CN115960942A

CN115960942A - 一种生产l-丙氨酸的基因工程菌株及其构建方法和应用

Info

Publication number: CN115960942A
Application number: CN202111171829.4A
Authority: CN
Inventors: 许平; 韩笑; 陶飞; 穆晓玲; 陈思弘; 李维理
Original assignee: Anhui Fengyuan Biotechnology Co ltd
Current assignee: Anhui Fengyuan Biotechnology Co ltd
Priority date: 2021-10-08
Filing date: 2021-10-08
Publication date: 2023-04-14
Also published as: WO2023056699A1

Abstract

本发明公开了一种生产L‑丙氨酸的基因工程菌株及其构建方法和应用，涉及生物工程领域。本发明通过增强糖酵解途径或/和引入热稳定性的丙氨酸脱氢酶基因，可构建得到能够在42℃～55℃高温条件下高产丙氨酸的基因工程菌株；通过敲除丙氨酸消旋酶基因还能够显著提升L‑丙氨酸的光学纯度；当起始菌中存在乳酸合成途径时，通过阻断乳酸合成途径，可增加丙酮酸合成途径的比例，进一步提高L‑丙氨酸的产量。本发明解决了现有技术中生产L‑丙氨酸发酵温度低、成本高等问题，实现了L‑丙氨酸在42℃～55℃条件下的高温发酵生产，丙氨酸产量能够达到95g/L以上，具有较高的工业化利用价值。

Description

一种生产L-丙氨酸的基因工程菌株及其构建方法和应用

技术领域

本发明涉及生物工程领域，尤其涉及一种生产L-丙氨酸的基因工程菌株及其构建方法和应用。

背景技术

L-丙氨酸是20种基本氨基酸之一，也是最小的手性分子之一，在食品、医药、日化等领域具有广泛应用。在食品工业中，L-丙氨酸可以作为防腐剂、甜味剂等添加到食品中。在医药保健中，L-丙氨酸不仅可用于氨基酸类营养补充剂中，还在急慢性肾衰竭、肝脏疾病、糖尿病、肥胖症等疾病治疗中有重要作用。在日化用品中，L-丙氨酸可以用于合成氨基酸表面活性剂，具有较高的生物亲和性。

L-丙氨酸的生产方法主要包括化学合成法、酶催化法和发酵法。化学合成法主要采用丙酸氯化法工艺，以液氯和丙酸作为主要原料。由于化学合成法的合成路线长、成本高、收率低，目前基本被淘汰。酶催化法主要利用固定化的L-天冬氨酸-β-脱羧酶催化天冬氨酸脱羧生成L-丙氨酸。但是酶催化法由四碳底物生成三碳产物的碳利用率较低，并且天冬氨酸的价格偏高，因此很难满足大规模生产需求。发酵法主要以葡萄糖为底物，以基因工程手段构建菌株发酵生产L-丙氨酸，具有原料廉价易得、产品得率高、成本低等优势，因而受到广泛关注。

与42℃以下的常温发酵相比，高温发酵能够显著降低污染风险、提高原料转化效率并降低热交换成本，因此在大规模发酵生产中有较高的应用价值。丙氨酸发酵通常以基因工程改造的大肠杆菌为生产菌株，但是该菌株的最适生长温度为37℃，无法进行高温发酵。

因此，本领域的技术人员致力于开发一种能够在高温条件下发酵生产L-丙氨酸的菌株，以满足大规模生产的需求。

发明内容

有鉴于此，本发明所要解决的技术问题是提供一种可以在42℃以上的高温条件下生产L-丙氨酸的基因工程菌株及其构建方法和应用。

为实现上述目的，本发明的第一方面提供了一种生产L-丙氨酸的基因工程菌株的构建方法，包括如下步骤：

提供具有丙酮酸合成途径的起始菌；

进行S200、S300、S400中的任一种步骤、任两种步骤或三种步骤对所述起始菌的基因组进行改造：

S200：插入6-磷酸果糖激酶基因pfk的拷贝和丙酮酸激酶基因pyk的拷贝；

S300：插入具有42℃～55℃热稳定性的丙氨酸脱氢酶基因GSald；

S400：所述起始菌的基因组中含有丙氨酸消旋酶基因，该步骤包括失活或缺失丙氨酸消旋酶基因。

本发明的第一方面构建得到的生产L-丙氨酸的基因工程菌株可以在42℃～55℃的高温条件下发酵生产L-丙氨酸。

在本发明的一些实施方式中，所述起始菌还具有乳酸合成途径，且所述起始菌的基因组中含有乳酸脱氢酶基因；所述的构建方法还包括如下步骤：

S100：失活或缺失所述起始菌的基因组中的乳酸脱氢酶基因。

在本发明的第二方面，提供了本发明的第一方面所述的构建方法构建得到的基因工程菌株。

在本发明的第三方面，提供了本发明的第二方面所述的基因工程菌株在生产L-丙氨酸中的应用。

在本发明的第四方面，提供了一种L-丙氨酸的生产方法，对本发明的第二方面所述的基因工程菌株进行发酵培养，其中，发酵培养温度为42℃～55℃。

在本发明的一些实施方式中，所述发酵培养步骤包括：将所述活化的种子接种到发酵培养基中，所述发酵培养基中包含碳源，在发酵培养温度为42℃～55℃、搅拌速度为50rpm～350rpm的条件下进行分批补料发酵，培养至设定的发酵密度。

本发明公开的技术方案所带来的有益效果包括：

1、本发明提供的基因工程菌株，实现了L-丙氨酸的高温生产(例如42℃～55℃)，在发酵过程中具有能耗低、抗污染等优点，有效降低了生产成本。

2、以嗜热菌作为起始菌构建基因工程菌株，可实现在高温条件下(例如42℃～55℃，具体地如50℃)进行L-丙氨酸的发酵生产。进一步地，通过增强糖酵解途径或/ 和引入热稳定性的丙氨酸脱氢酶，可显著提升丙氨酸的产量。通过敲除丙氨酸消旋酶基因可实现光学纯L-丙氨酸的生产。上述手段的组合可实现高温下高产光学纯L-丙氨酸的协同增效，发酵生产的温度可高达42℃～55℃，L-丙氨酸光学纯度可普遍实现98％以上，部分可实现99％以上，一些实施例中光学纯L-丙氨酸产量能够达到95g/L以上，部分可达到100g/L以上。本发明解决了现有技术中生产L-丙氨酸发酵温度低、成本高等问题，实现了L-丙氨酸的高温发酵生产，具有较高的工业化利用价值。

3、对于存在乳酸合成途径的起始菌，通过阻断乳酸合成途径，可增加丙酮酸合成途径的比例，进而实现L-丙氨酸的增产。采用同时产乳酸和丙酮酸的起始菌，通过阻断起始菌中的乳酸合成途径，可提高丙氨酸合成途径的比例，进一步地，通过增强糖酵解途径并引入热稳定性的丙氨酸脱氢酶，可构建得到高产丙氨酸的基因工程菌株。敲除丙氨酸消旋酶基因可实现光学纯L-丙氨酸的生产。

4、以能够50℃高温发酵的地衣芽孢杆菌为例，从一株高产D-乳酸的地衣芽孢杆菌BN11出发，通过消除其D-乳酸合成途径，增强糖酵解途径的通量并引入热稳定的异源丙氨酸脱氢酶，还消除D-丙氨酸的合成途径，可实现在42℃～55℃高温条件下高产光学纯L-丙氨酸，L-丙氨酸光学纯度可普遍实现98％以上，部分可实现99％以上；一些实施例中产量可实现95g/L以上，部分可实现100g/L以上。

以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。

附图说明

通过阅读参照以下附图，对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会阐述得更清晰：

图1是本发明的一个实施例中，以地衣芽孢杆菌为例的工程菌中丙氨酸的合成和代谢途径示意图；

图2是本发明的一个实施例中，一种生产L-丙氨酸的基因工程菌株BLA-1在5L 发酵罐50℃分批补料发酵生产L-丙氨酸的发酵曲线图(▲，OD600；■，葡萄糖；●，丙氨酸)；

图3是本发明的一些实施例中所用的PKVM载体的结构图，其包含ampR(氨苄青霉素抗性基因)和ermC(红霉素抗性基因)两个抗生素抗性基因，以及编码半乳糖苷酶的bgaB基因，均可作为筛选标记；该质粒具有一个热敏型复制起始位点oriT pE194ts，还有在大肠杆菌和地衣芽孢杆菌的复制起始位点ori和oriT。。

具体实施方式

下面将结合附图对本发明提供的具体事实方式作详细说明。

以下参考说明书附图介绍本发明的多个优选实施方式和优选实施例，使其技术内容更加清楚和便于理解。本发明可以通过许多不同形式的实施方式和实施例来得以体现，本发明的保护范围并非仅限于文中提到的实施方式和实施例。

应理解，本发明的上述各技术特征和在下文(包括但不限于实施方式和实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以通过任意合适的方式互相组合，从而构成新的或优选的技术方案，只要能够用于实施本发明的即可。

本发明中，“优选”、“特别”、“具体”、“进一步”、“更进一步”等词语仅表示效果较佳的或者较为具体的实施方式或实施例，应当理解，并不构成对本发明保护范围的限制。

本发明中，“和/或”、“或/和”均表示所列项目中的任一种或任意组合。

本发明中，“其组合”、“任何组合”、“任意组合”、“任意组合方式”，均指所列相关项目的任意合适的组合方式，以能够顺利实施本发明为准。构成组合的相关项目的数量等于2或大于2。

本发明中涉及百分比浓度，如无特别限定或说明，表示在相关体系中的终浓度。

本发明中的数值范围，如无特别说明，均包括两个端点。

本发明中，“以上”、“以下”，如无特别限定，均包括本数。

本发明上文及下文中涉及的各技术特征可以以任意合适的方式进行组合，只要不存在矛盾，且组合后的技术方案能够顺利实施并能够解决本发明的技术问题。所述任意合适的方式，以能够实现本发明的技术方案，解决本发明的技术问题，且能够实现相应的技术效果为准。

在本发明中，“出发菌”和“起始菌”具有相同含义，可以互换使用。

本发明中涉及温度控制，允许为恒温，也允许存在一定的温度波动范围。

在本发明中，高温生产L-丙氨酸，是相对于常温(指低于42℃，通常为37℃以下)，本文中的高温生产，如无特别限定，指在42℃～55℃条件下进行发酵生产，举例包括但不限于42℃、43℃、44℃、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃、50℃、52℃、53 ℃、54℃、55℃。

本发明中，如无特别说明，“丙酮酸合成途径”是指碳源经过糖酵解合成丙酮酸的途径。本发明中，“具有丙酮酸合成途径”是指具有内源性合成丙酮酸的能力。

本发明中，如无特别说明，“乳酸合成途径”是指：从丙酮酸转化为乳酸的合成途径。本发明中，如无特别说明，具有“乳酸合成途径”是可通过乳酸合成途径生产乳酸，也即，“具有乳酸合成途径”指具有内源性合成乳酸的能力。

本发明中，如无特别说明，“丙氨酸合成途径”是指：从丙酮酸转化为丙氨酸的合成途径。本发明中，如无特别说明，具有“丙氨酸合成途径”是可通过丙氨酸合成途径生产丙氨酸，换言之，指具有内源性合成丙氨酸的能力。本发明中，具有丙氨酸合成途径时，如无特别说明，同时具有从丙酮酸合成L-丙氨酸的途径，以及从L-丙氨酸合成D-丙氨酸的途径。

本发明中，如无特别说明，“D-丙氨酸的合成途径”是指，从L-丙氨酸合成D-丙氨酸的途径。“具有D-丙氨酸的合成途径”指具有内原性合成D-丙氨酸的能力。

本发明中，基因簇片段是指，相关基因单元的数量至少2个，相关基因单元可以为相同或不同的基因。如果为相同基因构成的基因簇片段，“重复”应进行广义理解，允许相邻地依次出现，也可以在任两个基因单元之间存在间隔序列。

本发明中，缺失相关基因的典型方式之一为基因敲除。

本发明中的“失活”、“缺失”，如无特别限定，可以为部分或全部的失活、部分或全部的缺失。

表1.部分术语的简写和中英文全称

表2部分术语的中外译文对照

英文	中文
		Bacillus licheniformis	地衣芽孢杆菌
Bacillus coagulans	凝结芽孢杆菌
		Glucose	葡萄糖
Alanine	丙氨酸

本发明中涉及的氨基酸和核苷酸序列汇总于表3。

表3.本发明中涉及的一些氨基酸和核苷酸序列。

SEQ ID NO.1(GSald)：

ATGAAAATCGGCATCCCGAAAGAAATCAAAAACAACGAAAACCGCGTCGCGATCACGCCGGCG GGCGTCATGACGCTGGTCAAAGCGGGCCATGACGTCTATGTCGAAACGGAAGCGGGCGCGGGC AGCGGCTTTAGCGACAGCGAATATGAAAAAGCGGGCGCGGTCATCGTCCCGAACGCGGAAGAC GCGTGGACGGCGGAAATGGTCCTGAAAGTCAAAGAACCGCTGGCGGAAGAATTTCGCTATTTTC GCCCGGGCCTGATCCTGTTTACGTATCTGCATCTGGCGGCGGCGGAAGCGCTGACGAAAGCGCT GGTCGAACAGAAAGTCGTCGGCATCGCGTATGAAACGGTCCAGCTGGCGAACGGCAGCCTGCC GCTGCTGACGCCGATGAGCGAAGTCGCGGGCCGCATGAGCGTCCAGGTCGGCGCGCAGTTTCTG GAAAAACCGCATGGCGGCAAAGGCATCCTGCTGGGCGGCGTCCCGGGCGTCCGCCGCGGCAAA GTCACGATCATCGGCGGCGGCACGGCGGGCACGAACGCGGCGAAAATCGCGGTCGGCCTGGGC AGCGACGTCACGATCCTGGACATCAACGCGGAACGCCTGCGCGAACTGGACGACCTGTTTGGCG ACCATGTCACGACGCTGATGAGCAACAGCTATCATATCGCGGAATGCGTCCGCGAAAGCGACCT GGTCGTCGGCGCGGTCCTGATCCCGGGCGCGAAAGCGCCGAAACTGGTCACGGAAGAAATGGT CCGCAGCATGACGCCGGGCAGCGTCCTGGTCGACATCGCGATCGACCAGGGCGGCATCTTTGAA ACGACGGACCGCGTCACGACGCATGACGACCCGACGTATGTCAAACATGGCGTCGTCCATTATG CGGTCGCGAACATGCCGGGCGCGGTCCCGCGCACGAGCACGTTTGCGCTGACGAACGTCACGAT CCCGTATGCGCTGCAGATCGCGAACAAAGGCTATCGCGCGGCGTGCCTGGACAACCCGGCGCTG CTGAAAGGCATCAACACGCTGGACGGCCATATCGTCTATGAAGCGGTCGCGGCGGCGCATAAC ATGCCGTATACGGACGTCCATAGCCTGCTGCATGGCTAA

SEQ ID NO.2(P_als启动子)：

AAGGTGACGCCTATTTCACTTTCTAGCTGTTTAATCTGCTGGCTGAGCGGAGGCTGAGTCATGTT CAGCCGAAGAGCTGCTTTTCCGAAATGCAGTTCTTCGGCAACAACCATAAAATAACGAAGATGG CGCAGCTCCATTAATCACTCATTCCTTTCTGAATGCGATTTCAGTCGTTTTACATATTAATTGTAA GACAAAGAAGTATTGGAAAACAATTTCCACAAGATGTATATTTAATAATACAATAATTTTATTA AAAATTCATTGTAAATGAATGAAAATGGAGGAGTGAGGGCT

SEQ ID NO.3：CCTCGCGTCGGGCGATATCGGATCCGAAGGGGAAAGTCTTCGATTTCT

SEQ ID NO.4：AGAGGGCTTTTTCATGCTGAAGAGGTCAAAAAGAGCC

SEQ ID NO.5：TTTGACCTCTTCAGCATGAAAAAGCCCTCTTTGAAAAG

SEQ ID NO.6：CCATGGTACCCGGGAGCTCGAATTCCATAAGACCGCTGATGACAAGC

SEQ ID NO.7：TCCAGCCTCGCGTCGGGCGATATCGTCCCCATAACAACGGAATCATC

SEQ ID NO.8：AATAGGCGTCACCTTGACTCATCATTCCTTTGCCGTT

SEQ ID NO.9：AAGGAATGATGAGTCAAGGTGACGCCTATTTCACTTTC

SEQ ID NO.10：TCCAATTCGCTTCATAGCCCTCACTCCTCCATTTTC

SEQ ID NO.11：GGAGGAGTGAGGGCTATGAAGCGAATTGGAGTATTGACA

SEQ ID NO.12：CTTCATGGTGTTCAGTTACAATACAGTCGCATGGCC

SEQ ID NO.13：GCGACTGTATTGTAACTGAACACCATGAAGATACTAACATCA

SEQ ID NO.14：ACTAGACAGATCTATCGATGCATGCTTTCCCTTATTCCTTTAAACCCG

SEQ ID NO.15：AATAGGCGTCACCTTGCTGAAGAGGTCAAAAAGAGCC

SEQ ID NO.16：TTTGACCTCTTCAGCAAGGTGACGCCTATTTCACTTTCT

SEQ ID NO.17：AGAGGGCTTTTTCATTTAGCCATGCAGCAGGCTATG

SEQ ID NO.18：CTGCTGCATGGCTAAATGAAAAAGCCCTCTTTGAAAAG

SEQ ID NO.19：CCTCGCGTCGGGCGATATCGGATCCAAAATATGACGCTGTCTCAAATTGA

SEQ ID NO.20：CTAATTCATCAATTTGACACTTCCTGTTCCTTGTTTCACT

SEQ ID NO.21：GGAACAGGAAGTGTCAAATTGATGAATTAGCGGAAAAAC

SEQ ID NO.22：CCATGGTACCCGGGAGCTCGAATTCCGGAGTCTCTTTCAAAACCGTAG

SEQ ID NO.23：CCTCGCGTCGGGCGATATCGGATCCAAAATCATGTAAGCCCATTCCG

SEQ ID NO.24：GTGAGTATGGGAAAACAACGCTCCCTTCTTTCTTGTC

SEQ ID NO.25：AAGAAGGGAGCGTTGTTTTCCCATACTCACAGGCCG

SEQ ID NO.26：CCATGGTACCCGGGAGCTCGAATTCTAAAATGAAGGTGGTCCGGGAT

SEQ ID NO.27(Pfk)：

ATGAAGCGAATTGGAGTATTGACAAGCGGCGGCGATGCACCGGGGATGAATGCGGCGGTCCGCG CGATTGCCCGTAAAGGGATTTATCACGGCCTGGAAGTTTACGGCATTCGCCAAGGTTATAACGGATTGA TTCAAGGAAACATCCAAAAGCTCGAAGCAGGATCTGTTGGCGATATTCTCCAGCGGGGCGGCACGGT TTTGCAGTCGGCAAGAAGCGAAGAATTCAAAACGCCGGAAGGGCAGCAAAAAGCGATCAGGCAGCT GAAAGACCATGGCATTGAAGCGCTCGTTGTGATCGGCGGCGACGGTTCCTACCAAGGGGCCAAAAAG TTGACGGAACAGGGCTTTAACTGCATTGGTGTGCCAGGGACAATCGATAACGACATCCCGGGGACGG ATTTTACAATCGGTTTTGATACGGCATTGAACACAGTGCTTGATGCGATTGATAAAATTCGCGACACCG CTTCTTCCCACGAACGCACCTTTATTATTGAAGTCATGGGCAGAAATGCCGGGGATATCGCGCTCTGGT CCGGCCTGGCCGGCGGAGCCGAATCGATTATTATTCCGGAAGAAAAATATGACTTAAAAGATGTCGTG GAGCGTCTTGAACAGGGGAGAAAACGCGGCAAACGCCACAGCATCATCATTGTCGCGGAAGGCGTG ATGAGCGGCAACGAGTTTGCTGAACAATTGAAAAAAACCGGTGTGATCGGCGATACCCGCGTTTCTG TTCTCGGCCATATCCAGCGCGGCGGTTCTCCGACGGCATTTGACCGCGTGCTTGCAAGCCGCCTCGGC GCAAGGGCTGTTGAACTGCTGCTTGAAGGAAAAGGGGGCCGCGCTGTCGGCATTCAAAATAACCAG CTGGTTGACCACGATATCCTTGAGATTCTCGGAAAACCGCACGCCGTTAATAAAAACATGTACAAGCT GTCGAAAGAATTGTCGATCTAA

SEQ ID NO.28(Pyk)：

ATGAAAAAAACCAAAATTGTATGTACAATCGGACCTGCCAGTGAAAGTGTGGAAATGCTTGAAA GATTAATGGCAAACGGGATGGATGTTTGCCGCCTGAACTTCTCGCACGGCAGCCATGAGGAACATCTT GCCCGGATTAAAAATATCCGTGAAGCTGCAAAAAACCAAAACAAAACGATCGGGCTTCTGCTCGATA CAAAGGGCCCGGAAATCCGCACCCATGATATGAAAGACGGCGGATTCGAGCTCGTTGAAGGCATGAC ACCGGTCATTTCAATGACAGAAGTGCTCGGGACACCGGAAAAATTTTCGGTCACATATGAAGGGCTG ATTGATGATGTGCACGTTGGCTCTAAAATTTTACTTGATGACGGTTTGATTGAACTGGAAGTGACGGCC ATCGATAAAAACGCCGGTGAAATCCATACAAAAGTGCTGAACCGCGGCGTTTTGAAAAACAAAAAAG GTGTTAACGTCCCGGGTGTTTCCGTGAACCTTCCGGGCATCACCGAAAAAGACGTGAGCGATATCCTG TTCGGGCTTGAACAAGGCATTGACTTCATTGCGGCTTCGTTTGTACGCCGGCCGTCCGACGTTTTGGA AATCCGCCAGCTCCTTGAAGAACACGATGCTTTGCATGTGAAAATTTTCCCTAAAATTGAAAACCAGG AAGGCGTCGACAATATCGATGAAATCCTTGCGGTATCAGACGGCTTAATGGTTGCCCGCGGCGACCTCGGCGTTGAAATTCCGACCGAAGCGGTGCCGCTCGTACAAAAAGAAATGATCAGAAAATGTAATACGC TCGGCAAACCGGTGATTACCGCAACGCAAATGCTTGATTCGATGCAACGCAACCCGCGCCCGACCCG CGCGGAAGCAAGCGACGTGGCCAACGCCATTTTTGACGGCACGGATGCGATCATGCTTTCCGGCGAA ACGGCAGCCGGGAAATATCCTGCTGAAGCGGTTAAGACGATGTACAATATTGCGGTTCATGTGGAAAA AGCAATTAACCATCGCGATATTCTGAACAAGCGCAGCAAGAGCACGGACCATAATATGACAGACGCTA TCTGCCAGTCCGTTGCCCATACGGCTTTAAATCTTGATGTGAATGCCATTATTGCGCCGACTGAAAGCG GCTATACGGCACGCATGATCTCCAAATACCGCCCGGCGGCCCCAATCATTGCTGTCACGAGCGATCCG AAAGTACAACGCGGCTTAACTGTTGTGTCCGGCGTATACCCACAATTGGGCACAAAGGCAAACAATA CGGATGAAATGCTTGAAATTGCAGTGGAGGAAGCGTTGAAATCCGAAATCGTCCATCACGGCGACCT TGTGATCATTACAGCAGGCGTCCCGGTTGGTGGGAAAGGCACCACCAACCTGATGAAAGTGCACCTGATCGGTGATATATTGGCAAAAGGCCAGGGAATCGGCAGAAAATCGGCATTCGGCCCGGTCATCGTTGC TGAAAGCCCTGAAGAAGCAAACGCAAAGGCAACAGAAGGTTGTGTGCTCGTCACGAGAACGACCG ACAAAGAAATCATGCCGGCCATTGAAAAATGCGCCGCGCTGATTACGGAAGAAGGCGGCTTGACAAG CCATGCTGCAGTTGTTGGCATCAATGTCGGCATTCCGGTCATTGTTGGCGTTGAAAAAGCCGTTTCCAT TTTTGAAGACGGGCAGGAAGTTACGGTAGATGCGGCAACCGGCTCGGTTTACAACGGCCATGCGACT GTATTGTAA

SEQ ID NO.29(Alr1):

ATGATGAGCTTAAAACCATTCTATAGAAAGACATGGGCCGAAATCGATTTAACGGCTTTAAAAGA AAACGTCCGCAATATGAAGCGGCACATCGGCGAGCATGTCCGCCTGATGGCCGTCGTTAAAGCGAAT GCCTACGGACACGGGGATGCACAGGTAGCGAAGGCGGCTCTTGCAGAAGGGGCGTCCATTCTTGCTG TGGCTTTATTGGATGAAGCGCTTTCGCTGAGGGCGCAGGGGATTGAAGAACCGATTCTTGTCCTCGGT GCAGTGCCGACCGAATATGCAAGCATTGCCGCGGAAAAGCGCATTATCGTGACTGGCTACTCCGTCGG CTGGCTGAAAGACGTGCTCGGTTTTCTGAATGAGGCCGAAGCTCCTCTTGAATATCATTTGAAGATCG ACACGGGCATGGGCCGCCTTGGCTGCAAAACGGAAGAAGAGATCAAAGAAATGATGGAGATGACCG AATCGAACGATAAGCTCAATTGTACGGGCGTGTTCACTCATTTCGCCACGGCGGACGAAAAGGACAC CGATTATTTCAACATGCAGCTTGACCGCTTTAAAGAGCTGATCAGCCCCCTCCCGCTTGACCGTTTGAT GGTGCATTCGTCAAACAGCGCCGCGGGTCTGCGCTTCAGGGAACAGCTATTTAATGCCGTCCGCTTCG GCATCGGCATGTACGGTTTGGCGCCGTCAACCGAAATAAAAGACGAGCTGCCGTTTCGTCTGCGGGA AGTGTTTTCGCTTCATACCGAACTCACCCATGTGAAAAAAATTAAAAAAGGCGAGAGCGTCAGCTAC GGGGCGACATATACAGCTCAGCGCGACGAATGGATCGGGACAGTCCCCGTCGGGTATGCCGACGGAT GGCTGAGGCGCCTGGCCGGAACGGAAGTGCTGATCGACGGAAAACGCCAAAAAATAGCAGGGAGAA TCTGCATGGACCAGTTCATGATTTCCCTTGCCGAAGAATACCCTGTCGGCACAAAGGTTACCTTGATC GGAAAGCAAAAAGACGAATGGATCTCAGTCGACGAAATCGCCCAAAATTTGCAGACGATCAATTATG AAATTACCTGTATGATAAGTTCAAGGGTGCCCCGTATGTTTTTGGAAAATGGGAGTATAATGGAAATAA GGAATCCGATCTTGCCTGATCAATCCTGA

SEQ ID NO.30(Alr2):

ATGAAAAAGCTTTGCCGTGAAGTTTGGGTAGAGGTAAATCTTGATGCGATCAAAAAAAATTTGCG CGCGTTTCGGCGGCATATTCCGAAAAAGAGCAAAATTATGGCTGTCGTAAAAGCGAATGCTTATGGTC ACGGATCGGTGGAAGTTGCACGCCATGCACTTGAACATGGTGCGAGTGAGCTCGCCGTTGCCTCGGT GGAGGAAGCGGTCGTTTTACGAAAAGCGGGGATTAAAGCGCCGATCCTTGTGCTTGGTTTCACCCCG CTGAGCTGTGTGAAAGAAGCGGCAGCTTGGAATATATCGTTATCAGCTTTTCAAGTTGACTGGATTAA AGAAGCGAACGAGATATTGGAAAATGAAGCAGATCCTAACCGGCTGGCTGTTCATATCAATGTGGATA CCGGCATGGGGCGTTTAGGTGTACGAACAAAGGAAAAGCTTTTAGCAATCGTGGAAGCGCTGACGGC AAGTGAAAACCTCGAATGGGAAGGAATTTTTACGCATTTTTCCACAGCTGACGAACCGGATACTGAG CTAACCATGATTCAACACGAAAAGTTTATCAGCTTTCTTCGCTTTCTGAAAGAACAAGGCTTTAAGCT GCCTACGGTGCATATGAACAATACGGCCGCGGCGATCGCTTTTCCGGAATTCAGCGCTGATATGATTCG CTTAGGCATCGGAATGTATGGATTATATCCTTCCGATTATATCAGGCAGCTTAATCTCGTTAAGCTTGTG CCTGCACTAAGCTTGAAGGCGCGAATCGCTTATGTGAAAACCATGTTGACTGAACCGCGGACGGTTA GTTATGGTGCTACATATGTTGCAGAGCGCGGGGAAGTCATTGCCACAATTCCGGTCGGCTATGCTGAC GGCTATTCCCGTGAACTTTCCAACCGCGGTTTTATTCTTCATCGAGGAAGACGAGTGCCGGTGGCGGG AAGAGTAACAATGGATATGATAATGGTCAGTCTGGGAGAGGGTGAAGGTAAACAAGGAGAGGAAGTC GTGATTTACGGCCGGCAAAAGGGAGCAGAGATATCTGTTGATGAAATTGCGGAAATGCTTGATACGAT CAACTATGAAGTGGTATCTACCATAAGCTGGCGCGTCCCTCGTTTTTATATAAGAGACGGCGAGATTTT TAAAAAGTCGACCCCGCTGTTATACGTGTAG

SEQ ID NO.31(No):

ATGAAAGTAATTTTTTTTTCTATGCACCCGTATGAAGAGGAATTTCTGGGTCCGATTCTGCCGTCT GACTGGGACGTAGAAATGACCCCGGACTTTCTGGACGAAACCACCGTGGAAAAGGCTAAAGGTGCC CAGGTAGTAAGCCTGTTTGTTTCTGACAAAGCTGATGGTCCGGTACTGGAAGCGCTGCATTCTTACGG TGTGGGCCTGCTGGCCCTGCGTTCTGCTGGCTATGATCACATCGATATTGAGACCGCAAAACGCCTGG GTATCAAAGTAGTTAACGTGCCAGCCTATTCTCCGCACGCTATCGCTGACCATACTCTGGCTATCATGC TGGCTCTGATTCGTCGTCTGCACCGTGCCCATGATAAAGTGCGCCTGGGTGATTTTGATCTGGATGGTC TGATGGGCTTTGATCTGAACGGCAAAGTTGCTGGTGTAATTGGTCTGGGTAAAATCGGTCGCCTGGTA GCTACCCGCCTGAAAGCGTTTGGTTGCAAAGTTCTGGGCTATGATCCATACATTCAGCCGGAAATCGT AGAAAACGTTGATCTGGATACCCTGATCACTCAGGCTGATATCATTTCTATTCATTGTCCGCTGACCCG TGAAAACTTTCATATGTTTAACGAAGAGACTTTTAAGCGTATGAAACCGGGTGCTATTCTGGTTAACAC CGCGCGTGGTGGTCTGATCGATACCAAGGCCCTGCTGGAGGCCCTGAAGTCTGGTAAACTGGGCGGC GCAGCCCTGGATGTGTATGAATATGAACGTGGCCTGTTTTTTAAAAACCACCAAAAAGAAGGTATCAA AGACCCGTATCTGGCCCAGCTGCTGGGTCTGGCCAACGTAGTGCTGACCGGTCATCAGGCCTTTCTGA CCCGTGAGGCTGTAAAAAACATCGAAGAAACTACCGTAGAAAACATTCTGGAATGGCAAAAGAACCCGCAGGCAAAGCTGAAAAACGAAATCTAA

SEQ ID NO.32(GSald)：

MKIGIPKEIKNNENRVAITPAGVMTLVKAGHDVYVETEAGAGSGFSDSEYEKAGAVIVPNAEDAWTAEMVLKVKEPLAEEFRYFRPGLILFTYLHLAAAEALTKALVEQKVVGIAYETVQLANGSLPLLTPMSEVAG RMSVQVGAQFLEKPHGGKGILLGGVPGVRRGKVTIIGGGTAGTNAAKIAVGLGSDVTILDINAERLRELD DLFGDHVTTLMSNSYHIAECVRESDLVVGAVLIPGAKAPKLVTEEMVRSMTPGSVLVDIAIDQGGIFETTD RVTTHDDPTYVKHGVVHYAVANMPGAVPRTSTFALTNVTIPYALQIANKGYRAACLDNPALLKGINTLDGHIVYEAVAAAHNMPYTDVHSLLHG

本发明的第一方面提供了一种生产L-丙氨酸的基因工程菌株的构建方法，包括如下步骤：

提供具有丙酮酸合成途径的起始菌；

S200：引入过表达的6-磷酸果糖激酶基因pfk的拷贝和丙酮酸激酶基因pyk；

S300：引入过表达的热稳定的丙氨酸脱氢酶基因(优选过表达热稳定的丙氨酸脱氢酶基因GSald)；

S400：所述起始菌的基因组中含有丙氨酸消旋酶基因，该步骤包括失活或缺失所述丙氨酸消旋酶基因。

在本发明的一些实施方式中，所述S200、S300、S400可各自独立地通过以下方式实现：

S300：插入具有42℃～55℃热稳定性的丙氨酸脱氢酶基因GSald；

S400：部分或全部地失活所述丙氨酸消旋酶基因，或者部分或全部地缺失所述丙氨酸消旋酶基因；例如敲除所述丙氨酸消旋酶基因。

本发明的第一方面构建得到的生产L-丙氨酸的基因工程菌株可以在42℃以上(如42℃～55℃)的高温条件下发酵生产L-丙氨酸。其中，步骤S200可实现过表达糖酵解途径的6-磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶，从而增强糖酵解途径，提升丙酮酸的供给，对提高L-丙氨酸产量具有促进作用。步骤S300可引入热稳定性的丙氨酸脱氢酶基因，可增强从丙酮酸到L-丙氨酸的合成途径，有效提高L-丙氨酸产量。步骤 S400可失活或缺失丙氨酸消旋酶基因，有利于实现光学纯L-丙氨酸的生产。上述步骤 S200、S300、S400中，采用了其中的任一种步骤均有利于提高L-丙氨酸的产量，采用其中的两种或三种步骤的组合时，可起到协同增效的作用。

S100：失活或缺失所述起始菌的基因组中的乳酸脱氢酶基因。

在本发明的一些实施方式中，一种生产L-丙氨酸的基因工程菌中丙氨酸的合成和代谢途径示意图如图1所示。其中，碳源通过糖酵解途径转化为丙酮酸，随后丙酮酸消耗NADH和铵离子被丙氨酸脱氢酶催化生成L-丙氨酸。生成的L-丙氨酸一部分直接分泌到胞外，另一部分则被丙氨酸消旋酶催化形成D-丙氨酸，随后分泌到胞外。在起始菌中乳酸合成途径占据丙酮酸下游主要的碳通量情况下，阻断乳酸合成途径可使碳通量尽量流向丙氨酸合成途径。进一步地，过表达糖酵解途径的6-磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶可以增加糖酵解途径，使丙酮酸的供给提升，从而提升了丙氨酸产量。进一步敲除丙氨酸消旋酶可阻断D-丙氨酸合成途径，从而得到光学纯的L-丙氨酸产品。

在本发明的一些实施方式中，所述起始菌还具有D-乳酸合成途径，且所述起始菌的基因组中含有D-乳酸脱氢酶基因ldh_Ti；所述的构建方法还包括如下步骤S500：失活或缺失所述起始菌的基因组中含有的D-乳酸脱氢酶基因ldh_Ti。在本发明的一些优选的实施方式中，所述步骤S500包括：敲除所述起始菌的基因组中含有的D-乳酸脱氢酶基因ldh_Ti。

在本发明的一些实施方式中，所述D-乳酸脱氢酶基因ldh_Ti的序列如SEQ ID NO.31所示。

在本发明的一些实施方式中，所述6-磷酸果糖激酶基因pfk的序列如SEQ IDNO.27所示，所述丙酮酸激酶基因pyk的序列如SEQ ID NO.28所示。

在本发明的一些实施方式中，所述丙氨酸脱氢酶基因的序列如SEQ ID NO.1所示。

在本发明的一些实施方式中，所述步骤S400中，失活或缺失的所述丙氨酸消旋酶基因的种类为1种、2种或更多种。

在本发明的一些实施方式中，缺失相关基因的方式是敲除该基因。

在本发明的一些实施方式中，所述步骤S400包括：失活或缺失丙氨酸消旋酶基因alr1或丙氨酸消旋酶基因alr2。在本发明的一些实施方式中，所述步骤S400包括：失活或缺失丙氨酸消旋酶基因alr1和丙氨酸消旋酶基因alr2。在本发明的一些优选的实施方式中，所述步骤S400包括：敲除丙氨酸消旋酶基因alr1和丙氨酸消旋酶基因alr2。

在本发明的一些实施方式中，所述丙氨酸消旋酶基因alr1的序列如SEQ ID NO.29所示，所述丙氨酸消旋酶基因alr2的序列如SEQ ID NO.30所示。

在本发明的一些实施方式中，对所述起始菌的基因组进行改造包括步骤S100和步骤S200。此时，可以通过乳酸脱氢酶基因的失活或缺实现乳酸合成途径被阻断失，糖酵解途径通过6-磷酸果糖激酶基因pfk和丙酮酸激酶基因pyk的过表达被增强。优选地，对所述起始菌的基因组进行改造还包括步骤S300，此时，插入热稳定的丙氨酸脱氢酶基因，可实现L-丙氨酸的进一步增产。

在本发明的一些实施方式中，对所述起始菌的基因组进行改造包括步骤S100、步骤S200、步骤S300和步骤S400。此时，使起始菌中的乳酸脱氢酶基因可实现阻断乳酸合成途径；过表达起始菌的6-磷酸果糖激酶基因和丙酮酸激酶基因可实现增强糖酵解途径，从而提升丙酮酸的供给；引入过表达的丙氨酸脱氢酶基因可增强从丙酮酸到L-丙氨酸的合成途径；进一步使起始菌中的丙氨酸消旋酶基因失活或缺失，协同实现光学纯L-丙氨酸的高产量。

在本发明的一些实施方式中，对所述起始菌的基因组进行改造包括步骤500和步骤200，此时，乳酸合成途径通过D-乳酸脱氢酶基因ldh_Ti的失活或缺失被阻断，糖酵解途径通过6-磷酸果糖激酶基因pfk和丙酮酸激酶基因pyk的过表达被增强。

在本发明的一个较佳的实施例中，所述的构建方法包括如下步骤：

S500：全部失活或全部缺失所述起始菌的基因组中含有的乳酸脱氢酶基因，优选地，所述乳酸脱氢酶基因为D-乳酸脱氢酶基因ldh_Ti(可实现阻断乳酸合成途径)；

S200：过表达6-磷酸果糖激酶基因pfk的拷贝和丙酮酸激酶基因pyk(可增强糖酵解途径，提高丙酮酸的供给)；

S300：过表达异源的丙氨酸脱氢酶基因GSald(可实现增加从丙酮酸到L-丙氨酸的合成途径)；和

S400：全部失活或全部缺失丙氨酸消旋酶基因alr1和丙氨酸消旋酶基因alr2 (可阻断L-丙氨酸向D-丙氨酸的转变，有利于实现光学纯L-丙氨酸的高产)。

S500：敲除所述起始菌的基因组中含有的乳酸脱氢酶基因，优选地，所述乳酸脱氢酶基因为D-乳酸脱氢酶基因ldh_Ti(可实现阻断乳酸合成途径)，更优选地，所述D-乳酸脱氢酶基因ldh_Ti的序列如SEQ ID NO.31所示；

S200：插入6-磷酸果糖激酶基因pfk的拷贝和丙酮酸激酶基因pyk的拷贝(可过表达起始菌中的6-磷酸果糖激酶pfk和丙酮酸激酶pyk，从而增强糖酵解途径，提高丙酮酸的供给)；优选地，所述6-磷酸果糖激酶基因pfk的序列如SEQ ID NO.27 所示，所述丙酮酸激酶基因pyk的序列如SEQ ID NO.28所示；

S300：插入异源的丙氨酸脱氢酶基因GSald(可过表达异源的丙氨酸脱氢酶基因GSald，实现增加从丙酮酸到L-丙氨酸的合成途径)；优选地，所述丙氨酸脱氢酶基因GSald的序列如SEQ ID NO.1所示；和

S400：敲除丙氨酸消旋酶基因alr1和丙氨酸消旋酶基因alr2(可阻断L-丙氨酸向D-丙氨酸的转变，有利于实现光学纯L-丙氨酸的生产)；优选地，所述丙氨酸消旋酶基因alr1的序列如SEQ ID NO.29所示，所述丙氨酸消旋酶基因alr2的序列如SEQ ID NO.30所示；

应当理解，如无特别说明，本发明各方案中的多个特征的优选各自独立，可以采用合适的方式进行组合。

在本发明的一些实施方式中，在步骤200和步骤300中，插入相关基因的方式为在染色体上增加该基因的拷贝(增加的拷贝数可以为1个或更多个)，并在该基因前面串联启动子。

在本发明的一些实施例中，所述启动子为P_als、Plac、Ptrc、Ptac、Pc P43等中任一种。

在本发明的一些实施方式中，所述启动子为P_als。

在本发明的一些实施方式中，所述启动子的序列如SEQ ID NO.2所示。

在本发明的一些实施方式中，所述起始菌为嗜热菌。

在本发明的一些优选的实施方式中，所述起始菌为芽孢杆菌。

在本发明的一些优选的实施方式中，所述起始菌为地衣芽孢杆菌。地衣芽孢杆菌是一种兼性厌氧、革兰氏阳性、内生孢子型的细菌，具有较快的生长速度和较广泛的底物谱，能够在50℃的条件下进行高温发酵。而且该菌株遗传操作方便稳定，还是美国食品和药物管理局公认的GRAS(generally regarded as safe)菌株，有潜力成为理想的平台菌株。

在本发明的一些优选的实施方式中，所述起始菌为地衣芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、甲基营养芽孢杆菌、嗜热菊糖芽孢杆菌或嗜热脂肪地芽孢杆菌。

在本发明的一些优选的实施方式中，所述起始菌为地衣芽孢杆菌ATCC 14580 及其衍生菌株。所述衍生菌株的举例包括但不限于：地衣芽孢杆菌MW3、地衣芽孢杆菌BN11等。

在本发明的一些优选的实施方式中，所述起始菌为地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)BN11，保藏号为CCTCC NO:M2016026，于2016年1月8日保藏于中国武汉，武汉大学，中国典型培养物保藏中心。

在本发明的一些优选的实施方式中，所述起始菌为地衣芽孢杆菌BN11，所述6- 磷酸果糖激酶基因pfk的序列如SEQ ID NO.27所示；所述丙酮酸激酶基因pyk的序列如SEQ IDNO.28所示。

在本发明的一些优选的实施方式中，所述起始菌为地衣芽孢杆菌BN11，所述丙氨酸脱氢酶基因GSald的序列如SEQ ID NO.1所示。

在本发明的一些优选的实施方式中，所述起始菌为地衣芽孢杆菌BN11，其内源的丙氨酸消旋酶基因包括alr1和alr2，其中，丙氨酸消旋酶基因alr1的序列如SEQ ID NO.29所示，丙氨酸消旋酶基因alr2的序列如SEQ ID NO.30所示。

在本发明的一些实施方式中，在本发明的一些优选的实施方式中，所述起始菌为地衣芽孢杆菌BN11，所述D-乳酸脱氢酶基因ldh_Ti的序列如SEQ ID NO.31所示。

在本发明的第二方面，提供了本明的第一方面所述的构建方法制得的基因工程菌株。该基因工程菌株能够在42℃以上(如42℃～55℃)发酵生产L-丙氨酸，可实现产量的显著提升，进一步地，还可以实现高产光学纯L-丙氨酸。

在本发明的第三方面，提供了本发明的第二方面所述的基因工程菌株在生产L-丙氨酸中的应用，可用于高温条件发酵生产L-丙氨酸，可显著提高产量，进一步地，可在高温条件下实现光学纯产L-丙氨酸的高产。

在本发明的第四方面，提供了一种L-丙氨酸的生产方法，对本发明的第二方面所述的基因工程菌株进行发酵培养，其中，发酵培养温度为42℃～55℃。发酵培养的温度举例包括但不限于42℃、43℃、44℃、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃、50℃、51 ℃、52℃、53℃、54℃、55℃。

在本发明的一些实施方式中，所述发酵培养步骤包括：将活化的种子接种到发酵培养基中，所述发酵培养基中包含碳源，在发酵培养温度为42℃～55℃、搅拌速度为 50rpm～350rpm的条件下进行分批补料发酵，培养至设定的发酵密度。进一步地，接种所述活化的种子的接种量，以体积百分比计，可以为3％～5％，举例如3％、4％、5％。

在本发明的一些实施方式中，所述的生产方法在所述发酵培养之前还进行种子培养得到活化的种子，然后将所述活化的种子接种到发酵培养基中进行所述发酵培养。

在本发明的一些实施方式中，所述种子培养步骤包括：将所述的基因工程菌株接种到种子培养基中，在种子培养温度为42℃～55℃的条件下培养12h～16h，得到的种子培养液即活化的种子。

在本发明的一些实施方式中，所述种子培养基包含以下成分：蛋白胨、酵母粉和氯化钠。

在本发明的一些实施方式中，所述种子培养基由以下组分构成：蛋白胨、酵母粉和氯化钠。

在本发明的一些实施方式中，所述的生产方法包括如下步骤：

种子培养：将所述的基因工程菌株接种到种子培养基中，在种子培养温度为42℃～55℃的条件下培养，得到活化的种子；和

发酵培养：将所述活化的种子接种到发酵培养基中，所述发酵培养基中包含碳源，在发酵培养温度为42℃～55℃的条件下进行分批补料发酵，培养至设定的发酵密度；其中，接种量可以为体积比3％～5％。

种子培养：将所述的基因工程菌株接种到种子培养基中，在种子培养温度为42℃～55℃的条件下培养12h～16h，得到活化的种子；和

发酵培养：将所述活化的种子接种到发酵培养基中，所述发酵培养基中包含碳源，在发酵培养温度为42℃～55℃、搅拌速度为50rpm～350rpm的条件下进行分批补料发酵，培养至设定的发酵密度；其中，接种量可以为体积比3％～5％。

在本发明的一些实施方式中，在所述发酵培养步骤中，所述碳源为葡萄糖、甘油、木糖或阿拉伯糖。

在本发明的一些实施方式中，在所述发酵培养步骤中，所述发酵培养基包含以下成分：葡萄糖、酵母粉、硫酸铵、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、硫酸镁、硫酸亚铁和硫酸锰。在本发明的一些实施方式中，所述发酵培养基由以下成分组成：葡萄糖、酵母粉、硫酸铵、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、硫酸镁、硫酸亚铁和硫酸锰。

在本发明的一些实施方式中，所述设定的发酵密度可以通过OD₆₀₀进行检测，比如，当OD₆₀₀达到6.5～8.0时停止发酵。

在本发明的一些实施方式中，在所述发酵培养步骤中，所述发酵培养步骤包括：使氨水调节pH为7.0左右，通气条件下，搅拌条件下进行发酵培养(第一段发酵培养) 至OD600值达到6.5～8.0，停止通气，降低搅拌速度继续发酵培养(第二段发酵培养) 至设定的发酵密度，结束发酵；在发酵过程中，所述碳源的浓度降到一定值时可补充所述碳源。

用于调节pH的氨水的浓度可以为20％～30％(v/v)，具体举例如20％、25％、30％，以体积百分比计算。

所述通气条件，优选为通入空气。

通气的通气量可以为0.8vvm～1.2vvm，举例如0.9vvm、1.0vvm、1.1vvm、1.2vvm等。

发酵培养分段进行。可以分两段进行，包括通气条件下的第一段发酵培养，停止通气后的第二段发酵培养。通过第一段发酵培养，可使菌体快速生长，通过第二段发酵培养，可以实现高效生产L-丙氨酸。其中，第一段发酵培养时的搅拌速度优选 280rpm～320rpm，举例如280rpm、290rpm、300rpm、310rpm、320rpm等。第一段发酵培养的时间根据OD600值确定，例如可以为6小时至8小时，具体举例如6h、6.5h、 7h、7.5h、8h。第二段发酵培养时的搅拌速度优选60rpm～100rpm，举例如60rpm、70rpm、 80rpm、90rpm、100rpm等。第二段发酵培养的时间也根据OD600值(比如1.2)确定，例如可以为50小时至70小时，具体举例如50h、55h、60h、65h、70h。

发酵过程中补充碳源的次数可以为一次、两次等。

关于发酵过程中补充碳源时的时点，比如碳源浓度下降到30g/L～50g/L时补充一次碳源，又比如，碳源浓度降到20g/L～40g/L时，还可以再补充一次碳源。优选地，所述碳源为葡萄糖。

在本发明的一些实施方式中，仅补充一次碳源时，以在所述碳源的浓度降到 30g/L～50g/L(举例如30g/L、35g/L、40g/L、45g/L、50g/L)时，可以将碳源的浓度补充至80g/L～120g/L(举例如80g/L、90g/L、100g/L、110g/L、120g/L)。优选地，所述碳源为葡萄糖。

在本发明的一些实施方式中，补充2次碳源。第一次补充碳源时，可以在所述碳源的浓度降到30g/L～50g/L(举例如30g/L、35g/L、40g/L、45g/L、50g/L)时，可以将碳源的浓度补充至80g/L～120g/L(举例如80g/L、90g/L、100g/L、110g/L、120 g/L)。第二次补充碳源时，可以在所述碳源的浓度降到20g/L～40g/L(举例如20g/L、 25g/L、30g/L、35g/L、40g/L)时，可以将碳源的浓度补充至60g/L～80g/L(举例如 60g/L、65g/L、70g/L、75g/L、80g/L)。优选地，所述碳源为葡萄糖。

在本发明的一些实施方式中，在所述发酵培养步骤中，所述发酵培养步骤包括：使用20％～30％(v/v)的氨水调节pH为7.0±0.2，通气量为0.8vvm～1.2vvm，初始搅拌转速为280rpm～320rpm，进行发酵培养6～8小时至OD600值达到6.5～8.0，停止通气，调节搅拌转速为60rpm～100rpm，继续发酵培养到50小时～70小时(例如继续发酵培养到60小时)，结束发酵；进一步地，发酵过程中在碳源浓度降低至一定值时补充该碳源，可以补充一次、两次等。在一些实施方式中，在发酵过程中仅补充一次碳源，所述碳源的浓度降到30g/L～50g/L时进行第一次补充所述碳源，至所述碳源的浓度为 80g/L～120g/L。在另一些实施方式中，在发酵过程中补充两次碳源，所述碳源的浓度降到30g/L～50g/L时进行第一次补充所述碳源，至所述碳源的浓度为80g/L～120g/L，然后，当所述碳源的浓度降到20g/L～40g/L时，第二次补充所述碳源，至所述碳源的浓度为60g/L～80g/L。优选地，所述碳源为葡萄糖。

在本发明的一些实施方式中，在所述发酵培养步骤中，所述碳源为葡萄糖；所述发酵培养步骤包括：25％的氨水调节pH使其维持7.0，通气量为1vvm，初始搅拌转速为300rpm。发酵培养6小时～8小时后地衣芽孢杆菌的OD₆₀₀达到6.5～8.0，停止通气并调节搅拌转速为80rpm，继续发酵到60h结束。发酵过程中葡萄糖浓度降到300g/L～50g/L时进行一次补充葡萄糖，使得葡萄糖浓度达到100g/L。当葡萄糖浓度再次降低到20g/L～40g/L时进行第二次补充葡萄糖，至葡萄糖浓度达到70g/L。

以下结合本发明的实施例对本发明作进一步详细说明。下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。本发明的实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。下述实施例中未注明具体条件的实验方法(比如 PCR扩增、转化、基因敲除、基因插入等)，优选地按照上文的方法和条件进行；然后通常按照常规方法和条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的方法和条件，或者按照制造厂商所建议的条件。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

丙氨酸浓度测定方法：使用高效液相色谱法，称取0.54g的辛烷磺酸钠，加入到800mL超纯水中，用磷酸调节pH为2.1，加入100mL甲醇，用超纯水定容到1L体积，作为流动相。色谱柱为ZORBAX Eclipse XDB-C18(150mm×4.6mm,5μm)，柱温30 ℃，流速0.8mL/min，进样量10μL，检测器为DAD检测器，波长210nm。待检样品为发酵样品，首先需要煮沸10min，随后8000rpm离心5min，吸取上清稀释到合适的倍数，至丙氨酸终浓度为0.2g/L到1g/L。

丙氨酸光学纯度测定方法：使用高效液相色谱法，流动相为2mM的硫酸铜的水溶液。色谱柱为SUMICHIRAL OA-5000(150mm×4.6mm,5μm)，柱温30℃，流速 0.5mL/min，进样量10μL，检测器为DAD检测器，波长254nm。待检样品为发酵样品，首先需要煮沸10min，随后8000rpm离心5min，吸取上清稀释到合适的倍数，至丙氨酸终浓度为0.2g/L到1g/L。

葡萄糖浓度测定方法：使用SBA-40D型生物传感分析仪(山东省科学院生物研究所)测定葡萄糖浓度。

以下实施例以地衣芽孢杆菌作为起始菌构建可以在高温条件下生产L-丙氨酸的基因工程菌株。应当理解，以下实施例中生产L-丙氨酸的基因工程菌株的构建方法也可以用于其它菌株(示例包括但不限于凝结芽孢杆菌、甲基营养芽孢杆菌、嗜热菊糖芽孢杆菌、嗜热脂肪地芽孢杆菌等)作为起始菌，用来得到本发明中可以在高温条件下生产L-丙氨酸的基因工程菌株。

PKVM载体：其结构如图3所示，其包含ampR(氨苄青霉素抗性基因)和ermC (红霉素抗性基因)两个抗生素抗性基因，以及编码半乳糖苷酶的bgaB基因，均可作为筛选标记；该质粒具有一个热敏型复制起始位点oriT pE194ts，还有在大肠杆菌和地衣芽孢杆菌的复制起始位点ori和oriT。

地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)BN11，是ATCC 14580为基础构建的乳酸生产菌株，保藏号为CCTCC NO:M2016026，于2016年1月8日保藏于中国武汉，武汉大学，中国典型培养物保藏中心。

接种量：以体积百分比计。

如无特别说明，新插入的基因拷贝数为1个。

实施例1：敲除D-乳酸合成途径的地衣芽孢杆菌的构建

1.1.根据地衣芽孢杆菌ATCC 14580的基因组信息(GenBank No. NC_006270.3)设计引物，分别以PKVM-XPDdldh-UpF(SEQ ID NO.3)和 XPDdldh-UpR(SEQ ID NO.4)、XPDdldh-DownF(SEQ ID NO.5)和 PKVM-XPDdldh-DownR(SEQ ID NO.6)为上下游引物，分别进行PCR扩增，分别得到ldh_Ti基因启动子上游同源臂片段和ldh_Ti基因下游同源臂片段。

1.2.将上述步骤1.1.得到的PCR产物进行纯化，然后以PKVM-XPDdldh-UpF 和PKVM-XPDdldh-DownR为引物进行重组PCR扩增，对PCR产物进行纯化后通过无缝克隆连接到PKVM载体，转化到大肠杆菌S17中得到S17-PKVMΔldh_Ti。

1.3.将步骤1.2.得到的S17-PKVMΔldh_Ti(大肠杆菌)和地衣芽孢杆菌BN11 (起始菌)分别进行发酵培养，均至OD₆₀₀为1.2时结束发酵培养，然后6000rpm 离心5min，用PBS洗涤两次。然后将肠杆菌的改造菌株S17-PKVMΔldh_Ti：地衣芽孢杆菌BN11的按照相同OD₆₀₀(也即相同浓度)下的体积比7:1混合滴加在LB 平板，30℃过夜培养后稀释涂在含有红霉素和多粘菌素的LB平板上，30℃培养。挑取转化子在含有红霉素的LB培养基37℃培养，随后转接到LB培养基50℃培养，稀释涂布在含有红霉素的LB平板上，50℃培养筛选单交换转化子。单交换转化子在LB培养基30℃连续培养两代后稀释涂布在LB平板，37℃过夜培养并根据红霉素抗性反向筛选双交换转化子。以PKVM-XPDdldh-UpF和 PKVM-XPDdldh-DownR为引物进行PCR和测序验证，得到正确地敲除了D-乳酸合成途径的基因工程菌株，敲除了D-乳酸脱氢酶基因ldh_Ti(SEQ ID NO.31)，记为BN11Δldh_Ti。

实施例2：过表达6-磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶的地衣芽孢杆菌的构建

2.1.根据地衣芽孢杆菌ATCC 14580的基因组信息(GenBank No. NC_006270.3)设计引物，分别以PKVM-XPDldh-UpF(SEQ ID NO.7)和 P_als-XPDldh-UpR(SEQ ID NO.8)、XPDldh-P_als-F(SEQ ID NO.9)和PFYAK-P_als-R (SEQ ID NO.10)、P_als-PFYAK-F(SEQ IDNO.11)和XPDldh-PFYAK-R(SEQ ID NO.12)、PFYAK-XPDldh-DownF(SEQ ID NO.13)和PKVM-XPDldh-DownR(SEQ ID NO.14)为上下游引物，分别进行PCR扩增，分别得到ldh基因上游同源臂片段、P_als启动子(SEQ ID NO.2)片段、pfk(SEQ ID NO.27)和pyk(SEQ ID NO.28) 基因簇片段以及ldh基因下游同源臂片段。

2.2.将上述步骤2.1.得到的PCR产物进行纯化，然后以PKVM-XPDldh-UpF和 PKVM-XPDldh-DownR为引物进行重组PCR扩增，对PCR产物进行纯化后通过无缝克隆连接到PKVM载体，转化到大肠杆菌S17中得到S17-PKVM-PFYAK。

2.3.将上述步骤2.2得到的大肠杆菌S17-PKVM-PFYAK和地衣芽孢杆菌 BN11Δldh_Ti按照实施例1中的方法进行接合转移和同源重组实验，得到过表达pfk 和pyk基因的菌株，记为BN11Δldh_Ti-PFYAK。

实施例3：过表达异源的丙氨酸脱氢酶的菌株的构建

3.1.根据丙氨酸脱氢酶的氨基酸序列通过BLAST方法在嗜热脂肪地芽孢杆菌基因组中挖掘潜在的热稳定性丙氨酸脱氢酶(其氨基酸序列如SEQ ID NO.32所示，蛋白序列编号对应WP_033014465.1)，嗜热脂肪地芽孢杆菌来源的丙氨酸脱氢酶基因被命名为GSald，根据地衣芽孢杆菌基因组进行了密码子优化(优化后的序列如SEQ ID NO.1所示)，并和P_als启动子(SEQ ID NO.2)一起进行合成，合并序列从5'至3'为P_als-GSald。

3.2.根据地衣芽孢杆菌ATCC 14580的基因组信息(GenBank No. NC_006270.3)设计引物，分别以PKVM-XPDdldh-UpF(SEQ ID NO.3)和 P_als-XPDdldh-UpR(SEQ ID NO.15)、XPDdldh-P_als-F(SEQ ID NO.16)和 XPDdldh-GSald-R(SEQ ID NO.17)、GSald-XPDdldh-DownF(SEQ ID NO.18)和 PKVM-XPDdldh-DownR(SEQ ID NO.6)为上下游引物进行PCR扩增，得到ldh_Ti基因启动子上游同源臂片段、P_als-GSald基因片段以及ldh_Ti基因下游同源臂片段。

3.3.将上述步骤3.2.得到的PCR产物进行纯化，然后以PKVM-XPDdldh-UpF 和PKVM-XPDdldh-DownR为引物进行重组PCR扩增，对PCR产物进行纯化后分别通过无缝克隆连接到PKVM载体，转化到大肠杆菌S17中，得到 S17-PKVM-GSald。然后，将大肠杆菌S17-PKVM-GSald和地衣芽孢杆菌 BN11Δldh_Ti-PFYAK按照实施例1中的方法进行接合转移和同源重组实验，得到表达异源GSald的菌株，记为BA-1。

实施例4：敲除地衣芽孢杆菌的丙氨酸消旋酶

4.1.根据地衣芽孢杆菌ATCC 14580的基因组信息(GenBank No. NC_006270.3)设计引物，分别以PKVM-XPDalr1-UpF(SEQ ID NO.19)和XPDalr1-UpR(SEQ ID NO.20)、XPDalr1-DownF(SEQ ID NO.21)和 PKVM-XPDalr1-DownR(SEQ ID NO.22)为上下游引物进行PCR扩增，得到alr1 基因上游同源臂片段和alr1基因下游同源臂片段。

4.2.将上述步骤4.1.得到的PCR产物进行纯化，然后以PKVM-XPDalr1-UpF 和PKVM-XPDalr1-DownR为引物进行重组PCR扩增，对PCR产物进行纯化，然后通过无缝克隆连接到PKVM载体，转化到大肠杆菌S17中，得到 S17-PKVMΔalr1。

4.3.将大肠杆菌S17-PKVMΔalr1和地衣芽孢杆菌BA-1按照实施例1中的方法进行接合转移和同源重组实验，得到敲除alr1基因(SEQ ID NO.29)的菌株，记为BA-1Δalr1。

4.4.根据地衣芽孢杆菌ATCC 14580的基因组信息(GenBank No. NC_006270.3)设计引物，分别以PKVM-XPDalr2-UpF(SEQ ID NO.23)和 XPDalr2-UpR(SEQ ID NO.24)、XPDalr2-DownF(SEQ ID NO.25)和 PKVM-XPDalr2-DownR(SEQ ID NO.26)为上下游引物，进行PCR扩增，得到alr2 基因上游同源臂片段和alr2基因下游同源臂片段。

4.5.将上述步骤4.4.得到的PCR产物进行纯化，然后以PKVM-XPDalr2-UpF 和PKVM-XPDalr2-DownR为引物进行重组PCR扩增，对PCR产物进行纯化，然后通过无缝克隆连接到PKVM载体，转化到大肠杆菌S17中，得到 S17-PKVMΔalr2。

4.6.将大肠杆菌S17-PKVMΔalr2和地衣芽孢杆菌BA-1Δalr1按照实施例1中的方法进行接合转移和同源重组实验，得到同时敲除alr1基因(SEQ ID NO.29) 和alr2基因(SEQ ID NO.30)的菌株，记为BLA-1。

实施例5：重组地衣芽孢杆菌BLA-1在42℃进行分批补料发酵(5L发酵罐)

5.1.种子培养基和发酵培养基

种子培养基配方：LB培养基，酵母粉5g/L，胰蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L。

发酵培养基配方：葡萄糖100g/L，酵母粉5g/L，硫酸铵5g/L，三水合磷酸氢二钾1.3g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，七水合硫酸镁0.5g/L，七水合硫酸亚铁20mg/L，四水合硫酸锰20mg/L。其中，对葡萄糖单独灭菌，115℃灭菌20min。

5.2.种子培养

从甘油管转接BLA-1到装有5mL的LB培养基的摇管中，50℃200rpm振荡培养12h。随后按照体积比3％～5％的接种量转接到装有150mL的LB培养基的500mL 三角瓶中，50℃200rpm振荡培养12h。得到种子液(也即活化的种子)。该步骤实现了种子的活化。

5.3.发酵培养

将步骤5.2.得到的种子液按照体积比5％的接种量转接到装有发酵培养基的5L发酵罐中，使得装液量达到3L。用25％(v/v)的氨水控制发酵pH为7.0，通气(通入空气)，通气量为1.0vvm，温度42℃，搅拌转速为300rpm。进行发酵培养6～8 小时后地衣芽孢杆菌的OD₆₀₀达到6.5～8.0，此时停止通气并调节搅拌转速为 80rpm，继续发酵到60h结束。发酵过程中葡萄糖浓度降到30g/L～50g/L时进行一次补糖(也即补充碳源，本实施例中具体补充葡萄糖)，使得葡萄糖浓度达到 100g/L。发酵60h后，经检测分析，发酵液中L-丙氨酸浓度达到93.7g/L，糖酸转化率为74.4％，L-丙氨酸光学纯度达到98.9％。

实施例6：重组地衣芽孢杆菌BLA-1在50℃进行分批补料发酵(5L发酵罐)

6.1.种子培养基和发酵培养基

同实施例5.1.。

6.2.种子培养

同实施例5.2.。

6.3.发酵培养

将步骤6.2.得到的种子液按照体积比5％的接种量转接到装有发酵培养基的5L发酵罐中，使得装液量达到3L。用25％(v/v)的氨水控制发酵pH为7.0，通气量为 1.0vvm，温度50℃，搅拌转速为300rpm。进行发酵培养6～8小时后地衣芽孢杆菌的OD₆₀₀达到6.5～8.0，此时停止通气并调节搅拌转速为80rpm，继续发酵到60h 结束。发酵过程中葡萄糖浓度降到30g/L～50g/L时进行补糖，使得葡萄糖浓度达到 100g/L。发酵曲线如图2所示。发酵60h后，经检测分析，发酵液中丙氨酸浓度达到96.8g/L，糖酸转化率为76.8％，L-丙氨酸光学纯度达到98.9％。

实施例7：重组地衣芽孢杆菌BLA-1在55℃进行分批补料发酵(5L发酵罐)

7.1.种子培养基和发酵培养基

同实施例5.1.。

7.2.种子培养

同实施例5.2.。

7.3.发酵培养

将步骤7.2.得到的种子液按照体积比5％的接种量转接到装有发酵培养基的5L发酵罐中，使得装液量达到3L。用25％(v/v)的氨水控制发酵pH为7.0，通气量为 1.0vvm，温度55℃，搅拌转速为300rpm。进行发酵培养6～8小时后地衣芽孢杆菌的OD₆₀₀达到3.0～4.5，此时停止通气并调节搅拌转速为80rpm，继续发酵到60h 结束。发酵60h后，经检测分析，发酵液中丙氨酸浓度达到21.4g/L，糖酸转化率为63.8％，L-丙氨酸光学纯度达到97.2％。

实施例8：重组地衣芽孢杆菌BLA-1在42℃进行分批补料发酵(50L发酵罐)

8.1.种子培养基和发酵培养基

同实施例5.1.。

8.2.种子培养

从甘油管转接BLA-1到装有5mL的LB培养基的摇管中，50℃、200rpm振荡培养12h。随后按照体积比3％～5％的接种量转接到装有150mL的LB培养基的 500mL三角瓶中，50℃、200rpm振荡培养12h。最后按照体积比3％～5％的接种量转接到装有1.5L的LB培养基的5L三角瓶中，50℃、200rpm振荡培养12h。

8.3.发酵培养

将步骤8.2.得到的种子液按照体积比5％的接种量转接到装有发酵培养基的 50L发酵罐中，使得装液量达到30L。用25％(v/v)的氨水控制发酵pH为7.0，通气量为1.0vvm，温度42℃，搅拌转速为300rpm。进行发酵培养6～8小时后地衣芽孢杆菌的OD₆₀₀达到6.5～8.0，此时停止通气并调节搅拌转速为80rpm，继续发酵到60h结束。发酵过程中葡萄糖浓度降到30g/L～50g/L时进行一次补糖，使得葡萄糖浓度达到100g/L。发酵60h后，经检测分析，发酵液中丙氨酸浓度达到40.5g/L，糖酸转化率为70.7％，L-丙氨酸光学纯度达到96.6％。

实施例9：重组地衣芽孢杆菌BLA-1在50℃进行分批补料发酵，50L发酵罐

9.1.种子培养基和发酵培养基

同实施例5.1.。

9.2.种子培养

同实施例8.2.。

9.3.发酵培养

将步骤9.2.得到的种子液按照5％的接种量转接到装有发酵培养基的50L发酵罐中，使得装液量达到30L。用25％(v/v)的氨水控制发酵pH为7.0，通气量为 1.0vvm，温度50℃，搅拌转速为300rpm。进行发酵培养6～8小时后，地衣芽孢杆菌的OD₆₀₀达到6.5～8.0，此时停止通气并调节搅拌转速为80rpm，继续发酵到60h 结束。发酵过程中葡萄糖浓度降到30g/L～50g/L时进行一次补糖，使得葡萄糖浓度达到100g/L。发酵60h后，经检测分析，发酵液中丙氨酸浓度达到108.2g/L，糖酸转化率为73.3％，L-丙氨酸光学纯度达到99.1％。

实施例10：重组地衣芽孢杆菌BLA-1在55℃进行的分批补料发酵(50L发酵罐)

10.1.种子培养基和发酵培养基

同实施例5.1.。

10.2.种子培养

同实施例8.2.。

10.3.发酵培养

将步骤10.2得到的种子液按照5％的接种量转接到装有发酵培养基的50L发酵罐中，使得装液量达到30L。用25％(v/v)的氨水控制发酵pH为7.0，通气量为1.0vvm，温度55℃，搅拌转速为300rpm。进行发酵培养6-8小时后，地衣芽孢杆菌的OD₆₀₀达到4.0～6.0，此时停止通气并调节搅拌转速为80rpm，继续发酵到60h 结束。发酵60h后，经检测分析，发酵液中丙氨酸浓度达到26.6g/L，糖酸转化率为59.0％，L-丙氨酸光学纯度达到98.7％。

实施例11.实施例2构建的BN11Δldh_Ti-PFYAK菌株的发酵培养结果

参考实施例6的方法和实验参数对实施例2得到的BN11Δldh_Ti-PFYAK菌株进行发酵培养。

结果发现：1、-丙氨酸产量64g/L；2、得到的产物是L型和D型的混合产品， L-丙氨酸的光学纯度仅67.7％难以满足要求，光学纯要求一般为98％以上。

实施例12.实施例3构建的BA-1菌株的发酵培养结果

采用实施例6的方法和实验参数对实施例3得到的BA-1菌株进行发酵培养。

结果发现：1、丙氨酸产量129g/L；2、得到的产物是L型和D型的混合产品， L型丙氨酸的光学纯度为70.8％，难以满足要求。

综合实施例11和实施例12的结果表明，敲除地衣芽孢杆菌的丙氨酸消旋酶是实现L-丙氨酸的高光学纯度所必需。

实施例13.仅敲除一个丙氨酸消旋酶

参考实施例4的方法仅敲除丙氨酸消旋酶alr1(SEQ ID NO.29)、敲除丙氨酸消旋酶alr2(SEQ ID NO.30)中的一个，参考实施例6的方法对构建得到的菌株进行发酵培养。

结果发现，光学纯度难以满足要求。

以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术人员无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

序列表

<110> 安徽丰原生物技术股份有限公司

<120> 一种生产L-丙氨酸的基因工程菌株及其构建方法和应用

<130> 2021

<160> 32

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 3

<211> 1119

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgaaaatcg gcatcccgaa agaaatcaaa aacaacgaaa accgcgtcgc gatcacgccg 60

gcgggcgtca tgacgctggt caaagcgggc catgacgtct atgtcgaaac ggaagcgggc 120

gcgggcagcg gctttagcga cagcgaatat gaaaaagcgg gcgcggtcat cgtcccgaac 180

gcggaagacg cgtggacggc ggaaatggtc ctgaaagtca aagaaccgct ggcggaagaa 240

tttcgctatt ttcgcccggg cctgatcctg tttacgtatc tgcatctggc ggcggcggaa 300

gcgctgacga aagcgctggt cgaacagaaa gtcgtcggca tcgcgtatga aacggtccag 360

ctggcgaacg gcagcctgcc gctgctgacg ccgatgagcg aagtcgcggg ccgcatgagc 420

gtccaggtcg gcgcgcagtt tctggaaaaa ccgcatggcg gcaaaggcat cctgctgggc 480

ggcgtcccgg gcgtccgccg cggcaaagtc acgatcatcg gcggcggcac ggcgggcacg 540

aacgcggcga aaatcgcggt cggcctgggc agcgacgtca cgatcctgga catcaacgcg 600

gaacgcctgc gcgaactgga cgacctgttt ggcgaccatg tcacgacgct gatgagcaac 660

agctatcata tcgcggaatg cgtccgcgaa agcgacctgg tcgtcggcgc ggtcctgatc 720

ccgggcgcga aagcgccgaa actggtcacg gaagaaatgg tccgcagcat gacgccgggc 780

agcgtcctgg tcgacatcgc gatcgaccag ggcggcatct ttgaaacgac ggaccgcgtc 840

acgacgcatg acgacccgac gtatgtcaaa catggcgtcg tccattatgc ggtcgcgaac 900

atgccgggcg cggtcccgcg cacgagcacg tttgcgctga cgaacgtcac gatcccgtat 960

gcgctgcaga tcgcgaacaa aggctatcgc gcggcgtgcc tggacaaccc ggcgctgctg 1020

aaaggcatca acacgctgga cggccatatc gtctatgaag cggtcgcggc ggcgcataac 1080

atgccgtata cggacgtcca tagcctgctg catggctaa 1119

<210> 2

<211> 300

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

aaggtgacgc ctatttcact ttctagctgt ttaatctgct ggctgagcgg aggctgagtc 60

atgttcagcc gaagagctgc ttttccgaaa tgcagttctt cggcaacaac cataaaataa 120

cgaagatggc gcagctccat taatcactca ttcctttctg aatgcgattt cagtcgtttt 180

acatattaat tgtaagacaa agaagtattg gaaaacaatt tccacaagat gtatatttaa 240

taatacaata attttattaa aaattcattg taaatgaatg aaaatggagg agtgagggct 300

<210> 3

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cctcgcgtcg ggcgatatcg gatccgaagg ggaaagtctt cgatttct 48

<210> 4

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

agagggcttt ttcatgctga agaggtcaaa aagagcc 37

<210> 5

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tttgacctct tcagcatgaa aaagccctct ttgaaaag 38

<210> 6

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ccatggtacc cgggagctcg aattccataa gaccgctgat gacaagc 47

<210> 7

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tccagcctcg cgtcgggcga tatcgtcccc ataacaacgg aatcatc 47

<210> 8

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

aataggcgtc accttgactc atcattcctt tgccgtt 37

<210> 9

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

aaggaatgat gagtcaaggt gacgcctatt tcactttc 38

<210> 10

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

tccaattcgc ttcatagccc tcactcctcc attttc 36

<210> 11

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ggaggagtga gggctatgaa gcgaattgga gtattgaca 39

<210> 12

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

cttcatggtg ttcagttaca atacagtcgc atggcc 36

<210> 13

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

gcgactgtat tgtaactgaa caccatgaag atactaacat ca 42

<210> 14

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

actagacaga tctatcgatg catgctttcc cttattcctt taaacccg 48

<210> 15

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

aataggcgtc accttgctga agaggtcaaa aagagcc 37

<210> 16

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

tttgacctct tcagcaaggt gacgcctatt tcactttct 39

<210> 17

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

agagggcttt ttcatttagc catgcagcag gctatg 36

<210> 18

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

ctgctgcatg gctaaatgaa aaagccctct ttgaaaag 38

<210> 19

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

cctcgcgtcg ggcgatatcg gatccaaaat atgacgctgt ctcaaattga 50

<210> 20

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

ctaattcatc aatttgacac ttcctgttcc ttgtttcact 40

<210> 21

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

ggaacaggaa gtgtcaaatt gatgaattag cggaaaaac 39

<210> 22

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

ccatggtacc cgggagctcg aattccggag tctctttcaa aaccgtag 48

<210> 23

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

cctcgcgtcg ggcgatatcg gatccaaaat catgtaagcc cattccg 47

<210> 24

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

gtgagtatgg gaaaacaacg ctcccttctt tcttgtc 37

<210> 25

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

aagaagggag cgttgttttc ccatactcac aggccg 36

<210> 26

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

ccatggtacc cgggagctcg aattctaaaa tgaaggtggt ccgggat 47

<210> 27

<211> 963

<212> DNA

<213> 凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)

<400> 27

atgaagcgaa ttggagtatt gacaagcggc ggcgatgcac cggggatgaa tgcggcggtc 60

cgcgcgattg cccgtaaagg gatttatcac ggcctggaag tttacggcat tcgccaaggt 120

tataacggat tgattcaagg aaacatccaa aagctcgaag caggatctgt tggcgatatt 180

ctccagcggg gcggcacggt tttgcagtcg gcaagaagcg aagaattcaa aacgccggaa 240

gggcagcaaa aagcgatcag gcagctgaaa gaccatggca ttgaagcgct cgttgtgatc 300

ggcggcgacg gttcctacca aggggccaaa aagttgacgg aacagggctt taactgcatt 360

ggtgtgccag ggacaatcga taacgacatc ccggggacgg attttacaat cggttttgat 420

acggcattga acacagtgct tgatgcgatt gataaaattc gcgacaccgc ttcttcccac 480

gaacgcacct ttattattga agtcatgggc agaaatgccg gggatatcgc gctctggtcc 540

ggcctggccg gcggagccga atcgattatt attccggaag aaaaatatga cttaaaagat 600

gtcgtggagc gtcttgaaca ggggagaaaa cgcggcaaac gccacagcat catcattgtc 660

gcggaaggcg tgatgagcgg caacgagttt gctgaacaat tgaaaaaaac cggtgtgatc 720

ggcgataccc gcgtttctgt tctcggccat atccagcgcg gcggttctcc gacggcattt 780

gaccgcgtgc ttgcaagccg cctcggcgca agggctgttg aactgctgct tgaaggaaaa 840

gggggccgcg ctgtcggcat tcaaaataac cagctggttg accacgatat ccttgagatt 900

ctcggaaaac cgcacgccgt taataaaaac atgtacaagc tgtcgaaaga attgtcgatc 960

taa 963

<210> 28

<211> 1761

<212> DNA

<213> 凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)

<400> 28

atgaaaaaaa ccaaaattgt atgtacaatc ggacctgcca gtgaaagtgt ggaaatgctt 60

gaaagattaa tggcaaacgg gatggatgtt tgccgcctga acttctcgca cggcagccat 120

gaggaacatc ttgcccggat taaaaatatc cgtgaagctg caaaaaacca aaacaaaacg 180

atcgggcttc tgctcgatac aaagggcccg gaaatccgca cccatgatat gaaagacggc 240

ggattcgagc tcgttgaagg catgacaccg gtcatttcaa tgacagaagt gctcgggaca 300

ccggaaaaat tttcggtcac atatgaaggg ctgattgatg atgtgcacgt tggctctaaa 360

attttacttg atgacggttt gattgaactg gaagtgacgg ccatcgataa aaacgccggt 420

gaaatccata caaaagtgct gaaccgcggc gttttgaaaa acaaaaaagg tgttaacgtc 480

ccgggtgttt ccgtgaacct tccgggcatc accgaaaaag acgtgagcga tatcctgttc 540

gggcttgaac aaggcattga cttcattgcg gcttcgtttg tacgccggcc gtccgacgtt 600

ttggaaatcc gccagctcct tgaagaacac gatgctttgc atgtgaaaat tttccctaaa 660

attgaaaacc aggaaggcgt cgacaatatc gatgaaatcc ttgcggtatc agacggctta 720

atggttgccc gcggcgacct cggcgttgaa attccgaccg aagcggtgcc gctcgtacaa 780

aaagaaatga tcagaaaatg taatacgctc ggcaaaccgg tgattaccgc aacgcaaatg 840

cttgattcga tgcaacgcaa cccgcgcccg acccgcgcgg aagcaagcga cgtggccaac 900

gccatttttg acggcacgga tgcgatcatg ctttccggcg aaacggcagc cgggaaatat 960

cctgctgaag cggttaagac gatgtacaat attgcggttc atgtggaaaa agcaattaac 1020

catcgcgata ttctgaacaa gcgcagcaag agcacggacc ataatatgac agacgctatc 1080

tgccagtccg ttgcccatac ggctttaaat cttgatgtga atgccattat tgcgccgact 1140

gaaagcggct atacggcacg catgatctcc aaataccgcc cggcggcccc aatcattgct 1200

gtcacgagcg atccgaaagt acaacgcggc ttaactgttg tgtccggcgt atacccacaa 1260

ttgggcacaa aggcaaacaa tacggatgaa atgcttgaaa ttgcagtgga ggaagcgttg 1320

aaatccgaaa tcgtccatca cggcgacctt gtgatcatta cagcaggcgt cccggttggt 1380

gggaaaggca ccaccaacct gatgaaagtg cacctgatcg gtgatatatt ggcaaaaggc 1440

cagggaatcg gcagaaaatc ggcattcggc ccggtcatcg ttgctgaaag ccctgaagaa 1500

gcaaacgcaa aggcaacaga aggttgtgtg ctcgtcacga gaacgaccga caaagaaatc 1560

atgccggcca ttgaaaaatg cgccgcgctg attacggaag aaggcggctt gacaagccat 1620

gctgcagttg ttggcatcaa tgtcggcatt ccggtcattg ttggcgttga aaaagccgtt 1680

tccatttttg aagacgggca ggaagttacg gtagatgcgg caaccggctc ggtttacaac 1740

ggccatgcga ctgtattgta a 1761

<210> 29

<211> 1173

<212> DNA

<213> 地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)

<400> 29

atgatgagct taaaaccatt ctatagaaag acatgggccg aaatcgattt aacggcttta 60

aaagaaaacg tccgcaatat gaagcggcac atcggcgagc atgtccgcct gatggccgtc 120

gttaaagcga atgcctacgg acacggggat gcacaggtag cgaaggcggc tcttgcagaa 180

ggggcgtcca ttcttgctgt ggctttattg gatgaagcgc tttcgctgag ggcgcagggg 240

attgaagaac cgattcttgt cctcggtgca gtgccgaccg aatatgcaag cattgccgcg 300

gaaaagcgca ttatcgtgac tggctactcc gtcggctggc tgaaagacgt gctcggtttt 360

ctgaatgagg ccgaagctcc tcttgaatat catttgaaga tcgacacggg catgggccgc 420

cttggctgca aaacggaaga agagatcaaa gaaatgatgg agatgaccga atcgaacgat 480

aagctcaatt gtacgggcgt gttcactcat ttcgccacgg cggacgaaaa ggacaccgat 540

tatttcaaca tgcagcttga ccgctttaaa gagctgatca gccccctccc gcttgaccgt 600

ttgatggtgc attcgtcaaa cagcgccgcg ggtctgcgct tcagggaaca gctatttaat 660

gccgtccgct tcggcatcgg catgtacggt ttggcgccgt caaccgaaat aaaagacgag 720

ctgccgtttc gtctgcggga agtgttttcg cttcataccg aactcaccca tgtgaaaaaa 780

attaaaaaag gcgagagcgt cagctacggg gcgacatata cagctcagcg cgacgaatgg 840

atcgggacag tccccgtcgg gtatgccgac ggatggctga ggcgcctggc cggaacggaa 900

gtgctgatcg acggaaaacg ccaaaaaata gcagggagaa tctgcatgga ccagttcatg 960

atttcccttg ccgaagaata ccctgtcggc acaaaggtta ccttgatcgg aaagcaaaaa 1020

gacgaatgga tctcagtcga cgaaatcgcc caaaatttgc agacgatcaa ttatgaaatt 1080

acctgtatga taagttcaag ggtgccccgt atgtttttgg aaaatgggag tataatggaa 1140

ataaggaatc cgatcttgcc tgatcaatcc tga 1173

<210> 30

<211> 1182

<212> DNA

<213> 地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)

<400> 30

atgaaaaagc tttgccgtga agtttgggta gaggtaaatc ttgatgcgat caaaaaaaat 60

ttgcgcgcgt ttcggcggca tattccgaaa aagagcaaaa ttatggctgt cgtaaaagcg 120

aatgcttatg gtcacggatc ggtggaagtt gcacgccatg cacttgaaca tggtgcgagt 180

gagctcgccg ttgcctcggt ggaggaagcg gtcgttttac gaaaagcggg gattaaagcg 240

ccgatccttg tgcttggttt caccccgctg agctgtgtga aagaagcggc agcttggaat 300

atatcgttat cagcttttca agttgactgg attaaagaag cgaacgagat attggaaaat 360

gaagcagatc ctaaccggct ggctgttcat atcaatgtgg ataccggcat ggggcgttta 420

ggtgtacgaa caaaggaaaa gcttttagca atcgtggaag cgctgacggc aagtgaaaac 480

ctcgaatggg aaggaatttt tacgcatttt tccacagctg acgaaccgga tactgagcta 540

accatgattc aacacgaaaa gtttatcagc tttcttcgct ttctgaaaga acaaggcttt 600

aagctgccta cggtgcatat gaacaatacg gccgcggcga tcgcttttcc ggaattcagc 660

gctgatatga ttcgcttagg catcggaatg tatggattat atccttccga ttatatcagg 720

cagcttaatc tcgttaagct tgtgcctgca ctaagcttga aggcgcgaat cgcttatgtg 780

aaaaccatgt tgactgaacc gcggacggtt agttatggtg ctacatatgt tgcagagcgc 840

ggggaagtca ttgccacaat tccggtcggc tatgctgacg gctattcccg tgaactttcc 900

aaccgcggtt ttattcttca tcgaggaaga cgagtgccgg tggcgggaag agtaacaatg 960

gatatgataa tggtcagtct gggagagggt gaaggtaaac aaggagagga agtcgtgatt 1020

tacggccggc aaaagggagc agagatatct gttgatgaaa ttgcggaaat gcttgatacg 1080

atcaactatg aagtggtatc taccataagc tggcgcgtcc ctcgttttta tataagagac 1140

ggcgagattt ttaaaaagtc gaccccgctg ttatacgtgt ag 1182

<210> 31

<211> 978

<212> DNA

<213> 地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)

<400> 31

atgaaagtaa tttttttttc tatgcacccg tatgaagagg aatttctggg tccgattctg 60

ccgtctgact gggacgtaga aatgaccccg gactttctgg acgaaaccac cgtggaaaag 120

gctaaaggtg cccaggtagt aagcctgttt gtttctgaca aagctgatgg tccggtactg 180

gaagcgctgc attcttacgg tgtgggcctg ctggccctgc gttctgctgg ctatgatcac 240

atcgatattg agaccgcaaa acgcctgggt atcaaagtag ttaacgtgcc agcctattct 300

ccgcacgcta tcgctgacca tactctggct atcatgctgg ctctgattcg tcgtctgcac 360

cgtgcccatg ataaagtgcg cctgggtgat tttgatctgg atggtctgat gggctttgat 420

ctgaacggca aagttgctgg tgtaattggt ctgggtaaaa tcggtcgcct ggtagctacc 480

cgcctgaaag cgtttggttg caaagttctg ggctatgatc catacattca gccggaaatc 540

gtagaaaacg ttgatctgga taccctgatc actcaggctg atatcatttc tattcattgt 600

ccgctgaccc gtgaaaactt tcatatgttt aacgaagaga cttttaagcg tatgaaaccg 660

ggtgctattc tggttaacac cgcgcgtggt ggtctgatcg ataccaaggc cctgctggag 720

gccctgaagt ctggtaaact gggcggcgca gccctggatg tgtatgaata tgaacgtggc 780

ctgtttttta aaaaccacca aaaagaaggt atcaaagacc cgtatctggc ccagctgctg 840

ggtctggcca acgtagtgct gaccggtcat caggcctttc tgacccgtga ggctgtaaaa 900

aacatcgaag aaactaccgt agaaaacatt ctggaatggc aaaagaaccc gcaggcaaag 960

ctgaaaaacg aaatctaa 978

<210> 32

<211> 372

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

Met Lys Ile Gly Ile Pro Lys Glu Ile Lys Asn Asn Glu Asn Arg Val

1 5 10 15

Ala Ile Thr Pro Ala Gly Val Met Thr Leu Val Lys Ala Gly His Asp

20 25 30

Val Tyr Val Glu Thr Glu Ala Gly Ala Gly Ser Gly Phe Ser Asp Ser

35 40 45

Glu Tyr Glu Lys Ala Gly Ala Val Ile Val Pro Asn Ala Glu Asp Ala

50 55 60

Trp Thr Ala Glu Met Val Leu Lys Val Lys Glu Pro Leu Ala Glu Glu

65 70 75 80

Phe Arg Tyr Phe Arg Pro Gly Leu Ile Leu Phe Thr Tyr Leu His Leu

85 90 95

Ala Ala Ala Glu Ala Leu Thr Lys Ala Leu Val Glu Gln Lys Val Val

100 105 110

Gly Ile Ala Tyr Glu Thr Val Gln Leu Ala Asn Gly Ser Leu Pro Leu

115 120 125

Leu Thr Pro Met Ser Glu Val Ala Gly Arg Met Ser Val Gln Val Gly

130 135 140

Ala Gln Phe Leu Glu Lys Pro His Gly Gly Lys Gly Ile Leu Leu Gly

145 150 155 160

Gly Val Pro Gly Val Arg Arg Gly Lys Val Thr Ile Ile Gly Gly Gly

165 170 175

Thr Ala Gly Thr Asn Ala Ala Lys Ile Ala Val Gly Leu Gly Ser Asp

180 185 190

Val Thr Ile Leu Asp Ile Asn Ala Glu Arg Leu Arg Glu Leu Asp Asp

195 200 205

Leu Phe Gly Asp His Val Thr Thr Leu Met Ser Asn Ser Tyr His Ile

210 215 220

Ala Glu Cys Val Arg Glu Ser Asp Leu Val Val Gly Ala Val Leu Ile

225 230 235 240

Pro Gly Ala Lys Ala Pro Lys Leu Val Thr Glu Glu Met Val Arg Ser

245 250 255

Met Thr Pro Gly Ser Val Leu Val Asp Ile Ala Ile Asp Gln Gly Gly

260 265 270

Ile Phe Glu Thr Thr Asp Arg Val Thr Thr His Asp Asp Pro Thr Tyr

275 280 285

Val Lys His Gly Val Val His Tyr Ala Val Ala Asn Met Pro Gly Ala

290 295 300

Val Pro Arg Thr Ser Thr Phe Ala Leu Thr Asn Val Thr Ile Pro Tyr

305 310 315 320

Ala Leu Gln Ile Ala Asn Lys Gly Tyr Arg Ala Ala Cys Leu Asp Asn

325 330 335

Pro Ala Leu Leu Lys Gly Ile Asn Thr Leu Asp Gly His Ile Val Tyr

340 345 350

Glu Ala Val Ala Ala Ala His Asn Met Pro Tyr Thr Asp Val His Ser

355 360 365

Leu Leu His Gly

370

Claims

1.一种生产L-丙氨酸的基因工程菌株的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

提供具有丙酮酸合成途径的起始菌；

S300：插入具有42℃～55℃热稳定性的丙氨酸脱氢酶基因GSald；

2.如权利要求1所述的生产L-丙氨酸的基因工程菌株的构建方法，其特征在于，所述起始菌还具有乳酸合成途径，且所述起始菌的基因组中含有乳酸脱氢酶基因；

所述的构建方法还包括如下步骤：

S100：失活或缺失所述起始菌的基因组中的乳酸脱氢酶基因。

3.如权利要求2所述的生产L-丙氨酸的基因工程菌株的构建方法，所述起始菌还具有D-乳酸合成途径，且所述起始菌的基因组中含有D-乳酸脱氢酶基因ldh_Ti；

所述的构建方法还包括如下步骤S500：失活或缺失所述起始菌的基因组中含有的D-乳酸脱氢酶基因ldh_Ti；

优选地，所述D-乳酸脱氢酶基因ldh_Ti的序列如SEQ ID NO.31所示。

4.如权利要求1所述的生产L-丙氨酸的基因工程菌株的构建方法，其特征在于，所述6-磷酸果糖激酶基因pfk的序列如SEQ ID NO.27所示，所述丙酮酸激酶基因pyk的序列如SEQID NO.28所示；和/或，

所述丙氨酸脱氢酶基因GSald的序列如SEQ ID NO.1所示。

5.如权利要求1所述的生产L-丙氨酸的基因工程菌株的构建方法，其特征在于，所述步骤S400中，失活或缺失的所述丙氨酸消旋酶基因的种类为1种、2种或更多种；和/或，

所述步骤S400包括：失活或缺失丙氨酸消旋酶基因alr1和丙氨酸消旋酶基因alr2；

优选地，所述丙氨酸消旋酶基因alr1的序列如SEQ ID NO.29所示，所述丙氨酸消旋酶基因alr2的序列如SEQ ID NO.30所示。

6.如权利要求2所述的生产L-丙氨酸的基因工程菌株的构建方法，其特征在于，对所述起始菌的基因组进行改造包括步骤S100和步骤S200；

优选地，对所述起始菌的基因组进行改造包括步骤S100、步骤S200和步骤S300。

7.如权利要求2所述的生产L-丙氨酸的基因工程菌株的构建方法，其特征在于，对所述起始菌的基因组进行改造包括步骤S100、步骤S200、步骤S300和步骤S400。

8.如权利要求3所述的生产L-丙氨酸的基因工程菌株的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

S500：敲除所述起始菌的基因组中含有的D-乳酸脱氢酶基因ldh_Ti；

S300：插入异源的丙氨酸脱氢酶基因GSald；和

S400：敲除丙氨酸消旋酶基因alr1和丙氨酸消旋酶基因alr2。

9.如权利要求1所述的生产L-丙氨酸的基因工程菌株的构建方法，其特征在于，在步骤200和步骤300中，插入相关基因的方式为在染色体上增加该基因的拷贝，并在该基因前面串联启动子。

10.如权利要求9所述的生产L-丙氨酸的基因工程菌株的构建方法，其特征在于，所述启动子为P_als。

11.如权利要求10所述的生产L-丙氨酸的基因工程菌株的构建方法，其特征在于，所述启动子的序列如SEQ ID NO.2所示。

12.如权利要求1～11中任一项所述的生产L-丙氨酸的基因工程菌株的构建方法，其特征在于，所述生产L-丙氨酸的基因工程菌株能够在42℃～55℃发酵生产L-丙氨酸。

13.如权利要求1～11中任一项所述的生产L-丙氨酸的基因工程菌株的构建方法，其特征在于，所述起始菌为嗜热菌。

14.如权利要求1～11中任一项所述的生产L-丙氨酸的基因工程菌株的构建方法，其特征在于，所述起始菌为芽孢杆菌。

15.如权利要求14所述的生产L-丙氨酸的基因工程菌株的构建方法，其特征在于，所述起始菌为地衣芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、甲基营养芽孢杆菌、嗜热菊糖芽孢杆菌或嗜热脂肪地芽孢杆菌。

16.如权利要求14所述的生产L-丙氨酸的基因工程菌株的构建方法，其特征在于，所述起始菌为地衣芽孢杆菌ATCC 14580及其衍生菌株。

17.如权利要求14所述的生产L-丙氨酸的基因工程菌株的构建方法，其特征在于，所述起始菌为地衣芽孢杆菌BN11，保藏号为CCTCC NO:M2016026，于2016年1月8日保藏于中国典型培养物保藏中心。

18.根据权利要求1～17中任一项所述的构建方法制得的基因工程菌株。

19.如权利要求18所述的基因工程菌株在生产L-丙氨酸中的应用。

20.一种L-丙氨酸的生产方法，对权利要求18所述的基因工程菌株进行发酵培养，其中，发酵培养温度为42℃～55℃。

21.如权利要求20所述的生产方法，其特征在于，所述发酵培养步骤包括：将活化的种子接种到发酵培养基中，所述发酵培养基中包含碳源，在搅拌速度为50rpm～350rpm的条件下进行分批补料发酵，培养至设定的发酵密度。

22.如权利要求21所述的生产方法，其特征在于，在所述发酵培养步骤中，所述碳源为葡萄糖、甘油、木糖或阿拉伯糖。

23.如权利要求21所述的生产方法，其特征在于，在所述发酵培养步骤中，所述发酵培养基包含以下成分：葡萄糖、酵母粉、硫酸铵、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、硫酸镁、硫酸亚铁和硫酸锰。

24.如权利要求21所述的生产方法，其特征在于，所述发酵培养步骤包括：使用20％～30％(w/v)的氨水调节pH为7.0±0.2，通气量为0.8vvm～1.2vvm，初始搅拌转速为280rpm～320rpm，进行发酵培养6～8小时至OD600值达到6.5～8.0，停止通气，调节搅拌转速为60rpm～100rpm，继续发酵培养到50小时～70小时，结束发酵；在发酵过程中，所述碳源的浓度降到一定值时补充所述碳源；

优选地，在发酵过程中，所述碳源的浓度降到30g/L～50g/L时，补充一次所述碳源，至所述碳源的浓度为80g/L～120g/L；

优选地，在发酵过程中，所述碳源的浓度降到30g/L～50g/L时进行第一次补充所述碳源，至所述碳源的浓度为80g/L～120g/L，然后，当所述碳源的浓度降到20g/L～40g/L时，第二次补充所述碳源，至所述碳源的浓度为60g/L～80g/L。

25.如权利要求24所述的生产方法，其特征在于，在所述发酵培养步骤中，所述碳源为葡萄糖。

26.如权利要求20～25中任一项所述的生产方法，其特征在于，所述的生产方法在所述发酵培养步骤之前还进行种子培养得到活化的种子，然后将所述活化的种子接种到发酵培养基中进行所述发酵培养。

27.如权利要求26所述的生产方法，其特征在于，

所述种子培养步骤包括：将所述的基因工程菌株接种到种子培养基中，在种子培养温度为42℃～55℃的条件下培养12h～16h，得到所述活化的种子。

28.如权利要求26所述的生产方法，其特征在于，在所述种子培养步骤中，所述种子培养基包含以下成分：蛋白胨、酵母粉和氯化钠。