic acid using the same

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010062707A1 (en) * 2008-10-30 2010-06-03 Joule Unlimited, Inc. Methods and compositions for producing carbon-based products of interest in micro-organisms
US11091782B2 (en) * 2017-10-27 2021-08-17 Alliance For Sustainable Energy, Llc Engineered zymomonas for the production of 2,3-butanediol
WO2020169221A1 (en) * 2019-02-20 2020-08-27 Synbionik Gmbh Production of plant-based active substances (e.g. cannabinoids) by recombinant microorganisms
EP3935932A1 (de) * 2020-07-07 2022-01-12 Andreas Stihl AG & Co. KG Schneidmesser für einen schneidkopf und schneidkopf für eine motorsense

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4297173A (en) * 1980-05-22 1981-10-27 Ajinomoto Company, Incorporated Method for determining ammonia and sensor therefor
US4413058A (en) * 1982-01-28 1983-11-01 Arcuri Edward J Continuous production of ethanol by use of flocculent zymomonas mobilis
US4771001A (en) * 1986-03-27 1988-09-13 Neurex Corp. Production of lactic acid by continuous fermentation using an inexpensive raw material and a simplified method of lactic acid purification
US6485947B1 (en) * 1999-05-21 2002-11-26 Cargill Dow Polymers, Llc Production of lactate using crabtree negative organisms in varying culture conditions
US7374939B1 (en) * 2000-05-01 2008-05-20 Midwest Research Institute Method of inactivation of an end product of energy metabolism in Zymomonas mobilis
BR0111979A (pt) * 2000-06-26 2003-07-01 Univ Florida Res Foudantion In Composição para degradar um oligossacarìdeo, método para degradar um oligossacarìdeo, célula hospedeira, métodos para realçar a degradação de um oligossacarìdeo, para fabricar uma célula hospedeira recombinante, para expressar uma endoglicanase em uma célula hospedeira, e para produzir etanol a partir de uma fonte de oligossacarìdeo, vetor, método para degradar um oligossacarìdeo, e, extrato de enzima
JP2004521619A (ja) * 2000-11-22 2004-07-22 カージル ダウ ポリマーズ エルエルシー 有機生成物の合成のための方法及び材料

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Biochemistry, Vol.39, No.31, pages 9430-9437 (2000.08.08)
Biotechnol. Prog. Vol.21, No.2, pages 358-365 (2005.03~04)
J. Ind. Microbiol. Biotechnol. Vol.33, No.1, pages 1-7(2006.01)
NCBI GenBank Accession No. AE008692 (2005.01.25)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101326583B1 (ko) 2011-02-23 2013-11-07 주식회사 마크로젠 고광학순도의 젖산 생산용 형질전환체 및 이를 이용한 젖산 생산 방법
US9428775B2 (en) 2011-02-23 2016-08-30 Macrogen Inc. Transformant for production of lactic acid of high optical purity and method for producing lactic acid using the same

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