CN102666838A - 用于高效产生化学品的工程化微生物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及从已经被基因工程化和代谢进化的微生物生产化学品。已经建立了化学品生产的改善，并且已经鉴定了导致这些改善的特定突变。给出了鉴定突变的具体实例，其中所述突变在经基因工程化修饰以产生琥珀酸的细菌菌株的代谢进化期间出现。本发明也提供一种用于评价突变的工业应用性的方法，其中所述突变是在代谢进化期间选择到的用来增加琥珀酸产生的突变。本发明还提供经工程化以具有突变的微生物，其中所述突变是在代谢进化期间选择到的并且对改进琥珀酸、其他有机酸和有商业利益的其他化学品的产生作出贡献。

Description

用于高效产生化学品的工程化微生物
相关申请的交叉引用
本申请要求2009年11月18日提交的美国临时申请系列号61/281,481的优先权。
政府资助
本发明在美国政府资助下在美国能源部以授予号DE-EE0002878/001所授予的合同下产生。美国政府享有本发明中的某些权利。
背景技术
在最近十年期间，随着我们关于微生物基因组、细胞内部生物化学途径、代谢流分析、微阵列分析和计算机方式分析的知识爆炸式增长，工业微生物学大胆地进入了使用生物催化剂从可再生原料制造化学品。
一份名为“来自生物量的增加高级价值的化学品”的2004年美国能源部报告已经确定了15种可以使用生物催化剂，从可再生原料产生的结构单元化学品。这15种结构单元化学品是1，4-二酸(琥珀酸、延胡索酸和苹果酸)、2，5-呋喃二羧酸、3-羟基丙酸、天冬氨酸、葡糖二酸、谷氨酸、衣康酸、乙酰丙酸、3-羟基丁内酯、甘油、山梨醇、木糖醇和阿拉伯糖醇。在美国能源部所确定的这15种化学品中，使用生物催化剂的工业规模琥珀酸生产已经明显取得进展(Kurzrock和Weuster-Botz，2009；Lee等人，2008；Andersson等人，2007；Lu等人，2009；美国专利申请公开号2006/0073577)。
牛瘤胃中定居的细菌已知在厌氧生长件下产生琥珀酸。已经将许多瘤胃细菌如琥珀酸放线杆菌(Actinobacillus succinogens)，产琥珀酸厌氧螺菌(Anaerobiosprillum succiniproducens)和产琥珀酸曼氏溶血杆菌(Mannheimia succiniproducens)分离并且开发为用于琥珀酸生产的生物催化剂。利用微生物碳代谢和微生遗传学的联合知识，也已经构建了能够以接近商业可行性的滴度、速率和产率产生琥珀酸的大肠杆菌(Escherichiacoli)菌株。美国专利号7,223,567描述了在丰富生长培养基中产生琥珀酸的大肠杆菌菌株SBS550MG的构建。美国专利号6,455,284描述了构建带有外源丙酮酸羧化酶基因的大肠杆菌菌株作为用于琥珀酸生产的生物催化剂。丙酮酸羧化酶不存在于野生型大肠杆菌菌株中。可以在组成型启动子下表达从其他微生物如埃特里根瘤菌(Rhizobium elti)获得的丙酮酸羧化酶基因，以增强琥珀酸产生。PCT专利申请号WO/2008/115958和WO/2010/115067描述了大肠杆菌菌株KJ122的构建，所述菌株是用于基本生长培养基中产生琥珀酸的生物催化剂。
为实现琥珀酸和其他化学品在商业上有吸引力的生物合成产生，需要进一步的遗传操作。仍需要使用新的遗传方法，通过操作细胞内部的生物化学途径而改善由微生物产生琥珀酸和其他化学品的总体“效率”(定义为，包括但不限于滴度、速率和产率)。也可以通过改善产生所需化学品的微生物细胞的生长速率，实现琥珀酸或其他化学品产生效率的增加，从而到了将化学品产生与细胞生长偶联的程度。大肠杆菌中琥珀酸产生的最大理论产量据计算是每1mol葡萄糖1.714mol琥珀酸，提供了质量产率(massyield)为1.12克琥珀酸/1克消耗的葡萄糖(Vemuri等人，2002)。
美国专利申请公开号2008/0009041描述了包含比野生型大肠杆菌菌株短至少470kb的染色体DNA的大肠杆菌菌株。这种突变体大肠杆菌菌株积累更多的细胞物质并且显示积累的苏氨酸的量显著增加。
美国专利申请公开2009/0075333也描述具有减少基因组尺寸的大肠杆菌菌株，所述菌株与亲本菌株相比具有相等或改进的生长速率、转化效率、蛋白质表达、DNA生产、DNA产率和/或DNA品质中的一种或多种性质。
美国专利申请公开2009/0221055描述了新的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)突变体菌株，其具有因基因破坏所致的多种酶的良好生产率(productivity)。
减小基因组尺寸以实现增加的生长速率的这些方法基于这样的事实：发酵罐中生长的细菌包含可以缺失的许多非必需基因。在天然环境中生活的细菌具有许多条件反应性基因以提供度过温度、胁迫或食物来源匮乏的艰难环境条件存活下来的机制。复制这些在发酵罐中为非必需的基因需要付出在这些非必需基因不存在的情况下本来可以保留下来的细胞能量。
尽管减小基因组尺寸的方法可以用于改善产生重组蛋白、核酸和氨基酸的菌株的生长性能，未曾显示该方法是改善菌株的性能以产生其他化学品如琥珀酸、延胡索酸和苹果酸的有用方法，其中所述酸是Krebs循环(也称作三羧酸循环或TCA循环中的中间体)。产生这些化学品和其他化学品的效率还取决于碳经中心代谢途径中的不同路径流动的速率，并且在一些情况下，取决于厌氧或微有氧生长期间实现有利的氧化还原平衡。
美国专利申请公开2009/0075352和Lee等人(2005)描述了一种用于基于计算机上分析改善细菌菌株的方法。在这种方法中，以显著量产生琥珀酸的产琥珀酸曼氏溶血杆菌的基因组序列与大肠杆菌基因组序列比较，以鉴定大肠杆菌中待缺失的最佳基因，目的是将野生型大肠杆菌菌株转变成产琥珀酸菌株。虽然这种方法在表面上看上去有吸引力，仍待观察源自产琥珀酸曼氏溶血杆菌的遗传信息是否可以外推至大肠杆菌以实现商业上可行的产琥珀酸菌株。从上文引用的美国专利申请中推荐的缺失是ptsG、pykA和pykF的组合。然而，从这种菌株实际实现的琥珀酸滴度仅是8.16mM(0.96g/l)，这无论如何不接近具有商业吸引力的生产所需要的水平，并且该菌株的生长很差。另外，较早已经报道了与上文参考的申请中推荐相似的缺失突变组合(pykA、pykF和ptsHI)，并且所得到的菌株在葡萄糖上生长得十分差(Ponce等人，1995)。因而，Lee等人(2005)描述的突变组合不足以构建商业上可行的菌株，并且所述突变没有在可以证明这些突变对商业上可行的菌株是必需或适宜的菌株背景下检验过。因此，对于本领域技术人员而言，从上文公开中不存在抵达商业上可行的产琥珀酸菌株的路线，所述菌株将需要在葡萄糖或其他廉价碳源上良好生长并且产生至少20g/l琥珀酸(170mM)。
为了与用于化学合成的石油化学方法竞争，本领域需要开发更高效的用于化学品生产的生物催化剂。第一步骤是鉴定在宿主染色体中对增强的化学品产生能作出贡献的遗传改变。考虑到这种情形，本发明的目的将是鉴定新突变，所述的新突变可以用来改善针对工业用途所选择的微生物菌株产生化学品。在具体实施方案中，本发明的一个目的是改善微生物产生有机酸的效率。在更具体的实施方案中，目的是改善产生琥珀酸的效率。在本发明的另一个方面，所述目的是了解总体上如何理性地改善从微生物中产生化学品如琥珀酸，而无必要求助于费力的方法如代谢进化法。
已经对谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)菌株进行了一种类型的反向工程，其中已经将所述的谷氨酸棒状杆菌诱变并且筛选高赖氨酸产生。高度改变的产赖氨酸菌株的基因组与野生型菌株的基因组比较，并且差异用来再工程化突变最少的菌株(Ikeda等人，2006)。然而，找到几百个突变，并且虽然这些突变中少数似乎在赖氨酸过量产生中发挥主要作用，但是全部检验几百个突变的关联性是高度不现实的。在表面上，本文中公开的本发明可能似乎与该现有技术中所公开内容相似，然而主要不同之处在于，不诱变本发明起始菌株，而是允许其自发突变，并且不筛选所述菌株，而是在代谢进化的过程中选择它。这导致区分本发明的至少两个主要不同之处：(1)突变的密度低得多，几乎低两个数量级，和(2)本发明中所检验的全部8个突变证明与改进的生长或改进的化学品产生效率相关。因而，本发明的方法和材料比现有技术的那些方法和材料显著改进。
发明简述
本发明提供了具有改进的产生化学品如琥珀酸的能力的微生物。
本发明也提供一种构建微生物的方法，所述微生物具有改进的产生化学品如琥珀酸的能力。
本发明也提供一种使用微生物产生琥珀酸的方法，所述微生物具有改进的产生化学品如琥珀酸的能力。
在本发明的一个实施方案中，提供一种微生物，所述微生物具有改进的产生化学品如琥珀酸的能力并且具有突变的pykA基因。
在本发明的另一个实施方案中，提供一种微生物，所述微生物具有改进的产生化学品如琥珀酸的能力并且具有突变的pykF基因。
在本发明的又一个实施方案中，提供一种微生物，所述微生物具有改进的产生化学品如琥珀酸的能力并且具有突变的pykA和pykF基因。
在本发明的一个实施方案中，提供一种微生物，所述微生物具有改进的产生化学品如琥珀酸的能力并且具有失活或突变的galS基因。
在本发明的一个实施方案中，提供一种微生物，所述微生物具有改进的产生化学品如琥珀酸的能力并且具有失活或突变的galR基因。
在本发明的另一个实施方案中，提供一种微生物，所述微生物具有改进的产生琥珀酸的能力并且具有galP基因的多个拷贝。
在本发明的又一个实施方案中，提供一种微生物，所述微生物具有改进的产生琥珀酸的能力并且具有galP基因的多个拷贝和突变的用于转运葡萄糖至细胞中的磷酸转移酶系统(PTS)。
在本发明的又一个实施方案中，提供一种微生物，所述微生物具有改进的产生化学品如琥珀酸的能力和基因组的大区域缺失，其中所述的基因组的大区域包含多个基因，包括染色体DNA的48kb区域内的基因ydcC至ydcF。
在本发明的一个实施方案中，提供一种微生物，所述微生物具有改进的产生化学品如琥珀酸的能力和在rpoA基因中的错义突变。
在本发明的又一个实施方案中，提供一种微生物，所述微生物具有改进的产生化学品如琥珀酸的能力和在rpoA基因第322氨基酸位置处的突变。
在本发明的又一个实施方案中，提供一种微生物，所述微生物具有改进的产生化学品如琥珀酸的能力和在rpoA基因第322氨基酸位置处的脯氨酸至亮氨酸突变。
在本发明的又一个实施方案中，提供一种微生物，所述微生物具有改进的产生化学品如琥珀酸的能力和在rpoC基因中的突变。
在本发明的又一个实施方案中，提供一种微生物，所述微生物具有改进的产生化学品如琥珀酸的能力和在rpoC基因的F区内的突变。
在本发明的又一个实施方案中，提供一种微生物，所述微生物具有改进的产生化学品如琥珀酸的能力和在rpoC基因的F区内第747位置处的氨基酸错义突变。
在本发明的又一个实施方案中，提供一种微生物，所述微生物具有改进的产生化学品如琥珀酸的能力和在rpoC基因的F区内第747位置处的甲硫氨酸至异亮氨酸突变。
在本发明的一个实施方案中，提供一种微生物，所述微生物具有改进的产生化学品如琥珀酸的能力并且具有gldA基因中的突变。
在本发明的一个实施方案中，提供一种微生物，所述微生物具有改进的产生化学品如琥珀酸的能力并且具有ftsI基因中的突变。
在本发明的又一个实施方案中，提供一种微生物，所述微生物具有改进的产生化学品如琥珀酸的能力并且具有在dhaM基因中的突变。
附图简述
本申请中不包括附图。
发明详述
本发明中公开了适于通过发酵过程产生琥珀酸的微生物。虽然本发明提供了用于通过遗传修饰的细菌菌株从碳化合物以商业显著的量产生琥珀酸的方法，但是本发明的教授内容同等地适用于工业地产生许多的其他化学品。
出于描述本发明的目的，应当使用以下定义。
利用本发明，可以制造许多工业有用的化学品。此类化学品的实例包括但不限于乙醇、丁醇、乳酸盐、琥珀酸盐、延胡索酸盐、苹果酸盐、苏氨酸、甲硫氨酸和赖氨酸。由于有机酸可以作为游离酸和作为盐(例如，但不限于钠、钾、镁、钙、铵盐、氯化物、硫酸盐、碳酸盐、碳酸氢盐等)存在，化学名称如琥珀酸、延胡索酸、苹果酸、天冬氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸和赖氨酸应当意图包括游离酸及其任何盐。类似地，任何盐如琥珀酸盐、延胡索酸盐、苹果酸盐、天冬氨酸盐等也应当意图包括游离酸。
本发明将特定的遗传修饰技术与代谢进化过程组合，以获得在厌氧或微有氧生长条件下在具有碳水化合物底物的无机盐培养基中显示琥珀酸生产高产量、滴度和体积生产率的菌株。
如本发明中所用，术语“滴度”意指发酵液中特定化合物的摩尔浓度。因而在本发明用于产生琥珀酸的发酵过程中，琥珀酸滴度100mM将意指发酵液在测量时含有每升发酵液100毫摩尔琥珀酸。
如本发明中所用，术语“产量”指在发酵过程期间每摩尔消耗的原料所产生的特定化合物的摩尔数。因而在利用葡萄糖作为原料产生琥珀酸的发酵过程中，术语“产量”指每摩尔消耗的葡萄糖所产生的琥珀酸的摩尔数。
如本发明中所用，术语“体积生产率”指每单位体积每单位时间以克计产生的特定化合物的量。因而，琥珀酸的体积生产率值0.9g L-1h-1将意指在1小时生长期间在1升发酵液中积累0.9克琥珀酸。
如本文所用的术语“基因工程的”或“遗传修饰的”指通过操作微生物的基因组DNA而改变微生物中一种或多种酶表达的实践。
如本发明中所用，术语“基因”包括基因的可读框以及上游和下游调节序列。上游调节区也称作基因的启动子区。下游调节区也称作终止子区。
“等位基因”是特定基因的DNA序列的两种或多种形式中的一种。与具有突变的相应基因相比较时，没有任何突变的每个基因称作野生型等位基因。
“同源物”是与从共同祖先DNA序列遗传的第二基因相关的基因。术语“同源物”可以适用于因物种形成事件而分离的基因之间的关系或适用于因遗传重复事件而分离的基因之间的关系。“直向同源物”是不同物种中通过物种形成从共同祖先基因进化而来的基因。正常情况下，直向同源物在进化的过程中保留相同功能。直向同源物的鉴定对于新测序基因组中基因功能的可靠预测是重要的。物种形成是新物种的起源，其中所述新物种能够从产生所述新物种的物种中以新方式生存。作为该过程的部分，它也已经获得一些与亲本物种遗传交换的屏障。“旁系同源物”是因基因组内部重复而相关的基因。直向同源物在进化的过程中保留相同功能，而旁系同源物演化出新功能，即便这些新功能与原始功能相关。
短语“功能上相似的”广义地意指来自任何生物的任何野生型或突变DNA序列、基因、酶、蛋白质，其具有与通过本文中公开的方法在相同或不同生物中找到的任何野生型或突变DNA序列、基因、酶、蛋白质等同或相似的生物学功能。功能相似性不需要要求序列同源性。例如，在中本发明，我们发现在pykA中的突变降低但是并不消除大肠杆菌中的总丙酮酸激酶活性，这导致更高效的琥珀酸产生。通过延展，在另一类型生物例如酵母(Saccharomyces)中减少丙酮酸激酶的突变是功能上相似的，并且酵母中的相关基因，例如PYK1或PYK2基因，将在功能上与大肠杆菌的pykA基因相似。
将具有“改变的活性”的基因或蛋白质广义地定义为，与相关的野生型基因或蛋白质相比时在可度量属性方面产生可度量差异的基因或蛋白质。改变的活性可能以一般方式通过增加或减少含有改变的基因或蛋白质的菌株的生长速率或琥珀酸产生效率而自我表现。其他可度量的属性包括但不限于酶活性、酶的底物特异性、酶的动力学参数如底物亲和力或速率、酶稳定性、酶的调节性能、基因表达水平、多种条件下对基因表达的调节等。
如本发明中所用，术语“突变”指对基因(包括可读框、上游调节区和下游调节区)所做的遗传修饰。基因突变导致该基因的可读框转录的上调或下调或完全抑制。通过缺失基因的整个编码区或一部分编码性核苷酸序列或通过导入移码突变、错义突变或插入或通过导入终止密码子或其组合基因实现突变。突变可以在编码直接参与生物学功能如酶反应或有机分子跨细胞膜转运的蛋白质的结构基因中出现。备选地，突变可以在编码蛋白的调节基因中出现，其中所述蛋白质控制编码直接参与生物学功能的蛋白质的基因的表达。控制其他基因表达的蛋白质称作调节蛋白并且编码这些调节蛋白的基因称作调节基因。
“突变”还应当包括DNA序列中相对于相关野生型生物的任何变化。例如，菌株KJ122中存在的突变是在DNA序列中当已突变区域的DNA序列与亲本野生型菌株大肠杆菌C(又称作ATCC 8739)的DNA序列比较时可以找到的任何变化。突变可以具有任何数目的碱基对的额外DNA的插入或具有任何数目的碱基对的DNA的缺失。一种特定类型的插入突变是基因重复。基因可以因自发突变事件而重复，其中该基因的第二副本可以毗邻于原始副本存在，或基因可以因基因工程操作而重复，其中该基因的第二副本可以位于基因组中远离原始副本的位点处。突变可以从一种碱基类型变化成另一种碱基类型，例如从腺嘌呤变化成鸟嘌呤碱基。在遗传学的术语中，突变可以是错义(其改变密码子编码的氨基酸)、无义(其改变密码子成终止密码子)、移码(其是不为3的倍数的多个碱基的插入或缺失，并且改变可读框并从该突变下游起改变所编码的氨基酸序列并且在该突变下游通常导入终止密码子)或倒位(其因DNA序列极性转换产生，而不是因缺失产生)。
“无效突变(null mutation)”是这样的突变，其赋予基本上与缺失相关基因的整个可读框相同的表型或其消除相关基因的全部可度量活性。
“突变体”是其基因组含有一个或多个突变的微生物。
如本发明中所用，术语“外源的”意图意指源自细胞外部的分子或活性被导入宿主微生物中。在外源核酸分子被导入微生物细胞中的情况下，导入的核酸可以作为独立质粒存在或可以整合至宿主染色体DNA中。编码蛋白质的外源核酸可以以具有自身调节序列如启动子和终止子序列的可表达形成导入微生物细胞中。备选地，该外源核酸分子可以整合至宿主染色体DNA中并且可以处于宿主调节序列的控制下。
术语“内源的”指存在于宿主细胞内部的分子和活性。当谈及生物合成活性使用时，术语“外源的”指导入宿主参比生物中的活性。来源可以是例如导入宿主微生物后表达所指活性的同源的或异源的编码核酸。如果从该微生物的相同物种获得编码蛋白质的核酸，则该核酸称作同源DNA。如果核酸源自不同的微生物物种，则该核酸称作异源DNA。无论DNA的性质是什么，它是否为同源的或异源的，当导入宿主细胞中时，从所导入DNA衍生的DNA以及活性称作外源的。因此，本发明编码性核酸的外源表达可以利用异源和同源编码性核酸中的任一者或两者。
“微生物”应当包括任何细菌、archeon、酵母、丝状真菌、单细胞藻类或沟鞭藻(dinoflagellate)。
最适于本发明的重组微生物源自许多细菌科，优选地源自肠杆菌科(Enterobacteriaceae)。合适的微生物选自埃希氏菌(Escherichia)、欧文氏菌属(Erwinia)、普罗威登斯菌属(Providencia)和沙雷菌属(Serratia)。特别优选埃希氏菌属。在埃希氏菌属内部，特别优选大肠杆菌物种。任一个大肠杆菌菌株如大肠杆菌B、大肠杆菌C、大肠杆菌W等用于本发明。
能够以显著量产生有机酸的大肠杆菌菌株是本领域熟知的。例如，美国专利申请公开号2009/0148914提供大肠杆菌菌株作为用于产生化学纯乙酸盐和/或丙酮酸盐的生物催化剂。美国专利7,629,162提供了为产生乳酸所构建的大肠杆菌K011菌株的衍生物。在专利合作条约下公布的国际专利申请号WO2008/115958和WO2010/115067提供了经工程化以在含有葡萄糖作为碳源的基本无机盐培养基中以pH受控制的分批发酵法产生琥珀酸和苹果酸的微生物。
在本发明的一些其他实施方案中，可以根据本发明修饰的细菌包括但不限于带马瓦无色杆菌(Achromobacter delmarvae)、粘无色杆菌(Achromobacter viscosus)、乳无色杆菌(Achromobacter lacticum)、马杜拉放线菌(Actinomadura madurae)、紫产色放线菌(Actinomycesviolaceochromogenes)、杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)、根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)、放射形农杆菌(Agrobacteriumradiobacter)、粪产碱菌(Alcaligenes faecalis)、柠檬节杆菌(Arthrobactercitreus)、肿胀节杆菌(Arthrobacter tumescens)、石蜡节杆菌(Arthrobacterparaffineus)、烃谷氨酸节杆菌(Arthrobacter hydrocarboglutamicus)、氧化节杆菌(Arthrobacter oxydans)、天牛金杆菌(Aureobacterium saperdae)、印度固氮菌(Azotobacter indicus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliqyefaciens)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、解硫胺素芽孢杆菌(Bacillus thiaminolyticus)、产氨短杆菌(Brevibacterium ammoniagenes)、叉开短杆菌(Brevibacterium divaricatum)、乳发酵短杆菌(Brevibacteriumlactofermentum)、黄短杆菌(Brevibacterium flavum)、Brevibacteriumglobosum、暗褐短杆菌(Brevibacterium fuscum)、酮戊二酸短杆菌(Brevibacterium ketoglutamicum)、Brevibacterium helcolum、极小短杆菌(Brevibacterium pusillum)、需土短杆菌(Brevibacterium testaceum)、玫瑰色短杆菌(Brevibacterium roseum)、Brevibacterium immariophilium、扩展短杆菌(Brevibacterium linens)、Brevibacterium protopharmiiae、弗氏柠檬酸细菌(Citrobactor freundii)、嗜乙酰棒杆菌(Corynebacteriumacetophilum)、谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)、帚石南棒杆菌(Corynebacterium callunae)、嗜乙酰乙酸棒杆菌(Corynebacteriumacetoacidophilum)、醋谷棒杆菌(Corynebacterium acetoglutamicum)、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)、解淀粉欧文氏菌(Erwinia amylovora)、胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwinia carotovora)、草生欧文氏菌(Erwiniaherbicola)、菊欧文氏菌(Erwinia chrysanthemi)、弗氏埃希氏菌(Escherichia freundii)、奇异黄杆菌(Flavobacterium peregrinum)、染色黄杆菌(Flavobacterium  fucatum)、橙色黄杆菌(Flavobacteriumaurantinum)、莱菌黄杆菌(Flavobacterium rhenanum)、塞沃尼黄杆菌(Flavobacterium sewanense)、短黄杆菌(Flavobacterium breve)、脑膜脓毒性黄杆菌(Flavobacterium meningosepticum)、氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)、浅井氏葡糖杆菌(Gluconobacter asaii)、Kitasatosporia parulosa、产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumonieae)、嗜氨微杆菌(Microbacteriumammoniaphilum)、微球菌属物种(Micrococcus sp.)CCM825、摩氏摩根氏菌(Morganella morganii)、灰暗诺卡氏菌(Nocardia opaca)、粗糙诺卡氏菌(Nocardia rugosa)、Planococcus eucinatus、雷氏变形菌(Proteusrettgeri)、谢氏丙酸杆菌(Propionibacterium shermanii)、类黄假单胞菌(Pseudomonas synxantha)、氮假单胞菌(Pseudomonas azotoformans)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、卵状假单胞菌(Pseudomonasovalis)、施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)、食酸假单胞菌(Pseudomonas acidovolans)、霉味假单胞菌(Pseudomonas mucidolens)、睾丸酮假单胞菌(Pseudomonas testosteroni)、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、红串红球菌(Rhodococcus erythropolis)、玫瑰色红球菌(Rhodococcus rhodochrous)、红球菌属物种(Rhodococcus sp.)ATCC15592、红球菌属物种(Rhodococcus sp.)ATCC 19070、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、脲芽孢八叠球菌(Sporosarcina ureae)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)、浅黄链霉菌(Streptomyces flavelus)、浅灰链霉菌(Streptomyces griseolus)、变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)、橄榄色链霉菌(Streptomycesolivaceus)、田无链霉菌(Streptomyces tanashiensis)、弗吉尼亚链霉菌(Streptomyces virginiae)、抗菌素链霉菌(Streptomyces antibioticus)、可可链霉菌(Streptomyces cacaoi)、淡紫灰链霉菌(Streptomyces lavendulae)、绿色产色链霉菌(Streptomyces viridochromogenes)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、薛氏沙门氏菌(Salmonella schottmulleri)、麦氏弧菌(Vibrio metschnikovii)、干酪弧菌(Vibrio tyrogenes)、柑桔黄单胞菌(Xanthomonas citri)等。
本发明提供遗传修饰的细菌菌株，在发酵条件下在含有碳源作为发酵过程底物的基本盐培养基中培育时，所述菌株显示令人印象深刻的琥珀酸滴度、高产率和突出的体积生产率。本发明的微生物可以在使用多种糖如己糖、戊糖、二糖和其他碳化合物如甘油的单步骤生产过程中使用。
术语“发酵”和“酵素(ferment)”在一些语境下表示生物的厌氧生长或代谢。然而，在本公开中，我们应当使用术语“发酵”和“酵素(ferment)”来广义地指微生物在包括有氧、厌氧或微有氧或其组合的任何条件下的商业性或实验性生长。
当生产生物的生长在氧或空气不存在或有限的条件下实施时，许多化学品的生物合成产生可以更高效地(例如，以更高的产率)继续进行。这主要是因为氧的存在一般导致碳源代谢成二氧化碳，一种相对低价值的副产物。在不有意输送氧或空气情况下的发酵通常称作“厌氧”。然而，实现严格厌氧条件是昂贵的并且有时难以达到。另外，对于一些发酵，严格厌氧条件不是必需的或有时不是最佳的。对于不严格使氧或空气不存在或当以低的受控速率有意输入氧或空气的发酵，我们应当使用术语“微有氧”。
适于实施本发明的微生物可以有氧地(在氧存在下)或厌氧地(在氧完全不存在下)或微有氧地(伴以最小量的氧供应)培育。在本发明的优选实施方案中，为产生琥珀酸所选择的微生物在厌氧条件下培育。备选地，适于本发明的微生物可以按双相生长方案培育，其中所述微生物起初在有氧生长条件下培育以达到某个细胞生长水平，随后，将其转移至厌氧生长条件以实现以商业显著的量产生琥珀酸。在由本发明微生物产生琥珀酸的双相生长期间，琥珀酸的产生和积累在厌氧发酵生长相期间出现。
在本发明中，已经使用基因突变的独特和有利组合来将碳流指向琥珀酸产生。此外，琥珀酸产生与微生物生长偶联，所述微生物生长转而偶联于细胞ATP水平和氧化还原平衡。
术语“氧化还原平衡”指细胞维持适宜NADH对NAD+比率的能力。换而言之，细胞能够氧化NADH，从而存在足够NAD+以在厌氧发酵生长期间氧化碳水化合物底物。在有氧生长期间，NAD+池通过涉及NADH的氧化磷酸化再生。然而，在厌氧生长条件下，仅通过操作碳流经细胞内部可以氧化NADH的多条代谢途径实现NAD+池的再生。
“碳分解代谢物阻遏”广义地指其中一个或多个基因的表达部分受该生物生长依赖的碳源调节的任何生物系统。例如，在大肠杆菌中，在野生型生物中糖异生方面发挥作用的基因因培养基中存在葡萄糖被阻遏。具体而言，大部分野生型大肠杆菌菌株中，pck基因被葡萄糖下调。作为另一个实例，在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的野生型菌株中，对除葡萄糖之外的碳源如半乳糖的利用因培养基中葡萄糖的存在而抑制。
“三羧酸循环”或“TCA”循环是在大部分微生物中完整或部分存在的一组生物化学反应。在许多生物例如真细菌和酵母中，TCA循环作为有氧生长期间的真实循环运行。在此情况下，TCA循环具有两项主要功能：将二碳单元(如乙酸盐)分解代谢成二氧化碳，和为生物合成产生生物化学中间体，如谷氨酸、琥珀酸和天冬氨酸。在厌氧或微有氧生长期间，TCA循环可能不作为真实循环运行，而是作为一条或多条线性途径运行。例如，在大肠杆菌中的低氧条件下，TCA循环酶作为两条途径运行，包含导致从琥珀酸至苹果酸的所谓还原性途径和导致从α-酮戊二酸至柠檬酸的所谓氧化性途径。在此情况下，TCA循环的功能主要是产生生物化学中间体谷氨酸、琥珀酸和天冬氨酸。一些碳可以在这两条支路之间通过乙醛酸支路转移。在有氧、厌氧和微有氧生长期间，对用于生物合成的每分子生物化学中间体而言，必须补充TCA循环中的分子，否则该化合物在循环中将耗竭。这种补充反应称作回补反应。
常见的回补反应取得一个三碳化合物，如丙酮酸或磷酸烯醇丙酮酸(PEP)，并且使用二氧化碳作为第二底物，将其转化成一个四碳化合物如草酰乙酸或苹果酸。
在许多生物如真细菌和酵母中，编码TCA循环和乙醛酸支路的酶的基因的表达被葡萄糖阻遏和/或由氧诱导(Cronan和Laporte，1996)。对这种调节的控制是复杂的。根据文献，琥珀酸和其他化合物的高效产生，尤其在低氧条件下，要求还原性TCA循环酶和乙醛酸支路的那些酶的精细平衡(Vemuri等人，2002；Wang等人，2007；Sanchez等人，2005)。
然而，现有技术没有取得足够进展，以致于理性地设计出最佳或接近最佳地利用TCA循环和乙醛酸支路途径用于化合物(如琥珀酸)生物合成的菌株。本发明的一个目标是在DNA序列的水平剖析高度地进化的接近最佳地产生TCA循环化学品的微生物，从而在将来，可以使用更合理的菌株设计和构建来工程化用于产生琥珀酸和其他化学品的菌株。在本发明中所发现的突变用于改善与TCA循环相关的化学品的生物合成，所述化学品包括TCA循环中间体和TCA循环中间体的衍生物，尤其源自草酰乙酸的化学品，其包括但不限于琥珀酸、延胡索酸、苹果酸、谷氨酸、天冬氨酸、苏氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸和异亮氨酸，原因是本文所述的突变用于在低氧条件下在基于葡萄糖(或其他糖)的培养基中增加指向或离开草酰乙酸的代谢流，而在野生型生物中，发挥作用以产生此类化合物的基因和酶以复杂方式受到负向调节。
经常存在于细菌中的一种糖转运机制是磷酸转移酶系统(PTS)。这种系统包含两种能量偶联蛋白质即酶I和HPr和几种糖特异性酶II蛋白质或蛋白质复合物(它们一般由3个蛋白质结构域EIIA、EIIB和EIIC组成)。EII结构域的组织在细菌之间不同。EII可以由单一融合蛋白或不同的融合和非融合结构域组成。特定糖的跨膜易位作用由整合型膜结构域EIIC和有时EIID促进。然而，正是一起发挥作用的这3种酶结构域或蛋白质的复合物才引起糖底物的转运和磷酸化，从而产生磷酸化碳水化合物的胞内池。PTS的能量和磷酸盐的来源是磷酸烯醇丙酮酸(PEP)。然而，PEP也可以是生物合成许多四碳化合物(如苹果酸、延胡索酸、琥珀酸、天冬氨酸)和由那些四碳化合物产生的其他化合物的底物，从而细胞内部PTS和生物合成途径之间存在对PEP的竞争。在大肠杆菌中，葡萄糖的PTS系统由ptsH、I、G和crr基因编码。存在不涉及PTS的转运糖至微生物中的其他机制。我们应当将参与这些不直接使用PEP作为底物的其他转运机制的蛋白质叫做“非PTS”糖转运蛋白。非PTS转运蛋白的实例是质子共运输蛋白(symporter)，如大肠杆菌的GalP和XylE，易化扩散蛋白如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的HEX1、2、6和7以及运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)的Glf，和ABC型转运蛋白，如大肠杆菌的XylFGH。
细菌中最大类别的糖转运蛋白称作ATP结合盒(ABC)转运蛋白。如名称暗示，ABC转运蛋白需要ATP分子用于转运每个糖分子至细菌细胞中。XylFGH是用于转运木糖(一种戊糖)至细胞中的ABC转运蛋白。AraFGH是用于转运阿拉伯糖(另一种戊糖)的ABC转运蛋白。
第二类型的非PTS细菌糖转运蛋白划归为主要易化因子超家族(MFS)。在MFS糖转运蛋白内部，确认了两种不同类别的转运蛋白。MFS包括H+-关联的共运输蛋白、Na+-关联的共运输蛋白-反向转运蛋白和单向转运蛋白。单向转运蛋白是用于糖转运的简单易化因子。大肠杆菌中的跨膜蛋白Glf是单向转运蛋白的实例。H+-共运输蛋白需要一个质子用于转运每个糖分子至细胞中。大肠杆菌中的GalP蛋白是一种用于转运半乳糖(己糖)至细胞中的共运输蛋白。GalP是表征十分充分的共运输蛋白，具有12个跨膜环。还报道GalP具有跨细胞膜转运葡萄糖的能力。AraE是用于跨细胞膜转运阿拉伯糖的质子关联共运输蛋白。类似地，XylE蛋白是用于转运木糖的质子关联共运输蛋白。
通过磷酸转移酶系统(PTS)消除葡萄糖摄入可以帮助减少将葡萄糖摄入微生物细胞时所消耗的能量。可以引导通过操作PTS保存的能量以改善生产有机酸的效率。可以操作磷酸转移酶系统基因ptsH和ptsG以保存在葡萄糖摄入方面的能量并且因而改善由微生物产生琥珀酸的效率。因而通过挖掘微生物代谢途径领域内可用的数据，可以缺失一组基因，从而以阻断大部分代谢途径并且将碳流引向高效率的琥珀酸产生。随着抑制PTS介导的葡萄糖摄入，可以激活用于葡萄糖摄入的其他系统以确保细胞内部用于产生工业有用化学品的葡萄糖持续可获得。例如，已经显示编码葡萄糖通透酶(一种葡萄糖单向转运蛋白)的glf基因顶替了PTS介导的葡萄糖摄入的损失。类似地，galP和glk基因的过量表达据报道增强大肠杆菌pts-菌株中的葡萄糖摄入和磷酸化。GalP是一种用于摄入半乳糖(一种己糖)的共运输蛋白。已经报道GalP在pts-菌株中转运葡萄糖。GalP介导葡萄糖摄入的意义由以下事实支持：发现pts-突变体中galP基因的失活是致死性的(Yi等人，2003)。需要Glk以实现葡萄糖分子在其可以进行糖酵解之前的磷酸化。GalP蛋白在pts-菌株中的表达可以通过在组成型启动子下表达外源基因或通过在编码galP基因阻抑物的基因如galS和galR中突变减轻对galP表达的阻遏来实现。
利用我们目前对微生物细胞中代谢途径的理解，可以合理地构建被设计成以显著量产生琥珀酸的菌株。构建高效产琥珀酸微生物的合理设计基于这样的假设：通过遗传操作阻断细胞内部碳流的其他潜在发酵途径时，琥珀酸可以在厌氧或微有氧条件下积累。为阻断细胞内部碳流的特定途径所要求的遗传操作包括减少或移除编码酶的一个或多个基因的活性，其中所述酶参与需要加以阻断的途径的运行。可以通过适宜的遗传方法阻断指向乙酸盐、甲酸盐、乙醇和乳酸盐的碳流。例如，通过缺失adhE的基因，可以阻断厌氧性醇产生，和可以通过缺失ack和/或ptaA基因阻断指向乙酸盐的碳流。
虽然原则上在细胞内部阻断不想要的特定碳流途径并且将碳流引向琥珀酸产生是简单明了的，但是在实践中，合理设计的基因缺失不产生合乎需要的表型。如Jantama等人(2008a；2008b)所描述，合理设计的基因缺失最初导致生长不良的基因缺失菌株。生长不良的基因缺失菌株随后经历代谢进化以改善生长速率。因而，在构建用于产生琥珀酸的大肠杆菌菌株时，进行移除ldhA、adhE和ack基因的第一轮缺失，随后进行代谢进化的第一阶段。
在代谢进化的第一阶段后，第二基因缺失移除focA和pflB基因。随后进行第二轮代谢进化。在第三轮缺失中，移除mgsA基因。随后进行代谢进化的第三阶段。在第四轮缺失中，缺失并移除poxB基因。随后进行代谢进化的第四阶段。
“代谢进化”是这样的过程，其中生物(经常是遗传修饰的生物)的培养物(通常，但不必然是液体培养物)经历反复的稀释和再生长(称作“转移”)循环，从而在多次转移后，可以获得拥有与生长偶联的改进生长性能和/或改进的化学品(如琥珀酸、乳酸、乙醇或丁醇)产生的菌株。当使微生物的生长依赖于通过发酵产生所需化学品时，代谢进化法作为一种用于改善菌株的方法是特别有效的。例如，当用糖如葡萄糖厌氧或微量有氧培育时，异型发酵性微生物如野生型大肠杆菌产生化学品D-乳酸盐、L-乳酸盐、甲酸盐、琥珀酸盐、乙酸盐、二氧化碳、氢和乙醇的混合物。指向这些化合物的途径称作“发酵途径”。在其他生物中，发酵途径可以产生种类繁多的化学品，如丁醇、其他醇、其他有机酸、酯、3-羟基链烷酸、脂肪酸、烷、烯、类胡萝卜素、氨基酸、维生素和更多化学品。由野生型大肠杆菌制得的化合物中，至少D-乳酸、琥珀酸和乙醇具有商业利益，并且可以视为“所需化合物”。通过缺失控制指向不想要的化合物的途径的基因，生物仅留下指向所需化合物的一条或多条途径，并且因而生长变得依赖于或偶联至所述的所需化合物。备选地，可以从宿主生物缺失全部发酵途径，和可以通过基因工程从不同生物导入新的外源途径，其中所述外源途径导致不在该宿主生物中天然产生的所需化合物。代谢进化可以随后应用于突变的或工程化的菌株以改善生长和因此产生所需的化合物。由于代谢进化不要求特意诱变，在进化菌株的突变荷载是最小的，并且积累的大多数(若非全部)突变将有益于生长和/或所需化合物的产生。代谢进化的良好实例是菌株KJ122，其已经工程化以产生琥珀酸作为所需化合物并且随后经历代谢进化(Jantama等人，2008b)。
在本说明书中，术语“化学品”和“化合物”应当互换地使用，并且二者均应当以常规意义使用。
在代谢进化期间，将选择的培养物反复转移并且多次系列稀释至新鲜的基本培养基中以实现许多生长世代，在其中发生自发突变并且在群体中固定下来的克隆之间存在伴随竞争(attendant competition)。一些突变引起正在喂饲的碳源的更高效利用、耐受培养物中有毒化学品的更好能力和产生受欢迎化学品(在这个实例中是琥珀酸)的更高效率。在代谢进化期间，注意力放在选择这样的克隆方面，所述克隆具有合乎需要的表型，但是还包括少量产生或不产生不想要的副产物。
因而，概而言之，设计并且经遗传修饰以过量产生特定化学品的微生物可能不具有适宜的生长速率，并且因此可能不显示出产生这种特定化学品的期望或想要的效率。代谢进化可以用来选择菌株，所述菌株具有改善的生长和产物耐受性，伴随产生这种特定化学品的速率增加。然而，由于代谢进化因自发突变引起，导致改进的生长、产物耐受性和化学品产生效率的精确遗传改变可能不是明显的、可预测的或通过代谢进化方法可重复的。测定已进化的生物的基因组DNA序列可以提供积累的突变的细节。随后，通过将进化的菌株中每个单一突变替换为同源野生型等位基因或备选地，将突变的等位基因导入未经过处理的未进化的菌株中，随后对比分析菌株性能，可以证明哪一种突变对合乎需要的表型作出贡献。一些在进化的菌株中留下的突变可能有损于合乎需要的过程。这些突变可能是在进化中的早期阶段有益或已经没有时间进化弃去的突变。在任何情况下，知道哪种突变有益和这些突变的本质，将允许(1)更合理设计用于将来的基因工程，例如工程化用于产生琥珀酸的新菌株或生物，而不需要漫长的进化过程，和(2)深入了解微妙或不可预测的改善菌株性能的突变，这转而可以导致进一步更合理地改善菌株。例如，如果在进化的菌株中发现存在于阻抑基因中的移码突变，则基因工程可以用来产生该阻抑基因的完全缺失以产生不可回复并因而更稳定的赋予相同表型的等位基因。
在利用某种选择压力以迫使该生物获得某种所需表型的代谢进化过程期间，可能出现两种可能的变化。该生物可以仅自身适应于选择压力并且不显示改变的基因型。备选地，该生物可能在选择压力下经历某些遗传改变并且显示更永久的改变的表型。当仅存在适应作用并且不存在遗传改变时，一旦选择压力减轻，则该生物将回复成其原始表型。这些生物称作“适应型”生物。“适应型”微生物必须经历新的另一轮选择压力以显示改变的表型。另一方面，当存在伴随的遗传改变时，改变的表型将持续存在，甚至不存在选择压力时也是如此。伴有某些遗传改变的代谢进化是合乎需要的。可以通过在无任何选择压力情况下在原始生长培养基中培育微生物持续一些时间，随后将其转移至存在选择压力下的新鲜培养基，从而轻易地鉴定在代谢进化期间获得稳定遗传改变的微生物。如果这些生物能够在无任何延迟期情况下显示良好的生长和期望的表型，则认为该生物已经在代谢进化期间获得伴有所述表型的改变的基因型。
为了制备以显著量产生琥珀酸的微生物，可以使用在以上段落中引用并且通过引用方式并入的科学文献及专利文献中所述的多种基因工程技术，操作参与许多微生物代谢途径(包括糖酵解途径、三羧酸循环(也称作Krebs循环或TCA循环)和乙醛酸支路)的多种酶。关于多种微生物代谢途径的细节可以在标准生物化学教材如Lehninger的Principles of Biochemistry和Lubert Stryer的Biochemistry中找到。从St.Louis，MO，USA的SigmaChemical Company可获得的G.Michael生物化学途径公告也提供关于细菌细胞中多种生物化学途径的细节。
在有氧生长期间，微生物碳代谢包括糖酵解、三羧酸循环和氧化磷酸化。还原型酶辅助因子如NADPH和NADH因氧化磷酸化的运行再生，伴随细胞生长所需要的ATP产生。在本发明优选实施方案中用于产生琥珀酸的厌氧生长条件下，通过引导碳流进入三羧酸循环中前往琥珀酸生产并且消除用于再生NADP+和NAD+的全部其他发酵途径，完成还原型辅因子NADPH和NADH的再生。
根据优选的有机酸的类型，对代谢途径特定地工程化，从而微生物产生我们所选的特定有机酸。所述微生物能够合成许多有机酸，这包括乳酸、乙酸、苹果酸、丙酮酸、甲酸和琥珀酸。因而在开发用于产生琥珀酸的生物催化剂时，阻断用于产生乙酸、乳酸、丙酮酸和甲酸的途径，并且通过操作一种或多种参与细胞内部碳代谢的酶，促进碳流指向琥珀酸生产。在使用已知基因工程技术可以操作的在微生物发酵途径中有活性的酶的名单包括但不限于异柠檬酸合成酶(aceA)、苹果酸合酶(aceB)、乙醛酸支路操纵子(aceBAK)、乙酸激酶-磷酸转乙酰酶(ackA-pta)；顺乌头酸水化酶1和2(acnA和acnB)；乙酰辅酶A合成酶(acs)；柠檬酸裂合酶(citDEF)；醇脱氢酶(adhE)；柠檬酸合酶(citZ)；延胡索酸还原酶(frd)；乳酸脱氢酶(ldh)；苹果酸脱氢酶(mdh)；aceBAK操纵子阻抑物(iclR)；磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(pepC)；丙酮酸甲酸裂解酶(pfl)；丙酮酸氧化酶(poxB)；丙酮酸羧激酶(pck)和丙酮酸羧化酶(pyc)。
碳源的糖酵解导致磷酸烯醇丙酮酸(PEP)的产生。PEP进一步由混合酸途径代谢。如本发明中所用，术语“混合酸途径”指碳经PEP流过三羧酸循环和厌氧条件下运行的多种发酵途径。在厌氧条件下，至少4种代谢丙酮酸的不同发酵途径是可识别的。丙酮酸可以利用NADH还原成乳酸并且从而产生NAD+以维持为碳源连续代谢所必需的细胞氧化还原平衡。源自丙酮酸的乙酰辅酶A也可以还原以产生乙醇，伴随NADH的氧化以产生NAD+。丙酮酸也可以转变成甲酸或乙酸。
在TCA循环内部，认识到两个不同的分路。在TCA循环称作氧化分路的包括经异柠檬酸从草酰乙酸至琥珀酸的碳流的一个分路中，NADP+用来氧化异柠檬酸，伴有所得的NADPH形成。在TCA循环称作还原分路的包括经苹果酸和延胡索酸从草酰乙酸至琥珀酸的碳流的另一个分路中，NADH氧化以产生NAD+并且因而帮助细胞维持氧化还原平衡。
在本发明的一个实施方案中，通过失活编码参与发酵途径的酶的基因阻止从PEP经发酵途径的碳流。适于阻断经过这些发酵途径的碳流的基因包括ldhA、pflB、adhE、pta、ackA和poxB。消除这些基因中的一个或多个预期减少从PEP经所述发酵途径的碳流。在本发明的另一个方面，除了失活6个参与发酵途径的其他基因外，还失活编码甲基乙二醛合酶(mgsA)的mgsA基因，所述甲基乙二醛合酶负责转化甲基乙二醛成乳酸。
在本发明的又一个实施方案中，除了失活熟知的参与一条或其他发酵途径的基因外，还失活参与发酵途径的基因的有功能的同源物。具有乙酸激酶活性的丙酸激酶由tdcD基因编码，其中产生所述激酶仅用于苏氨酸的降解。然而，在伴有10％(w/v)葡萄糖的厌氧生长期间，tdcD的表达可以功能地替换ackA。此外，相同操纵子中的相邻tdcE基因与pflB相似并且编码具有丙酮酸甲酸裂解酶活性的α-酮丁酸甲酸裂解酶。在本发明的一个方面，使tdcDE基因失活防止碳进入发酵途径并且确保碳流入TCA循环。
在本发明的另一个实施方案中，除了阻断碳流经发酵途径之外，还改变TCA循环内部的碳流，从而存在指向琥珀酸生产的碳流。在本发明的一个方面，通过上调一个或多个基因的表达来操作TCA循环内部的碳流。在本发明的又一个方面，可以失活在TCA循环内部发挥作用的一个或多个基因以促进指向琥珀酸的碳流增加。
在本发明的优选方面，上调编码苹果酸脱氢酶的基因mdh以改善苹果酸至延胡索酸和琥珀酸的转化。经苹果酸和延胡索酸从草酰乙酸至琥珀酸的碳流称作TCA循环的还原分路。经过TCA循环的这个还原分路从草酰乙酸至琥珀酸的碳流将消耗2摩尔的NADH用于产生的每摩尔琥珀酸并且因而帮助维持在厌氧条件下细胞的氧化还原平衡。换而言之，mdh的上调将帮助再生为维持细胞氧化还原平衡所需要的NAD+。可以通过将mdh基因的天然启动子替换为其他一些强启动子序列或备选地通过突变mdh基因的启动子区因而mdh基因转录增加，实现mdh基因表达的上调。备选地，可以将mdh基因的额外副本添加至菌株，或可以操作调节mdh基因表达的基因以增加mdh基因的表达。在本发明的优选实施方案中，通过遗传地操作mdh基因的启动子区实现其表达上调。
在TCA循环正常运行中，通过TCA循环的氧化分路的运行而产生琥珀酸。经柠檬酸、顺-乌头酸、异柠檬酸、α-酮戊二酸和琥珀酰辅酶A从草酰乙酸至琥珀酸的碳流称作TCA循环的氧化分路。也可以通过乙醛酸支路的运行产生琥珀酸。在乙醛酸支路的运行期间，通过异柠檬酸裂合酶的作用，从异柠檬酸产生琥珀酸和乙醛酸。如此从TCA循环的氧化分路运行或从乙醛酸支路运行中产生的琥珀酸可以受琥珀酸脱氢酶(sdh)作用以产生延胡索酸并且随后产生苹果酸。因此，在本发明的又一个实施方案中，可以使用基因失活来防止琥珀酸的脱氢，以增加胞内琥珀酸产生。
在本发明的又一个方面。可以操作经过乙醛酸支路的碳流以实现琥珀酸产生的增加。异柠檬酸裂合酶催化异柠檬酸裂解成乙醛酸和琥珀酸。异柠檬酸裂合酶由aceBAK操纵子编码。异柠檬酸裂合酶活性被iclR基因抑制。换而言之，iclR基因的表达防止乙醛酸支路运行。在本发明的另一个方面，除了失活参与发酵代谢的基因外，还失活iclR基因。
在本发明的又一个实施方案中除了通过遗传操作防止发酵途径运行并且增加TCA循环内部的碳流向琥珀酸产生外，也可以通过遗传手段阻断从TCA循环向外至其他代谢途径的碳流以增加琥珀酸产生。例如，可以阻断从TCA循环至氨基酸代谢中的碳流以改善朝向琥珀酸的碳流。天冬氨酸氨基转移酶基因(aspC)转移来自谷氨酸的氨基至天冬氨酸合成中的草酰乙酸并且因而促进碳从TCA循环向外流动。在本发明的一个方面，失活aspC基因后，阻断碳从TCA循环向外流动以通过TCA循环的氧化分路或还原分路改善从草酰乙酸至琥珀酸产生的碳流。
碳从TCA循环的其他向外流动从苹果酸发生。苹果酸由苹果酸酶(sfcA)脱羧导致了丙酮酸的产生。在本发明的一个方面，使编码sfcA基因的基因失活以削弱碳从TCA循环向外流动。在本发明的又一个方面，使aspC和sfcA基因均失活以防止碳从TCA循环向外流动，从而增强琥珀酸积累。
在本发明的又一个方面，通过失活负责将柠檬酸裂解成草酰乙酸和乙酸的柠檬酸裂合酶基因(citDEF)防止碳从TCA循环向外流动。
除了失活参与发酵途径的基因及其有功能的类似物之外，还可以通过遗传地操作微生物细胞内部的羧化酶，进一步改进生长偶联的琥珀酸产率。尽管通过实施遗传分析和酶分析表征了代谢进化期间出现的变化，然而已经显示，细胞内部的羧化酶可能是实现琥珀酸产率改进的另一个遗传操作靶。
可以羧化糖酵解中间体磷酸烯醇丙酮酸(PEP)和丙酮酸以改善进入TCA循环的碳流。在正常条件下，通过柠檬酸合酶的作用实现碳进入TCA循环，所述柠檬酸合酶将源自丙酮酸的乙酰辅酶A与草酰乙酸(TCA循环中的一种中间体)合并以产生柠檬酸。通过改善细胞内部存在的一种或多种羧化酶的效率，可以将磷酸烯醇丙酮酸和丙酮酸羧化成草酰乙酸，它是TCA循环中的一种中间体。从羧化反应如此产生的草酰乙酸可以借助TCA循环的还原分路进一步还原以产生琥珀酸。
操作细胞内部存在的羧化酶是一种在厌氧发酵生长期间增加琥珀酸产率的方法。本领域熟知通过导入来自外部来源的丙酮酸羧化酶(pyc)可以将丙酮酸羧化成草酰乙酸。充分适合遗传操作的微生物菌株如大肠杆菌不具备pyc基因。已经将源自其他细菌物种如埃特里根瘤菌(Rhizopium elti)和乳酸乳杆菌(Lactobacillus lacti)的pyc基因导入遗传修饰的大肠杆菌菌株中以改善琥珀酸产生。
大肠杆菌中已知4种不同的内源性羧化酶。这些酶中的两种负责羧化磷酸烯醇丙酮酸并且其他两种酶负责羧化源自因丙酮酸激酶的酶作用所得到的磷酸烯醇丙酮酸的丙酮酸。作为酶的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(ppc)将磷酸烯醇丙酮酸羧化成草酰乙酸，其可以进入TCA循环的还原分路以产生琥珀酸。第二种羧化酶即磷酸烯醇丙酮酸激酶(pck)也羧化磷酸烯醇丙酮酸以产生草酰乙酸，但是通常催化逆反应，因为它在葡萄糖存在下不表达。其他两种羧化酶即NADH关联的马来酸酶(maeB)和NADPH关联的马来酸酶(maeA/sfcA)将丙酮酸羧化成苹果酸。maeB和sfcA酶通过丙酮酸激酶的作用羧化源自磷酸烯醇丙酮酸的丙酮酸。
可以遗传地操作细胞中存在的这四种羧化酶中的任一种酶以增加其酶活性，目的在于改善从糖酵解循环中间体至TCA循环的碳流。大肠杆菌中存在的这四种天然羧化酶中，PPC催化的反应受到有力支持。含于PEP中的能量在该反应中丢失，伴随无机磷酸盐释放。其他三种羧化酶即pck、maeA和sfcA(maeB)预期在利用葡萄糖作为底物的发酵生长期间不发挥作用，因为这三种羧化酶受葡萄糖阻遏。当细胞以氧化方式代谢有机酸时，认为这三种羧化酶在糖异生期间以逆方向发挥作用。
可以遗传操作糖异生性PEP羧激酶(pck)以改善进入TCA循环的碳流。改善pck活性的优点存在于以下事实中：这种酶在将磷酸烯醇丙酮酸羧化成草酰乙酸的同时，导致每产生一分子草酰乙酸，产生一分子ATP。ATP产量的增加将提高细胞的生长速率。
可以通过正向影响pck基因转录的任何突变，实现招募天然的糖异生性pck用于琥珀酸发酵产生。可以通过在带有天然启动子或已知增加基因表达的任何其他启动子序列的多拷贝质粒中表达pck基因，实现PCK活性水平的增加。增加pck基因在细胞内部表达的另一种方式是整合pck基因的额外副本。在本发明的另一个实施方案中，pck基因的天然启动子可以由已知增强活性水平的一些其他启动子元件替换。也可以通过该基因启动子区中的突变或通过遗传操作已知与pck基因启动子区相互作用的调节元件，实现pck基因增加的表达。编码pck基因的调节蛋白的基因可以按某种方式突变或缺失或过量表达以增加pck基因的表达。单点突变(在相对于pck基因的ATG起始密码子-64位置处G至A转变)可以增加的pck基因的转录，伴随磷酸烯醇丙酮酸羧激酶酶活性的相应增加。也可以通过遗传操作编码已知调节pck基因表达的蛋白质的基因，实现pck基因表达的类似增加。例如，已经显示Cra蛋白激活大肠杆菌中pck基因的表达(Saier和Ramseier，196)。类似地，还已经报道csrA系统(包含csrA、csrB、csrC、csrD、uvrY或barA)通过改变mRNA稳定性调节参与葡萄糖代谢的pck和其他基因的水平(Babitzke和Romeo，2007；Pernestig等人，2003；SuzukiK等人，2002)。
在本发明中，对显示合乎需要的表型(例如改进的琥珀酸产生效率)的遗传修饰的和代谢进化的菌株和在构建遗传修饰的和代谢进化的菌株时所用的野生型菌株进行了基因组DNA序列分析。
野生型亲本菌株以及基因工程化和代谢进化的菌株的全基因组测序可以通过高通量DNA测序领域的技术人员熟知的测序技术来完成。许多测序技术是市场上可获得的，所述市场可以按有成本效益的方式提供基因组序列信息，例如由Illumina，Inc.和454，Inc.提供硬件、软件和方法。
可以使用适宜的软件比较从野生型和进化的细菌菌株中获得的序列数据并且可以获得两个菌株之间的遗传改变。从这两个菌株之间的一系列全部遗传改变中，可以验证在基因工程阶段特意导入的遗传改变，并且可以鉴定代谢进化过程期间产生和固定下来的额外遗传改变。
一旦鉴定到代谢进化期间出现的突变，通过使用反向遗传分析，确定这些突变在改善所需化学品生产方面的重要性。例如，可以使用以可度量滴度产生琥珀酸并且在其染色体DNA中包含最小数目基因变化的未处理过的细菌菌株。包含突变形式的pck和pstI并且包含在pflB中的缺失这两者的尤其是大肠杆菌菌株XZ722和相同的已公开菌株XZ721适用于此目的(Zhang等人，2009)。在菌株KJ122(或任何其他目的菌株)的代谢进化期间出现的遗传突变可以使用本领域熟知的技术安置于菌株XZ721或XZ722中。两步骤基因替换方法是本领域熟知的(Zhang等人，2009a；Zhang等人，2009b；Jantama等人，2008a；Jantama等人，2008b)。就用来构建本发明菌株的“两步骤基因替换方法”而言，第一步骤是安置一个可选择盒和反向可选择盒，其含有耐药基因如cat(耐受30mg/l的氯霉素)或kan(50mg/l的卡那霉素耐药性)连同引起对60g/l蔗糖敏感的来自枯草芽孢杆菌的sacB基因。分别使用pLOI4151(SEQ ID NO.33)或pGW162(SEQ ID NO.34)作为模板，通过PCR获得cat-sacB或kan-sacB盒。除约18至25个碱基的引发序列之外，PCR引物还含有与染色体靶序列的5’和3′末端同源的约50个碱基以促进同源重组。通过电穿孔法将线性PCR产物转化至事先已经用质粒pKD46转化的受体菌株中，所述质粒pKD46表达λ噬菌体Red重组酶以增加合乎需要的PCR片段整合至受体菌株染色体中的频率。通过100mg/l的氨苄青霉素耐药性在30℃选择pKD46。pKD46具有温度敏感型复制起点并且可以通过在42℃生长而在宿主菌株中固化。pKD46由Datsenko和Wanner(2000)描述并且是从美国康涅狄格州纽黑文耶鲁大学大肠杆菌遗传保藏中心(Coli Genetic Stock Center，Yale University，NewHaven，CT，USA)可获得的。就两步骤基因替换方法的第二步骤而言，使用例如KJ122染色体DNA作为模板，使用在需要安置的等位基因的5′和3′末端处引发的第二对PCR引物，产生第二PCR产物。与第一对PCR引物相似，第二对PCR引物也可以含有与染色体靶序列的5′和3′末端同源的约50碱基对以促进同源重组。然而，如果被插入的等位基因的染色体靶是待插入的等位基因的天然基因座，则第二步骤的同源序列也可以简单地作为扩增的DNA序列的部分。换而言之，如果染色体靶是与所述等位基因的天然基因座不同的位点，如在染色体中的第二位点处安置基因的第二副本时，则仅需要添加与所述染色体靶同源的50碱基对序列至PCR引物的5′末端。通过将线性第二PCR产物电穿孔至仍含有刺激同源重组的pKD46的受体菌株中(它是在第一步骤中产生的菌株)并且在含有60g/l蔗糖的平板上选择，完成在第二步骤安装改变的等位基因。在这个两步骤方法中，对于其中需要同源重组的全部操作，将细胞在含有5g/l阿拉伯糖的丰富培养基中培育以引起λRed重组酶基因从辅助质粒pKD46表达。由于自发sacB突变体可以在蔗糖选择期间产生，因此将所得到的菌落针对氯霉素或卡那霉素敏感性并通过诊断性PCR筛选以鉴定已经挑选到合乎需要的等位基因变化的菌落。对于细微突变如点突变，必需获得已安置的等位基因的DNA序列以确信安置了合乎需要的等位基因。这通过获得已安置等位基因的PCR扩增副本并且将所述PCR产物测序而实现。存在开展DNA测序作为商业服务的许多机构，例如美国马萨诸塞州波士顿，塔夫茨大学医学院，塔夫茨大学核心设施(Tufts University Core Facility)。
表2中给出用于两步骤基因替换的PCR引物的实例。
一种确定每种突变的作用的备选方法是使用上述相同的两步骤基因替换方法，将进化的菌株(例如KJ122)中的单一突变等位基因替换为来自亲本菌株大肠杆菌C(ATCC 8739)的同源野生型等位基因。菌株构建也可以使用例如噬菌体P1 vir，通过普遍的噬菌体转导法完成(Silhavy等人，1984)。
用于在大肠杆菌染色体中产生特定的小缺失或大缺失的技术也是熟知的，并且这些技术应当适用于其他细菌、古细菌、酵母和丝状真菌。例如，Kolisnychenko等人(2002)描述了可以遵循以从染色体DNA移除特定基因序列并且在此通过引用方式并入的技术。
在构建含有野生型或突变体等位基因的同基因菌株对后，可以在适宜的小规模发酵罐中对该菌株对的成员测试生长和化学品产生。例如，可以如先前所述那样测试在厌氧或微有氧条件下伴有pH控制的生长和琥珀酸产生(Zhang等人，2009a；Zhang等人，2008b；Janatama等人，2008a；Jantama等人，2008b)。为了在小规模发酵罐中测试菌株性能，当琥珀酸产生时用来中和琥珀酸的碱性溶液可以是2.4M碳酸钾加1.2M氢氧化钾，或备选地，它可以是用于测试菌株性能的6M氢氧化铵加3M碳酸氢铵。
通过一次导入一个突变至产琥珀酸大肠杆菌菌株如XZ722中或从产琥珀酸菌株如KJ122中一次移除一个突变(即，再导入一个或多个已突变基因的野生型等位基因)，可以确定对改善生长或化学品产生作出贡献的遗传改变。此外，可以将多于一个类型的突变导入或移入产生化学品的菌株以确定是否存在归因于突变组合的任何加性或协同效应。通过这种突变筛选，可以鉴定对实现高效生长和化学品产生重要的突变。一旦鉴定出负责改善化学品产生的那些新突变，则可以将这些突变添加至用来合理设计用于产生琥珀酸或其他化学品的细菌菌株的遗传修饰清单并且因而消除在选择具有合乎需要的表型的菌株中进行代谢进化过程的需要。
在本公开中，给出了具体实例，其涉及通过大肠杆菌菌株产生琥珀酸。然而，本发明中发现的原理具有广阔应用性，从而具体实例的提及不应当用来以任何方式限制宽泛含义。例如，特定基因中的特定类型突变对于大肠杆菌中琥珀酸生物合成是有用的这一发现可以在不必过度实验情况下应用于其他细菌和其他生物。一旦鉴定出目的基因中的突变，可以将相似突变或实现相同功能或目的的突变导入多种生物中。
例如，本发明公开了减少编码丙酮酸激酶的基因的表达在高度开发的大肠杆菌产琥珀酸菌株环境下可用于琥珀酸生产。现在容易鉴定出其他生物中编码丙酮酸激酶的基因并且通过缺失或其他突变减少这种新生物中所述基因的表达，目的在于改善琥珀酸产生。对于大肠杆菌的近亲，如克雷伯氏菌属、沙雷菌属(Serratia)、柠檬酸细菌属(Citrobacter)、欧文氏菌属或沙门氏菌属的细菌，可以通过遍及GenBank或其他公共DNA或蛋白质序列数据库进行同源性检索，容易地找到相关基因。虽然不存在可以用来定义什么是或不是同源物的明晰临界值，但是查询序列的“同源物”是与查询序列进化相关的DNA序列，并且通常可以1)使用经GenBank可获得的BLASTN程序并且选择默认参数(将格式要求表格中的“描述”、“图形概述”和“比对结果”设置设为1000或更大将产生更多数目的同源物，而把“期望”数字从默认值10增加至更大的数字也会同样产生更多数目的同源物)来找到，作为允许缺失和插入的基因或DNA序列，其中50个或更多个碱基长度的序列或该序列的一部分与查询序列具有50％或更大同一性匹配，或2)使用经GenBank可获得的BLASTP程序的默认参数来找到，作为允许缺失和插入的蛋白质序列或该蛋白质序列的一部分，其具有25个或更多个氨基酸长度并且与所述查询序列具有25％或更大同一性或50％或更大的相似性。当使用GenBank数据库和多种BLAST程序来进行同源性检索时，有时需要不选择(或去选择)查询对象的亲缘最近亲属的基因组。例如，埃希氏菌属成员的巨大数目的基因组可以排挤出同源性命中结果清单中存在于亲缘更远的菌株如克雷伯氏菌属中的大肠杆菌查询项同源物，但是去选择埃希氏菌属成员的基因组允许找到克雷伯氏菌属“命中结果”。对于较不相关的生物，相关基因可能不是同源物，或可能不是借助DNA或蛋白质序列同源性可鉴定的，但是该基因仍可以通过关键词检索找到。例如，使用“酵母属(Saccharomyces)”和“丙酮酸激酶”作为检索中的关键词，通过检索GenBank容易找到编码丙酮酸激酶的酿酒酵母基因。进行了这种检索，并且找到两个基因，CDC19(也称作PYK1)和PYK2，二者均编码丙酮酸激酶。
简而言之，本发明提供了用于鉴定新基因突变而不经历费力代谢进化过程的扣减或加合基因组分析，其中所述的新基因突变赋予合乎需要的表型至工业上有用的微生物。以这种方式，可以完全使用合理设计，构建工业微生物。虽然本公开详细地描述使用微生物产生有机酸，并且更具体地是使用生物催化剂产生琥珀酸，工业微生物学领域技术人员将能够应用本文中公开的方法以使用多种微生物催化剂改善其他工业化学品的生产率。实验部分
总体评价
菌株、培养基和生长条件
使用与基于生长的选择法偶联的独特基因缺失组合，开发了大肠杆菌C(ATCC 8739)的新衍生物用于琥珀酸产生。
本发明的微生物可以在微生物学领域熟知的许多不同培养基中培育。例如，在含有1％(w/v)胰蛋白胨、0.5％(w/v)酵母提取物和0.5％(w/v)NaCl的Luria-Bertani(LB)培养基中培育大肠杆菌的野生型和突变体菌株。为了利用涉及遗传修饰微生物作为生物催化剂的发酵过程商业化生产有机酸，优选补充有碳源的基本无机盐培养基。与丰富培养基如LB培养基相反，基本无机盐培养基的使用降低以商业规模生产有机酸的成本。
适于本发明的基本无机培养基包括NBS培养基(Causey等人，2007)和AM1培养基(Martinez等人，2007)。NBS培养基含有1mM甜菜碱、25.72
mM KH2PO4、28.71mM K2HPO4、26.50mM(NH4)2HPO4、1mMMgSO4.7H2O、0.1mM CaCl2.2H20、0.15mM盐酸硫胺素、5.92μMFeCl36H20、0.84μM COCl2.6H2O、0.59μM CuCl2.2H2O、1.47μMZnCl2、0.83μM Na2MoO42H2O和0.81μM H3BO3。AM1培养基含有1mM甜菜碱、19.92mM(NH4)2HPO4、7.56mM NH4H2PO4、1.5mMMgSO4.7H2O、1.0mM甜菜碱-KCl、8.88μM FeCl36H20、1.26μMCOCl2.6H2O、0.88μM  CuCl2.2H2O、2.20μM  ZnCl2、1.24μMNa2MoO42H2O、1.21μM H3BO3和2.50μM MnCl24H2O。将痕量元素制备为1000X母液并且含有以下组分：1.6g/L FeCl3、0.2g/L CoCl2.6H2O、0.1g/L CuCl2、0.2g/L ZnCl2.4H2O、0.2g/L NaMoO4、0.05g/L H3BO3和0.33g/L MnCl2.4H2O。
用于微生物产生有机酸的无机培养基补充有碳源。在本发明中有用的碳源包括但不限于戊糖如木糖、己糖如葡萄糖、果糖和半乳糖或者二糖如蔗糖和麦芽糖。也可以通过提供不同糖的组合如葡萄糖和木糖的组合满足碳源需要。碳源也可以衍生自淀粉或木素纤维素的水解。可以通过使用本领域熟知的热化学转化过程或酶促方法，实现复杂糖如淀粉和木素纤维素的水解。用于利用微生物发酵工业生产有机酸的优选碳源是从农业或林业废弃物水解衍生的木素纤维素水解产物。木素纤维素水解产物可以进一步分级以产生己糖富化和戊糖富化的级分，并且这些级分可以充当利用微生物发酵商业化生产有机酸的碳源。木素纤维素水解产物可以进一步脱毒以移除发现高于某些浓度时对许多微生物有毒的某些化学品，如糠醛。
在菌株构建期间，将培养物在30、37或39℃于含2％(w/v)葡萄糖或5％(w/v)阿拉伯糖的Luria肉汤(10g l-1Difco胰蛋白胨，5g l-1Difco酵母提取物和5g l-1NaCl)中有氧培育。在开发用于产生琥珀酸的最终菌株中不存在编码抗生素耐药性的基因、质粒或外来基因。然而，在构建不同菌株的早期阶段期间，使用了多种抗生素耐药性标记。如抗生素选择过程所需要，添加抗生素如氨苄青霉素(50mg l-1)，卡那霉素(50mgl-1)或氯霉素(40mg l-1)。
将种子培养物和发酵物在37℃，100转/分钟于含有葡萄糖、100mMKHCO3和1mM甜菜碱HCl的NBS或AM1无机盐培养基培育。在一些实验中，使用玉米浆。它是来自玉米湿磨工业的副产物。与酵母提取物和蛋白胨相比时，玉米浆是廉价的维生素和痕量元素源。
对于发酵性琥珀酸产生，除非另外说明，否则将菌株在没有抗生素的情况下于37℃在补充有10％(w/v)葡萄糖和100mM碳酸氢钾的NBS无机盐培养基(Causey等人，2004)中培育。通过将新鲜菌落转移至250ml烧瓶(100ml NBS培养基，2％葡萄糖)中，培育用于发酵的预接种物。在16小时(37℃，120转/分钟)后，将这种培养物稀释至含有300ml NBS培养基(10％葡萄糖，100mM碳酸氢钾)的小发酵容器中以提供0.033g细胞干重(CDW)l-1的接种物。
由于有机酸在生长培养基中的积累倾向于降低培养基的pH，故根据需要添加适宜的中和剂至培养基是必需的。可以利用pH探头连续监测培养容器的pH，并且可以添加适宜的碱以维持生长培养基的pH在中性pH附近。适于维持微生物培养物的pH的碱包括但不限于NaOH、KOH、NH4SO4、Na2CO3、NaHCO3和NH4CO3。可以单独或组合地使用适合此目的的碱。
在某些实验中，通过添加含有额外CO2的(1.2M氢氧化钾中的2.4M碳酸钾)的碱，将发酵物自动地维持在pH7.0。随后，通过添加3M K2CO3和6N KOH的1∶1混合物，维持pH。将发酵容器密封，不包括充当用于取出样品的通气孔的一个16号针头。在生长期间快速实现厌氧生活，同时添加碳酸氢盐起到确保CO2气氛的作用。
细胞生长：通过使用Thermo Electronic Spectronic 20分光光度计测量550nm处的光密度(OD550)，估计细胞质量。
有机酸和糖分析：通过HPLC测量多种有机酸和糖的浓度。在配有BioRad Aminex HPX-87H柱的Agilent 1200HPLC装置上分析在发酵液中存在的琥珀酸和其他有机酸。使用BioRad Microguard阳离子H+作为保护柱。在0.008N硫酸中制备HPLC分析用标准物。HPLC柱温维持在50℃。使用0.008N浓度的硫酸作为流速0.6ml/分钟的流动相。通过测量其在210
nm处的吸收，进行多种组分的定量。
实施例
实施例1
比较KJ122和大肠杆菌C野生型(ATCC 8739)的基因组序列
KJ122菌株借助一系列遗传操作和许多轮次的代谢进化从大肠杆菌C菌株衍生。在公布的PCT专利申请号WO/2008/15958和WO/2010/115067中提供了构建KJ122菌株的细节，所述文献通过引用方式并入本文。Jantama等人的两份科学论文(2008a和2008b)和Zhang等人的两份科学论文(2009a；2009b)也描述了KJ122菌株的构建。这两部分科学论文均通过引用的方式并入本文。菌株KJ122已经于2008年2月20日在USDA-ARS培养物保藏中心保藏，菌株命名编号B-50115。
使用在塔夫茨大学核心设施的Illumina测序系统，获得KJ122的基因组序列，并且该序列与可从GenBank获得的注释的野生型大肠杆菌C序列(登录号CP000946)比较。从这种对比基因组分析，检测到这两个菌株之间的许多遗传差异。在本公开中，将基于核苷酸碱基的编号给出可读框中出现的突变的位置，该可读框的起始密码子的第一碱基(如上文引用的GenBank序列中所注释那样)计为碱基编号1。从KJ122和大肠杆菌C之间的一系列遗传差异中，验证了已经在构建KJ122时的多个阶段特意导入的缺失，并且鉴定到在代谢进化过程期间出现的额外的遗传改变名单。在代谢进化过程期间于KJ122基因组中固定下来的这个突变系列内包括1)在编码两种丙酮酸激酶之一的pykA(SEQ ID NO.1)中的移码突变，2)在编码半乳糖诱导型基因如糖转运蛋白基因galP的阻抑物的galS基因(SEQ IDNO.2)中的移码突变，3)包含许多基因的大肠杆菌基因组区域的48千碱基缺失(SEQ ID NO.3)，其包含大肠杆菌C基因组的ydcC至ydcF的许多基因，4)在rpoA基因(SEQ ID NO.4)的C端结构域内的错义点突变，所述rpoA基因编码RNA聚合酶的亚基，5)在rpoC基因(SEQ ID NO.5)的F区内的错义点突变，所述rpoC基因编码RNA聚合酶的不同亚基，6)在编码甘油脱氢酶的gldA基因(SEQ ID NO.6)中的移码突变，7)在dhaM基因(SEQ IDNO.7)中的移码突变，所述dhaM基因编码PEP依赖性二羟丙酮激酶的亚基，和8)在ftsI基因(SEQ ID NO.8)中的错义点突变，所述ftsI基因编码参与细胞壁合成和细胞形状的基因。
实施例2
固化KJ122中突变的pykA基因
在含有葡萄糖的培养基中培育野生型大肠杆菌和许多其他细菌时，细胞内部的丙酮酸产生经由磷酸转移酶系统(PTS)的作用发生，所述系统使用一分子的磷酸烯醇丙酮酸(PEP)以转运并且磷酸化葡萄糖，同时获得一分子丙酮酸的形成。丙酮酸形成也可以因pykA和/或pykF基因编码的丙酮酸激酶的作用而出现。PykA和PykF蛋白是同工酶。当葡萄糖是碳源时，两种丙酮酸激酶同工酶在丙酮酸生物合成中发挥积极作用。然而，三重突变体pts、pykA和pykF不能以葡萄糖作为唯一碳源而生长，因为形成丙酮酸的细胞能力缺失或大幅度削减(Ponce等人，1995)。
由于KJ122含有在编码PtsI蛋白的ptsI中的突变，所述PtsI蛋白是PTS的组分(Zhang等人，2009a Zhang等人，2009b)，故意料不到这样的观察结果：pykA基因在代谢进化期间在KJ122中也突变了。为了确定这个突变是否有助于琥珀酸产生，将野生型pykA等位基因安置于KJ122中以产生新菌株WG85a，并且就这种突变对琥珀酸产生的影响，评估表型变化。使用上述的两步骤基因替换方法，以两个步骤构建WG85a。在第一步骤中，将cat-sacB盒安置在菌株KJ122的pykA基因座处，以产生菌株WG84。所用的PCR引物是SEQ ID NO.21和22(见表1)。在第二步骤中，将来自大肠杆菌C的野生型pykA基因安置于WG84中，以产生菌株WG85a。所用的PCR引物是SEQ ID NO.23和24(见表1)。与KJ122约550mM琥珀酸相比，WG85a产生约160mM琥珀酸。显然，KJ122中的pykA突变对于琥珀酸产生是重要的。由于KJ122中的pykA突变是移码，因此可以推断含有pykA缺失的菌株应当类似地表现。中间菌株WG84含有pykA可读框的完全缺失，并且如预测那样，WG84以类似于KJ122的方式表现，琥珀酸滴度为540mM，这表明KJ122中的移码突变与无效突变相似。已经获得这项发现后，本发明人随后可以推断，降低的丙酮酸激酶活性水平对于KJ122是重要的，并且可以通过许多相关方法中的任一种实现这种状态。例如，可以进一步降低或消除KJ122中的ptsI＊活性，可以减弱或消除PykF活性，或降低的PykA、PykF和/或PtsI活性的组合可以用来建立总丙酮酸激酶活性降低，其中所述总丙酮酸激酶活性降低现在已知对琥珀酸产生是重要的。
为了确定第二个丙酮酸激酶基因pykF的缺失是否可以替换pykA中的缺失，将pykF的缺失安置于菌株WG85a中，以产生菌株WG89。这使用所述两步骤基因替换方法完成。对于第一步骤，将kan-sacB盒安置在WG85a的pykF基因座处，以产生菌株WG87。所用的引物是SEQ IDNO.36和37(见表1)。对于第二步骤，将pykF可读框的缺失安置于WG87中，以产生新菌株WG89。所用的PCR引物是SEQ ID NO.38和39(见表1)，并且模板是pGW191(SEQ ID NO.35)。在小规模发酵罐中，WG89生长更不良并且与KJ122的510mM琥珀酸相比，仅产生115mM琥珀酸。因而，对于改善琥珀酸产生，pykF的缺失不能替代pykA的缺失或移码。虽然在不同实验中测试WG89和WG85a，但是似乎WG89比WG85a表现更差，这表明对于KJ122的生长和琥珀酸产生，存在最佳的丙酮酸激酶水平，但是pykF的缺失导致对于良好琥珀酸产生而言并非最佳的总丙酮酸激酶活性水平。因而，代谢进化已经产生了具有接近于最佳水平的丙酮酸激酶水平的菌株。另外，如美国专利申请公开2009/0075352和Lee等人(2005)中所显示，编码丙酮酸激酶的全部基因(pykA、pykF和一个或多个pts基因)的缺失将不改善琥珀酸产生，因为总丙酮酸激酶活性在这种菌株中将太低。在新菌株中(例如在酿酒酵母中)构建新的产琥珀酸菌株时，根据本发明，在阻断不想要的途径后，调节总丙酮酸激酶的水平以导致良好的琥珀酸产生效率。这可以通过例如这样的方式完成：缺失非必需性丙酮酸激酶基因PYK2并且随后通过在PYK1前方安置强度不同的启动子或从PYK1可读框的5′末端或3′末端造成递进缺失而改变剩余PYK1的表达或活性水平，和测试改进的琥珀酸产生。
实施例3
在XZ722中突变galS
大肠杆菌C菌株和KJ122菌株之间的基因组序列比较分析揭示了galS基因中的移码突变。已知该基因阻遏编码半乳糖通透酶GalP的galP基因表达。GalP蛋白据报道在完整功能的磷酸转移酶系统(PTS)不存在时至少部分地负责葡萄糖转运，如其中编码PtsI蛋白(PTS的组分之一)的ptsI被突变的KJ122菌株中那样(Zhang等人2009a)。因而，就葡萄糖摄入或对琥珀酸产生速率的一些其他影响而言，KJ122中的galS突变可能具有一些功能意义。这通过转移galS的KJ122等位基因至大肠杆菌菌株XZ722中(ΔpflB、ptsI＊、pck＊)以产生新菌株WG86a并且评价该突变对菌株中琥珀酸产生速率的影响而测试。使用上述的两步骤基因替换方法，以两个步骤构建WG86a。在第一步骤中，将kan-sacB盒安置在菌株XZ722的galS基因座处，以产生菌株WG83。所用的PCR引物是SEQ ID NO.17和18(见表1)。在第二步骤中，安置来自KJ122基因的移码的galS等位基因以产生菌株WG86a。所用的PCR引物是SEQ ID NO.19和20(见表1)。在小规模发酵罐中，来自XZ722的琥珀酸滴度是175mM，而来自WG86a的琥珀酸滴度210mM，这证明galS突变可能对改进的琥珀酸产生作出贡献。该galS突变是移码，进而可以推断galS缺失将类似地发挥作用，且在遗传上更稳定。中间菌株WG83含有galS可读框的缺失，并且它以类似于WG86a的方式表现，产生220mM琥珀酸。此外，本发明人可以推断，突变已知编码galP表达的不同阻抑物的galR基因也将通过增加细胞输入葡萄糖的能力而增强琥珀酸产生。另外，本发明人可以推断，galP基因拷贝数的增加将具有相似的作用并且提供了又一种增加琥珀酸产生效率的方法。可以通过PCR扩增galP基因和相邻的含有启动子和终止子的上游和下游DNA，带有或不带有调节位点，并且随后将其安置在产琥珀酸大肠杆菌菌株的染色体中远离天然galP基因座的一个或多个位点处，以产生含有多于一个galP基因副本的菌株。所得到的菌株将因具有更高水平的GalP蛋白而增强琥珀酸产生(实施例11)。
实施例4
从自染色体DNA缺失一个48kbp区域
在KJ122和大肠杆菌C菌株之间的基因组序列比较分析已经揭示在代谢进化过程期间包括KJ122中基因组的基因ydcC至ydcF的一个48千碱基区域的缺失。该缺失对应于大肠杆菌ATCC 8739的核苷酸坐标2,416,108和2,464,284(包括这两个核苷酸)之间的序列。通过将这个48千碱基序列再安置于KJ122中以产生菌株WG110，评估这个基因缺失的功能意义及其对琥珀酸产生的影响。使用基因替换法和P1vir转导法的组合，这以两个步骤完成。对于第一步骤，将cat-sacB盒安置在KJ122的缺失端点之间，以产生菌株WG51。所用的PCR引物是SEQ ID NO.31和32(见表1)。在第二步骤中，使用P1vir并以大肠杆菌C作为供体，针对蔗糖抗性和氯霉素敏感性转导WG51，以产生新菌株WG110，所述新菌株现在使所述48千碱基序列在KJ122菌株背景下于其天然基因座处恢复。可以使用美国专利申请公开2009/0075333和2008/0009041中所述的方法完成大肠杆菌菌株的特定区域的缺失。可以将KJ122的特定48千碱基缺失以两个步骤通过以下方式安置于其他受体大肠杆菌菌株中：(1)从WG51转导至受体菌株中，针对氯霉素抗性选择，和(2)从KJ122转导至步骤1中构建的菌株中，针对蔗糖抗性选择，并且针对氯霉素敏感性筛选。
显然，48千碱基缺失中所含的基因对于最低葡萄糖培养基中的生长或对于琥珀酸产生不是必需的。48kb缺失的优点在于，所得到的染色体略微较短，这将引起生长速率轻微增加。另外，所述缺失下存在至少4个基因，当单一缺失时，所述基因导致在最低葡萄糖培养基中更高密度的生长。分别含有基因ydcI、ydcL、ydcO和ydcV缺失的Keio缺失集合菌株JW5226、JW1427、JW5229和JW1438均在48小时于最低葡萄糖培养基中生长到显著更高的OD600(见Baba，T.等人(2006)中的附表3)。
实施例5
固化KJ122中突变的rpoA基因
细菌RNA聚合酶的核心酶以化学计量α2ββ′ω含有4种不同多肽亚基：α、β、β′和ω。RNA聚合酶的α亚基由rpoA基因编码。需要该亚基用于装配此酶，并且它与一些调节蛋白相互作用。KJ122菌株和大肠杆菌C菌株之间的基因组序列比较分析揭示了rpoA基因中的错义点突变。更具体地，该突变位于RNA聚合酶α亚基C端结构域(α-CTD)中第322氨基酸位置处。野生型大肠杆菌C菌株中的脯氨酸残基已经转变成KJ122菌株中的亮氨酸残基。
先前已经将一个使脯氨酸322变成丙氨酸的不同突变描述为对metE基因的表达具有不利影响(Fritsch等人，2000)。在一篇独立的报道中，发现在RpoA蛋白中这个位置处的脯氨酸至丙氨酸突变减少大肠杆菌中rhaS启动子的环AMP受体蛋白(CRP)活化(Holcroft和Egan，2000)。通过转移野生型等位基因rpoA突变至KJ122中以产生新菌株RY859A1并且确定这种突变对琥珀酸产生的影响，评估了KJ122的RpoA蛋白中脯氨酸至亮氨酸点突变的作用。使用P1vir转导法，以两个步骤构建RY859A1。首先，使用来自Keio缺失集合(从美国康涅狄格州纽黑文耶鲁大学大肠杆菌遗传保藏中心可获得)的JW3242作为供体并且对卡那霉素耐药性选择，将连锁的aroE::kan等位基因转导至KJ122中。对于第二步骤，使用野生型大肠杆菌C作为供体，并且选择是对在最低葡萄糖培养基上的生长进行的选择。测定RY859A1的rpoA基因的序列并且显示其是野生型的。在小规模发酵罐中在48小时时，RY859A1产生370mM的琥珀酸，这略小于产生385mM琥珀酸的KJ122。发酵一式两份进行并且是可重复的。
实施例6
固化KJ122中突变的rpoC基因
KJ122菌株和大肠杆菌C菌株之间的基因组序列比较分析揭示了由rpoC基因编码的RNA聚合酶的β′亚基的F区内的错义点突变。RpoC蛋白在RNA合成期间与DNA模板结合。在第747位置处的甲硫氨酸残基已经被KJ122中的异亮氨酸替换。通过转移野生型等位基因rpoC突变至KJ122中以产生新菌株RY862A并且确定这种突变对琥珀酸产生的影响，评估了KJ122的RpoC蛋白中这个点突变的作用。使用P1vir转导法构建RY862A。使用来自Keio缺失集合(从美国康涅狄格州纽黑文耶鲁大学大肠杆菌遗传保藏中心可获得)的JW5549作为供体并且对卡那霉素耐药性选择，将连锁的thiG::kan等位基因转导至KJ122中。测定RY862A的rpoC基因的序列并且显示其是野生型的。将盐酸硫胺素以5mg/升添加至RY862A和对照KJ122的发酵培养基以确保的RY862A生长。在小规模发酵罐中在48小时时，RY862A的琥珀酸滴度是320mM，显著地低于KJ122的琥珀酸滴度425mM。RY862A的初始生长速率也慢于KJ122，是0.15OD550/小时对0.23OD550/小时。发酵一式两份进行并且是可重复的。
实施例7
固化KJ122中突变的gldA基因
NAD+依赖性甘油脱氢酶由gldA基因编码。GldA蛋白催化甘油可逆氧化成二羟丙酮，并且也可以催化甲基乙二醛还原成R-乳醛。基因组序列比较分析已经揭示，KJ122中的gldA基因含有移码突变。使用上述的两步骤基因替换方法，通过将野生型gldA基因安置到KJ122中以产生新菌株AC6，评估gldA基因的突变形式对琥珀酸生产的影响。在第一步骤中，将cat-sacB盒安置在菌株KJ122的gldA基因座处，以产生菌株AC5。所用的PCR引物是SEQ ID NO.9和10(见表1)。在第二步骤中，将来自大肠杆菌C的野生型gldA基因安置于AC5中，以产生菌株AC6。所用的PCR引物是SEQ ID NO.13和14(见表1)。在小规模发酵罐中在96小时，AC6的琥珀酸滴度是580mM，略微高于KJ122的琥珀酸滴度，其是530mM。然而，AC6的初始生长速率是0.16OD550/小时，略微慢于KJ122的初始生长速率，其是0.20OD550/小时。因而，突变的gldA产生将在KJ122的代谢进化期间予以选择的轻微生长优势。
实施例8
固化KJ122中突变的dhaM基因
二羟丙酮激酶是与磷酸转移酶(PTS)系统相关的多亚基蛋白，由一个操纵子dhaKLM上的三个基因编码。DhaM亚基与甘露糖转运蛋白的IIA结构域、磷酰基载体蛋白Hpr和酶1的N端结构域具有序列相似性。在大肠杆菌中，DhaM使用PEP而不是ATP作为二羟丙酮的磷酸化时磷酸的供体。DhaM由PEP借助酶1和磷酰基载体蛋白HPr磷酸化。KJ122的dhaM基因含有移码突变。为了评估dhaM突变在KJ122中的作用，使用上述的两步骤基因替换方法，将野生型dhaM基因安置到KJ122中以产生新菌株AC2。在第一步骤中，将cat-sacB盒安置在菌株KJ122的dhaM基因座处，以产生菌株AC1。所用的PCR引物是SEQ ID NO.11和12(见表1)。在第二步骤中，将来自大肠杆菌C的野生型dhaM基因安置于AC1中，以产生菌株AC2。所用的PCR引物是SEQ ID NO.15和16(见表1)。在小规模发酵罐中在96小时，来自AC2的琥珀酸的滴度是560mM，略微高于KJ122的琥珀酸滴度，530mM。然而，AC6的初始生长速率是0.16OD550/小时，略微慢于KJ122的初始生长速率，其是0.20OD550/小时。因而，使dhaM突变产生了将在KJ122的代谢进化期间予以选择的轻微生长优势。由于DhaKLM消耗了作为琥珀酸生物合成的底物的PEP，保留PEP是KJ122生长优势的机制。除了使dhaKLM操纵子中基因突变之外或取而代之，也可以突变编码任何其他PTS依赖性二羟丙酮激酶的亚基的基因以检验它们在琥珀酸产生中的重要性。
实施例9
固化KJ122的ftsI基因中的错义突变
ftsI基因编码参与细胞壁合成和/或分隔的必需蛋白。KJ122的ftsI基因含有错义突变，其使编码序列的第619碱基从C变成T，这使得精氨酸207变成半胱氨酸。通过转移野生型等位基因ftsI突变至KJ122中以产生新菌株RY858G1并且确定这种突变对琥珀酸产生的影响，评估了KJ122的FtsI蛋白中精氨酸至半胱氨酸点突变的作用。由于FtsI是必需蛋白，所述两步骤基因替换方法将不起作用，取而代之使用一个两步骤P1vir转导法来构建RY858G1。首先，使用来自Keio缺失集合(从美国康涅狄格州纽黑文耶鲁大学大肠杆菌遗传保藏中心可获得)的JW0073作为供体并且对卡那霉素耐药性选择，将连锁的leuA::kan等位基因转导至KJ122中，以产生新菌株RY853G1。对于第二步骤，使用大肠杆菌C作为供体，RY853G1是受体，并且选择是对在最低葡萄糖培养基上的生长进行的选择。测定RY858G1的ftsI基因的序列并且显示其是野生型的。在小规模发酵罐中，RY858G1以大约与KJ122相同的初始速率生长，但是在72小时，RY858G1产生比KJ122(其产生460mM)略少的琥珀酸，是440mM。因此，KJ122的ftsI基因中的错义突变对琥珀酸滴度的增加略微作出贡献。
实施例10
联合突变的加性效应
在表3中汇总了上文详述的菌株比较结果。已经一次一个地测试过的许多突变仅导致琥珀酸滴度或生长速率的轻微增加。然而，这些增加必须是加性和/或协同的以产生对KJ122相对于其祖先而言所找到的总体改善(Jantama等人，2008a；Jantama等人2008b)。例如，通过将野生型rpoC基因转导至含有野生型rpoA基因的RY859A1中，构建了针对rpoA中错义突变和rpoC中错义突变固化的KJ122衍生物，从而产生新菌株RY860A。按照与实施例6中所述的RY862A相同的方式构建RY860A，除了受体菌株是RY859A1而不是KJ122之外。在小规模发酵罐中在48小时，补充5mg/l盐酸硫胺素的情况下，RY860A产生比KJ122(425mM)明显更少和比仅针对rpoC突变固化的RY862A(320mM)更少的琥珀酸(300mM)。
实施例11
从原生态
Figure BDA00001656471200411
菌株构建新的琥珀酸生产者
菌株TG128是源自大肠杆菌W(ATCC 9637)的D-乳酸生产者，基因型为ΔfrdABCD、ΔadhE、ΔpflB、ΔmgsA和Δack。TG128已经在2005年7月25保藏于美国农业研究菌种保藏中心，北大学街1815，皮奥里亚市，伊利诺斯州，61604美国(Agricultural Research Services CultureCollection，1815N.University Street，Peoria，Illinois，61604U.S.A)，并且具有菌株登录号NRRL B-30962。随后，TG128通过以下方式进行代谢进化：首先在蔗糖上生长进行选择，其次39摄氏度生长进行选择，并且第三对40摄氏度生长进行选择。所得的菌株命名为TG160。随后将TG160再工程化为产琥珀酸菌株。使用上述的两步骤基因替换方法，按照以下时间顺序安置来自KJ122的等位基因：pck＊、ΔldhA、frdABCD+和ptsI＊。pck＊和ptsI＊突变均是已经存在于KJ122基因组中并且已经显示增加琥珀酸产生效率的突变(Zhang等人，2009a)。所得的菌株WG32b随后在微有氧小发酵罐培育约126代(23次转移)以产生菌株WG32b-T23。WG32b-T23是在小规模发酵罐中产生约260mM琥珀酸的中等良好的琥珀酸生产者。接下来，基于本发明在KJ122基因组中的发现，将两个额外的突变添加至WG32b-T23。首先，使用两步骤基因替换方法，在基因组中在dnaA基因附近的基因座处整合galP基因的第二副本，连同含天然启动子和终止子的侧翼序列。在插入位点的DNA序列是：attaaattttccaatatgcggcgtaaatcgtgcccgcctcgcggcaggatcgtttacacttagcgagttctggaaagtcctgtggataaatcgggaaaatctgtgagaaacagaagatct-插入位点-cttgcgcagtttaggctatgatccgcggtcccgatcgttttgcaggatcttgactcgggcatataaccgcagacagcggt。在第一步骤中，将kan-sacB盒在dnaA基因座处插入以产生菌株WG62。所用的PCR引物是SEQ ID NO.25和26(见表1)。在第二步骤中，将galP的第二副本安置在dnaA基因座处。所用的PCR引物是SEQ IDNO.27和28(见表1)。所到的菌株命名为WG74，以小规模发酵时产生约320mM琥珀酸。其次，将pykA基因的完整可读框从WG74缺失并且替换为cat-sacB盒以产生新菌株WG96。所用的PCR引物是SEQ ID NO.29和30(见表1)。在小规模发酵中，WG96产生450mM琥珀酸，这是超过前体菌株WG32b-T23和WG74的明显改善。因而，本发明人已经清楚地确立，发现KJ122中突变的确切本质为怎样从进化较少的不同亲本菌株构建出新的改进的产琥珀酸菌株提供了独特的信息和深入认识。另外，本发明的发现是广泛适用的。例如，不仅可以通过在新菌株中安置KJ122中存在的相同突变，而且可以通过重复GalS阻遏作用的靶galP基因，应用对galS突变的认识。作为另一个实例，不仅可以通过在新菌株中安置KJ122中存在的相同突变，而且可以通过安置pykA缺失，应用对pykA突变的认识。
本文公开的发明可以归纳为改善用于产生除琥珀酸之外还改善用于产生其它化学品的菌株和方法。提供的实施例意在起说明作用，但不起限制作用。
GalP蛋白起到通过耗费细胞大约1/3ATP的质子共运输机制输入葡萄糖和其他糖的作用。在输入后，糖如葡萄糖需要磷酸化，这耗费额外的一个ATP，总共耗费约1.33个ATP。就代谢能量而言，这比通过PTS系统输入糖如葡萄糖成本更低，其中所述PTS系统耗费一个PEP，其在能量学上等同于约2个ATP。因而，由GalP输入糖如葡萄糖是比使用PTS更高效的。
另外，在许多发酵过程中，尤其但限于厌氧和微有氧过程，除琥珀酸之外，PEP还可以充当生物合成其它化学品如苹果酸、延胡索酸、天冬氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸、赖氨酸和其他化学品的中间体。因而，通过使用GalP替代PTS而保留PEP并且通过总体降低丙酮酸激酶活性，可以改进生物合成的效率。
在许多发酵中，在基本培养基中的更高效生长是合乎需要的，并且存在于KJ122中的48kb缺失将帮助改善在基本培养基中使用大肠杆菌的任何发酵的效率。
存在于KJ122中的ftsI突变可能通过导致更小或更多的球状细胞(转而导致更高的表面积对体积比)来改善效率。这转而将导致更高效输入养分如葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、甘油等和更高效地输出产物如琥珀酸、苹果酸、延胡索酸、天冬氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸、赖氨酸等。
rpoA和rpoC中存在的突变导致葡萄糖的分解代谢物阻遏作用广泛丧失。这种去阻遏作用在很多情况下增加生物合成的效率。例如，作为受欢迎的廉价糖来源的生物量水解产物通常含有糖(包括葡萄糖)的混合物。想要的是，多种其他糖应当随葡萄糖一起利用，并且移除分解代谢物阻遏作用增强了细胞高效消耗和代谢非葡萄糖的糖及葡萄糖的能力。另外，移除分解代谢物阻遏作用增加所需基因如pck、galP、mdh、fumA、xylE、lacZ、lacY、fumB和frdABCD的表达。因而，本发明的RNA聚合酶突变对于多个商业有用菌株和发酵过程具有广泛的应用性。
因而，在本发明中发现的突变用于增加琥珀酸产生，它们是新颖的，在于先前未曾描述它们用于琥珀酸产生或用于其他有机酸产生，并且它们具有创造性，在于本领域技术人员本来不可能预测到本发明的各个突变或这些突变的组合会改善琥珀酸或其他机酸的产生。
虽然在KJ122基因组序列中发现的几个突变在一次一个地改变时仅轻微影响生长或琥珀酸产生，但是应当强调，随着时间段覆盖许多世代，将在代谢进化期间对甚至微小的生长速率增加进行选择。另外，其中每一单独突变以加性或协同方式作出贡献的几个突变的组合将引起生长和/或琥珀酸产生的效率大幅度增加。
从新的第二亲本菌株构建旨在通过发酵产生所需化学的微生物的方法，如在实施例11中所公开，可以概括至多种化学品和菌株。所述的普遍适用的方法将包括：(A)从第一亲本菌株缺失至少一个编码酶的基因以产生第一中间菌株，所述酶催化指向与所述所需化学品不同的发酵产物的生物合成途径中的步骤，(B)对所述第一中间菌株进行代谢进化以产生第二中间菌株，(C)测定所述亲本菌株和所述第二中间菌株的基因组DNA序列，(D)比较所述基因组DNA序列以鉴定所述代谢进化期间选择出的突变，(E)测试所述突变至少之一以确定所述突变中哪些有益于增加生长速率或产生所述所需化学品的效率，(F)选择所述有益突变中的至少之一，和(G)将所述有益突变的至少之一或功能上与所述有益突变之一相似的至少一个突变安置于第二亲本菌株中以产生所述微生物。
除琥珀酸之外，这种普遍适用的方法还适用于其它化学品，如延胡索酸、苹果酸、天冬氨酸、谷氨酸和这些化学品中任一者的衍生物，并且除了适用于大肠杆菌之外，还适用于其它微生物，包括其他细菌、archeons、酵母、丝状真菌、藻类和沟鞭藻(dinoflagellate)。
已经参考优选的实施方案在上文详述了申请人的发明。熟悉以上详述内容的技术人员可以作出任何修改而不脱离后附权利要求书的精神。
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Figure BDA00001656471200481
参考文献
为便利读者，列出全部参考资料。每份参考资料通过引用的方式完整并入。
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Claims (23)

1.一种非天然存在的微生物，其包含增加的磷酸烯醇丙酮酸羧激酶活性水平和编码丙酮酸激酶活性的基因中的突变。
2.根据权利要求1所述的非天然存在的微生物，其中增加的磷酸烯醇丙酮酸羧激酶活性水平因将pck基因的天然调节序列替换为增加磷酸烯醇丙酮酸羧激酶活性的改变的调节序列引起。
3.根据权利要求1所述的非天然存在的微生物，其中编码丙酮酸激酶活性的基因是pykA基因或其同源物。
4.根据权利要求1所述的非天然存在的微生物，其中编码丙酮酸激酶活性的基因是pykF基因或其同源物。
5.根据权利要求1所述的非天然存在的微生物，还包含降低PEP依赖性磷酸转移酶系统的功能的一个或多个遗传修饰。
6.根据权利要求1所述的非天然存在的微生物，还包含：
(a)降低PEP依赖性磷酸转移酶系统的功能的一个或多个遗传修饰；和
(b)增加至少一种非PTS糖转运蛋白的活性的一个或多个遗传修饰。
7.根据权利要求7所述的非天然存在的微生物，其中所述的非PTS糖转运蛋白是半乳糖通透酶。
8.根据权利要求7所述的非天然存在的微生物，其中半乳糖通透酶活性的增加由增加编码半乳糖通透酶的galP基因的拷贝数实现。
9.根据权利要求7所述的非天然存在的微生物，其中半乳糖通透酶活性的增加由通过一个或多个突变减轻阻抑物的负向控制作用来实现。
10.根据权利要求9所述的非天然存在的微生物，其中半乳糖通透酶的所述阻抑物由galS或galR基因编码。
11.根据权利要求1所述的非天然存在的微生物，还包含在参与发酵途径的至少一个基因中的突变。
12.根据权利要求1所述的非天然存在的微生物，还包含在与三羧酸循环运行相关的至少一个基因中的突变。
13.根据权利要求1所述的非天然存在的微生物，还包含在编码RNA聚合酶亚基的基因中的突变。
14.一种非天然存在的微生物，其产生多于20g/L从草酰乙酸衍生的有机酸或其他化学品并且包含在编码RNA聚合酶亚基的基因中的突变。
15.根据权利要求13或权利要求14所述的非天然存在的微生物，其中编码RNA聚合酶亚基的基因是rpoA基因。
16.根据权利要求13或权利要求14所述的非天然存在的微生物，其中编码RNA聚合酶亚基的基因是rpoC基因。
17.根据权利要求1所述的非天然存在的微生物，还包含在染色体DNA中的缺失，其中所述缺失移除ydcC、ydcD、ydcE和ydcF基因。
18.根据权利要求1或权利要求14所述的非天然存在的微生物，还包含在ftsI基因中的突变。
19.根据权利要求1或权利要求14所述的非天然存在的微生物，还包含在gldA基因中的突变。
20.根据权利要求1或权利要求14所述的非天然存在的微生物，还包含在dhaKLM操纵子或编码PTS依赖性二羟丙酮激酶亚基的基因中的突变。
21.一种非天然存在的微生物，其产生多于20g/L从草酰乙酸衍生的有机酸或其他化学品并且包含在染色体DNA中的缺失，其中所述缺失移除ydcC、ydcD、ydcE和ydcF基因或其同源物。
22.一种产生琥珀酸的方法，包括：
(a)培养根据权利要求1至权利要求14中任一项所述的微生物；
(b)提供碳源；
(c)允许所述微生物代谢所述碳源；和
(d)任选地，分离琥珀酸。
23.一种用于构建微生物以通过发酵产生所需化学品的方法，包括：
(a)从第一亲本菌株缺失编码酶的至少一个基因以产生第一中间菌株，所述酶催化生物合成途径中指向与所述所需化学品不同的发酵产物的步骤，
(b)对所述第一中间菌株进行代谢进化以产生相对于所述第一菌株具有改进的生长的第二中间菌株，
(c)测定所述第一亲本菌株和第二中间菌株的基因组DNA序列，
(d)比较所述基因组DNA序列以鉴定在所述代谢进化期间受到选择的突变，
(e)测试所述突变中的至少一个突变并且鉴定哪个所述突变对于增加生长速率或产生所述所需化学品的效率是有益的，和
(f)将所述鉴定的有益突变中的一个或多个突变或在功能上与所述有益突变之一相似的一个或多个突变安置在第二亲本菌株中，以形成用于产生所需化学品的微生物。
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