KR20160098324A - 정밀 화학물질의 개선된 생산을 위한 재조합 미생물 - Google Patents

정밀 화학물질의 개선된 생산을 위한 재조합 미생물 Download PDF

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Abstract

재조합 핵산 분자, 재조합 미생물 및 알라닌의 생산 방법이 제공된다. 또한, 알라닌의 발효적 생산을 위한, 재조합 핵산 분자 또는 재조합 미생물의 용도가 제공된다.

Description

정밀 화학물질의 개선된 생산을 위한 재조합 미생물 {RECOMBINANT MICROORGANISM FOR IMPROVED PRODUCTION OF FINE CHEMICALS}
본 출원은 번호 US 61/915517, US 61/915527, US 61/915518, US 61/915534 및 EP 13197432.1의 출원을 우선권 주장하며, 상기 출원 모두는 그 전문이 참조로 포함된다.
발명의 분야
본 발명은 재조합 핵산 분자; 재조합 미생물; 피루베이트, 숙시네이트, 아스파르테이트, 말레이트, 락테이트, 발린, 류신 및/또는 알라닌의 생산 방법; 및 피루베이트, 숙시네이트, 아스파르테이트, 말레이트, 락테이트, 발린, 류신 및/또는 알라닌의 발효적 생산을 위한, 재조합 핵산 분자 또는 재조합 미생물의 용도에 관한 것이다.
아미노산은 카르복시 기 및 아미노 기를 갖는 유기 화합물이다. 가장 중요한 아미노산은 아미노 기가 카르복시 기 옆에 위치해 있는 알파-아미노산이다. 단백질은 알파-아미노산을 기재로 한다.
알라닌은 식품, 사료 및 제약 산업에서 첨가제로서 사용되어 왔기 때문에 상당한 관심을 끌고 있다. 더욱이, 알라닌은 유기 및 무기 스케일을 분해하는데 있어서 탁월한 성능을 보여주는, 강력한 킬레이트제인 알라닌, N,N-비스(카르복시메틸)-, 삼나트륨 염 (MGDA, 상표명 트릴론(Trilon) M)을 산업적으로 생산하기 위한 원료이다 (WO94/29421, WO2012/150155). 트릴론 M 등급은 표준 OECD 시험에 따라 용이하게 생분해가능하다. 뛰어난 생태학적 및 독성학적 프로파일로 인해, 트릴론 M 등급은 최종 소비자를 위한 제품에 사용하는데 특히 적합하고, 이러한 생분해성 복합 빌더에 대한 수요는 지속적으로 증가하고 있다.
알라닌은 코리네형(Coryneform) 박테리아 (Hermann, 2003: Industrial production of amino acids by Coryneform bacteria, J. of Biotechnol, 104, 155-172) 또는 이. 콜라이(E. coli) (WO2007/120198, WO2008/119009)를 사용한 발효에 의해 생산될 수 있다.
최근에는 ygaW 유전자의 과다발현이 미생물의 발효적 알라닌 생산성을 개선시킨다고 기재되었다 (WO2012/172822).
이. 콜라이에서의 알라닌 생산은 화학 산업용 원료로서의 알라닌을 산업적으로 생산하는데 보다 효율적이고 광범위하게 사용되고 있다. 알라닌에 대한 화학 산업의 수요가 증가하고 있기 때문에, 알라닌의 발효적 생산의 생산성을 개선시키고자 하는 요구가 있다.
본 발명의 한 목적은 높은 수율 및 효율을 갖는 알라닌의 발효적 생산에 사용될 수 있는 미생물을 제공하는 것이다.
상기 언급된 목적을 달성하는데 있어서의 기여는 각각의 참조 미생물과 비교하여 i) brnQ 유전자의 감소, 억제 또는 결실된 활성 및/또는 발현, 및/또는 ii) argP 유전자의 도입, 증가 또는 증진된 활성 및/또는 발현, 및/또는 iii) gcvA 유전자의 도입, 증가 또는 증진된 활성 및/또는 발현, 및/또는 iv) gcvB 유전자의 감소, 억제 또는 결실된 활성 및/또는 발현, 및/또는 v) lpxD 유전자의 변경된 활성 중 적어도 하나를 갖는 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) (이. 콜라이) 과의 재조합 미생물에 의해 제공된다.
용어 "효소의 감소, 억제 또는 결실된 발현 및/또는 활성"은 유의하게 감소, 억제 또는 결실된 발현 및/또는 활성을 의미하고, 또한 각각의 효소의 검출가능하지 않은 발현 및/또는 활성을 포괄한다.
예를 들어, 효소의 발현 및/또는 활성 또는 수율 또는 생산성과 관련하여, 용어 "보다 높은", "증가" 또는 "증진된"은 유의하게 더 높거나, 증가되거나 또는 증진된 발현 및/또는 활성 또는 수율 또는 생산성을 의미한다.
용어 효소의 "변경된" 발현 및/또는 활성은 야생형의 비-재조합 미생물에서의 각각의 효소의 발현 및/또는 활성과 유의하게 상이한, 재조합 미생물에서의 효소의 발현 및/또는 활성을 의미한다.
놀랍게도, i) brnQ 유전자에 의해 코딩된 단백질의 감소, 억제 또는 결실된 발현 및/또는 활성, 및/또는 ii) argP 유전자의 도입, 증가 또는 증진된 활성 및/또는 발현, 및/또는 iii) gcvA 유전자의 도입, 증가 또는 증진된 활성 및/또는 발현, 및/또는 iv) gcvB 유전자의 감소, 억제 또는 결실된 활성 및/또는 발현, 및/또는 v) lpxD 유전자의 변경된 활성 중 적어도 하나를 갖는 미생물이, 각각의 brnQ 유전자의 감소, 억제 또는 결실된 발현 및/또는 활성, 및/또는 argP 유전자의 도입, 증가 또는 증진된 활성 및/또는 발현, 및/또는 gcvA 유전자의 도입, 증가 또는 증진된 활성 및/또는 발현, 및/또는 gcvB 유전자의 감소, 억제 또는 결실된 활성 및/또는 발현, 및/또는 lpxD 유전자의 변경된 활성을 포함하지 않는 동일한 미생물과 비교한 경우에, 발효적 생산에 있어서 알라닌의 보다 높은 수율 및/또는 생산성을 갖는 것으로 발견되었다.
따라서, 당면한 본 발명의 한 실시양태는 각각의 참조 미생물과 비교하여 i) 분지쇄 아미노산 수송체 활성을 갖는 brnQ 단백질을 코딩하는 brnQ 유전자의 감소, 억제 또는 결실된 활성 및/또는 발현, 및/또는 ii) DNA 결합 / 전사 활성화 활성을 갖는 argP 단백질을 코딩하는 argP 유전자의 도입, 증가 또는 증진된 활성 및/또는 발현, 및/또는 iii) DNA-결합 단백질을 코딩하는 gcvA 유전자의 도입, 증가 또는 증진된 활성 및/또는 발현, 및/또는 iv) 비-단백질 코딩 RNA를 코딩하는 gcvB 유전자의 감소, 억제 또는 결실된 활성 및/또는 발현, 및/또는 v) UDP-3-O-(3-히드록시미리스토일)-글루코사민 N-아실트랜스퍼라제 단백질을 코딩하는 lpxD 유전자의 변경된 활성 중 적어도 하나를 포함하며, 각각의 참조 미생물과 비교하여 발효적 생산에 있어서 알라닌의 보다 높은 수율 및/또는 생산성을 갖는 재조합 미생물이다.
본원에 사용된 용어 "참조 미생물"은 재조합 미생물이 비교되는 대조군 미생물을 의미한다. 이러한 참조 미생물은 분석하고자 하는 차이를 제외하고는, 재조합 미생물과 실질적으로 동일한 유전자형을 갖는다. 바람직하게는, 참조 미생물은 재조합 미생물이 유래되는 균주이다. 예를 들어, 유전자가 야생형 미생물 내로 도입되어, 재조합 미생물을 생성시킨 경우에, 상기 야생형이 이러한 재조합 미생물에 적합한 참조 미생물일 것이다. 또한, 재조합 미생물 A 내로 추가의 돌연변이를 도입함으로써, 재조합 미생물 B를 생성시키는 것이 가능하다. 이때, 재조합 미생물 A가 재조합 미생물 B에 적합한 참조 미생물일 것이다. 재조합 미생물 및 각각의 참조 미생물의 성능을 비교해야 하는 경우에는, 두 미생물을 실질적으로 동일한 조건 하에 성장시킨다.
알라닌의 증가된 수율 및/또는 생산성을 갖는 미생물이 또한, 알라닌과 밀접하게 관련된 기타 대사물, 예를 들어 알라닌 경로 내의 중간체이거나, 알라닌 경로와 공통의 중간체를 공유하거나 또는 그의 경로에서 중간체로서 알라닌을 사용하는 대사물을 생산하는데 사용될 수 있다는 것이 통상의 기술자에게 명백하다. 본 발명의 미생물은 또한, 특정 효소 활성을 증가 또는 도입하거나 또는 특정 효소 활성을 녹아웃 또는 감소시킴으로써 상기 관련된 대사물의 증가된 수율 및/또는 생산성을 갖도록 용이하게 적응될 수 있다.
이러한 대사물은, 예를 들어 피루베이트, 숙시네이트, 아스파르테이트, 말레이트, 락테이트, 발린 및 류신이다.
예를 들어, 본 발명의 재조합 미생물을 사용하여 숙시네이트를 생산하기 위해서는, 유전자 ldh, pfl, pta 및 adhE를 녹아웃시켜야 하고, PEP 카르복실라제 유전자 및/또는 피루베이트 카르복실라제 유전자를 본 발명의 미생물의 게놈에 도입해야 한다. 각각의 경로 및 필요한 돌연변이는, 예를 들어 문헌 [Zhang et al. (2009), PNAS (106) pp20180-20185]에 기재되어 있다.
따라서, 당면한 본 발명의 또 다른 실시양태는 각각의 참조 미생물과 비교하여 i) 분지쇄 아미노산 수송체 활성을 갖는 brnQ 단백질을 코딩하는 brnQ 유전자의 감소, 억제 또는 결실된 활성 및/또는 발현, 및/또는 ii) DNA 결합 / 전사 활성화 활성을 갖는 argP 단백질을 코딩하는 argP 유전자의 도입, 증가 또는 증진된 활성 및/또는 발현, 및/또는 iii) DNA-결합 단백질을 코딩하는 gcvA 유전자의 도입, 증가 또는 증진된 활성 및/또는 발현, 및/또는 iv) 비-단백질 코딩 RNA를 코딩하는 gcvB 유전자의 감소, 억제 또는 결실된 활성 및/또는 발현, 및/또는 v) UDP-3-O-(3-히드록시미리스토일)-글루코사민 N-아실트랜스퍼라제 단백질을 코딩하는 lpxD 유전자의 변경된 활성 중 적어도 하나를 포함하며, 각각의 참조 미생물과 비교하여 발효적 생산에 있어서 피루베이트, 숙시네이트, 아스파르테이트, 말레이트, 락테이트, 발린 및/또는 류신의 보다 높은 수율 및/또는 생산성을 갖는 재조합 미생물이다.
일부 실시양태에서, 미생물은 원핵 세포이다. 적합한 원핵 세포는 그람-양성, 그람-음성 및 그람-가변 박테리아 세포, 바람직하게는 그람-음성 박테리아 세포를 포함한다.
따라서, 본 발명에 사용될 수 있는 미생물은 글루코노박터 옥시단스(Gluconobacter oxydans), 글루코노박터 아사이이(Gluconobacter asaii), 아크로모박터 델마르바에(Achromobacter delmarvae), 아크로모박터 비스코수스(Achromobacter viscosus), 아크로모박터 락티쿰(Achromobacter lacticum), 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens), 아그로박테리움 라디오박터(Agrobacterium radiobacter), 알칼리게네스 파에칼리스(Alcaligenes faecalis), 아르트로박터 시트레우스(Arthrobacter citreus), 아르트로박터 투메스센스(Arthrobacter tumescens), 아르트로박터 파라피네우스(Arthrobacter paraffineus), 아르트로박터 히드로카르보글루타미쿠스(Arthrobacter hydrocarboglutamicus), 아르트로박터 옥시단스(Arthrobacter oxydans), 아우레오박테리움 사페르다에(Aureobacterium saperdae), 아조토박터 인디쿠스(Azotobacter indicus), 브레비박테리움 암모니아게네스(Brevibacterium ammoniagenes), 브레비박테리움 디바리카툼(Brevibacterium divaricatum), 브레비박테리움 락토페르멘툼(Brevibacterium lactofermentum), 브레비박테리움 플라붐(Brevibacterium flavum), 브레비박테리움 글로보숨(Brevibacterium globosum), 브레비박테리움 푸스쿰(Brevibacterium fuscum), 브레비박테리움 케토글루타미쿰(Brevibacterium ketoglutamicum), 브레비박테리움 헬콜룸(Brevibacterium helcolum), 브레비박테리움 푸실룸(Brevibacterium pusillum), 브레비박테리움 테스타세움(Brevibacterium testaceum), 브레비박테리움 로세움(Brevibacterium roseum), 브레비박테리움 임마리오필리움(Brevibacterium immariophilium), 브레비박테리움 리넨스(Brevibacterium linens), 브레비박테리움 프로토파르미아에(Brevibacterium protopharmiae), 코리네박테리움 아세토필룸(Corynebacterium acetophilum), 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum), 코리네박테리움 칼루나에(Corynebacterium callunae), 코리네박테리움 아세토아시도필룸(Corynebacterium acetoacidophilum), 코리네박테리움 아세토글루타미쿰(Corynebacterium acetoglutamicum), 엔테로박터 아에로게네스(Enterobacter aerogenes), 에르위니아 아밀로보라(Erwinia amylovora), 에르위니아 카로토보라(Erwinia carotovora), 에르위니아 헤르비콜라(Erwinia herbicola), 에르위니아 크리산테미(Erwinia chrysanthemi), 플라보박테리움 페레그리눔(Flavobacterium peregrinum), 플라보박테리움 푸카툼(Flavobacterium fucatum), 플라보박테리움 아우란티눔(Flavobacterium aurantinum), 플라보박테리움 레나눔(Flavobacterium rhenanum), 플라보박테리움 세와넨세(Flavobacterium sewanense), 플라보박테리움 브레베(Flavobacterium breve), 플라보박테리움 메닝고셉티쿰(Flavobacterium meningosepticum), 미크로코쿠스 종(Micrococcus sp.) CCM825, 모르가넬라 모르가니이(Morganella morganii), 노카르디아 오파카(Nocardia opaca), 노카르디아 루고사(Nocardia rugosa), 플라노코쿠스 에우시나투스(Planococcus eucinatus), 프로테우스 레트게리(Proteus rettgeri), 프로피오니박테리움 세르마니이(Propionibacterium shermanii), 슈도모나스 신크산타(Pseudomonas synxantha), 슈도모나스 아조토포르만스(Pseudomonas azotoformans), 슈도모나스 질루오레스센스(Pseudomonas jluorescens), 슈도모나스 오발리스(Pseudomonas ovalis), 슈도모나스 스투체리(Pseudomonas stutzeri), 슈도모나스 아시도볼란스(Pseudomonas acidovolans), 슈도모나스 무시돌렌스(Pseudomonas mucidolens), 슈도모나스 테스토스테로니(Pseudomonas testosteroni), 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 로도코쿠스 에리트로폴리스(Rhodococcus erythropolis), 로도코쿠스 로도크로우스(Rhodococcus rhodochrous), 로도코쿠스 종(Rhodococcus sp.) ATCC 15592, 로도코쿠스 종(Rhodococcus sp.) ATCC 19070, 스포로사르시나 우레아에(Sporosarcina ureae), 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 비브리오 메트슈니코비이(Vibrio metschnikovii), 비브리오 티로게네스(Vibrio tyrogenes), 악티노마두라 마두라에(Actinomadura madurae), 악티노미세스 비올라세오크로모게네스(Actinomyces violaceochromogenes), 키타사토스포리아 파룰로사(Kitasatosporia parulosa), 스트렙토미세스 아베르미틸리스(Streptomyces avermitilis), 스트렙토미세스 코엘리콜로르(Streptomyces coelicolor), 스트렙토미세스 플라벨루스(Streptomyces flavelus), 스트렙토미세스 그리세올루스(Streptomyces griseolus), 스트렙토미세스 리비단스(Streptomyces lividans), 스트렙토미세스 올리바세우스(Streptomyces olivaceus), 스트렙토미세스 타나쉬엔시스(Streptomyces tanashiensis), 스트렙토미세스 비르기니아에(Streptomyces virginiae), 스트렙토미세스 안티비오티쿠스(Streptomyces antibioticus), 스트렙토미세스 카카오이(Streptomyces cacaoi), 스트렙토미세스 라벤둘라에(Streptomyces lavendulae), 스트렙토미세스 비리도크로모게네스(Streptomyces viridochromogenes), 아에로모나스 살모니시다(Aeromonas salmonicida), 바실루스 푸밀루스(Bacillus pumilus), 바실루스 시르쿨란스(Bacillus circulans), 바실루스 티아미놀리티쿠스(Bacillus thiaminolyticus), 에스케리키아 프레운디이(Escherichia freundii), 미크로박테리움 암모니아필룸(Microbacterium ammoniaphilum), 세라티아 마르세센스(Serratia marcescens), 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium), 살모넬라 스코트물레리(Salmonella schottmulleri), 크산토모나스 시트리(Xanthomonas citri), 시네코시스티스 종(Synechocystis sp.), 시네코코쿠스 엘롱가투스(Synechococcus elongatus), 써모시네코코쿠스 엘롱가투스(Thermosynechococcus elongatus), 미크로시스티스 아에루기노사(Microcystis aeruginosa), 노스톡 종(Nostoc sp.), 엔. 콤뮤네(N. commune), 엔. 스파에리쿰(N. sphaericum), 노스톡 푼크티포르메(Nostoc punctiforme), 스피룰리나 플라텐시스(Spirulina platensis), 린그비아 마주스쿨라(Lyngbya majuscula), 엘. 라게레이미아(L. lagerheimia), 포르미디움 테누에(Phormidium tenue), 아나바에나 종(Anabaena sp.), 렙토린그비아 종(Leptolyngbya sp.) 등을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시양태에서, 미생물은 진핵 세포이다. 적합한 진핵 세포는 효모 세포, 예를 들어 사카로미세스(Saccharomyces) 종, 예컨대 사카로미세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae), 한세눌라(Hansenula) 종, 예컨대 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha), 쉬조사카로미세스(Schizosaccharomyces) 종, 예컨대 쉬조사카로미세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 클루이베로미세스(Kluyveromyces) 종, 예컨대 클루이베로미세스 락티스(Kluyveromyces lactis) 및 클루이베로미세스 마르시아누스(Kluyveromyces marxianus), 야로위아(Yarrowia) 종, 예컨대 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica), 피키아(Pichia) 종, 예컨대 피키아 메타놀리카(Pichia methanolica), 피키아 스티피테스(Pichia stipites) 및 피키아 파스토리스(Pichia pastoris), 지고사카로미세스(Zygosaccharomyces) 종, 예컨대 지고사카로미세스 로욱시이(Zygosaccharomyces rouxii) 및 지고사카로미세스 바일리이(Zygosaccharomyces bailii), 칸디다(Candida) 종, 예컨대 칸디다 보이디니이(Candida boidinii), 칸디다 우틸리스(Candida utilis), 칸디다 프레이슈시이(Candida freyschussii), 칸디다 글라브라타(Candida glabrata) 및 칸디다 소노렌시스(Candida sonorensis), 슈완니오미세스(Schwanniomyces) 종, 예컨대 슈완니오미세스 옥시덴탈리스(Schwanniomyces occidentalis), 아륵술라(Arxula) 종, 예컨대 아륵술라 아데니니보란스(Arxula adeninivorans), 오가타에아(Ogataea) 종, 예컨대 오가타에아 미누타(Ogataea minuta), 클레브시엘라(Klebsiella) 종, 예컨대 클레브시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumonia)를 포함한다.
수많은 박테리아 산업용 균주가 본원에 개시된 방법에 사용하는데 특히 적합하다. 일부 실시양태에서, 미생물은 코리네박테리움(Corynebacterium) 속의 종, 예를 들어 씨. 아세토필룸(C. acetophilum), 씨. 글루타미쿰(C. glutamicum), 씨. 칼루나에(C. callunae), 씨. 아세토아시도필룸(C. acetoacidophilum), 씨. 아세토글루타미쿰(C. 아세토글루타미쿰)이다. 일부 실시양태에서, 미생물은 바실루스(Bacillus) 속의 종, 예를 들어 비. 투린기엔시스(B. thuringiensis), 비. 안트라시스(B. anthracis), 비. 메가테리움(B. megaterium), 비. 서브틸리스(B. subtilis), 비. 렌틸스(B. lentils), 비. 시르쿨란스(B. circulans), 비. 푸밀루스(B. pumilus), 비. 라우투스(B. lautus), 비. 코아굴란스(B. coagulans), 비. 브레비스(B. brevis), 비. 피르무스(B. firmus), 비. 알카오피우스(B. alkaophius), 비. 리케니포르미스(B. licheniformis), 비. 클라우시이(B. clausii), 비. 스테아로써모필루스(B. stearothermophilus), 비. 할로두란스(B. halodurans), 비. 서브틸리스, 비. 푸밀루스 및 비. 아밀로리퀘파시엔스(B. amyloliquefaciens)이다. 일부 실시양태에서, 미생물은 에르위니아 속의 종, 예를 들어 이. 우레도보라(E. uredovora), 이. 카로토보라(E. carotovora), 이. 아나나스(E. ananas), 이. 헤르비콜라(E. herbicola), 이. 푼크타타(E. punctata) 및 이. 테레우스(E. terreus)이다. 일부 실시양태에서, 미생물은 에스케리키아 속의 종, 예를 들어 이. 콜라이이다. 다른 실시양태에서, 미생물은 판토에아(Pantoea) 속의 종, 예를 들어 피. 시트레아(P. citrea) 또는 피. 아글로메란스(P. agglomerans)이다. 또 다른 실시양태에서, 미생물은 스트렙토미세스 속의 종, 예를 들어 에스. 암보파시엔스(S. ambofaciens), 에스. 아크로모게네스(S. achromogenes), 에스. 아베르미틸리스(S. avermitilis), 에스. 코엘리콜로르(S. coelicolor), 에스. 아우레오파시엔스(S. aureofaciens), 에스. 아우레우스(S. aureus), 에스. 푼기시디쿠스(S. fungicidicus), 에스. 그리세우스(S. griseus) 또는 에스. 리비단스(S. lividans)이다. 추가 실시양태에서, 미생물은 지모모나스(Zymomonas) 속의 종, 예를 들어 지. 모빌리스(Z. mobilis) 또는 지. 리폴리티카(Z. lipolytica)이다. 추가 실시양태에서, 미생물은 로도코쿠스(Rhodococcus) 속의 종, 예를 들어 알. 오파쿠스(R. opacus)이다.
바람직하게는, 미생물은 엔테로박테리아세아에 과, 바람직하게는 에스케리키아 속으로부터 선택되며, 예를 들어 에스케리키아 콜라이 (이. 콜라이), 바람직하게는 DSMZ 1116 (이는 ATCC9637에 상응함)에 상응하는 균주 이. 콜라이 W이다.
분지쇄 아미노산 수송체 활성을 갖는 brnQ 단백질을 코딩하는 brnQ 유전자의 감소, 억제 또는 결실된 활성 및/또는 발현, 및/또는 DNA 결합 / 전사 활성화 활성을 갖는 argP 단백질을 코딩하는 argP 유전자의 도입, 증가 또는 증진된 활성 및/또는 발현, 및/또는 DNA-결합 단백질을 코딩하는 gcvA 유전자의 도입, 증가 또는 증진된 활성 및/또는 발현, 및/또는 비-단백질 코딩 RNA를 코딩하는 gcvB 유전자의 감소, 억제 또는 결실된 활성 및/또는 발현, 및/또는 UDP-3-O-(3-히드록시미리스토일)-글루코사민 N-아실트랜스퍼라제 단백질을 코딩하는 lpxD 유전자의 변경된 활성에 추가로, 본 발명의 재조합 미생물은 (a) 피루베이트 포르메이트 리아제 I을 코딩하는 pflB 유전자의 감소, 억제 또는 결실된 활성 및/또는 발현을 추가로 포함할 수 있으며, 여기서 pflB 유전자의 활성 및/또는 발현의 감소, 억제 또는 결실은 각각의 참조 미생물과 비교하여 결정된다.
분지쇄 아미노산 수송체 활성을 갖는 brnQ 단백질을 코딩하는 brnQ 유전자의 감소, 억제 또는 결실된 활성 및/또는 발현, 및/또는 DNA 결합 / 전사 활성화 활성을 갖는 argP 단백질을 코딩하는 argP 유전자의 도입, 증가 또는 증진된 활성 및/또는 발현, 및/또는 DNA-결합 단백질을 코딩하는 gcvA 유전자의 도입, 증가 또는 증진된 활성 및/또는 발현, 및/또는 비-단백질 코딩 RNA를 코딩하는 gcvB 유전자의 감소, 억제 또는 결실된 활성 및/또는 발현, 및/또는 UDP-3-O-(3-히드록시미리스토일)-글루코사민 N-아실트랜스퍼라제 단백질을 코딩하는 lpxD 유전자의 변경된 활성에 추가로, 본 발명의 재조합 미생물은 (b) 이관능성 아세트알데히드-CoA 데히드로게나제/철-의존성 알콜 데히드로게나제/피루베이트-포르메이트 리아제 데악티바제를 코딩하는 adhE 유전자의 감소, 억제 또는 결실된 활성 및/또는 발현을 추가로 포함할 수 있으며, 여기서 adhE 유전자의 활성 및/또는 발현의 감소, 억제 또는 결실은 각각의 참조 미생물과 비교하여 결정된다.
분지쇄 아미노산 수송체 활성을 갖는 brnQ 단백질을 코딩하는 brnQ 유전자의 감소, 억제 또는 결실된 활성 및/또는 발현, 및/또는 DNA 결합 / 전사 활성화 활성을 갖는 argP 단백질을 코딩하는 argP 유전자의 도입, 증가 또는 증진된 활성 및/또는 발현, 및/또는 DNA-결합 단백질을 코딩하는 gcvA 유전자의 도입, 증가 또는 증진된 활성 및/또는 발현, 및/또는 비-단백질 코딩 RNA를 코딩하는 gcvB 유전자의 감소, 억제 또는 결실된 활성 및/또는 발현, 및/또는 UDP-3-O-(3-히드록시미리스토일)-글루코사민 N-아실트랜스퍼라제 단백질을 코딩하는 lpxD 유전자의 변경된 활성에 추가로, 본 발명의 재조합 미생물은 (c) NAD-의존성 발효적 D-락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 ldhA 유전자의 감소, 억제 또는 결실된 활성 및/또는 발현을 추가로 포함할 수 있으며, 여기서 ldhA 유전자의 활성 및/또는 발현의 감소, 억제 또는 결실은 각각의 참조 미생물과 비교하여 결정된다.
분지쇄 아미노산 수송체 활성을 갖는 brnQ 단백질을 코딩하는 brnQ 유전자의 감소, 억제 또는 결실된 활성 및/또는 발현, 및/또는 DNA 결합 / 전사 활성화 활성을 갖는 argP 단백질을 코딩하는 argP 유전자의 도입, 증가 또는 증진된 활성 및/또는 발현, 및/또는 DNA-결합 단백질을 코딩하는 gcvA 유전자의 도입, 증가 또는 증진된 활성 및/또는 발현, 및/또는 비-단백질 코딩 RNA를 코딩하는 gcvB 유전자의 감소, 억제 또는 결실된 활성 및/또는 발현, 및/또는 UDP-3-O-(3-히드록시미리스토일)-글루코사민 N-아실트랜스퍼라제 단백질을 코딩하는 lpxD 유전자의 변경된 활성에 추가로, 본 발명의 재조합 미생물은 (d) 포스페이트 아세틸트랜스퍼라제를 코딩하는 pta 유전자의 감소, 억제 또는 결실된 활성 및/또는 발현을 추가로 포함할 수 있으며, 여기서 pta 유전자의 활성 및/또는 발현의 감소, 억제 또는 결실은 각각의 참조 미생물과 비교하여 결정된다.
분지쇄 아미노산 수송체 활성을 갖는 brnQ 단백질을 코딩하는 brnQ 유전자의 감소, 억제 또는 결실된 활성 및/또는 발현, 및/또는 DNA 결합 / 전사 활성화 활성을 갖는 argP 단백질을 코딩하는 argP 유전자의 도입, 증가 또는 증진된 활성 및/또는 발현, 및/또는 DNA-결합 단백질을 코딩하는 gcvA 유전자의 도입, 증가 또는 증진된 활성 및/또는 발현, 및/또는 비-단백질 코딩 RNA를 코딩하는 gcvB 유전자의 감소, 억제 또는 결실된 활성 및/또는 발현, 및/또는 UDP-3-O-(3-히드록시미리스토일)-글루코사민 N-아실트랜스퍼라제 단백질을 코딩하는 lpxD 유전자의 변경된 활성에 추가로, 본 발명의 재조합 미생물은 (e) 푸마레이트 리덕타제를 코딩하는 frdA 유전자의 감소, 억제 또는 결실된 활성 및/또는 발현을 추가로 포함할 수 있으며, 여기서 frdA 유전자의 활성 및/또는 발현의 감소, 억제 또는 결실은 각각의 참조 미생물과 비교하여 결정된다.
분지쇄 아미노산 수송체 활성을 갖는 brnQ 단백질을 코딩하는 brnQ 유전자의 감소, 억제 또는 결실된 활성 및/또는 발현, 및/또는 DNA 결합 / 전사 활성화 활성을 갖는 argP 단백질을 코딩하는 argP 유전자의 도입, 증가 또는 증진된 활성 및/또는 발현, 및/또는 DNA-결합 단백질을 코딩하는 gcvA 유전자의 도입, 증가 또는 증진된 활성 및/또는 발현, 및/또는 비-단백질 코딩 RNA를 코딩하는 gcvB 유전자의 감소, 억제 또는 결실된 활성 및/또는 발현, 및/또는 UDP-3-O-(3-히드록시미리스토일)-글루코사민 N-아실트랜스퍼라제 단백질을 코딩하는 lpxD 유전자의 변경된 활성에 추가로, 본 발명의 재조합 미생물은 (f) 알라닌 데히드로게나제를 코딩하는 alaD 유전자의 도입, 증가 또는 증진된 활성 및/또는 발현을 추가로 포함할 수 있으며, 여기서 alaD 유전자의 활성 및/또는 발현의 증가 또는 증진은 각각의 참조 미생물과 비교하여 결정된다.
분지쇄 아미노산 수송체 활성을 갖는 brnQ 단백질을 코딩하는 brnQ 유전자의 감소, 억제 또는 결실된 활성 및/또는 발현, 및/또는 DNA 결합 / 전사 활성화 활성을 갖는 argP 단백질을 코딩하는 argP 유전자의 도입, 증가 또는 증진된 활성 및/또는 발현, 및/또는 DNA-결합 단백질을 코딩하는 gcvA 유전자의 도입, 증가 또는 증진된 활성 및/또는 발현, 및/또는 비-단백질 코딩 RNA를 코딩하는 gcvB 유전자의 감소, 억제 또는 결실된 활성 및/또는 발현, 및/또는 UDP-3-O-(3-히드록시미리스토일)-글루코사민 N-아실트랜스퍼라제 단백질을 코딩하는 lpxD 유전자의 변경된 활성에 추가로, 본 발명의 재조합 미생물은 (g) 알라닌 수송체를 코딩하는 ygaW 유전자의 도입, 증가 또는 증진된 활성 및/또는 발현을 추가로 포함할 수 있으며, 여기서 ygaW 유전자의 활성 및/또는 발현의 증가 또는 증진은 WO2012/172822 및 PCT/IB2014/064426 (후자는 참조로 포함됨)에 기재된 바와 같이 각각의 참조 미생물과 비교하여 결정된다.
분지쇄 아미노산 수송체 활성을 갖는 brnQ 단백질을 코딩하는 brnQ 유전자의 감소, 억제 또는 결실된 활성 및/또는 발현, 및/또는 DNA 결합 / 전사 활성화 활성을 갖는 argP 단백질을 코딩하는 argP 유전자의 도입, 증가 또는 증진된 활성 및/또는 발현, 및/또는 DNA-결합 단백질을 코딩하는 gcvA 유전자의 도입, 증가 또는 증진된 활성 및/또는 발현, 및/또는 비-단백질 코딩 RNA를 코딩하는 gcvB 유전자의 감소, 억제 또는 결실된 활성 및/또는 발현, 및/또는 UDP-3-O-(3-히드록시미리스토일)-글루코사민 N-아실트랜스퍼라제 단백질을 코딩하는 lpxD 유전자의 변경된 활성에 추가로, 본 발명의 재조합 미생물은 (h) Z 고리 조립에 수반되는 세포 분열 단백질을 코딩하는 zipA 유전자의 도입, 증가 또는 증진된 활성 및/또는 발현을 추가로 포함할 수 있으며, 여기서 zipA 유전자의 활성 및/또는 발현의 증가 또는 증진은 PCT/IB2014/064426 (이는 본원에 참조로 포함됨)에 기재된 바와 같이 각각의 참조 미생물과 비교하여 결정된다.
분지쇄 아미노산 수송체 활성을 갖는 brnQ 단백질을 코딩하는 brnQ 유전자의 감소, 억제 또는 결실된 활성 및/또는 발현, 및/또는 DNA 결합 / 전사 활성화 활성을 갖는 argP 단백질을 코딩하는 argP 유전자의 도입, 증가 또는 증진된 활성 및/또는 발현, 및/또는 DNA-결합 단백질을 코딩하는 gcvA 유전자의 도입, 증가 또는 증진된 활성 및/또는 발현, 및/또는 비-단백질 코딩 RNA를 코딩하는 gcvB 유전자의 감소, 억제 또는 결실된 활성 및/또는 발현, 및/또는 UDP-3-O-(3-히드록시미리스토일)-글루코사민 N-아실트랜스퍼라제 단백질을 코딩하는 lpxD 유전자의 변경된 활성에 추가로, 본 발명의 재조합 미생물은 (j) 리포아미드 데히드로게나제를 코딩하는 lpd 유전자의 도입, 증가 또는 증진된 활성 및/또는 발현을 추가로 포함할 수 있으며, 여기서 lpd 유전자의 활성 및/또는 발현의 증가 또는 증진은 WO2012/172822 및 PCT/IB2014/064426에 기재된 바와 같이 각각의 참조 미생물과 비교하여 결정된다.
바람직하게는, 분지쇄 아미노산 수송체 활성을 갖는 brnQ 단백질을 코딩하는 brnQ 유전자의 감소, 억제 또는 결실된 활성 및/또는 발현, 및/또는 DNA 결합 / 전사 활성화 활성을 갖는 argP 단백질을 코딩하는 argP 유전자의 도입, 증가 또는 증진된 활성 및/또는 발현, 및/또는 DNA-결합 단백질을 코딩하는 gcvA 유전자의 도입, 증가 또는 증진된 활성 및/또는 발현, 및/또는 비-단백질 코딩 RNA를 코딩하는 gcvB 유전자의 감소, 억제 또는 결실된 활성 및/또는 발현, 및/또는 UDP-3-O-(3-히드록시미리스토일)-글루코사민 N-아실트랜스퍼라제 단백질을 코딩하는 lpxD 유전자의 변경된 활성 중 적어도 하나를 포함하는 본 발명의 재조합 미생물은
(a) 피루베이트 포르메이트 리아제 I을 코딩하는 pflB 유전자의 감소, 억제 또는 결실된 활성 및/또는 발현, 및
(b) 이관능성 아세트알데히드-CoA 데히드로게나제/철-의존성 알콜 데히드로게나제/피루베이트-포르메이트 리아제 데악티바제를 코딩하는 adhE 유전자의 감소, 억제 또는 결실된 활성 및/또는 발현, 및
(c) NAD-의존성 발효적 D-락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 ldhA 유전자의 감소, 억제 또는 결실된 활성 및/또는 발현, 및
(d) 포스페이트 아세틸트랜스퍼라제를 코딩하는 pta 유전자의 감소, 억제 또는 결실된 활성 및/또는 발현, 및
(e) 푸마레이트 리덕타제를 코딩하는 frdA 유전자의 감소, 억제 또는 결실된 활성 및/또는 발현, 및
(f) 알라닌 데히드로게나제를 코딩하는 alaD 유전자의 도입, 증가 또는 증진된 활성 및/또는 발현, 및
(g) 알라닌 수송체를 코딩하는 ygaW 유전자의 도입, 증가 또는 증진된 활성 및/또는 발현, 및
(h) Z 고리 조립에 수반되는 세포 분열 단백질을 코딩하는 zipA 유전자의 도입, 증가 또는 증진된 활성 및/또는 발현, 및
(j) 리포아미드 데히드로게나제를 코딩하는 lpd 유전자의 도입, 증가 또는 증진된 활성 및/또는 발현
의 군으로부터 선택된 특색 중 적어도 2개, 바람직하게는 적어도 3개, 보다 바람직하게는 적어도 4개, 보다 더 바람직하게는 적어도 5개, 보다 더 바람직하게는 적어도 6개, 보다 더 바람직하게는 적어도 7개, 보다 더 바람직하게는 적어도 8개, 가장 바람직하게는 모두를 추가적으로 가지며, 여기서 유전자의 활성 및/또는 발현의 감소, 억제, 결실, 증가 또는 증진은 각각의 참조 미생물과 비교하여 결정된다.
alaD 유전자는 임의의 유기체로부터 유래될 수 있거나 또는 인간에 의해 설계된, 예를 들어 본 발명의 재조합 미생물에서의 발현을 위해 최적화된 코돈 용법을 갖거나 또는 효소 활성을 위해 최적화되는, 예를 들어 개선된 Vmax 또는 Km을 갖는 합성 유전자일 수 있다. 바람직하게는 alaD 유전자는 바실루스 속, 게오바실루스(Geobacillus) 속, 파에니바실루스(Paenibacillus) 속, 할로바실루스(Halobacillus) 속, 브레비바실루스(Brevibacillus) 속 중 하나의 미생물로부터 유래된다. 보다 바람직한 실시양태에서, alaD 유전자는 게오바실루스 속의 미생물로부터 유래된다. 가장 바람직한 실시양태에서, alaD 유전자는 게오바실루스 스테아로써모필루스(Geobacillus stearothermophilus)로부터 유래된다.
바람직한 실시양태에서, alaD 유전자는 본 발명의 재조합 미생물에서의 발현을 위해 코돈 최적화되었다.
본 발명의 미생물은 알라닌, 피루베이트, 숙시네이트, 아스파르테이트, 말레이트, 락테이트, 발린 및/또는 류신, 바람직하게는 숙시네이트 또는 알라닌, 보다 바람직하게는 알라닌의 수율 및/또는 생산성을 추가로 개선시키는, 추가의 유전자 변형, 예컨대 돌연변이, 녹아웃, 또는 증진되거나 또는 도입된 효소 활성을 포함할 수 있다.
추가 실시양태에서, 본 발명의 재조합 미생물에서 감소, 억제 또는 결실된 활성 및/또는 발현을 수반하는, 분지쇄 아미노산 수송체 활성을 갖는 brnQ 단백질을 코딩하는 brnQ 유전자는
(i) 서열 1의 서열을 포함하는 핵산 분자, 또는
(ii) 서열 1의 핵산 분자에 대해 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 85%, 예를 들어 적어도 90%, 보다 바람직하게는 적어도 95%, 예를 들어 적어도 96%, 보다 더 바람직하게는 적어도 97%, 예를 들어 적어도 98%, 가장 바람직하게는 적어도 99% 동일성을 갖는 핵산 분자, 또는
(iii) 중간 정도의 엄격한 조건 하에, 보다 바람직하게는 고도의 엄격한 조건 하에, 가장 바람직하게는 매우 고도의 엄격한 조건 하에, 서열 1을 갖는 핵산 분자에 혼성화되는 핵산 분자, 또는
(iv) 서열 2의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자, 또는
(v) 서열 2의 폴리펩티드에 대해 적어도 60%, 바람직하게는 적어도 70%, 예를 들어 적어도 75%, 보다 바람직하게는 적어도 80%, 예를 들어 적어도 85%, 보다 더 바람직하게는 적어도 90%, 예를 들어 적어도 95%, 가장 바람직하게는 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 상동성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자
의 군으로부터 선택되며,
여기서 (ii), (iii) 또는 (v)에 의해 코딩된 폴리펩티드는 서열 2를 갖는 폴리펩티드의 활성의 적어도 10%, 20%, 바람직하게는 적어도 30% 또는 50%, 보다 바람직하게는 적어도 60% 또는 70%, 보다 더 바람직하게는 적어도 75%, 80%, 85% 또는 90%, 가장 바람직하게는 적어도 95%를 갖고,
여기서 상기 정의된 바와 같은 돌연변이된 유전자 및/또는 단백질을 포함하는 미생물은 발효시 개선된 알라닌 수율을 갖는다.
한 예에서, 본 발명의 재조합 미생물에서 감소, 억제 또는 결실된 활성 및/또는 발현을 수반하는, 분지쇄 아미노산 수송체 활성을 갖는 brnQ 단백질을 코딩하는 brnQ 유전자는 서열 4를 갖는 단백질을 코딩하는 서열 3의 서열을 갖는다.
추가 실시양태에서, 본 발명의 재조합 미생물에서 도입, 증가 또는 증진된 활성 및/또는 발현을 수반하는, DNA 결합 / 전사 활성화 활성을 갖는 argP 단백질을 코딩하는 argP 유전자는
(i) 서열 45의 서열을 포함하는 핵산 분자, 또는
(ii) 서열 45의 핵산 분자에 대해 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 85%, 예를 들어 적어도 90%, 보다 바람직하게는 적어도 95%, 예를 들어 적어도 96%, 보다 더 바람직하게는 적어도 97%, 예를 들어 적어도 98%, 가장 바람직하게는 적어도 99% 동일성을 갖는 핵산 분자, 또는
(iii) 중간 정도의 엄격한 조건 하에, 보다 바람직하게는 고도의 엄격한 조건 하에, 가장 바람직하게는 매우 고도의 엄격한 조건 하에, 서열 45를 갖는 핵산 분자에 혼성화되는 핵산 분자, 또는
(iv) 서열 46의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자, 또는
(v) 서열 46의 폴리펩티드에 대해 적어도 60%, 바람직하게는 적어도 70%, 예를 들어 적어도 75%, 보다 바람직하게는 적어도 80%, 예를 들어 적어도 85%, 보다 더 바람직하게는 적어도 90%, 예를 들어 적어도 95%, 가장 바람직하게는 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 상동성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자
의 군으로부터 선택되며,
여기서 (ii), (iii) 또는 (v)에 의해 코딩된 폴리펩티드는 서열 46을 갖는 폴리펩티드의 활성의 적어도 10%, 20%, 바람직하게는 적어도 30% 또는 50%, 보다 바람직하게는 적어도 60% 또는 70%, 보다 더 바람직하게는 적어도 75%, 80%, 85% 또는 90%, 가장 바람직하게는 적어도 95%를 갖고,
여기서 상기 정의된 바와 같은 돌연변이된 유전자 및/또는 단백질을 포함하는 미생물은 발효시 개선된 알라닌 수율을 갖는다.
한 예에서, 본 발명의 재조합 미생물에서 도입, 증가 또는 증진된 활성 및/또는 발현을 수반하는, DNA 결합 / 전사 활성화 활성을 갖는 argP 단백질을 코딩하는 argP 유전자는 서열 48을 갖는 단백질을 코딩하는 서열 47의 서열을 갖는다.
추가 실시양태에서, 본 발명의 재조합 미생물에서 도입, 증가 또는 증진된 활성 및/또는 발현을 수반하는, DNA-결합 단백질을 코딩하는 gcvA 유전자는
(i) 서열 53의 서열을 포함하는 핵산 분자, 또는
(ii) 서열 53의 핵산 분자에 대해 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 85%, 예를 들어 적어도 90%, 보다 바람직하게는 적어도 95%, 예를 들어 적어도 96%, 보다 더 바람직하게는 적어도 97%, 예를 들어 적어도 98%, 가장 바람직하게는 적어도 99% 동일성을 갖는 핵산 분자, 또는
(iii) 중간 정도의 엄격한 조건 하에, 보다 바람직하게는 고도의 엄격한 조건 하에, 가장 바람직하게는 매우 고도의 엄격한 조건 하에, 서열 53을 갖는 핵산 분자에 혼성화되는 핵산 분자, 또는
(iv) 서열 54의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자, 또는
(v) 서열 54의 폴리펩티드에 대해 적어도 60%, 바람직하게는 적어도 70%, 예를 들어 적어도 75%, 보다 바람직하게는 적어도 80%, 예를 들어 적어도 85%, 보다 더 바람직하게는 적어도 90%, 예를 들어 적어도 95%, 가장 바람직하게는 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 상동성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자
의 군으로부터 선택되며,
여기서 (ii), (iii) 또는 (v)에 의해 코딩된 폴리펩티드는 서열 54를 갖는 폴리펩티드의 활성의 적어도 10%, 20%, 바람직하게는 적어도 30% 또는 50%, 보다 바람직하게는 적어도 60% 또는 70%, 보다 더 바람직하게는 적어도 75%, 80%, 85% 또는 90%, 가장 바람직하게는 적어도 95%를 갖고,
여기서 상기 정의된 바와 같은 돌연변이된 유전자 및/또는 단백질을 포함하는 미생물은 발효시 개선된 알라닌 수율을 갖는다.
추가 실시양태에서, 본 발명의 재조합 미생물에서 감소, 억제 또는 결실된 활성 및/또는 발현을 수반하는, 비-단백질 코딩 RNA를 코딩하는 gcvB 유전자는
(i) 서열 58의 서열을 포함하는 핵산 분자, 또는
(ii) 서열 58의 핵산 분자에 대해 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 85%, 예를 들어 적어도 90%, 보다 바람직하게는 적어도 95%, 예를 들어 적어도 96%, 보다 더 바람직하게는 적어도 97%, 예를 들어 적어도 98%, 가장 바람직하게는 적어도 99% 동일성을 갖는 핵산 분자, 또는
(iii) 중간 정도의 엄격한 조건 하에, 보다 바람직하게는 고도의 엄격한 조건 하에, 가장 바람직하게는 매우 고도의 엄격한 조건 하에, 서열 58을 갖는 핵산 분자에 혼성화되는 핵산 분자
의 군으로부터 선택되며,
여기서 (ii), (iii) 또는 (v)에 의해 코딩된 비-단백질 코딩 RNA는 서열 58을 갖는 비-단백질 코딩 RNA의 활성의 적어도 10%, 20%, 바람직하게는 적어도 30% 또는 50%, 보다 바람직하게는 적어도 60% 또는 70%, 보다 더 바람직하게는 적어도 75%, 80%, 85% 또는 90%, 가장 바람직하게는 적어도 95%를 갖고,
여기서 상기 정의된 바와 같은 돌연변이된 유전자를 포함하는 미생물은 발효시 개선된 알라닌 수율을 갖는다.
추가 실시양태에서, 본 발명의 재조합 미생물에서 변경된 활성 및/또는 발현을 수반하는, UDP-3-O-(3-히드록시미리스토일)-글루코사민 N-아실트랜스퍼라제 단백질을 코딩하는 lpxD 유전자는
(i) 서열 49의 서열을 포함하는 핵산 분자, 또는
(ii) 서열 49의 핵산 분자에 대해 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 85%, 예를 들어 적어도 90%, 보다 바람직하게는 적어도 95%, 예를 들어 적어도 96%, 보다 더 바람직하게는 적어도 97%, 예를 들어 적어도 98%, 가장 바람직하게는 적어도 99% 동일성을 갖는 핵산 분자, 또는
(iii) 중간 정도의 엄격한 조건 하에, 보다 바람직하게는 고도의 엄격한 조건 하에, 가장 바람직하게는 매우 고도의 엄격한 조건 하에, 서열 49를 갖는 핵산 분자에 혼성화되는 핵산 분자, 또는
(iv) 서열 50의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자, 또는
(v) 서열 50의 폴리펩티드에 대해 적어도 60%, 바람직하게는 적어도 70%, 예를 들어 적어도 75%, 보다 바람직하게는 적어도 80%, 예를 들어 적어도 85%, 보다 더 바람직하게는 적어도 90%, 예를 들어 적어도 95%, 가장 바람직하게는 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 상동성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자
의 군으로부터 선택되며,
여기서 서열 49의 위치 43 내지 45에 상응하는 (i) 내지 (v) 하의 유전자의 코돈은 아미노산 알라닌을 코딩하지 않고 정지 코돈이 아니거나, 또는 서열 50의 위치 15에 상응하는 (i) 내지 (v) 하의 유전자에 의해 코딩된 단백질의 아미노산은 알라닌이 아니고,
여기서 상기 (1) 내지 (5)에 정의된 바와 같은 유전자에 의해 코딩된 단백질은 서열 50을 갖는 단백질과 비교하여 변경된 활성 및/또는 발현을 갖고,
여기서 상기 정의된 바와 같은 돌연변이된 유전자 및/또는 단백질을 포함하는 미생물은 발효시 개선된 알라닌 수율을 갖는다.
한 예에서, 본 발명의 재조합 미생물에서 변경된 활성 및/또는 발현을 수반하는, UDP-3-O-(3-히드록시미리스토일)-글루코사민 N-아실트랜스퍼라제 단백질을 코딩하는 lpxD 유전자는 서열 52를 갖는 단백질을 코딩하는 서열 51의 서열을 갖는다.
분지쇄 아미노산 수송체 단백질을 코딩하는 brnQ 유전자의 감소, 억제 또는 결실된 활성 및/또는 발현, 및/또는 DNA 결합 / 전사 활성화 활성을 갖는 argP 단백질을 코딩하는 argP 유전자의 도입, 증가 또는 증진된 활성 및/또는 발현, 및/또는 DNA-결합 단백질을 코딩하는 gcvA 유전자의 도입, 증가 또는 증진된 활성 및/또는 발현, 및/또는 비-단백질 코딩 RNA를 코딩하는 gcvB 유전자의 감소, 억제 또는 결실된 활성 및/또는 발현, 및/또는 UDP-3-O-(3-히드록시미리스토일)-글루코사민 N-아실트랜스퍼라제 단백질을 코딩하는 lpxD 유전자의 변경된 활성 중 적어도 하나를 포함하는 본 발명의 재조합 미생물은 상기 정의된 바와 같은 (a) 내지 (j) 하의 특색 중 어느 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 모두를 추가로 포함할 수 있으며,
여기서 pflB 유전자는
(A) 서열 5의 서열을 포함하는 핵산 분자, 또는
(B) 서열 5의 핵산 분자에 대해 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 85%, 예를 들어 적어도 90%, 보다 바람직하게는 적어도 95%, 예를 들어 적어도 96%, 보다 더 바람직하게는 적어도 97%, 예를 들어 적어도 98%, 가장 바람직하게는 적어도 99% 동일성을 갖는 핵산 분자, 또는
(C) 중간 정도의 엄격한 조건 하에, 보다 바람직하게는 고도의 엄격한 조건 하에, 가장 바람직하게는 매우 고도의 엄격한 조건 하에, 서열 5를 갖는 핵산 분자에 혼성화되는 핵산 분자, 또는
(D) 서열 6의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자, 또는
(E) 서열 6의 폴리펩티드에 대해 적어도 60%, 바람직하게는 적어도 70%, 예를 들어 적어도 75%, 보다 바람직하게는 적어도 80%, 예를 들어 적어도 85%, 보다 더 바람직하게는 적어도 90%, 예를 들어 적어도 95%, 가장 바람직하게는 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 상동성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자
로 이루어진 군으로부터 선택되며,
여기서 (B), (C) 또는 (E)에 의해 코딩된 폴리펩티드는 서열 6을 갖는 폴리펩티드의 활성의 적어도 10%, 20%, 바람직하게는 적어도 30% 또는 50%, 보다 바람직하게는 적어도 60% 또는 70%, 보다 더 바람직하게는 적어도 75%, 80%, 85% 또는 90%, 가장 바람직하게는 적어도 95%를 갖고,
여기서 adhE 유전자는
(F) 서열 7의 서열을 포함하는 핵산 분자, 또는
(G) 서열 7의 핵산 분자에 대해 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 85%, 예를 들어 적어도 90%, 보다 바람직하게는 적어도 95%, 예를 들어 적어도 96%, 보다 더 바람직하게는 적어도 97%, 예를 들어 적어도 98%, 가장 바람직하게는 적어도 99% 동일성을 갖는 핵산 분자, 또는
(H) 중간 정도의 엄격한 조건 하에, 보다 바람직하게는 고도의 엄격한 조건 하에, 가장 바람직하게는 매우 고도의 엄격한 조건 하에, 서열 7을 갖는 핵산 분자에 혼성화되는 핵산 분자, 또는
(I) 서열 8의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자, 또는
(J) 서열 8의 폴리펩티드에 대해 적어도 60%, 바람직하게는 적어도 70%, 예를 들어 적어도 75%, 보다 바람직하게는 적어도 80%, 예를 들어 적어도 85%, 보다 더 바람직하게는 적어도 90%, 예를 들어 적어도 95%, 가장 바람직하게는 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 상동성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자
로 이루어진 군으로부터 선택되며,
여기서 (G), (H) 또는 (J)에 의해 코딩된 폴리펩티드는 서열 8을 갖는 폴리펩티드의 활성의 적어도 10%, 20%, 바람직하게는 적어도 30% 또는 50%, 보다 바람직하게는 적어도 60% 또는 70%, 보다 더 바람직하게는 적어도 75%, 80%, 85% 또는 90%, 가장 바람직하게는 적어도 95%를 갖고,
여기서 ldhA 유전자는
(K) 서열 9의 서열을 포함하는 핵산 분자, 또는
(L) 서열 9의 핵산 분자에 대해 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 85%, 예를 들어 적어도 90%, 보다 바람직하게는 적어도 95%, 예를 들어 적어도 96%, 보다 더 바람직하게는 적어도 97%, 예를 들어 적어도 98%, 가장 바람직하게는 적어도 99% 동일성을 갖는 핵산 분자, 또는
(M) 중간 정도의 엄격한 조건 하에, 보다 바람직하게는 고도의 엄격한 조건 하에, 가장 바람직하게는 매우 고도의 엄격한 조건 하에, 서열 9를 갖는 핵산 분자에 혼성화되는 핵산 분자, 또는
(N) 서열 10의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자, 또는
(O) 서열 10의 폴리펩티드에 대해 적어도 60%, 바람직하게는 적어도 70%, 예를 들어 적어도 75%, 보다 바람직하게는 적어도 80%, 예를 들어 적어도 85%, 보다 더 바람직하게는 적어도 90%, 예를 들어 적어도 95%, 가장 바람직하게는 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 상동성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자
로 이루어진 군으로부터 선택되며,
여기서 (L), (M) 또는 (O)에 의해 코딩된 폴리펩티드는 서열 10을 갖는 폴리펩티드의 활성의 적어도 10%, 20%, 바람직하게는 적어도 30% 또는 50%, 보다 바람직하게는 적어도 60% 또는 70%, 보다 더 바람직하게는 적어도 75%, 80%, 85% 또는 90%, 가장 바람직하게는 적어도 95%를 갖고,
여기서 pta 유전자는
(P) 서열 11의 서열을 포함하는 핵산 분자, 또는
(Q) 서열 11의 핵산 분자에 대해 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 85%, 예를 들어 적어도 90%, 보다 바람직하게는 적어도 95%, 예를 들어 적어도 96%, 보다 더 바람직하게는 적어도 97%, 예를 들어 적어도 98%, 가장 바람직하게는 적어도 99% 동일성을 갖는 핵산 분자, 또는
(R) 중간 정도의 엄격한 조건 하에, 보다 바람직하게는 고도의 엄격한 조건 하에, 가장 바람직하게는 매우 고도의 엄격한 조건 하에, 서열 11을 갖는 핵산 분자에 혼성화되는 핵산 분자, 또는
(S) 서열 12의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자, 또는
(T) 서열 12의 폴리펩티드에 대해 적어도 60%, 바람직하게는 적어도 70%, 예를 들어 적어도 75%, 보다 바람직하게는 적어도 80%, 예를 들어 적어도 85%, 보다 더 바람직하게는 적어도 90%, 예를 들어 적어도 95%, 가장 바람직하게는 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 상동성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자
로 이루어진 군으로부터 선택되며,
여기서 (Q), (R) 또는 (T)에 의해 코딩된 폴리펩티드는 서열 12를 갖는 폴리펩티드의 활성의 적어도 10%, 20%, 바람직하게는 적어도 30% 또는 50%, 보다 바람직하게는 적어도 60% 또는 70%, 보다 더 바람직하게는 적어도 75%, 80%, 85% 또는 90%, 가장 바람직하게는 적어도 95%를 갖고,
여기서 frdA 유전자는
(U) 서열 13의 서열을 포함하는 핵산 분자, 또는
(V) 서열 13의 핵산 분자에 대해 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 85%, 예를 들어 적어도 90%, 보다 바람직하게는 적어도 95%, 예를 들어 적어도 96%, 보다 더 바람직하게는 적어도 97%, 예를 들어 적어도 98%, 가장 바람직하게는 적어도 99% 동일성을 갖는 핵산 분자, 또는
(W) 중간 정도의 엄격한 조건 하에, 보다 바람직하게는 고도의 엄격한 조건 하에, 가장 바람직하게는 매우 고도의 엄격한 조건 하에, 서열 13을 갖는 핵산 분자에 혼성화되는 핵산 분자, 또는
(X) 서열 14의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자, 또는
(Y) 서열 14의 폴리펩티드에 대해 적어도 60%, 바람직하게는 적어도 70%, 예를 들어 적어도 75%, 보다 바람직하게는 적어도 80%, 예를 들어 적어도 85%, 보다 더 바람직하게는 적어도 90%, 예를 들어 적어도 95%, 가장 바람직하게는 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 상동성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자
로 이루어진 군으로부터 선택되며,
여기서 (V), (W) 또는 (Y)에 의해 코딩된 폴리펩티드는 서열 14를 갖는 폴리펩티드의 활성의 적어도 10%, 20%, 바람직하게는 적어도 30% 또는 50%, 보다 바람직하게는 적어도 60% 또는 70%, 보다 더 바람직하게는 적어도 75%, 80%, 85% 또는 90%, 가장 바람직하게는 적어도 95%를 갖고,
여기서 alaD 유전자는
(Z) 서열 15의 서열을 포함하는 핵산 분자, 또는
(AA) 서열 15의 핵산 분자에 대해 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 85%, 예를 들어 적어도 90%, 보다 바람직하게는 적어도 95%, 예를 들어 적어도 96%, 보다 더 바람직하게는 적어도 97%, 예를 들어 적어도 98%, 가장 바람직하게는 적어도 99% 동일성을 갖는 핵산 분자, 또는
(BB) 중간 정도의 엄격한 조건 하에, 보다 바람직하게는 고도의 엄격한 조건 하에, 가장 바람직하게는 매우 고도의 엄격한 조건 하에, 서열 15를 갖는 핵산 분자에 혼성화되는 핵산 분자, 또는
(CC) 서열 16의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자, 또는
(DD) 서열 16의 폴리펩티드에 대해 적어도 60%, 바람직하게는 적어도 70%, 예를 들어 적어도 75%, 보다 바람직하게는 적어도 80%, 예를 들어 적어도 85%, 보다 더 바람직하게는 적어도 90%, 예를 들어 적어도 95%, 가장 바람직하게는 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 상동성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자
로 이루어진 군으로부터 선택되며,
여기서 (AA), (BB) 또는 (DD)에 의해 코딩된 폴리펩티드는 서열 16을 갖는 폴리펩티드의 활성의 적어도 10%, 20%, 바람직하게는 적어도 30% 또는 50%, 보다 바람직하게는 적어도 60% 또는 70%, 보다 더 바람직하게는 적어도 75%, 80%, 85% 또는 90%, 가장 바람직하게는 적어도 95%를 갖고,
여기서 ygaW 유전자는
(FF) 서열 109의 서열을 포함하는 핵산 분자, 또는
(GG) 서열 109의 핵산 분자에 대해 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 85%, 예를 들어 적어도 90%, 보다 바람직하게는 적어도 95%, 예를 들어 적어도 96%, 보다 더 바람직하게는 적어도 97%, 예를 들어 적어도 98%, 가장 바람직하게는 적어도 99% 동일성을 갖는 핵산 분자, 또는
(HH) 중간 정도의 엄격한 조건 하에, 보다 바람직하게는 고도의 엄격한 조건 하에, 가장 바람직하게는 매우 고도의 엄격한 조건 하에, 서열 109를 갖는 핵산 분자에 혼성화되는 핵산 분자, 또는
(JJ) 서열 110의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자, 또는
(KK) 서열 110의 폴리펩티드에 대해 적어도 60%, 바람직하게는 적어도 70%, 예를 들어 적어도 75%, 보다 바람직하게는 적어도 80%, 예를 들어 적어도 85%, 보다 더 바람직하게는 적어도 90%, 예를 들어 적어도 95%, 가장 바람직하게는 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 상동성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자
로 이루어진 군으로부터 선택되며,
여기서 (GG), (HH) 또는 (KK)에 의해 코딩된 폴리펩티드는 서열 110을 갖는 폴리펩티드의 활성의 적어도 10%, 20%, 바람직하게는 적어도 30% 또는 50%, 보다 바람직하게는 적어도 60% 또는 70%, 보다 더 바람직하게는 적어도 75%, 80%, 85% 또는 90%, 가장 바람직하게는 적어도 95%를 갖고,
여기서 zipA 유전자는
(LL) 서열 111의 서열을 포함하는 핵산 분자, 또는
(MM) 서열 111의 핵산 분자에 대해 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 85%, 예를 들어 적어도 90%, 보다 바람직하게는 적어도 95%, 예를 들어 적어도 96%, 보다 더 바람직하게는 적어도 97%, 예를 들어 적어도 98%, 가장 바람직하게는 적어도 99% 동일성을 갖는 핵산 분자, 또는
(NN) 중간 정도의 엄격한 조건 하에, 보다 바람직하게는 고도의 엄격한 조건 하에, 가장 바람직하게는 매우 고도의 엄격한 조건 하에, 서열 111을 갖는 핵산 분자에 혼성화되는 핵산 분자, 또는
(OO) 서열 112의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자, 또는
(PP) 서열 112의 폴리펩티드에 대해 적어도 60%, 바람직하게는 적어도 70%, 예를 들어 적어도 75%, 보다 바람직하게는 적어도 80%, 예를 들어 적어도 85%, 보다 더 바람직하게는 적어도 90%, 예를 들어 적어도 95%, 가장 바람직하게는 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 상동성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자
로 이루어진 군으로부터 선택되며,
여기서 (MM), (NN) 또는 (PP)에 의해 코딩된 폴리펩티드는 서열 112를 갖는 폴리펩티드의 활성의 적어도 10%, 20%, 바람직하게는 적어도 30% 또는 50%, 보다 바람직하게는 적어도 60% 또는 70%, 보다 더 바람직하게는 적어도 75%, 80%, 85% 또는 90%, 가장 바람직하게는 적어도 95%를 갖고,
여기서 lpd 유전자는
(QQ) 서열 113의 서열을 포함하는 핵산 분자, 또는
(RR) 서열 113의 핵산 분자에 대해 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 85%, 예를 들어 적어도 90%, 보다 바람직하게는 적어도 95%, 예를 들어 적어도 96%, 보다 더 바람직하게는 적어도 97%, 예를 들어 적어도 98%, 가장 바람직하게는 적어도 99% 동일성을 갖는 핵산 분자, 또는
(SS) 중간 정도의 엄격한 조건 하에, 보다 바람직하게는 고도의 엄격한 조건 하에, 가장 바람직하게는 매우 고도의 엄격한 조건 하에, 서열 113을 갖는 핵산 분자에 혼성화되는 핵산 분자, 또는
(TT) 서열 114의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자, 또는
(UU) 서열 114의 폴리펩티드에 대해 적어도 60%, 바람직하게는 적어도 70%, 예를 들어 적어도 75%, 보다 바람직하게는 적어도 80%, 예를 들어 적어도 85%, 보다 더 바람직하게는 적어도 90%, 예를 들어 적어도 95%, 가장 바람직하게는 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 상동성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자
로 이루어진 군으로부터 선택되며,
여기서 (RR), (SS) 또는 (UU)에 의해 코딩된 폴리펩티드는 서열 114를 갖는 폴리펩티드의 활성의 적어도 10%, 20%, 바람직하게는 적어도 30% 또는 50%, 보다 바람직하게는 적어도 60% 또는 70%, 보다 더 바람직하게는 적어도 75%, 80%, 85% 또는 90%, 가장 바람직하게는 적어도 95%를 갖는다.
바람직하게는, (Z) 내지 (DD)에 정의된 바와 같은 핵산 분자는
(1) 서열 115 또는 116의 서열을 포함하는 핵산 분자, 또는
(2) 서열 115 또는 116의 핵산 분자에 대해 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 85%, 예를 들어 적어도 90%, 보다 바람직하게는 적어도 95%, 예를 들어 적어도 96%, 보다 더 바람직하게는 적어도 97%, 예를 들어 적어도 98%, 가장 바람직하게는 적어도 99% 동일성을 갖는 핵산 분자, 또는
(3) 중간 정도의 엄격한 조건 하에, 보다 바람직하게는 고도의 엄격한 조건 하에, 가장 바람직하게는 매우 고도의 엄격한 조건 하에, 서열 115 또는 116을 갖는 핵산 분자에 혼성화되는 핵산 분자, 또는
(4) 서열 115 또는 116을 갖는 핵산 분자의 적어도 10개 뉴클레오티드, 바람직하게는 적어도 20개 뉴클레오티드, 적어도 30개 뉴클레오티드 또는 적어도 40개 뉴클레오티드의 단편, 보다 바람직하게는 적어도 50개 뉴클레오티드, 적어도 75개 뉴클레오티드 또는 적어도 100개 뉴클레오티드, 보다 더 바람직하게는 적어도 150개 또는 적어도 200개 뉴클레오티드의 단편
의 서열을 갖는, 미생물에서 프로모터로서 기능하는 서열의 제어 하에 있다. 바람직하게는 서열 115 또는 116의 단편은 서열 115 또는 116의 3' 영역을 포함하는 단편이고, 따라서 단편은 서열 115 또는 116의 5' 말단에 결실을 포함한다.
본 발명의 추가 실시양태는 상기 정의된 바와 같은 본 발명의 하나 이상의 재조합 미생물을 포함하는 조성물이다. 조성물은 본 발명의 재조합 미생물의 성장을 허용하는 배지를 추가로 포함할 수 있다. 배지는 추가적으로 탄소 공급원, 예컨대 헥소스, 펜토스 또는 폴리올, 예를 들어 수크로스, 글루코스, 프룩토스, 갈락토스, 만노스, 라피노스, 크실로스, 아라비노스, 크실룰로스, 글리세롤, 만니톨, 아라비톨, 크실리톨, 전분, 셀룰로스, 리그노셀룰로스 또는 그의 조합을 포함할 수 있다. 바람직하게는 탄소 공급원은 글루코스 또는 수크로스, 보다 바람직하게는 탄소 공급원은 글루코스이다.
바람직한 실시양태에서, 조성물은 본 발명의 미생물, 및 NBS 배지, AM1 배지 또는 PPM01 배지를 포함한다. 보다 바람직하게는 조성물은 탄소 공급원, 바람직하게는 당을 추가로 포함한다. 이들 배지의 성분은 통상의 기술자에게 공지되어 있다.
바람직하게는 NBS 배지는 리터당
1-5 g, 바람직하게는 3.5 g KH2PO4 및
1-10 g, 바람직하게는 5.0 g K2HPO4 및
1-5 g, 바람직하게는 3.5 g (NH4)2HPO4 및
0.1-1 g, 바람직하게는 0.25 g MgSO4 - 7 H2O 및
5-25 mg, 바람직하게는 15 mg CaCl2 - 2 H2O 및
0.1-1 mg, 바람직하게는 0.5 mg 티아민 및
0.1-5 ml, 바람직하게는 1 ml 미량 금속 스톡
을 포함하며, 여기서 미량 금속 스톡은 0.01-1 M, 바람직하게는 0.1 M HCl 리터당 0.5-5 g, 바람직하게는 1.6 g FeCl3 - 6 H2O; 0.05-0.5 g, 바람직하게는 0.2 g CoCl2 - 6 H2O; 0.01-0.5 g, 바람직하게는 0.1 g CuCl2 - 2 H2O; 0.1-0.5 g, 바람직하게는 0.2 g ZnCl2; 0.05-0.5 g, 바람직하게는 0.2 g NaMoO4 - 2 H2O; 0.001-0.1 g, 바람직하게는 0.05 g H3BO3을 포함한다.
NBS 배지 중 바람직한 탄소 공급원은 글루코스 또는 수크로스, 바람직하게는 2%-18% 글루코스 또는 2%-16% 수크로스이다.
바람직하게는 AM 1 배지는 0.1-10 mM, 바람직하게는 1 mM 베타인 용액 리터당
1-10 g, 바람직하게는 2.6 g (NH4)2HPO4 및
0.1-5 g, 바람직하게는 0.87 g NH4H2PO4 및
0.05-2.5 g, 바람직하게는 0.15 g KCl 및
0.05-5 g, 바람직하게는 0.37 g MgSO4-7H2O 및
0.1-5 ml, 바람직하게는 1 ml 미량 금속 스톡
을 포함하며, 여기서 미량 금속 스톡은 0.01-1 M, 바람직하게는 0.12 M HCl 리터당 1-5 g, 바람직하게는 2.4 g FeCl3-6H2O; 0.1-1 g, 바람직하게는 0.3 g CoCl2-6H2O; 0.1-1 g, 바람직하게는 0.21 g CuCl2 - 2 H2O; 0.1-1 g, 바람직하게는 0.3 g ZnCl2; 0.1-1 g, 바람직하게는 0.27 g NaMoO4 - 2 H2O; 0.01-0.5 g, 바람직하게는 0.068 g H3BO3 및 0.1-1 g, 바람직하게는 0.5 g MnCl2 - 4 H2O, 및 임의로 1-30 g, 바람직하게는 15 g (NH4)2SO4를 포함한다.
NBS 배지 중 바람직한 탄소 공급원은 글루코스 또는 수크로스, 바람직하게는 2%-18% 글루코스 또는 2%-16% 수크로스이다.
바람직하게는 PPM01 배지는 리터당
0.05-5 g, 바람직하게는 0.37 g MgSO4 - 7 H2O 및
0.1-10 g, 바람직하게는 1 g (NH4)2SO4 및
0.05-5 g, 바람직하게는 0.46 g 베타인 및
0.001-0.5 g, 바람직하게는 0.05 g 시아노코발라민 (B12) 및
1-10 g, 바람직하게는 3.74 g KH2PO4 및
0.1-5 ml, 바람직하게는 1 ml 미량 금속 스톡
을 포함하며, 여기서 미량 금속 스톡은 10-100 mM, 바람직하게는 60 mM 황산 리터당 1-10 g, 바람직하게는 3.48 g (NH4)2Fe(II)(SO4)2 - 7 H2O; 0.1-1 g, 바람직하게는 0.35 g CoSO4 - 7 H2O; 0.1-1 g, 바람직하게는 0.31 g CuSO4 - 5 H2O; 0.1-5 g, 바람직하게는 0.63 g ZnSO4 - 7 H2O; 0.1-1 g, 바람직하게는 0.27 g MnSO4 - H2O; 0.01-1 g, 바람직하게는 0.07 g NaMoO4 - 2 H2O 및 0.1-5 g, 바람직하게는 0.43 g H3BO3을 포함한다.
PPM01 배지 중 바람직한 탄소 공급원은 글루코스 1수화물이고, 배지 리터당 바람직하게는 바람직하게는 10-500 g, 보다 바람직하게는 140 g 글루코스 1수화물이다.
본 발명의 추가 실시양태는 하기 단계를 포함하는, 증진된 알라닌, 피루베이트, 숙시네이트, 아스파르테이트, 말레이트, 락테이트, 발린 및/또는 류신, 바람직하게는 숙시네이트 또는 알라닌, 보다 바람직하게는 알라닌 수율 또는 생산성을 갖는 재조합 미생물을 생산하는 방법이다:
(I) 미생물에서 i) 상기 (i) 내지 (v) 하에 정의된 바와 같은 brnQ 유전자의 하나 이상의 활성 및/또는 발현을 감소시키거나, 억제하거나 또는 결실시키고/거나, ii) 상기 (i) 내지 (v) 하에 정의된 바와 같은 argP 유전자의 하나 이상의 활성 및/또는 발현을 도입하거나, 증가시키거나, 증진시키고/거나, iii) 상기 (i) 내지 (v) 하에 정의된 바와 같은 gcvA 유전자의 하나 이상의 활성 및/또는 발현을 도입하거나, 증가시키거나, 증진시키고/거나, iv) 상기 (i) 내지 (v) 하에 정의된 바와 같은 gcvB 유전자의 하나 이상의 활성 및/또는 발현을 감소시키거나, 억제하거나 또는 결실시키고/거나, v) 상기 (i) 내지 (v) 하에 정의된 바와 같은 lpxD 유전자의 활성을 변경시키는 단계; 및
(II) 상기 (I) 하에 정의된 바와 같은 변형이 없는 상응하는 미생물과 비교하여 증진된 알라닌, 피루베이트, 숙시네이트, 아스파르테이트, 말레이트, 락테이트, 발린 및/또는 류신, 바람직하게는 숙시네이트 또는 알라닌, 보다 바람직하게는 알라닌 수율 또는 생산성을 갖는 재조합 미생물을 생성하고, 확인하고, 단리하는 단계.
바람직한 실시양태에서, 감소, 억제 또는 결실된 활성 및/또는 발현을 수반하는 brnQ 유전자는 서열 3의 서열을 갖고/거나 서열 4의 폴리펩티드를 코딩한다.
바람직한 실시양태에서, 도입, 증가 또는 증진된 활성 및/또는 발현을 수반하는 argP 유전자는 서열 47의 서열을 갖고/거나 서열 48의 폴리펩티드를 코딩한다.
바람직한 실시양태에서, 도입, 증가 또는 증진된 활성 및/또는 발현을 수반하는 gcvA 유전자는 서열 56 또는 57의 서열을 갖는 프로모터에 기능적으로 연결된다.
바람직한 실시양태에서, 감소, 억제 또는 결실된 활성 및/또는 발현을 수반하는 gcvB 유전자는 서열 60 또는 61의 서열을 갖는 프로모터에 기능적으로 연결된다.
바람직한 실시양태에서, 변경된 활성 및/또는 발현을 수반하는 lpxD 유전자는 서열 51의 서열을 갖고/거나 서열 52의 폴리펩티드를 코딩한다.
본 발명의 재조합 미생물을 생산하는 방법의 바람직한 실시양태에서, 방법은, 예를 들어 상기 (A) 내지 (Y) 하에 정의된 바와 같은 pflB 유전자, adhE 유전자, ldhA 유전자, pta 유전자 또는 frdA 유전자 중 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개 또는 모두의 활성 및/또는 발현을 감소시키거나, 억제하거나 또는 결실시키는 단계, 및/또는 예를 들어, 상기 (Z) 내지 (UU) 하에 정의된 바와 같은 alaD 유전자, ygaW 유전자, zipA 유전자 또는 lpd 유전자 중 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개 또는 모두의 활성 및/또는 발현을 도입하거나, 증가시키거나 또는 증진시키는 단계를 추가로 포함한다.
본 발명의 재조합 미생물을 생산하는 방법의 추가의 바람직한 실시양태에서, (Z) 내지 (DD)에 정의된 바와 같은 핵산 분자는
(1) 서열 115 또는 116의 서열을 포함하는 핵산 분자, 또는
(2) 서열 115 또는 116의 핵산 분자에 대해 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 85%, 예를 들어 적어도 90%, 보다 바람직하게는 적어도 95%, 예를 들어 적어도 96%, 보다 더 바람직하게는 적어도 97%, 예를 들어 적어도 98%, 가장 바람직하게는 적어도 99% 동일성을 갖는 핵산 분자, 또는
(3) 중간 정도의 엄격한 조건 하에, 보다 바람직하게는 고도의 엄격한 조건 하에, 가장 바람직하게는 매우 고도의 엄격한 조건 하에, 서열 115 또는 116을 갖는 핵산 분자에 혼성화되는 핵산 분자, 또는
(4) 서열 115 또는 116을 갖는 핵산 분자의 적어도 10개 뉴클레오티드, 바람직하게는 적어도 20개 뉴클레오티드, 적어도 30개 뉴클레오티드 또는 적어도 40개 뉴클레오티드의 단편, 보다 바람직하게는 적어도 50개 뉴클레오티드, 적어도 75개 뉴클레오티드 또는 적어도 100개 뉴클레오티드, 보다 더 바람직하게는 적어도 150개 또는 적어도 200개 뉴클레오티드의 단편
의 서열을 갖는, 미생물에서 프로모터로서 기능하는 서열의 제어 하에 있다. 바람직하게는 서열 115 또는 116의 단편은 서열 115 또는 116의 3' 영역을 포함하는 단편이고, 따라서 단편은 서열 115 또는 116의 5' 말단에 결실을 포함한다.
본 발명의 재조합 미생물을 생산하기 위한 가장 바람직한 방법은 brnQ 유전자, gcvB 유전자, pflB 유전자, adhE 유전자, ldhA 유전자, pta 유전자 및 frdA 유전자 모두의 활성 및/또는 발현을 감소시키거나, 억제하거나 또는 결실시키는 단계, 및/또는 alaD 유전자, ygaW 유전자, zipA 유전자, lpd 유전자, argP 유전자 및 gcvA 유전자 모두의 활성 및/또는 발현을 도입하거나, 증가시키거나 또는 증진시키는 단계, 및/또는 lpxD 유전자의 활성 및/또는 발현을 변경시키는 단계를 포함한다.
본 발명의 재조합 미생물을 생산하는 방법의 한 실시양태에서, 미생물은 글루코노박터 옥시단스, 글루코노박터 아사이이, 아크로모박터 델마르바에, 아크로모박터 비스코수스, 아크로모박터 락티쿰, 아그로박테리움 투메파시엔스, 아그로박테리움 라디오박터, 알칼리게네스 파에칼리스, 아르트로박터 시트레우스, 아르트로박터 투메스센스, 아르트로박터 파라피네우스, 아르트로박터 히드로카르보글루타미쿠스, 아르트로박터 옥시단스, 아우레오박테리움 사페르다에, 아조토박터 인디쿠스, 브레비박테리움 암모니아게네스, 브레비박테리움 디바리카툼, 브레비박테리움 락토페르멘툼, 브레비박테리움 플라붐, 브레비박테리움 글로보숨, 브레비박테리움 푸스쿰, 브레비박테리움 케토글루타미쿰, 브레비박테리움 헬콜룸, 브레비박테리움 푸실룸, 브레비박테리움 테스타세움, 브레비박테리움 로세움, 브레비박테리움 임마리오필리움, 브레비박테리움 리넨스, 브레비박테리움 프로토파르미아에, 코리네박테리움 아세토필룸, 코리네박테리움 글루타미쿰, 코리네박테리움 칼루나에, 코리네박테리움 아세토아시도필룸, 코리네박테리움 아세토글루타미쿰, 엔테로박터 아에로게네스, 에르위니아 아밀로보라, 에르위니아 카로노보라, 에르위니아 헤르비콜라, 에르위니아 크리산테미, 플라보박테리움 페레그리눔, 플라보박테리움 푸카툼, 플라보박테리움 아우란티눔, 플라보박테리움 레나눔, 플라보박테리움 세와넨세, 플라보박테리움 브레베, 플라보박테리움 메닝고셉티쿰, 미크로코쿠스 종 CCM825, 모르가넬라 모르가니이, 노카르디아 오파카, 노카르디아 루고사, 플라노코쿠스 에우시나투스, 프로테우스 레트게리, 프로피오니박테리움 세르마니이, 슈도모나스 신크산타, 슈도모나스 아조토포르만스, 슈도모나스 오발리스, 슈도모나스 스투체리, 슈도모나스 아시도볼란스, 슈도모나스 무시돌렌스, 슈도모나스 테스토스테로니, 슈도모나스 아에루기노사, 로도코쿠스 에리트로폴리스, 로도코쿠스 로도크로우스, 로도코쿠스 종 ATCC 15592, 로도코쿠스 종 ATCC 19070, 스포로사르시나 우레아에, 스타필로코쿠스 아우레우스, 비브리오 메트슈니코비이, 비브리오 티로게네스, 악티노마두라 마두라에, 악티노미세스 비올라세오크로모게네스, 키타사토스포리아 파룰로사, 스트렙토미세스 아베르미틸리스, 스트렙토미세스 코엘리콜로르, 스트렙토미세스 플라벨루스, 스트렙토미세스 그리세올루스, 스트렙토미세스 리비단스, 스트렙토미세스 올리바세우스, 스트렙토미세스 타나쉬엔시스, 스트렙토미세스 비르기니아에, 스트렙토미세스 안티비오티쿠스, 스트렙토미세스 카카오이, 스트렙토미세스 라벤둘라에, 스트렙토미세스 비리도크로모게네스, 아에로모나스 살모니시다, 바실루스 푸밀루스, 바실루스 시르쿨란스, 바실루스 티아미놀리티쿠스, 에스케리키아 프레운디이, 미크로박테리움 암모니아필룸, 세라티아 마르세센스, 살모넬라 티피무리움, 살모넬라 스코트물레리, 크산토모나스 시트리, 시네코시스티스 종, 시네코코쿠스 엘롱가투스, 써모시네코코쿠스 엘롱가투스, 미크로시스티스 아에루기노사, 노스톡 종, 엔. 콤뮤네, 엔. 스파에리쿰, 노스톡 푼크티포르메, 스피룰리나 플라텐시스, 린그비아 마주스쿨라, 엘. 라게레이미아, 포르미디움 테누에, 아나바에나 종, 렙토린그비아 종 등을 포함하는 원핵 미생물의 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 미생물은 진핵 세포이다. 적합한 진핵 세포는 효모 세포, 예를 들어 사카로미세스 종, 예컨대 사카로미세스 세레비지아에, 한세눌라 종, 예컨대 한세눌라 폴리모르파, 쉬조사카로미세스 종, 예컨대 쉬조사카로미세스 폼베, 클루이베로미세스 종, 예컨대 클루이베로미세스 락티스 및 클루이베로미세스 마르시아누스, 야로위아 종, 예컨대 야로위아 리폴리티카, 피키아 종, 예컨대 피키아 메타놀리카, 피키아 스티피테스 및 피키아 파스토리스, 지고사카로마이세스 종, 예컨대 지고사카로마이세스 로욱시이 및 지고사카로마이세스 바일리이, 칸디다 종, 예컨대 칸디다 보이디니이, 칸디다 우틸리스, 칸디다 프레이슈시이, 칸디다 글라브라타 및 칸디다 소노렌시스, 슈완니오미세스 종, 예컨대 슈완니오미세스 옥시덴탈리스, 아륵술라 종, 예컨대 아륵술라 아데니니보란스, 오가타에아 종, 예컨대 오가타에아 미누타, 클레브시엘라 종, 예컨대 클레브시엘라 뉴모니아를 포함한다.
수많은 박테리아 산업용 균주가 본원에 개시된 방법에 사용하는데 특히 적합하다. 일부 실시양태에서, 미생물은 코리네박테리움 속의 종, 예를 들어 씨. 아세토필룸, 씨. 글루타미쿰, 씨. 칼루나에, 씨. 아세토아시도필룸, 씨. 아세토글루타미쿰이다. 일부 실시양태에서, 미생물은 바실루스 속의 종, 예를 들어 비. 투린기엔시스, 비. 안트라시스, 비. 메가테리움, 비. 서브틸리스, 비. 렌틸스, 비. 시르쿨란스, 비. 푸밀루스, 비. 라우투스, 비. 코아굴란스, 비. 브레비스, 비. 피르무스, 비. 알카오피우스, 비. 리케니포르미스, 비. 클라우시이, 비. 스테아로써모필루스, 비. 할로두란스, 비. 서브틸리스, 비. 푸밀루스 및 비. 아밀로리퀘파시엔스이다. 일부 실시양태에서, 미생물은 에르위니아 속의 종, 예를 들어 이. 우레도보라, 이. 카로노보라, 이. 아나나스, 이. 헤르비콜라, 이. 푼크타타 및 이. 테레우스이다. 일부 실시양태에서, 미생물은 에스케리키아 속의 종, 예를 들어 이. 콜라이이다. 다른 실시양태에서, 미생물은 판토에아 속의 종, 예를 들어 피. 시트레아 또는 피. 아글로메란스이다. 또 다른 실시양태에서, 미생물은 스트렙토미세스 속의 종, 예를 들어 에스. 암보파시엔스, 에스. 아크로모게네스, 에스. 아베르미틸리스, 에스. 코엘리콜로르, 에스. 아우레오파시엔스, 에스. 아우레우스, 에스. 푼기시디쿠스, 에스. 그리세우스 또는 에스. 리비단스이다. 추가 실시양태에서, 미생물은 지모모나스 속의 종, 예를 들어 지. 모빌리스 또는 지. 리폴리티카이다. 추가 실시양태에서, 미생물은 로도코쿠스 속의 종, 예를 들어 알. 오파쿠스이다.
바람직하게는, 미생물은 엔테로박테리아세아에 과, 바람직하게는 에스케리키아 속으로부터 선택되며, 예를 들어 에스케리키아 콜라이 (이. 콜라이), 바람직하게는 DSMZ 1116 (이는 ATCC9637에 상응함)에 상응하는 균주 이. 콜라이 W이다.
본 발명의 추가 실시양태는 알라닌, 피루베이트, 숙시네이트, 아스파르테이트, 말레이트, 락테이트, 발린 및/또는 류신, 바람직하게는 숙시네이트 또는 알라닌, 보다 바람직하게는 알라닌, 가장 바람직하게는 L-알라닌의 생산을 허용하는 조건 하에 상기 정의된 바와 같은 하나 이상의 재조합 미생물을 배양하는 단계를 포함하는, 알라닌, 피루베이트, 숙시네이트, 아스파르테이트, 말레이트, 락테이트, 발린 및/또는 류신, 바람직하게는 숙시네이트 또는 알라닌, 보다 바람직하게는 알라닌, 가장 바람직하게는 L-알라닌의 생산 방법이다.
일부 실시양태에서, 본 발명에 의해 포괄된 재조합 미생물은 회분식 또는 연속식 발효 조건 하에 성장시킨다. 전통적인 회분식 발효는 배지의 조성을 발효 시작시 설정하고 발효 동안에는 이를 인위적으로 변경시키지 않는 폐쇄 시스템이다. 회분식 시스템의 변형이 유가식 발효이다. 이러한 변형에서는, 발효가 진행됨에 따라 기질을 증분하여 첨가한다. 유가식 시스템은 이화대사물 억제가 세포의 대사를 억제할 가능성이 있는 경우에 및 배지 중에 제한된 양의 기질을 갖는 것이 요망되는 경우에 유용하다. 회분식 및 유가식 발효는 통상적이고 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 본 발명에서 또한 사용되는 것으로 발견된 연속식 발효는 한정된 발효 배지를 생물반응기에 연속적으로 첨가하고 동등량의 조건화 배지 (예를 들어, 목적하는 최종 산물을 함유함)를 처리를 위해 동시에 제거하는 시스템이다. 연속식 발효는 일반적으로, 세포가 주로 최종 산물의 생산이 증진되는 성장기에 있는 경우에 일정한 고 밀도로 배양물을 유지시킨다. 연속식 발효 시스템은 정상 상태 성장 조건을 유지하려고 노력한다. 연속식 발효 공정을 위해 영양소 및 성장 인자를 조절하는 방법, 뿐만 아니라 산물 형성 비율을 최대화하기 위한 기술은 산업 미생물학 분야에 널리 공지되어 있다.
일부 실시양태에서, 발효는 약 10℃ 내지 약 60℃, 약 15℃ 내지 약 50℃, 약 20℃ 내지 약 45℃, 약 25℃ 내지 약 45℃, 약 30℃ 내지 약 45℃, 및 약 25℃ 내지 약 40℃의 범위 내의 온도에서 수행된다. 바람직한 실시양태에서, 온도는 약 34℃, 35℃ 또는 36℃이다. 가장 바람직한 실시양태에서, 온도는 약 37℃ 또는 38℃이다.
일부 다른 실시양태에서, 발효는 약 8시간 내지 240시간, 약 8시간 내지 약 168시간, 약 10시간 내지 약 144시간, 약 15시간 내지 약 120시간, 또는 약 20시간 내지 약 72시간의 범위 내의 기간 동안 수행된다. 바람직하게는, 발효는 약 20시간 내지 약 40시간 동안 수행된다.
일부 다른 실시양태에서, 발효는 약 4 내지 약 9의 범위, 약 4.5 내지 약 8.5의 범위, 약 5 내지 약 8의 범위, 또는 약 5.5 내지 약 7.5의 범위 내의 pH에서 수행된다. 바람직하게는, 발효는 7의 pH에서 수행될 것이다.
알라닌, 피루베이트, 숙시네이트, 아스파르테이트, 말레이트, 락테이트, 발린 및/또는 류신, 바람직하게는 숙시네이트 또는 알라닌, 보다 바람직하게는 알라닌을 생산하는 방법의 한 실시양태에서, 미생물은 1% 내지 30% (w/v)의 당, 5% 내지 25% (w/v)의 당, 10% 내지 20% (w/v)의 당, 11% 내지 18% (w/v)의 당을 포함하는 배지에서 배양된다. 바람직하게는, 미생물은 12% 내지 16% (w/v)의 당을 포함하는 배지에서 배양된다. 보다 바람직하게는 미생물은 13% 내지 15% (w/v)의 당을 포함하는 배지에서 배양되고, 가장 바람직하게는 미생물은 14% (w/v)의 당을 포함하는 배지에서 배양된다.
알라닌, 피루베이트, 숙시네이트, 아스파르테이트, 말레이트, 락테이트, 발린 및/또는 류신, 바람직하게는 숙시네이트 또는 알라닌, 보다 바람직하게는 알라닌을 생산하는 방법의 또 다른 실시양태에서, 알라닌, 피루베이트, 숙시네이트, 아스파르테이트, 말레이트, 락테이트, 발린 및/또는 류신의 수율은 적어도 80%, 예를 들어 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84% 또는 적어도 85%이다. 바람직하게는 수율은 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89% 또는 적어도 90%이다. 보다 바람직하게는 수율은 적어도 90.5%, 적어도 91%, 적어도 91.5%, 적어도 92%, 적어도 92.5%, 적어도 93%, 적어도 93.5%, 적어도 94% 또는 적어도 94.5%이다. 보다 더 바람직한 실시양태에서, 수율은 적어도 95% 또는 적어도 95.5%이다. 가장 바람직한 실시양태에서, 수율은 적어도 96%이다. 퍼센트 수율은 배지 중 글루코스 그램으로부터 생산된 산물 그램으로서 계산된다. 따라서, 배지가 100 g 글루코스를 함유하고 발효로 인해 98 g 알라닌이 생성되면, 그 수율은 98%일 것이다.
알라닌을 생산하는 방법의 또 다른 실시양태에서, 바람직하게는 L-알라닌이 생산되며, 여기서 L-알라닌의 키랄 순도는 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93% 또는 적어도 94%이다. 바람직한 실시양태에서, L-알라닌의 키랄 순도는 적어도 95% 또는 적어도 95.5%이다. 보다 바람직한 실시양태에서, L-알라닌의 키랄 순도는 적어도 96% 또는 적어도 96.5% 또는 적어도 97%이다. 보다 더 바람직한 실시양태에서, L-알라닌의 키랄 순도는 적어도 97.5%, 적어도 98% 또는 적어도 98.5%, 예를 들어 적어도 99%이다. 보다 더 바람직하게는, L-알라닌의 키랄 순도는 적어도 99.5% 또는 적어도 99.6%, 예를 들어 적어도 99.7%, 적어도 99.8% 또는 적어도 99.9%이다. 가장 바람직한 실시양태에서, 키랄 순수 L-알라닌이 생산된다.
본 발명의 또 다른 실시양태는 배양 배지에 하나 이상의 유전자 변형된 미생물을 접종하는 단계; 및 상기 유전자 변형된 미생물을 상기 정의된 바와 같은 조건 하에 배양 배지에서 배양하거나 성장시키는 단계를 포함하는, 상기 정의된 바와 같은 유전자 변형된 미생물 중 어느 것을 배양하거나 성장시키는 방법이다.
알라닌, 피루베이트, 숙시네이트, 아스파르테이트, 말레이트, 락테이트, 발린 및/또는 류신, 바람직하게는 숙시네이트 또는 알라닌, 보다 바람직하게는 알라닌, 가장 바람직하게는 L-알라닌의 발효적 생산을 위한, 상기 정의된 바와 같은 재조합 미생물 또는 상기 정의된 바와 같은 조성물의 용도가 본 발명의 추가의 실시양태이다.
본 발명에 따른 재조합 미생물은 각각의 참조 미생물, 예를 들어 야생형과 비교하여, brnQ 유전자에 의해 코딩되는 효소 및/또는 gcvB 유전자에 의해 코딩되는 RNA의 발현 및/또는 활성이 감소되고/거나, argP 유전자 및/또는 gcvA 유전자에 의해 코딩되는 효소의 발현 및/또는 활성이 증가되고/거나, lpxD 유전자에 의해 코딩되는 효소의 활성이 변경되는 것을 특징으로 한다.
용어 "의 감소된 발현 및/또는 활성"은 또한 brnQ 및/또는 gcvB의 검출가능하지 않은 발현 및/또는 활성을 갖는 야생형 미생물을 포괄한다.
한 실시양태에서, 유전자의 발현 및/또는 활성의 감소는 유전자의 탈활성화, 돌연변이 또는 녹아웃에 의해 달성된다. 이것은 유전자의 코딩 영역 및/또는 프로모터의 일부 또는 전부의 결실, 유전자의 돌연변이, 예를 들어 유전자의 코딩 영역 내에 프레임시프트를 유발시키는 일정수의 뉴클레오티드, 예컨대 1 또는 2개의 뉴클레오티드의 삽입 또는 결실, 코딩 영역 내에 정지 코돈의 도입, 유전자의 프로모터의 불활성화 (이는 예를 들어 프로모터 박스, 예컨대 리보솜 진입 측면, TATA 박스 등을 결실시키거나 돌연변이시킴으로써 수행됨)에 의해 수행될 수 있었다. 감소는 또한, 예를 들어 리보자임, dsRNA, 안티센스 RNA 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드의 도입을 통해 유전자의 전사체를 분해함으로써 달성될 수 있다. 유전자의 활성의 감소는 세포에서 표적 효소에 특이적으로 결합하는 항체 또는 압타머를 발현시킴으로써 달성될 수 있다. 유전자의 발현 및/또는 활성을 감소시키기 위한 다른 방법은 통상의 기술자에게 공지되어 있다.
바람직한 실시양태에서, brnQ 유전자의 발현 및/또는 활성의 감소는 유전자 내로의 돌연변이, 바람직하게는 결실의 도입에 의해 달성된다. 추가의 바람직한 실시양태에서, 결실은 서열 1의 위치 667과 764 사이에 도입되며, 이에 의해 brnQ 유전자로부터 97개 뉴클레오티드가 결실된다. 생성된 말단절단된 핵산은 서열 3에 도시된 바와 같은 서열을 갖고 서열 4에 도시된 바와 같은 말단절단된 단백질을 코딩한다.
바람직한 실시양태에서, argP 유전자의 발현 및/또는 활성의 증가는 유전자 내로의 돌연변이, 바람직하게는 점 돌연변이의 도입에 의해 달성된다. 보다 바람직하게는, 그것은 서열 45의 argP 유전자의 위치 286 내지 288에서의 코돈 또는 기능적 상동 유전자의 상응하는 코돈을 돌연변이시킴으로써 달성된다. 보다 더 바람직하게는, 코돈은 아미노산 글루탐산 또는 또 다른 산성 아미노산 또는 그의 아미드 또는 알라닌이 아닌 글루탐산과 유사한 아미노산을 코딩하도록 돌연변이된다. 가장 바람직한 실시양태에서, 각각의 코돈은 아미노산 글루탐산을 코딩하도록 돌연변이된다.
바람직하게는 argP 유전자의 발현 및/또는 활성의 증가는 argP 유전자에 돌연변이를 도입함으로써 달성되며, 여기서 돌연변이된 argP 유전자는 서열 47의 서열을 갖고, 서열 48의 단백질을 코딩한다.
바람직하게는 gcvA 유전자의 발현 및/또는 활성의 증가는 gcvA 유전자의 프로모터에 돌연변이를 도입함으로써 달성되며, 여기서 돌연변이된 프로모터는 바람직하게는 서열 56 또는 서열 57의 서열을 갖는다.
바람직한 실시양태에서, gcvB 유전자의 발현 및/또는 활성의 감소는 프로모터 내로의 돌연변이의 도입에 의해 달성된다. 예를 들어, 프로모터는 서열 59의 위치 62 내지 68에 염기 T 중 어느 하나 이상을 결실시키거나 또는 서열 59의 위치 60에 점 돌연변이를 도입하여 이 위치에 있는 A가 G, C 또는 T 중 어느 하나가 되도록 함으로써 돌연변이될 수 있다. 바람직하게는, 돌연변이된 프로모터는 서열 60 또는 61의 서열을 갖는다.
바람직하게는, gcvB 유전자의 발현 및/또는 활성의 감소는 gcvB 유전자의 프로모터에 돌연변이를 도입함으로써 달성된다. 바람직하게는, 서열 59를 갖는 야생형 프로모터는 서열 60 또는 61의 서열을 갖도록 돌연변이된다.
바람직하게는, lpxD 유전자의 변경된 발현 및/또는 활성은 lpxD 유전자에 돌연변이를 도입함으로써 달성되며, 여기서 돌연변이된 lpxD 유전자는 서열 51의 서열을 갖고, 서열 52의 단백질을 코딩한다.
본원에 개시된, 각각 RNA 또는 효소의 감소된 발현 및/또는 활성, 특히 락테이트 데히드로게나제 (ldhA), 피루베이트 포르메이트 리아제 I (pflB), 이관능성 아세트알데히드-CoA 데히드로게나제/철-의존성 알콜 데히드로게나제/피루베이트-포르메이트 리아제 데악티바제 (adhE), 포스페이트 아세틸트랜스퍼라제 (pta), 푸마레이트 리덕타제 (frdA), gcvB 및/또는 brnQ에 의해 코딩된 RNA 또는 효소의 감소된 발현 및/또는 감소된 활성은 각각의 참조 미생물, 예를 들어 야생형 미생물에서의 상기 RNA 또는 효소의 발현 및/또는 활성과 비교하여, 상기 발현 및/또는 효소 활성의 적어도 50% 감소, 또는 상기 발현 및/또는 효소 활성의 적어도 90% 감소, 또는 보다 바람직하게는 상기 발현 및/또는 효소 활성의 적어도 95% 감소, 또는 보다 바람직하게는 상기 발현 및/또는 효소 활성의 적어도 98% 감소, 또는 보다 더 바람직하게는 상기 발현 및/또는 효소 활성의 적어도 99% 감소, 또는 보다 더 바람직하게는 상기 발현 및/또는 효소 활성의 적어도 99.9% 감소일 수 있다. 가장 바람직한 실시양태에서, 상기 RNA 또는 효소의 발현 및/또는 활성은 본 발명의 미생물에서 검출가능하지 않다.
gcvB 유전자 및/또는 brnQ 유전자의 발현 및/또는 활성의 상실, 및 argP 유전자 및/또는 gcvA 유전자의 도입 또는 증가된 발현 및/또는 활성, 및 lpxD 유전자의 변경된 활성 및/또는 발현은, 각각의 참조 미생물과 비교하여 본 발명의 재조합 미생물에서의 알라닌, 피루베이트, 숙시네이트, 아스파르테이트, 말레이트, 락테이트, 발린 및/또는 류신, 바람직하게는 숙시네이트 또는 알라닌, 보다 바람직하게는 알라닌의 개선된 수율 및/또는 생산성을 유발한다. 따라서, brnQ 유전자 또는 gcvB 유전자의 발현 및/또는 활성의 상실, 및 argP 유전자 또는 gcvA 유전자의 발현 및/또는 활성의 도입 또는 증가, 및 lpxD 유전자의 활성 및/또는 발현의 변경은 각각의 참조 미생물과 비교하여 본 발명의 재조합 미생물의 알라닌, 피루베이트, 숙시네이트, 아스파르테이트, 말레이트, 락테이트, 발린 및/또는 류신, 바람직하게는 숙시네이트 또는 알라닌, 보다 바람직하게는 알라닌 수율 및/또는 생산성을 측정함으로써 결정될 수 있다. 대사물, 예를 들어 알라닌의 발효적 생산 방법은 통상의 기술자에게 공지되어 있고 또한 본원에 기재되어 있다. 각각의 참조 미생물에 의한 발효에서의 알라닌의 수율과 비교하여 본 발명의 미생물에 의한 발효에서의, 예를 들어 알라닌의 개선된 수율이 각각의 유전자의 발현 및/또는 활성의 상실, 감소, 도입 또는 증가 또는 변경에 대한 척도이다.
락테이트 데히드로게나제 (ldhA) 발현 또는 활성을 결정하는 방법은, 예를 들어 문헌 [Bunch et al. in "The ldhA gene encoding the fermentative lactate de hydrogenase of Escherichia Coli", Microbiology (1997), Vol. 143, pages 187-155; 또는 Bergmeyer, H.U., Bergmeyer J. and Grassl, M. (1983-1986) in “Methods of Enzymatic Analysis”, 3rd Edition, Volume III, pages 126-133, Verlag Chemie, Weinheim; 또는 Enzymes in Industry: Production and Applications, Second Edition (2004), Wolfgang Aehle, page 23]에 개시되어 있다. 마지막 방법이 바람직하다.
피루베이트 포르메이트 리아제 I (pflB) 발현 또는 활성을 결정하는 방법은, 예를 들어 문헌 [Knappe J, Blaschkowski HP, Grobner P, Schmitt T (1974). "Pyruvate formate-lyase of Escherichia coli: the acetyl-enzyme intermediate." Eur J Biochem 1974;50(1);253-63. PMID: 4615902; KNAPPE, Joachim, et al. "Pyruvate Formate-Lyase of Escherichia coli: the Acetyl-Enzyme Intermediate." European Journal of Biochemistry 50.1 (1974): 253-263; Wong, Kenny K., et al. "Molecular properties of pyruvate formate-lyase activating enzyme." Biochemistry 32.51 (1993): 14102-14110 및 Nnyepi, Mbako R., Yi Peng, and Joan B. Broderick. "Inactivation of E. coli pyruvate formate-lyase: Role of AdhE and small molecules." Archives of biochemistry and biophysics 459.1 (2007): 1-9]에 개시되어 있다.
이관능성 아세트알데히드-CoA 데히드로게나제/철-의존성 알콜 데히드로게나제/피루베이트-포르메이트 리아제 데악티바제 (adhE) 발현 또는 활성을 결정하는 방법은, 예를 들어 문헌 [Membrillo-Hernandez, Jorge, et al. "Evolution of the adhE Gene Product of Escherichia coli from a Functional Reductase to a Dehydrogenase GENETIC AND BIOCHEMICAL STUDIES OF THE MUTANT PROTEINS." Journal of Biological Chemistry 275.43 (2000): 33869-33875 및 Mbako R. Nnyepi, Yi Peng, Joan B. Broderick, Inactivation of E. coli pyruvate formate-lyase: Role of AdhE and small molecules, Archives of Biochemistry and Biophysics, Volume 459, Issue 1, 1 March 2007, Pages 1-9]에 개시되어 있다.
포스페이트 아세틸트랜스퍼라제 (PTA) 발현 또는 활성을 결정하는 방법은, 예를 들어 문헌 [Dittrich, Cheryl R., George N. Bennett, and Ka-Yiu San. "Characterization of the Acetate-Producing Pathways in Escherichia coli." Biotechnology progress 21.4 (2005): 1062-1067 및 Brown, T. D. K., M. C. Jones-Mortimer, and H. L. Kornberg. "The enzymic interconversion of acetate and acetyl-coenzyme A in Escherichia coli." Journal of general microbiology 102.2 (1977): 327-336]에 개시되어 있다.
푸마레이트 리덕타제 (frdA) 발현 또는 활성을 결정하는 방법은, 예를 들어 문헌 [Dickie, Peter, and Joel H. Weiner. "Purification and characterization of membrane-bound fumarate reductase from anaerobically grown Escherichia coli." Canadian journal of biochemistry 57.6 (1979): 813-821; Cecchini, Gary, et al. "Reconstitution of quinone reduction and characterization of Escherichia coli fumarate reductase activity." Journal of Biological Chemistry 261.4 (1986): 1808-1814; 또는 Schroeder, I., et al. "Identification of active site residues of Escherichia coli fumarate reductase by site-directed mutagenesis." Journal of Biological Chemistry 266.21 (1991): 13572-13579]에 개시되어 있다.
알라닌 데히드로게나제 (alaD) 발현 또는 활성을 결정하는 방법은, 예를 들어 문헌 [Sakamoto, Y., Nagata, S., Esaki, N., Tanaka, H., Soda, K. "Gene cloning, purification and characterization of thermostable alanine dehydrogenase of Bacillus stearothermophilus" J Fermen. Bioeng. 69 (1990):154-158]에 개시되어 있다.
용어 "효소의 감소된 발현"은, 예를 들어 각각의 참조 미생물, 예를 들어 야생형 미생물에 의해 발현된 것보다 더 낮은 수준에서 상기 유전자 조작된 (예를 들어, 유전자 공학처리된) 미생물에 의한 효소의 발현을 포함한다. 효소의 발현을 감소시키기 위한 유전적 조작은 효소를 코딩하는 유전자 또는 그의 일부를 결실시키는 것, 효소를 코딩하는 유전자의 발현과 연관된 조절 서열 또는 부위를 변경 또는 변형시키는 것 (예를 들어, 강력한 프로모터 또는 억제성 프로모터를 제거함으로써 수행됨), 효소를 코딩하는 유전자의 전사 및/또는 유전자 산물의 번역에 수반되는 단백질 (예를 들어, 조절 단백질, 억제자, 인핸서, 전사 활성화제 등)을 변형시키는 것, 또는 관련 기술분야에서 통상적인 특정한 유전자의 발현을 감소시키는 임의의 다른 통상적인 수단 (이는 안티센스 핵산 분자의 사용 또는 표적 단백질의 발현을 녹아웃 또는 차단시키는 다른 방법을 포함하나, 이에 제한되지는 않음)을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 추가로, 탈안정화 요소를 mRNA 내로 도입할 수 있거나 또는 RNA의 리보솜 결합 부위 (RBS)의 열화를 유발하는 유전자 변형을 도입할 수 있다. 번역 효율 및 속도가 감소되는 방식으로 유전자의 코돈 용법을 변화시키는 것이 또한 가능하다.
효소의 감소된 활성은 또한, 효소의 감소된 활성을 유발하는 하나 이상의 유해 유전자 돌연변이를 도입함으로써 수득될 수 있다. 게다가, 효소의 활성 감소는 또한, 활성이 감소되어야 하는 효소를 활성화시키기 위해 필요한 활성화 효소의 불활성화 (또는 감소된 발현)를 포함할 수 있다. 후자의 접근법에 의해, 활성이 감소되어야 하는 효소를 바람직하게는 불활성화 상태로 유지시킨다.
본 출원에 따른 유해 돌연변이는 유전자의 코딩 영역에 의해 코딩된 단백질의 감소되거나 또는 결실된 단백질 활성을 유발하는, 프로모터 및 코딩 영역을 포함하는 유전자 내에서의 임의의 돌연변이이다. 이러한 유해 돌연변이는, 예를 들어 프레임시프트, 코딩 영역 내에 정지 코돈의 도입, 전사를 방지하는 TATA 박스와 같은 프로모터 요소의 돌연변이 등을 포함한다.
brnQ-유전자에 의해 코딩된 효소 또는 gcvB 유전자에 의해 코딩된 RNA의 감소된 발현 및/또는 활성, 또는 argP 유전자 또는 gcvA 유전자에 의해 코딩된 단백질의 증진 또는 증가된 발현 및/또는 활성, 또는 lpxD 유전자에 의해 코딩된 단백질의 변경된 활성 및/또는 발현을 갖는 미생물은 자연적으로, 즉 자연 돌연변이로 인해 발생할 수 있다. 미생물은 상기 유전자 중 하나 이상에 의해 코딩되는 효소 또는 RNA의 유의하게 감소되거나, 증진되거나 또는 변경된 활성이 결여되거나 또는 그를 갖도록 다양한 기술, 예컨대 화학적 처리 또는 방사선에 의해 변형될 수 있다. 이러한 목적을 위해, 미생물을, 예를 들어 돌연변이유발성 화학적 작용제, X선 또는 UV 광에 의해 처리할 것이다. 후속 단계에서, 상기 유전자 중 하나 이상에 의해 코딩되는 효소 또는 RNA의 감소되거나, 증진되거나 또는 변경된 발현 및/또는 활성을 갖는 그러한 미생물이 선택될 것이다. 재조합 미생물은 또한 미생물의 게놈에서 상기 유전자 중 하나 이상을 돌연변이시키거나, 교란시키거나 또는 절제하는 것 또는 상기 유전자 중 하나 이상을 야생형 유전자에 의해 코딩되는 효소 또는 RNA에 비교하여 감소되거나, 증진되거나 또는 변경된 발현 및/또는 활성을 갖는 효소 또는 RNA를 코딩하는 상응하는 유전자로 치환하는 것을 목적으로 하는 상동 재조합 기술에 의해 수득가능하다.
본 발명에 따른 재조합 미생물의 한 실시양태에 따르면, brnQ-유전자 또는 gcvB 유전자에 의해 코딩된 효소 또는 RNA의 발현 및/또는 활성의 감소는 brnQ-유전자의 변형에 의해 달성되며, 여기서 이/이들 유전자 변형(들)은 바람직하게는 상기 유전자 또는 그의 적어도 일부 중 하나 이상의 결실, 상기 유전자 또는 그의 일부 중 하나 이상의 조절 요소, 예컨대 프로모터 서열의 결실, 또는 상기 유전자 중 하나 이상 내로의 적어도 하나의 유해 돌연변이의 도입에 의해 실현된다.
본 발명에 따른 재조합 미생물의 한 실시양태에 따르면, argP-유전자 및/또는 gcvA-유전자에 의해 코딩된 효소의 발현 및/또는 활성의 증가는 argP-유전자 및/또는 gcvA-유전자의 변형에 의해 달성될 수 있으며, 여기서 이/이들 유전자 변형(들)은 바람직하게는 미생물의 게놈 내에서 argP 유전자 및/또는 gcvA-유전자의 카피 수를 크게 증가시킴으로써, 자기-복제성 발현 벡터 상의 유전자를 미생물 내로 도입함으로써, argP-유전자 및/또는 gcvA-유전자의 프로모터를 강력한 프로모터에 대항하여 교환시킴으로써, 또는 예를 들어 점 돌연변이를 프로모터 서열 내로 도입함으로써 유전자의 내인성 프로모터를 보다 강력한 프로모터로 전환시킴으로써 실현된다.
추가로, argP-유전자 및/또는 gcvA-유전자 및/또는 lpxD 유전자의 활성은 유전자의 활성을 개선시키거나 변경하는 단백질 내에서의 아미노산 교환을 달성하기 위해 유전자를 돌연변이시킴으로써 증진되거나 변경될 수 있다. 이러한 방법은 통상의 기술자에게 공지되어 있다.
상기 유전자 내로의 돌연변이는, 예를 들어 부위-지정 또는 무작위 돌연변이유발을 수행한 다음, 변형된 유전자를 재조합에 의해 미생물의 게놈 내로 도입함으로써 도입될 수 있다. 유전자의 변이체는 PCR을 통해 유전자 서열을 돌연변이시킴으로써 생성될 수 있다. "퀵체인지(Quickchange) 부위-지정 돌연변이유발 키트" (스트라타진(Stratagene))를 사용하여, 지정 돌연변이유발을 수행할 수 있다. 전체 코딩 서열 전반에 걸쳐, 또는 단지 그의 일부에 대한 무작위 돌연변이유발은 "진모르프(GeneMorph) II 무작위 돌연변이유발 키트" (스트라타진)의 보조로 수행할 수 있다. 돌연변이유발 비율은 사용된 주형 DNA의 양을 통해 목적하는 양의 돌연변이가 되도록 설정한다. 다중 돌연변이는 개개의 돌연변이의 표적화 조합에 의해 또는 수회의 돌연변이유발 주기의 순차적 수행에 의해 생성된다.
하기에는, 재조합에 적합한 기술, 특히 돌연변이를 도입하거나 또는 서열을 결실시키는데 적합한 기술이 기재되어 있다.
이러한 기술은 또한 종종, 본원에서 "캠벨(Campbell) 재조합"으로서 지칭된다 (Leenhouts et al., Appl Env Microbiol. (1989), Vol. 55, pages 394-400). 본원에 사용되는 "캠벨 인(Campbell in)"은 전체 원형 이중 가닥 DNA 분자 (예를 들어 플라스미드)가 상기 원형 DNA 분자의 선형화 버전을 상기 원형 DNA 분자의 제1 DNA 서열에 상동인 염색체의 제1 DNA 서열 내로 효과적으로 삽입시키는 단일 상동 재조합 사건 (크로스-인 사건)에 의해 염색체 내로 통합되는, 원래 숙주 세포의 형질전환체를 지칭한다. "캠벨드 인(Campbelled in)"은 "캠벨 인" 형질전환체의 염색체 내로 통합된 선형화된 DNA 서열을 지칭한다. "캠벨 인"은 제1 상동 DNA 서열의 복제물을 함유하며, 이들 각각의 카피는 상동 재조합 교차 점의 카피를 포함하고 이에 둘러싸여 있다.
본원에 사용된 "캠벨 아웃(Campbell out)"은 제2 상동 재조합 사건 (크로스 아웃 사건)이, "캠벨드 인" DNA의 선형화되고 삽입된 DNA 상에 함유된 제2 DNA 서열과 상기 선형화 삽입물의 제2 DNA 서열과 상동인 염색체 기원의 제2 DNA 서열 사이에서 발생된, "캠벨 인" 형질전환체로부터 유래된 세포를 지칭하며, 제2 재조합 사건에 의해서, 통합된 DNA 서열의 부분이 결실 (폐기)되지만, 중요하게도 염색체에 남아있는 통합된 캠벨드 인 DNA의 부분 (이는 단일 염기 정도로 극히 적을 수 있음)이 생성되므로, 원래 숙주 세포와 비교하여, "캠벨 아웃" 세포는 염색체에 하나 이상의 의도적인 변화 (예를 들어, 단일 염기 치환, 다중 염기 치환, 이종 유전자 또는 DNA 서열의 삽입, 상동 유전자 또는 변형된 상동 유전자의 추가의 카피 또는 카피들의 삽입, 또는 상기 열거된 전술된 예 중 1개 초과를 포함하는 DNA 서열의 삽입)를 함유한다. "캠벨 아웃" 세포는 바람직하게는, "캠벨드 인" DNA 서열의 부분 (폐기시키는 것이 바람직한 부분)에 함유된 유전자, 예를 들어 약 5% 내지 10% 수크로스의 존재 하에 성장시킨 세포에서 발현되는 경우에 치명적인 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis) sacB-유전자에 대한 반대-선택에 의해 수득된다. 반대-선택을 이용하거나 이용하지 않고서도, 목적하는 "캠벨 아웃" 세포를 수득할 수 있거나, 또는 임의의 스크리닝가능한 표현형, 예컨대 비제한적으로 콜로니 형태, 콜로니 색상, 항생제 내성의 존재 또는 부재, 폴리머라제 연쇄 반응에 의한 소정의 DNA 서열의 존재 또는 부재, 영양요구성의 존재 또는 부재, 효소의 존재 또는 부재, 콜로니 핵산 혼성화, 항체 스크리닝 등을 사용하여, 목적하는 세포에 대해 스크리닝함으로써 확인할 수 있다. 용어 "캠벨 인" 및 "캠벨 아웃"은 또한, 상기 언급된 방법 또는 공정을 지칭하기 위한 각종 시제의 동사로서 사용될 수 있다.
"캠벨 인" 또는 "캠벨 아웃"을 유발하는 상동 재조합 사건은 상동성 DNA 서열 내의 일정 범위의 DNA 염기 상에서 일어날 수 있으며, 상동 서열은 이러한 범위의 적어도 일부에서 서로 동일할 것이기 때문에, 정확하게 교차 사건이 발생하는 곳이 어디인지를 명시하는 것은 통상적으로 가능하지 않다. 다시 말해서, 어떠한 서열이 삽입된 DNA로부터 기원하는지, 및 어떠한 서열이 염색체 DNA로부터 기원하는지를 정밀하게 명시하는 것은 가능하지 않다. 더욱이, 제1 상동 DNA 서열 및 제2 상동 DNA 서열은 통상적으로 부분 비-상동성 영역에 의해 분리되고, "캠벨 아웃" 세포의 염색체에 침착된 채로 있는 것이 이러한 비-상동성 영역이다.
바람직하게는, 제1 및 제2 상동 DNA 서열은 적어도 약 200개 염기 쌍 길이이고, 수천개 이하의 염기 쌍 길이일 수 있다. 그러나, 보다 짧거나 또는 보다 긴 서열을 사용하여 절차를 수행할 수 있다. 예를 들어, 제1 상동 서열 및 제2 상동 서열에 대한 길이는 약 500개 내지 2000개 염기의 범위일 수 있고, "캠벨 인"으로부터 "캠벨 아웃"을 수득하는 것은 제1 상동 서열 및 제2 상동 서열을 대략 동일한 길이가 되도록, 바람직하게는 200개 미만 염기 쌍 차이를 지니도록, 가장 바람직하게는 두 서열 중 보다 짧은 것이 보다 긴 것의 염기 쌍 길이의 적어도 70%가 되도록 배열함으로써 용이하게 된다.
한 실시양태에서, brnQ 및/또는 gcvB 유전자의 발현 및/또는 활성의 감소는 각각 분지쇄 아미노산 수송체 또는 비-단백질 코딩 RNA를 코딩하는 brnQ-유전자 및/또는 gcvB 유전자의 불활성화에 의해 달성된다.
한 실시양태에서, 유전자의 불활성화는 바람직하게는 유전자 또는 그의 적어도 일부의 결실에 의해, 유전자 또는 그의 적어도 일부의 조절 요소 결실에 의해, 또는 유전자 내로의 적어도 하나의 유해 돌연변이의 도입에 의해 달성된다.
한 실시양태에서, argP의 발현 및/또는 활성의 유도는 DNA 결합 / 전사가 활성화 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 argP-유전자의 활성화에 의해 달성된다.
한 실시양태에서, gcvA의 발현 및/또는 활성의 유도는 DNA-결합 단백질을 코딩하는 gcvA-유전자의 활성화에 의해 달성된다.
본 발명의 문맥에서 사용된 바와 같은 용어 "알라닌, 피루베이트, 숙시네이트, 아스파르테이트, 말레이트, 락테이트, 발린 및/또는 류신"은 그의 가장 넓은 의미로 이해되어야 하고, 또한 그의 염, 예를 들어 알칼리 금속 염, 예컨대 Na+ 및 K+-염, 또는 토금속 염, 예컨대 Mg2+ 및 Ca2+-염, 또는 암모늄 염, 또는 알라닌, 피루베이트, 숙시네이트, 아스파르테이트, 말레이트, 락테이트, 발린 및/또는 류신의 무수물을 포괄한다.
바람직하게는, 알라닌, 피루베이트, 숙시네이트, 아스파르테이트, 말레이트, 락테이트, 발린 및/또는 류신, 바람직하게는 숙시네이트 또는 알라닌, 보다 바람직하게는 알라닌은 미세호기성 조건 하에 생산된다. 호기성 또는 혐기성 조건을 사용할 수도 있다.
미세호기성은 산소 농도가 공기 중에 있는 것보다 적은 것을 의미하다. 한 실시양태에 따르면, 미세호기성은 5 내지 27 mm Hg, 바람직하게는 10 내지 20 mm Hg의 산소 분압을 의미한다 (Megan Falsetta et al. (2011), The composition and metabolic phenotype of Neisseria gonorrhoeae biofilms, Frontiers in Microbiology, Vol 2, page 1 to 11). 바람직하게는 미세호기성 조건은 0.1 내지 1 vvm 기류로 확립된다.
혐기성 조건은 통상적인 기술에 의해, 예를 들어 반응 매질의 구성성분을 탈기시키고, 이산화탄소 또는 질소 또는 이들의 혼합물 및 임의로 수소를, 예를 들어 0.1 내지 1 또는 0.2 내지 0.5 vvm의 유속으로 도입하여 혐기성 조건을 유지함으로써 확립될 수 있다. 호기성 조건은 통상적인 기술에 의해, 예를 들어 공기 또는 산소를, 예를 들어 0.1 내지 1 또는 0.2 내지 0.5 vvm의 유속으로 도입함으로써 확립될 수 있다. 적절한 경우에, 0.1 내지 1.5 bar의 약간 과도한 압력을 공정에 적용할 수 있다.
본 발명에 따른 공정의 한 실시양태에 따르면, 동화가능한 탄소 공급원은 글루코스, 글리세린, 글루코스, 말토스, 말토덱스트린, 프룩토스, 갈락토스, 만노스, 크실로스, 수크로스, 아라비노스, 락토스, 라피노스 및 그의 조합일 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 동화가능한 탄소 공급원은 글루코스, 수크로스, 크실로스, 아라비노스, 글리세롤 또는 그의 조합이다. 바람직한 탄소 공급원은 글루코스, 수크로스, 글루코스와 수크로스, 글루코스와 크실로스 및/또는 글루코스, 아라비노스와 크실로스이다. 본 발명에 따른 공정의 한 실시양태에 따르면, 동화가능한 탄소 공급원은 수크로스, 글리세린 및/또는 글루코스일 수 있다.
동화가능한 탄소 공급원의 초기 농도, 바람직하게는 초기 농도는, 바람직하게는 5 내지 250 g/l, 바람직하게는 50 내지 200 g/l 및 보다 바람직하게는 125 내지 150 g/l, 가장 바람직하게는 약 140 g/l의 범위 내의 값이 되도록 조정되고, 배양 동안 상기 범위에서 유지될 수 있다. 반응 매질의 pH는 적합한 염기, 예를 들어 기체상 암모니아, NH4OH, NH4HCO3, (NH4)2CO3, NaOH, Na2CO3, NaHCO3, KOH, K2CO3, KHCO3, Mg(OH)2, MgCO3, Mg(HCO3)2, Ca(OH)2, CaCO3, Ca(HCO3)2, CaO, CH6N2O2, C2H7N 및/또는 그의 혼합물을 첨가함으로써 제어될 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시양태는
I) 발효기에서 상기 정의된 바와 같은 본 발명에 따른 미생물을 성장시키는 단계, 및
II) I)에서 수득된 발효 브로쓰로부터 알라닌, 피루베이트, 숙시네이트, 아스파르테이트, 말레이트, 락테이트, 발린 및/또는 류신, 바람직하게는 숙시네이트 또는 알라닌, 보다 바람직하게는 알라닌, 가장 바람직하게는 L-알라닌을 회수하는 단계
를 포함하는, 알라닌, 피루베이트, 숙시네이트, 아스파르테이트, 말레이트, 락테이트, 발린 및/또는 류신, 바람직하게는 숙시네이트 또는 알라닌, 보다 바람직하게는 알라닌, 가장 바람직하게는 L-알라닌의 발효적 생산 방법이다.
본 발명에 따른 발효 단계 I)은, 예를 들어 교반된 발효기, 버블 칼럼 및 루프 반응기에서 수행될 수 있다. 교반기 유형 및 기하학적 설계를 포함한 가능한 방법 유형의 포괄적인 개관은 문헌 [Chmiel: "Bioprozesstechnik: Einfuehrung in die Bioverfahrenstechnik", Volume 1]에서 찾을 수 있다. 본 발명에 따른 방법에서, 이용가능한 전형적인 변형은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되거나 또는 예를 들어, 문헌 [Chmiel, Hammes and Bailey: "Biochemical Engineering"]에서 설명된 하기 변형, 예컨대 바이오매스의 재활용을 수반한 및 수반하지 않는, 회분식, 유가식, 반복 유가식 또는 연속식 발효이다. 생산 균주에 따라, 우수한 수율 (YP/S)을 달성하기 위해서는 공기, 산소, 이산화탄소, 수소, 질소 또는 적절한 기체 혼합물을 사용한 살포를 수행할 수 있다.
공정 단계 I)에서 알라닌, 피루베이트, 숙시네이트, 아스파르테이트, 말레이트, 락테이트, 발린 및/또는 류신, 바람직하게는 숙시네이트 또는 알라닌, 보다 바람직하게는 알라닌, 가장 바람직하게는 L-알라닌을 생산하는데 특히 바람직한 조건은 다음과 같다:
동화가능한 탄소 공급원: 글루코스
온도: 30 내지 45℃
pH: 6.0 내지 7.0
미세호기성 조건.
공정 단계 II)에서는, 공정 단계 I)에서 수득된 발효 브로쓰로부터 산물을 회수한다.
통상적으로, 회수 공정은 재조합 미생물을 발효 브로쓰로부터 소위 "바이오매스"로서 분리하는 단계를 포함한다. 바이오매스를 제거하는 공정은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있고, 여과, 침강, 부유 또는 그의 조합을 포함한다. 결과적으로, 바이오매스는, 예를 들어 원심분리기, 분리기, 경사분리기, 필터를 사용하거나 또는 부유 장치로 제거할 수 있다. 가치있는 산물을 최대로 회수하기 위해, 바이오매스를, 예를 들어 투석여과의 형태로 세척하는 것이 종종 바람직하다. 방법의 선택은 발효 브로쓰 내의 바이오매스 함량 및 바이오매스의 특성에 좌우되고, 또한 바이오매스와 유기 화합물 (즉, 가치있는 산물)과의 상호작용에 좌우된다. 한 실시양태에서는, 발효 브로쓰를 멸균 또는 저온살균할 수 있다. 추가의 실시양태에서는, 발효 브로쓰를 농축시킨다. 필요에 따라, 이러한 농축을 회분식 또는 연속식으로 수행할 수 있다. 1차로는 산물 손상이 일어나지 않아야 하고, 2차로는 최소한의 장치 및 에너지 사용이 필요하도록 압력 및 온도 범위를 선택해야 한다. 특히 다단계 증발을 위한 압력 및 온도 수준을 능숙하게 선택함으로써 에너지를 절감할 수 있다.
회수 공정은 발효 산물을 추가로 정제하는 추가의 정제 단계를 추가로 포함할 수 있다. 그러나, 발효 산물을 화학 반응에 의해 2차 유기 산물로 전환시키는 경우에는, 반응의 종류 및 반응 조건에 따라 발효 산물의 추가의 정제가 반드시 요구되지 않을 수도 있다. 공정 단계 II)에서 수득된 발효 산물의 정제를 위해, 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 방법, 예를 들어 결정화, 여과, 전기투석 및 크로마토그래피를 사용할 수 있다. 생성된 용액은 바람직하지 않은 잔류 이온을 제거하기 위해 이온 교환 크로마토그래피에 의해 추가로 정제될 수 있다.
한 실시양태에서, brnQ 유전자의 감소, 억제 또는 결실된 발현 및/또는 활성은 야생형 유전자 내로 결실을 도입함으로써 달성된다. 바람직하게는, 서열 1을 갖는 야생형 유전자 또는 그의 기능적 변이체의 위치 667 내지 764에 특정 돌연변이를 도입함으로써 달성된다.
따라서, 본 발명의 추가 실시양태는
(6) 서열 3의 서열을 포함하는 핵산 분자, 또는
(7) 서열 3의 핵산 분자에 대해 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 85%, 예를 들어 적어도 90%, 보다 바람직하게는 적어도 95%, 예를 들어 적어도 96%, 보다 더 바람직하게는 적어도 97%, 예를 들어 적어도 98%, 가장 바람직하게는 적어도 99% 동일성을 갖는 핵산 분자, 또는
(8) 중간 정도의 엄격한 조건 하에, 보다 바람직하게는 고도의 엄격한 조건 하에, 가장 바람직하게는 매우 고도의 엄격한 조건 하에, 서열 3을 갖는 핵산 분자에 혼성화되는 핵산 분자, 또는
(9) 서열 4의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자, 또는
(10) 서열 4의 폴리펩티드에 대해 적어도 60%, 바람직하게는 적어도 70%, 예를 들어 적어도 75%, 보다 바람직하게는 적어도 80%, 예를 들어 적어도 85%, 보다 더 바람직하게는 적어도 90%, 예를 들어 적어도 95%, 가장 바람직하게는 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 상동성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자
의 군으로부터 선택된 서열을 갖는 재조합 핵산 분자이며,
여기서 상기 정의된 바와 같이 돌연변이된 유전자 및/또는 단백질을 포함지만 야생형 유전자 및/또는 단백질은 포함하지 않는 미생물은 발효시 개선된 알라닌 수율을 갖는다.
한 실시양태에서, argP 유전자의 증진 또는 증가된 발현 및/또는 활성은 돌연변이를 야생형 유전자 내로 도입함으로써 달성된다. 바람직하게는, 서열 45를 갖는 야생형 유전자 또는 그의 기능적 변이체의 위치 286 내지 288에 특정 돌연변이를 도입함으로써 달성된다.
따라서, 본 발명의 추가 실시양태는
(1) 서열 45의 서열을 포함하는 핵산 분자, 또는
(2) 서열 45의 핵산 분자에 대해 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 85%, 예를 들어 적어도 90%, 보다 바람직하게는 적어도 95%, 예를 들어 적어도 96%, 보다 더 바람직하게는 적어도 97%, 예를 들어 적어도 98%, 가장 바람직하게는 적어도 99% 동일성을 갖는 핵산 분자, 또는
(3) 중간 정도의 엄격한 조건 하에, 보다 바람직하게는 고도의 엄격한 조건 하에, 가장 바람직하게는 매우 고도의 엄격한 조건 하에, 서열 45를 갖는 핵산 분자에 혼성화되는 핵산 분자, 또는
(4) 서열 46의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자, 또는
(5) 서열 46의 폴리펩티드에 대해 적어도 60%, 바람직하게는 적어도 70%, 예를 들어 적어도 75%, 보다 바람직하게는 적어도 80%, 예를 들어 적어도 85%, 보다 더 바람직하게는 적어도 90%, 예를 들어 적어도 95%, 가장 바람직하게는 적어도 96%,적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 상동성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자
의 군으로부터 선택된 서열을 갖는 재조합 핵산 분자이며,
여기서 서열 45의 위치 286 내지 288에 상응하는 (1) 내지 (5) 하의 유전자의 코돈은 아미노산 알라닌을 코딩하지 않고 정지 코돈이 아니거나, 또는 서열 46의 위치 96에 상응하는 (1) 내지 (5) 하의 유전자에 의해 코딩된 단백질의 아미노산은 알라닌이 아니고,
여기서 상기 (1) 내지 (5)에 정의된 바와 같은 유전자에 의해 코딩된 단백질은 서열 46을 갖는 단백질과 비교하여 증진 또는 증가된 활성을 갖고,
여기서 상기 정의된 바와 같이 돌연변이된 유전자 및/또는 단백질을 포함하는 미생물은 발효시 개선된 알라닌 수율을 갖는다.
바람직하게는, 재조합 핵산 분자는
(6) 서열 47의 서열을 포함하는 핵산 분자, 또는
(7) 서열 47의 핵산 분자에 대해 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 85%, 예를 들어 적어도 90%, 보다 바람직하게는 적어도 95%, 예를 들어 적어도 96%, 보다 더 바람직하게는 적어도 97%, 예를 들어 적어도 98%, 가장 바람직하게는 적어도 99% 동일성을 갖는 핵산 분자, 또는
(8) 중간 정도의 엄격한 조건 하에, 보다 바람직하게는 고도의 엄격한 조건 하에, 가장 바람직하게는 매우 고도의 엄격한 조건 하에, 서열 47을 갖는 핵산 분자에 혼성화되는 핵산 분자, 또는
(9) 서열 48의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자, 또는
(10) 서열 48의 폴리펩티드에 대해 적어도 60%, 바람직하게는 적어도 70%, 예를 들어 적어도 75%, 보다 바람직하게는 적어도 80%, 예를 들어 적어도 85%, 보다 더 바람직하게는 적어도 90%, 예를 들어 적어도 95%, 가장 바람직하게는 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 상동성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자
의 군으로부터 선택된 서열을 가지며,
여기서 서열 47의 위치 286 내지 288에 상응하는 (7) 내지 (10) 하의 유전자의 코돈은 아미노산 글루탐산 또는 관련 아미노산을 코딩하거나, 또는 서열 48의 위치 96에 상응하는 (7) 내지 (10) 하의 유전자에 의해 코딩된 단백질의 아미노산은 글루탐산 또는 관련 아미노산이고,
여기서 상기 (7) 내지 (10)에 정의된 바와 같은 유전자에 의해 코딩된 단백질은 서열 48을 갖는 단백질과 비교하여 증진 또는 증가된 활성을 갖고,
여기서 상기 정의된 바와 같이 돌연변이된 유전자 및/또는 단백질을 포함하는 미생물은 발효시 개선된 알라닌 수율을 갖는다.
한 실시양태에서, gcvA 유전자의 증진 또는 증가된 발현 및/또는 활성은 돌연변이를 야생형 유전자의 프로모터 내로 도입함으로써 달성된다. 바람직하게는 서열 53을 갖는 야생형 유전자 또는 그의 기능적 변이체의 프로모터에 특정 돌연변이를 도입함으로써 달성되며, 여기서 돌연변이는 서열 55에 도입되어 서열 56 또는 서열 57을 유발하는 돌연변이에 상응한다.
따라서, 본 발명의 추가 실시양태는
(11) 서열 53의 서열을 포함하는 핵산 분자, 또는
(12) 서열 53의 핵산 분자에 대해 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 85%, 예를 들어 적어도 90%, 보다 바람직하게는 적어도 95%, 예를 들어 적어도 96%, 보다 더 바람직하게는 적어도 97%, 예를 들어 적어도 98%, 가장 바람직하게는 적어도 99% 동일성을 갖는 핵산 분자, 또는
(13) 중간 정도의 엄격한 조건 하에, 보다 바람직하게는 고도의 엄격한 조건 하에, 가장 바람직하게는 매우 고도의 엄격한 조건 하에, 서열 53을 갖는 핵산 분자에 혼성화되는 핵산 분자, 또는
(14) 서열 54의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자, 또는
(15) 서열 54의 폴리펩티드에 대해 적어도 60%, 바람직하게는 적어도 70%, 예를 들어 적어도 75%, 보다 바람직하게는 적어도 80%, 예를 들어 적어도 85%, 보다 더 바람직하게는 적어도 90%, 예를 들어 적어도 95%, 가장 바람직하게는 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 상동성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자
의 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 재조합 핵산 분자이며,
이는 상기 핵산 분자에 이종인, 미생물에서 돌연변이된 프로모터 또는 활성인 프로모터에 기능적으로 연결되고,
여기서 상기 정의된 바와 같이 과다발현된 유전자 및/또는 단백질을 포함하는 미생물은 발효시 개선된 알라닌 수율을 갖는다.
한 실시양태에서, 알라닌 또는 관련 화합물의 증진 또는 증가된 수율 및/또는 생산성은 돌연변이를 lpxD 야생형 유전자 내로 도입함으로써 달성된다.
따라서, 본 발명의 한 실시양태는
(16) 서열 49의 서열을 포함하는 핵산 분자, 또는
(17) 서열 49의 핵산 분자에 대해 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 85%, 예를 들어 적어도 90%, 보다 바람직하게는 적어도 95%, 예를 들어 적어도 96%, 보다 더 바람직하게는 적어도 97%, 예를 들어 적어도 98%, 가장 바람직하게는 적어도 99% 동일성을 갖는 핵산 분자, 또는
(18) 중간 정도의 엄격한 조건 하에, 보다 바람직하게는 고도의 엄격한 조건 하에, 가장 바람직하게는 매우 고도의 엄격한 조건 하에, 서열 49를 갖는 핵산 분자에 혼성화되는 핵산 분자, 또는
(19) 서열 50의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자, 또는
(20) 서열 50의 폴리펩티드에 대해 적어도 60%, 바람직하게는 적어도 70%, 예를 들어 적어도 75%, 보다 바람직하게는 적어도 80%, 예를 들어 적어도 85%, 보다 더 바람직하게는 적어도 90%, 예를 들어 적어도 95%, 가장 바람직하게는 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 상동성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자
의 군으로부터 선택된 서열을 갖는 재조합 핵산 분자이며,
여기서 서열 49의 위치 43 내지 45에 상응하는 (16) 내지 (20) 하의 유전자의 코돈은 아미노산 알라닌을 코딩하지 않고 정지 코돈이 아니거나, 또는 서열 50의 위치 15에 상응하는 (6) 내지 (10) 하의 유전자에 의해 코딩된 단백질의 아미노산은 알라닌이 아니고,
여기서 상기 (16) 내지 (20)에 정의된 바와 같은 유전자에 의해 코딩된 단백질은 서열 50을 갖는 단백질과 비교하여 변경된 활성 및/또는 발현을 갖고,
여기서 상기 정의된 바와 같이 돌연변이된 유전자 및/또는 단백질을 포함하는 미생물은 발효시 개선된 알라닌 수율을 갖는다.
바람직하게는, 재조합 핵산 분자는
(21) 서열 51의 서열을 포함하는 핵산 분자, 또는
(22) 서열 51의 핵산 분자에 대해 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 85%, 예를 들어 적어도 90%, 보다 바람직하게는 적어도 95%, 예를 들어 적어도 96%, 보다 더 바람직하게는 적어도 97%, 예를 들어 적어도 98%, 가장 바람직하게는 적어도 99% 동일성을 갖는 핵산 분자, 또는
(23) 중간 정도의 엄격한 조건 하에, 보다 바람직하게는 고도의 엄격한 조건 하에, 가장 바람직하게는 매우 고도의 엄격한 조건 하에, 서열 51을 갖는 핵산 분자에 혼성화되는 핵산 분자, 또는
(24) 서열 52의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자, 또는
(25) 서열 52의 폴리펩티드에 대해 적어도 60%, 바람직하게는 적어도 70%, 예를 들어 적어도 75%, 보다 바람직하게는 적어도 80%, 예를 들어 적어도 85%, 보다 더 바람직하게는 적어도 90%, 예를 들어 적어도 95%, 가장 바람직하게는 적어도 96%,적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 상동성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자
의 군으로부터 선택된 서열을 가지며,
여기서 서열 51의 위치 43 내지 45에 상응하는 (21) 내지 (25) 하의 유전자의 코돈은 아미노산 트레오닌 또는 관련 아미노산을 코딩하거나, 또는 서열 52의 위치 15에 상응하는 (21) 내지 (25) 하의 유전자에 의해 코딩된 단백질의 아미노산은 트레오닌 또는 관련 아미노산이고,
여기서 상기 (21) 내지 (25)에 정의된 바와 같은 유전자에 의해 코딩된 단백질은 서열 50을 갖는 단백질과 비교하여 변경된 활성 및/또는 발현을 갖고,
여기서 상기 정의된 바와 같이 돌연변이된 유전자 및/또는 단백질을 포함하는 미생물은 발효시 개선된 알라닌 수율을 갖는다.
용어 "관련 아미노산" 또는 "보존적 아미노산 치환"은 아미노산이 유사한 측쇄를 갖는 아미노산에 의해 대체되는 것을 의미한다. 관련 아미노산의 목록은 하기 표 2에 제공된다. 보존적 치환 표는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Creighton (1984) Proteins. W.H. Freeman and Company (Eds)] 및 하기 표 2 참조).
<표 2> 보존적 아미노산 치환의 예
Figure pct00001
바람직한 실시양태에서, 재조합 핵산 분자는 서열 3, 47, 51을 갖고, 각각 서열 4, 48, 52를 갖는 단백질을 코딩한다.
본 발명의 추가 실시양태는
(26) 서열 4의 서열을 포함하는 아미노산 분자, 또는
(27) 서열 4의 폴리펩티드에 대해 60%, 바람직하게는 적어도 70%, 예를 들어 적어도 75%, 보다 바람직하게는 적어도 80%, 예를 들어 적어도 85%, 보다 더 바람직하게는 적어도 90%, 예를 들어 적어도 95%, 가장 바람직하게는 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 상동성을 갖는 아미노산 분자
의 군으로부터 선택된 서열을 갖는 재조합 아미노산 분자이며,
여기서 상기 정의된 바와 같이 돌연변이된 단백질을 포함하지만 야생형 단백질은 포함하지 않는 미생물은 발효시 개선된 알라닌 수율을 갖는다.
바람직하게는 본 발명의 재조합 아미노산 분자는 서열 4를 갖는다.
본 발명의 추가 실시양태는
(28) 서열 48의 서열을 갖는 아미노산 분자, 또는
(29) 서열 48의 폴리펩티드에 대해 60%, 바람직하게는 적어도 70%, 예를 들어 적어도 75%, 보다 바람직하게는 적어도 80%, 예를 들어 적어도 85%, 보다 더 바람직하게는 적어도 90%, 예를 들어 적어도 95%, 가장 바람직하게는 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 상동성을 갖는 아미노산 분자
의 군으로부터 선택된 서열을 갖는 재조합 아미노산 분자이며,
여기서 서열 48의 위치 96에 상응하는 (29) 하의 단백질의 아미노산은 글루탐산 또는 관련 아미노산이고,
여기서 상기 (29)에 정의된 바와 같은 단백질은 서열 46을 갖는 단백질과 비교하여 증진 또는 증가된 활성을 갖고,
여기서 상기 정의된 바와 같이 돌연변이된 단백질을 포함하지만 야생형 단백질은 포함하지 않는 미생물은 발효시 개선된 알라닌 수율을 갖는다.
바람직하게는 본 발명의 재조합 아미노산 분자는 서열 48을 갖는다.
본 발명의 추가 실시양태는
(30) 서열 52의 서열을 포함하는 아미노산 분자, 또는
(31) 서열 52의 폴리펩티드에 대해 60%, 바람직하게는 적어도 70%, 예를 들어 적어도 75%, 보다 바람직하게는 적어도 80%, 예를 들어 적어도 85%, 보다 더 바람직하게는 적어도 90%, 예를 들어 적어도 95%, 가장 바람직하게는 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 상동성을 갖는 아미노산 분자
의 군으로부터 선택된 서열을 갖는 재조합 아미노산 분자이며,
여기서 서열 52의 위치 15에 상응하는 (31) 하의 단백질의 아미노산은 트레오닌 또는 관련 아미노산이고,
여기서 상기 (31)에 정의된 바와 같은 단백질은 서열 50을 갖는 단백질과 비교하여 변경된 활성 및/또는 발현을 갖고,
여기서 상기 정의된 바와 같이 돌연변이된 유전자 및/또는 단백질을 포함하는 미생물은 발효시 개선된 알라닌 수율을 갖는다.
바람직하게는 본 발명의 재조합 아미노산 분자는 서열 52를 갖는다.
정의
본 발명은 특별한 방법론 또는 프로토콜로 제한되지 않는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 본원에 사용된 용어는 특정한 실시양태만을 기재하기 위한 목적을 위한 것으로, 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 것이 아니며, 본 발명의 범주는 첨부된 청구범위에 의해서만 제한될 것으로 이해되어야 한다. 본원 및 첨부된 청구범위에서 사용되는 바와 같이, 단수 형태는 문맥에서 달리 명백하게 나타내지 않는 한 복수 지시대상을 포함함을 주목하여야 한다. 따라서, 예를 들어, "벡터"에 대한 언급은 하나 이상의 벡터에 대한 언급이고, 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 그의 등가물 등을 포함한다. 용어 "약"은 대략적으로, 대략, 부근 또는 영역 내의 것을 의미하는 것으로 본원에 사용된다. 용어 "약"이 수치 범위와 함께 사용되는 경우에, 이는 경계를 기재된 수치 값 초과 및 미만까지 확장함으로써 범위를 변경한다. 일반적으로, 용어 "약"은 수치값을 언급된 값의 위 및 아래로 20%, 바람직하게는 10% 증가 또는 감소한 (더 높거나 또는 더 낮은) 변동치만큼 변경하기 위해 본원에서 사용된다. 본원에 사용된 용어 "또는"은 특정한 목록의 임의의 하나의 구성원을 의미하고, 상기 목록의 구성원의 임의의 조합도 또한 포함한다. 용어 "포함하다" 및 "포함하는"은 본 명세서 및 하기 청구범위에서 사용될 때 하나 이상의 언급된 특징부, 정수, 성분 또는 단계의 존재를 구체화하는 것이 의도되지만, 하나 이상의 다른 특징부, 정수, 성분, 단계 또는 이들의 군의 존재 또는 추가를 배제하지 않는다. 명확성을 위해, 본 명세서에 사용된 특정 용어는 다음과 같이 정의되고 사용된다:
코딩 영역: 본원에 사용된 용어 "코딩 영역"은 구조 유전자에 관련하여 사용될 때, mRNA 분자의 번역의 결과로서 신생 폴리펩티드 내에서 발견되는 아미노산을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 나타낸다. 코딩 영역은 진핵생물에서, 개시인자 메티오닌을 코딩하는 뉴클레오티드 삼중자 "ATG"에 의해 5'-측 상에 결합되고, 원핵생물은 또한 출발 코돈으로서 삼중자 "GTG" 및 "TTG"를 사용한다. 3'-측 상에는 정지 코돈을 지정하는 3개의 삼중자 (즉, TAA, TAG, TGA) 중 하나에 의해 결합된다. 또한, 유전자는 RNA 전사체 상에 존재하는 서열의 5'-말단과 3'-말단 둘 다 상에 위치한 서열을 포함할 수 있다. 이들 서열은 "플랭킹" 서열 또는 영역으로서 언급된다 (이들 플랭킹 서열은 mRNA 전사체 상에 존재하는 비-번역 서열의 5' 또는 3'에 위치한다). 5'-플랭킹 영역은 유전자의 전사를 제어하거나 또는 이에 영향을 미치는 조절 서열, 예컨대 프로모터 및 인핸서를 함유할 수 있다. 3'-플랭킹 영역은 전사의 종결, 전사후 절단 및 폴리아데닐화를 지시하는 서열을 함유할 수 있다.
상보적: "상보적" 또는 "상보성"은 역병렬 뉴클레오티드 서열 내의 상보적 염기 잔기들 간의 수소 결합 형성시 서로 쌍을 형성할 수 있는 (염기 쌍 형성 규칙에 의함) 역병렬 뉴클레오티드 서열을 포함하는 2개의 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 예를 들어, 서열 5'-AGT-3'는 서열 5'-ACT-3'에 대해 상보적이다. 상보성은 "부분적" 또는 "전체"일 수 있다. "부분적" 상보성은 1개 이상의 핵산 염기가 염기 쌍 형성 규칙에 따라서 매칭되지 않는 경우이다. 핵산 분자 간의 "전체" 또는 "완전한" 상보성은 각각의 및 모든 핵산 염기가 염기 쌍 형성 규칙 하에 또 다른 염기와 매칭되는 경우이다. 핵산 분자 가닥 간의 상보성 정도는 핵산 분자 가닥 간의 혼성화의 효율 및 강도에 대해 상당한 효과를 지니고 있다. 본원에 사용된 바와 같은 핵산 서열의 "보체"는 그의 핵산 분자가 핵산 서열의 핵산 분자에 대해 전체 상보성을 나타내는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다.
내인성: "내인성" 뉴클레오티드 서열은 야생형 미생물의 게놈에 존재하는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다.
증진된 발현: 미생물에서의 핵산 분자의 발현을 "증진" 또는 "증가"시키는 것은 본원에서 동등하게 사용되고, 이는 미생물에서의 핵산 분자의 발현 수준이 참조 미생물, 예를 들어 야생형과 비교하여 더 높다는 것을 의미한다. 본원에 사용된 용어 "증진된" 또는 "증가된"은 발현될 핵산 분자의 발현이 본원에서 더 높다는 것을, 바람직하게는 유의하게 더 높다는 것을 의미한다. 본원에 사용된 바와 같은, 단백질, mRNA 또는 RNA와 같은 작용제의 수준의 "증진" 또는 "증가"는 그 수준이 실질적으로 동일한 조건 하에 성장한 실질적으로 동일한 미생물과 비교하여 증가되는 것을 의미한다. 본원에 사용된 바와 같은, 표적 유전자에 의해 발현된 작용제, 예컨대 예를 들어 preRNA, mRNA, rRNA, tRNA, 및/또는 그에 의해 코딩된 단백질 산물의 수준의 "증진" 또는 "증가"는 그 수준이 적합한 참조 미생물과 비교하여 50% 이상, 예를 들어 100% 이상, 바람직하게는 200% 이상, 보다 바람직하게는 5배 이상, 보다 더 바람직하게는 10배 이상, 가장 바람직하게는 20배 이상, 예를 들어 50배 증가되는 것을 의미한다. 이러한 증진 또는 증가는 통상의 기술자에게 능숙한 방법에 의해 결정될 수 있다. 따라서, 핵산 또는 단백질 양의 증진 또는 증가는, 예를 들어 단백질의 면역학적 검출에 의해 결정될 수 있다. 더욱이, 단백질 검정, 형광, 노던(Northern) 혼성화, 뉴클레아제 보호 검정, 역전사 (정량적 RT-PCR), ELISA (효소 결합 면역흡착 검정), 웨스턴 블롯팅(Western blotting), 방사성면역검정 (RIA) 또는 기타 면역검정 및 형광-활성화 세포 분류 (FACS)와 같은 기술을 사용하여, 미생물에서의 특정 단백질 또는 RNA를 측정할 수 있다. 유도된 단백질 산물의 유형에 따라서, 상기 미생물의 표현형에 대한 효과 또는 그의 활성을 또한 결정할 수 있다. 단백질 양을 결정하는 방법은 통상의 기술자에게 공지되어 있다. 언급될 수 있는 예는 다음과 같다: 마이크로-뷰렛(micro-Biuret) 방법 (Goa J (1953) Scand J Clin Lab Invest 5:218-222), 폴린-시오칼토(Folin-Ciocalteau) 방법 (Lowry OH et al. (1951) J Biol Chem 193:265-275) 또는 CBB G-250의 흡광도를 측정하는 방법 (Bradford MM (1976) Analyt Biochem 72:248-254).
발현: "발현"은 세포에서 유전자 산물의 생합성, 바람직하게는 뉴클레오티드 서열, 예를 들어 내인성 유전자 또는 이종 유전자의 전사 및/또는 번역을 지칭한다. 예를 들어, 구조 유전자의 경우에, 발현은 이러한 구조 유전자를 mRNA로 전사하고, 임의로 mRNA를 하나 이상의 폴리펩티드로 후속 번역하는 것을 포함한다. 다른 경우에, 발현은 RNA 분자를 정착시킨 DNA의 전사만을 지칭할 수 있다.
외래: 용어 "외래"는 실험적 조작에 의해 세포 내로 도입되는 모든 핵산 분자 (예를 들어, 유전자 서열)를 지칭하고, 이와 같이 도입된 서열이 일부 변형 (예를 들어, 점 돌연변이, 선택 마커 유전자의 존재 등)을 함유하는 한은 그 세포에서 발견되는 서열을 포함할 수 있고, 따라서 자연 발생 서열과 대비하여 상이하다.
기능적 연결: 용어 "기능적 연결" 또는 "기능적으로 연결된"은 용어 "작동가능한 연결" 또는 "작동가능하게 연결"과 등가이고, 예를 들어 각각의 조절 요소가 그의 의도된 기능을 충족시켜, 발현될 핵산 서열의 발현을 허용하거나, 변형시키거나, 촉진시키거나 또는 달리 영향을 미칠 수 있도록 하는 방식으로, 조절 요소 (예를 들어, 프로모터)가 상기 발현될 핵산 서열, 및 경우에 따라 추가의 조절 요소 (예컨대 예를 들어, 종결인자)와 순차적으로 배열되는 것을 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 동의어로서, "작동가능한 연결" 또는 "작동가능하게 연결"이란 표현을 사용할 수 있다. 발현은 센스 또는 안티센스 RNA와 관련한 핵산 서열의 배열에 따라서 유발될 수 있다. 이러한 목적을 달성하기 위해, 화학적 의미에서의 직접적인 연결이 반드시 요구되지는 않는다. 유전적 제어 서열, 예컨대 예를 들어 인핸서 서열은 또한, 추가로 떨어져 있거나 또는 실제로 다른 DNA 분자로부터 떨어져 있는 위치로부터 표적 서열에 대해 그의 기능을 발휘할 수 있다. 바람직한 배열은 재조합적으로 발현될 핵산 서열이 프로모터로서 작용하는 서열 뒤에 위치하고 있으므로, 두 서열이 서로 공유적으로 연결되는 배열이다. 바람직한 실시양태에서, 전사될 핵산 서열은 전사 출발점이 본 발명의 키메라 RNA의 목적하는 시작점과 동일한 방식으로 프로모터 뒤에 위치한다. 기능적 연결, 및 발현 구축물은 문헌 (예를 들어, [Maniatis T, Fritsch EF and Sambrook J (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor (NY); Silhavy et al. (1984) Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor (NY); Ausubel et al. (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience; Gelvin et al. (Eds) (1990) Plant Molecular Biology Manual; Kluwer Academic Publisher, Dordrecht, The Netherlands])에 기재된 바와 같은 통상적인 재조합 및 클로닝 기술을 통해 생성될 수 있다. 그러나, 예를 들어 제한 효소에 대한 특이적 절단 부위를 수반한 링커로서 작용하거나 또는 신호 펩티드로서 작용하는 추가 서열이 또한, 상기 두 서열 사이에 위치할 수 있다. 서열의 삽입으로 인해, 융합 단백질의 발현이 유발될 수도 있다. 바람직하게는, 조절 영역, 예를 들어 프로모터와 발현될 핵산 서열의 연결로 이루어진 발현 구축물이 벡터-통합된 형태로 존재할 수 있거나 또는 예를 들어 형질전환에 의해 게놈 내로 삽입될 수 있다.
유전자: 용어 "유전자"는 일부 방식으로 유전자 산물 (예를 들어, 폴리펩티드 또는 기능적 RNA)의 발현을 조절할 수 있는 적당한 조절 서열과 작동적으로 연결된 영역을 지칭한다. 유전자는 코딩 영역 (오픈 리딩 프레임, ORF) 선행 (상류) 및 하행 (하류) DNA의 비번역 조절 영역 (예를 들어, 프로모터, 인핸서, 리프레서 등)을 포함한다. 본원에 사용된 용어 "구조 유전자"는 mRNA로 전사된 다음, 특이적 폴리펩티드 특유의 아미노산 서열로 번역되는 DNA 서열을 의미한다.
게놈 또는 게놈 DNA: 용어 "게놈" 또는 "게놈 DNA"는 숙주 유기체의 유전적 유전자 정보를 지칭한다. 상기 게놈 DNA는 핵양체의 DNA 뿐만 아니라 자기-복제 플라스미드의 DNA를 포함한다.
이종: 핵산 분자 또는 DNA와 관련된 용어 "이종"은 자연에서는 작동적으로 연결되지 않거나 또는 자연에서는 상이한 위치에서 작동적으로 연결되는 제2의 핵산 분자와 작동적으로 연결되거나 또는 이러한 분자와 작동적으로 연결되도록 조작되는 핵산 분자를 지칭한다. 핵산 분자, 및 이와 연결된 하나 이상의 조절 핵산 분자 (예컨대, 프로모터 또는 전사 종결 서열)를 포함하는 이종 발현 구축물은 예를 들어, a) 상기 핵산 분자, 또는 b) 상기 조절 핵산 분자, 또는 c) 둘 다 (즉 (a) 및 (b))가 그의 자연 (천연) 유전적 환경에 위치되지 않거나 또는 실험적 조작에 의해 변형된 (변형의 예는 하나 이상의 뉴클레오티드 잔기의 치환, 부가, 결실, 역위 또는 삽입임), 실험적 조작에 의해 유래되는 구축물이다. 자연 유전적 환경은 기원 유기체 내의 자연 게놈 유전자좌, 또는 게놈 라이브러리 내에서의 존재를 지칭한다. 게놈 라이브러리의 경우에는, 핵산 분자의 서열의 자연 유전적 환경이 적어도 부분적으로 보유되는 것이 바람직하다. 이러한 환경은 적어도 한쪽에 있는 핵산 서열에 플랭킹되고, 적어도 50 bp, 바람직하게는 적어도 500 bp, 특히 바람직하게는 적어도 1,000 bp, 매우 특히 바람직하게는 적어도 5,000 bp 길이의 서열을 갖는다. 자연 발생 발현 구축물 - 예를 들어 프로모터와 상응하는 유전자의 자연 발생 조합물 - 은 비-자연, 합성 "인공" 방법, 예컨대 예를 들어, 돌연변이유발에 의해 변형되는 경우에 트랜스제닉 발현 구축물로 된다. 상기 방법은 문헌에 기재되어 있다 (US 5,565,350; WO 00/15815). 예를 들어, 핵산 분자의 천연 프로모터가 아닌 프로모터와 작동가능하게 연결 핵산 분자를 코딩하는 단백질이, 이러한 프로모터와 관련하여 이종인 것으로 간주된다. 바람직하게는, 이종 DNA는 이것이 도입되는 세포와 대해 내인성이 아니거나 또는 이러한 세포와 자연적으로 회합되지 않지만, 또 다른 세포로부터 수득되었거나 또는 합성되었다. 이종 DNA는 또한, 내인성 DNA 서열의 일부 변형, 비-자연 발생, 다중 카피를 함유하는 내인성 DNA 서열, 또는 그와 물리적으로 연결된 또 다른 DNA 서열과 자연적으로 회합되지 않는 DNA 서열을 포함한다. 반드시는 아니지만 일반적으로, 이종 DNA는 이것이 발현되는 세포에 의해서는 정상적으로 생산되지 않는 RNA 또는 단백질을 코딩한다.
혼성화: 본원에 사용된 용어 "혼성화"는 "핵산 분자의 가닥이 염기 쌍 형성을 통해 상보적 가닥과 결합되는 임의의 공정"을 포함한다 (J. Coombs (1994) Dictionary of Biotechnology, Stockton Press, New York). 혼성화 및 혼성화의 강도 (즉, 핵산 분자들 간의 회합 강도)는 핵산 분자들 간의 상보성 정도, 관련된 조건의 엄격도, 형성된 혼성체의 Tm, 및 핵산 분자 내의 G:C 비와 같은 요인들에 의해 영향을 받는다. 본원에 사용된 용어 "Tm"은 "융점"과 관련하여 사용된다. 융점은 이중 가닥 핵산 분자의 집단이 절반 분리되어 단일 가닥으로 되는 온도이다. 핵산 분자의 Tm을 계산하는 방정식은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 표준 참조에 의해 표시된 바와 같이, Tm 값의 간단한 평가치는, 핵산 분자가 1 M NaCl 하의 수용액 중에 있는 경우에 다음 방정식으로써 계산될 수 있다: Tm=81.5+0.41(% G+C) (예를 들어, 문헌 [Anderson and Young, Quantitative Filter Hybridization, in Nucleic Acid Hybridization (1985)] 참조). 다른 참조는 보다 복잡한 계산을 포함하는데, 이는 Tm을 계산하기 위해 구조적 특징뿐만 아니라 서열 특징을 고려한다. 엄격한 조건은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있고 문헌 [Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6]에서 찾을 수 있다.
적합한 혼성화 조건은, 예를 들어 서열의 보체의 적어도 50개, 바람직하게는 적어도 100개, 보다 바람직하게는 적어도 150개, 보다 더 바람직하게는 적어도 200개, 가장 바람직하게는 적어도 250개의 연속되는 뉴클레오티드를 포함하는 핵산 분자와, 50℃ 하에 2 X SSC, 0.1% 소듐 도데실 술페이트 (SDS)에서 세척하면서 (저 엄격도) 50℃ 하에 7% SDS, 0.5 M NaPO4, 1 mM EDTA에서 혼성화되는 것과 등가의 조건 하에 혼성화되는 것이다. 다른 적합한 혼성화 조건은 서열의 보체의 적어도 50개, 바람직하게는 적어도 100개, 보다 바람직하게는 적어도 150개, 보다 더 바람직하게는 적어도 200개, 가장 바람직하게는 적어도 250개의 연속되는 뉴클레오티드를 포함하는 핵산 분자와, 50℃ (중간 수준의 엄격도) 또는 65℃ (고도의 엄격도) 하에 1 X SSC, 0.1% 소듐 도데실 술페이트 (SDS)에서 세척하면서 50℃ 하에 7% SDS, 0.5 M NaPO4, 1 mM EDTA에서 혼성화되는 것이다. 다른 적합한 혼성화 조건은 서열의 보체의 적어도 50개, 바람직하게는 적어도 100개, 보다 바람직하게는 적어도 150개, 보다 더 바람직하게는 적어도 200개, 가장 바람직하게는 적어도 250개의 연속되는 뉴클레오티드를 포함하는 핵산 분자와, 65℃ (매우 고도의 엄격도) 하에 0.1 X SSC, 0.1% 소듐 도데실 술페이트 (SDS)에서 세척하면서 50℃ 하에 7% SDS, 0.5 M NaPO4, 1 mM EDTA에서 혼성화되는 것이다.
"동일성": 2개 이상의 핵산 또는 아미노산 분자의 비교와 관련하여 사용되는 경우의 "동일성"은 상기 분자의 서열이 특정 정도의 서열 유사성을 공유하는 것을 의미하며, 서열은 부분적으로 동일하다.
2개의 아미노산 서열 또는 2개의 핵산 분자의 백분율 동일성 (상동성은 이것이 핵산 서열을 지칭하는 경우에 본원에서 상호교환가능하게 사용됨)을 결정하기 위해, 이들 서열은 최적의 비교를 위해 하나를 다른 것 아래에 표기한다 (예를 들어, 갭을 단백질 서열 또는 핵산 서열 내로 삽입하여, 다른 단백질 또는 다른 핵산과의 최적의 정렬을 생성시킬 수 있다).
이어서, 상응하는 아미노산 위치 또는 뉴클레오티드 위치에서 아미노산 잔기 또는 핵산 분자를 비교한다. 한 서열 내의 위치가 다른 서열 내의 상응하는 위치와 동일한 아미노산 잔기 또는 동일한 핵산 분자에 의해 점유되는 경우, 상기 분자들은 이 위치에서 동일하다. 두 서열 간의 백분율 동일성은 서열들에 의해 공유된 동일한 위치의 수의 함수이다 (즉, % 동일성 = 동일한 위치의 수/위치의 총 수 x 100). 따라서, 용어 "상동성" 및 "동일성"은 핵산 서열을 지칭하는 경우에 동의어로서 간주되어야 한다. 아미노산 서열을 지칭하는 경우에, 용어 동일성은 서열 내의 특정 위치에서 동일한 아미노산을 지칭하고, 용어 상동성은 서열 내의 특정 위치에서 상동인 아미노산을 지칭한다. 상동 아미노산은 유사한 측쇄를 갖는 아미노산이다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 패밀리는 관련 기술분야에 정의되어 있다.
본 발명의 단백질과 상동인 단백질을 코딩하는 핵산 분자는 하나 이상의 뉴클레오티드 치환, 부가 또는 결실을 뉴클레오티드 서열 내로 도입하여, 하나 이상의 아미노산 치환, 부가 또는 결실이 상기 코딩된 단백질 내로 도입되도록 함으로써 생성될 수 있다. 돌연변이는 표준 기술, 예컨대 부위-지정 돌연변이유발 및 PCR-매개된 돌연변이유발에 의해 본 발명의 서열 중 하나 내로 도입할 수 있다. 바람직하게는, 보존적 아미노산 치환이 하나 이상의 예측된 비필수 아미노산 잔기에서 만들어진다. "보존적 아미노산 치환"은 아미노산 잔기를 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체시키는 것이다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 패밀리는 관련 기술분야에 정의되어 있다. 이들 패밀리는 염기성 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들어, 리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 비하전된 극성 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들어, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인), 비극성 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 베타-분지형 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들어, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)을 포함한다. 따라서, 본 발명의 단백질 내의 예측되는 비필수 아미노산 잔기를 동일한 측쇄 패밀리로부터의 또 다른 아미노산 잔기로 대체하는 것이 바람직하다.
대안적으로, 또 다른 실시양태에서, 돌연변이는, 예컨대 포화 돌연변이유발에 의해 코딩 서열의 전부 또는 일부를 따라 무작위로 도입될 수 있고, 생성된 돌연변이체를 본원에 기재된 각각의 활성에 대해 스크리닝하여, 그의 활성을 보유하고 있는 돌연변이체를 확인할 수 있다. 본 발명의 서열 중 하나를 돌연변이유발시킨 후, 코딩된 단백질을 재조합적으로 발현시킬 수 있고, 이러한 단백질의 활성은, 예를 들어 본원에 기재된 검정을 사용하여 결정할 수 있다.
2개 이상의 아미노산 또는 2개 이상의 뉴클레오티드 서열의 백분율 동일성을 결정하기 위한 여러 컴퓨터 소프트웨어 프로그램이 개발되었다. 2개 이상의 서열의 동일성은, 예를 들어 소프트웨어 파스타 (이는 현재 버전 파스타 3으로 사용되고 있음)를 사용하여 계산할 수 있다 (W. R. Pearson and D. J. Lipman, PNAS 85, 2444(1988); W. R. Pearson, Methods in Enzymology 183, 63 (1990); W. R. Pearson and D. J. Lipman, PNAS 85, 2444 (1988); W. R. Pearson, Enzymology 183, 63 (1990)). 상이한 서열의 동일성 계산을 위한 또 다른 유용한 프로그램은 바이오맥스(Biomax) 펜던트 소프트웨어에 포함된 표준 블라스트 프로그램이다 (바이오맥스, 독일 뮌헨). 이는 불행하게도 종종, 최적 이하의 결과를 유발하는데, 이는 블라스트가 대상 및 질의의 완전한 서열을 항상 포함하지는 않기 때문이다. 그럼에도 불구하고, 이러한 프로그램은 매우 효율적이기 때문에, 엄청나게 많은 수의 서열을 비교하는데 사용될 수 있다. 하기 설정이 이러한 서열 비교를 위해 전형적으로 사용된다:
-p 프로그램 명칭 [문자열]; -d 데이터베이스 [문자열]; 디폴트 = nr; -i 질의 파일 [파일 인]; 디폴트 = stdin; -e 기대 값 (E) [실제]; 디폴트 = 10.0; -m 정렬 뷰 옵션: 0 = 쌍을 이룸; 1 = 동일성을 보여주는 질의-참조; 2 = 동일성이 없는 질의-참조; 3 = 동일성을 보여주는, 플랫 질의-참조; 4 = 동일성이 없는, 플랫 질의-참조; 5 = 동일성이 없고 평활 말단인, 질의-참조; 6 = 동일성이 없고 평활 말단인, 플랫 질의-참조; 7 = XML 블라스트 출력; 8 = 테이블 형태; 9 = 주석 라인을 수반한 테이블 형태 [정수]; 디폴트 = 0; -o BLAST 리포트 출력 파일 [파일 아웃] 선택적; 디폴트 = stdout; -F 필터 질의 서열 (blastn을 수반한 DUST, 다른 것을 수반한 SEG) [문자열]; 디폴트 = T; -G 갭을 개방하기 위한 비용 (제로는 디폴트 행위를 호출한다) [정수]; 디폴트 = 0; -E 갭을 확장하기 위한 비용 (제로는 디폴트 행위를 호출한다) [정수]; 디폴트 = 0; -X 갭 형성된 정렬에 대한 X 드롭오프 (비트) (제로는 디폴트 행위를 호출한다); blastn 30, 메가블라스트 20, tblastx 0, 기타 모두 15 [정수]; 디폴트 = 0; -I 디플라인에서의 GI를 나타낸다 [T/F]; 디폴트 = F; -q 뉴클레오티드 미스매치에 대한 페널티 (blastn 경우만) [정수]; 디폴트 = -3; -r 뉴클레오티드 매치에 대한 보상 (blastn 경우만) [정수]; 디폴트 = 1; -v (V)에 대한 온-라인 설명을 나타내는 데이터베이스 서열의 수 [정수]; 디폴트 = 500; -b (B)에 대한 정렬을 나타내는 데이터베이스 서열의 수 [정수]; 디폴트 = 250; -f 확장성 히트에 대한 역치, 제로인 경우 디폴트; blastp 11, blastn 0, blastx 12, tblastn 13; tblastx 13, 메가블라스트 0 [정수]; 디폴트 = 0; -g 갭 형성된 정렬을 수행한다 (tblastx으로는 이용 가능하지 않음) [T/F]; 디폴트 = T; -Q 사용하기 위한 질의 유전자 코드 [정수]; 디폴트 = 1; -D DB 유전자 코드 (tblast[nx] 경우에만) [정수]; 디폴트 = 1; -a 사용되는 프로세서의 수 [정수]; 디폴트 = 1; -O SeqAlign 파일 [파일 아웃] 선택적; -J 질의 디플라인을 신뢰한다 [T/F]; 디폴트 = F; -M 매트릭스 [문자열]; 디폴트 = BLOSUM62; -W 단어 크기, 제로인 경우 디폴트 (blastn 11, 메가블라스트 28, 기타 모두 3) [정수]; 디폴트 = 0; -z 데이터베이스의 유효 길이 (실제 크기에 대해서는 제로를 이용한다) [실제]; 디폴트 = 0; -K 유지하기 위한 영역으로부터 최적 히트의 수 (디폴트에 의한 오프, 사용된 경우에는 100의 값이 권장된다) [정수]; 디폴트 = 0; -P 다중 히트의 경우에는 0이고, 단일 히트에 대해서는 1이다 [정수]; 디폴트 = 0; -Y 조사 공간의 유효 길이 (실제 크기에 대해서는 제로를 이용한다) [실제]; 디폴트 = 0; -S 데이터베이스에 대항하여 조사하기 위한 질의 가닥 (blast[nx], 및 tblastx의 경우); 3은 둘 다이고, 1은 상단이며, 2는 하단이다 [정수]; 디폴트 = 3; -T HTML 출력을 생산한다 [T/F]; 디폴트 = F; -l 데이터베이스의 조사를 GI의 목록으로 제한한다 [문자열] 선택적; -U FASTA 서열의 소문자 필터를 이용한다 [T/F] 선택적; 디폴트 = F; -y 갭을 형성하지 않은 확장물에 대한 X 드롭오프 값 (비트) (0.0은 디폴트 행위를 호출한다); blastn 20, 메가블라스트 10, 기타 모두 7 [실제]; 디폴트 = 0.0; -Z 최종 갭 형성된 정렬에 대한 X 드롭오프 값 (비트) (0.0은 디폴트 행위를 호출한다); blastn/메가블라스트 50, tblastx 0, 기타 모두 25 [정수]; 디폴트 = 0; -R PSI-TBLASTN 체크포인트 파일 [파일 인] 선택적; -n 메가블라스트 조사 [T/F]; 디폴트 = F; -L 질의 서열 상의 위치 [문자열] 선택적; -A 다중 히트 윈도우 크기, 제로인 경우 디폴트 (blastn/메가블라스트 0, 기타 모두 40 [정수]; 디폴트 = 0; -w 프레임 시프트 페널티 (blastx에 대한 OOF 알고리즘) [정수]; 디폴트 = 0; -t HSP를 연결하기 위해 tblastn에서 허용된 가장 큰 인트론의 길이 (0 연결할 수 없게 된다) [정수]; 디폴트 = 0.
고 품질의 결과는 니들만(Needleman) 및 분쉬(Wunsch)의 알고리즘 또는 스미스(Smith) 및 워터만(Waterman)의 알고리즘을 이용함으로써 달성된다. 따라서, 상기 알고리즘에 기초한 프로그램이 바람직하다. 유리하게는, 서열의 비교는 프로그램 파일업(PileUp) (J. Mol. Evolution., 25, 351 (1987), Higgins et al., CABIOS 5, 151 (1989)) 또는 바람직하게 프로그램 "갭(Gap)" 및 "니들(Needle)" (이는 둘 다 니들만 및 분쉬의 알고리즘에 기초함) (J. Mol. Biol. 48; 443 (1970)), 및 "베스트피트(BestFit)" (이는 스미스 및 워터만의 알고리즘에 기초함) (Adv. Appl. Math. 2; 482 (1981))를 사용하여 수행될 수 있다. "갭" 및 "베스트피트"는 GCG 소프트웨어-패키지의 일부이고 (Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711 (1991); Altschul et al., (Nucleic Acids Res. 25, 3389 (1997)), "니들"은 유럽 분자 생물학 오픈 소프트웨어 슈트 (EMBOSS)의 일부이다 (Trends in Genetics 16 (6), 276 (2000)). 따라서 바람직하게는, 서열 동일성의 백분율을 결정하기 위한 계산은 서열의 전체 범위 전반에 걸쳐 프로그램 "갭" 또는 "니들"을 사용하여 수행된다. "니들"의 경우에는 핵산 서열의 비교를 위해 다음 표준 조정을 사용하였다: 매트릭스: EDNAFULL, 갭_페널티: 10.0, 확장_페널티: 0.5. "갭"의 경우에는 핵산 서열의 비교를 위해 다음 표준 조정을 사용하였다: 갭 가중치: 50, 길이 가중치: 3, 평균 매치: 10.000, 평균 미스매치: 0.000.
예를 들어, 핵산 수준에서 서열 1과 80% 동일성을 갖는 것으로 언급되는 서열은 상기 파라미터 세트를 수반하는 상기 프로그램 "니들"에 의해 서열 1로 나타낸 서열과 비교할 때, 80% 동일성을 갖는 서열을 의미하는 것으로 이해된다. 바람직하게는 동일성은 질의 서열, 예를 들어 서열 1의 완전한 길이 상에서 계산된다.
단리된: 본원에 사용된 용어 "단리된"은 물질이 인공적으로 제거되어 그의 원래 천연 환경에서 벗어나서 존재하고, 따라서 자연의 산물이 아님을 의미한다. 단리된 물질 또는 분자 (예컨대, DNA 분자 또는 효소)는 정제된 형태로 존재할 수 있거나 또는 비-천연 환경, 예컨대 예를 들어 트랜스제닉 숙주 세포에 존재할 수 있다. 예를 들어, 살아있는 세포에 존재하는 자연 발생 핵산 분자 또는 폴리펩티드는 단리된 것이 아니지만, 자연계에서 공존하는 물질의 일부 또는 전부로부터 분리된 동일한 핵산 분자 또는 폴리펩티드는 단리된 것이다. 이러한 핵산 분자는 벡터의 일부일 수 있고/거나 상기 핵산 분자 또는 폴리펩티드는 조성물의 일부일 수 있으며, 상기 벡터 또는 조성물이 그의 원래 환경의 일부가 아니라는 점에서 단리된 것일 것이다. 바람직하게는, 용어 "단리된"은 "단리된 핵산 서열"에서처럼 핵산 분자에 대해 사용될 때 그의 자연 공급원에서 통상 회합되는 적어도 하나의 오염 핵산 분자로부터 확인되고 분리된 핵산 서열을 의미한다. 단리된 핵산 분자는 그것이 자연에서 발견되는 것과 상이한 형태 또는 세팅으로 존재하는 핵산 분자이다. 이와는 달리, 비-단리된 핵산 분자는 그들이 자연에서 존재하는 상태로 발견되는 핵산 분자, 예컨대 DNA 및 RNA이다. 예를 들어, 소정의 DNA 서열 (예를 들어, 유전자)은 이웃하는 유전자에 근접하여 숙주 세포 염색체 상에서 발견되고; RNA 서열, 예컨대 특이적 단백질을 코딩하는 특이적 mRNA 서열은 다수의 단백질을 코딩하는 수많은 다른 mRNA와의 혼합물로서 세포에서 발견된다. 그러나, 예를 들어 서열 1을 포함하는 단리된 핵산 서열은 한 예로서, 핵산 서열이 자연 세포의 것과 상이한 게놈 또는 플라스미드 위치에 있거나 또는 자연에서 발견되는 것보다 상이한 핵산 서열이 플랭킹된 서열 1을 통상적으로 함유하는 세포에서의 상기 핵산 서열을 포함한다. 단리된 핵산 서열은 단일 가닥 또는 이중 가닥 형태로 존재할 수 있다. 단리된 핵산 서열을 활용하여 단백질을 발현시켜야 하는 경우에는, 이러한 핵산 서열이 최소한, 센스 또는 코딩 가닥의 적어도 일부를 함유할 것이다 (즉, 상기 핵산 서열은 단일 가닥일 수 있다). 대안적으로, 이는 센스 가닥과 안티센스 가닥 둘 다를 함유할 수 있다 (즉, 상기 핵산 서열은 이중 가닥일 수 있다).
비-코딩: 용어 "비-코딩"은 발현되는 단백질의 일부 또는 전부를 코딩하지 않는 핵산 분자의 서열을 의미한다. 비-코딩 서열은 인핸서, 프로모터 영역, 3' 비번역 영역 및 5' 비번역 영역을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
핵산 및 뉴클레오티드: 용어 "핵산" 및 "뉴클레오티드"는 자연 발생 또는 합성 또는 인공 핵산 또는 뉴클레오티드를 지칭한다. 용어 "핵산" 및 "뉴클레오티드"는 단일 가닥 또는 이중 가닥, 센스 또는 안티센스 형태의, 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 또는 그의 모든 뉴클레오티드 유사체 및 중합체 또는 혼성체를 포함한다. 달리 나타내지 않는 한, 특정한 핵산 서열은 또한, 그의 보존적으로 변형된 변이체 (예를 들어, 축중성 코돈 치환) 및 상보적 서열, 뿐만 아니라 명시적으로 나타낸 서열을 암시적으로 포괄한다. 용어 "핵산"은 본원에서 "유전자", "cDNA", "mRNA", "올리고뉴클레오티드" 및 "핵산 분자"와 상호교환가능하게 사용된다. 뉴클레오티드 유사체는 염기, 당 및/또는 포스페이트의 화학적 구조에서의 변형을 갖는 뉴클레오티드를 포함하며, 이러한 변형은 5-위치 피리미딘 변형, 8-위치 퓨린 변형, 시토신 엑소시클릭 아민에서의 변형, 5-브로모-우라실의 치환 등; 및 2'-위치 당 변형 (이는 2'-OH를 H, OR, R, 할로, SH, SR, NH2, NHR, NR2, 또는 CN으로부터 선택된 군으로 대체시킨, 당-변형된 리보뉴클레오티드를 포함하나, 이에 제한되지는 않음)을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 짧은 헤어핀 RNA (shRNA)는 또한, 비-자연 요소, 예컨대 비-자연 염기, 예를 들어 이노신 및 크산틴, 비-자연 당, 예를 들어 2'-메톡시 리보스, 또는 비-자연 포스포디에스테르 연결, 예를 들어 메틸포스포네이트, 포스포로티오에이트 및 펩티드를 포함할 수 있다.
핵산 서열: 어구 "핵산 서열"은 5'-말단에서 3'-말단으로 읽는 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 염기의 단일 또는 이중 가닥 중합체를 지칭한다. 이는 염색체 DNA, 자기-복제 플라스미드, DNA 또는 RNA의 감염성 중합체, 및 주로 구조적 역할을 수행하는 DNA 또는 RNA를 포함한다. "핵산 서열"은 또한 뉴클레오티드를 나타내는 약어, 글자, 문자 또는 단어의 연속적인 목록을 지칭한다. 한 실시양태에서, 핵산은 길이가 대체로 100개 미만의 뉴클레오티드인 비교적 짧은 핵산인 "프로브"일 수 있다. 종종 핵산 프로브는 약 50개 뉴클레오티드 길이 내지 약 10개 뉴클레오티드 길이이다. 핵산의 "표적 영역"은 관심있는 것으로 확인된 핵산의 부분이다. 핵산의 "코딩 영역"은 적절한 조절 서열의 제어 하에 위치할 때 특정한 폴리펩티드 또는 단백질을 생산하기 위해 서열-특이적 방식으로 전사 및 번역되는 핵산의 부분이다. 코딩 영역은 이러한 폴리펩티드 또는 단백질을 코딩하는 것으로 전해진다.
올리고뉴클레오티드: 용어 "올리고뉴클레오티드"는 리보핵산 (RNA) 또는 데옥시리보핵산 (DNA) 또는 그의 모방체의 올리고머 또는 중합체, 및 유사하게 기능하는 비-자연 발생 부분을 갖는 올리고뉴클레오티드를 지칭한다. 이러한 변형 또는 치환된 올리고뉴클레오티드는 종종 천연 형태에 비해 바람직한데, 이는 바람직한 특성, 예컨대 예를 들어 증진된 세포 흡수, 핵산 표적에 대한 증진된 친화성, 및 뉴클레아제의 존재 하의 증가된 안정성 때문이다. 올리고뉴클레오티드는 바람직하게는, 연결 (예를 들어, 포스포디에스테르) 또는 치환 연결에 의해 서로 공유적으로 커플링된 2개 이상의 뉴클레오모노머를 포함한다.
오버행: "오버행"은 이중 가닥 올리고뉴클레오티드 분자의 5'- 또는 3'-히드록실 말단 상의 비교적 짧은 단일 가닥 뉴클레오티드 서열이다 ("연장물", "돌출성 말단" 또는 "점착성 말단"으로서 지칭되기도 함).
폴리펩티드: 용어 "폴리펩티드", "펩티드", "올리고펩티드", "폴리펩티드", "유전자 산물", "발현 산물" 및 "단백질"은 연속되는 아미노산 잔기의 중합체 또는 올리고머를 지칭하기 위해 본원에서 상호교환가능하게 사용된다.
프로모터: 용어 "프로모터" 또는 "프로모터 서열"은 등가이고, 본원에 사용된 바와 같이, 관심 뉴클레오티드 서열과 작동적으로 연결되는 경우에, 이러한 관심 뉴클레오티드 서열을 RNA로 전사하는 것을 제어할 수 있는 DNA 서열을 지칭한다. 프로모터는 그의 mRNA로의 전사를 제어하는 관심 뉴클레오티드 서열의 전사 출발 부위에 근접한 5' (즉, 상류)에 위치하고, 전사 개시를 위한 다른 전사 인자 및 RNA 폴리머라제에 의한 특이적 결합을 위한 부위를 제공한다. 프로모터는 코딩 영역 또는 5' 비번역 영역을 포함하지 않는다. 프로모터는, 예를 들어 각각의 세포에 대해 이종 또는 동종일 수 있다. 핵산 분자 서열은 이것이 외래 종으로부터 유래되는 경우에, 또는 동일한 종으로부터 그의 원래 형태로부터 변형되는 경우에, 유기체 또는 제2의 핵산 분자 서열에 대해 "이종"이다. 예를 들어, 이종 코딩 서열과 작동적으로 연결된 프로모터는 프로모터가 유래되는 것과 상이한 종으로부터의 코딩 서열, 또는 동일한 종으로부터 유래된 경우에는, 프로모터와 자연적으로 회합되지 않는 코딩 서열 (예를 들어, 유전자 조작된 코딩 서열 또는 상이한 생태형 또는 변종으로부터의 대립 유전자)을 지칭한다. 적합한 프로모터는 발현이 일어나야 하는 숙주 세포의 유전자로부터 유래되거나 또는 이러한 숙주에 대한 병원체로부터 유래될 수 있다.
정제된: 본원에 사용된 용어 "정제된"은 그의 자연 환경으로부터 제거되거나, 단리되거나 또는 분리되는 핵산 또는 아미노산 서열 분자를 지칭한다. "실질적으로 정제된" 분자는 이들과 자연적으로 회합되는 다른 성분이 적어도 60% 없고, 바람직하게는 적어도 75% 없고, 보다 바람직하게는 적어도 90% 없다. 정제된 핵산 서열은 단리된 핵산 서열일 수 있다.
재조합: 핵산 분자와 관련된 용어 "재조합"은 재조합 DNA 기술에 의해 생산된 핵산 분자를 지칭한다. 용어는 또한, 그 자체로는 자연에서 존재하지 않지만, 인간에 의해 변형되거나, 변화되거나, 돌연변이되거나 또는 달리 조작되는 핵산 분자를 포함한다. 바람직하게는, "재조합 핵산 분자"는 자연 발생 핵산 분자와 서열상 적어도 1개의 핵산이 상이한 비-자연 발생 핵산 분자이다. "재조합 핵산 분자"는 또한, 그 순서로는 자연 발생이지 않는 핵산 분자의 서열을 포함하는, 바람직하게는 작동적으로 연결된 "재조합 구축물"을 포함할 수 있다. 상기 재조합 핵산 분자를 생산하는 바람직한 방법은 클로닝 기술, 지정 또는 비-지정 돌연변이유발, 합성 또는 재조합 기술을 포함할 수 있다.
유의한 증가: 측정 기술에 고유한 오차 범위 보다 더 큰, 예를 들어 특정 산물의 효소 활성, 유전자 발현, 생산성 또는 수율의 증가, 바람직하게는 대조군 효소의 활성, 발현, 생산성 또는 수율, 또는 대조군 세포에서의 발현, 대조군 세포의 생산성 또는 수율의 약 10% 또는 25%, 바람직하게는 50% 또는 75%, 보다 바람직하게는 2배 또는 5배 이상 정도의 증가, 보다 더 바람직하게는 약 10배 이상 정도의 증가.
유의한 감소: 측정 기술에 고유한 오차 범위 보다 더 큰, 예를 들어 특정 산물의 효소 활성, 유전자 발현, 생산성 또는 수율 상의 감소, 바람직하게는 적어도 약 5% 또는 10%, 바람직하게는 적어도 약 20% 또는 25%, 보다 바람직하게는 적어도 약 50% 또는 75%, 보다 더 바람직하게는 적어도 약 80% 또는 85%, 가장 바람직하게는 적어도 약 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 정도의 감소.
실질적으로 상보적: 그의 가장 넓은 의미에서, 참조 또는 표적 뉴클레오티드 서열과 관련하여 뉴클레오티드 서열에 대하여 본원에서 사용되는 경우, 용어 "실질적으로 상보적"은 상기 참조 또는 표적 뉴클레오티드 서열의 실질적으로 상보적인 뉴클레오티드 서열과 정확히 상보적인 서열 간의 동일성 백분율이 적어도 60%, 보다 바람직하게는 적어도 70%, 보다 바람직하게는 적어도 80% 또는 85%, 바람직하게는 적어도 90%, 보다 바람직하게는 적어도 93%, 보다 더 바람직하게는 적어도 95% 또는 96%, 또한 보다 더 바람직하게는 적어도 97% 또는 98%, 또한 보다 더 바람직하게는 적어도 99% 또는 가장 바람직하게는 100% (후자는 본 문맥에서 용어 "동일한" 것과 등가임)인 뉴클레오티드 서열을 의미한다. 바람직하게는 동일성은 상기 참조 서열에 대한 적어도 19개 뉴클레오티드의 길이, 바람직하게는 적어도 50개 뉴클레오티드의 길이, 보다 바람직하게는 핵산 서열의 전체 길이 전반에 걸쳐 (하기에 달리 명시되지 않는 한) 평가된다. 서열 비교는 니들만 및 분쉬의 알고리즘 (Needleman and Wunsch (1970) J Mol. Biol. 48: 443-453; 상기 정의된 바와 같음)에 기초한, GAP의 위스콘신 대학교 GCG, SEQWEB 적용 하에 디폴트 GAP 분석을 사용하여 수행된다. 참조 뉴클레오티드 서열에 대해 "실질적으로 상보적"인 뉴클레오티드 서열은 저 엄격도 조건, 바람직하게는 중간 엄격도 조건, 가장 바람직하게는 고도 엄격도 조건 (상기 정의된 바와 같음) 하에 참조 뉴클레오티드 서열에 혼성화된다.
트랜스진: 본원에 사용된 용어 "트랜스진"은 실험적 조작에 의해 세포의 게놈 내로 도입되는 임의의 핵산 서열을 지칭한다. 트랜스진은 "내인성 DNA 서열" 또는 "이종 DNA 서열" (즉, "외래 DNA")일 수 있다. 용어 "내인성 DNA 서열"은 그것이 도입되는 세포에서 자연적으로 발견되는 뉴클레오티드 서열을 지칭하며, 단 이것은 자연 발생 서열과 대비하여 일부 변형 (예를 들어, 점 돌연변이, 선택 마커 유전자의 존재 등)을 함유하지 않아야 한다.
트랜스제닉: 유기체를 지칭하는 경우의 용어 트랜스제닉은 관심 DNA 서열과 작동적으로 연결된 적합한 프로모터를 바람직하게 포함하는 재조합 DNA 분자로 형질전환, 바람직하게는 안정적으로 형질전환된 것을 의미한다.
벡터: 본원에 사용된 용어 "벡터"는 이와 연결된 또 다른 핵산 분자를 수송할 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 한 가지 유형의 벡터는 게놈 통합된 벡터 또는 "통합된 벡터"이며, 이는 숙주 세포의 게놈 DNA 내로 통합될 수 있다. 또 다른 유형의 벡터는 에피솜 벡터, 즉 염색체외 복제할 수 있는 핵산 분자 또는 플라스미드이다. 이들과 작동적으로 연결되는 유전자의 발현을 지시할 수 있는 벡터는 본원에서 "발현 벡터"로서 지칭된다. 본 명세서에서, "플라스미드" 및 "벡터"는 문맥상 달리 명확하지 않는 한 상호교환가능하게 사용된다.
야생형: 용어 "야생형", "자연" 또는 "자연 기원"은 유기체와 관련하여, 이러한 유기체가 인간에 의해 변화되지 않거나, 돌연변이되지 않거나 또는 달리 조작되지 않은 것을 의미한다. 폴리펩티드 또는 핵산 서열과 관련해서는, 폴리펩티드 또는 핵산 서열이 자연 발생이거나, 또는 인간에 의해 변화되지 않거나, 돌연변이되지 않거나 또는 달리 조작되지 않은 적어도 하나의 자연 발생 유기체에서 이용가능하다는 것을 의미한다.
미생물의 야생형은 그의 게놈이 특정 유전자의 유전자 변형의 도입 이전과 같은 상태로 존재하는 미생물을 지칭한다. 유전자 변형은, 예를 들어 유전자 또는 그의 일부의 결실 또는 점 돌연변이 또는 유전자의 도입일 수 있다.
용어 "생산" 또는 "생산성"은 관련 기술분야에서 인식되고, 소정의 시간 및 소정의 발효 부피 내에서 형성된 발효 산물 (예를 들어, 알라닌)의 농도 (예를 들어, 리터당 시간당 산물 kg)를 포함한다. 용어 "생산 효율"은 달성하고자 하는 특정한 생산 수준에 요구되는 시간 (예를 들어, 세포가 정밀 화학물질의 특정한 출력 비율을 획득하기 위해 소요되는 시간)을 포함한다. 생산성은 또한 생성된 산물의 양을 반응기 부피 및 시간으로 나눈 것으로 정의되는 공간-시간-수율을 의미할 수 있다.
용어 "수율" 또는 "산물/탄소 수율"은 관련 기술분야에서 인식되고, 탄소 공급원이 산물 (즉, 정밀 화학물질)로 전환되는 효율을 포함한다. 이것은 일반적으로, 예를 들어 탄소 공급원 kg당 산물 kg으로서 표기된다. 화합물의 수율 또는 생산을 증가시킴으로써, 소정 양의 시간에 걸쳐 소정 양의 배양물 중에서 상기 화합물의 회수된 분자 또는 유용한 회수된 분자의 양이 증가된다.
용어 "재조합 미생물"은 그것이 유래되는 야생형 미생물과 비교하여 변경되거나 상이한 유전자형 및/또는 표현형을 나타내도록 유전자 변형시킨 (예를 들어, 이러한 유전자 변형이 미생물의 코딩 핵산 서열에 영향을 미치는 경우) 미생물을 포함한다. 재조합 미생물은 적어도 하나의 재조합 DNA 분자를 포함한다.
DNA와 관련하여 용어 "재조합"은 재조합 DNA 기술을 사용하여 인간에 의해 생산된 DNA 분자를 지칭한다. 용어는 그 자체로는 자연에서 존재하지 않거나 또는 DNA가 유래되는 유기체에는 존재하지 않지만, 인간에 의해 변형되거나, 변화되거나, 돌연변이되거나 또는 달리 조작되는 DNA 분자를 포함한다. 바람직하게는, "재조합 DNA 분자"는 자연 발생 핵산 분자와 서열상 적어도 1개의 핵산이 상이한 비-자연 발생 핵산 분자이다. "재조합 DNA 분자"는 또한, 그 순서로는 자연 발생이지 않는 핵산 분자의 서열을 포함하는, 바람직하게는 작동적으로 연결된 "재조합 구축물"을 포함할 수 있다. 상기 재조합 DNA 분자를 생산하는 바람직한 방법은 클로닝 기술, 지정 또는 비-지정 돌연변이유발, 유전자 합성 또는 재조합 기술을 포함할 수 있다.
이러한 재조합 DNA의 예는 이종 DNA-서열이 삽입된 플라스미드, 또는 재조합 DNA가 유래되는 유전자 또는 프로모터와 비교하여 돌연변이된 유전자 또는 프로모터이다. 돌연변이는 관련 기술분야에 공지된 지정 돌연변이유발 기술 또는 무작위 돌연변이유발 기술, 예컨대 화학물질, UV 광 또는 X선 돌연변이유발 또는 방향적 진화 기술에 의해 도입될 수 있다.
용어 "방향적 진화"는 본원에서 용어 "대사 진화"와 동의어로 사용되고, 관심 형질을 지닌 돌연변이체의 성장을 선호하는 선택 압력을 적용하는 것을 수반한다. 선택 압력은 상이한 배양 조건, ATP 및 성장 커플링된 선택 및 산화환원 관련 선택에 기초할 수 있다. 선택 압력은 일련의 전송 접종을 수반하는 회분식 발효 또는 동일한 압력을 사용하는 연속식 배양으로 수행될 수 있다.
용어 "발현" 또는 "유전자 발현"은 특이적 유전자(들) 또는 특이적 유전적 벡터 구축물의 전사를 의미한다. 용어 "발현" 또는 "유전자 발현"은 특히, 유전자(들) 또는 유전적 벡터 구축물의 mRNA로의 전사를 의미한다. 과정은 DNA의 전사를 포함하고, 생성되는 RNA-산물의 프로세싱을 포함할 수 있다. 용어 "발현" 또는 "유전자 발현"은 또한, mRNA의 번역 및 그를 이용한, 코딩된 단백질의 합성, 즉 단백질 발현을 포함할 수 있다.
도 1
ackA-pta 유전자의 불활성화 후 클론 검증.
A: 프라이머 P395-ackA-pta-check2 및 P395-ackA-pta-check5 (338 bp)를 사용하여 이. 콜라이 W ΔackA-pta::FRT의 게놈 DNA로부터 수득된 PCR 앰플리콘. M: DNA 크기 마커. B: P395-ackA-pta-check2 및 P395-ackA-pta-check5를 사용하여 PCR 앰플리콘을 서열분석한 결과, ackA-pta 유전자좌의 염기쌍-정확한 변형을 확증하였다. 서열분석에 의해 확증된 뉴클레오티드는 이탤릭체로 나타낸다. 나머지 FRT 부위는 녹색으로 나타내고, 플랭킹 프라이머 결합 부위는 적색으로 나타낸다. 대문자: 코딩 서열. 소문자: 유전자간 영역.
도 2
adhE 유전자의 불활성화 후 클론 검증.
A: 프라이머 P395-adhE-check2 및 P395-adhE-check5 (569 bp)를 사용하여 이. 콜라이 W ΔackA-pta::FRT ΔadhE::FRT의 게놈 DNA로부터 수득된 PCR 앰플리콘. M: DNA 크기 마커. B: P395-adhE-check2 및 P395-adhE-check5를 사용하여 상기 PCR 앰플리콘을 서열분석한 결과, adhE 유전자좌의 염기쌍-정확한 변형을 확증하였다. 서열분석에 의해 확증된 뉴클레오티드는 이탤릭체로 나타낸다. 나머지 FRT 부위는 녹색으로 나타내고, 플랭킹 프라이머 결합 부위는 적색으로 나타낸다. 대문자: 코딩 서열. 소문자: 유전자간 영역.
도 3
frdABCD 유전자의 불활성화 후 클론 검증.
A: 프라이머 P395-frd-check1 및 P395-frd-check4 (797 bp)를 사용하여 이. 콜라이 W ΔackA-pta::FRT ΔadhE::FRT ΔfrdABCD::FRT의 게놈 DNA로부터 수득된 PCR 앰플리콘. M: DNA 크기 마커. B: P395-frd-check1 및 P395-frd-check4를 사용하여 상기 PCR 앰플리콘을 서열분석한 결과, frd 유전자좌의 염기쌍-정확한 변형을 확증하였다. 서열분석에 의해 확증된 뉴클레오티드는 이탤릭체로 나타낸다. 나머지 FRT 부위는 녹색으로 나타내고, 플랭킹 프라이머 결합 부위는 적색으로 나타낸다. 대문자: 코딩 서열. 소문자: 유전자간 영역.
도 4
pflB 유전자의 불활성화 후 클론 검증.
A: 프라이머 P395-pflB-check1 및 P395-pflB-check3 (511 bp)를 사용하여 이. 콜라이 W ΔackA-pta::FRT ΔadhE::FRT ΔfrdABCD::FRT ΔpflB::FRT의 게놈 DNA로부터 수득된 PCR 앰플리콘. M: DNA 크기 마커. B: P395-pflB-check1 및 P395-pflB-check3을 사용하여 상기 PCR 앰플리콘을 서열분석한 결과, pflB 유전자좌의 염기쌍-정확한 변형을 확증하였다. 서열분석에 의해 확증된 뉴클레오티드는 이탤릭체로 나타낸다. 나머지 FRT 부위는 녹색으로 나타내고, 플랭킹 프라이머 결합 부위는 적색으로 나타낸다. 대문자: 코딩 서열. 소문자: 유전자간 영역.
도 5
alaD-gstear 유전자의 통합 후 클론 검증.
A: 프라이머 P395-ldhA-check1 및 P395-ldhA-check2 (1833 bp)를 사용하여 이. 콜라이 W ΔackA-pta::FRT ΔadhE::FRT ΔfrdABCD::FRT ΔpflB::FRT ΔldhA::alaD-gstear의 게놈 DNA로부터 수득된 PCR 앰플리콘. M: DNA 크기 마커. B: P395-ldhA-check1 및 P395-ldhA-check2를 사용하여 상기 PCR 앰플리콘을 서열분석한 결과, ldhA 유전자좌의 염기쌍-정확한 변형 및 alaD-gstear의 통합을 확증하였다. 서열분석에 의해 확증된 뉴클레오티드는 이탤릭체로 나타낸다. alaD-gstear ORF는 청록색으로 나타내고, 나머지 FRT 부위는 녹색으로 나타내며, 플랭킹 프라이머 결합 부위는 적색으로 나타낸다. 대문자: 코딩 서열. 소문자: 유전자간 영역.
도 6
본 발명의 미생물에서의 알라닌 합성의 대사 맵.
적색 별표는 효소 활성의 녹아웃을 도시한다
녹색 화살표는 도입된 효소 활성을 도시한다.
J7은 ldh - 락테이트 데히드로게나제를 나타내고, KO는 락테이트의 생산을 감소시킨다.
J6은 frdABCD - 푸마레이트 리덕타제를 나타내고, KO는 숙시네이트의 생산을 감소시킨다.
J8은 pfl - 피루베이트 포르메이트 리아제를 나타내고, KO는 아세테이트 및 에탄올의 생산을 감소시킨다.
J10은 ack-pta - 포스포트랜스아세틸라제-아세테이트 키나제를 나타내고, KO는 아세테이트의 생산을 감소시킨다.
J11은 adhE- 알콜 데히드로게나제를 나타내고, KO는 에탄올의 생산을 감소시킨다.
도 7
140 g/L 글루코스를 포함하는 500 mL AM 1 배지에서의 이. 콜라이 QZ20 및 이. 콜라이 QZ48 (ArgP A96E)의 회분식 발효. 발효를 통기 없이 37℃, 400 rpm에서 pH 6.8 하에 5 N NH4OH로 제어하였다. 샘플의 알라닌 농도 및 NH4OH 소모율로부터 상관관계가 있는 알라닌의 형성이 도시되어 있다.
도 8
탄소 공급원으로서 140 g/L 글루코스를 포함하는 500 mL AM 1 배지에서의 46h 회분식 발효 후 이. 콜라이 QZ20 및 QZ48 (ArgP A96E)의 부피 알라닌 생산성 (공간-시간-수율) (생성된 산물의 양을 반응기 부피 및 시간으로 나눈 것으로 정의됨).
도 9
140 g/L 글루코스를 포함하는 500 mL AM 1 배지에서의 이. 콜라이 QZ20/pACYC184 플라스미드 대조군 및 이. 콜라이 QZ20/pACYC184-argP의 회분식 발효. 발효를 통기 없이 37℃, 400 rpm에서 pH 6.8 하에 5 N NH4OH로 제어하였다. 샘플의 알라닌 농도 및 NH4OH 소모율로부터 상관관계가 있는 알라닌의 형성이 도시되어 있다.
도 10
탄소 공급원으로서 140 g/L 글루코스를 포함하는 500 mL AM 1 배지에서의 20h 회분식 발효 후 이. 콜라이 QZ20/pACYC184 플라스미드 대조군 및 이. 콜라이 QZ20/pACYC184-argP의 부피 알라닌 생산성 (공간-시간-수율) (생성된 산물의 양을 반응기 부피 및 시간으로 나눈 것으로 정의됨).
도 11
140 g/L 글루코스를 포함하는 500 mL AM 1 배지에서의 이. 콜라이 QZ20 및 이. 콜라이 QZ58 (gcvA/B 프로모터 SNP)의 회분식 발효. 발효를 통기 없이 37℃, 400 rpm에서 pH 6.8 하에 5 N NH4OH로 제어하였다. 샘플의 알라닌 농도 및 NH4OH 소모율로부터 상관관계가 있는 알라닌의 형성이 도시되어 있다.
도 12
탄소 공급원으로서 140 g/L 글루코스를 포함하는 500 mL AM 1 배지에서의 46h 회분식 발효 후 이. 콜라이 QZ20 및 QZ58 (gcvA/B 프로모터 SNP)의 부피 알라닌 생산성 (공간-시간-수율) (생성된 산물의 양을 반응기 부피 및 시간으로 나눈 것으로 정의됨).
도 13
140 g/L 글루코스를 포함하는 500 mL AM 1 배지에서의 이. 콜라이 QZ48 (ArgP A96E) 및 이. 콜라이 QZ66 (Arg A96E, gcvA/B 프로모터 SNP)의 회분식 발효. 발효를 통기 없이 37℃, 400 rpm에서 pH 6.8 하에 5 N NH4OH로 제어하였다. 샘플의 알라닌 농도 및 NH4OH 소모율로부터 상관관계가 있는 알라닌의 형성이 도시되어 있다.
도 14
탄소 공급원으로서 140 g/L 글루코스를 포함하는 500 mL AM 1 배지에서의 46h 회분식 발효 후 이. 콜라이 QZ48 (ArgP A96E) 및 이. 콜라이 QZ66 (ArgP A96E, gcvA/B 프로모터 SNP)의 부피 알라닌 생산성 (공간-시간-수율) (생성된 산물의 양을 반응기 부피 및 시간으로 나눈 것으로 정의됨).
도 15
회분식 발효 동안 8h, 11h 및 28h에 이. 콜라이 QZ20 및 QZ23에서의 (a) gcvA 및 (b) gcvB의 이. 콜라이 QZ20 8h에 대비한 상대 유전자 전사 분석. 모든 qPCR-유래된 데이터를 참조로서의 rrsA 유전자에 대해 정규화시켰다.
도 16
140 g/L 글루코스를 포함하는 500 mL AM 1 배지에서의 이. 콜라이 QZ20/pACYC184 플라스미드 대조군, 이. 콜라이 QZ20/pACYC184-gcvA 및 이. 콜라이 QZ20/pACYC184-gcvB의 회분식 발효. 발효를 통기 없이 37℃, 400 rpm에서 pH 6.8 하에 5 N NH4OH로 제어하였다. 샘플의 알라닌 농도 및 NH4OH 소모율로부터 상관관계가 있는 알라닌의 형성.
도 17
탄소 공급원으로서 140 g/L 글루코스를 포함하는 500 mL AM 1 배지에서의 46h 회분식 발효 후 플라스미드 대조군 pACYC184, pACYC184-gcvA 및 pACYC184-gcvB를 갖는 이. 콜라이 QZ20의 부피 알라닌 생산성 (공간-시간-수율) (생성된 산물의 양을 반응기 부피 및 시간으로 나눈 것으로 정의됨).
도 18
140 g/L 글루코스를 포함하는 500 mL AM 1 배지에서의 이. 콜라이 QZ20 및 이. 콜라이 QZ71 (gcvB 녹아웃)의 회분식 발효. 발효를 통기 없이 37℃, 400 rpm에서 pH 6.8 하에 5 N NH4OH로 제어하였다. 샘플의 알라닌 농도 및 NH4OH 소모율로부터 상관관계가 있는 알라닌의 형성이 도시되어 있다.
도 19
탄소 공급원으로서 140 g/L 글루코스를 포함하는 500 mL AM 1 배지에서의 46h 회분식 발효 후 이. 콜라이 QZ20 및 이. 콜라이 QZ71 (gcvB 녹아웃)의 부피 알라닌 생산성 (공간-시간-수율) (생성된 산물의 양을 반응기 부피 및 시간으로 나눈 것으로 정의됨).
도 20
140 g/L 글루코스를 포함하는 500 mL AM 1 배지에서의 이. 콜라이 QZ20, 이. 콜라이 QZ57 (brnQΔ667-764) 및 이. 콜라이 QZ69 (brnQ KO)의 회분식 발효. 발효를 통기 없이 37℃, 400 rpm에서 pH 6.8 하에 5 N NH4OH로 제어하였다. 샘플의 알라닌 농도 및 NH4OH 소모율로부터 상관관계가 있는 알라닌의 형성이 도시되어 있다.
도 21
탄소 공급원으로서 140 g/L 글루코스를 포함하는 500 mL AM 1 배지에서의 46h 회분식 발효 후 이. 콜라이 QZ20, 이. 콜라이 QZ57 (brnQΔ667-764) 및 이. 콜라이 QZ69 (brnQ KO)의 부피 알라닌 생산성 (공간-시간-수율) (생성된 산물의 양을 반응기 부피 및 시간으로 나눈 것으로 정의됨).
도 22
140 g/L 글루코스를 포함하는 500 mL AM 1 배지에서의 이. 콜라이 QZ20 및 이. 콜라이 QZ56 (LpxD A15T)의 회분식 발효. 발효를 통기 없이 37℃, 400 rpm에서 pH 6.8 하에 5 N NH4OH로 제어하였다. 샘플의 알라닌 농도 및 NH4OH 소모율로부터 상관관계가 있는 알라닌의 형성이 도시되어 있다.
도 23
탄소 공급원으로서 140 g/L 글루코스를 포함하는 500 mL AM 1 배지에서의 46h 회분식 발효 후 이. 콜라이 QZ20 및 QZ56 (LpxD A15T)의 부피 알라닌 생산성 (공간-시간-수율) (생성된 산물의 양을 반응기 부피 및 시간으로 나눈 것으로 정의됨).
도 24
140 g/L 글루코스를 포함하는 500 mL AM 1 배지에서의 이. 콜라이 QZ68 (argP A96E, gcvA/B 프로모터 SNP, brnQΔ667-764) 및 이. 콜라이 QZ70 (argP A96E, gcvA/B 프로모터 SNP, brnQΔ667-764, lpxD A15T)의 회분식 발효. 발효를 통기 없이 37℃, 400 rpm에서 pH 6.8 하에 5 N NH4OH로 제어하였다. 샘플의 알라닌 농도 및 NH4OH 소모율로부터 상관관계가 있는 알라닌의 형성이 도시되어 있다.
도 25
탄소 공급원으로서 140 g/L 글루코스를 포함하는 500 mL AM 1 배지에서의 46h 회분식 발효 후 이. 콜라이 QZ68 (argP A96E, gcvA/B 프로모터 SNP, brnQΔ667-764) 및 이. 콜라이 QZ70 (argP A96E, gcvA/B 프로모터 SNP, brnQΔ667-764, lpxD A15T)의 부피 알라닌 생산성 (공간-시간-수율) (생성된 산물의 양을 반응기 부피 및 시간으로 나눈 것으로 정의됨).
실시예
화학물질 및 통상의 방법
달리 나타내지 않는 한, 제한 소화, 아가로스 겔 전기영동, 핵산의 정제, 핵산의 라이게이션, 박테리아 세포의 형질전환, 선택 및 배양을 포함한, 본 발명의 목적을 위해 수행된 클로닝 절차는 문헌 [Sambrook et al., 1989]에 기재된 바와 같이 수행하였다. 재조합 DNA의 서열분석은 생어(Sanger) 기술 (Sanger et al., 1977)을 사용하여 레이저 형광 DNA 서열분석기 (어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems), 미국 캘리포니아주 포스터 시티)로 수행하였다. 달리 기재되지 않는 한, 화학물질 및 시약은 시그마 알드리히(Sigma Aldrich) (미국 세인트 루이스), 프로메가(Promega) (미국 위스콘신주 매디슨), 두체파(Duchefa) (네덜란드 하를렘) 또는 인비트로젠(Invitrogen) (미국 캘리포니아주 칼스배드)로부터 수득되었다. 제한 엔도뉴클레아제는 뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs) (미국 매사추세츠주 입스위치) 또는 로슈 다이아그노스틱스 게엠베하(Roche Diagnostics GmbH) (독일 펜즈베르크)로부터 수득되었다. 올리고뉴클레오티드는 유로핀스 MWG 오페론(Eurofins MWG Operon) (독일 에버스베르크)에 의해 합성되었다.
실시예 1
이. 콜라이 W (LU17032)를 L-알라닌 생산을 위해, ackA-pta, adhE, frdABCD 및 pflB ORF를 불활성화시키고 ldhA ORF를 alaD 유전자의 코돈-최적화 변이체 (alaD-gstear)로 대체함으로써 조작하였다.
FRT-플랭킹된 카나마이신 내성 카세트를 삽입한 다음, FLP 재조합에 의해 항생제 내성 카세트를 제거함으로써, ackA-pta, adhE, frdABCD 및 pflB ORF를 불활성화시켰다.
ldhA 유전자를 alaD-gstear 및 하류 FRT-플랭킹된 제오신 내성 카세트 (이는 FLP 재조합에 의해 최종적으로 제거되었음)로 대체하였다.
물질 및 방법
박테리아 배양
이. 콜라이 W (LU17032)를 루리아-베르타니(Luria-Bertani) (LB) 액체 배지 중에서 또는 루리아-베르타니 고체 배지 상에서 배양하였다. 가끔, 10 mM 수크로스를 함유하는 M9 최소 한천 상에서 클론을 계대하여 W 균주 정체성을 확증하였다. 항생제를 상기 액체 및 고체 배지에 적절하게 첨가하여, 15 μg/ml (카나마이신, 클로람페니콜), 25 μg/ml (제오신) 또는 3 μg/ml (테트라시클린)의 최종 농도가 되도록 하였다.
Red/ET 재조합
진 브리지스 게엠베하(Gene Bridges GmbH) (www.genebridges.com)의 표준 프로토콜을 사용하여 Red/ET 재조합을 수행하였다. 간략하게, Red/ET-적격 이. 콜라이 W를 30℃에서 호기적으로 성장시켜 ~0.3의 OD600 nm가 되도록 하였다. 50 μl의 10% (w/v) L-아라비노스를 첨가한 다음, 온도를 37℃로 증가시킴으로써, red 유전자의 발현을 유도시켰다. 유도되지 않은 대조군 배양물로부터는 아라비노스를 생략하였다. 37℃에서 35 min 인큐베이션한 후, 세포를 빙냉 10% (v/v) 글리세롤로 2회 세척하고, 1.35 kV, 10 μF, 600Ω에서 500 ng의 PCR 산물로 전기천공하였다. 이어서, 세포를 1 ml 빙냉 LB 배지에 재현탁시키고, 대략 1.5 h 동안 37℃에서 호기적으로 성장시켰다. 그 다음, 배양물을, 15 μg/ml 카나마이신 (녹아웃) 또는 25 μg/ml 제오신 (녹인)을 함유하는 LB 한천 상에 플레이팅하였다.
FLP 재조합
플랭킹 FRT 부위는 이. 콜라이 염색체의 변형 후 FLP 재조합에 의해 항생제 내성 마커의 제거를 허용하였다. FLP 재조합으로 인해, 단일 FRT 부위 (34 bp) 뿐만 아니라 짧은 플랭킹 서열 (각각 대략 20 bp)이 남게되는데, 이들은 카세트의 증폭에서 프라이머 결합 부위로서 사용되었다.
FLP 재조합을 수행하기 위해, FLP 레콤비나제를 코딩하는 플라스미드 708-FLPe (표 1)를 전기천공에 의해 Red/ET 재조합체 내로 도입하였다. KanR CmR 또는 ZeoR CmR 형질전환체를 사용하여 0.2 ml LB 배양물을 접종하였으며, 이를 3 h 동안 30℃에서 인큐베이션하였다. 이어서, 온도를 37℃로 이동시킨 다음 37℃에서 3시간 인큐베이션함으로써 FLP 활성을 유도시켰다. 이후 이들 배양물로부터 수득된 단일 콜로니를 CmS 및 KanS 또는 ZeoS 표현형에 대해 스크리닝하였다.
DNA 제조 및 분석
이. 콜라이 게놈 DNA (gDNA)를, 젠트라 퓨어진 효모/박테리아 키트 B (Gentra Puregene Yeast/Bact. Kit B) (퀴아젠(Qiagen), 독일 힐덴)를 사용하여 밤새 배양물로부터 단리하였다. 녹아웃 또는 녹인 카세트를 정착시킨 PCR 산물을, PRECISOR 고충실도 DNA 폴리머라제 (바이오캣(BioCat), 독일 하이델베르크)를 사용하여 주형 플라스미드로부터 증폭시키고, 제조업체의 권고에 따라서 PCR 익스텐더 시스템 (5PRIME 게엠베하, 독일 함부르크)을 사용하여 분석적 PCR 반응을 수행하였다. 진제트(GeneJET) PCR 정제 키트 또는 진제트 겔 추출 키트 (퍼멘타스(Fermentas), 독일 세인트 레온-로트)를 사용하여 PCR 앰플리콘을 정제하고, GATC 바이오텍(BioTech) (독일 콘스탄츠) 또는 바이오스프링(BioSpring) (독일 프랑크푸르트 암 마인)에 의해 서열분석을 수행하였다.
<표 1>
플라스미드 및 프라이머
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
1.1. ackA-pta 유전자좌 - ackA-pta의 표적화
대략 500 ng의 ΔackA-pta PCR 구축물 (1737 bp)을 Red/ET-적격 이. 콜라이 W 세포 내로 전기천공하였다. 8개의 KanR 형질전환체를 게놈-특이적 프라이머를 사용하여 PCR함으로써 내성 마커 카세트의 정확한 통합에 대해 분석하였다. 3개의 클론을 FLP 재조합하였으며, 이는 물질 및 방법에 기재된 바와 같이 수행하였다 (데이터는 제시되지 않음).
클론 검증. ackA-pta 유전자좌의 불활성화 및 카나마이신 내성 카세트의 제거는 남아있는 FRT 반흔 전반에 걸쳐 PCR함으로써 확증하였다. 정확한 PCR 신호를 생성한 1개 클론이 또한 서열분석에 의해 확증되었다 (도 1).
1.2 adhE 유전자좌 - adhE의 표적화
대략 500 ng의 ΔadhE PCR 구축물 (1093 bp)을, ΔackA-pta::FRT 변형을 정착시킨 Red/ET-적격 이. 콜라이 W 세포 내로 전기천공하였다. 8개의 KanR 형질전환체를, 게놈-특이적 프라이머를 사용하여 PCR함으로써 내성 마커 카세트의 정확한 통합에 대해 분석하였다. 2개의 클론을 FLP 재조합하였으며, 이는 물질 및 방법에 기재된 바와 같이 수행하였다 (데이터는 제시되지 않음).
클론 검증. adhE 유전자좌의 불활성화 및 카나마이신 내성 카세트의 제거는 남아있는 FRT 반흔 전반에 걸쳐 PCR함으로써 확증하였다. 정확한 PCR 신호를 생성한 1개 클론이 또한 서열분석에 의해 확증되었다 (도 2).
1.3 frd 유전자좌 - frdABCD의 표적화
대략 500 ng의 ΔfrdABCD PCR 구축물 (1093 bp)을, ΔackA-pta::FRT 및 ΔadhE::FRT 변형을 정착시킨 Red/ET-적격 이. 콜라이 W 세포 내로 전기천공하였다. 8개의 KanR 형질전환체를, 게놈-특이적 프라이머를 사용하여 PCR함으로써 내성 마커 카세트의 정확한 통합에 대해 분석하였다. 1개의 클론을 FLP 재조합하였으며, 이는 물질 및 방법에 기재된 바와 같이 수행하였다 (데이터는 제시되지 않음).
클론 검증. frd 유전자좌의 불활성화 및 카나마이신 내성 카세트의 제거는 남아있는 FRT 반흔 전반에 걸쳐 PCR함으로써 확증하였다. 정확한 PCR 신호를 생성한 1개 클론이 또한 서열분석에 의해 확증되었다 (도 3).
1.4 pflB 유전자좌 - pflB의 표적화
대략 500 ng의 ΔpflB PCR 구축물 (1093 bp)을, ΔackA-pta::FRT, ΔadhE::FRT 및 ΔfrdABCD::FRT 변형을 정착시킨 Red/ET-적격 이. 콜라이 W 세포 내로 전기천공하였다. 8개의 KanR 형질전환체를, 게놈-특이적 프라이머를 사용하여 PCR함으로써 내성 마커 카세트의 정확한 통합에 대해 분석하였다. 4개의 클론을 FLP 재조합하였으며, 이는 물질 및 방법에 기재된 바와 같이 수행하였다 (데이터는 제시되지 않음).
클론 검증. pflB 유전자좌의 불활성화 및 카나마이신 내성 카세트의 제거는 남아있는 FRT 반흔 전반에 걸쳐 PCR함으로써 확증하였다. 정확한 PCR 신호를 생성한 1개 클론이 또한 서열분석에 의해 확증되었다 (도 4).
1.5 ldhA 유전자좌 - alaD-gstear의 녹인
대략 500 ng의 ΔldhA::alaD-gstear PCR 구축물 (1783 bp)을, ΔackA-pta::FRT, ΔadhE::FRT, ΔfrdABCD::FRT 및 ΔpflB::FRT 변형을 정착시킨 Red/ET-적격 이. 콜라이 W 세포 내로 전기천공하였다. 4개의 ZeoR 형질전환체를, 게놈-특이적 프라이머를 사용하여 PCR함으로써 내성 마커 카세트의 정확한 통합에 대해 분석하였다. 1개의 클론을 FLP 재조합하였으며, 이는 물질 및 방법에 기재된 바와 같이 수행하였다 (데이터는 제시되지 않음).
클론 검증. alaD-gstear의 통합 및 제오신 내성 카세트의 제거는 남아있는 FRT 반흔 전반에 걸쳐 PCR함으로써 확증하였다. 정확한 PCR 신호를 생성한 1개 클론이 또한 서열분석에 의해 확증되었다 (도 5).
실시예 2 알라닌의 HPLC 검출 및 정량화
세포 배양 배지에서 알라닌 검출을 위해 하기 HPLC 방법을 사용하였다:
칼럼: 아미넥스(Aminex) HPX-87C 칼럼 (바이오-라드(Bio-Rad)), 300 x 7.8 mm, i.d. 입자 크기 9 μm
이동상: 0.1 mol/L 90%의 Ca(NO3)2, 아세토니트릴 10%
유량: 0.6 mL/min
칼럼 온도: 60℃
검출: 굴절률 검출기.
상기 방법 하에, 세포 배양 샘플 매트릭스 내에서 평가된 주요 성분은 알라닌의 정량화를 방해하지 않으면서, 알라닌으로부터 잘 분리될 수 있다.
샘플 중 알라닌의 양은 외부 표준 보정 방법에 의해 결정하였다. 0.5 내지 10.0 g/L의 알라닌을 함유하는 표준 샘플을 주사하고, 보정을 위해 피크 면적을 사용하였다. 보정 곡선의 선형 회귀 계수는 0.9995였다.
샘플을 20 μL로 1회 주사하였다. 피크 면적을 사용하여, 워터스 LC 밀레니움(Waters LC Millenium) 소프트웨어에 의해 샘플 중에 존재하는 양을 계산하였다.
실시예 3 글루코스, 숙시네이트, 락테이트, 포르메이트, 아세테이트 및 에탄올의 HPLC 검출 및 정량화
사용된 HPLC 방법
칼럼: 아미넥스 HPX-87H 칼럼 (바이오-라드), 300 x 7.8 mm, i.d. 입자 크기 9 μm
이동상: H2SO4 4 mM
유량: 0.4 mL/min
칼럼 온도: 45℃
검출: 굴절률 검출기.
분석물의 양은 외부 표준 보정 방법에 의해 결정하였다. 0.1 내지 38.0 g/L의 글루코스, 0.05 내지 10.0 g/L의 숙시네이트, 락테이트, 포르메이트, 아세테이트 및 에탄올을 함유하는 표준 샘플을 주사하고, 보정을 위해 피크 면적을 사용하였다. 6개 모든 보정 곡선에 대한 선형 회귀 계수는 0.999 보다 우수하였다.
샘플을 20 μL로 1회 주사하였다. 피크 면적을 사용하여, 워터스 LC 밀레니움 소프트웨어에 의해 샘플 중에 존재하는 양을 계산하였다.
실시예 4 개선된 알라닌 수율을 위한 실시예 1로부터 유래된 이. 콜라이 W 줄기의 대사 진화
실시예 1에 기재된 바와 같은 모든 돌연변이를 포함하는 이. 콜라이 줄기 (이. 콜라이 Ex1 또는 QZ16으로 명명됨)를 대사 진화 절차에 사용하여, 이. 콜라이 Ex1 줄기의 알라닌 수율을 개선시켰다.
대사 진화는 하기와 같이 수행하였다: 제1 및 제2 진화 라운드에서, 5% 글루코스를 포함하는 NBS 배지에서 각각 500시간 및 750시간 동안 연속되는 진화를 수행하였다.
NBS 배지:
3.5 g KH2PO4
5.0 g K2HPO4
3.5 g (NH4)2HPO4
0.25 g MgSO4-7H2O
15 mg CaCl2-2H2O
0.5 mg 티아민
1 ml 미량 금속 스톡.
상기 미량 금속 스톡은 0.1 M HCl, 1.6 g FeCl3-6H2O; 0.2 g CoCl2-6H2O; 0.1 g CuCl2-2H2O; 0.2 g ZnCl2; 0.2 g NaMoO4-2H2O; 0.05 g H3BO3에서 제조하였다.
세포를 LB 플레이트 상에 스트리킹하고, 알라닌 수율에 대해 시험하였다. 가장 우수한 이. 콜라이 줄기 (이. 콜라이 Ev1 또는 QZ17)는 37℃에서 24 및 48 h 동안 5% 글루코스를 포함하는 NBS 배지를 사용한 발효에서, 80% - 83%를 생성하는 출발 줄기 이. 콜라이 Ex1의 알라닌 수율과 비교하여 84% - 86%의 알라닌 수율을 생성하였다.
이. 콜라이 Ev1을 추가 진화 단계에 사용하였으며, 이는 20일 동안 회분식 진화로서 수행되었다. 세포의 5%를 37℃에서 14% 글루코스를 포함하는 AM1 배지 중에서 24 h, 48 h, 72 h 등 마다 신선한 배지에 재접종하였다.
AM1 배지:
19.92 mm (NH4)2HPO4=2.6 g/L MW: 132.07
7.56 mm NH4H2PO4=0.87 g/L MW: 115
2.0 mm KCl=0.15 g/L MW: 74.55
1.5 mm MgSO4-7H2O=0.37 g/L MW: 246.5
15 g/L 황산암모늄을 최종 단계에 첨가하였다
1 mm 베타인
1 ml 미량 금속 스톡"
1 L 미량 금속 스톡을 제조하기 위해:
미량 금속 스톡을 0.12 M HCl, 2.4 g FeCl3-6H2O; 0.3 g CoCl2-6H2O; 0.21 g CuCl2-2H2O; 0.3 g ZnCl2; 0.27 g NaMoO4-2H2O; 0.068 g H3BO3; 0.5 g MnCl2-4H2O에서 제조하였다.
이러한 진화로부터, 줄기 이. 콜라이 Ev2 (QZ18로 또한 명명됨)를 단리하였다. 이러한 줄기를, 14% 글루코스를 포함하는 AM1 배지를 수반한 발효기에서 수행된 발효에서 시험하였다. 줄기 이. 콜라이 Ev2는 동일한 조건 하에 91% - 92%의 이. 콜라이 Ev1의 알라닌 수율과 비교하여 92% - 94%의 알라닌 수율을 가졌다.
12% 글루코스를 포함하는 AM1 배지에서 300 h 동안 추가의 회분식 진화 단계 및 12% 글루코스를 포함하는 AM1에서 후속 10회의 회분식 진화 단계 후에, 줄기 이. 콜라이 Ev3 (QZ20으로 또한 명명됨)을 단리하였다.
알라닌 수율에 대해 시험한 결과, 줄기 이. 콜라이 Ev3이 동일한 조건 하에 92% - 93%의 이. 콜라이 Ev2의 알라닌 수율과 비교하여, 12% 글루코스를 포함하는 AM1 배지에서 94% - 96%의 알라닌 수율을 갖는 것으로 밝혀졌다.
14% 글루코스를 포함하는 AM1 배지에서 1000 h의 기간 동안 상기 기재된 바와 같은 추가의 순차적 회분식 진화를 이. 콜라이 Ev3으로 수행하고, 줄기 이. 콜라이 Ev4 (QZ23으로 또한 명명됨)를 단리하였다. 이. 콜라이 Ev4를 14% 글루코스를 포함하는 AM1 배지에서 이. 콜라이 Ev3과 비교하여 시험하였다. 줄기 이. 콜라이 Ev4는 46 h의 발효 후의 줄기 이. 콜라이 Ev3의 1.0 -1.3 g(/Lh)과 비교하여, 2.0-2.4 g/(Lh)의 증가된 알라닌 생산성 (공간-시간-수율) (생성된 산물의 양을 반응기 부피 및 시간으로 나눈 것으로 정의됨)을 나타냈다.
실시예 5 이. 콜라이 Ev3과 비교하여 줄기 이. 콜라이 Ev4에서의 돌연변이의 결정
이. 콜라이 줄기 이. 콜라이 Ev4 및 이. 콜라이 Ev3의 게놈을 서열분석하였고, 그 결과를 비교하여, 줄기 이. 콜라이 Ev4의 증가된 알라닌 생산성을 유발하는 돌연변이를 결정하였다.
줄기 이. 콜라이 Ev3에서 서열 2를 갖는 단백질을 코딩하는 서열 1로부터의 brnQ 유전자의 서열이, 줄기 이. 콜라이 Ev4에서 서열 4를 갖는 단백질을 코딩하는 서열 3으로 변화된 brnQ 유전자 내에서의 돌연변이를 확인하였다.
추가로, 줄기 이. 콜라이 Ev3에서 서열 46을 갖는 단백질을 코딩하는 서열 45로부터의 argP 유전자의 서열이, 줄기 이. 콜라이 Ev4에서 서열 48을 갖는 단백질을 코딩하는 서열 47로 변화된 argP 유전자 내에서의 돌연변이를 확인하였다.
추가로, 줄기 이. 콜라이 Ev3에서 서열 55로부터의 gcvA 유전자의 프로모터의 서열이, 줄기 이. 콜라이 Ev4에서 서열 56으로 변화된 gcvA 유전자의 프로모터 내에서의 돌연변이를 확인하였다. 또한 증진된 알라닌 수율을 나타내는 독립적 균주에서, 서열 55에서 서열 57까지의 gcvA 유전자의 프로모터의 서열을 변화시키는 또 다른 돌연변이를 확인하였다.
추가로, 줄기 이. 콜라이 Ex1에서 서열 59로부터의 gcvB 유전자의 프로모터의 서열이, 줄기 이. 콜라이 Ev1에서 서열 60으로 변화된 gcvB 유전자의 프로모터 내에서의 돌연변이를 확인하였다. 증가된 알라닌 수율을 나타내는 또 다른 독립적 균주에서, 서열 59에서 서열 61까지의 gcvB 유전자의 프로모터 서열을 변화시키는 상기 프로모터에서의 또 다른 돌연변이를 확인하였다.
추가로, 줄기 이. 콜라이 Ev3에서 서열 50을 갖는 단백질을 코딩하는 서열 49로부터의 lpxD 유전자의 서열이, 줄기 이. 콜라이 Ev4에서 서열 52를 갖는 단백질을 코딩하는 서열 51로 변화된 lpxD 유전자 내에서의 돌연변이를 확인하였다.
알라닌 수율 및 생산성을 위해 확인된 돌연변이의 중요성을 결정하기 위해, 실시예 1에 기재된 바와 같은 돌연변이 및 PCT/IB2014/064426에 기재된 바와 같은 돌연변이를 포함하며 또한 상기 기재된 바와 같은 ygaW 유전자, zipA 유전자, lpd 유전자에서의 돌연변이 및 alaD 유전자의 발현을 제어하는 프로모터에서의 돌연변이를 포함하는 이. 콜라이 균주 내로 돌연변이를 순차적으로 도입하였다. 이들 돌연변이를 알라닌 생산성에 대한 그의 효과에 대해 평가하였다. 돌연변이된 유전자 또는 돌연변이된 프로모터 영역의 제어 하의 유전자의 발현 수준을 qPCR에 의해 모니터링하였다.
실시예 6 argP (iciA) 유전자에서의 SNP의 효과의 확증
ArgP (또는 iciA)는 전사 조절제이다. 아르기닌 수송 시스템에 수반되는 유전자 및 DNA 복제에 수반되는 유전자를 제어한다. ArgP 단백질에서의 A96E 돌연변이를 유발하는 SNP를 이. 콜라이 QZ23에서 확인하고, 알라닌 생산성에 대한 그의 효과에 대해 평가하였다.
이. 콜라이 QZ48의 균주 구축
선택성 클로람페니콜 내성 마커 및 역선택성 sacB 마커 (수크로스 감수성을 부여함)를 갖는 argP-cat-sacB 카세트를, 푸션 핫 스타트(Phusion Hot Start) 고충실도 DNA 폴리머라제 (써모(Thermo))를 사용하여 프라이머 argP_1_F 및 argP_1_R (표 1 참조)을 사용하여 주형 벡터 pQZ11 (진스크립트)로부터 증폭시켰다. PCR 산물을 37℃에서 1h 동안 DpnI (NEB) 소화시켜 플라스미드 주형 배경을 감소시키고, 퀴아퀵(QIAquick) 겔 추출 키트 (퀴아젠)를 사용하여 1% 아가로스 겔로부터 겔 추출하였다. argP SNP 카세트 (543 bp)를 푸션 핫 스타트 고충실도 DNA 폴리머라제 (써모)를 사용하여 프라이머 argP_2_F 및 argP_2_R (표 1 참조)을 사용하여 QZ23 게놈 DNA로부터 증폭시키고, 퀴아퀵 PCR 정제 키트 (퀴아젠)로 정제하였다.
Red/ET 재조합을 위해, 진브리지스 Red/ET 재조합 키트를 제조업체의 프로토콜에 따라 사용하였다. 대략 200 ng의 argP-cat-sacB를 Red/ET-적격 이. 콜라이 QZ20 세포 내로 전기천공하였다. 전기천공 후의 양성 형질전환체의 선택을 위해 10 ug/mL 클로람페니콜을 갖는 LB 한천 플레이트 상에 배양물을 플레이팅하였다. 여러 콜로니를 게놈-특이적 프라이머 argP_seq_F 및 argP_seq_R (표 1 참조)을 사용하여 PCR에 의해 마커 카세트의 통합에 대해 스크리닝하였다. PCR 확증된 클론을 argP SNP 카세트와의 제2의 Red/ET 재조합에 사용하여 cat-sacB 마커 카세트를 대체하였다. 전기천공 후의 양성 형질전환체의 선택을 위해 NaCl 없이 6% 수크로스를 갖는 LB 한천 플레이트 상에 배양물을 플레이팅하였다. 여러 클론을 게놈-특이적 프라이머 argP_seq_F 및 argP_seq_R (표 1 참조)을 사용하여 cat-sacB 마커 카세트의 상실에 대해 시험하였다. 정확한 크기의 PCR 산물을 생성한 적어도 1개의 클론을 또한 서열분석함으로써 확증하였다 (진위즈(Genewiz)). 균주를 생물반응기에서 시험하기 전에, 열-감수성 재조합조작 플라스미드 pRedET (amp)를 LB 플레이트 상에서 밤새 42℃에서 균주로부터 큐어링하였다. ArgP A96E 돌연변이를 유발하는 SNP를 균주 이. 콜라이 QZ20 내로 도입하였다. 생성된 균주를 QZ48로 지정하였다.
이. 콜라이 QZ48과 비교한 이. 콜라이 QZ20의 발효 시험
이. 콜라이 균주 QZ48을, 실험실 규모 생물반응기에서의 발효 동안 그의 성능에 대해 시험하였다. 세포 성장 및 알라닌 형성을 이. 콜라이 균주 QZ20과 비교하여 모니터링하였다.
37℃ 및 200 rpm에서 밤새 LB 배지, 20% 충전 부피를 갖는 진탕 플라스크에서 예비배양물을 성장시켰다. 발효는 500 mL AM 1 배지 (2.6 g/L (NH4)2HPO4, 0.87 g/L NH4H2PO4, 0.15 g/L 킬(Kill), 0.37 g/L MgSO4 · 7 H2O, 15 g/L (NH4)2SO4, 1 mM 베타인, 1 ml/L 미량 금속 스톡 용액)에서 DASGIP 1.5 L 병렬 생물반응기 시스템 (에펜도르프(Eppendorf))에서 수행하였다. 미량 금속 스톡은 1.6 g/L FeCl3 · 6 H2O; 0.2 g/L CoCl2 · 6 H2O; 0.1 g/L CuCl2 · 2 H2O; 0.2 g/L ZnCl2; 0.2 g/L NaMoO4 · 2 H2O; 0.05 g/L H3BO3, 0.1 M HCl로 구성되었다. 140 g/L 글루코스를 발효 배지에서의 탄소 공급원으로서 사용하였다.
7의 OD600·mL에 등가인 이. 콜라이 세포를 원심분리를 통해 수거하고 5 mL AM 1 배지에 재현탁시켰다. # OD600·mL = (희석되지 않은 배양물의 OD600) x (배양물 부피 mL). 재현탁된 세포 5 mL를 사용하여 500 mL 발효 배지를 1.5 L DASGIP 생물반응기에 접종하였다. 각 균주를 37℃ 및 400 rpm 교반기 속도 하에 이중으로 실행하였다. 5 N NH4OH를 사용하여 pH를 6.8로 제어하고 발효 과정 내내 알라닌 전구체로서 암모늄을 상기 배양물에 제공하였다. 발효 동안에는 공기를 살포하지 않았으며, 용기를 가압시키지 않아, 세포에 의한 배지 중 용존 산소의 초기 소모 후에는, 발효를 미세호기성 조건 하에 실행하였다. 샘플을 발효 내내 취하고, 알라닌 및 글루코스 농도에 대해 HPLC에 의해 분석하였다.
QZ48에서의 ArgP A96E 돌연변이는 알라닌 형성에 강한 영향을 미쳤다 (도 7). 46 h 후 QZ20의 부피 알라닌 생산성 (공간-시간-수율) (생성된 산물의 양을 반응기 부피 및 시간으로 나눈 것으로 정의됨)은 1.15 ± 0.06 g/(Lh)였다. 이. 콜라이 QZ48은 46 h 후에 1.51 ± 0.01 g/(Lh)의 증가된 부피 알라닌 생산성을 나타냈다 (도 8).
pACYC184-argP 플라스미드의 구축
argP 과다발현의 영향을 시험하기 위해, 상업용 인퓨전(InFusion) 클로닝 기술 (클론텍(Clontech), 미국 캘리포니아주 마운틴 뷰)을 통해 플라스미드 pACYC184-argP (p15 ori, CmR, 세포당 ~15개 카피)를 구축하였다. 먼저, 벡터 pACYC184 (표 1)를 NEB (미국 매사추세츠주 입스위치)를 통해 수득하였고, HindIII 및 SalI 제한 엔도뉴클레아제 (또한 NEB로부터 수득함)로 선형화하였다. 이러한 소화로 테트라시클린-내성 유전자의 대부분을 제거하였다. 개별적으로, argP ORF는 프라이머 argP-pACYC_F 및 argP-pACYC_R (표 1)을 사용하여 푸션 폴리머라제 (써모 사이언티픽, 매사추세츠주 월섬)를 사용하여 야생형 이. 콜라이 W DNA로부터 PCR 증폭시켰다.
프라이머는 선형화된 벡터 말단에 상동인 추가의 15 bp 오버행을 함유하여 매끄러운 클로닝이 용이하게 하였다. 이어서, 정제된 선형화 벡터 백본 및 argP 삽입물 둘 다를 사용하여 제조업체의 프로토콜에 따라 상기 인퓨전 반응을 수행하였다. 이어서, 생성된 인퓨전 산물을, LB 클로람페니콜 플레이트 상에서 전기천공 및 선택을 통해 QZ20을 형질전환시키는데 사용하였다. 양성 클론을 PCR 확인하였고, DNA 서열분석에 의해 확증하였으며, 과다발현 연구를 위해 발효에 사용하였다.
QZ20/pACYC184와 QZ20/pACYC184-argP 사이의 발효 비교
37℃ 및 200 rpm에서 밤새 LB 배지, 20% 충전 부피를 갖는 진탕 플라스크에서 예비배양물을 성장시켰다. AM 1 배지에 14% 글루코스를 갖는 DASGIP 1.5 L 병렬 생물반응기 시스템에서 발효를 수행하였다. 모든 발효 조건은 상기 기재된 바와 같았다.
argP 과다발현은 발효 20 h 후에 가속된 알라닌 형성 비율 및 보다 높은 알라닌 역가를 유발하였다 (도 9). 20 h 후 QZ20/pACYC-argP의 부피 알라닌 생산성 (공간-시간-수율) (생성된 산물의 양을 반응기 부피 및 시간으로 나눈 것으로 정의됨)은 pACYC184 플라스미드 대조군을 갖는 균주의 0.61 ± 0.02 g/(Lh)와 비교하여 0.69 ± 0.04 g/(Lh)였다 (도 10).
실시예 7 gcvA / gcvB 프로모터 영역에서의 SNP의 효과의 확증
QZ58 및 QZ66의 균주 구축
gcvA-cat-sacB 카세트를 프라이머 gcvA_1_F/R (표 1)을 사용하여 벡터 pQZ11 (진스크립트)로부터 증폭시켰다. gcvA/B SNP 카세트 (320 bp)를 프라이머 gcvA_2_F/R (표 1)을 사용하여 균주 QZ23의 게놈 DNA로부터 증폭시켰다. Red/ET를 이전에 기재된 바와 같이 수행하였다. gcvA_seq_F/R 서열분석 프라이머를 사용하여 콜로니 PCR함으로써 클론을 시험하였다. gcvA/B 프로모터 영역에서의 SNP를 이. 콜라이 QZ20 내로 도입하고, 생성된 균주를 QZ58로 지정하였다. SNP를 또한 QZ48 내로 도입하고 (argP SNP), 생성된 균주를 QZ66으로 지정하였다.
QZ58 및 QZ66의 발효 시험
균주 QZ58 (gcvA/B 프로모터 SNP)을 이전에 기재된 바와 같이 발효 동안 그의 성능에 대해 시험하였다. 알라닌 형성을 균주 QZ20과 비교하여 모니터링하였다.
gcvA/B 프로모터 SNP는 알라닌 형성에 대해 유의한 영향을 가졌으며, 46 h 후에 QZ20에 의해 생산된 약 54 g/L과 비교하여 약 76 g/L 알라닌의 알라닌 역가 및 보다 높은 알라닌 형성 비율을 생성하였다 (도 11). QZ58의 부피 알라닌 생산성은 46 h 후에 QZ20에서의 1.15 ± 0.06 g/(Lh)와 비교하여 1.66 ± 0.02 g/(Lh)였다 (도 12).
gcvA/B 프로모터 SNP를 또한 QZ48에서 argP SNP의 상단에 부가하였고, 생성된 균주 QZ66을 QZ48과 비교하여 알라닌 발효 동안 시험하였다. QZ66에서 argP 돌연변이의 상단에서의 추가의 gcvA/B 프로모터 돌연변이는 QZ48과 비교하여 보다 빠른 알라닌 형성 비율 및 46 h 후에 QZ48에서의 약 70 g/L와 비교하여 약 76 g/L의 보다 높은 알라닌 수율을 유발하였다 (도 13). QZ66의 부피 알라닌 생산성은 46 h 후에 QZ48의 1.51 ± 0.01 g/(Lh)와 비교하여 1.65 ± 0.08 g/(Lh)였다 (도 14).
gcvA 및 gcvB 전사 수준의 RT-qPCR 분석
gcvA 및 gcvB의 전사 수준은 정량적 역전사 PCR (RT-qPCR)을 통해 결정하였다. 바이오라드로부터의 iTaq 범용 1-단계 키트를 SYBR 그린-기반 1-단계 역전사 (RT)-qPCR 반응에 사용하였다. 이전에 기재된 바와 같이 수행되었던 이. 콜라이 QZ20 및 이. 콜라이 QZ23의 병렬 회분식 발효로부터, 배양 샘플을 8 h, 11 h 및 28 h에 취하였다. 샘플을 RNA프로텍트 박테리아 시약 (퀴아젠)으로 즉시 처리하여 RNA를 안정화시켰다. RNA를 아우룸토탈(AurumTotal) RNA 미니 키트 (바이오라드)를 사용하여 제조업체의 매뉴얼에 따라 샘플로부터 추출하였다. 단리된 RNA를 DNA-무함유 DNA 제거 키트 (라이프 테크놀로지(life technologies))로 추가로 처리하여 오염성 게놈 DNA를 제거하고 qPCR 동안 배경을 감소시켰다. RNA를 λ = 260 nm에서 분광광도측정으로 정량화하였다.
100 ng 이. 콜라이 QZ20 RNA의 일련의 7-단계 10배 희석을 다음 RT-qPCR 프라이머 (표 1)인, gcvA 유전자에 대한 gcvA_RT_F/R, gcvB 조절 RNA에 대한 gcvB_RT_F/R 및 리보솜 16 S RNA 코딩 rrsA 유전자 (이는 qPCR 시험 동안 참조 유전자로서의 역할을 함)에 특이적인 rrsA_RT_F 및 rrsA_RT_R을 사용하여 시험하였다. 신호 증폭 효율 90% < E < 110% 및 선형 회귀 인자 R2 > 0.985로 이어지는 RNA 희석물의 적합한 선형 동적 범위를 각각의 RT-qPCR 프라이머 세트에 대해 결정하였다. rrsA가 정규화를 위한 내부 참조 유전자로서 적합한지에 대해 시험하였고, 그 결과 시험된 모든 샘플 중에서 안정하게 발현되는 것으로 밝혀졌다 (데이터는 제시되지 않음). CFX96 터치 실시간 PCR 검출 시스템 (바이오라드)을 제조업체의 프로토콜에 따라 사용하여 RT-qPCR 반응을 수행하였다. ΔΔCt 방법에 따라 내부 보정인자로서 이. 콜라이 QZ20 8h RNA를 사용하여 유전자 발현의 상대 정량화를 계산하였다 (Livak and Schmittgen 2001).
qPCR 결과는 8h 및 11h의 발효 후에 지수기 동안 QZ20과 비교하여 QZ23에서의 gcvA의 과다발현을 확증해 주었다. 28h 샘플에서 세포 밀도가 감소하는 경우에 gcvA의 하향조절이 관찰되었다 (도 15a). gcvB 조절 단백질은 8h 및 11h의 발효 후에 지수기 동안 QZ20과 비교하여 QZ23에서 하향조절되었다. 28h 샘플에서 세포 밀도가 감소하는 경우에 gcvB 전사의 전체 하향조절이 관찰되었다 (도 15b).
pACYC184-gcvA 및 pACYC184-gcvB 플라스미드의 구축
gcvA/B 프로모터 SNP가 gcvA의 과다발현을 유발하였기 때문에, 실제로 gcvA 과다발현이 알라닌 생산성을 증가시켰는지를 확증할 필요가 있었다. 따라서 플라스미드 pACYC184-gcvA를 상업용 인퓨전 클로닝 기술 (클론테크, 미국 캘리포니아주 마운틴 뷰)을 통해 구축하였다. 먼저, 벡터 pACYC184 (표 1)를 NEB (미국 매사추세츠주 입스위치)를 통해 수득하였고, HindIII 및 SalI 제한 엔도뉴클레아제 (또한 NEB로부터 수득함)로 선형화하였다. 이러한 소화로 테트라시클린-내성 유전자의 대부분을 제거하였다. 개별적으로, gcvA ORF는 프라이머 gcvA-pACYC_F 및 gcvA-pACYC_R (표 1)을 사용하여 푸션 폴리머라제 (써모 사이언티픽, 매사추세츠주 월섬)를 사용하여 야생형 이. 콜라이 W DNA로부터 PCR 증폭시켰다. gcvB 과다발현의 효과를 시험하기 위해 마찬가지로 플라스미드 pACYC184-gcvB를 구축하였다. gcvB 전사 단위를 프라이머 gcvB-pACYC_F 및 gcvB-pACYC_R (표 1)을 사용하여 PCR 증폭시켰다.
프라이머는 선형화된 벡터 말단에 상동인 추가의 15 bp 오버행을 함유하여 매끄러운 클로닝이 용이하게 하였다. 이어서, 정제된 선형화 벡터 백본 및 각각 gcvA 및 gcvB 삽입물 둘 다를 사용하여 제조업체의 프로토콜에 따라 상기 인퓨전 반응을 수행하였다. 이어서, 생성된 인퓨전 산물을, LB 클로람페니콜 플레이트 상에서 전기천공 및 선택을 통해 QZ20을 형질전환시키는데 사용하였다. 양성 클론을 PCR 확인하였고, DNA 서열분석에 의해 확증하였으며, 과다발현 연구를 위해 발효에 사용하였다.
QZ20/pACYC184, QZ20/pACYC184-gcvA 및 QZ20/pACYC-gcvB 사이의 발효 비교
37℃ 및 200 rpm에서 밤새 LB 배지, 20% 충전 부피를 갖는 진탕 플라스크에서 예비배양물을 성장시켰다. AM 1 배지에 14% 글루코스를 갖는 DASGIP 1.5 L 병렬 생물반응기 시스템에서 발효를 수행하였다. 모든 발효 조건은 상기 기재된 바와 같았다.
발효 시험은 플라스미드 pACYC184-gcvA로부터의 gcvA의 과다발현이 빈 플라스미드 대조군과 비교하여 보다 높은 알라닌 형성 비율 및 역가를 유발한다는 것을 확증해 주었다 (도 16). 대조적으로, 플라스미드 pACYC184-gcvB로부터의 gcvB 소형 조절 RNA의 과다발현은 알라닌 형성 비율 및 역가의 유의한 감소를 유발하였다. 이. 콜라이 QZ20/pACYC184-gcvA는 플라스미드 대조군을 갖는 QZ20의 1.18 ± 0.08 g/(Lh)와 비교하여 1.50 ± 0.09 g/(Lh)의 부피 알라닌 생산성을 나타냈다. 이. 콜라이 QZ20/pACYC184-gcvB는 플라스미드 대조군과 비교하여 0.89 ± 0.01 g/(Lh)의 감소된 부피 알라닌 생산성을 나타냈다 (도 17).
QZ20 gcvB 녹아웃 QZ71의 균주 구축
플라스미드 pACYC184-gcvB로부터의 조절 RNA gcvB의 과다발현이 알라닌 생산성의 유의한 감소를 유발하였기 때문에, gcvB를 QZ20에서 녹아웃시키고 성능에 대해 시험하였다. gcvB-cat-sacB 카세트를 프라이머 gcvB_1_F/R (표 1)을 사용하여 벡터 pQZ11 (진스크립트)로부터 증폭시켰다. IDT로부터 dsDNA gBlock으로서 gcvB 결실 카세트 (400 bp) (서열 98)를 주문하였다. Red/ET를 이전에 기재된 바와 같이 수행하였다. gcvB_seq_F/R 서열분석 프라이머를 사용하여 콜로니 PCR함으로써 클론을 시험하였다. gcvB 결실을 이. 콜라이 QZ20 내로 도입하고, 생성된 균주를 QZ71로 지정하였다.
QZ71의 발효 시험
균주 QZ71 (gcvB 녹아웃)을 이전에 기재된 바와 같이 발효 동안 그의 성능에 대해 시험하였다. 알라닌 형성을 균주 QZ20과 비교하여 모니터링하였다.
QZ20으로부터의 gcvB 조절 RNA의 결실은 QZ20과 비교하여 알라닌 역가의 약간의 증가를 유발하였다 (도 18). QZ71의 부피 알라닌 생산성은 46 h 후에 QZ20의 1.15 ± 0.06 g/(Lh)와 비교하여 1.28 ± 0.05 g/(Lh)였다 (도 19).
실시예 8 brnQ 유전자에서의 결실 (Δ667-764)의 효과 확증
BrnQ는 나트륨/분지쇄 아미노산 공수송체로서 세포 내로 류신, 발린 및 이소류신을 수송하는 추정 439 AA 분지쇄 아미노산 수송체이다. QZ23에서 리딩 프레임 시프트를 야기하는 97 bp 결실 (Δ667-764)을 확인하였다. 439 AA 단백질의 처음 222개의 아미노산은 변경되지 않았만, 31개의 아미노산은 프레임 시프트로 인해 변화되고, 나머지 C-말단 쇄는 발생한 정지 코돈으로 인해 말단절단되었다. QZ23 내 brnQ 유전자에서 발견된 97 bp 부분적 결실이 제거된 BrnQ 활성을 유발하는 것으로 가정되었기 때문에, brnQ 유전자의 완전한 결실 (녹아웃)을 부분적 brnQ 결실에 추가로 시험하였다.
QZ57 및 QZ69의 균주 구축
brnQ-cat-sacB 카세트를 프라이머 brnQ_1_F/R (표 1)을 사용하여 벡터 pQZ11 (진스크립트)로부터 증폭시켰다. brnQ 부분적 결실 카세트 (462 bp)를 프라이머 brnQ_2_F/R (표 1)을 사용하여 균주 QZ23의 게놈 DNA로부터 증폭시켰다. IDT로부터 dsDNA gBlock으로서 brnQ KO 카세트 (500 bp) (서열 117)를 주문하였다. Red/ET를 이전에 기재된 바와 같이 수행하였다. brnQ_seq_F/R 서열분석 프라이머를 사용하여 콜로니 PCR함으로써 클론을 시험하였다. brnQ 부분적 결실을 이. 콜라이 QZ20 내로 도입하고, 생성된 균주를 QZ57로 지정하였다. brnQ 완전한 결실을 이. 콜라이 QZ20 내로 도입하고, 생성된 균주를 QZ69로 지정하였다.
QZ57 및 QZ69의 발효 시험
균주 QZ57 (brnQ Δ667-764) 및 QZ69 (brnQ KO)를 이전에 기재된 바와 같이 발효 동안 그의 성능에 대해 시험하였다. 알라닌 형성을 균주 QZ20과 비교하여 모니터링하였다.
QZ57에서의 97 bp brnQ 결실 및 완전한 brnQ 녹아웃은 대등한 성능을 가졌다. 둘 다 QZ20보다 더 높은 알라닌 형성 및 알라닌 역가를 유발하였다 (도 20). QZ57의 부피 알라닌 생산성은, 46 h 후에 QZ20에서의 1.15 ± 0.06 g/(Lh)와 비교하여 1.30 ± 0.04 g/(Lh)였고, QZ69의 생산성은 1.28 g/(Lh)였다 (도 21).
실시예 9 lpxD 유전자에서의 SNP의 효과 확증
QZ23에서 코딩되는 효소의 A15T 돌연변이를 유발하는 lpxD 유전자에서의 SNP가 검출되었다. LpxD에 의해 코딩되는 UDP-3-O-(3-히드록시미리스토일) 글루코사민-N-아세틸트랜스퍼라제는 지질 A의 생합성에 수반되는 본질적 효소이다. 지질 A는 이. 콜라이 외막 리포폴리사카라이드 (LPS)의 필수 부분이다.
QZ56 및 QZ70의 균주 구축
lpxD-cat-sacB 카세트를 프라이머 lpxD_1C_F/R (표 1)을 사용하여 벡터 pQZ11 (진스크립트)로부터 증폭시켰다. lpxD SNP 카세트 (2588 bp)를 프라이머 lpxD_fix_F/R (표 1)을 사용하여 균주 QZ23의 게놈 DNA로부터 증폭시켰다. Red/ET를 이전에 기재된 바와 같이 수행하였다. lpxD_flank_F/R 서열분석 프라이머를 사용하여 콜로니 PCR함으로써 클론을 시험하였다. lpxD SNP를 이. 콜라이 QZ20 내로 도입하고, 생성된 균주를 QZ56으로 지정하였다. lpxD SNP를 또한 QZ68 내로 도입하고 (argP SNP, gcvA/B 프로모터 SNP, brnQ Δ667-764), 생성된 균주를 QZ70으로 지정하였다.
QZ56 및 QZ70의 발효 시험
균주 QZ56 (lpxD SNP)을 이전에 기재된 바와 같이 발효 동안 그의 성능에 대해 시험하였다. 알라닌 형성을 균주 QZ20과 비교하여 모니터링하였다. QZ56에서의 LpxD A15T 돌연변이는 QZ20과 비교하여 증가된 알라닌 역가를 유발하였다 (도 22). QZ56의 부피 알라닌 생산성은 46 h 후에 QZ20에서 1.15 ± 0.06 g/(Lh)와 비교하여 1.34 ± 0.06 g/(Lh)였다 (도 23).
lpxD SNP를 또한 QZ68 내로 도입하고 (argP SNP, gcvA/B 프로모터 SNP, brnQ Δ667-764), 생성된 균주 QZ70을 QZ68과 비교하여 알라닌 발효 동안 시험하였다. LpxD A15T 돌연변이는 알라닌 형성에 대해 강한 영향을 미쳤다. QZ68과 QZ70 사이의 알라닌 형성 비율은 대등하였으나, QZ68의 알라닌 역가는 대략 75 g/L에서 정체되었으며, 반면에 QZ70에서 알라닌 형성은 배지 중 모든 글루코스가 소모될 때까지 계속되었고, 약 37 h 후에 102 g/L의 알라닌 역가에 도달하였다 (도 24). QZ70의 부피 알라닌 생산성은 46 h 후에 QZ68의 1.64 ± 0.03 g/(Lh)와 비교하여 2.24 ± 0.002 g/(Lh)였다 (도 25).
SEQUENCE LISTING <110> BASF SE <120> Recombinant microorganism for improved production of fine chemicals <130> PF 76461 <150> US 61/915517 <151> 2013-12-13 <150> US 61/915527 <151> 2013-12-13 <150> US 61/915518 <151> 2013-12-13 <150> US 61/915534 <151> 2013-12-13 <150> EP 13197432.1 <151> 2013-12-16 <160> 117 <170> According WIPO Sd. 25 <210> 1 <211> 1320 <212> DNA <213> E. coli <220> <223> brnQ <400> 1 atgacccatc aattaagatc gcgcgatatc atcgctctgg gctttatgac atttgcgttg 60 ttcgtcggcg caggtaacat tattttccct ccaatggtcg gcttgcaggc aggcgaacac 120 gtctggactg cggcattcgg cttcctcatt actgccgttg gcctgccggt attaacggta 180 gtggcgctgg caaaagttgg cggcggtgtt gacagcctca gcacgccaat cggtaaagtc 240 gctggcgtgc tgctggcaac ggtttgttac ctggcggtgg ggccgctttt cgctacgccg 300 cgtacagcta ccgtttcctt tgaagtgggg attgcgccgc tgacgggtga ttccgcgctg 360 ccgctgttta tctacagcct ggtctatttc gctatcgtta ttctggtttc gctctatccg 420 ggcaagctgc tggataccgt gggcaacttc cttgcgccgc tgaaaattat cgcgctggtc 480 atcctgtctg ttgccgcgat tgtctggccg gcgggttcta tcagcacggc gactgaggct 540 tatcaaaacg ctgcgttttc taacggcttc gttaacggct atctgaccat ggatacgctg 600 ggcgcaatgg tgtttggtat cgttattgtt aacgcggcgc gttctcgtgg cgttaccgaa 660 gcgcgtctgc tgacccgtta taccgtctgg gctggcctga tggcgggtgt tggtctgact 720 ctgctgtacc tggcgctgtt ccgtctgggt tcagacagcg cgtcgctggt cgatcagtct 780 gcaaacggcg ctgctattct gcatgcttac gttcagcaca cctttggcgg cggcggtagc 840 ttcctgctgg cggcgttaat cttcatcgcc tgcctggtaa cggcagttgg cctgacctgt 900 gcttgtgcag aattctttgc ccagtacgta ccgctctctt atcgtacgct ggtgtttatc 960 ctcggcggct tctcgatggt ggtttctaac ctcggcttaa gccagctgat ccagatctcc 1020 gtaccggtgc tgaccgctat ttatccgccg tgtatcgcac tggttgtatt aagttttaca 1080 cgctcatggt ggcataattc gtcccgcgtg attgctccgc cgatgtttat cagcctgctt 1140 tttggtattc tcgacgggat caaagcatct gcattcagcg atatcttacc gtcctgggcg 1200 cagcgtttac cgctggccga acaaggtctg gcgtggttaa tgccaacagt ggtgatggtg 1260 gttctggcca ttatctggga tcgcgcggca ggtcgtcagg tgacctccag cgctcactaa 1320 <210> 2 <211> 439 <212> PRT <213> E. coli <220> <223> brnQ <400> 2 Met Thr His Gln Leu Arg Ser Arg Asp Ile Ile Ala Leu Gly Phe Met 1 5 10 15 Thr Phe Ala Leu Phe Val Gly Ala Gly Asn Ile Ile Phe Pro Pro Met 20 25 30 Val Gly Leu Gln Ala Gly Glu His Val Trp Thr Ala Ala Phe Gly Phe 35 40 45 Leu Ile Thr Ala Val Gly Leu Pro Val Leu Thr Val Val Ala Leu Ala 50 55 60 Lys Val Gly Gly Gly Val Asp Ser Leu Ser Thr Pro Ile Gly Lys Val 65 70 75 80 Ala Gly Val Leu Leu Ala Thr Val Cys Tyr Leu Ala Val Gly Pro Leu 85 90 95 Phe Ala Thr Pro Arg Thr Ala Thr Val Ser Phe Glu Val Gly Ile Ala 100 105 110 Pro Leu Thr Gly Asp Ser Ala Leu Pro Leu Phe Ile Tyr Ser Leu Val 115 120 125 Tyr Phe Ala Ile Val Ile Leu Val Ser Leu Tyr Pro Gly Lys Leu Leu 130 135 140 Asp Thr Val Gly Asn Phe Leu Ala Pro Leu Lys Ile Ile Ala Leu Val 145 150 155 160 Ile Leu Ser Val Ala Ala Ile Val Trp Pro Ala Gly Ser Ile Ser Thr 165 170 175 Ala Thr Glu Ala Tyr Gln Asn Ala Ala Phe Ser Asn Gly Phe Val Asn 180 185 190 Gly Tyr Leu Thr Met Asp Thr Leu Gly Ala Met Val Phe Gly Ile Val 195 200 205 Ile Val Asn Ala Ala Arg Ser Arg Gly Val Thr Glu Ala Arg Leu Leu 210 215 220 Thr Arg Tyr Thr Val Trp Ala Gly Leu Met Ala Gly Val Gly Leu Thr 225 230 235 240 Leu Leu Tyr Leu Ala Leu Phe Arg Leu Gly Ser Asp Ser Ala Ser Leu 245 250 255 Val Asp Gln Ser Ala Asn Gly Ala Ala Ile Leu His Ala Tyr Val Gln 260 265 270 His Thr Phe Gly Gly Gly Gly Ser Phe Leu Leu Ala Ala Leu Ile Phe 275 280 285 Ile Ala Cys Leu Val Thr Ala Val Gly Leu Thr Cys Ala Cys Ala Glu 290 295 300 Phe Phe Ala Gln Tyr Val Pro Leu Ser Tyr Arg Thr Leu Val Phe Ile 305 310 315 320 Leu Gly Gly Phe Ser Met Val Val Ser Asn Leu Gly Leu Ser Gln Leu 325 330 335 Ile Gln Ile Ser Val Pro Val Leu Thr Ala Ile Tyr Pro Pro Cys Ile 340 345 350 Ala Leu Val Val Leu Ser Phe Thr Arg Ser Trp Trp His Asn Ser Ser 355 360 365 Arg Val Ile Ala Pro Pro Met Phe Ile Ser Leu Leu Phe Gly Ile Leu 370 375 380 Asp Gly Ile Lys Ala Ser Ala Phe Ser Asp Ile Leu Pro Ser Trp Ala 385 390 395 400 Gln Arg Leu Pro Leu Ala Glu Gln Gly Leu Ala Trp Leu Met Pro Thr 405 410 415 Val Val Met Val Val Leu Ala Ile Ile Trp Asp Arg Ala Ala Gly Arg 420 425 430 Gln Val Thr Ser Ser Ala His 435 <210> 3 <211> 1223 <212> DNA <213> E. coli <220> <223> brnQ Mut <400> 3 atgacccatc aattaagatc gcgcgatatc atcgctctgg gctttatgac atttgcgttg 60 ttcgtcggcg caggtaacat tattttccct ccaatggtcg gcttgcaggc aggcgaacac 120 gtctggactg cggcattcgg cttcctcatt actgccgttg gcctgccggt attaacggta 180 gtggcgctgg caaaagttgg cggcggtgtt gacagcctca gcacgccaat cggtaaagtc 240 gctggcgtgc tgctggcaac ggtttgttac ctggcggtgg ggccgctttt cgctacgccg 300 cgtacagcta ccgtttcctt tgaagtgggg attgcgccgc tgacgggtga ttccgcgctg 360 ccgctgttta tctacagcct ggtctatttc gctatcgtta ttctggtttc gctctatccg 420 ggcaagctgc tggataccgt gggcaacttc cttgcgccgc tgaaaattat cgcgctggtc 480 atcctgtctg ttgccgcgat tgtctggccg gcgggttcta tcagcacggc gactgaggct 540 tatcaaaacg ctgcgttttc taacggcttc gttaacggct atctgaccat ggatacgctg 600 ggcgcaatgg tgtttggtat cgttattgtt aacgcggcgc gttctcgtgg cgttaccgaa 660 gcgcgtcgct ggtcgatcag tctgcaaacg gcgctgctat tctgcatgct 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caactggaaa atatgttcgg gcagccgctg ttggtgcgta ccgtaccgcc gcgcccgacg 180 gaacaagggc aaaaactgct ggcactgctg cgccaggtgg agttgctgga agaagagtgg 240 ctgggcgatg aacaaaccgg ttcgactccg ctgctgcttt cactggcggt caacgccgac 300 agtctggcga cgtggttgct tcctgcactg gctcctgtgt tggctgattc gcctatccgc 360 ctcaacttgc aggtagaaga tgaaacccgc actcaggaac gtctgcgccg cggcgaagtg 420 gtcggcgcgg tgagtattca acatcaggcg ctgccgagtt gtcttgtcga taaacttggt 480 gcgctcgact atctgttcgt cagctcaaaa ccctttgccg aaaaatattt ccctaacggc 540 gtaacgcgtt cggcattact gaaagcgcca gtggtcgcgt ttgaccatct tgacgatatg 600 caccaggcct ttttgcagca aaacttcgat ctgcctccag gcagcgtgcc ctgccatatc 660 gttaattctt cagaagcgtt cgtacaactt gctcgccagg gcaccacctg ctgtatgatc 720 ccgcacctgc aaatcgagaa agaactggcc agcggtgaac tgattgactt aacgccgggg 780 ctatttcaac gccggatgct ctactggcac cgctttgctc ctgaaagccg catgatgcgt 840 aaagtcactg atgcgttgct cgattatggt cacaaagtcc ttcgtcagga ttaa 894 <210> 46 <211> 297 <212> PRT <213> E. coli <220> <223> argP <400> 46 Met Lys Arg Pro Asp Tyr Arg 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taaacttggt 480 gcgctcgact atctgttcgt cagctcaaaa ccctttgccg aaaaatattt ccctaacggc 540 gtaacgcgtt cggcattact gaaagcgcca gtggtcgcgt ttgaccatct tgacgatatg 600 caccaggcct ttttgcagca aaacttcgat ctgcctccag gcagcgtgcc ctgccatatc 660 gttaattctt cagaagcgtt cgtacaactt gctcgccagg gcaccacctg ctgtatgatc 720 ccgcacctgc aaatcgagaa agaactggcc agcggtgaac tgattgactt aacgccgggg 780 ctatttcaac gccggatgct ctactggcac cgctttgctc ctgaaagccg catgatgcgt 840 aaagtcactg atgcgttgct cgattatggt cacaaagtcc ttcgtcagga ttaa 894 <210> 48 <211> 297 <212> PRT <213> E. coli <220> <223> argP Mut <400> 48 Met Lys Arg Pro Asp Tyr Arg Thr Leu Gln Ala Leu Asp Ala Val Ile 1 5 10 15 Arg Glu Arg Gly Phe Glu Arg Ala Ala Gln Lys Leu Cys Ile Thr Gln 20 25 30 Ser Ala Val Ser Gln Arg Ile Lys Gln Leu Glu Asn Met Phe Gly Gln 35 40 45 Pro Leu Leu Val Arg Thr Val Pro Pro Arg Pro Thr Glu Gln Gly Gln 50 55 60 Lys Leu Leu Ala Leu Leu Arg Gln Val Glu Leu Leu Glu Glu Glu Trp 65 70 75 80 Leu Gly Asp Glu Gln Thr Gly Ser Thr Pro Leu Leu Leu Ser Leu 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gattaccacc gctaaatgcc ttacgagttt ttgatgccgc agcacgccat 60 ttaagtttca ctcgcgcagc agaagagctt tttgtgaccc aggccgcagt aagtcatcaa 120 atcaagtctc ttgaggattt tctggggcta aaactgttcc gccgccgtaa tcgttcactc 180 ctgctgaccg aggaaggtca aagctatttc ctcgatatca aagagatatt ttcgcaatta 240 accgaagcga cgcgtaaact ccaggcccgt agcgccaagg gggcgttgac ggtcagttta 300 ctccccagtt tcgccattca ttggttggtt ccgcgacttt ccagctttaa ttcagcttat 360 ccgggaattg acgttcgaat ccaggcggtt gatcgtcagg aagataagct ggcggatgat 420 gttgatgtgg cgatatttta tggtcggggc aactggccgg ggctacgggt ggaaaaactg 480 tacgccgaat atttattgcc ggtgtgttcg ccgctactgc tgacaggcga aaaacccttg 540 aagaccccgg aagatctggc taaacatacg ttattacatg atgcgtcacg ccgtgactgg 600 cagacatata cccgacagtt ggggttaaat catatcaacg ttcagcaagg gccaattttt 660 agtcatagcg ccatggtgct gcaagcggct attcacgggc agggagtggc gctggcaaat 720 aacgtgatgg cgcaatctga aatcgaggcc ggacgtcttg tttgcccgtt taatgatgtt 780 ctggtcagta aaaacgcttt ttatctggtt tgtcatgaca gccaggcaga actgggtaaa 840 atagccgcct ttcgccaatg gatcctggcg aaagccgctg ctgaacaaga aaaattccgc 900 tttcgttatg aacaataa 918 <210> 54 <211> 305 <212> PRT <213> E. coli <220> <223> gcvA <400> 54 Met Ser Lys Arg Leu Pro Pro Leu Asn Ala Leu Arg Val Phe Asp Ala 1 5 10 15 Ala Ala Arg His Leu Ser Phe Thr Arg Ala Ala Glu Glu Leu Phe Val 20 25 30 Thr Gln Ala Ala Val Ser His Gln Ile Lys Ser Leu Glu Asp Phe Leu 35 40 45 Gly Leu Lys Leu Phe Arg Arg Arg Asn Arg Ser Leu Leu Leu Thr Glu 50 55 60 Glu Gly Gln Ser Tyr Phe Leu Asp Ile Lys Glu Ile Phe Ser Gln Leu 65 70 75 80 Thr Glu Ala Thr Arg Lys Leu Gln Ala Arg Ser Ala Lys Gly Ala Leu 85 90 95 Thr Val Ser Leu Leu Pro Ser Phe Ala Ile His Trp Leu Val Pro Arg 100 105 110 Leu Ser Ser Phe Asn Ser Ala Tyr Pro Gly Ile Asp Val Arg Ile Gln 115 120 125 Ala Val Asp Arg Gln Glu Asp Lys Leu Ala Asp Asp Val Asp Val Ala 130 135 140 Ile Phe Tyr Gly Arg Gly Asn Trp Pro Gly Leu Arg Val Glu Lys Leu 145 150 155 160 Tyr Ala Glu Tyr Leu Leu Pro Val Cys Ser Pro Leu Leu Leu Thr Gly 165 170 175 Glu Lys Pro Leu Lys Thr Pro Glu Asp Leu Ala Lys His Thr Leu Leu 180 185 190 His Asp Ala Ser Arg Arg Asp Trp Gln Thr Tyr Thr Arg Gln Leu Gly 195 200 205 Leu Asn His Ile Asn Val Gln Gln Gly Pro Ile Phe Ser His Ser Ala 210 215 220 Met Val Leu Gln Ala Ala Ile His Gly Gln Gly Val Ala Leu Ala Asn 225 230 235 240 Asn Val Met Ala Gln Ser Glu Ile Glu Ala Gly Arg Leu Val Cys Pro 245 250 255 Phe Asn Asp Val Leu Val Ser Lys Asn Ala Phe Tyr Leu Val Cys His 260 265 270 Asp Ser Gln Ala Glu Leu Gly Lys Ile Ala Ala Phe Arg Gln Trp Ile 275 280 285 Leu Ala Lys Ala Ala Ala Glu Gln Glu Lys Phe Arg Phe Arg Tyr Glu 290 295 300 Gln 305 <210> 55 <211> 350 <212> DNA <213> E. coli <220> <223> gcvA WT Promoter <400> 55 ttcgcgatcg caaggtaaaa aaaagcaccg caattaggcg gtgctacatt aatcactatg 60 gacagacagg gtaaatgtac aggaagtgaa aaaaggtagc tttgctacca tggtctgaat 120 cgcagaccaa ttgcaaacac aacaacacaa catcacaacc gtaagccaaa agttcaccag 180 aacacgcatt ccgataaaac ttttcgttcc ggctcaggaa gtgccgccac tataggtatt 240 tgctggtaga agctcaacgg acaatttata atggctcaga ttaaaaaaac taataggtta 300 cacagtgtga tctaattgtt aaattcattt aacatcaaag tttaaaagcc 350 <210> 56 <211> 349 <212> DNA <213> E. coli <220> <223> gcvA Mut Promoter1 <400> 56 ttcgcgatcg caaggtaaaa aaaagcaccg caattaggcg gtgctacatt aatcactatg 60 gacagacagg gtaaatgtac aggaagtgaa aaaaggtagc tttgctacca tggtctgaat 120 cgcagaccaa ttgcaaacac aacaacacaa catcacaacc gtaagccaaa agttcaccag 180 aacacgcatt ccgataaaac ttttcgttcc ggctcaggaa gtgccgccac tataggtatt 240 tgctggtaga agctcaacgg acaatttata atggctcaga ttaaaaaact aataggttac 300 acagtgtgat ctaattgtta aattcattta acatcaaagt ttaaaagcc 349 <210> 57 <211> 350 <212> DNA <213> E. coli <220> <223> gcvA Mut Promoter2 <400> 57 ttcgcgatcg caaggtaaaa aaaagcaccg caattaggcg gtgctacatt aatcactatg 60 gacagacagg gtaaatgtac aggaagtgaa aaaaggtagc tttgctacca tggtctgaat 120 cgcagaccaa ttgcaaacac aacaacacaa catcacaacc gtaagccaaa agttcaccag 180 aacacgcatt ccgataaaac ttttcgttcc ggctcaggaa gtgccgccac tataggtatt 240 tgctggtaga agctcaacgg acaatttata atggctcaga ttaaaaaaac aaataggtta 300 cacagtgtga tctaattgtt aaattcattt aacatcaaag tttaaaagcc 350 <210> 58 <211> 206 <212> DNA <213> E. coli <220> <223> gcvB <400> 58 acttcctgag ccggaacgaa aagttttatc ggaatgcgtg ttctggtgaa cttttggctt 60 acggttgtga tgttgtgttg ttgtgtttgc aattggtctg cgattcagac catggtagca 120 aagctacctt ttttcacttc ctgtacattt accctgtctg tccatagtga ttaatgtagc 180 accgcctaat tgcggtgctt tttttt 206 <210> 59 <211> 128 <212> DNA <213> E. coli <220> <223> gcvB WT Promoter <400> 59 ggcttttaaa ctttgatgtt aaatgaattt aacaattaga tcacactgtg taacctatta 60 gtttttttaa tctgagccat tataaattgt ccgttgagct tctaccagca aatacctata 120 gtggcggc 128 <210> 60 <211> 127 <212> DNA <213> E. coli <220> <223> gcvB Mut1 Promoter <400> 60 ggcttttaaa ctttgatgtt aaatgaattt aacaattaga tcacactgtg taacctatta 60 gttttttaat ctgagccatt ataaattgtc cgttgagctt ctaccagcaa atacctatag 120 tggcggc 127 <210> 61 <211> 128 <212> DNA <213> E. coli <220> <223> gcvB Mut2 Promoter <400> 61 ggcttttaaa ctttgatgtt aaatgaattt aacaattaga tcacactgtg taacctattt 60 gtttttttaa tctgagccat tataaattgt ccgttgagct tctaccagca aatacctata 120 gtggcggc 128 <210> 62 <211> 73 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer argP_1_F <400> 62 ttgctggaag aagagtggct gggcgatgaa caaaccggtt cgactccgct gatatcggaa 60 gccctgggcc aac 73 <210> 63 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer argP_1_R <400> 63 tcagccaaca caggagccag tgcaggaagc aaccacgtcg ccagactgtc cacctgagac 60 aacttgttac agctc 75 <210> 64 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer argP_2_F <400> 64 actggatgcg gtgatacgtg aacg 24 <210> 65 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer argP_2_R <400> 65 accactggcg ctttcagtaa tgcc 24 <210> 66 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer argP_seq_F <400> 66 ttaccaggag cagacaacag c 21 <210> 67 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer argP_seq_R <400> 67 ggcagatcga agttttgctg c 21 <210> 68 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer argP-pACYC_F 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E.coli <220> <223> ygaW <400> 109 atgttctcac cgcagtcacg cttgcgtcat gcagttgcag atacgttcgc gatggttgtt 60 tactgttctg tcgtgaacat gtgtattgaa gttttcctct ccggaatgag cttcgaacag 120 tctttttatt ccagattggt agcgattccg gtgaacatct taattgcatg gccatacggt 180 atgtaccgtg atctgtttat gcgcgcggca cgcaaagtta gcccgtcggg ctggataaaa 240 aatctggctg atatcctggc ttatgtgacg ttccagtcac cggtgtatgt ggcgatcttg 300 ttagtggtgg gcgcagactg gcatcagatt atggcggcgg tcagttcaaa catcgttgtt 360 tcgatgttga tgggggcggt ttatggctac ttcctcgatt attgccgccg actgtttaaa 420 gtcagccgtt accagcaggt aaaagcctga 450 <210> 110 <211> 149 <212> PRT <213> E.coli <220> <223> ygaW <400> 110 Met Phe Ser Pro Gln Ser Arg Leu Arg His Ala Val Ala Asp Thr Phe 1 5 10 15 Ala Met Val Val Tyr Cys Ser Val Val Asn Met Cys Ile Glu Val Phe 20 25 30 Leu Ser Gly Met Ser Phe Glu Gln Ser Phe Tyr Ser Arg Leu Val Ala 35 40 45 Ile Pro Val Asn Ile Leu Ile Ala Trp Pro Tyr Gly Met Tyr Arg Asp 50 55 60 Leu Phe Met Arg Ala Ala Arg Lys Val Ser Pro Ser Gly Trp Ile Lys 65 70 75 80 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agcctgagcc tgtagcggaa 540 ccggctccag ttatggataa accgaagcgc aaagaagcgg tgattatcat gaacgtcgcg 600 gcgcatcacg gtagcgagct aaacggtgaa ctgcttctta acagcattca acaagcgggc 660 ttcatttttg gcgatatgaa tatttaccat cgtcatctta gcccggatgg cagcggcccg 720 gcgttattca gcctggcgaa tatggtgaaa ccgggaacct ttgatcctga aatgaaggat 780 ttcactactc cgggtgtcac catctttatg caggtaccgt cttacggtga cgagctgcag 840 aacttcaagc tgatgctgca atctgcgcag catattgccg atgaagtggg cggtgtcgtg 900 cttgacgatc agcgccgtat gatgactccg cagaaattgc gcgagtacca ggacatcatc 960 cgcgaagtca aagacgccaa cgcctga 987 <210> 112 <211> 328 <212> PRT <213> E.coli <220> <223> zipA <400> 112 Met Met Gln Asp Leu Arg Leu Ile Leu Ile Ile Val Gly Ala Ile Ala 1 5 10 15 Ile Ile Ala Leu Leu Val His Gly Phe Trp Thr Ser Arg Lys Glu Arg 20 25 30 Ser Ser Met Phe Arg Asp Arg Pro Leu Lys Arg Met Lys Ser Lys Arg 35 40 45 Asp Asp Asp Ser Tyr Asp Glu Asp Val Glu Asp Asp Glu Gly Val Gly 50 55 60 Glu Val Arg Val His Arg Val Asn His Ala Pro Ala Asn Ala Gln Glu 65 70 75 80 His Glu Ala Ala Arg Pro Ser Pro Gln His Gln Tyr Gln Pro Pro Tyr 85 90 95 Ala Ser Ala Gln Pro Arg Gln Pro Val Gln Gln Pro Pro Glu Ala Gln 100 105 110 Val Pro Pro Gln His Ala Pro Arg Pro Ala Gln Pro Val Gln Gln Pro 115 120 125 Ala Tyr Gln Pro Gln Pro Glu Gln Pro Leu Gln Gln Pro Val Ser Pro 130 135 140 Gln Val Ala Pro Ala Pro Gln Pro Val His Ser Ala Pro Gln Pro Ala 145 150 155 160 Gln Gln Ala Phe Gln Pro Ala Glu Pro Val Ala Ala Pro Gln Pro Glu 165 170 175 Pro Val Ala Glu Pro Ala Pro Val Met Asp Lys Pro Lys Arg Lys Glu 180 185 190 Ala Val Ile Ile Met Asn Val Ala Ala His His Gly Ser Glu Leu Asn 195 200 205 Gly Glu Leu Leu Leu Asn Ser Ile Gln Gln Ala Gly Phe Ile Phe Gly 210 215 220 Asp Met Asn Ile Tyr His Arg His Leu Ser Pro Asp Gly Ser Gly Pro 225 230 235 240 Ala Leu Phe Ser Leu Ala Asn Met Val Lys Pro Gly Thr Phe Asp Pro 245 250 255 Glu Met Lys Asp Phe Thr Thr Pro Gly Val Thr Ile Phe Met Gln Val 260 265 270 Pro Ser Tyr Gly Asp Glu Leu Gln Asn Phe Lys Leu Met Leu Gln Ser 275 280 285 Ala Gln His Ile Ala Asp Glu Val Gly Gly Val Val Leu Asp Asp Gln 290 295 300 Arg Arg Met Met Thr Pro Gln Lys Leu Arg Glu Tyr Gln Asp Ile Ile 305 310 315 320 Arg Glu Val Lys Asp Ala Asn Ala 325 <210> 113 <211> 1425 <212> DNA <213> E.coli <220> <223> lpd <400> 113 atgagtactg aaatcaaaac tcaggtcgtg gtacttgggg caggccccgc aggttactcc 60 gctgccttcc gttgcgctga tttaggtctg gaaaccgtaa tcgtagaacg ttacaacacc 120 cttggcggtg tttgcctgaa cgtcggctgt atcccttcta aagcactgct gcacgtagca 180 aaagttatcg aagaagccaa agcgctggct gaacacggta tcgtcttcgg cgaaccgaaa 240 accgatattg acaagattcg tacctggaaa gagaaagtga tcaatcagct gaccggtggt 300 ctggctggta tggcgaaagg ccgcaaagtc aaagtggtca acggtctggg taaatttacc 360 ggggctaaca ccctggaagt tgaaggtgag aacggtaaaa ccgtgatcaa cttcgacaac 420 gcgatcattg cagcgggttc tcgcccgatc caactgccgt ttattccgca tgaagatccg 480 cgtatctggg actccactga cgcgctggaa ctgaaagaag taccagaacg cctgctggta 540 atgggtggcg gtatcatcgg tctggaaatg ggcaccgtat accacgcgct gggttcacag 600 attgacgtgg ttgaaatgtt cgaccaggtt atcccggcag ctgacaaaga catcgttaaa 660 gtcttcacca agcgtatcag caagaaattc aacctgatgc tggaaaccaa agttaccgcc 720 gttgaagcga aagaagacgg tatttatgtg acgatggaag gcaaaaaagc acccgctgaa 780 ccgcagcgtt acgacgccgt gctggtagcg attggtcgtg tgccgaacgg taaaaacctc 840 gacgcaggca aagctggcgt ggaagtggac gaccgtggtt tcatccgcgt tgacaaacag 900 ctgcgtacca acgtaccgca catctttgct atcggcgata tcgtcggtca gccgatgctg 960 gcacacaaag gtgttcacga aggtcacgtt gccgctgaag ttatcgccgg taagaaacac 1020 tacttcgatc cgaaagttat cccgtccatc gcctataccg aaccagaagt tgcatgggta 1080 ggtctgactg agaaagaagc gaaagagaaa ggcatcagct atgaaaccgc caccttcccg 1140 tgggctgctt ctggtcgtgc tatcgcttcc gactgcgcag acggtatgac caagctgatt 1200 ttcgacaaag aatctcaccg tgtgatcggt ggtgcgattg tcggtaccaa cggcggcgag 1260 ctgctgggtg aaatcggcct ggcaatcgaa atgggttgtg atgctgaaga catcgcactg 1320 accatccacg cgcacccgac tctgcacgag tctgtgggcc tggcggcaga agtgttcgaa 1380 ggtagcatta ccgacctgcc gaacccgaaa gcgaagaaga agtaa 1425 <210> 114 <211> 474 <212> PRT <213> E.coli <220> <223> lpd <400> 114 Met Ser Thr Glu Ile Lys Thr Gln Val Val Val Leu Gly Ala Gly Pro 1 5 10 15 Ala Gly Tyr Ser Ala Ala Phe Arg Cys Ala Asp Leu Gly Leu Glu Thr 20 25 30 Val Ile Val Glu Arg Tyr Asn Thr Leu Gly Gly Val Cys Leu Asn Val 35 40 45 Gly Cys Ile Pro Ser Lys Ala Leu Leu His Val Ala Lys Val Ile Glu 50 55 60 Glu Ala Lys Ala Leu Ala Glu His Gly Ile Val Phe Gly Glu Pro Lys 65 70 75 80 Thr Asp Ile Asp Lys Ile Arg Thr Trp Lys Glu Lys Val Ile Asn Gln 85 90 95 Leu Thr Gly Gly Leu Ala Gly Met Ala Lys Gly Arg Lys Val Lys Val 100 105 110 Val Asn Gly Leu Gly Lys Phe Thr Gly Ala Asn Thr Leu Glu Val Glu 115 120 125 Gly Glu Asn Gly Lys Thr Val Ile Asn Phe Asp Asn Ala Ile Ile Ala 130 135 140 Ala Gly Ser Arg Pro Ile Gln Leu Pro Phe Ile Pro His Glu Asp Pro 145 150 155 160 Arg Ile Trp Asp Ser Thr Asp Ala Leu Glu Leu Lys Glu Val Pro Glu 165 170 175 Arg Leu Leu Val Met Gly Gly Gly Ile Ile Gly Leu Glu Met Gly Thr 180 185 190 Val Tyr His Ala Leu Gly Ser Gln Ile Asp Val Val Glu Met Phe Asp 195 200 205 Gln Val Ile Pro Ala Ala Asp Lys Asp Ile Val Lys Val Phe Thr Lys 210 215 220 Arg Ile Ser Lys Lys Phe Asn Leu Met Leu Glu Thr Lys Val Thr Ala 225 230 235 240 Val Glu Ala Lys Glu Asp Gly Ile Tyr Val Thr Met Glu Gly Lys Lys 245 250 255 Ala Pro Ala Glu Pro Gln Arg Tyr Asp Ala Val Leu Val Ala Ile Gly 260 265 270 Arg Val Pro Asn Gly Lys Asn Leu Asp Ala Gly Lys Ala Gly Val Glu 275 280 285 Val Asp Asp Arg Gly Phe Ile Arg Val Asp Lys Gln Leu Arg Thr Asn 290 295 300 Val Pro His Ile Phe Ala Ile Gly Asp Ile Val Gly Gln Pro Met Leu 305 310 315 320 Ala His Lys Gly Val His Glu Gly His Val Ala Ala Glu Val Ile Ala 325 330 335 Gly Lys Lys His Tyr Phe Asp Pro Lys Val Ile Pro Ser Ile Ala Tyr 340 345 350 Thr Glu Pro Glu Val Ala Trp Val Gly Leu Thr Glu Lys Glu Ala Lys 355 360 365 Glu Lys Gly Ile Ser Tyr Glu Thr Ala Thr Phe Pro Trp Ala Ala Ser 370 375 380 Gly Arg Ala Ile Ala Ser Asp Cys Ala Asp Gly Met Thr Lys Leu Ile 385 390 395 400 Phe Asp Lys Glu Ser His Arg Val Ile Gly Gly Ala Ile Val Gly Thr 405 410 415 Asn Gly Gly Glu Leu Leu Gly Glu Ile Gly Leu Ala Ile Glu Met Gly 420 425 430 Cys Asp Ala Glu Asp Ile Ala Leu Thr Ile His Ala His Pro Thr Leu 435 440 445 His Glu Ser Val Gly Leu Ala Ala Glu Val Phe Glu Gly Ser Ile Thr 450 455 460 Asp Leu Pro Asn Pro Lys Ala Lys Lys Lys 465 470 <210> 115 <211> 269 <212> DNA <213> E.coli <220> <223> ldhA mut Promoter <400> 115 catagtaaat tcccccacca gtttaaccgg cggctgattt tcaaacgcga cgacatccag 60 ttcgctgact gtaagttgtt gccctttcag ctggccttga aatttaactt tttcgccctg 120 ataacgcagt tgctggatat cagaggttaa tgcgagagag agttttccct gccattcctg 180 ccagggagaa aaaatcagtt tatcgatatt gattttgtaa aatattttta gtagcttaaa 240 tgtgattcaa catcactgga gaaagtctt 269 <210> 116 <211> 50 <212> DNA <213> E.coli <220> <223> ldhA mut Promoter fragment <400> 116 tattgatttt gtaaaatatt tttagtagct taaatgtgat tcaacatcac 50 <210> 117 <211> 500 <212> DNA <213> E.coli <220> <223> brnQ_KO_fix <400> 117 gtgatttctt atcgctatat acctctggtt tttagatccc tccttgcttt aaaacgttat 60 aagcgtttaa attgcgcttc aggtgctgtc atactgactg cattaacgcg gtaaatcgaa 120 aaactattct tcgccgcgcc tggttgggag tatttcccgc taaaattgtt taaatatacc 180 gctgtatcat ccccagggat tggcacaaaa atttaacgtt acaacaccac atccacaggc 240 agtatgattt atcactgaac atttgtttta accacggggc tgcgatgccc cgtggttttt 300 tattgtgttg atgggttagg aattgatgga aagtaagaac aagctaaagc gtgggctaag 360 tacccgccac atacgcttta tggcactggg ttcagcaatt ggcaccgggc tgttttacgg 420 ttcggcagac gccatcaaaa tggccggtcc gagcgtgttg ttggcctata ttatcggtgg 480 tatcgcggcg tatatcatta 500

Claims (47)

  1. (I) 서열 3, 45, 49, 56, 57, 60 또는 61의 서열을 포함하는 핵산 분자, 또는
    (II) 서열 3, 45, 49, 56, 57, 60 또는 61의 핵산 분자에 대해 적어도 80% 동일성을 갖는 핵산 분자, 또는
    (III) 엄격한 조건 하에 서열 3, 45, 49, 56, 57, 60 또는 61을 갖는 핵산 분자의 보체에 혼성화되는 핵산 분자, 또는
    (IV) 서열 4, 46 또는 50의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자, 또는
    (V) 서열 4, 46 또는 50의 폴리펩티드에 대해 적어도 60% 상동성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자
    의 군으로부터 선택된 서열을 갖는 재조합 핵산 분자이며,
    여기서 서열 45의 위치 286 내지 288에 상응하는 (I) 내지 (V) 하의 유전자의 코돈은 아미노산 알라닌을 코딩하지 않고 정지 코돈이 아니거나, 또는 서열 46의 위치 96에 상응하는 (I) 내지 (V) 하의 유전자에 의해 코딩된 단백질의 아미노산은 알라닌이 아니고 정지 코돈이 아니고,
    여기서 서열 49의 위치 43 내지 45에 상응하는 (I) 내지 (V) 하의 유전자의 코돈은 아미노산 알라닌을 코딩하지 않고 정지 코돈이 아니거나, 또는 서열 50의 위치 15에 상응하는 (I) 내지 (V) 하의 유전자에 의해 코딩된 단백질의 아미노산은 알라닌이 아니고 정지 코돈이 아닌 것인
    재조합 핵산 분자.
  2. 제1항에 있어서, (II) 내지 (V) 하에 정의된 바와 같은 서열 45의 서열 또는 그의 상동체를 가지며, 여기서 서열 45의 위치 286 내지 288에 상응하는 아미노산 알라닌을 코딩하는 코돈이 아미노산 글루탐산 또는 글루탐산과 관련된 아미노산을 코딩하는 코돈에 의해 대체된 것인, 재조합 핵산 분자.
  3. 제1항에 있어서, (II) 내지 (V) 하에 정의된 바와 같은 서열 49의 서열 또는 그의 상동체를 가지며, 여기서 위치 43 내지 45에 상응하는 아미노산 알라닌을 코딩하는 코돈이 아미노산 트레오닌 또는 트레오닌과 유사한 아미노산을 코딩하는 코돈에 의해 대체된 것인, 재조합 핵산 분자.
  4. (VI) 서열 46의 서열을 포함하는 아미노산 분자, 또는
    (VII) 서열 46의 핵산 분자에 대해 적어도 60% 동일성을 갖는 아미노산 분자
    의 군으로부터 선택된 서열을 갖는 재조합 아미노산 분자이며,
    여기서 서열 46의 위치 96에 상응하는 (VII) 하의 단백질의 아미노산은 알라닌이 아닌 것인
    재조합 아미노산 분자.
  5. (VI) 서열 50의 서열을 포함하는 아미노산 분자, 또는
    (VII) 서열 50의 핵산 분자에 대해 적어도 60% 동일성을 갖는 아미노산 분자
    의 군으로부터 선택된 서열을 갖는 재조합 아미노산 분자이며,
    여기서 서열 50의 위치 15에 상응하는 (VII) 하의 단백질의 아미노산은 알라닌이 아닌 것인
    재조합 아미노산 분자.
  6. 제4항에 있어서, 서열 46의 위치 96에 상응하는 위치에서의 아미노산 아르기닌이 글루탐산 또는 글루탐산과 관련된 아미노산에 의해 대체된 것인 재조합 아미노산 분자.
  7. 제5항에 있어서, 서열 50의 위치 15에 상응하는 위치에서의 아미노산 알라닌이 트레오닌 또는 트레오닌과 유사한 아미노산에 의해 대체된 것인 재조합 아미노산 분자.
  8. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 단백질 코딩 핵산 분자 중 적어도 하나와 작동가능하게 연결된, 미생물에서 기능적인 적어도 하나의 프로모터를 포함하는 재조합 발현 구축물.
  9. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 핵산 분자 중 적어도 하나 또는 제8항에 정의된 바와 같은 재조합 발현 구축물을 포함하는 재조합 벡터.
  10. a) brnQ 유전자 또는 그의 상동체 또는 기능적 변이체의 감소, 억제 또는 결실된 활성 및/또는 발현,
    b) argP 유전자 또는 그의 상동체 또는 기능적 변이체의 도입, 증가, 증진 또는 변경된 활성 및/또는 발현,
    c) gcvA 유전자 또는 그의 상동체 또는 기능적 변이체의 도입, 증가, 증진 또는 변경된 활성 및/또는 발현,
    d) gcvB 유전자 또는 그의 상동체 또는 기능적 변이체의 감소, 억제 또는 결실된 활성 및/또는 발현,
    e) (I) 서열 49의 서열을 포함하는 핵산 분자, 또는
    (II) 서열 49의 핵산 분자에 대해 적어도 80% 동일성을 갖는 핵산 분자, 또는
    (III) 엄격한 조건 하에 서열 49를 갖는 핵산 분자의 보체에 혼성화되는 핵산 분자, 또는
    (IV) 서열 50의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자, 또는
    (V) 서열 50의 폴리펩티드에 대해 적어도 60% 상동성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자
    중 적어도 하나를 포함하는 재조합 미생물이며,
    여기서 서열 49의 위치 43 내지 45에 상응하는 (I) 내지 (V) 하의 유전자의 코돈은 아미노산 알라닌을 코딩하지 않고 정지 코돈이 아니거나, 또는 서열 50의 위치 15에 상응하는 (I) 내지 (V) 하의 유전자에 의해 코딩된 단백질의 아미노산은 알라닌이 아니고 정지 코돈이 아닌 것인
    재조합 미생물.
  11. 제10항에 있어서, brnQ 유전자가
    (i) 서열 1의 서열을 포함하는 핵산 분자, 또는
    (ii) 서열 1의 핵산 분자에 대해 적어도 80% 동일성을 갖는 핵산 분자, 또는
    (iii) 엄격한 조건 하에 서열 1을 갖는 핵산 분자의 보체에 혼성화되는 핵산 분자, 또는
    (iv) 서열 2의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자, 또는
    (v) 서열 2의 폴리펩티드에 대해 적어도 60% 상동성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자
    의 군으로부터 선택되는 것인 재조합 미생물.
  12. 제10항에 있어서, argP 유전자가
    (i) 서열 45의 서열을 포함하는 핵산 분자, 또는
    (ii) 서열 45의 핵산 분자에 대해 적어도 80% 동일성을 갖는 핵산 분자, 또는
    (iii) 엄격한 조건 하에 서열 45를 갖는 핵산 분자의 보체에 혼성화되는 핵산 분자, 또는
    (iv) 서열 46의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자, 또는
    (v) 서열 46의 폴리펩티드에 대해 적어도 60% 상동성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자
    의 군으로부터 선택되는 것인 재조합 미생물.
  13. 제10항에 있어서, gcvA 유전자가
    (i) 서열 53의 서열을 포함하는 핵산 분자, 또는
    (ii) 서열 53의 핵산 분자에 대해 적어도 80% 동일성을 갖는 핵산 분자, 또는
    (iii) 엄격한 조건 하에 서열 53을 갖는 핵산 분자의 보체에 혼성화되는 핵산 분자, 또는
    (iv) 서열 54의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자, 또는
    (v) 서열 54의 폴리펩티드에 대해 적어도 60% 상동성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자
    의 군으로부터 선택되는 것인 재조합 미생물.
  14. 제10항에 있어서, gcvB 유전자가
    (i) 서열 58의 서열을 포함하는 핵산 분자, 또는
    (ii) 서열 58의 핵산 분자에 대해 적어도 80% 동일성을 갖는 핵산 분자, 또는
    (iii) 엄격한 조건 하에 서열 58을 갖는 핵산 분자의 보체에 혼성화되는 핵산 분자
    의 군으로부터 선택되는 것인 재조합 미생물.
  15. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 재조합 핵산 분자 중 적어도 하나 또는 제8항의 재조합 발현 구축물 또는 제9항의 재조합 벡터를 포함하는 재조합 미생물.
  16. 제10항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, alaD 유전자의 도입, 증가 또는 증진된 활성 및/또는 발현을 추가로 포함하는 재조합 미생물.
  17. 제10항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, pflB 유전자의 감소, 억제 또는 결실된 활성 및/또는 발현을 추가로 포함하는 재조합 미생물.
  18. 제10항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, adhE 유전자의 감소, 억제 또는 결실된 활성 및/또는 발현을 추가로 포함하는 재조합 미생물.
  19. 제10항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, ldhA 유전자의 감소, 억제 또는 결실된 활성 및/또는 발현을 추가로 포함하는 재조합 미생물.
  20. 제10항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, pta 유전자의 감소, 억제 또는 결실된 활성 및/또는 발현을 추가로 포함하는 재조합 미생물.
  21. 제10항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, frdA 유전자의 감소, 억제 또는 결실된 활성 및/또는 발현을 추가로 포함하는 재조합 미생물.
  22. 제10항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, ygaW 유전자의 도입, 증가 또는 증진된 활성 및/또는 발현을 추가로 포함하는 재조합 미생물.
  23. 제10항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, zipA 유전자의 도입, 증가 또는 증진된 활성 및/또는 발현을 추가로 포함하는 재조합 미생물.
  24. 제10항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, lpd 유전자의 도입, 증가 또는 증진된 활성 및/또는 발현을 추가로 포함하는 재조합 미생물.
  25. 제16항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, alaD 유전자가
    (AA) 서열 15의 서열을 포함하는 핵산 분자, 또는
    (BB) 서열 15의 핵산 분자에 대해 적어도 80% 동일성을 갖는 핵산 분자, 또는
    (CC) 엄격한 조건 하에 서열 15를 갖는 핵산 분자의 보체에 혼성화되는 핵산 분자, 또는
    (DD) 서열 16의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자, 또는
    (EE) 서열 16의 폴리펩티드에 대해 적어도 60% 상동성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자
    로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 재조합 미생물.
  26. 제16항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, alaD 유전자가 서열 115 또는 116을 갖는 프로모터, 또는
    (I) 서열 115 또는 116의 핵산 분자에 대해 적어도 80% 동일성을 갖는 핵산 분자, 또는
    (II) 엄격한 조건 하에 서열 115 또는 116을 갖는 핵산 분자에 혼성화되는 핵산 분자, 또는
    (III) 서열 115를 갖는 핵산 분자의 적어도 10개 뉴클레오티드의 단편
    에 작동가능하게 연결된 것인 재조합 미생물.
  27. 제17항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, pflB 유전자가
    (A) 서열 5의 서열을 포함하는 핵산 분자, 또는
    (B) 서열 5의 핵산 분자에 대해 적어도 80% 동일성을 갖는 핵산 분자, 또는
    (C) 엄격한 조건 하에 서열 5를 갖는 핵산 분자의 보체에 혼성화되는 핵산 분자, 또는
    (D) 서열 6의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자, 또는
    (E) 서열 6의 폴리펩티드에 대해 적어도 60% 상동성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자
    로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 재조합 미생물.
  28. 제18항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, adhE 유전자가
    (F) 서열 7의 서열을 포함하는 핵산 분자, 또는
    (G) 서열 7의 핵산 분자에 대해 적어도 80% 동일성을 갖는 핵산 분자, 또는
    (H) 엄격한 조건 하에 서열 7을 갖는 핵산 분자의 보체에 혼성화되는 핵산 분자, 또는
    (I) 서열 8의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자, 또는
    (J) 서열 8의 폴리펩티드에 대해 적어도 60% 상동성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자
    로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 재조합 미생물.
  29. 제19항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, ldhA 유전자가
    (K) 서열 9의 서열을 포함하는 핵산 분자, 또는
    (L) 서열 9의 핵산 분자에 대해 적어도 80% 동일성을 갖는 핵산 분자, 또는
    (M) 엄격한 조건 하에 서열 9를 갖는 핵산 분자의 보체에 혼성화되는 핵산 분자, 또는
    (N) 서열 10의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자, 또는
    (O) 서열 10의 폴리펩티드에 대해 적어도 60% 상동성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자
    로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 재조합 미생물.
  30. 제20항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, pta 유전자가
    (P) 서열 11의 서열을 포함하는 핵산 분자, 또는
    (Q) 서열 11의 핵산 분자에 대해 적어도 80% 동일성을 갖는 핵산 분자, 또는
    (R) 엄격한 조건 하에 서열 11을 갖는 핵산 분자의 보체에 혼성화되는 핵산 분자, 또는
    (S) 서열 12의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자, 또는
    (T) 서열 12의 폴리펩티드에 대해 적어도 60% 상동성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자
    로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 재조합 미생물.
  31. 제21항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, frdA 유전자가
    (U) 서열 13의 서열을 포함하는 핵산 분자, 또는
    (V) 서열 13의 핵산 분자에 대해 적어도 80% 동일성을 갖는 핵산 분자, 또는
    (W) 엄격한 조건 하에 서열 13을 갖는 핵산 분자의 보체에 혼성화되는 핵산 분자, 또는
    (X) 서열 14의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자, 또는
    (Y) 서열 14의 폴리펩티드에 대해 적어도 60% 상동성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자
    로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 재조합 미생물.
  32. 제22항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, ygaW 유전자가
    (FF) 서열 109의 서열을 포함하는 핵산 분자, 또는
    (GG) 서열 109의 핵산 분자에 대해 적어도 80% 동일성을 갖는 핵산 분자, 또는
    (HH) 엄격한 조건 하에 서열 109를 갖는 핵산 분자의 보체에 혼성화되는 핵산 분자, 또는
    (JJ) 서열 110의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자, 또는
    (KK) 서열 110의 폴리펩티드에 대해 적어도 60% 상동성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자
    로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 재조합 미생물.
  33. 제23항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, zipA 유전자가
    (LL) 서열 111의 서열을 포함하는 핵산 분자, 또는
    (MM) 서열 111의 핵산 분자에 대해 적어도 80% 동일성을 갖는 핵산 분자, 또는
    (NN) 엄격한 조건 하에 서열 111을 갖는 핵산 분자의 보체에 혼성화되는 핵산 분자, 또는
    (OO) 서열 112의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자, 또는
    (PP) 서열 112의 폴리펩티드에 대해 적어도 60% 상동성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자
    로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 재조합 미생물.
  34. 제24항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, lpd 유전자가
    (QQ) 서열 113의 서열을 포함하는 핵산 분자, 또는
    (RR) 서열 113의 핵산 분자에 대해 적어도 80% 동일성을 갖는 핵산 분자, 또는
    (SS) 엄격한 조건 하에 서열 113을 갖는 핵산 분자의 보체에 혼성화되는 핵산 분자, 또는
    (TT) 서열 114의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자, 또는
    (UU) 서열 114의 폴리펩티드에 대해 적어도 60% 상동성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자
    로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 재조합 미생물.
  35. 제10항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 코리네박테리움(Corynebacterium), 바실루스(Bacillus), 에르위니아(Erwinia), 에스케리키아(Escherichia), 판토에아(Pantoea), 스트렙토미세스(Streptomyces), 지모모나스(Zymomonas) 및 로도코쿠스(Rhodococcus)로 이루어진 군의 속으로부터 선택되는 재조합 미생물.
  36. 제10항 내지 제35항 중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 재조합 미생물을 포함하는 조성물.
  37. 제36항에 있어서, 배지 및 탄소 공급원을 추가로 포함하는 조성물.
  38. (I) 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 핵산 분자 중 적어도 하나 또는 제4항 내지 제7항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 아미노산 분자 중 적어도 하나 또는 제8항의 발현 구축물 또는 제9항의 벡터를 미생물 내로 도입하는 단계; 및
    (II) 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 핵산 분자 중 적어도 하나 또는 제4항 내지 제7항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 아미노산 분자 중 적어도 하나 또는 제8항의 발현 구축물 또는 제9항의 벡터를 포함하지 않는 상응하는 미생물과 비교하여 증진된 피루베이트, 숙시네이트, 아스파르테이트, 말레이트, 락테이트, 발린, 류신 및/또는 알라닌 수율을 갖는 재조합 미생물을 생성하는 단계
    를 포함하는, 증진된 피루베이트, 숙시네이트, 아스파르테이트, 말레이트, 락테이트, 발린, 류신 및/또는 알라닌 수율을 갖는 재조합 미생물을 생산하는 방법.
  39. 제38항에 있어서, 상기 방법에 사용된 재조합 미생물이, 제16항, 제22항 내지 제26항 및 제32항 내지 제34항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 유전자 중 적어도 하나의 증가 또는 증진된 활성 및/또는 발현, 및/또는 제17항 내지 제21항 및 제27항 내지 제31항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 적어도 하나의 유전자의 감소, 억제 또는 결실된 활성 및/또는 발현을 추가로 포함하는 것인 방법.
  40. 제38항 또는 제39항에 있어서, 미생물이 코리네박테리움, 바실루스, 에르위니아, 에스케리키아, 판토에아, 스트렙토미세스, 지모모나스 및 로도코쿠스로 이루어진 군의 속으로부터 선택되는 것인 방법.
  41. 피루베이트, 숙시네이트, 아스파르테이트, 말레이트, 락테이트, 발린, 류신 및/또는 알라닌의 생산을 허용하는 조건 하에, 제10항 내지 제35항 중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 재조합 미생물을 배양하는 단계를 포함하는, 피루베이트, 숙시네이트, 아스파르테이트, 말레이트, 락테이트, 발린, 류신 및/또는 알라닌을 생산하는 방법.
  42. 제41항에 있어서, 미생물을 0.5% 내지 30% (w/v)의 당을 포함하는 배지에서 배양하는 것인 방법.
  43. 제41항 또는 제42항에 있어서, 피루베이트, 숙시네이트, 아스파르테이트, 말레이트, 락테이트, 발린, 류신 및/또는 알라닌의 수율이 적어도 80%인 방법.
  44. 제41항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, L-알라닌의 키랄 순도가 적어도 98%인 방법.
  45. 배양 배지에 제10항 내지 제35항 중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 유전자 변형된 미생물을 접종하는 단계; 및 상기 배양 배지에서 상기 유전자 변형된 미생물을 배양하거나 성장시키는 단계를 포함하는, 유전자 변형된 미생물을 배양하거나 성장시키는 방법.
  46. 피루베이트, 숙시네이트, 아스파르테이트, 말레이트, 락테이트, 발린, 류신 및/또는 알라닌의 발효적 생산을 위한, 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 재조합 핵산 분자, 제4항 내지 제7항 중 어느 한 항의 재조합 아미노산 분자, 제8항의 재조합 발현 구축물, 제9항의 재조합 벡터, 제10항 내지 제35항 중 어느 한 항에 따른 재조합 미생물 또는 제36항 또는 제37항에 따른 조성물의 용도.
  47. I) 발효기에서 제10항 내지 제35항 중 어느 한 항에 따른 미생물을 성장시키는 단계, 및
    II) I)에서 수득된 발효 브로쓰로부터 피루베이트, 숙시네이트, 아스파르테이트, 말레이트, 락테이트, 발린, 류신 및/또는 알라닌을 회수하는 단계
    를 포함하는, 피루베이트, 숙시네이트, 아스파르테이트, 말레이트, 락테이트, 발린, 류신 및/또는 알라닌의 발효적 생산 방법.
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