JP2014506477A

JP2014506477A - 高光学純度の乳酸生産用形質転換体およびそれを利用した乳酸生産方法

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Publication number: JP2014506477A
Application number: JP2013555345A
Authority: JP
Inventors: ジェ−ヨン・キム; サン−フム・シン; ヒョン−ヨン・チョン; カプ−ソク・ヤン; ジョン−スン・セオ
Original assignee: マクロジェン・インコーポレーテッド
Priority date: 2011-02-23
Filing date: 2011-02-23
Publication date: 2014-03-17
Anticipated expiration: 2031-02-23
Also published as: US9428775B2; EP2679668B1; US20140128635A1; EP2679668A4; EP2679668A1; JP5797280B2; WO2012115290A1

Abstract

本発明は、微生物を利用した乳酸の生物学的な生産方法に関するものであって、簡便且つ経済的な方法で高光学純度の乳酸を高収率で生産することができる形質転換体、その製造方法およびそれを利用した乳酸生産方法に関するものである。
本発明によって、ｐＨ条件など生産条件の厳しい制限や微生物内の代謝経路の複雑な調節なしにも簡便に高光学純度の乳酸を高収率で生産することができ、また、付加的な乳酸分離精製工程が不要であるため、乳酸生産段階を顕著に減少させることができて生産費用を大幅に節減することができるだけでなく、沈澱廃棄物による環境的な問題を排除することができて環境保護効果も得ることができる。

Description

本発明は、微生物を利用した乳酸の生物学的な生産方法に関するものであって、簡便且つ経済的な方法で高光学純度の乳酸を高収率で生産することができる形質転換体、その製造方法およびそれを利用した乳酸生産方法に関するものである。

ポリ乳酸（ＰＬＡ）は、商業的に生産されるバイオプラスチック（ｂｉｏ−ｐｌａｓｔｉｃ）の原料であって、ラクチド（ｌａｃｔｉｄｅ）の縮合重合（ｃｏｎｄｅｎｓａｔｉｏｎ）によって生成される脂肪族ポリエステル（ｐｏｌｙｅｓｔｅｒ）である。ＰＬＡは、電子製品包装材、ミネラルウォーター瓶、自動車内装材、事務用家具、エンジニアリングプラスチック、繊維分野などのような非常に重要な用途を有しており、未来の代表的な生分解性バイオプラスチックとして脚光を浴びている。特に、近来の全世界的に活発に展開されている「地球環境保護運動」と共に地球温暖化、気候変化に対する環境親和的な次世代の代替繊維素材の必要性が台頭することに伴って、天然的に再利用が可能であり、汚染物質を排出せず、合成繊維と類似する物理化学的性質および機械的性質を有しながら生分解が可能なＰＬＡ生分解性繊維は無限の潜在力を有していると見ることができる。このような潜在力があるにもかかわらず、生分解性繊維はまだ一般の合成繊維に比べて５〜１０倍程度生産単価が高く、大量生産に困難が多いだけでなく、特性による用途開発が行われていないため、その実用化が微々たる実情である。

乳酸（ｌａｃｔｉｃａｃｉｄ／ｌａｃｔａｔｅ）は、医薬品（ｍｅｄｉｃｉｎｅ）、食品（ｆｏｏｄａｎｄｆｏｏｄｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ）、化粧品（ｃｏｓｍｅｔｉｃｓ）、化学製品（ｃｈｅｍｉｃａｌｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ）等の多様な分野の実用可能な原料物質（ｃｏｍｍｏｄｉｔｙｃｈｅｍｉｃａｌ）として広く知られてきた。最近は生分解性高分子（ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅｐｏｌｙｍｅｒ）であるポリ乳酸（ｐｏｌｙｌａｃｔｉｃａｃｉｄ、ＰＬＡ）の原料としても注目を浴びつつあり、使用量の急激な増加傾向と共に関連技術開発が活発が行われている。

乳酸は、生物体内で炭水化物が酸化されたピルビン酸（ｐｙｒｕｖａｔｅ）の還元でｌａｃｔａｔｅｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ酵素により生産される。乳酸は、Ｌ−（＋）−ＬａｃｔｉｃａｃｉｄとＤ−（−）−ｌａｃｔｉｃａｃｉｄの光学異性体（ｅｎａｎｔｉｏｍｅｒ）を有する特性を有しており、化学合成方法によって生産されてきたが、最近は微生物を利用した生物学的な生産方法への転換技術を通じて直接生産している。
一般に乳酸発酵生産は、（１）発酵、（２）細胞菌体および蛋白質除去、（３）乳酸分離および精製、（４）乳酸濃縮、（５）脱色の５段階で構成される。乳酸発酵生産技術は、大部分新規な乳酸生産工程の開発と持続的な改善を通じてプラント（ｐｌａｎｔｓ）の規模と生産効率向上など生産技術と経済的な蒸発濃縮器（ｅｖａｐｏｒａｔｏｒ）とメンブレイン（ｍｅｍｂｒａｎｅ）技術と共に脱水工程の革新的な進歩のような優れた分離、精製技術開発を通じた分離精製費用節減と効率向上に集中されてきた。

最近は多様なシステム分析技術と代謝工学技術を活用した温度、ｐＨ、有機酸物の生産に卓越な性能を有する一層優れた発酵微生物の開発に研究開発が集中している。しかし、現在発酵生産される乳酸は、石油から生産される乳酸に比べて高い光学選択度（ｏｐｔｉｃａｌｐｕｒｉｔｙ）と純度の乳酸を生産するために生産単価が増加し、様々な応用分野に適した多様な品質の乳酸を経済的に生産することに限界を有している。

乳酸発酵生産は、石油化学工程とは異なり、乳酸生産微生物に絶対的に依存的であるため、乳酸を大量で生産することができるのはもちろん、生産費用を節減することができるように高い光学純度の乳酸を生産することができる微生物を確保することが何よりも重要である。高純度光学選択度の乳酸を大量生産するためには、大量の乳酸原料が投入されなければならず、多段階の分離精製工程が必須に要求されるため、生産単価は急激に増加する。したがって、乳酸を大量で生産すると共に必須に要求される技術が高純度の光学選択度を有する乳酸生産微生物菌株を開発することである。そのためには、優れた光学選択度を有する乳酸生産遺伝子の確保と共に高い光学選択度の代謝流れを最適化できるシステム分析技術と高度な代謝工学技術が必須に要求される。

一般に微生物の生存条件は、中温（３０−３７℃）と中性ｐＨ（ｎｅｕｔｒａｌｐＨ７．０）の条件であり、微生物は特にｐＨに非常に敏感であり、狭いｐＨ範囲でのみ活発な生存性と生産性を示す特性がある。しかし、弱酸性を有する乳酸を生産する乳酸生産工程では乳酸の生産自体で酸度を低下させて酸性化する特性があるため、最適ｐＨを維持するために、ＮａＯＨ、（ＮＨ_４）ＯＨ、Ｃａ（ＯＨ）_２のような塩基（ｂａｓｅ）または炭酸塩（ＣａＣＯ_３）を持続的に添加することによって中性発酵ｐＨを維持することが要求される。酸度７．０の中性ｐＨでの乳酸は本質的に全てイオン化される。中性ｐＨで生産された乳酸塩（ｌａｃｔａｔｅｓａｌｔ）形態の乳酸を分離および精製するために、硫酸（ｓｕｌｆｕｒｉｃａｃｉｄ）のような強酸を添加して乳酸塩を陽イオン化（ｐｒｏｔｏｎａｔｉｏｎ）する工程が必要である。この時、添加された硫酸１モルは２モルの乳酸を生産するようになる反面、１モルの沈殿物（ｓｕｌｆａｔｅｐｒｅｃｉｐｉｔａｎｔ、ｅｇ．ＣａＳＯ_４）を同時に生産するようになる。

結果的に生産された乳酸の量と同量の硫酸が必要である。これは、より多い乳酸の回収、精製のために投入されるべき硫酸の費用が持続的に増加するだけでなく、それによって生産される沈殿物の処理費用と環境的な問題を引き起こす非経済的な工程と知られている。これを改善し経済性を確保するために、高い酸度（酸性ｐＨ）でも乳酸を生産することができる乳酸生産微生物と、このような酸性条件で生成された乳酸（ｌａｃｔｉｃａｃｉｄ）または乳酸塩（ｌａｃｔａｔｅｓａｌｔ）の沈澱廃棄物の生成なしに回収、精製することができる技術が切実に要求されてきた。

Ｎｅｕｍａｎｎｅｔａｌ．、ＴｈｅＥＭＢＯＪｏｕｍａｌＶｏｌ．１Ｎｏ．７ｐｐ．８４１−８４５、１９８２

そこで、本発明は、前記従来の技術の問題点を解決するために案出されたものであって、ｐＨ条件の制限や微生物内の代謝経路の調節なしにも高収率で乳酸を生産することができるだけでなく、別途の乳酸分離精製工程なしにも高い光学純度の乳酸を生産することができる形質転換体、その製造方法およびそれを利用した乳酸生産方法を提供することを目的とする。

前記のような課題を解決するために、本発明者らが高光学純度の乳酸を大量生産可能な乳酸生産微生物を研究している中、ロイコノストック（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）属菌株由来のＤ−乳酸デヒドロゲナーゼ（Ｄ−ｌａｃｔａｔｅｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）をコーディングする遺伝子をザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓｍｏｂｉｌｉｓ）菌株に導入することによって、別途の複雑な工程や生産条件の制約なしに簡便且つ経済的な方法でＤ−乳酸デヒドロゲナーゼ酵素活性を極大化することができ、ひいては高光学純度の乳酸生産を最大化することができることを確認して本発明を完成するように至った。

本発明は、ロイコノストック属菌株由来のＤ−乳酸デヒドロゲナーゼをコーディングする遺伝子が導入されたザイモモナス・モビリス形質転換体を提供する。

また本発明は、ザイモモナス・モビリス菌株を準備する段階と、前記ザイモモナス・モビリス菌株にロイコノストック属菌株由来のＤ−乳酸デヒドロゲナーゼをコーディングする遺伝子を導入する段階とを含むザイモモナス・モビリス形質転換体製造方法を提供する。
また本発明は、ロイコノストック属菌株由来のＤ−乳酸デヒドロゲナーゼをコーディングする遺伝子をザイモモナス・モビリス菌株に導入してザイモモナス・モビリス形質転換体を製造する段階と、
前記製造されたザイモモナス・モビリス形質転換体を培養する段階とを含む乳酸生産方法を提供する。

また本発明は、前記乳酸生産方法によって生産された高光学純度乳酸を提供する。
以下、本発明をより詳しく説明する。

乳酸（ｌａｃｔａｔｅ／ｌａｃｔｉｃａｃｉｄ）は、カルボキシ基・ヒドロキシ基・メチル基・水素の４つの原子団が結合した非対称炭素原子を有する有機化合物（化学式：Ｃ_３Ｈ_６Ｏ_３）であって、Ｄ−、Ｌ−、ＤＬ−型の光学異性質体を全て含み、好ましくはＤ−型であり得る。

前記乳酸の生産収率を高めるために、本発明の一実施形態は、ロイコノストック（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）属菌株由来のＤ−乳酸デヒドロゲナーゼをコーディングする遺伝子が導入されたザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓｍｏｂｉｌｉｓ）形質転換体を提供する。

本発明はまた、ザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓｍｏｂｉｌｉｓ）菌株を準備する段階と、前記ザイモモナス・モビリス菌株にロイコノストック（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）属菌株由来のＤ−乳酸デヒドロゲナーゼをコーディングする遺伝子を導入する段階とを含むザイモモナス・モビリス形質転換体製造方法を提供する。

前記ザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓｍｏｂｉｌｉｓ）菌株は、アルコール発酵菌であって、細胞生長に比べて産物転換率に優れた菌株であるため、Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ（Ｄ−ｌａｃｔａｔｅｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）をコーディングする遺伝子を導入することに好ましい。

前記ザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓｍｏｂｉｌｉｓ）形質転換体を利用することによって、ザイモモナス・モビリス菌株の代謝経路中のある特定の代謝経路を遮断して前記特定の代謝経路で生成される一次代謝産物以外の他の一次代謝産物の生産を増加させるなどの複雑な代謝経路の調節工程がなくても非常に簡単且つ容易な工程によって乳酸生産を顕著に向上させることができる。

本明細書における「形質転換」とは、元来の細胞が有していたものとは異なる種類の遺伝子があるＤＮＡ鎖切れまたはプラスミドが細胞らの間に浸透して元来の細胞に存在していたＤＮＡと結合、細胞の遺伝型質が変化する分子生物学的な現象を意味する。

特に本発明における形質転換とは、前記Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼをコーディングする遺伝子をザイモモナス・モビリス菌株内に導入することを意味し、「形質転換体」とは、前記遺伝子が導入されたザイモモナス・モビリス菌株を意味し、好ましくは前記ＳＥＱＩＤＮＯ：１の塩基配列で表される遺伝子（Ｄｌｄｈ−Ｌｍｅｓ１８０１／ＤｌｍｅｓＣ２）が導入された寄託番号ＫＣＴＣ１１８０３ＢＰである形質転換体である。

前記Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼをコーディングする遺伝子はこれに制限されないが、好ましくはロイコノストック属菌株由来のものであり得、より好ましくはＳＥＱＩＤＮＯ：２のアミノ酸配列で表されるペプチドまたは前記ＳＥＱＩＤＮＯ：２のアミノ酸配列とアミノ酸一致度（ｉｄｅｎｔｉｔｙ、％）が４０％以上であるペプチドをコーディングする遺伝子であり得る。

好ましくは、ＳＥＱＩＤＮＯ：２、ＳＥＱＩＤＮＯ：４、ＳＥＱＩＤＮＯ：６、またはＳＥＱＩＤＮＯ：８のアミノ酸配列で表されるペプチドをコーディングする遺伝子であり得る。

前記ＳＥＱＩＤＮＯ：２のアミノ酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ：１の塩基配列によって暗号化し、前記ＳＥＱＩＤＮＯ：４のアミノ酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ：３の塩基配列によって暗号化し、前記ＳＥＱＩＤＮＯ：６のアミノ酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ：５の塩基配列によって暗号化し、前記ＳＥＱＩＤＮＯ：８のアミノ酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ：７の塩基配列によって暗号化するものであり得る。

したがって、前記Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼをコーディングする遺伝子はこれに制限されないが、ＳＥＱＩＤＮＯ：１の塩基配列で表される遺伝子または前記ＳＥＱＩＤＮＯ：１の塩基配列で表される遺伝子と塩基配列類似度（ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ、％）が８５％以上である遺伝子であり得る。

好ましくは前記遺伝子は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１の塩基配列で表される遺伝子（Ｄｌｄｈ−Ｌｍｅｓ１８０１）、ＳＥＱＩＤＮＯ：３の塩基配列で表される遺伝子（ｌｄｈＤ−ＡＴＣＣ１９２５４）、ＳＥＱＩＤＮＯ：５の塩基配列で表される遺伝子（ｌｄｈＤ１−ＬＭＧ１８８１１）、またはＳＥＱＩＤＮＯ：７の塩基配列で表される遺伝子（Ｄ−ｌｄｈ−ＮＢＲＣ３４２６）であり得る。

前記遺伝子の導入はこれに制限されないが、好ましくは接合（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）、電気穿孔法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、および遺伝子銃方法（ｇｅｎｅｇｕｎ）からなる群より選ばれた方法を用いることができる。

前記接合（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）は、細胞間（ｄｏｎｏｒｃｅｌｌ、ｒｅｃｉｐｉｅｎｔｃｅｌｌ）の細胞表面の接合性繊毛（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｖｅｐｉｌｉ）をよるＤＮＡ伝達機作を通じて遺伝子を導入する方法である（ＬｅｄｅｒｂｅｒｇａｎｄＴａｔｕｍ，Ｎａｔｕｒｅ．Ｏｃｔ１９；１５８（４０１６）：ｐｐ．５５８．１９４６）。

前記電気穿孔法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）は、細胞に電気衝撃を与えて細胞膜に一時的に小さい孔ができるようにして細胞のＤＮＡ吸収を増加させる方法であり（Ｎｅｕｍａｎｎｅｔａｌ．，ＴｈｅＥＭＢＯＪｏｕｍａｌＶｏｌ．１Ｎｏ．７ｐｐ．８４１−８４５、１９８２；ＣｅｌｌｕｌａｒａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙＬｅｔｔｅｒｓ，ｐｐ８４９−８５８，２００２参照）、前記遺伝子銃方法は、遺伝子を金属（タングステンまたは金）粒子にコーティングした後、高圧ガスの力で発射して遺伝子を導入する方法である（ＣｅｌｌｕｌａｒａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙＬｅｔｔｅｒｓ，ｐｐ８４９−８５８，２００２参照）。

前記遺伝子のザイモモナス・モビリス菌株内の導入位置は特に制限されず、導入される位置と関係なく高光学純度の乳酸を高い収率と効率で生産することができる。したがって、非常に簡単で便利なだけでなく、費用節減の効果がある。

つまり、ザイモモナス・モビリス菌株の代謝経路と関連がない遺伝子またはその周辺地域に導入できることはもちろんであり、本発明によれば、ザイモモナス・モビリス菌株の代謝経路の調節が不要であり、代謝経路に対する影響有無とも関係がないため、代謝経路と関連した遺伝子位置に導入することも可能である。

例えば、ザイモモナス・モビリス菌株のゲノム内、ＯＲＦＺＭＯ２７０−ＺＭＯ２６３、ＯＲＦＺＭＯ００８７〜ＺＭＯ００８９、ＯＲＦＺＭＯ０３８１〜ＺＭＯ０３８４、ＯＲＦＺＭＯ０３９０〜ＺＭＯ０３９４またはＯＲＦＺＭＯ１７８６〜ＺＭＯ１７８９部位に導入することができ、または代謝経路関連遺伝子であるＬ−乳酸デヒドロゲナーゼ（ＺＭＯ０２５６）遺伝子、Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ（ＺＭＯ１２３７）、アルコールデヒドロゲナーゼＩ（ＺＭＯ１２３６）遺伝子、またはアルコールデヒドロゲナーゼＩＩ（ＺＭＯ１５９６）遺伝子位置に導入することもできる。

前記Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼをコーディングする遺伝子は、ザイモモナス・モビリス菌株のプロモーターと共にベクターに挿入して前記ザイモモナス・モビリス菌株内に導入させることができる。

使用可能なベクターとしては、公知の全ての種類のベクターを含み、例えばｐＧＭＣ、ｐＺＹ５０７、ｐＺＹ５００、およびｐＺｙｍｏのようなザイモモナス・モビリス遺伝子発現ベクターだけでなく、ｐＵＣｓｅｒｉｅｓ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔｓｅｒｉｅｓ、ｐＧＥＭｓｅｒｉｅｓなどのような一般クローニング用ベクターであり得る。好ましくは前記ベクターは、ザイモモナス・モビリスで調節可能なプロモーターを含み、選別マーカ、コンジュゲーター（ｃｏｎｊｕｇａｔｏｒ）などをさらに含むことができる。

ザイモモナスで強力に発現するプロモーターは、通常の組み換え蛋白質の発現に使用される全ての種類のプロモーターであり得、またはザイモモナス・モビリスＺＭ４由来のプロモーターを使用することもできる。例えばＺＭ４由来のａｄｈＩ（ａｄｈＡ、ＺＭＯ１２３６）、ｐｄｃ（ｐｄｃ、ＺＭＯ１３６０）またはａｄｈＩＩ遺伝子（ａｄｈＢ、ＺＭＯ１５９６）のプロモーターがあり、それ以外にもザイモモナス・モビリスＺＭ４のそれぞれの遺伝子の上流配列５００ｂｐがプロモーターとして作用が可能である。一方、大腸菌で強力に発現するｔａｃプロモーターもまたザイモモナスで使用することができる（Ｚｈａｎｇｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９９５．Ｊａｎ１３；２６７（５１９５）：ｐｐ．２４０−２４３）。

選別マーカは、抗生剤耐性遺伝子であり得、スペクチノマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子などが使用され得るが、これに限定されない。

またベクターは、宿主細胞に形質転換されてエピソーマル（ｅｐｉｓｏｍａｌ）状態で存在する場合、複製に必要な複製オリジン（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｒｉｇｉｎ）が要求される。複製オリジンとしては大部分のグラム（−）バクテリアで作用するＯｒｉＶｏｒｉｇｉｎがあり、前記ｏｒｉｇｉｎに作用するｒｅｐＡ、ｒｅｐＢ遺伝子がさらに要求され得る。

前記ベクターは、微生物に形質導入の際、微生物の染色体に挿入（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）されたりプラスミド形態で細胞質内に存在することができ、これはベクターの種類によって適切に調節することができる。染色体内にベクターが挿入される場合は、ベクター内にザイモモナス菌株で複製に必要な複製オリジンがない場合として、染色体内にプラスミドと相同性を有する部分がある場合、相同性がある部分に挿入（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）されて同一の遺伝子が連続的に２ｃｏｐｙ存在（ｓｉｎｇｌｅｃｒｏｓｓｏｖｅｒ、ｇｅｎｅｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）したり相同性部位がプラスミドの相同性部位に代替されるようになる（ｄｏｕｂｌｅｃｒｏｓｓｏｖｅｒ、ｇｅｎｅｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ）。もし染色体内にプラスミドと相同性がある部分が存在しないならば、無作為的な挿入（Ｒａｎｄｏｍｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）が起こるようになる。

また本発明は、ロイコノストック属菌株由来のＤ−乳酸デヒドロゲナーゼをコーディングする遺伝子をザイモモナス・モビリス菌株に導入してザイモモナス・モビリス形質転換体を製造する段階と、前記製造されたザイモモナス・モビリス形質転換体を培養する段階とを含む乳酸生産方法を提供する。

前記培養は、正常発酵条件であるｐＨ５．０ではもちろん、酸性発酵条件やその他ｐＨ非調節条件でも制限なしに行うことができる。例えば、ｐＨ３．０乃至ｐＨ７．０、より具体的にはｐＨ２．０乃至ｐＨ６．０、またはｐＨ３．０乃至ｐＨ５．０のような酸性条件下でも乳酸の生産が可能である。

一般に微生物の生存条件は、中温（３０−３７℃）と中性ｐＨ（ｎｅｕｔｒａｌｐＨ７．０）条件であり、微生物は特にｐＨに非常に敏感であり、狭いｐＨ範囲だけで活発な生存性と生産性を示す特性があるが、弱酸性を有する乳酸を生産する乳酸生産工程では、乳酸の生産自体で酸度を低下させて酸性化する特性があるため、最適のｐＨを維持するために、ＮａＯＨ、（ＮＨ_４）ＯＨ、Ｃａ（ＯＨ）_２のような塩基（ｂａｓｅ）または炭酸塩（ＣａＣＯ_３）を持続的に添加することによって中性発酵ｐＨを維持することが要求された。しかし、本発明の乳酸生産方法は、このようなｐＨ条件の制限なしにいかなるｐＨ条件でも高い光学純度の乳酸を高収率で生産すること

前記乳酸方法によって、好ましくは７０％以上、高い場合は１００％以上の顕著に高い生産収率で光学純度が高い優れた乳酸を大量生産することができる。
したがって、本発明は前記乳酸生産方法によって生産された高光学純度の乳酸を提供する。

前記乳酸生産方法によって生産される乳酸は、光学純度が９５％以上であり、高い場合は９９％、より高い場合は９９．９％以上の顕著に優れた光学純度を有することができる。

本発明によって、ｐＨ条件など生産条件の厳しい制限や微生物内の代謝経路の複雑な調節なしにも簡便に高光学純度の乳酸を高収率で生産することができるザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓｍｏｂｉｌｉｓ）形質転換体、その製造方法、およびそれを利用した乳酸生産方法が提供される。
前記形質転換体を利用すれば、別途の付加的な乳酸分離精製工程が不要であるため、乳酸生産段階を顕著に減少させることができて生産費用を大幅に節減することができるだけでなく、沈澱廃棄物による環境的な問題を排除することができて環境保護効果も得ることができる。

ＳＥＱＩＤＮＯ：１の塩基配列で表されるＤ−乳酸デヒドロゲナーゼをコーディングする遺伝子の発現単位を概略的に示したものである。実施例１で製造されたｐＢＳ−ｄｅｌ−２７０：：２６３ベクターの開裂地図である。実施例１で製造されたｐＢＳ−ｄｅｌ−２７０：：ｓｐ−ＤｌｍｅｓＣ２：：２６３ベクターの開裂地図である。

以下、本発明の理解を助けるために好ましい実施例を通じてより詳しく説明する。ただし、下記の実施例は本発明を予告するものに過ぎず、本発明の範囲はこれに限定されない。

実施例１．Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ＤｌｍｅｓＣ２）が導入されたＺＭ形質転換体の製造

実施例１−１．プラスミドｐＧＥＭ−Ｔ−ＤｌｍｅｓＣ２の製造

キムチから分離されたロイコノストック・メセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）菌株からＤ−乳酸デヒドロゲナーゼ酵素をコーディングするＤｌｍｅｓＣ２遺伝子（１，０６８ｂｐ）（ＳＥＱＩＤＮＯ：１）をＰＣＲ方法（９６℃で５分間にかけて前変性（ｐｒｅ−ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ）；９６℃で３０秒、６０℃で３０秒、７２℃で１分間にかけて総２５ｃｙｃｌｅｓ；７２℃で７分間にかけて後伸張（ｐｏｓｔｅｘｔｅｎｓｉｏｎ））で０．１ＵｎｉｔのＨｉｇｈ−ＦｉｄｅｌｉｔｙＰｌａｔｉｎｕｍＴａｑＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｒｏｃｈｅ）と以下に記載されたプライマーを用いて選択的に増幅、分離した。

前記ＰＣＲ工程で使用されたプライマーは次のとおりである。
正方向プライマー（ＤＬｍｅｓＣ２Ｆ）（ＳＥＱＩＤＮＯ：９）
５−ＴＧＧＡＧＧＡＴＣＣＣＡＴＧＧＴＡＡＡＧＡＴＴＴＴＴＧＣ−３
逆方向プライマー（ＤＬｍｅｓＣ２Ｒ）（ＳＥＱＩＤＮＯ：１０）
５−ＴＧＴＴＴＧＡＴＴＡＴＴＣＣＴＧＣＡＧＡＡＡＣＣＣＣＴＣ−３
以降、ｐＧＥＭ−ＴＥａｓｙｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）にクローニングしてＤｌｍｅｓＣ２遺伝子がクローニングされたプラスミドｐＧＥＭ−Ｔ−ＤｌｍｅｓＣ２を製造し、塩基配列を確認した。ＰＣＲ増幅とクローニングは製造会社の実験方法に従って行った。

実施例１−２．ＢＳ−ｄｅｌ−２７０：：ｓｐ−ＤｌｍｅｓＣ２：：２６３ベクターの製造

前記実施例１−１で製造されたプラスミド（ｐＧＥＭ−Ｔ−ＤｌｍｅｓＣ２）を制限酵素ＮｃｏＩ（ＮＥＢ）とＰｓｔＩ（ＮＥＢ）で切断した後、ザイモモナス・モビリスアルコールデヒドロゲナーゼ（ａｄｈ）ＩＩ遺伝子（ａｄｈＢ、ＺＭＯ１５９６）のプロモーター部位（ＳＥＱＩＤＮＯ：１１）とスペクチノマイシン耐性（ｓｐｅｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎｒｅｓｉｓｔａｎｔ）遺伝子（ｓｐｅｃ^Ｒ、１，１４２ｂｐ）（ＳＥＱＩＤＮＯ：１２）を有するｐＢＳ−ｓｐ−Ｐ１５９６−ｓｐｅｃ^Ｒベクター（マクロゼン）に同一の制限酵素シートでクローニングしてＤ−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ＤｌｍｅｓＣ２）を含むｐＢＳ−ｓｐ−ＤｌｍｅｓＣ２ベクターを得た。

Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ＤｌｍｅｓＣ２）をザイモモナス・モビリス遺伝体に導入するために、相同性組み換え（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）（Ａｌｂｅｒｔｓｅｔａｌ．，２００２． “Ｃｈａｐｔｅｒ５：ＤＮＡＲｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｒｅｐａｉｒ，ａｎｄＲｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ”．ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙｏｆｔｈｅＣｅｌｌ（４ｔｈｅｄ．）．ＮｅｗＹｏｒｋ：ＧａｒｌａｎｄＳｃｉｅｎｃｅ．ｐ．８４５）を利用した。

相同性組み換えに使用された遺伝子は、ザイモモナス・モビリス（ＡＴＣＣ３１８２１）の遺伝体情報から選別し、具体的にＯＲＦＺＭＯ０２６３からＺＭＯ０２７０までの８個の反復された遺伝子ら（ＳＥＱＩＤＮＯ：１３〜ＳＥＱＩＤＮＯ：２０）を選別した。ＯＲＦＺＭＯ０２６３からＺＭＯ０２７０までの反復された遺伝子らは、特定の代謝酵素をコーディングしない遺伝子らであり、全体約１０ｋｂに達する部位である。これら遺伝子らの上流相同部位の４，４６８ｂｐ遺伝子（ＳＥＱＩＤＮＯ：２１）と下流相同部位の４，９３５ｂｐ遺伝子（ＳＥＱＩＤＮＯ：２２）のそれぞれを実施例１と同一な実験方法を用いてそれぞれ選択的に増幅、分離した後、ＨｉｎｄＩＩＩ（ＮＥＢ）、ＰｓｔＩ（ＮＥＢ）、ＰｖｕＩ（ＮＥＢ）、ＳｃａＩ（ＮＥＢ）で切断した後、同一の制限酵素で切断されたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩｖｅｃｔｏｒ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にクローニングして最終的にｐＢＳ−ｄｅ−２７０：：２６３ベクター（図２）を製造した。使用されたプライマーは次のとおりである。

上流遺伝子正方向プライマー（Ｌ−２７０Ｆ）（ＳＥＱＩＤＮＯ：２３）
５−ＧＧＡＡＡＧＴＣＡＡＧＣＴＴＡＴＣＡＴＣＴＡＧ−３
上流遺伝子逆方向プライマー（Ｌ−２７０Ｒ）（ＳＥＱＩＤＮＯ：２４）
５−ＧＴＧＡＧＴＴＧＴＴＡＡＣＣＡＡＴＴＴＴＡＴＡＣＴＣＣＡＴＴＣＡＴＣ−３
下流遺伝子正方向プライマー（Ｒ２６３Ｆ）（ＳＥＱＩＤＮＯ：２５）
５−ＧＡＣＡＡＴＡＣＡＡＡＧＴＡＣＴＧＡＴＡＡＡＧＧＡ−３
下流遺伝子逆方向プライマー（Ｒ２６３Ｒ）（ＳＥＱＩＤＮＯ：２６）
５−ＡＴＡＡＧＣＣＴＧＴＴＡＡＣＴＴＡｃｃＣＡＴＣＴＴＧＴＣＣＧＡＣＧ−３
上記で製造されたｐＢＳ−ｓｐ−ＤｌｍｅｓＣ２ベクターを制限酵素ＮｏｔＩ（ＮＥＢ）とＰｓｔＩ（ＮＥＢ）で切断して、ｓｐｅｃ^Ｒ−ＤｌｍｅｓＣ２遺伝子切片だけを回収し、Ｔ４ＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＮＥＢ）とＴ４ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｋｉｎａｓｅ酵素（ＮＥＢ）処理を通じて平滑末端（ｂｌｕｎｔｅｎｄ）のｓｐｅｃ^Ｒ−ＤｌｍｅｓＣ２遺伝子切片を作製した。作製された平滑末端のｓｐｅｃ^Ｒ−ＤｌｍｅｓＣ２を前記製造されたｐＢＳ−ｄｅｌ−２７０：：２６３ベクターの制限酵素ＨｐａＩシートにＴ４ＤＮＡｌｉｇａｓｅ（ＮＥＢ）酵素でライゲーション（ｌｉｇａｔｉｏｎ）およびクローニングしてｐＢＳ−ｄｅｌ−２７０：：ｓｐ−ＤｌｍｅｓＣ２：：２６３ベクター（図３）を製造した。

実施例１−３．Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ＤｌｍｅｓＣ２）が導入されたＺＭ形質転換体の製造

前記実施例１−２で製造されたｐＢＳ−ｄｅｌ−２７０：：ｓｐ−ＤｌｍｅｓＣ２：：２６３ベクターをザイモモナス・モビリスＺＭ４菌株（ＡＴＣＣ３１８２１）に電気穿孔法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）（Ｎｅｕｍａｎｎｅｔａｌ．，ＴｈｅＥＭＢＯＪｏｕｍａｌＶｏｌ．１Ｎｏ．７ｐｐ．８４１−８４５，１９８２）で形質転換し、ＲＭ培地（グルコース、２０ｇ／ｌ；酵母抽出物（ＤＩＦＣＯ）、１０ｇ／ｌ；ＭｇＳＯ_４、１ｇ／ｌ；（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、１ｇ／ｌ；ＫＨ_２ＰＯ_４、２ｇ／ｌ；ａｇａｒ、１５ｇ／ｌ；ｐＨ５．０）にスペクチノマイシンを添加してｐＢＳ−ｄｅｌ−２７０：：ｓｐ−ＤｌｍｅｓＣ２：：２６３ベクターが形質転換された菌株を選別し、最終的にＯＲＦＺＭＯ０２６３からＺＭＯ０２７０反復遺伝子らが相同性組み換えられ、ｓｐ−ＤｌｍｅｓＣ２遺伝子が導入された形質転換体をＺｙｍｏｍｏｎａｓｍｏｂｉｌｉｓＭＧ６１０６と命名し、２０１０年１１月５日付で韓国生命工学研究院微生物資源センターに寄託して寄託番号ＫＣＴＣ１１８０３ＢＰを付与された。

実施例２．多様なＤ−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子が導入された乳酸生産ＺＭ菌株の製造

ロイコノストック・クレモリス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃｃｒｅｍｏｒｉｓ）ＡＴＣＣ１９２５４、ロイコノストック・メセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）ＬＭＧ１８８１１、およびロイコノストック・メセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）ＮＢＲＣ３４２６菌株由来のＤ−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子であるｌｄｈＤ−ＡＴＣＣ１９２５４、ｌｄｈＤ１−ＬＭＧ１８８１１、およびＤ−ｌｄｈ−ＮＢＲＣ３４２６を実施例１と同様な方法と材料を用いてＰＣＲ増幅、分離した。前記多様なＤ−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の増幅に使用されたプライマーは次のとおりである。

［ｌｄｈＤ−ＡＴＣＣ１９２５４遺伝子増幅プライマー］
ＡＴＣＣ１９２５４Ｆ（ＳＥＱＩＤＮＯ：２７）
５−ＣＡＴＡＴＧＡＡＧＡＴＴＴＴＴＧＣＴＴＡＣＧＧＣＡＴＴＣＧＴ−３
ＡＴＣＣ１９２５４Ｒ（ＳＥＱＩＤＮＯ：２８）
５−ＴＴＡＡＴＡＴＴＣＡＡＣＡＧＣＡＡＴＡＧＣＴ−３

［ｌｄｈＤ１−ＬＭＧ１８８１１遺伝子増幅プライマー］
ＬＭＧ１８８１１Ｆ（ＳＥＱＩＤＮＯ：２９）
５−ＣＡＴＡＴＧＡＡＡＡＴＴＴＴＴＧＣＴＴＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧ−３
ＬＭＧ１８８１１Ｒ（ＳＥＱＩＤＮＯ：３０）
５−ＣＴＧＣＡＧＴＣＡＧＴＡＴＴＴＡＡＣＡＧＣＧＡＴＴＧＣＡ−３

［Ｄ−ｌｄｈ−ＮＢＲＣ３４２６遺伝子増幅プライマー］
ＮＢＲＣ３４２６Ｆ（ＳＥＱＩＤＮＯ：３１）
５−ＣＡＴＡＴＧＡＡＧＡＴＴＴＴＴＧＣＴＴＡＣＧＧＣＡＴＴＣＧ−３
ＮＢＲＣ３４２６Ｒ（ＳＥＱＩＤＮＯ：３２）
５−ＣＴＧＣＡＧＴＴＡＡＴＡＴＴＣＡＡＣＡＧＣＡＡＴＡＧＣＴ−３

個別に増幅されたＰＣＲ産物は、制限酵素ＮｃｏＩ（ＮＥＢ）とＰｓｔＩ（ＮＥＢ）で切断して同一の制限酵素で切断されたｐＢＳ−ｓｐ−Ｐ１５９６−ｓｐｅｃ^Ｒベクター（マクロゼン）に同一の制限酵素シートにＴ４ＤＮＡｌｉｇａｓｅ酵素（ＮＥＢ）でライゲーション（ｌｉｇａｔｉｏｎ）およびクローニングし、ＮＢＲＣ３４２６菌株のＤ−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を含むベクターであるｐＢＳ−ｓｐ−Ｄ−ＮＢＲＣ３４２６ｌベクター、ＬＭＧ１８８１１菌株のＤ−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を含むベクターであるｐＢＳ−ｓｐ−Ｄ−ＬＭＧ１８８１１、そしてＡＴＣＣ１５２９４菌株のＤ−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を含むベクターであるｐＢＳ−ｓｐ−Ｄ−ＡＴＣＣ１５２９４ベクターをそれぞれ作製した。

前記ベクターらを制限酵素ＮｏｔＩ（ＮＥＢ）とＰｓｔＩ（ＮＥＢ）で切断して、ｓｐｅｃ^Ｒ−Ｄ−ＮＢＲＣ３４２６ｌ、ｓｐｅｃ^Ｒ−Ｄ−ＬＭＧ１８８１１、そしてｓｐｅｃ^Ｒ−Ｄ−ＡＴＣＣ１５２９４遺伝子切片を回収し、Ｔ４ＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＮＥＢ）とＴ４ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｋｉｎａｓｅ酵素（ＮＥＢ）処理を通じて平滑末端（ｂｌｕｎｔｅｎｄ）の遺伝子切片それぞれを作製した。作製された平滑末端の遺伝子切片を前記実施例１で製造されたｐＢＳ−ｄｅｌ−２７０：：２６３ベクターの制限酵素ＨｐａＩシートにクローニングしてｐＢＳ−ｄｅｌ−２７０：：ｓｐ−Ｄ−ＮＢＲＣ３４２６ｌ：：２６３ベクター、ｐＢＳ−ｄｅｌ−２７０：：ｓｐ−Ｄ−ＬＭＧ１８８１１：：２６３ベクター、そしてｐＢＳ−ｄｅｌ−２７０：：ｓｐ−Ｄ−ＡＴＣＣ１５２９４：：２６３ベクターをそれぞれ製造した。

上記で製造されたベクターらをザイモモナス・モビリスＺＭ４菌株（ＡＴＣＣ３１８２１）に電気穿孔法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）で形質転換し、ＲＭ培地（グルコース、２０ｇ／ｌ；酵母抽出物（ＤＩＦＣＯ）、１０ｇ／ｌ；ＭｇＳＯ_４、１ｇ／ｌ；（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、１ｇ／ｌ；ＫＨ_２ＰＯ_４、２ｇ／ｌ；ａｇａｒ、１５ｇ／ｌ；ｐＨ５．０）にスペクチノマイシンを添加して形質転換された菌株を選別し、最終的にＯＲＦＺＭＯ０２６３からＺＭＯ０２７０反復遺伝子らが相同性組み換えられ、ロイコノストック・クレモリスＡＴＣＣ１９２５４菌株からＤ−乳酸デヒドロゲナーゼ酵素をコーディングするｌｄｈＤ−ＡＴＣＣ１９２５４遺伝子（９９６ｂｐ）（ＳＥＱＩＤＮＯ：３）が導入された菌株をＭＧ６１１５、ロイコノストック・メセンテロイデスＬＭＧ１８８１１菌株からＤ−乳酸デヒドロゲナーゼ酵素をコーディングするｌｄｈＤ１−ＬＭＧ１８８１１遺伝子（９９６ｂｐ）（ＳＥＱＩＤＮＯ：５）が導入された菌株をＭＧ６１１６、そしてロイコノストック・メセンテロイデスＮＢＲＣ３４２６からＤ−乳酸デヒドロゲナーゼ酵素をコーディングするＤ−ｌｄｈ−ＮＢＲＣ３４２６遺伝子（９９６ｂｐ）（ＳＥＱＩＤＮＯ：７）が導入された菌株をＭＧ６１１７とそれぞれ命名した。

実施例３．遺伝体内の代謝経路と無関係な遺伝子または部位を除去し、Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を導入したＺＭ菌株の製造

Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の菌株内導入位置およびこれによる乳酸生産程度に対する影響を調べてみるために、ザイモモナス・モビリス菌株（ＡＴＣＣ３１８２１）内の代謝経路と無関係な特定の遺伝体位置に該当する遺伝子または部位を除去すると同時に、ＳＥＱＩＤＮＯ：１の塩基配列を有するＤｌｍｅｓＣ２遺伝子を導入した菌株を製造した。具体的に、ザイモモナス・モビリス遺伝体で特定酵素をコーディングせず、いかなる遺伝子情報を有していない遺伝子部位４種類を選別してそれぞれ除去すると同時に、ＤｌｍｅｓＣ２遺伝子が導入された菌株を製造した。菌株製造は実施例１と同様な方法を用い、代謝経路と無関係な遺伝子のそれぞれの上流相同部位および下流相同部位約３，０００ｂｐ以上を相同性組み換え部位にクローニングして用いた。

実施例３−１．ＺＭＯ００８７〜ＺＭＯ００８９の３種類のＯＲＦ部位を除去し、Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を導入したベクターの製造

ＺＭＯ００８７〜ＺＭＯ００８９の３種類のＯＲＦ（ｏｐｅｎｒｅａｄｉｎｇｆｒａｍｅ）らを５’末端側に５’末端から上流相同部位の３，１６８ｂｐ（ＳＥＱＩＤＮＯ：３３）と３’末端側に３’末端から下流相同部位の３，１５９ｂｐ（ＳＥＱＩＤＮＯ：３４）をそれぞれ正方向プライマー（８７Ｆ）と逆方向プライマー（８９Ｒ）対を用いて実施例１と同様な方法と条件でＰＣＲ増幅し、ただし、伸張時間を１０分に調節した。

正方向プライマー（８７Ｆ）（ＳＥＱＩＤＮＯ：３５）
５−ＴＧＡＡＡＴＧＧＣＣＴＣＴＧＣＧＡＴＡＴＡＴＣＧＡＡＴＡ−３
逆方向プライマー（８９Ｒ）（ＳＥＱＩＤＮＯ：３６）
５−ＧＴＡＡＧＧＧＴＡＴＣＧＣＴＣＣＧＣＴＣＴＴＴＡＴＧＧＣＧＧＡ−３

増幅されたＰＣＲ産物は、制限酵素ＮｏｔＩ（ＮＥＢ）で処理した後、同一の制限酵素で切断されたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にクローニングしてｐＢＳ−ＺＭＯ００８７８９ベクターを作製した。

以降、逆方向（ｒｅｖｅｒｓｅ）ＰＣＲ方法を応用してＯＲＦ遺伝子ＺＭＯ００８７〜ＺＭＯ００８９らを除いてｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩベクターを含む上流相同部位と下流相同部位だけを選択的にＰＣＲ増幅した。逆方向ＰＣＲ反応に使用されたプライマーら（ｄｅｌ８９Ｆおよびｄｅｌ８７Ｒ）は次のとおりであり、ＰＣＲ増幅反応は、実施例１と同様な方法と条件を用い、ただし、伸張時間を１０分に調節した。

正方向プライマー（ｄｅｌ８９Ｆ）（ＳＥＱＩＤＮＯ：３７）
５−ＴＡＡＣＣＣＧＴＴＴＡＣＣＴＣＴＡＴＣＡＴＡＴＡＡＴＴＡＴＡ−３
逆方向プライマー（ｄｅｌ８７Ｒ）（ＳＥＱＩＤＮＯ：３８）
５−ＣＡＴＡＡＡＡＴＴＣＣＴＡＣＡＡＡＴＡＴＧＡＴＣＴＴＴＴＴＡ−３

増幅されたＰＣＲ産物を制限酵素ＰｍｅＩ（ＮＥＢ）で処理して得た遺伝子切片と実施例１のｓｐ−ＤｌｍｅｓＣ２遺伝子断片をＴ４ＤＮＡｌｉｇａｓｅ（ＮＥＢ）酵素でライゲーション（ｌｉｇａｔｉｏｎ）してｐＢＳ−Ｄｅｌ８７：：ｓｐ−ＤｌｍｅｓＣ２：：８９ベクターを作製した。

実施例３−２．ＺＭＯ０３８１〜ＺＭＯ０３８４の４種類のＯＲＦ部位を除去し、Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を導入したベクターの製造

ＺＭＯ０３８１〜ＺＭＯ０３８４の４種類のＯＲＦらを５’末端側に５’末端から上流相同部位の３，１４０ｂｐ（ＳＥＱＩＤＮＯ：３９）と３’末端側に３’末端から下流相同部位の３，２１２ｂｐ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４０）をそれぞれ正方向プライマー（３８１Ｆ）と逆方向プライマー（３８４Ｒ）対を用いて実施例１と同様な方法と条件でＰＣＲ増幅し、ただし、伸張時間を１０分に調節した。

正方向プライマー（３８１Ｆ）（ＳＥＱＩＤＮＯ：４１）
５−ＧＡＡＧＡＡＧＣＧＣＡＧＡＣＣＣＴＡＴＣＴＣＡＡＣＧＡＴＣＴＴＴ−３
逆方向プライマー（３８４Ｒ）（ＳＥＱＩＤＮＯ：４２）
５−ＣＣＡＡＡＣＴＧＴＣＣＣＴＴＧＧＣＣＡＧＣＴＴＴＣＡＡＡＡＡＡＡＣ−３

増幅されたＰＣＲ産物は、制限酵素ＮｏｔＩ（ＮＥＢ）で処理した後、同一の制限酵素で切断されたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にクローニングし、ｐＢＳ−ＺＭＯ０３８１３８４ベクターを作製した。

以降、逆方向ＰＣＲ方法を応用してＯＲＦ遺伝子ＺＭＯ０３８１〜ＺＭＯ０３８４らを除いてｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩベクターを含む上流相同部位と下流相同部位だけを選択的にＰＣＲ増幅した。逆方向ＰＣＲ反応に使用されたプライマーら（ｄｅｌ３８４Ｆおよびｄｅｌ３８１Ｒ）は次のとおりであり、ＰＣＲ増幅反応は、実施例１と同様な方法と条件を使用し、ただし、伸張時間を１０分に調節した。

正方向プライマー（ｄｅｌ３８４Ｆ）（ＳＥＱＩＤＮＯ：４３）
５−ＴＧＴＡＧＴＴＴＡＴＡＣＧＣＴＧＣＡＴＴＡＡＡＴＧＡＡＡＡＧＧ−３
逆方向プライマー（ｄｅｌ３８１Ｒ）（ＳＥＱＩＤＮＯ：４４）
５−ＴＡＴＴＴＡＴＣＣＡＡＴＧＣＧＣＣＣＣＣＴＧＣＴＴＴＧ−３

増幅されたＰＣＲ産物を制限酵素ＰｍｅＩ（ＮＥＢ）で処理した後、実施例１のｓｐ−ＤｌｍｅｓＣ２遺伝子断片をＴ４ＤＮＡｌｉｇａｓｅ（ＮＥＢ）酵素でライゲーション（ｌｉｇａｔｉｏｎ）してｐＢＳ−Ｄｅｌ３８１：：ｓｐ−ＤｌｍｅｓＣ２：：３８４ベクターを作製した。

実施例３−３．ＺＭＯ０３９０〜ＺＭＯ０３９４の４種類のＯＲＦ部位を除去し、Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を導入したベクターの製造

ＺＭＯ０３９０〜ＺＭＯ０３９４の５種類のＯＲＦらを５’末端側に５’末端から上流相同部位の３，２８０ｂｐ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４５）と３’末端側に３’末端から下流相同部位の３，００８ｂｐ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４６）をそれぞれ正方向プライマー（３９０Ｆ）と逆方向プライマー（３９４Ｆ）対を用いて実施例１と同様な方法と条件でＰＣＲ増幅し、ただし、伸張時間を１０分に調節した。

正方向プライマー（３９０Ｆ）（ＳＥＱＩＤＮＯ：４７）
５−ＡＴＧＡＴＣＣＧＡＴＧＧＣＴＧＧＡＡＡＴＡＡＴＧＣＧＧＡＴＡＴＧ−３
逆方向プライマー（３９４Ｒ）（ＳＥＱＩＤＮＯ：４８）
５−ＴＡＧＣＧＧＴＣＴＧＡＧＧＣＴＧＴＧＣＣＴＣＣＧＡＴＧＴＡ−３
増幅されたＰＣＲ産物は、制限酵素ＮｏｔＩ（ＮＥＢ）で処理した後、同一の制限酵素で切断されたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にクローニングし、ｐＢＳ−ＺＭＯ０３９０３９４ベクターを作製した。

以降、逆方向ＰＣＲ方法を応用してＯＲＦ遺伝子ＺＭＯ０３９０〜ＺＭＯ０３９４らを除いてｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩベクターを含む上流相同部位と下流相同部位だけを選択的にＰＣＲ増幅した。逆方向ＰＣＲ反応に使用されたプライマーら（ｄｅｌ３９４Ｆおよびｄｅｌ３９０Ｒ）は次のとおりであり、ＰＣＲ増幅反応は、実施例１と同様な方法と条件を使用しており、ただし、伸張時間を１０分に調節した。

正方向プライマー（ｄｅｌ３９４Ｆ）（ＳＥＱＩＤＮＯ：４９）
５−ＣＡＴＣＣＡＴＴＴＴＧＧＡＴＡＴＴＡＴＴＴＴＴＡＡＡＴＴＡＡＴＣＣ−３
逆方向プライマー（ｄｅｌ３９０Ｒ）（ＳＥＱＩＤＮＯ：５０）
５−ＣＧＧＴＡＡＧＴＧＣＣＴＴＴＣＡＣＣＧＣＴＴＣＣＡＣＧＡＣＡＧ−３
増幅されたＰＣＲ産物を制限酵素ＰｍｅＩ（ＮＥＢ）で処理した後、実施例１のｓｐ−ＤｌｍｅｓＣ２遺伝子断片をＴ４ＤＮＡｌｉｇａｓｅ（ＮＥＢ）酵素でライゲーション（ｌｉｇａｔｉｏｎ）してｐＢＳ−Ｄｅｌ３９０：：ｓｐ−ＤｌｍｅｓＣ２：：３９４ベクターを作製した。

実施例３−４．ＺＭＯ１７８６〜ＺＭＯ１７８９の４種類のＯＲＦ部位を除去し、Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を導入したベクターの製造

ＺＭＯ１７８６〜ＺＭＯ１７８９の４種類のＯＲＦらは５’末端側に５’末端から上流相同部位の３，４５０ｂｐ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５１）と３’末端側に３’末端から下流相同部位の３，１００ｂｐ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５２）をそれぞれ正方向プライマー（１７８６Ｆ）と逆方向プライマー（１７８９Ｒ）対を用いて実施例１と同様な方法と条件でＰＣＲ増幅しており、ただし、伸張時間を１０分に調節した。

正方向プライマー（１７８６Ｆ）（ＳＥＱＩＤＮＯ：５３）
５−ＡＣＣＡＡＡＧＣＣＧＡＡＡＡＡＡＧＧＴＣＡＴＣＡＡＡＡＡＴＡＣＣ−３
逆方向プライマー（１７８９Ｒ）（ＳＥＱＩＤＮＯ：５４）
５−ＧＴＴＣＡＡＴＴＧＣＣＡＣＧＣＴＴＧＡＧＧＣＴＴＴＴＧＡＡＡＡＴＧＣ−３

増幅されたＰＣＲ産物は、制限酵素ＮｏｔＩ（ＮＥＢ）で処理した後、同一の制限酵素で切断されたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にクローニングし、ｐＢＳ−ＺＭＯ１７８６１７８９ベクターを作製した。

以降、逆方向ＰＣＲ方法を応用してＯＲＦ遺伝子ＺＭＯ１７８６〜ＺＭＯ１７８９らを除いてｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩベクターを含む上流相同部位と下流相同部位だけを選択的にＰＣＲ増幅した。逆方向ＰＣＲ反応に使用されたプライマーら（ｄｅｌ１７８９Ｆおよびｄｅｌ１７８６Ｒ）は次のとおりであり、ＰＣＲ増幅反応は、実施例１と同様な方法と条件を使用しており、ただし、伸張時間を１０分に調節した。

正方向プライマー（ｄｅｌ１７８９Ｆ）（ＳＥＱＩＤＮＯ：５５）
５−ＴＡＴＣＴＣＧＣＴＴＧＣＡＡＴＡＡＡＡＣＡＴＡＴＴＴＴＣＡＧＧ−３
逆方向プライマー（ｄｅｌ１７８６Ｒ）（ＳＥＱＩＤＮＯ：５６）
５−ＡＧＡＴＴＴＴＡＴＣＣＧＡＣＡＡＡＡＴＣＡＡＴＴＣＴＡＴＡＡＧ−３
増幅されたＰＣＲ産物を制限酵素ＰｍｅＩ（ＮＥＢ）で処理した後、実施例１のｓｐ−ＤｌｍｅｓＣ２遺伝子断片をＴ４ＤＮＡｌｉｇａｓｅ（ＮＥＢ）酵素でライゲーション（ｌｉｇａｔｉｏｎ）してｐＢＳ−Ｄｅｌ１７８６：：ｓｐ−ＤｌｍｅｓＣ２：：１７８９ベクターを作製した。

実施例３−５．代謝経路と無関係な遺伝子または部位がＤ−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子で置換されたＺＭ菌株の製造

前記実施例３−１乃至実施例３−４により製造されたベクターらをザイモモナス・モビリスＺＭ４菌株（ＡＴＣＣ３１８２１）に電気穿孔法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）で形質転換して代謝と無関係な遺伝子らが除去され、ｓｐ−ＤｌｍｅｓＣ２遺伝子が挿入された菌株らを次のとおり作製した。

実施例３−１のｐＢＳ−Ｄｅｌ８７：：ｓｐ−ＤｌｍｅｓＣ２：：８９ベクターをザイモモナス・モビリスＺＭ４菌株に形質転換し、抗生剤スペクチノマイシンが含まれているＲＭ培地（グルコース、２０ｇ／ｌ；酵母抽出物（ＤＩＦＣＯ）、１０ｇ／ｌ；ＭｇＳＯ_４、１ｇ／ｌ；（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、１ｇ／ｌ；ＫＨ_２ＰＯ_４、２ｇ／ｌ；ａｇａｒ、１５ｇ／ｌ；ｐＨ５．０）に選択的生長を示す形質転換体らを選別する過程を通じてＯＲＦ遺伝子ＺＭＯ００８７〜ＺＭＯ００８９がｓｐ−ＤｌｍｅｓＣ２遺伝子で置換されたＺ．ｍｏｂｉｌｉｓ ΔＺＭＯ８７８９：：ｓｐ−ＤｌｍｅｓＣ２菌株を製造し、これをＭＧ６１１８菌株と命名した。

これと同様に、実施例３−２乃至実施例３−４により製造されたｐＢＳ−Ｄｅｌ３８１：：ｓｐ−ＤｌｍｅｓＣ２：：３８４ベクター、ｐＢＳ−Ｄｅｌ３９０：：ｓｐ−ＤｌｍｅｓＣ２：：３９４ベクターおよびｐＢＳ−Ｄｅｌ１７８６：：ｓｐ−ＤｌｍｅｓＣ２：：１７８９ベクターで形質転換されてそれぞれの遺伝子部位がｓｐ−ＤｌｍｅｓＣ２遺伝子で置換されたＺ．ｍｏｂｉｌｉｓ ΔＺＭＯ３８１３８４：：ｓｐ−ＤｌｍｅｓＣ２菌株（ＭＧ６１１９菌注）、Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ ΔＺＭＯ３９０３９４：：ｓｐ−ＤｌｍｅｓＣ２菌株（ＭＧ６１２０菌注）、およびＺ．ｍｏｂｉｌｉｓ ΔＺＭＯ３９０３９４：：ｓｐ−ＤｌｍｅｓＣ２菌株（ＭＧ６１２１菌株）を製造した。

実施例４．代謝経路関連遺伝子を除去し、Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を導入したＺＭ菌株の製造

菌株内Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の導入と菌株の代謝経路調節間の関係およびその乳酸生産に対する影響を調べてみるために、菌株内の他の代謝経路遺伝子（ら）を除去すると同時にＳＥＱＩＤＮＯ：１の塩基配列を有するＤｌｍｅｓＣ２遺伝子を導入した菌株を製造した。具体的にザイモモナス・モビリス菌株の中心代謝回路に該当するエタノール（ｅｔｈａｎｏｌ）と乳酸（ｌａｃｔｉｃａｃｉｄ）生産遺伝子が除去された菌株と、ここにＤｌｍｅｓＣ２遺伝子が導入された菌株を製造した。菌株製造方法は、実施例１と同様な方法を用い、代謝経路遺伝子のそれぞれの上流相同部位および下流相同部位約３，０００ｂｐ以上を相同性組み換え部位でクローニングして用いた。

実施例４−１．乳酸デヒドロゲナーゼ（ＺＭＯ０２５６）遺伝子を除去し、Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ＤｌｍｅｓＣ２）を導入したベクターの製造

ザイモモナス・モビリスＺＭ４（ＡＴＣＣ３１８２１）のゲノム遺伝子（ＡＥ００８６９２）から乳酸デヒドロゲナーゼ（ＺＭＯ０２５６）遺伝子５’末端側に５’末端から上流相同部位の４，８７９ｂｐ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５７）と３’末端側に３’末端から下流相同部位の４，９８４ｂｐ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５８）をそれぞれ正方向プライマー（ｌｄｈＡＦ）と逆方向プライマー（ｌｄｈＡＲ）対を用いて実施例１と同様な方法と条件でＰＣＲ増幅し、ただし、伸張時間を１０分に調節した。

正方向プライマー（ｌｄｈＡＦ）（ＳＥＱＩＤＮＯ：５９）
５−ＴＧＧＣＡＧＴＣＣＴＣＣＡＴＣＴＡＧＡＴＣＧＡＡＧＧＴＧＣ−３
逆方向プライマー（ｌｄｈＡＲ）（ＳＥＱＩＤＮＯ：６０）
５−ＧＴＧＡＴＣＴＧＡＣＧＧＴＧＡＧＣＴＣＡＧＣＡＴＧＣＡＧＧ−３

増幅されたＰＣＲ産物は、制限酵素ＮｏｔＩ（ＮＥＢ）で処理した後、同一の制限酵素で切断されたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にクローニングし、ｐＢＳ−ＺＭＯ０２５６ベクターを作製した。

以降、逆方向ＰＣＲ方法を応用して乳酸デヒドロゲナーゼ（ＺＭＯ０２５６）遺伝子を除いてｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩベクターを含む上流相同部位と下流相同部位だけを選択的にＰＣＲ増幅した。逆方向ＰＣＲ反応に使用されたプライマーら（ｌｄｈＡ−ＰｍｅＩ−２ＦおよびｌｄｈＡ−ＰｍｅＩ−２Ｒ）は次のとおりであり、ＰＣＲ増幅反応は、実施例１と同様な方法と条件を使用しており、ただし、伸張時間を１０分に調節した。

正方向プライマー（ｌｄｈＡ−ＰｍｅＩ−２Ｆ）（ＳＥＱＩＤＮＯ：６１）
５−ＡＡＣＴＡＧＴＴＴＡＡＡＣＡＡＧＡＧＣＧＡＡＧＡＡＴＡＧＣＡＡＡＧＡＡＴ−３
逆方向プライマー（ｌｄｈＡ−ＰｍｅＩ−２Ｒ）（ＳＥＱＩＤＮＯ：６２）
５−ＣＴＣＴＴＧＴＴＴＡＡＡＣＴＡＧＴＴＡＴＧＧＣＡＴＡＧＧＣＴＡＴＴＡＣＧ−３

増幅されたＰＣＲ産物を制限酵素ＰｍｅＩ（ＮＥＢ）で処理した後、実施例１のｓｐ−ＤｌｍｅｓＣ２遺伝子断片をＴ４ＤＮＡｌｉｇａｓｅ（ＮＥＢ）酵素でライゲーション（ｌｉｇａｔｉｏｎ）してｐＢＳ−ＤｅｌＺＭ０２５６：：ｓｐ−ＤｌｍｅｓＣ２ベクターを作製した。

実施例４−２．Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ（ＺＭＯ１２３７）遺伝子を除去し、Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ＤｌｍｅｓＣ２）を導入したベクターの製造

ザイモモナス・モビリスＺＭ４（ＡＴＣＣ３１８２１）のゲノム遺伝子（ＡＥ００８６９２）から乳酸デヒドロゲナーゼ（ＺＭＯ１２３７）遺伝子５’末端側に５’末端から上流相同部位の３，６５６ｂｐ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６３）と３’末端側に３’末端から下流相同部位の３，８４８ｂｐ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６４）をそれぞれ正方向プライマー（Ｄｌｄｈ−Ｆ）と逆方向プライマー（Ｄｌｄｈ−Ｒ）対を用いて実施例１と同様な方法と条件でＰＣＲ増幅しており、ただし、伸張時間を１０分に調節した。

正方向プライマー（Ｄｌｄｈ−Ｆ）（ＳＥＱＩＤＮＯ：６５）
５−ＴＧＴＴＴＣＡＧＧＣＧＧＣＣＧＣＴＡＴＴＴＴＡＡＧＴＣ−３
逆方向プライマー（Ｄｌｄｈ−Ｒ）（ＳＥＱＩＤＮＯ：６６）
５−ＴＣＴＴＴＡＴＣＧＣＧＧＣＣＧＣＡＴＣＡＡＴＣＡＣＡＡ−３

増幅されたＰＣＲ産物は、制限酵素ＮｏｔＩ（ＮＥＢ）で処理した後、同一の制限酵素で切断されたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にクローニングし、ｐＢＳ−ＺＭＯ１２３７ベクターを作製した。

以降、逆方向ＰＣＲ方法を応用してＤ−乳酸デヒドロゲナーゼ（ＺＭＯ１２３７）遺伝子を除いてｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩベクターを含む上流相同部位と下流相同部位だけを選択的にＰＣＲ増幅した。逆方向ＰＣＲ反応に使用されたプライマーら（Ｄｅｌ−ＤｌｄＦおよびＤｅｌ−ＤｌｄＲ）は次のとおりであり、ＰＣＲ増幅反応は、実施例１と同様な方法と条件を使用しており、ただし、伸張時間を１０分に調節した。

正方向プライマー（Ｄｅｌ−ＤｌｄＦ）（ＳＥＱＩＤＮＯ：６７）
５−ＴＴＴＣＴＴＴＴＧＣＡＧＴＴＡＡＣＴＧＴＣＡＧＣＣＴＧＡＡ−３
逆方向プライマー（Ｄｅｌ−ＤｌｄＲ）（ＳＥＱＩＤＮＯ：６８）
５−ＴＧＡＴＣＣＴＧＴＡＴＧＧＴＴＡＡＣＡＡＴＴＧＴＴＧＣＣ−３

増幅されたＰＣＲ産物を制限酵素ＰｍｅＩ（ＮＥＢ）で処理した後、実施例１のｓｐ−ＤｌｍｅｓＣ２遺伝子断片をＴ４ＤＮＡｌｉｇａｓｅ（ＮＥＢ）酵素でライゲーション（ｌｉｇａｔｉｏｎ）してｐＢＳ−ＤｅｌＺＭ０１２３７：：ｓｐ−ＤｌｍｅｓＣ２ベクターを作製した。

実施例４−３．アルコールデヒドロゲナーゼＩ（ＺＭＯ１２３６）遺伝子を除去し、Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ＤｌｍｅｓＣ２）を導入したベクターの製造

ザイモモナス・モビリスＺＭ４（ＡＴＣＣ３１８２１）のゲノム遺伝子（ＡＥ００８６９２）からアルコールデヒドロゲナーゼＩ（ＺＭＯ１２３６）遺伝子５’末端側に５’末端から上流相同部位の３，８４４ｂｐ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６９）と３’末端側に３’末端から下流相同部位の３，８６１ｂｐ（ＳＥＱＩＤＮＯ：７０）をそれぞれ正方向プライマー（Ａｄｈ１−Ｆ）と逆方向プライマー（Ａｄｈ１−Ｒ）対を用いて実施例１と同様な方法と条件でＰＣＲ増幅しており、ただし、伸張時間を１０分に調節した。

正方向プライマー（Ａｄｈ１−Ｆ）（ＳＥＱＩＤＮＯ：７１）
５−ＡＣＴＣＡＡＴＧＧＡＡＣＴＧＣＡＧＣＡＴＧＡＴＣＴＧＡ−３
逆方向プライマー（Ａｄｈ１−Ｒ）（ＳＥＱＩＤＮＯ：７２）
５−ＡＣＣＡＡＡＧＴＡＡＣＡＴＣＴＧＣＡＧＴＧＴＴＧＡＴＡＡＴＧＧー−３

増幅されたＰＣＲ産物は、制限酵素ＮｏｔＩ（ＮＥＢ）で処理した後、同一の制限酵素で切断されたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にクローニングし、ｐＢＳ−ＺＭＯ１２３６ベクターを作製した。

以降、逆方向ＰＣＲ方法を応用してアルコールデヒドロゲナーゼＩ（ＺＭＯ１２３６）遺伝子を除いてｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩベクターを含む上流相同部位と下流相同部位だけを選択的にＰＣＲ増幅しており、逆方向ＰＣＲ反応に使用されたプライマーら（Ｄｅｌ−Ａｄｈ１ＦおよびＤｅｌ−Ａｄｈ１Ｒ）は次のとおりであり、ＰＣＲ増幅反応は、実施例１と同様な方法と条件を使用しており、ただし、伸張時間を１０分に調節した。

正方向プライマー（Ｄｅｌ−Ａｄｈ１Ｆ）（ＳＥＱＩＤＮＯ：７３）
５−ＴＴＧＣＧＡＡＴＡＴＡＧＴＴＴＡＡＡＣＧＡＴＴＧＣ−３
逆方向プライマー（Ｄｅｌ−Ａｄｈ１Ｒ）（ＳＥＱＩＤＮＯ：７４）
５−ＡＣＣＡＧＡＡＡＧＧＴＴＴＡＡＡＣＴＴＴＧＴＣＧＴＣ−３

増幅されたＰＣＲ産物を制限酵素ＰｍｅＩ（ＮＥＢ）で処理した後、実施例１のｓｐ−ＤｌｍｅｓＣ２遺伝子断片をＴ４ＤＮＡｌｉｇａｓｅ（ＮＥＢ）酵素でライゲーション（ｌｉｇａｔｉｏｎ）してｐＢＳ−ＤｅｌＺＭ０１２３６：：ｓｐ−ＤｌｍｅｓＣ２ベクターを作製した。

実施例４−４．アルコールデヒドロゲナーゼＩＩ（ＺＭＯ１５９６）遺伝子を除去し、Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ＤｌｍｅｓＣ２）を導入したベクターの製造
ザイモモナス・モビリスＺＭ４（ＡＴＣＣ３１８２１）のゲノム遺伝子（ＡＥ００８６９２）からアルコールデヒドロゲナーゼＩＩ（ＺＭＯ１５９６）遺伝子５’末端側に５’末端から上流相同部位の３、９８６ｂｐ（ＳＥＱＩＤＮＯ：７５）と３’末端側に３’末端から下流相同部位の３，８６８ｂｐ（ＳＥＱＩＤＮＯ：７６）をそれぞれ正方向プライマー（Ａｄｈ２−Ｆ）と逆方向プライマー（Ａｄｈ２−Ｒ）対を用いて実施例１と同様な方法と条件でＰＣＲ増幅し、ただし、伸張時間を１０分に調節した。

正方向プライマー（Ａｄｈ２−Ｆ）（ＳＥＱＩＤＮＯ：７７）
５−ＣＡＴＡＡＣＣＧＡＣＣＴＧＣＡＧＡＡＴＡＧＣＣＡ−３
逆方向プライマー（Ａｄｈ２−Ｒ）（ＳＥＱＩＤＮＯ：７８）
５−ＴＧＴＡＣＣＣＡＣＴＧＣＡＧＡＡＧＡＡＴＧＡＴＧ−３

増幅されたＰＣＲ産物は、制限酵素ＮｏｔＩ（ＮＥＢ）で処理した後、同一の制限酵素で切断されたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にクローニングし、ｐＢＳ−ＺＭＯ１５９６ベクターを作製した。

以降、逆方向ＰＣＲ方法を応用してアルコールデヒドロゲナーゼＩＩ（ＺＭＯ１５９６）遺伝子を除いてｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩベクターを含む上流相同部位と下流相同部位だけを選択的にＰＣＲ増幅した。逆方向ＰＣＲ反応に使用されたプライマーら（Ｄｅｌ−Ａｄｈ２ＦおよびＤｅｌ−Ａｄｈ２Ｒ）は次のとおりであり、ＰＣＲ増幅反応は、実施例１と同様な方法と条件を用い、伸長時間を１０分に調節した。

正方向プライマー（Ｄｅｌ−Ａｄｈ２Ｆ）（ＳＥＱＩＤＮＯ：７９）
５−ＣＣＴＡＣＡＴＡＣＴＡＧＴＴＴＡＡＡＣＣＡＡＣＡＡＣ−３
逆方向プライマー（Ｄｅｌ−Ａｄｈ２Ｒ）（ＳＥＱＩＤＮＯ：８０）
５−ＣＴＧＴＣＴＴＧＡＴＧＴＴＴＡＡＡＣＡＡＡＣＡＡＴＧＣ−３

増幅されたＰＣＲ産物を制限酵素ＰｍｅＩ（ＮＥＢ）で処理した後、実施例１のｓｐ−ＤｌｍｅｓＣ２遺伝子断片をＴ４ＤＮＡｌｉｇａｓｅ（ＮＥＢ）酵素でライゲーション（ｌｉｇａｔｉｏｎ）してｐＢＳ−ＤｅｌＺＭ０１５９６：：ｓｐ−ＤｌｍｅｓＣ２ベクターを作製した。

実施例４−５．代謝経路関連遺伝子がＤ−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子で置換されたＺＭ菌株の製造

前記実施例４−１乃至実施例４−４により製造されたベクターらをザイモモナス・モビリスＺＭ４菌株（ＡＴＣＣ３１８２１）に電気穿孔法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）で形質転換して代謝経路関連遺伝子らが除去され、ｓｐ−ＤｌｍｅｓＣ２遺伝子が挿入された菌株らを次のとおり作製した。

前記実施例４−１により製造されたｐＢＳ−ＤｅｌＺＭ０２５６：：ｓｐ−ＤｌｍｅｓＣ２ベクターをザイモモナス・モビリスＺＭ４菌株に形質転換し、抗生剤スペクチノマイシンが含まれているＲＭ培地（グルコース、２０ｇ／ｌ；酵母抽出物（ＤＩＦＣＯ）、１０ｇ／ｌ；ＭｇＳＯ_４、１ｇ／ｌ；（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、１ｇ／ｌ；ＫＨ_２ＰＯ_４、２ｇ／ｌ；ａｇａｒ、１５ｇ／ｌ；ｐＨ５．０）に選択的生長を示す形質転換体らを選別する過程を通じて乳酸デヒドロゲナーゼ（ＺＭＯ０２５６）遺伝子がｓｐ−ＤｌｍｅｓＣ２遺伝子で置換されたＺ．ｍｏｂｉｌｉｓ ΔＺＭＯ０２５６：：ｓｐ−ＤｌｍｅｓＣ２菌株をＭＧ６１１１菌株と命名した。

前記実施例４−２により製造されたｐＢＳ−ＤｅｌＺＭ０１２３７：：ｓｐ−ＤｌｍｅｓＣ２ベクターを実施例４−１により乳酸デヒドロゲナーゼ（ＺＭＯ０２５６）遺伝子が除去されたザイモモナス・モビリス菌株（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ ΔＺＭＯ０２５６：：ｔｅｔ）に形質転換して、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＺＭＯ０２５６）遺伝子およびＤ−乳酸デヒドロゲナーゼ（ＺＭＯ１２３７）が全て除去され、ＤｌｍｅｓＣ２遺伝子が導入されたＺ．ｍｏｂｉｌｉｓ ΔＺＭＯ０２５６：：ｃｍ、ΔＺＭＯ１２３７：：ｓｐ−ＤｌｍｅｓＣ２菌株（ＭＧ６１１２菌株）を、前述のように抗生剤スペクチノマイシンが含まれているＲＭ培地に選択的生長を示す形質転換体らを選別する過程を通じて製造した。
前記実施例４−３により製造されたｐＢＳ−ＤｅｌＺＭ０１２３６：：ｓｐ−ＤｌｍｅｓＣ２ベクターをザイモモナス・モビリスＺＭ４菌株に形質転換し、前記抗生剤スペクチノマイシンが含まれているＲＭ培地に選択的生長を示す形質転換体らを選別する過程を通じてアルコールデヒドロゲナーゼＩ（ＺＭＯ１２３６）遺伝子がｓｐ−ＤｌｍｅｓＣ２遺伝子で置換されたＺ．ｍｏｂｉｌｉｓ ΔＺＭＯ１２３６：：ｓｐ−ＤｌｍｅｓＣ２菌株（ＭＧ６１１３菌株）を製造した。

最後に、前記実施例４−４により製造されたｐＢＳ−ＤｅｌＺＭ０１５９６：：ｓｐ−ＤｌｍｅｓＣ２ベクターをザイモモナス・モビリスＺＭ４菌株に形質転換し、前記抗生剤スペクチノマイシンが含まれているＲＭ培地に選択的生長を示す形質転換体らを選別する過程を通じてアルコールデヒドロゲナーゼＩＩ（ＺＭＯ１５９６）遺伝子がｓｐ−ＤｌｍｅｓＣ２遺伝子で置換されたＺ．ｍｏｂｉｌｉｓ ΔＺＭＯ１５９６：：ｓｐ−ＤｌｍｅｓＣ２菌株（ＭＧ６１１４菌株）を製造した。

実験例１．Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼの活性（ｅｎｚｙｍｅａｃｔｉｖｉｔｙ）試験

前記実施例１乃至３で製造されたＤ−乳酸デヒドロゲナーゼ導入菌株が、ｐｙｒｕｖａｔｅを基質で利用してＤ−ｌａｃｔｉｃａｃｉｄを生産する酵素反応を促進するＤ−乳酸デヒドロゲナーゼ酵素活性を示すのか確認するために酵素活性測定実験を行った。
対照群としては野生型ザイモモナス・モビリス菌株ＺＭ４（ＡＴＣＣ３１８２１）を用い、前記野生型ＺＭ４菌株とＤ−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子が導入されたＺＭ菌株（ＭＧ６１０６、ＭＧ６１１５、ＭＧ６１１６、ＭＧ６１１７およびＭＧ６１１８）のそれぞれをＲＭ培地（グルコース、２０ｇ／ｌ；酵母抽出物（ＤＩＦＣＯ）、１０ｇ／ｌ；ＭｇＳＯ４、１ｇ／ｌ；（ＮＨ４）２ＳＯ４、１ｇ／ｌ；ＫＨ２ＰＯ４、２ｇ／ｌ；ｐＨ５．０）で対数増殖期までインキュベータ（ｉｎｃｕｂａｔｏｒ）で定置培養して生長させた後、各細胞を回収した（１２，０００ｒｐｍ、５ｍｉｎ、４℃）。回収された各細胞らを高周波破砕（ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ）方法で破砕した後、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ、４℃）して上澄液（ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ）を回収して酵素活性測定に用いた。
Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ酵素活性は２種類のキット（Ｌａｃｔｉｃａｃｉｄａｓｓａｙｋｉｔ）（Ｍｅｇａｚｙｍｅ、Ｓｉｇｍａ）を利用して製造会社の方法に従って測定し、その結果を下記表１に示した。

前記表１に示されているように、対照群である前記野生型ＺＭ４菌株の酵素活性は、０．０１２Ｕ／ｍｇｏｆｐｒｏｔｅｉｎに過ぎない反面、Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子が導入されたＺＭ菌株（ＭＧ６１０６、ＭＧ６１１５、ＭＧ６１１６、ＭＧ６１１７およびＭＧ６１１８）のそれぞれの酵素活性は、全て１Ｕ／ｍｇｏｆｐｒｏｔｅｉｎを超え、高い場合は１．５５６Ｕ／ｍｇｏｆｐｒｏｔｅｉｎまで現れてＤ−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子が導入された形質転換体の酵素活性が野生型菌株に比べて顕著に優れていることを確認することができた。

実験例２．乳酸（Ｄ−ｌａｃｔｉｃａｃｉｄ／Ｄ−ｌａｃｔａｔｅ）生産能力試験

実験例２−１．乳酸（Ｄ−ｌａｃｔｉｃａｃｉｄ／Ｄ−ｌａｃｔａｔｅ）生産能力試験方法

前記実施例１乃至４で製造されたＤ−乳酸デヒドロゲナーゼ導入菌株らのＤ−ｌａｃｔｉｃａｃｉｄ／Ｄ−ｌａｃｔａｔｅ生産能力を試験するために、前記菌株らをそれぞれｐＨを５．０に調節したＲＭ液体培地（グルコース、２０ｇ／ｌ；酵母抽出物（ＤＩＦＣＯ）、１０ｇ／ｌ；ＭｇＳＯ_４、１ｇ／ｌ；（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、１ｇ／ｌ；ＫＨ_２ＰＯ_４、２ｇ／ｌ）で、それぞれ３０℃で２０時間培養した後、前記培養した培養液から細胞を除去して得た培養上澄液を以下のような条件でＨＰＬＣ（ｈｉｇｈｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅｌｉｑｕｉｄｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）を用いて代謝産物を測定した。対照群としては前記実験例１で使用された野生型ザイモモナス・モビリス菌株ＺＭ４（ＡＴＣＣ３１８２１）を用い、比較例としてはＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（ＤｅｑｕｉｎａｎｄＢａｒｒｅ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＮｅｗＹｏｒｋ）．１９９４．Ｆｅｂ；１２（２）：１７３−１７７）および／またはＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＯＣ２菌株（Ｉｓｈｉｄａｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇ．２００６．Ｆｅｂ；１０１（２）：１７２−１７７）を用いた。

＜ＨＰＬＣ測定条件＞
ＨＰＬＣシステム：ＨｉｔａｃｈｉＨＰＬＣシステム（ｍｏｄｅｌＤ−７０００）
カラム：ＡｍｉｎｅｘＨＰＸ−８７Ｈ（３００ｍｍＸ７．８ｍｍ）
カラム温度：６０℃
流速：０．６ｍｌ／ｍｉｎ
移動床（溶媒）：０．００２５Ｎｓｕｌｆｕｒｉｃａｃｉｄ
検出器：
Ｄ−ｌａｃｔｉｃａｃｉｄ／Ｄ−ｌａｃｔａｔｅおよびその他有機酸−ＵＶ検出器（ＨｉｔａｃｈｉＤ−４２００）（２１５ｎｍ）
糖およびエタノール−ＲＩ（ｒｅｆｒａｃｔｉｖｅｉｎｄｅｘ）検出器（Ｄ−３３００）

実験例２−２．多様なＤ−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子が導入された菌株らのＤ−ｌａｃｔｉｃａｃｉｄ／Ｄ−ｌａｃｔａｔｅ生産能力試験

前記実施例１および実施例２で製造された菌株ら（ＭＧ６１０６、ＭＧ６１１５、ＭＧ６１１６、およびＭＧ６１１７）のＤ−ｌａｃｔｉｃａｃｉｄ／Ｄ−ｌａｃｔａｔｅ生産能力を前記実験例２−１に記載された方法で比較してみた結果、下記表２に示されているように、ＤｌｍｅｓＣ２遺伝子が導入された菌株であるＭＧ６１０６だけでなく、これと遺伝子一致度が９５％以上であるＬｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃｃｒｅｍｏｒｉｓＡＴＣＣ１９２５４菌株から分離されたＤ−乳酸デヒドロゲナーゼ酵素をコーディングするｌｄｈＤ−ＡＴＣＣ１９２５４遺伝子（９９６ｂｐ）（ＳＥＱＩＤＮＯ：３）、ＬｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓＬＭＧ１８８１１菌株から分離されたＤ−乳酸デヒドロゲナーゼ酵素をコーディングするｌｄｈＤ１−ＬＭＧ１８８１１遺伝子（９９６ｂｐ）（ＳＥＱＩＤＮＯ：５）、およびＬｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓＮＢＲＣ３４２６から分離されたＤ−乳酸デヒドロゲナーゼ酵素をコーディングするＤ−ｌｄｈ−ＮＢＲＣ３４２６遺伝子（９９６ｂｐ）（ＳＥＱＩＤＮＯ：７）がそれぞれ導入された菌株ＭＧ６１１５、ＭＧ６１１６、およびＭＧ６１１７も非常に高い収率および生産性で乳酸を生産できることが分かった。

したがって、前記Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子としては、ＤｌｍｅｓＣ２以外にもこれと遺伝子一致度が９５％以上である多様なＤ−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を使用可能であることを確認することができた。

実験例２−３．Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の導入位置および代謝経路調節によるＤ−ｌａｃｔｉｃａｃｉｄ／Ｄ−ｌａｃｔａｔｅ生産能力に対する影響試験

前記実施例３および実施例４で製造された菌株らのＤ−ｌａｃｔｉｃａｃｉｄ／Ｄ−ｌａｃｔａｔｅ生産能力を前記実験例２−１に記載された方法で比較してみた結果、下記表３に示されているように、ＤｌｍｅｓＣ２遺伝子が導入される特定の遺伝体位置に該当する遺伝子または部位と関係なく、乳酸を、低い場合は約９５．０％、高い場合は９９．９％以上の顕著に高い収率と効率で生産することが分かった。また下記表４に示されているように、Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子ＤｌｍｅｓＣ２が導入された各菌株の乳酸生産は他の代謝経路流れに依存したりまたは促進されることもないことが分かった。

このようにＤ−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子が導入された菌株の乳酸生産は、前記遺伝子が導入される遺伝体の位置（ｇｅｎｅｏｒｒｅｇｉｏｎ）または代謝経路流れに依存したりまたは促進されず、したがってＤ−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の導入位置または代謝経路調節と関係なくＤ−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の存在自体に独立依存的に行われることを確認することができた。反面、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの場合、代謝経路と関係がなかったり核心産物代謝（例：エタノール生産経路ら）経路が除去されない状態の独立的なＤ−ｌａｃｔａｔｅｄｅｈｙｄｒｏｇｎａｓｅはＤ−ｌａｃｔｉｃａｃｉｄ／ｌａｃｔａｔｅ生産に効率的ではないため、代謝経路調節に依存的であることを確認することができた。

したがって、代謝経路調節と関係なく独立的にＤ−ｌａｃｔｉｃａｃｉｄ／ｌａｃｔａｔｅを効率的に生産できるＤ−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子が導入された菌株の乳酸生産能力が顕著に優れていることを確認することができた。

実験例２−４．ｐＨ条件による乳酸（Ｄ−ｌａｃｔｉｃａｃｉｄ／Ｄ−ｌａｃｔａｔｅ）生産比較

前記実施例１で製造されたＭＧ６１０６菌株のｐＨ条件による乳酸生産能力を試験するために、前記実験例２−１に記載された方法と同様な方法でＤ−ｌａｃｔｉｃａｃｉｄ／Ｄ−ｌａｃｔａｔｅ生産能力を測定し、ただし、ｐＨ非調節によるＤ−ｌａｃｔｉｃａｃｉｄ／Ｄ−ｌａｃｔａｔｅ生産能力は、塩基添加によるｐＨ調節なしに最終発酵ｐＨを３．０にしたＲＭ液体培地で前記菌株を３０℃で２０時間培養した後、前記培養した培養液から細胞を除去して得た培養上澄液を用いて測定した。その結果を下記表５に示した。

前記表５に示されているように、Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子が導入された菌株の場合、ｐＨ５．０の条件はもちろん、ｐＨ非調節（酸性条件）発酵条件下でも乳酸（Ｄ−ｌａｃｔｉｃａｃｉｄ／Ｄ−ｌａｃｔａｔｅ）生産収率がそれぞれ９９．９％以上および９９．７％に非常に高く現れ、ひいてはｐＨ５．０条件およびｐＨ非調節の全ての発酵条件でＤ−ｌａｃｔｉｃａｃｉｄ生産効率が優れていると報告されたＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＯＣ２と比較してみた結果、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＯＣ２の場合、同一の条件でＤ−ｌａｃｔｉｃａｃｉｄ／ｌａｃｔａｔｅ生産収率がそれぞれ６１％および５３％に過ぎないと示され、前記Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子が導入された菌株は、ｐＨ条件の制限なしにいかなるｐＨ条件でも顕著に優れたＤ−ｌａｃｔｉｃａｃｉｄ／ｌａｃｔａｔｅ生産収率を有することを確認することができた。

実験例３．ｐＨ条件によるＤ−ｌａｃｔｉｃａｃｉｄ／Ｄ−ｌａｃｔａｔｅの光学純度（ｏｐｔｉｃａｌｐｕｒｉｔｙ）比較

前記実施例１で製造されたＭＧ６１０６菌株のｐＨ条件によるＤ−ｌａｃｔｉｃａｃｉｄ／Ｄ−ｌａｃｔａｔｅの光学純度を比較分析するために、前記菌株を塩基（ｂａｓｅ）添加を通じてｐＨを５．０に調節したＲＭ液体培地（グルコース、２０ｇ／ｌ；酵母抽出物（ＤＩＦＣＯ）、１０ｇ／ｌ；ＭｇＳＯ_４、１ｇ／ｌ；（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、１ｇ／ｌ；ＫＨ_２ＰＯ_４、２ｇ／ｌ）と、塩基添加によるｐＨ調節なしに最終発酵ｐＨを３．０にしたＲＭ液体培地で３０℃で２０時間培養した後、前記培養した培養液から細胞を除去して得た培養上澄液を以下のような条件でＨＰＬＣ（ｈｉｇｈｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅｌｉｑｕｉｄｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）を行ってＤ−ｌａｃｔｉｃａｃｉｄ／Ｄ−ｌａｃｔａｔｅの光学純度（ｏｐｔｉｃａｌｐｕｒｉｔｙ、％）または光学超過数値（ｅｎａｎｔｉｏｍｅｒｉｃｅｘｃｅｓｓ、ｅｅｖａｌｕｅ、％）を分析してその結果を下記表６に示した。前記実験例２と同様に、対照群としては野生型ザイモモナス・モビリス菌株ＺＭ４（ＡＴＣＣ３１８２１）を用い、比較例としてはＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＯＣ２菌株（Ｉｓｈｉｄａｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇ．２００６．Ｆｅｂ；１０１（２）：１７２−１７７）を用いた。

＜ＨＰＬＣ測定条件＞
ＨＰＬＣシステム：ＨｉｔａｃｈｉＨＰＬＣシステム（ｍｏｄｅｌＤ−７０００）
カラム：Ｃｈｉｒｅｘ３１２６カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）（２５０ｍｍＸ４．６ｍｍ）
カラム温度：２５℃
流速：１．５ｍｌ／ｍｉｎ
移動床（溶媒）：１ｍＭｃｏｐｐｅｒｓｕｌｆａｔｅ（ＣｕＳＯ４）溶液
検出器：ＵＶ検出器（ＨｉｔａｃｈｉＤ−４２００）（２５４ｎｍ）
具体的に標準試薬Ｄ（−）−ｌａｃｔｉｃａｃｉｄ（Ｌ０６２５、Ｓｉｇｍａ）、Ｌ（＋）−ｌａｃｔｉｃａｃｉｄ（Ｌ１７５０、Ｓｉｇｍａ）、そしてＤＬ−ｌａｃｔｉｃａｃｉｄ（Ｌ１２５０、Ｓｉｇｍａ）を用いてＤ−ｌａｃｔｉｃａｃｉｄとＬ−ｌａｃｔｉｃａｃｉｄの光学異性体を区分、分離し、光学純度（％）と光学超過数値（％）はそれぞれ以下の数式１および２により計算した。

［数式１］
Ｄ−ｌａｃｔｉｃａｃｉｄの光学純度（％）＝Ｄ／Ｄ＋Ｌ＊１００
［数式２］
ｅｅｖａｌｕｅ（％）＝Ｄ＋Ｌ／Ｄ−Ｌ＊１００

前記表６に示されているように、対照群である前記野生型ＺＭ４菌株により生産された乳酸の光学純度は約３３．３％と低く示された反面、Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子が導入された菌株により生産された乳酸の光学純度はＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＯＣ２と同等な程度である９９．９％の非常に高い光学純度を示すことを確認することができた。ただし、前記Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＯＣ２の場合、前記実験例２−３で考察したように代謝経路調節に依存した乳酸生産効率を示す反面、Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼが導入された形質転換菌株の場合、代謝経路調節がなくてもｐＨ条件の制限なしに非常に高い収率と非常に高い光学純度で乳酸を生産することができるため、対照群である前記野生型ＺＭ４菌株はもちろん、前記Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＯＣ２に比べても顕著に優れていることを確認することができた。

Claims

ロイコノストック（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）属菌株由来のＤ−乳酸デヒドロゲナーゼをコーディングする遺伝子が導入されたザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓｍｏｂｉｌｉｓ）形質転換体。
前記Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼをコーディングする遺伝子は、ＳＥＱＩＤＮＯ：２、ＳＥＱＩＤＮＯ：４、ＳＥＱＩＤＮＯ：６、またはＳＥＱＩＤＮＯ：８のアミノ酸配列で表されるペプチドをコーディングする遺伝子である、請求項１に記載の形質転換体。
前記Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼをコーディングする遺伝子は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１、ＳＥＱＩＤＮＯ：３、ＳＥＱＩＤＮＯ：５、またはＳＥＱＩＤＮＯ：７の塩基配列で表される、請求項１に記載の形質転換体。
前記形質転換体は、寄託番号ＫＣＴＣ１１８０３ＢＰである、請求項１に記載の形質転換体。
ザイモモナス・モビリス菌株を準備する段階と、
前記ザイモモナス・モビリス菌株にロイコノストック属菌株由来のＤ−乳酸デヒドロゲナーゼをコーディングする遺伝子を導入する段階とを含む
ザイモモナス・モビリス形質転換体製造方法。
前記導入は、接合、電気穿孔法、および遺伝子銃方法からなる群より選ばれた方法で行う、請求項５に記載の方法。
ロイコノストック属菌株由来のＤ−乳酸デヒドロゲナーゼをコーディングする遺伝子をザイモモナス・モビリス菌株に導入してザイモモナス・モビリス形質転換体を製造する段階と、
前記製造されたザイモモナス・モビリス形質転換体を培養する段階とを含む
乳酸生産方法。
前記培養は、ｐＨ３．０乃至ｐＨ７．０の条件下で行う、請求項７に記載の方法。
請求項７または８の方法によって生産された光学純度が９５％以上である乳酸。
光学純度が９９％以上である、請求項９に記載の乳酸。