BRPI0707860A2 - mÉtodos de preparaÇço e de produÇço em massa de pelo menos um metabàlico e transformante dos mesmos - Google Patents

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Abstract

Métodos de Preparação e de Produção em Massa de Pelo Menos um Metabôlito e Transformante dos Mesmos. A presente invenção relaciona-se com um método de produção em massa de outros metabólitos primários que inibem um metabólito específico de metabolismo em microorganismos, um transformante para a produção em massa de outros metabólitos primários por modificação de um gene específico relativo ao metabolismo e um método para de preparação do mesmo. Os metabólitos primários podem conter lactato, succinato ou álcool como etanol, em que cada um tem uma elevada aplicabilidade industrial como material bioquímico ambiental amigável.

Description

"Métodos de Preparação e de Produção em Massade Pelo Menos um Metabólito e Transformante dos Mesmos"
Referência Remissivaa Pedido Correlato
Este Pedido reivindica a prioridade e o benefício dos Pedidosde Patente Coreana 10-2006-0015116, depositado em 16 de fevereiro de2006, e 10-2007-0011953, depositado em 06 de fevereiro de 2007, asquais são aqui incorporadas por referência para todos os propósitoscomo se aqui completamente descritas neste documento.
Antecedentes da Invenção(a) Campo da Invenção
A presente invenção refere-se a um método para a produçãoem massa de outros metabólitos primários pela inibição de um metabó-lito específico do metabolismo em microorganismos, um transformantepara a produção em massa de outros metabólitos primários pelamodificação de um gene específico relacionado ao metabolismo e ummétodo para a preparação dos mesmos. Estes metabólitos primáriospodem conter lactato, succinato ou álcool como etanol, em que cada umtem alta aplicabilidade industrial como um material bioquímico ambien-talmente amigável.
(b) Descrição da Técnica Relacionada
Desde a revolução industrial, o ser humano tem conseguidoum crescimento memorável com o desenvolvimento da indústriapetroquímica como base, mas o desenvolvimento indiscriminado e aapropriação indevida tem também trazido muitos problemas ambientaisque devem ser resolvidos tão cedo quanto possível tal como o ecocídio.Devido às mudanças climáticas causadas pelo ecocídio talcomo o esgotamento da camada de ozônio, o mundo inteiro estácolocando esforços em contra medidas na proteção ambiental paraprevenir destruição ecológica adicional, tais como os acordos deimplementação de mudanças climáticas e o Protocolo de Kioto. Todavi-a, estas contramedidas de proteção ambiental influenciarão o desenvol-vimento estendido de indústrias petroquímicas que consomem muitaenergia através do mundo inteiro e nas infra-estruturas econômica esocial das nações tendo alta dependência em óleo.
Atualmente, a pesquisa em produtos químicos substitutosque podem ser produzidos de fontes renováveis, entre eles ácido lácticoe ácido succínico, está recebendo reconhecimento para a possibilidadede desenvolver produtos bioquímicos úteis. O ácido láctico já tem sidousado para desenvolver um plástico biodegradável e, dependendo desua produção comercial futura, tem sido relatado que será umacommodity comercializável. Além disso, governos de nações avançadasestão liderando ativamente a pesquisa e estão sendo desenvolvidastécnicas de produção de ácido poli-láctico (PLA) com a pesquisa deprodução por fermentação do ácido láctico através da colaboração entreas companhias Cargill e Dow dos Estados Unidos e a produção detécnicas usando o 1,3-propanodiol (PDO) para produzir politrimetilenotereftalato (PTT) estão sendo desenvolvidas sob colaboração entre ascompanhias DuPont e Denocor. Comparado às fibras desenvolvidasanteriormente, o PLA tem excelente eficiência em termos de taxa derecuperação de umidade, taxa de recuperação elástica, prova de fogo eabsorção ultravioleta, assim o PLA tem a promessa de ser um polímeroambientalmente amigável biodegradável. As propriedades físicas donylon e poliéster que são conhecidas como fibras representativasdesenvolvidas previamente e o PLA como polímero ambientalmenteamigável, estão denotadas na Tabela 1 seguinte.<table>table see original document page 4</column></row><table>
Como mostrado na Tabela 1, o PLA tem propriedades físicasiguais ou melhores quando comparadas com as fibras conhecidasanteriormente de nylon e poliéster, indicando que o PLA é um materialde excelente qualidade na substituição de produtos de fibras sintetiza-das quimicamente.
O polímero de ácido succínico é conhecido como outro pro-duto bioquímico útil e tem uma maior flexibilidade do que o PLA. Alémdo mais, o Departamento de Energia dos Estados Unidos (DOE) em2004 selecionou o polímero de ácido succínico como um dos compostosquímicos valiosos derivados da biomassa para o futuro (NREL, 2004).
O ácido succínico é um ácido dicarboxílico e é conhecidocomo um produto intermediário do ciclo TCA, ele consiste em 4 carbo-nos e é um material químico que existe em todas as células de plantas eanimais, ainda que em baixa concentração. O ácido succínico e seusderivados têm sido largamente usados na indústria de plásticos,alimentos, medicamentos e cosméticos.
A utilidade do ácido succínico como monômero de um poli-mero biodegradável que pode superar o não biodegradável, o que é umavulnerabilidade dos polímeros sintetizados, tem aumentado com odesenvolvimento da indústria petroquímica. Como um terço do plásticoque está sendo atualmente usado está sendo descartado após apenasum uso, estão ocorrendo problemas significativos de contaminaçãoambiental induzidos pelo lixo de plástico e em razão das regulamenta-ções ambientais que estipulam que a maioria deste plástico deveria sersubstituída com material biodegradável, muitas nações estão começan-do a ter um interesse substancial na indústria de plásticos biodegradá-veis. Atualmente, a pesquisa relacionada ao polibutileno succinatocomo poliéster alifático biodegradável, que está sendo considerado comoo próximo polímero biodegradável, está sendo ativamente conduzida(Kirk-Other, 1979).
Todavia, o preço de venda do ácido succínico é alto, se com-parado ao que a indústria está pretendendo pagar e sua produção epurificação são também não eficientes. Em razão destes motivos, oácido succínico está sendo produzido em sua maioria por um método desíntese químico. Nominalmente, o ácido succínico é produzido atravésde um processo em que o anidrido succínico produzido pela hidrogena-ção de anidrido maleico é novamente hidratado. Mas, como previamen-te descrito, de acordo com mudanças do ambiente do processo devido àforça da lei de rapidamente mudar as regulamentações ambientais, temsido necessário desenvolver um método biológico em oposição aométodo da síntese química como descrito acima e está atualmentesendo efetuada a pesquisa relacionada à produção do ácido succínicopelo método da fermentação com o desenvolvimento de técnicas decultivo de micróbios e técnicas de engenharia genética. Particularmen-te, o método de produção do ácido succínico pelo método da fermenta-ção tem uma vantagem econômica de ser capaz de usar fontes renová-veis baratas como carga de processo e usa tecnologia ambientalmentelimpa amigável.Para a produção em massa de ácido succínico pelo métododa fermentação, é necessário se desenvolver uma cepa tendo altaeficiência. A maioria dos micróbios de fermentação do ácido succínico éconhecida como anaeróbios aero-tolerantes ou anaeróbios facultativos.Como estes micróbios anaeróbicos recebem muitas influências naprodução de metabólitos bem como no crescimento de célula de acordocom mudanças nas condições externas comparadas com micróbiosaeróbicos, a pesquisa fisiológica e ambiental relacionada aos micróbiosde produção de ácido succínico é importante. Além disso, as condiçõesde fermentação ótimas são necessárias para a produção em massa deácido succínico através da análise do ciclo metabólito de produção deácido succínico baseado nos dados de pesquisa (Cynthia e colaborado-res, 1996).
Por outro lado, de acordo com investigações da Associaçãode Combustíveis Renováveis dos Estados Unidos (RFA) em 2004, cercade 80 empresas de produção de álcool nos Estados Unidos produziramcerca de 13,3 bilhões de litros de álcool e o Brasil, tendo fontes de cargaabundantes, produziu cerca de 15,2 bilhões de litros de álcool. Amaioria do álcool nos Estados Unidos foi usada como combustível,sendo a quantidade de 11,4 bilhões de litros. Além disso, a maioria daprodução foi produzida pelo uso do milho como carga de processo. Amaior vantagem de produzir álcool usando milho como carga é que ele éum processo ambientalmente amigável. Isto é, o método de uso destafonte natural como carga para a produção de álcool pode induzir umpequeno consumo de energia e uma pequena ocorrência de dióxido decarbono, quando o álcool é produzido. Também, em razão do métodousar energia renovável, o método tem a vantagem em que o gastoseparado e consumo de energia que ocorre no descarte do resíduo épequeno. Particularmente, as nações com alta dependência de óleo talcomo a República da Coréia devem certamente resolver estes proble-mas.O etanol, como representante do álcool, pode ter vários usostais como para bebidas alcoólicas, solventes industriais e de laborató-rios, fabricação de álcool desnaturado, medicamento, fabricação decosméticos e substratos para síntese orgânica e desta forma a demandatem grandemente aumentada. Recentemente, o etanol tem sidoamplamente usado como aditivo à gasolina para melhorar o controle dobarulho da gasolina como combustível e para reduzir o nível de monó-xido de carbono do gás de exaustão e para energia substituta. Amaioria do etanol, exceto álcool para bebida, tem sido principalmenteproduzida por sínteses químicas, mas devido ao aumento nos custos defabricação de acordo com o aumento no preço do petróleo, é necessáriofazer um esforço na substituição do método da síntese química pelométodo da fermentação usando micróbios para a produção de etanol.
Sumário da Invenção
Um objetivo da presente invenção é proporcionar uma cepaotimizada e condição de produção em massa de metabólitos primárioscomo álcool como metanol, ácido láctico e ácido succínico que tenhamaplicação industrial e são materiais bioquímicos ambientalmenteamigáveis e é prover um método para a produção em massa de metabó-litos primários usando a cepa e condição.
Breve Descrição dos Desenhos
A Figura 1 é um diagrama que mostra processos de deleçãode um gene pd.c (piruvato decarboxilase) numa cepa de Zymomonasmobilis (Z. mobilis) ZM4 de acordo com os Exemplos 1 e 3.
A Figura 2 é um diagrama que mostra o esquema do inicia-dor para identificação da deleção de um gene pdc de um transformanteZM 4 produzido no Exemplo 1.
A Figura 3 mostra o resultado da eletroforese com respeitoa um transformante ZM4 fabricado no Exemplo 1 e uma cepa ZM4 dotipo natural.
A Figura 4 é um diagrama que mostra os processos de de-leção de um gene IghA (lactato desidrogenase) em uma cepa Zymomonasmobilis (Z. mobilis) ZM4 de acordo com os Exemplos 2 e 3.
A Figura 5 é um diagrama que mostra o esquema do inicia-dor para identificação da deleção do gene IdhA de um transformanteZM4 fabricado no Exemplo 2.
A Figura 6 mostra o resultado da eletroforese com respeitoa um transformante ZM4 fabricado no Exemplo 2 e uma cepa ZM4 dotipo natural.
As Figuras 7A e 7B são gráficos que mostram a taxa decrescimento e produtividade de um metabólito primário induzido de umtransformante de deleção de gene pdc (Apdc) comparado com uma cepaZM4 do tipo natural quando posta em cultura sem um suprimento dehidrogênio, respectivamente.
As Figuras 8A e 8B são gráficos que mostram a taxa decrescimento (biomassa: g/L) e produtividade de um metabólito primárioinduzido de um transformante de deleção de gene pdc (Apdc) comparadocom ambos o transformante de delação de gene pdc e IdhA (Apdc; AlghA)quando posto em cultura sem suprimento de hidrogênio, respectiva-mente.
As Figuras 9A e 9B são gráficos que mostram a taxa decrescimento (biomassa: g/L) e produtividade de um metabólito primárioinduzido de um transformante de deleção de gene pdc (Apdc) comparadocom ambos o transformante de delação de gene pdc, quando posto emcultura com um suprimento de hidrogênio comparado com o transfor-mante posto em cultura sem suprimento de hidrogênio, respectivamen-te.
As Figuras IOA e IOB são gráficos que mostram a taxa decrescimento (biomassa: g/L) e a produtividade de um metabólitoprimário induzido de um transformante de deleção de gene pdc e IdhA(Apdc; AlghA), quando posto em cultura com suprimento de hidrogêniocomparado com o transformante posto em cultura sem suprimento dehidrogênio, respectivamente.
As Figuras IlA a IlC são gráficos que mostram o cresci-mento celular, consumo de glucose e produtividade de metabólitosprimários induzidos de um transformante de deleção de gene IdhAcomparado com uma cepa ZM4 Z. mobilis, respectivamente.
Descrição Detalhadadas Modalidades Preferidas
Uma apreciação mais completa da invenção e muitas dasvantagens que acompanham a mesma ficarão prontamente evidentes,quando a mesma se tornar melhor compreendida com referência àseguinte descrição detalhada.
A presente invenção refere-se a um método de produção emmassa de outros metabólitos primários pela inibição de um metabólitoespecífico do metabolismo em microorganismos; um transformante paraa produção em massa de outros metabólitos primários pela modificaçãode um gene específico referindo-se ao metabolismo e um método para apreparação dos mesmos. Os metabólitos primários podem conterálcool, lactato ou succinato tendo alta aplicação industrial comomateriais bioquimicamente ambientalmente amigáveis.
A presente invenção é capaz de usar Zymomonas mobilis {Z.mobilis) como uma cepa para a produção em massa de metabólitosprimários. O Ζ. mobilis é conhecido como um microorganismo defermentação do álcool com uma taxa de conversão em produto excelentecomparada com o crescimento celular. Teoricamente, o rendimento doproduto do Z. mobilis é mais do que cerca de 98% e a produtividade doetanol é até 5 g/g/L e em mais detalhes, o Z. mobilis produz 2 moles deetanol por mol de glucose tendo uma taxa metabólica de glucose demais do que 10 g/g/h.
No metabolismo de uma Z. mobilis, a rota principal do me-tabolismo inclui as seguintes etapas:
-o piruvato invertido é produzido por glicólise comacetaldeído; e
-finalmente, é produzido etanol por álcool desidroge-nase. Desta forma, uma enzima representante relacionada à altaeficiência na produção de etanol é o piruvato decarboxilase e a enzimachave intermedeia a conversão do piruvato com acetaldeído. Destaforma, se a produção do piruvato decarboxilase é bloqueada, o álcoolnão é produzido pela interrupção da conversão do piruvato comacetaldeído e as células hospedeiras começam a produzir outrosmetabólitos primários exceto o álcool usando outros caminhos que arota da produção do álcool para a produção de energia.
Como tipo de metabólitos primários existe o metanol comoum metabólito C2, lactato e piruvato como metabólitos C3, citrato comoC6, glutamato como metabólito C5 e succinato, fumarato e malato comometabólitos C4. Desta forma, se o metabolismo do etanol for inibidocomo acima, são aumentados outros metabólitos primários tais comolactato, piruvato, citrato, glutamato, succinato, fumarato e malato e,particularmente, é aumentada a produtividade do lactato e succinatonotavelmente. Na rota de produção do lactato, a produção do succinatopode ainda ser aumentada pela inibição do lactato desidrogenaseintermediando a conversão do piruvato com lactato e então pela inibiçãoda produção do lactato.
Também um Z. mobilis parece usar o lactato como um doa-dor de elétrons com um ciclo TCA (ácido tricarboxílico) parcial desco-nhecido previamente e ele promove o crescimento celular e taxa deprodução de etanol através da indução ainda da fermentação anaeróbi-ca pela inibição da produção do lactato e ainda produz butanodiol pelamudança da especificidade do substrato do piruvato decarboxilase.
Desta forma, podem ser aumentados outros metabólitosprimários exceto um metabólito primário produzido pelo metabolismoespecífico pela inibição de um metabolismo específico em microorga-nismos.
Baseado neste ponto, a presente invenção proporciona ummétodo para a produção em massa de outros metabólitos primários,particularmente álcool como etanol, succinato e lactato pelo bloqueio daprodução de piruvato decarboxilase e/ou lactato desidrogenase em umZ. mobilis e então pela inibição da produção de álcool e/ou lactato.
Em mais detalhes, a presente invenção proporciona um mé-todo para a produção em massa de outros metabólitos primários excetoálcool pela deleção do gene pdc codificando piruvato decarboxilase (SEQID NO: 1) e/ou o gene IdhA codificando lactato desidrogenase (SEQ IDNO: 2) e então pela inibição da produção do piruvato decarboxilase e/oulactato desidrogenase.
Na cepa de Z. mobilis que obtém energia pela fermentaçãodo álcool, como o gene pdc derivado a partir da cepa é um gene essenci-al para a sobrevivência, tem sido previsto que, se o gene for apagado, acepa não seja capaz de sobreviver. Todavia, modalidades específicaspreferidas da presente invenção demonstraram que a cepa com o genepdc removido é capaz de sobreviver, mesmo que o seu crescimento sejaretardado de cerca de 2 vezes em comparação com uma cepa do tiponatural e é capaz de aumentar a produção de outros metabólitosprimários exceto álcool, por exemplo, lactato, piruvato, citrato, glutama-to, succinato, fumarato e malato.
Isto é, se o gene pdc é removido do genoma do Z. mobilis, acepa vem a ter a possibilidade de usar o piruvato acumulado em massarapidamente para a produção em massa de produtos úteis em razão daprodutividade removida do etanol e pode ser desenvolvida e aplicadacomo uma "Fábrica de Célula Z. mobilis" para a produção de váriosprodutos úteis exceto o etanol. Desta forma, os produtos úteis que sãoproduzidos em massa pela cepa podem compreender piruvato, glicerol eácido láctico obtido a partir da acetil-coA, ácido 3-hidróxipropiônico,ácido 3-hidróxibutanóico, 1,3-propanodiol, ácido glutâmico, ácidopoliglutâmico, ácido aspártico, ácido málico, ácido fumárico, ácidosuccínico, ácido cítrico, ácido adípico, piruvato, glicerol, xilitol, sorbitole arabinitol. Também, a cepa pode produzir em massa compostosisoprenóides tais como coenzima Q10, poliprenil difosfatos, politerpeno,diterpeno, monoterpeno, triterpeno e sesquiterpeno, em que os compos-tos podem ser usados como aditivos cosméticos, protetores e precurso-res de drogas médicas.
No caso do succinato, foi confirmado que a produção dosuccinato é aumentada em mais de cerca de 100%. Como a cepa para aprodução em massa de um metabólito C4, diferentemente dos metabóli-tos conhecidos C2, C3, C5 e C6, é pouco desenvolvida e o succinato éamplamente usado em vários campos de aplicação tais como o campode plástico e resina, o campo da medicina, o campo dos cosméticos, ocampo da agricultura, o campo de detergente/emulsificante, o campotêxtil, o campo da fotografia, o campo da catálise e o campo dosprocessos de galvanização, é muito significativo que seja possível oaumento de produtividade do succinato como um metabólito C4 deacordo com a presente invenção.A rota metabólica de um Z. mobilis pode ser representadapela seguinte Fórmula Reativa 1:
Fórmula Reativa 1
<formula>formula see original document page 13</formula>
Em um aspecto, a presente invenção se refere a um métodopara a produção em massa de metabólitos primários de um Z. mobilispela deleção de pelo menos um gene selecionado do grupo consistindodo gene pdc (SEQ ID NO: 1) e do gene IdhA (SEQ ID NO: 2) derivado dogenoma do Z. mobilis. Os metabólitos primários podem incluir pelomenos um metabólito selecionado do grupo consistindo de etanol,lactato, piruvato, citrato, glutamato, succinato, fumarato e malato.
Em mais detalhes, a presente invenção proporciona um mé-todo para a produção em massa de metabólitos primários outros que oálcool pela deleção gene pdc (SEQ ID NO: 1) derivado do genoma do Z.mobilis e então inibição da rota de produção de álcool. Os metabólitosprimários podem incluir pelo menos um metabólito selecionado dogrupo consistindo de lactato, piruvato, citrato, glutamato, succinato,fumarato e malato e pode com maior preferência incluir lactato e/ousuccinato.
A rota metabólica do Z. mobilis com gene pdc removido podeser representada pela seguinte Fórmula Reativa 2:
Fórmula Reativa 2
<formula>formula see original document page 14</formula>produção em massa de metabólitos primários outros que o lactato peladeleção do gene IdhA (SEQ ID NO: 2) derivado do genoma do Z. mobilis eentão inibição da rota de produção de lactato. Os metabólitos primáriospodem incluir pelo menos um metabólito selecionado do grupo consis-tindo de etanol, piruvato, citrato, glutamato, succinato, fumarato emalato e pode com maior preferência incluir etanol e/ou succinato.
A rota metabólica do Z. mobilis com gene IdhA removido po-de ser representada pela seguinte Fórmula Reativa 3:
Fórmula Reativa 3
<image>image see original document page 15</image>
Ainda, a presente invenção proporciona um método para aprodução em massa de metabólitos primários outros que o álcool elactato pela deleção de ambos o gene pdc (SEQ ID NO: 1) e o gene IdhA(SEQ ID NO: 2) derivado do genoma do Z. mobilis e então inibição deambas as rotas de produção de álcool e lactato. Os metabólitos primá-rios podem incluir pelo menos um metabólito selecionado do grupoconsistindo de piruvato,, citrato, glutamato, succinato, fumarato emalato e pode com maior preferência incluir o succinato.
A rota metabólica do Z. mobilis com ambos os genes pdc e1dhA removidos pode ser representada pela seguinte Fórmula Reativa 4:
Fórmula Reativa 4
<formula>formula see original document page 16</formula>
Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a umtransformante Z. mobilis que tem pelo menos um gene selecionado dogrupo consistindo do gene pdc (SEQ ID NO: 1) e do gene IdhA (SEQ IDNO: 2) derivado do genoma do Z. mobilis removido.Em mais detalhes, a presente invenção proporciona umtransformante com gene pdc (SEQ ID NO: 1) de Z. mobilis removido. Otransformante pode produzir em massa pelo menos um metabólitoselecionado do grupo consistindo do lactato, piruvato, citrato, glutama-to, succinato, fumarato e malato e pode, com maior preferência,produzir em massa lactato e/ou succinato. Na modalidade específicapreferida da presente invenção, o transformante com gene pdc (SEQ IDNO: 1) removido pode ser uma cepa KCTC 11012BP.
A presente invenção também proporciona um transforman-te com gene IdhA (SEQ ID NO: 2) de Z. mobilis removido. O transfor-mante pode produzir em massa pelo menos um metabólito selecionadodo grupo consistindo em etanol, piruvato, citrato, glutamato, succinato,fumarato e malato e pode, com maior preferência, produzir em massaetanol e/ou succinato. Na modalidade específica preferida da presenteinvenção, o transformante com gene IdhA (SEQ ID NO: 2) removido podeser uma cepa KCTC 11013BP.
A presente invenção também proporciona tanto um trans-formante com o gene pdc (SEQ ID NO: 1) como o gene IdhA (SEQ ID NO:2) de Z. mobilis removidos. O transformante pode produzir em massapelo menos um metabólito selecionado do grupo consistindo do piruva-to, citrato, glutamato, succinato, fumarato e malato e pode, com maiorpreferência, produzir em massa succinato. Na modalidade específicapreferida da presente invenção, tanto o transformante com gene pdc(SEQ ID NO: 1) como o gene IdhA (SEQ ID NO: 2) removidos podem seruma cepa KCTC 10908BP.
Em um aspecto adicional, a presente invenção proporcionaum método para a preparação de um transformante Z. mobilis, queinclui a etapa de deleção de pelo menos um gene selecionado do grupoconsistindo de um gene pdc (SEQ ID NO: 1) e de um gene IdhA (SEQ IDNO: 2) derivado do genoma do Z. mobilis.Em mais detalhes, o método de preparação do transforman-te Z. mobilis com gene pdc removido inclui as seguintes etapas:
- clonagem do fragmento contendo do gene pdc do Z.mobilis (SEQ ID NO: 1) em um plasmídeo;
- remoção do gene pdc do plasmídeo contendo o genepdc; e
- transformação do plasmídeo com gene pdc removidoem um genoma de Z. mobilis contendo o gene pdc.
Nas etapas de clonagem, o fragmento contendo o gene pdcdo Z. mobilis pode incluir uma região homóloga para recombinaçãohomóloga localizada em ambas as regiões terminais 5'- e 3'- do gene pdcjunto com o gene pdc do Z. mobilis, em que a região do gene pdc do Z.mobilis pode ser substituída pela região do gene pdc removido noplasmídeo. A região homóloga para a recombinação homóloga podeincluir 1.500 a 5.000 bp de polinucleotídeos localizados em ambas asregiões terminais 5 - e 3'- do gene pdc do Z. mobilis e, com maiorpreferência, a região homóloga pode incluir tanto o polinucleotídeocontendo a região terminal 5'- do gene pdc a montante da região SacI(região homóloga a montante, 2.933 bp, SEQ ID NO: 3) como o polinu-cleotídeo contendo a região terminal 3'- do gene pdc a jusante da regiãoXbaJ (região homóloga a jusante, 2.873 bp, SEQ ID NO: 4).
De forma a facilmente selecionar um transformante comgene pdc de Z. mobilis removido, o gene pdc é removido e então a regiãocom o gene pdc removido pode ser substituída com um marcador deseleção apropriado. O marcador de seleção pode incluir um generesistente a clorafenicol (cmR), um gene resistente a tetraciclina (tetR),um gene resistente a ampicilina (ampR) ou um gene resistente acanamicina (kmR).O método de preparação do transformante com gene pdc deZ. mobilis removido de acordo com uma modalidade específica dapresente invenção é descrito na Figura 1.
O método de preparação do transformante Z. mobilis comgene IdhA removido inclui também as seguintes etapas:
- clonagem do fragmento contendo do gene IdhA do Z.mobilis (SEQ ID NO: 2) em um plasmídeo;
- remoção do gene IdhA do plasmídeo contendo o geneldhA\ e
- transformação do plasmídeo com gene IdhA removi-do em um genoma de Z. mobilis contendo o gene IdhA.
Nas etapas de clonagem, o fragmento contendo o gene IdhAdo Z. mobilis pode incluir uma região homóloga para recombinaçãohomóloga localizada em ambas as regiões terminais 5'- e 3'- do geneIdhA junto com o gene IdhA do Z. mobilis, em que a região do gene IdhAdo Z. mobilis pode ser substituída pela região com gene IdhA removidono plasmídeo. A região homóloga para recombinação homóloga podeincluir de 1.500 a 5.000 bp de polinucleotídeos localizados em ambasas regiões terminais 5'- e 3'- do gene IdhA do Z. mobilis e, com maiorpreferência, a região homóloga pode incluir ambos o polinucleotídeocontendo a região terminal 5'- do gene IdhA a montante da região SacI(região homóloga a montante, 4.879 bp, SEQ ID NO: 5) e o polinucleotí-deo contendo a região terminal 3'- do gene IdhA a jusante da regiãoXbal (região homóloga a jusante, 4.894 bp, SEQ ID NO: 6).
De forma a facilmente selecionar um transformante comgene IdhA de Z. mobilis removido, o gene IdhA é removido e, então, aregião com gene IdhA removido pode ser substituída com um marcadorde seleção apropriado. O marcador de seleção pode incluir um generesistente a clorafenicol (cmR), um gene resistente a tetraciclina (tetR),um gene resistente a ampicilina (ampR) ou um gene resistente acanamicina (kmR).
O método de preparação do transformante com gene IdhAde Z. mobilis removido de acordo com outra modalidade específica dapresente invenção é descrito na Figura 4.
A presente invenção também proporciona um método depreparação de ambos os transformantes Z. mobilis com gene pdc e IdhAremovidos, o qual inclui as etapas consecutivas de:
- preparação do transformante com gene pdc de Z.mobilis removido; e
- preparação do transformante com gene IdhA de Z.mobilis removido.
Além disso, a presente invenção proporciona um métodopara a produção em massa de pelo menos um metabólito primárioconsistindo do etanol, lactato, piruvato, citrato, glutamato, succinato,fumarato e malato pela cultura do transformante com gene pdc removi-do e/ou gene IdhA removido de Z. mobilis. Aqui, a temperatura decultura e o tempo de cultura não são particularmente limitados,preferivelmente a temperatura pode ser 30 a 34°C e o tempo de culturapode ser de 10 a 14 h.
No método de produção em massa, a produtividade do me-tabólito primário pode ser aumentada pelo uso de um meio de culturado transformante de Z. mobilis adicionalmente contendo dióxido decarbono, porque o dióxido de carbono atua como fonte de carbono,quando a glucose na cepa é mudada com o metabólito primário. Porexemplo, a produção de succinato de Z. mobilis é alcançada principal-mente por uma enzima málica, em que o succinato é necessariamentecarboxilado para a produção do malato (C4) a partir do piruvato (C3) e aprodutividade do succinato pode ser aumentada pelo suprimento decarbono.
Aqui, o suprimento de carbono não é particularmente limi-tado, e o suprimento de carbono pode incluir dióxido de carbono oucarbonato. O carbonato pode usar qualquer carbonato e, com maiorpreferência, pode ser selecionado do grupo que consiste em NaHCOs,Na2CO3 e CaCO3. Considerando a ação efetiva com o metabólitoprimário da transferase no metabolismo, o gás dióxido de carbono podeser adicionado ao meio de cultura com um 0,1 a 1 wm (volume deaeração/volume do meio/minuto) e o carbonato pode ser adicionado aomeio de cultura de 1 a 50 mM e, com maior preferência, de 5 a 20 mM.
Com suprimento de dióxido de carbono, o suprimento dehidrogênio é também um componente muito importante na produção deum metabólito primário tal como succinato. Aqui, o suprimento dehidrogênio aumenta a transferência de elétrons nas células e entãoaumenta a eficiência de produção do metabólito primário tal comosuccinato pela redutase do fumarato. Por exemplo, porque o Z. mobilisque é conhecido como um micróbio anaeróbico que não pode produzirATP usando o NADH nas células, o NADH (NADH+H+) é na sua maiorparte oxidado com NAD pela desidrogenase NADH, aqui os prótonsproduzidos (H+) são usados para manter o ΔρΗ, e elétrons são transferi-dos para o fumarato através de um canal de transferência de elétronstal como quinona e citocromo, succinato é finalmente produzido pelaredutase do fumarato. O hidrogênio suprido de fora é introduzido nascélulas através da quinona existindo na membrana da célula, onde aquinona tem a função de intermediação de transferência de elétronsatravés da mudança de hidrogênio com prótons e elétrons através deum ciclo de quinona na membrana da célula, suprindo prótons induzi-dos a partir do hidrogênio para dentro das células e transferência deelétrons para o citocromo. Desta forma, como o suprimento de hidro-gênio no meio de cultura induz efeitos idênticos ao suprimento depróton (H+) produzido pelo NADH oxidado com NAD, a eficiência deprodução do metabólito primário tal como o succinato pela promoção datransferência de elétrons pode ser aumentada. Aqui, o hidrogênio podeser adicionado em um meio de cultura sob uma condição de gás e, commaior preferência, o teor de hidrogênio pode ser adicionado em um meiode cultura de 0,2 a 1 wm (volume de aeração/volume do meio/minuto).
Em uma modalidade específica da presente invenção, otransformante Z. mobilis pode ser posto em cultura em um meio RM(glucose 50 g/L, extrato de levedura lOg/L, MgSO4 lg/L, (NH4)2S04lg/L, KH2PO4 2g/L, pH 5,2) contendo IOmM de NaHCO3 ou 1 wm degás dióxido de carbono para 14 h a 30°C. Como resultado, pode serainda aumentada a produção do succinato e pode também ser aumen-tada a eficiência de produção do succinato até um máximo de 5 g/g/h.
A presente invenção é ainda explicada em mais detalhescom referência aos seguintes exemplos. Estes exemplos, todavia, nãodevem ser interpretados de nenhum modo como limitativos do escopoda presente invenção.
ExemploExemplo 1
Preparação do Transformante Zymomonas mobilis (Z. mobilis)com um Gene pdc Removido
De acordo com o método mostrado na Figura 1, foi prepara-do um transformante Zymomonas mobilis com um gene pdc removido.Ele será explicado com referência à Figura 1.
1-1. Clonagem de um Gene pdcUm fragmento de um gene correspondendo a seqüênciasnucleotídeos 7.513 bp contendo um gene pdc derivado de um genoma(AE008692) de Zymomonas mobilis (daqui em diante referido como 'Z.mobilis') foi melhorado por um método de reação em cadeia de polime-rase (PCR). Os iniciadores usados na reação PCR são como se seguem.
Iniciador direto (pdcF):
5'-CCTGAATAGCTGGATCTAGAGCCCGTCAAAGC-3'(SEQ ID NO: 7)
Iniciador reverso (pdcR):
5'-CTGATCAAGGAGAGCTCGGCCTCCAAGC-3' (SEQID NO: 8)
O fragmento obtido a partir do PCR foi cortado com as en-zimas SacI (NEB, New England Biolab, MA, EUA) e XbaI (NEB, NewEngland Biolab, MA, EUA) e então ele foi sub-clonado em um vetoraberto pHSG398 (Takara Shuzo Co., Ltd., Kioto, Japão) tratado com asenzimas SacI e XbaI. Como mostrado na etapa a) da Figura 1, ofragmento contendo o gene pdc inclui um gene pdc (1.707 bp), umpolinucleotídeo contendo a partir da região terminal 5' do gene pdc amontante da região SacI (região homóloga a montante, 2.933 bp, SEQID NO: 3) e um polinucleotídeo contendo a partir da região terminal 3'do gene pdc a jusante da região XbaI (região homóloga a montante,2.873 bp, SEQ ID NO: 4). Ambas as regiões homólogas 5' e 3' sãousadas para recombinação homóloga com o genoma do Z. mobilisquando transformando-os para dentro da cepa de Z. mobilis.
1.2 - Construção de Plasmídeo
em que um Gene pdc
Foi Substituído por um Gene tetR (Apdc::tetR)O plasmídeo obtido da etapa 1-1) foi cortado com as enzi-mas KpnI (NEB, New England Biolab, MA, EUA) e MluI (NEB, NewEngland Biolab, MA, EUA) e então um gene tetR (J01749) amplificadopelo PCR a partir de um vetor pBR322 foi inserido dentro do plasmídeo.
Como resultado, o plasmídeo contendo o gene substituído tetR para ogene pdc foi preparado.
1.2 - Transformação de um Z. mobilis
O plasmídeo obtido a partir da etapa 1-2) foi introduzido emuma cepa de ZM4 Z. mobilis (ATCC31821) usando a eletroporação. Emmais detalhes, a cepa ZM4 Z. mobilis foi posta em cultura em um meiolíquido RM (glucose 50 g/L, extrato de levedura lOg/L, MgSC>4 lg/L,(NH4)2SO4 lg/L, KH2PO4 2g/L, pH 5,2) por 10 h e então posto emcultura em um novo meio RM por 4 h até que o valor O.D se aproximoude 0,3-0,4 a 600 nm. O meio de cultura foi deixado em gelo por 20minutos e o sobrenadante foi removido por centrifugação a 5.000 rpmpor 5 minutos e então lavado com glicerol 10%. Após lavar 3 vezes, oplasmídeo foi transformado em uma cepa ZM4 Z. mobilis que foiconcentrada com 100 μί de volume. A eletroporação foi efetuadausando o Sistema GenePulser (Bio-Rad Chemical Division, USA), emque as condições para a eletroporação foram 1,0 kV, 25 uF e 400Ω,respectivamente e em que a constante de tempo foi de 8,8-9,9.
De acordo com a recombinação homóloga entre as regiõeshomólogas 5' e 3' localizadas no plasmídeo e, depois disto, cada umadas regiões homólogas de um genoma ZM4 Z. mobilis então é transfor-mado, o gene pdc no genoma ZM4 Z. mobilis foi removido e foi inserido ogene tetR localizado no plasmídeo. Como resultado, foi obtido o trans-formante Z. mobilis {Ápdcr.tet*) em que o gene pdc foi substituído pelogene tetR. O transformante Z. mobilis [Apdcr.tet*) foi depositado noKorean Collection for TVpe Culture (Korea Research Institute of Biosci-ence and Biotechnology, Taejon, República da Coréia) em 26 de outubrode 2006 e teve atribuído o número de depósito No. KCTCl 1012BP.
1.2 - Seleção e Identificação de um
Transformante Apdc-.:tetR Z. mobilis
O transformante obtido na etapa 1-3) foi posto em culturaem um meio sólido RM (etanol 20 g/L, glucose 50 g/L, extrato delevedura lOg/L, MgSO4 lg/L, (NH4)2SO4 lg/L, KH2PO4 2g/L, tetracicli-na 15 μg/mL, pH 5,2) contendo tetraciclina a 30°C por 5 dias e então ascélulas vivas foram coletadas.
Para identificar se as células coletadas eram do transfor-mante Z. mobilis {Apdcr.tet1*) ou não, uma modalidade da presenteinvenção usou o método mostrado na Figura 2. Como mostrado naFigura 2, no caso de um genoma de Z. mobilis do tipo natural contendoo gene pdc, o comprimento das seqüências de DNA entre a região doiniciador localizada a montante do gene pdc e a região do iniciador (dn-pdcR) localizado a jusante do gene pdc foi 2.642 bp e, por outro lado, nocaso de um transformante Z. mobilis onde o gene pdc foi substituídopelo gene tetR, o comprimento das seqüências de DNA entre os doisiniciadores foi de 2.536 bp. Deste modo, pela identificação do compri-mento da região amplificada pelo PCR usando o iniciador fixado nadireção do genoma das células vivas coletadas, pode ser avaliado se o Z.mobilis Apdc::tetR é o transformante ou não.
Em mais detalhes, o DNA genômico das células vivas cole-tadas foi isolado usando o kit DNA Easy Tissue (QIAGEN Corp.,Valencia, Califórnia, EUA) de acordo com as instruções do fabricante.Então a reação PCR em direção ao genoma DNA foi efetuada usando uminiciador como estabelecido a seguir:
Iniciador direto (pr-pdcF):5'-GAGGGAAAGGCTTTGTCAGTGTTGCG-3' (SEQ ID NO: 9)
Iniciador reverso (dn-pdcR):
5'-TGACGCGGTTACCGTTAATTTCAGCGC-3' (SEQ ID NO:10)
Como controle, um Z. mobilis do tipo natural foi tratadocom os dois iniciadores como acima.
Os resultados são mostrados na Figura 3. Na Figura 3, WTindica um Z. mobilis do tipo natural como um controle e M1 e M2 indicao transformante Z. mobilis Ápdc::tetR, respectivamente. Como mostradona Figura 3, uma modalidade da presente invenção obteve um fragmen-to de nucleotídeo de 2.536 bp, indicando que o gene pdcfoi removido.
Exemplo 2
Preparação de um Transformante Z. mobiliscom um Gene IdhA removido
De acordo com o método mostrado na Figura 4, foi prepara-do um transformante Zymomonas mobilis com um gene IdhA removido.Ele será explicado com referência à Figura 4.
2-1 - Clonagem de um Gene IdhA
Um fragmento de um gene correspondendo a seqüênciasnucleotídeos 10.859 bp contendo um gene IdhA derivado de um genoma(AE008692) de Z. mobilis foi melhorado por um método de reação emcadeia de polimerase (PCR). Os iniciadores usados na reação PCR sãocomo se seguem.
Iniciador direto (IdhAF):5'-TGGCAGTCCTCCATCTAGATCGAAGGTGC-3' (SEQID NO: 11)
Iniciador reverso (IdhAR):5'-GTGATCTGACGGTGAGCTCAGCATGCAGG-3' (SEQ IDNO: 12)
O fragmento obtido a partir do PCR foi cortado com as en-zimas SaeI (NEB, New England Biolab, MA, EUA) e XbaI (NEB, NewEngland Biolab, MA, EUA) e, então, ele foi sub-clonado em um vetoraberto pGEM-T (Promega, Madison, WI, EUA) tratado com as enzimasSacI e XbaI. Como mostrado na etapa a) da Figura 4, o fragmento degene contém um gene IdhA (996 bp), um polinucleotídeo contendo apartir da região terminal 5' do gene IdhA a montante da região SacI(região homóloga a montante, 4.879 bp, SEQ ID NO: 5) e um polinucle-otídeo contendo a partir da região terminal 3' do gene IdhA a jusante daregião XbaI (região homóloga a montante, 4.984 bp, SEQ ID NO: 6).Ambas as regiões homólogas 5' e 3' são usadas para recombinaçãohomóloga com o genoma do Z. mobilis quando transformando-os paradentro da cepa de Z. mobilis.
2-2 - Construção de Plasmídeo em que um Gene IdhA
Foi Substituído por um Gene cmR {AldhA::cmR)
Para alcançar o propósito, a reação PCR foi efetuada usan-do o plasmídeo obtido da etapa 2-1) como um modelo junto com umconjunto de iniciador projetado ao simultaneamente amplificar apenasas regiões a montante e a jusante. Como resultado, um fragmento degene foi obtido. Os iniciadores usados na reação PCR são como a seguir.
Iniciador direto (ldhA-PmeI-2F):
5'-AACTAGTTTAAAÇAAGAGCGAAGAATAGCAAAGAAT-3'(SEQ ID NO: 13)
Iniciador reverso (ldhA-PmeI-2R)
5'-CTCTTGTTTAAAÇTAGTTATGGCATAGGCTATTACG-3'(SEQ ID NO: 14)
O fragmento de gene foi cortado com a enzima PmeI (NEB,New England Biolab, MA, EUA) e, então, foi inserido um gene cmR(U08461) amplificado pelo PCR a partir de um vetor pHSG398 (TakaraShuzo Co., Ltd., Kioto, Japão) dentro do plasmídeo. Como resultado, foipreparado o plasmídeo contendo o gene substituído cmR para o geneldhA.
2-3 - Transformação de um Z. mobilís
O plasmídeo obtido a partir da etapa 2-2) foi introduzido emuma cepa de ZM4 Z. mobilis (ATCC 31821) usando a eletroporação. Emmais detalhes, a cepa ZM4 Z. mobilis foi posta em cultura em um meiolíquido RM (glucose 50 g/L, extrato de levedura lOg/L, MgSO4 lg/L,(NH4)2SO4 lg/L, KH2PO4 2g/L, pH 5,2) por 10 h e então posto emcultura em um novo meio RM por 4 h até que o valor O.D se aproximoude 0,3-0,4 a 600 nm. O meio de cultura foi deixado em gelo por 20minutos e o sobrenadante foi removido por centrifugação a 5.000 rpmpor 5 minutos e então as células colhidas foram lavadas com glicerol10%. Após lavar 3 vezes, o plasmídeo foi transformado em uma cepaZM4 Z. mobilis que foi concentrada com 100 μL de volume.
De acordo com a recombinação homóloga entre as regiõeshomólogas 5' e 3' localizadas no plasmídeo e, depois disto, cada umadas regiões homólogas de um genoma ZM4 Z. mobilis então é transfor-mado, o gene IdhA no genoma ZM4 Z. mobilis foi removido e foi inseridoo gene cmR localizado no plasmídeo. Como resultado, o transformante Z.mobilis (AldhAr.cmK) onde o gene IdhA foi substituído pelo gene cmR foiobtido. O transformante Ζ. mobilis [AldhAr.cmF] foi depositado no KoreanCollection for Type Culture (Korea Research Institute of Bioscience andBiotechnology, Taejon, República da Coréia) em 26 de outubro de 2006,e teve atribuído o número de depósito No. KCTCl 1013BP.
2.4 - Seleção e Identificação
de um Transformante AldhA::cmR Z. mobilis
O transformante obtido na etapa 2-3) foi posto em culturaem um meio sólido RM (glucose 50 g/L, extrato de levedura lOg/L,MgSO4 lg/L, (NH4)2SO4 lg/L, KH2PO4 2g/L, clorafenicol 75 μg/mL, pH5,2) contendo clorafenicol a 30°C por 5 dias e, então, as células vivasresistentes ao clorafenicol foram coletadas.
Para identificar se as células coletadas eram do transfor-mante Z. mobilis {AlcLhAr.cmF) ou não, uma modalidade da presenteinvenção usou o método mostrado na Figura 5. A células vivas resis-tentes a clorafenicol foram postas em cultura em um meio líquido RM(glucose 50 g/L, extrato de levedura lOg/L, MgSO4 lg/L, (NH4)2SO41g/L, KH2PO4 2g/L, clorafenicol 75 μg/mL, pH 5,2) a 30°C por 16 h e osobrenadante foi removido por centrifugação a 5.000 rpm por 5 minu-tos, e então as células foram coletadas. Como mostrado na Figura 5, nocaso de um genoma de Z. mobilis do tipo natural contendo o gene IdhA,o comprimento das seqüências de DNA entre a região do iniciador (pr-ldhAF) localizada a montante do gene IdhA e a região do iniciador (dn-ldhAR) localizada a jusante do gene IdhA foi 1.861 bp, por outro lado,no caso de um transformante Z. mobilis onde o gene IdhA foi substituídopelo gene cmR, o comprimento das seqüências de DNA entre os doisiniciadores foi de 1.493 bp. Deste modo, pela identificação do compri-mento da região amplificada pelo PCR usando o iniciador fixado nadireção do genoma das células vivas coletadas, pode ser avaliado se o Z.mobilis AldhA::cmR é o transformante ou não.Em mais detalhes, o DNA genômico das células vivas cole-tadas foi isolado usando o kit DNA Easy Tissue (QIAGEN Corp.,Valencia, Califórnia, EUA) de acordo com as instruções do fabricante.Então a reação PCR em direção ao genoma DNA foi efetuada usando uminiciador como estabelecido a seguir:
Iniciador direto (npr-ldhAF):
5'-CAGCAAGTTCGATCTGTCTGGCGATCG-3' (SEQ ID NO: 15)Iniciador reverso (dn-ldhAR):
5'-GATTAAATAATGCGGCGATGGCTAAGCAAGG-3' (SEQ IDNO: 16)
Como controle, um Z. mobilis do tipo natural foi tratadocom os dois iniciadores como acima.
Os resultados são mostrados na Figura 6. Na Figura 6, WTindica um Z. mobilis do tipo natural como um controle e Ml, M2 e M3indica o transformante Z. mobilis AldhA::cmR, respectivamente. Comomostrado na Figura 6, uma modalidade da presente invenção obteveum fragmento de nucleotídeo de 1.493 bp, indicando que foi removido ogene IdhA.
Exemplo 3
Preparação de ambos o transformante Z. mobiliscom Genes pdc e IdhA Removidos
A seguir, o processo dos Exemplos 1 e 2 foi continuamenteefetuado e, depois disso, foi preparado o transformante Z. mobilis comgenes pdc e IdhA (Apdc::tetR /AldhA::cm*) removidos. O transformanteΖ. mobilis (Apdc::tetR /AldhAr.cmF) foi depositado no Korean Collectionfor Type Culture (Korea Research Institute of Bioscience and Biotechno-Iogy, Taejon, República da Coréia) em 15 de fevereiro de 2006 e teveatribuído o número de depósito No. KCTC10908BP.
Exemplo 4
Teste de Produtividade dos Metabólitos Primários
Para investigar a produtividade de metabólitos primários decada transformante Z. mobilis, foram usados os transformantes Z.mobilis preparados dos Exemplos 1 a 3. Como controle, foi usada umacepa ZM4 Z. mobilis do tipo natural.
Em mais detalhes, um ZM4 Z. mobilis do tipo natural (ATCC31821), um transformante Z. mobilis (.Apdcr.tetum transformante Z.mobilis [AldhAr.cm^) e um transformante Z. mobilis (Apdc::tetR/AldhAr.cmforam postos em cultura em um meio líquido RM (glucose50 g/L, extrato de levedura lOg/L, MgSO4 lg/L, (NH4JaSO4 lg/L,KH2PO4 2g/L, tetraciclina 15 μg/mL, pH 5,2) a 30°C por 16 h, respecti-vamente. Aqui, os transformantes foram preparados a partir dosExemplos 1 a 3. Após o cultivo, as células foram removidas porcentrifugação e, então, foram medidos os metabólitos primários obtidosdo sobrenadante cultivado usando HPLC (cromatografia líquida de altodesempenho). Na medida com HPLC, um sistema Hitachi HPLC (ModeloD-7000, Tóquio, Japão) foi usado e os metabólitos foram separadosusando uma coluna Aminex HPX-87H (Bio-Rad, EUA). Entre osmetabólitos primários, foi identificado e quantificado o ácido orgânicocom um detector UV (ultravioleta) (Hitachi D-4200, Tóquio, Japão),açúcar e etanol com um detector RI (índice de refração) (Hitachi D-3300, Tóquio, Japão), respectivamente. 0,0025 N de ácido sulfúrico foiusado como fase móvel (solvente), a temperatura da coluna foi de 60°Ce a taxa de fluxo foi de 0,6 ml/minutos.O processo foi repetido 3 vezes e a média dos resultadosna seguinte Tabela 2 e Figuras 7A a 10 B, respectivamente.<table>table see original document page 33</column></row><table>Como mostrado na Tabela 2, os transformantes preparadosa partir dos Exemplos 1 a 3 foram confirmados com o aumento naprodutividade do succinato comparado com o tipo natural.
Também, o transformante ΔldhA::cmR foi confirmado com aexcelente produtividade do etanol e o transformante Apdc::tetR foiconfirmado com a excelente produtividade de succinato e lactato,respectivamente.
Exemplo 5
Teste da Taxa de Crescimento de Célulae de Produtividade de Metabólitos Primários
Os transformantes foram postos em cultura com métodosidênticos aos do Exemplo 4 e a análise cinética foi avaliada para utilizarcomo uma medida para determinar o crescimento da biomassa eprodução de metabólito primário (daqui em diante referido como'produto') de acordo com o tempo. Na análise cinética, os valoresmedidos em uma fase de crescimento exponencial, nominalmente umponto entre o crescimento de biomassa máximo e produto, foramobtidos pelo seguinte método:
1. Taxa de crescimento específico (MmaxHlr1)
<formula>formula see original document page 34</formula>dt = diferença no tempo.
2. Rendimento da biomassa (Yx/s) e rendimentodo produto (Yp/s)
Yx/s = -dx/ds...................................< Fórmula 1.3>
Yx/s = (X-X0)/(S0-S) ..........................<Fórmula 1.4>
dx = diferença na biomassa;
ds= diferença no substrato (glucose).
Yp/s = dp/ds....................................< Fórmula 1.5>
Yp/s = (P-P0)/(S0-S) ..........................<Fórmula 1.6>
dp = diferença no produto;
ds = diferença no substrato (glucose).
3. Taxa de consumo de glucose específico (qs)(g g"1 h"1)
ds = -qs χ dt (qs = taxa de consumo de glucose especí-fico) < Fórmula 1.7>
A partir das Fórmulas 1.1 e 1.3,
qs = (1/Yx/s) χμ................................. <Fórmula 1.8>
4. Taxa de produção de succinato específica (qp) (g g-1h-i)
dp = -qp x dt (qp = taxa de produção de succinato es-pecífica) < Fórmula 1.9>A partir das Fórmulas 1.1 e 1.4,
qp = (1/Yp/x) χμ........................... <Fórmula 1.10>
5. Produtividade (g I1 h1)
Como não existe um parâmetro cinético da produtividade, aconcentração de produto máxima produzida durante a fase de cresci-mento exponencial, a qual é o período de produção mais ativo, foidescrita pelo seguinte método:
P (Produtividade) = dP/dt.............. <Fórmula 1.11>
dP = diferença no produto durante a fase de cresci-mento exponencial (g l·1)
dt = diferença no tempo durante a fase de crescimen-to exponencial (h)
Valores aproximados podem também ser calculadoscom o seguinte método:
P = (Yp/s)(Yx/s) χ μ........................<Fórmula 1.12>
6. Rendimento molar do ácido succínico
O rendimento molar do ácido succínico tem um significadoidêntico que o rendimento do produto, onde o primeiro foi expressocomo um rendimento molar não uma percentagem (%). Teoricamente,como o ácido succínico produzido de 1 mol (180 g) de glucose é apenas2 moles (236 g), após fazer a mudança do ácido succínico realmenteproduzido (g) com concentração molar, o valor divide com o valor apósfazer a mudança de glucose (g) usado no experimento com concentraçãomolar. Como resultado, o valor propósito foi obtido.
[ácido succínico (g)/glucose (g)]........< Fórmula 1.13>Os resultados da análise cinética em relação a um ZM4 dotipo natural, um transformante Apdc e um transformante Apdc/AldhAsão descritos na seguinte Tabela 3 e o crescimento celular, o consumode glucose e o rendimento do produto são descritos nas Figuras IlAa11C, respectivamente.<table>table see original document page 38</column></row><table>A presente invenção proporciona um método de produçãoem massa de vários metabólitos primários contendo ácidos orgânicosque são ambientalmente amigáveis e tem aplicação industrial pelainibição específica de um metabólito do metabolismo em microorganis-mos e os ácidos orgânicos de acordo com a presente invenção podemser usados ao invés dos materiais de síntese química prévios em várioscampos, e ela pode também fornecer os efeitos da redução do custo eproteção ambiental.
<table>table see original document page 19</column></row><table>
BUDATAST TREATY OF THE INTERNATIONAL RECOGNITION OF THE DEPOSITOF THE MICROORGANISMS FOR THE PURPOSE OF PATENT PROCEDURE
INTERNATIONAL FORMRECEIPT IN THE CASE OF AN ORIGINAL DEPOSITissued pursuant to Rule 7.1
TO: KIM Jae YoungLife Science Institute, Macrogen Inc.10F, World Meridian Venture Center80-24, Gasan-dong, Keumchan-gu Seoul 158-081Budapest Treaty on the International Recognition of the Depositof Microorganisms for the Purpose of the Patent Procedures
International FormReciept in the Case if an Original Depostitissued pursuant to Rule 7.1
To: KIM, Jae YoungLife Science Institute, Macrogen Inc., 10F, World Meridian Venture Center80-24 Gasan-dong, Keumchun-gu, Seoul 153-081Republic of Korea
<table>table see original document page 40</column></row><table>BUDAPEST TREATY ON THE INTERNATIONAL RECOGNITION OF THE DEPOSIT OF MICROORGANISMS FOR THE PURPOSE OF PATENT PROCEDURE
INTERNATIONAL FORMRECEIPT IN THE CASE OF AN ORIGINAL DEPOSITissued pursuant to Rule 7.1
TO: KIM JAE YoungLife Science Institute, Macrogen Inc., 10F, World Meridian Venture CenterЄO-24 Gasan-dong, Keumchun-gu, Seoul 153-081Republic of Korea
<table>table see original document page 41</column></row><table>

Claims (19)

1. Método de Produção em Massa de Pelo Menos um Metabólito-9 Primário, selecionado do grupo que consiste em etanol, lactato,piruvato, citrato, glutamato, succinato, fumarato, e malato por umacepa Zymomonas mobilis (Z. mobilis), caracterizado por apagar pelomenos um gene selecionado do grupo que consiste num piruvatodecarboxilase que codifica o gene pdc (SEQ ID NO: 1) e um lactatodesidrogenase que codifica o gene IdhA (SEQ ID NO: 2) a partir de um
2. Método de Produção em Massa de Pelo Menos um MetabólitoPrimário, de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por que éproduzido pelo menos um metabólito primário selecionado do grupo queconsiste em succinato e lactato apagando o gene pdc (SEQ ID NO: 1).
3. Método de Produção em Massa de Pelo Menos um MetabólitoPrimário, de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por que éproduzido pelo menos um metabólito primário selecionado do grupo queconsiste em etanol e succinato apagando o gene IdhA (SEQ ID NO: 2).
4. Método de Produção em Massa de Pelo Menos um MetabólitoPrimário, de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por que osuccinato é produzido apagando tanto o gene pdc (SEQ ID NO: 1) comoo gene IdhA (SEQ ID NO: 2).
5. Transformante para Produção em Massa de Pelo Menos umMetabólito Primário, selecionado do grupo que consiste em etanol,lactato, piruvato, citrato, glutamato, succinato, fumarato e malato,caracterizado por que o transformante é preparado apagando pelomenos um gene selecionado do grupo que consiste num gene pdc (SEQID NO: 1) e um gene IdhA (SEQ ID NO: 2) a partir do genoma deZymomonas mobilis.
6. Transformante para Produção em Massa de Pelo Menos umMetabólito Primário, de acordo com a Reivindicação 5, caracterizadopor que o gene pdc (SEQ ID NO: 1) é apagado de Z mobilis, aumentando,assim, a produção de pelo menos um metabólito primário selecionadodo grupo que consiste em succinato e lactato.
7. Transformante para Produção em Massa de Pelo Menos umMetabólito Primário, de acordo com a Reivindicação 5, caracterizadopor que o gene IdhA (SEQ ID NO: 2) é apagado de Z mobilis, aumentan-do, assim, a produção de pelo menos um metabólito primário seleciona-do do grupo que consiste em etanol e succinato.
8. Transformante para Produção em Massa de Pelo Menos umMetabólito Primário, de acordo com a Reivindicação 5, caracterizadopor que ambos o gene pdc (SEQ ID NO: 1) e o gene IdhA (SEQ ID NO: 2)são apagados de Z mobilis, aumentando, assim, a produção de succina-to.
9. Transformante para Produção em Massa de Pelo Menos umMetabólito Primário, de acordo com a Reivindicação 5, caracterizadopor que o transformante é uma cepa selecionada do grupo que consisteem KCTC 11012BP, KCTC 11013BPe KCTC 10908BP.
10. Método de Preparação de um Transformante Z mobilis, deacordo com a Reivindicação 5, caracterizado por que compreendeapagar pelo menos um gene selecionado do grupo que consiste numgene pdc (SEQ ID NO: 1) e um gene IdhA (SEQ ID NO: 2) a partir de umgenoma de Z mobilis.
11. Método de Preparação de um Transformante Z mobilis, deacordo com a Reivindicação 10, caracterizado por que compreende asetapas de:clonar o fragmento que contém o gene pdc de Z mobilis(SEQ ID NO: 1) num plasmídio;remover o gene pdc a partir do plasmídio que contém o genepdc; etransformar o plasmídio do gene pdc apagado num genomade Z mobilis.
12. - Método de Preparação de um Transformante Z mobilis, deacordo com a Reivindicação 11, caracterizado por que o fragmento quecontém o gene pdc compreende de 1.500 a 5.000 bp de uma regiãohomóloga para recombinação homóloga localizada em ambas as regiõesterminais 5'- e 3'- do gene pdc em conjunto com o gene pdc do Z mobilis.
13. - Método de Preparação de um Transformante Z mobilis, deacordo com a Reivindicação 10, caracterizado por que compreende asetapas de:clonar o fragmento que contém o gene IdhA de Z mobilis(SEQ ID NO: 2) num plasmídio;remover o gene IdhA do plasmídio que contém o gene IdhA;etransformar o plasmídio do gene IdhA apagado numgenoma de Z mobilis.
14. - Método de Preparação de um Transformante Z mobilis, deacordo com a Reivindicação 13, caracterizado por que o fragmento quecontém o gene IdhA compreende de 1.500 a 5.000 bp de uma regiãohomóloga para recombinação homóloga localizada em ambas as regiõesterminais 5'- e 3'- do gene IdhA em conjunto com o gene IdhA do Z.mobilis.
15. Método de Preparação de um Transformante Z mobilis, deacordo com a Reivindicação 10, caracterizado por que compreendeetapas consecutivas de:clonar o fragmento que contém o gene pdc do Z mobilis(SEQ ID NO: 1) num plasmídio;remover o gene pdc do plasmídio que contém o gene pdc;transformar o plasmídio do gene pdc apagado num genomade Z mobilis; eclonar o fragmento que contém o gene IdhA do Z mobilis(SEQ ID NO: 2) num plasmídio;remover o gene IdhA do plasmídio que contém o gene IdhA;transformar o plasmídio que contém o gene IdhA apagadonum genoma de Z mobilis.
16. Método de Produção em Massa de Pelo Menos um MetabólitoPrimário, selecionado do grupo que consiste em etanol, lactato,piruvato, citrato, glutamato, succinato, fumarato e malato, caracteri-zado por que compreende as etapas de:preparar um transformante de Z mobilis em que pelo menosum gene selecionado do grupo que consiste no gene pdc (SEQ ID NO: 1)e no gene IdhA (SEQ ID NO: 2) é apagado; ecultivar o transformante Z mobilis durante 10a 14 h a 30 a-34 °C .
17. Método de Produção em Massa de Pelo Menos um MetabólitoPrimário, de acordo com a Reivindicação 16, caracterizado por que aetapa de cultivar o transformante de Z mobilis é realizada adicionandode 0,2 a 1 wm de gás de gás carbônico ou usando um meio de culturaque contém de 1 a 50 mm de carbonato.
18. - Método de Produção em Massa de Pelo Menos um MetabólitoPrimário, de acordo com a Reivindicação 17, caracterizado por que ocarbonato é selecionado do grupo que consiste EM NAHCO3, NA2CO3 eCaCO3.
19. - Método de Produção em Massa de Pelo Menos um MetabólitoPrimário, de acordo com qualquer das Reivindicações de 16 a 18,caracterizado por que a etapa de cultivar o transformante de Z mobilisé realizada adicionando de 0,2 a 1 wm de hidrogênio gasoso.
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