WO2011016706A2 - Cepas de escherichia cou modificadas por ingeniería metabólica para la producción de compuestos químicos a partir de lignocelulosa hidrolizada, pentosas, hexosas u otras fuentes de carbono - Google Patents

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Georgina Teresa HERNÁNDEZ CHÁVEZ
Gerardo Huerta Beristain
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Definitions

  • the present invention relates to new strains of Escherichia coli called JU15, JU15A, LL26, MS04, deposited in the Agricultural Research Service (ARS) Patent Culture Collection (NRRL), of the United States Department of Agriculture, with access numbers NRRL B-50140, NRRL B-50137, NRRL B-50139 and NRRL B-50138, and derivatives that produce metabolites, particularly D-Lactate, L-Lactate and even ethanol, with high yield and high selectivity from a broad variety of carbon sources.
  • ARS Agricultural Research Service
  • Particularly media formulated with vegetable fiber hydrolysates such as cane bagasse, agave and grasses, in addition to a wide variety of agroindustrial wastes, such as buttermilk or forest wastes, cellulose, grasses, agave bagasse, scrap paper, shavings and sawdust, shrubs and in general any material derived from lignocellulose, as well as glycerol from the biodiesel and sugar industry derived from starch and sucrose.
  • agroindustrial wastes such as buttermilk or forest wastes, cellulose, grasses, agave bagasse, scrap paper, shavings and sawdust, shrubs and in general any material derived from lignocellulose, as well as glycerol from the biodiesel and sugar industry derived from starch and sucrose.
  • agroindustrial wastes such as buttermilk or forest wastes, cellulose, grasses, agave bagasse, scrap paper, shavings and sawdust, shrubs and in general any material derived from lignocellulose,
  • IVM Metabolic Pathways
  • PLA polylactates
  • Dien et al., 2002; Skory, 2003 polylactates
  • the synthesis of biodegradable PLA requires the separate production of the D and L isomers of lactate, in addition the physical and biodegradation properties of PLA depend on the proportion used in the manufacture of the polymer of forms D and L.
  • Lactate can be produced either by microbial fermentation or by chemical synthesis (Narayanan et al., 2004).
  • the most used chemical process is the hydrolysis of lactonitrile by strong acids; however, there are other chemical routes (John et al., 2007) such as: propylene glycol oxidation; acetaldehyde reaction; carbon monoxide and water at elevated temperatures and hydrolysis of chloropropionic acid, among others. All these routes have as a final product a mixture of the D and L isomers and depend on raw materials derived from petroleum, which reduces the sustainability of these production processes.
  • Lactate is produced by a microbial fermentation process of culture media with a carbon source of easy assimilation, such as glucose.
  • Ethanol can be used for a wide variety of applications, the main application discussed in this document is that of liquid fuel that allows to oxygenate, replace or complement the fossil fuels that are currently used in internal combustion engines.
  • Other applications of ethanol are as fuel in industrial boilers, lamps, stoves, turbines, etc.
  • ethanol Compared in volumetric terms, the energy content of ethanol is approximately two thirds of the energy contained in gasoline or diesel. However, ethanol has a high octane number value, which causes engines that use gasoline-ethanol blends to have better efficiency. Mixtures containing up to 22% (v / v) ethanol can be used successfully in today's gasoline engines, this is without the need to make modifications to internal combustion engines.
  • ethanol Another alternative for the use of ethanol is that of oxygenator.
  • gasoline needs to raise its octane without using lead, for this purpose, alcohols and esters have been used.
  • terbutyl ethers are used, of which terbutyl methyl ether (MTBE) is the most widely used.
  • MTBE terbutyl methyl ether
  • these compounds can accumulate in the water tables, which are recalcitrant to chemical or biological degradation, and that in concentrations of parts per million are carcinogenic to humans. In some states, such as California in the US, its use has been banned.
  • ethanol is obtained from the fermentation of glucose or sucrose, obtained from corn starch and cane sugar respectively.
  • This fermentation is carried out with ethanol organisms such as Saccharomyces cerevisiae, which is the organism that is traditionally used for the production of ethanol from glucose, from the hydrolysis of grain starch and sucrose, from sugar cane or beet .
  • Saccharomyces cerevisiae which is the organism that is traditionally used for the production of ethanol from glucose, from the hydrolysis of grain starch and sucrose, from sugar cane or beet .
  • This microorganism lacks the ability to metabolize the sugars of five carbons known as pentoses that are abundantly found in hydrolysates of plant material (Hahn-Hagerdal et al., 1993).
  • Zymomonas mobilis is a Gram negative bacterium, which has the native ability to produce ethanol with good yields, due to its metabolic characteristics, among which two very efficient enzymatic activities stand out: pyruvate decarboxylase (Pdc) and alcohol dehydrogenase (Adh), which convert pyruvate to acetaldehyde and ethanol, respectively.
  • Pdc pyruvate decarboxylase
  • Adh alcohol dehydrogenase
  • S. cerevisiae Z. mobilis is limited in the sugars it can metabolize; You can only use sucrose, glucose and fructose, and do not use xylose or other pentoses, or other disaccharides.
  • Cellulose is the major constituent of lignocellulose (20-50%), it is a linear polymer composed of dextrose (D-glucose) subunits, linked by ⁇ - (1-4) glycosidic bonds and due to its structural conformation it is highly hydrolysis resistant.
  • D-glucose dextrose
  • ⁇ - (1-4) glycosidic bonds due to its structural conformation it is highly hydrolysis resistant.
  • Glucose can also be obtained mainly from the hydrolysis of starch.
  • hemicellulose is not chemically homogeneous, since it is composed of a heterogeneous polysaccharide with monomers of hexoses (glucose, mannosa and galactose), and pentoses (xylose and arabinose) and some acids (acetic acid and glucuronic acid), What makes its bioconversion to fermentation products of interest for industrial use problematic.
  • hemicellulose is the second most common polysaccharide in nature because it represents 20-35% of lignocellulosic biomass.
  • the proportion of pentoses and hexoses in hemicellulose is 85 and 15% respectively, where xylose is the most abundant, followed by glucose and arabinose (75, 15 and 10%, respectively) (Saha, 2003; Mart ⁇ nez et al., 2000).
  • the hemicellulose can be converted to monomeric sugars by hydrolysis at temperatures below 200 0 C, using low acid concentrations, among other methods, since there are various methods of hydrolysis: physical, physicochemical, chemical and / or biological ( Sun et al., 2002).
  • xylose is the most abundant monosaccharide in nature and is usually polymerized in the hemicellulosic fraction of plant tissue, however, the variety of microorganisms that metabolize both pentose and hexoseous is very limited, moreover, there are no wild microorganisms that can efficiently catabolize pentoses or mixtures of pentoses-hexoses, by fermentation processes to products of industrial interest with high yields (Hernández-Montalvo et al., 2001).
  • lignocellulosic materials presents serious limitations, because they are composed of sugar polymers, mainly glucose-xylose, where xylose is a pentose that is not fermentable by most wild or genetically modified microorganisms and that they are used industrially as Saccharomyces cerevissiae, Corynebacterium glutamicum, some lactobacilli, Zymomonas mobilis or Bacillus subtillis (Dien et al., 2001).
  • Another disadvantage for its industrial use is that most of the microorganisms used for this purpose, such as lactobacilli, require complex culture media, thereby increasing production costs by nutrients, by purification of the product, etc.
  • lactobacilli require complex culture media, thereby increasing production costs by nutrients, by purification of the product, etc.
  • the majority synthesizes only the D-lactic isomer or a mixture of D and L-lactic acid.
  • Lactose is a disaccharide composed of glucose and galactose molecules linked by beta 1-4 bonds. This disaccharide is present in the milk of mammals and it is common to find it in whey as an agroindustrial waste obtained in cheese making. Escher ⁇ chia coli.
  • Escherichia coli has many advantageous characteristics as a base microorganism for developing strains and obtaining biotechnological products. Among these are: rapid growth under aerobic or anaerobic conditions; its complete genome is known; methodologies are available to modify its genome; It can metabolize both hexoses and pentoses, disaccharides, another wide variety of sugars and other carbon sources, using only mineral salts as nutrients.
  • metabolic engineering strategies propose changes in the fermentative pathways to modify the carbon balance towards the desired product while maintaining the redox balance and avoiding the formation of by-products, in order to improve the accumulation of a single fermentation product, as an example lactic acid (Zhu et al., 2007), obtaining in this case a homolactic microorganism and when only a homoetanologenic microorganism is produced ethanol (Zhou et al., 2008).
  • the insufficiency of ATP was confirmed by inactivating the acetate kinase (ack) gene in E.
  • the mutant was unable to grow in a minimal medium supplemented with xylose under anaerobic conditions, confirming the need for ATP produced by Ia Ack (Hasona et al., 2004).
  • Ia Ack Hasona et al., 2004.
  • transport and phosphorylation is carried out by the PTS system with the expense of an equivalent of ATP, however for xylose the cell spends two ATP molecules, one for transport (High affinity transporter ABC) and the second for phosphorylation (Lin, 1996; Linton and Higgins 1998) .
  • E. coli contains a gene that codes for an enzyme essential for the production of lactate such as lactate dehydrogenase (IdhA), which is expressed under anaerobic conditions (Zhou et al., 2003a), however, E. coli when grown in the presence of glucose or xylose is heterofermentative, also producing acids: acetic, formic, lactic, succinic; in addition to ethanol, hydrogen and carbon dioxide (Bóck and Sawers 1996).
  • IVM lactate dehydrogenase
  • E. coli strains have been modified for the interruption of the pathways competing for the availability of pyruvate, to make the microorganism homofermentative and produce mostly D-lactate (US Patent Application No.
  • Another disadvantage is, in response to a low availability of acetyl-CoA (key metabolite in the contribution of carbon skeletons to biomass), obtaining strains with very low or no growth rate in anaerobic culture conditions with glucose as the only source carbon Typically these strains are unable to grow unless the medium is supplemented with acetate (Zhou et al., 2003a), making the culture medium more expensive and / or complicating the industrial process.
  • E. coli has a route to produce other compounds of industrial interest such as ethanol naturally, however the amount of alcohol produced in this way is very low: In addition to the product of interest, it produces a mixture of others fermentation products, among which are acetic, formic, succinic, and lactic acids (González et al., 2002; Dien et al., 2003; Lawford and Rousseau 1996; Lawford and Rousseau, 1997), thus being a microorganism Heterofermentative Through the use of the Engineering of Metabolic Pathways (IVM) it has been possible to divert the flow of carbon to a heterologous route of ethanol production in E. coli, obtaining strains, with different genetic background to those reported in the present invention, capable to give good yields in the fermentation of basically glucose or xylose to ethanol (Otha er a /., 1991).
  • IVM Engineering of Metabolic Pathways
  • Figure 1 Image showing the interrupted pathways in the diagram of glucose and xylose metabolism in E. coli and the main fermentation products, including that of ATP, in strain CL3.
  • Figure 2 Image showing the interrupted pathways in the diagram of glucose and xylose metabolism in E. coli and the main fermentation products, including ATP, in strain JU15.
  • Figure 3 Image showing the blocked pathways in the diagram of glucose and xylose metabolism in E. coli and the main fermentation products, including ATP, in strain JU15A.
  • FIG. 4 Image showing a gel with the PCR products in colony of possible ⁇ pfIB mutants. (lane headings represent the number from colony) (C: Control). Lanes 12, 15, 17,18 correspond to the size of the interrupted gene. 13,14, and 16 correspond to the intact gene.
  • Figure 7 Image showing a gel with the 1.9 Kpb product corresponding to the inactivated adhE gene.
  • Figure 10 Image showing a gel with the PCR product corresponding to inactivated xylFGH genes.
  • Figure 12 Graphs showing growth kinetics during the adaptive evolution of strain JU01 in AM2-xylose 120 g / L and a bar graph of the productivity of organic acids at 48 h.
  • Figure 14 Graph showing the growth kinetics of E. coli JIM 5 in simulated hydrolyzate 1.
  • Figure 17 Graph showing the growth and substrate consumption kinetics by JU15A in simulated hydrolyzate 1.
  • Figure 18 Graph showing the fermentation kinetics of JU15A in simulated hydrolyzate 2.
  • Figure 19. Graph showing the growth and substrate consumption kinetics by JU15A in simulated hydrolyzate 2.
  • Figure 20 Graphs showing kinetics of: A) growth and B) lactate production in the hemicellulosic hydrolyzates of the cane bagasse of 6 independent runs (A, B, C, D, E, F) by E. coli JU15A.
  • Figure 21 Graphs showing kinetics of: A) consumption of glucose B) consumption of xylose in the hemicellulosic hydrolysates of the cane bagasse of 6 independent runs (A, B, C, D, E, F) by E. coli JU15A.
  • Figure 22 Graphs showing kinetics of: A) Arabinose consumption B) accumulation of acetic acid in the hemicellulosic hydrolyzates of the cane bagasse of 6 independent runs (A, B, C, D, E, F) by E. coli JU15A.
  • Figure 23 Graphs showing fermentation kinetics in hemicellulosic hydrolyzates of cane bagasse by E. coli JU15A.
  • Figure 24 Graph showing kinetics of lactose consumption by three different strains: MG1655, JU01 and JU15.
  • Figure 25 Graph showing kinetics of D-lactate production from lactose by three different strains: MG1655, JU01 and JIM 5.
  • Figure 26 Graph showing basic consumption kinetics of three different media with whey with strain JU15.
  • Figure 27 Image showing the plasmid pLDHf ⁇ sC containing the LDH Ss gene, the sites: P1, FRT, the gene encoding chloramphenicol acetyl transferase, and the FRT and P2 sites.
  • Figure 28 Image showing a gel with the PCR product corresponding to
  • Lane 1 molecular weight markers
  • lanes 2 and 3 negative controls
  • lanes 5 and 6 PCR product of 2.6 kbp corresponding to the verification of the gene in strain LL1.
  • Figure 29 Image showing a gel with the verification of the integration of the heterologous gene and the elimination of the gene coding for chloramphenicol acetyl transferase.
  • PCR products of the interrupted colonies in the IdhA gene and lacking the gene that confers resistance to Cm are shown from lane 2 to 6, as well as the control strain JU15 lanes 7 and 9 whose product is 1069 bp, lane 8 corresponds to a negative control of 1860 bp.
  • Figure 30 Graph illustrating the adaptive evolution of the LL2 vs JU15 strain in xylose at 40 g / L and the consumption of 2N KOH.
  • FIG. 31 Image showing a 1% agarose gel with the PCR product in which it comprises the gene coding for chloramphenicol acetyl transferase (Cm), FRT, PS1 and PS2 sites and homology sequences to the IdhA gene of E coli JU15A.
  • Lane 1 molecular weight marker
  • lane 3 PCR product.
  • Figure 32 Image showing a gel with the verification of the interruption of the IdhA gene by PCR.
  • Lane 1 Molecular weight marker
  • Lane 3 control Cm R
  • lanes 4 to 7 of 4 colonies transformed using an oligo with homology to a region of the Cm gene and oligo 1190 RVF.
  • Figure 33 Image showing a 1% agarose gel: lanes 1 and 2 lanes molecular weight marker; 3-6: The verification of the interruption of the IdhA gene and the elimination of the Cm gene by PCR of 4 colonies transformed with the pCP20, product size: 619 bp, lane 7: Control strain JU15A ldhA + (1482 bp).
  • Figure 34 Image showing a gel with the agarose gel PCR product (1%) containing the pdc and adhB genes of Z. mobilis flanked by homology sequences with upstream and downstream regions of the pflB gene of E. coli MS01. Lane 1: molecular weight marker, lane 2: PCR product.
  • Figure 35 Image showing a gel with the PCR products with oligos 250 bp upstream and downstream of the pflB gene.
  • Lane 1 molecular weight marker
  • Lanes 2 and 9 control strain MS01; 569 bp
  • lanes 3-8 strains with the integration of the pdc and adhB genes of Z. mobilis under the promoter region of pflB: 3361 bp.
  • Figure 36 Graph showing fermentation kinetics of E. coli strain MS04 in AM2 medium with: A) glucose and B) xylose (50 g / L) all with acetate (2.05 g / L).
  • Figure 37 Graph showing fermentation kinetics of E. coli strain MS04 in AM2 medium with the mixture: glucose-xylose (7.5-42.5 g / L) and with acetate (2.05 g / L).
  • Figure 38 Graph showing fermentation kinetics of E. coli LL26 strain in AM2 medium with glucose (4%). The yield was close to the theoretical one (100%) and the volumetric productivity 1.17 g of lactate per liter per hour for glucose.
  • Figure 39 Graph showing fermentation kinetics of E. coli LL26 strain in AM2 medium with xylose (4%). The yield was close to the theoretical one (100%) and the volumetric productivity 0.68 g of lactate per liter per hour for xylose.
  • Figure 40 Image showing the interrupted pathways in the diagram of glucose and xylose metabolism in E. coli and the main fermentation products, including ATP, in strain LL6.
  • Figure 41 Image showing the blocked pathways in the diagram of glucose and xylose metabolism in E. coli and the main fermentation products, including ATP, in strain MS4.
  • Figure 42 Graph showing a Kinetics of ethanol production from gramalote grass hydrolyzate syrup (Paspalum fasciculatum).
  • Figure 43 Graph showing a Kinetics of ethanol production from agave hydrolyzate syrup.
  • E. coli strains capable of growing with different basic carbon sources have been obtained, such as glucose, Ia xylose, arabinose, and / or lactose, among others, and convert them into a single metabolite of interest, particularly L-lactate, D-lactate or even ethanol, with high productivity and yields, based on a homolactic strain that showed superior abilities , in terms of specific growth rate, glucose consumption and D-Lactate production, with respect to the previously reported E. coli strains.
  • coli was constructed, named in the present invention as the strain JU 15, deposited in the ARS Patent Culture Collection (NRRL), of the United States Department of Agriculture, with the accession number NRRL B- 50140, capable of fermenting sources of very difficult assimilation such as the hydrolysates of the hemicellulosic fraction of plant tissues (abundant in xylose), such as cane bagasse and produce in D-lactate with yield of 95% of theoretical value and comparable speeds to lactic bacteria (strains commonly used to produce D-Lactate).
  • NRRL ARS Patent Culture Collection
  • the inventors of the present invention seeking to propose a solution to this technical problem, have generated new microbial strains capable of growing and fermenting glucose, but the most important thing is that they can also take advantage of xylose and even lactose, and efficiently convert them into a single metabolite of industrial interest.
  • metabolites that can be produced with the strains of the present invention include organic acids, such as acetic, succinic, malic, pyruvic and lactate, the latter in either its D isomer or its L isomer, with a high degree of purity optical, other possible metabolites are alcohols, such as ethanol, 1, 2 and 1, 3 propanediol, among others.
  • the inventors used the most recent techniques of metabolic pathway engineering, under an original criterion.
  • the present invention relates to methods or processes for bioconverting sugars in metabolites of industrial interest, by using the strains of the present invention.
  • these methods are able to convert the sugars present in plant tissues, such as cane bagasse, in different metabolites of industrial interest such as Io is Dy L-lactate with yields of the order of 95% and volumetric productivity around 1g / (L * h) and ethanol with yield of 90% and productivity of 1 g / (Lh)
  • a great advantage of the methods of the present invention is that the obtaining of such metabolites can be carried out by fermentation in a simple and cheap mineral medium, using the sugars found, for example , in hydrolysates of the hemicellulosic fraction of plant tissues, such as cane bagasse, or in agroindustrial residues such as whey, with high yield and productivity compared with other previously reported strains of E. coli that do not efficiently metabolize the xylose and that They need complex means to grow.
  • This strain shows a conversion yield of glucose to D-lactate of 95%, a specific glucose consumption rate of 6 g / g cells.h; and as a result of its unusual ability to grow at cell densities of about 1 g / L it has the volumetric productivity of D- Highest lactate achieved in a batch culture by an un evolved strain, due to the aforementioned characteristics, this strain was used as a starting strain for subsequent modifications in terms of efficient xylose metabolism and production of other metabolites. precedents, shown by the strain CL3 to grow optimally in Anaerobic conditions were considered a key skill as a starting point for the development of the present invention.
  • This strain CL3 was used as a starting strain for subsequent modification and to achieve the efficient conversion of xylose into lactate, for which modifications were made in the transport of xylose, inactivating the ATP-dependent transporter (xylFGhi) (see Figure 2 ) and subjecting said bacterial strain to an adaptive evolution process in mineral medium (AM2) with 12% xylose.
  • AM2 adaptive evolution process in mineral medium
  • the new strain named in the present invention was obtained as JU15 (deposited in ARS Patent Culture Collection (NRRL), of the United States Department of Agriculture, with access number NRRL B-50140) and through a second process of adaptive evolution using this time a medium containing xylose and acetate, to avoid the inhibition of growth by acetate, a derived strain named in the present invention JU15A was obtained (see diagram of its metabolism in Figure 3) (deposited in ARS Patent Culture Collection (NRRL), of the United States Department of Agriculture, with accession number NRRL B-50137), which unlike the predecessor strains, it is capable of growing even in culture media with high concentrations of acetate , even greater than 15 g / L, the concentration of acetate that the vegetable hydrolysates present, because usually the acetate is released when the hemicellulose is hydrolyzed, since it is at cetilated
  • both strains, JU 15 and JU15A were inactivated in the gene coding for the homologous lactate dehydrogenase of E. coli (IdhA), to disable the production of D-Lactate, and the coding gene (s) necessary for the synthesis of other metabolites of industrial interest were inserted, for example, L-Lactate and ethanol were used in the present invention.
  • IdhA homologous lactate dehydrogenase of E. coli
  • the coding gene (s) necessary for the synthesis of other metabolites of industrial interest were inserted, for example, L-Lactate and ethanol were used in the present invention.
  • the gene encoding the lactate dehydrogenase of B the gene encoding the lactate dehydrogenase of B.
  • the present invention also refers to the methods for producing D-Lactate, L-Lactate or even ethanol, from xylose as the main source of carbon, by different fermentation processes with the strains of the present invention.
  • the present invention provides new strains of Escherichia coli genetically modified for the versatile, efficient and preferential production of metabolites from a versatile consumption of a variety of low-cost carbon sources. It also provides methods for the production of said metabolites from such carbon sources by fermentation by said new strains.
  • a strain derived (see materials and methods) of the E. coli strain MG 1655 that was previously sequenced was used as the parental strain.
  • coli was obtained, here named as JU01, (E. coli MG1655 ApflB AadhE Afrd AxylFGH.) That is for the first time, by using If the transporter of the symmetric type (xylose / H + ) was able to increase the yield of ATP per mole of metabolized xylose, notably improving the ability of the strains to grow in xylose as the sole (or main) source of carbon, this through inactivation of the genes xylF, xylG and xylH (for details see Example 5), however this strain took a long time to consume the xylose present.
  • JU01 E. coli MG1655 ApflB AadhE Afrd AxylFGH.
  • strain JU 15 had a delayed growth phase (lag phase) inconveniently prolonged by 12 hours, so that the inventors of this invention decided to improve the strain again.
  • JU15A Japanese lag phase
  • the inventors of the present invention decided to genetically modify the strain JU15, by means of the inactivation of the gene that codes for the lactate dehydrogenase of E. coli and the introduction of the gene that codes for the lactate dehydrogenase of B.
  • strain LL2 L-lactate producing strain
  • LL26 E. coli JU15, :: ldh Bs , for details see Example 14.
  • the inventors of the present invention obtained a E. coli mutant strain derived from strain JU15A, with the interruption of the Idha gene and the integration of the pdc and adhB genes of Z. mobilis, in the strain derived from JU15A, under the pflB promoter, in addition to an adaptive evolution process.
  • the mutant strain finally obtained was named in the present invention as strain MS04, (E.
  • the strains of the present invention can be inactivated by the ⁇ dhA gene and integrated with the gene (s) necessary for the production of some other metabolite.
  • they can be inactivated pyruvate consumption pathways and have a strain thereof or they can be forced to use homologous routes of succinate production, 1, 2 propanediol or malate as the only way of regeneration of power reducer, heterologous pathways such as that of 1.3 propanediol can also be integrated to regenerate the reducing power, or even use L-alanine as an amino acid that also allows the regeneration of reducing power etc.
  • the selection of the starting strain will depend on several criteria, including the source of carbon on which it is desired to ferment and the possible presence of acetate in the culture medium.
  • the source of carbon on which it is desired to ferment it is possible to start from strain CL3, however, in xylose-abundant media, it can be started from JU15, and if the medium is expected to contain acetate, it can be started from JU15A, while if it is fermented from lactose, any of them can be used.
  • microorganisms and plasmids used in the present invention are presented in Tables 1 and 2, in addition to the Annex of SEQUENCE LISTING.
  • JU15A derived from acetate tolerant JU15
  • cane bagasse acquired from the Emiliano Zapata sugar mill of the municipality of Zacatepec, Morelos, Mexico was used as an example.
  • the hydrolysis process for obtaining fermentable sugars was carried out with sulfuric acid at different concentrations, temperature conditions, liquid: solid and time ratio, as shown in the following section. Some hydrolysis tests were carried out in a steam autoclave and the majority at the pilot plant level in a plated reactor.
  • the obtaining of hemicellulosic hydrolysates from cane bagasse was carried out in several stages: a) homogenized cane bagasse; b) mixed sulfuric acid diluted with cane bagasse with different liquid ratios: solid; C) acid-diluted hydrolysis at selected temperature, concentration and time; d) obtaining hemicellulosic hydrolysates from bagasse; e) neutralization and detoxification of the hydrolyzate by the addition of Ca (OH) 2 (30.5 g of Ca (OH) 2 / L hydrolyzate) based on the milliequivalents necessary to raise the pH -10-11 at room temperature; and f) concentration of the hydrolyzate.
  • Ca (OH) 2 30.5 g of Ca (OH) 2 / L hydrolyzate
  • batches 4-8 were selected to be mixed, detoxified with Ca (OH) 2 at room temperature and concentrated in a Büchi 185 Ex. Rotary evaporator, in order to increase the concentration of sugars from -29 g / L to 70 g / L.
  • the greatest amount of waste was removed in a MiniSharples CL-M tubular centrifuge.
  • the detoxified hydrolysates were stored in a cold room (4 0 C), before starting a test they were sterilized by filtration (0.2 ⁇ m).
  • the E. coli JU15 strain was handled in some cases, which was obtained from E. coli JU01 derived from the MG1655 strain, the latter was obtained from the laboratory strain of the inventors of the present invention. It has interrupted the production routes of ethanol, acetate-format, succinate and the ATP-dependent xylose transport system. The inventors of the present invention assume that it uses the simporter path to transport the xylose. Its genotype is E. coli ⁇ adhE ApflB ⁇ frd ⁇ xylFGH. In cases where there was acetate in the culture medium, a strain derived from E. coli JU15, Ia JU15A, was used.
  • the JU15A strain was obtained from two passes of E. coli JU 15 in AM2 medium containing xylose and acetate as a carbon source. Cell banks were generated separately with strains JU15 and JU15A to carry out the experiments. From cells growing in exponential phase, strains JU 15 and JU15A were frozen in one mL of culture and one mL of 80% glycerol in 2 mL cryovials, making use of dry ice to achieve a very fast freezing after mixing the culture with glycerol. Later it stored at -70 0 C in a deep freezer, with Ia order to have an inoculum under the same conditions along the length of the study.
  • the inoculum corresponding to strain JU15A is carried out under the same conditions as for strain JU 15, with the only difference in the medium of culture: 200 ml_ of mineral medium (AM2), containing 20 g / L xylose and 1.48 g / L acetate.
  • AM2 mineral medium
  • the composition of the AM2 medium (Mart ⁇ nez et. Al., 2007) for cultivation in fleakers (mini-fermenters) was: 2.63 g / L (NhU) 2 HPO 4 , 0.87 g / L NH 4 H 2 PO 4 , 1.0 ml_ / L MgSO 4 7H 2 O (1 M), 1.5 mL / L trace elements, 1.0 mL / L KCI (2M), 1.0 mL / L Betaine HCI (1 M), 100 mg / L citric acid.
  • the medium was supplemented with different concentrations of xylose, glucose, arabinose and / or sodium acetate.
  • the trace elements contain (in g / L): 1.6 of FeCI 3 , 0.2 of CoCI 2 6H 2 O, 0.1 of CuCI 2 , 0.2 of ZnCI 2 4H 2 O, 0.2 of Na 2 MoO 4 , 0.05 of H 3 BO 3 and 0.33 of MnCI 2 .4H 2 O 2 .
  • KCI Media for the A-F cultures were supplemented with: 50 g / L xylose, 6.7 g / L glucose, 3.3 g / L arabinose and 1.48 g / L sodium acetate.
  • the system of fleakers used in the present work consists of the following elements: a) 6 mini-fermenters (300 mL) with magnetic stirrer; b) temperature control, integrated by a thermal cycler and water bath; c) pH control, consisting of six automatic controllers with valves for the release of the base and six pH electrodes; and d) stir control, composed of a magnetic plate (100 - 850 rpm).
  • Anaerobic cultures at a higher workload were carried out in a pilot fermenter (Microferm, New Brunswick, New Jersey, USA) of 10L.
  • the controlled conditions of pH, temperature and stirring speed were maintained at the values of 6.6-7.0, 37 0 C and 240 rpm respectively.
  • the pH was controlled with the addition of 4N KOH base and the temperature was maintained with a internal coil A marine propeller type impeller was used to maintain agitation.
  • the optical density was measured at 600 nm (OD 6 oo) on a Beckman spectrophotometer (DU-70) (Beckman instrument, Inc. Fullerton, CA, USA) and converted to dry cell weight (DCW: dry cellular weigth, by its acronym in English), according to a calibration curve: 1 unit of DO ⁇ oo equals 0.37 gocw / l. All samples were centrifuged (5,000 rpm at room temperature); The cell packet was discarded and the supernatant froze for further analysis.
  • CFU colony forming units
  • the basic consumption, by the pH control, in a culture to obtain a growth kinetics gives an approximate data of the amount of organic acids (lactic acid) present in the culture medium.
  • concentration of organic acids CA
  • concentration of the base C B
  • base volume consumed V B A
  • initial volume of work in the mini-fermenter V ⁇
  • Equation 1 c (Q XO Equation 1
  • the parameters evaluated were: specific growth rate ( ⁇ ); biomass / substrate yield (Yx / s); product / substrate yield (Yp / s); product / biomass yield (Yp / ⁇ ); volumetric productivity of the desired product (P); specific speed of substrate consumption (qs); specific rate of formation of lactic product (q P ), which were determined during the exponential growth phase of the different bacterial strains generated in the present invention.
  • ⁇ specific growth rate
  • Yx / s biomass / substrate yield
  • Yp / s product / substrate yield
  • Yp / ⁇ volumetric productivity of the desired product
  • qs specific speed of substrate consumption
  • q P specific rate of formation of lactic product
  • Vi is the initial volume of work in ml_
  • V BA is the base volume added to control the pH in ml_ EXAMPLES
  • Plasmid and oligo microorganisms used in the present invention are presented in the MATERIALS AND METHODS section or in the annex to THE LIST OF SEQUENCES.
  • Example 1 Interruption of the pf ⁇ B gene.
  • the pflB gene of the E. coli strain MG1655 was interrupted using the plasmid PKO3-p / 7 ⁇ (Lara et al., 2006). The interruption of pflB was verified by PCR ( Figure 4) using as a control the progenitor strain and another ⁇ pflB mutant of E. coli W3110.
  • the expected PCR product in the mutants corresponds to a product of 1.7 Kpb, or 4.5 Kpb in the false positives, which is the size corresponding to the amplification of the intact gene. From analysis in several gels, 7 mutants were selected. From these strains, cultures were carried out in static tubes in AM2-10 g / L glucose and 37 0 C medium to verify fermentation products at 24 h ( Figures 5 and 6).
  • the PCR product with the homology regions to said gene was obtained using the oligos AdhForw (SEQ. ID NO: 1) and AdhRev (SEQ. ID NO: 2) and the plasmid was used pKD4 as temperate (Datsenko and Wanner 2000). Said product was electroporated in arabinose induced cells and carrying the helper plasmid (pKD46). Several kanamycin-resistant colonies were obtained and analyzed by PCR with the adhck forward (SEQ. ID NO: 3) and reverse (SEQ.
  • the PCR product with the homology regions to said gene was obtained using the old frd Forw (SEQ. ID NO: 5) and frd Rev (SEQ. ID NO: 6) and it was used the plasmid pKD4 as temperate (Datzenko and Wanner 2001). Said product was electroporated in arabinose induced cells and carrying the helper plasmid (pKD46). Several kanamycin-resistant colonies were obtained and analyzed by PCR with the frdck forward (SEQ. ID NO: 7) and reverse (SEQ.
  • oligos which amplify a 1.9 Kpb product, corresponding to 50 bp regions downstream and upstream, plus the frd gene (1.8 Kpb), when the interruption has been carried out, a 1.6 Kpb product corresponding to the kanamycin resistance cassette and adjacent regions already mentioned is obtained.
  • strain CL3 E. coli MG1655 ApflB AadhE Afrd
  • AM2 medium which has a low salt content and is optimized for anaerobic growth of E. coli (Mart ⁇ nez et al., 2007), with 40 g / L of xylose or glucose.
  • the specific growth rate and the production of lactate, ethanol, acetate, format and succinate were measured.
  • the strain CL1, from which the strain CL3 comes from, was characterized in a mineral medium with xylose or glucose at a concentration of 40 g / L.
  • the strain CL3 in the AM2 medium has a growth rate similar to that found for CL1 in the mineral medium with xylose or glucose, but an increase in biomass production of 38% and 14% in xylose was obtained. and glucose respectively.
  • strains CL1 and CL3 have the ability to grow at 0.22 h "1.
  • the inventors of the present invention inactivated the ATP-dependent xylose transport system (xylF, xylG, xylH genes) using the chromosomal gene inactivation technique per PCR product (Datsenko and Wanner, 2000).
  • the inventors obtained a 1.6 Kpbs PCR product using oligos XyI frw (SEQ. ID NO: 9) and XyI Rev (SEQ. ID NO: 10) and plasmid pKD4 as tempered corresponding to the kanamycin cassette with homology regions a the genes to be inactivated, the xylckFor oligos (SEQ. ID NO: 11) and xylck rev (SEQ. ID NO: 12) were designed to amplify the regions adjacent to the xylFGH genes which have a size of 3.7 kpbs in the wild strain and 1.6 in the case of the inactivated strain (Figure 10).
  • strain JU01 decided to subject strain JU01 to an adaptive evolution process in AM2 medium with 40 g / L of xylose (as the only carbon source), 9 transfers were made and in these It was not possible to significantly increase the growth rate or the production of organic acids evaluated by means of the base consumption used to control the pH. It was decided to use a concentration of 120 g / L of xylose, to increase the selection pressure and thus obtain mutants with better ability to grow in xylose, 6 transfers were made and in the present invention the growth and production capacities were improved of organic acids of strain JU01 ( Figure 12), obtaining a new strain of E. coli named in the present invention as JU15. Comparison of kinetic parameters at different pH values.
  • the new strain JIM 5 was also characterized in a simulated plant tissue hydrolyzate, numbering it as 1 (simulated hydrolyzate 1), for this purpose they used AM2 mineral medium with the addition of other main components in the following concentrations: xylose 50 g / L, glucose 6.7 g / L, arabinose 3.3 g / L and acetic acid 1.1 g / L, to have a total sugar concentration of 60 g / L, starting at a pH of 6.6 and changing to pH 7.0, when starting The fermentation. In this culture medium, it was observed that the strain had a delayed growth phase of 12 hours due to the presence of acetic acid, causing a possible effect of inhibiting the growth of strain JU15 ( Figure 14).
  • the inventors of the present invention determined that in the fermentation with the new strain JU15A there was a total consumption of carbon sources (xylose, glucose and arabinose), lactate production with a yield of 100% of theory, not There was acetate consumption but if production after 24 hours, there was no ethanol formation or format and trace concentrations were detected in the case of fumarate.
  • acetic acid is used as an antimicrobial agent in the food industry, as it is known as an inhibitor for both bacteria and yeasts.
  • the way in which it inhibits growth is due to the fact that it has the ability to cross the membrane freely, acidifying the cytoplasm, collapsing the transmembrane pH gradient and destroying homeostasis with respect to intracellular pH.
  • the inventors of the present invention evaluated the new E. coli strain JU15A in a second control culture (simulated hydrolyzate 2) with the same conditions of pH, temperature and rpm, but changing the concentrations of the components present in the AM2 medium , that is, a quarter of the amount of salts of (NH 4 ) 2 HPO 4 and NH 4 H 2 PO 4 were reduced; without adding KCI, MgSO 4 7H 2 O or trace elements, and keeping the concentration of betaine and citric acid constant, as well as the concentration of the carbon source (xylose, glucose and arabinose), in addition to acetate.
  • Table 8 and Figures 18 and 19 summarize the results obtained in this fermentation process. Table 8.
  • the qs has a greater value (1.7 times in exponential phase) for the control 2 culture, which demonstrates, together with the value of the ⁇ , that in At the beginning, growth is good and fast, but then the lack of essential nutritional elements causes an insufficiency to maintain growth, so JU1 5A is limited in this type of culture medium.
  • Example 8 Characterization of E. coli JU15A in cultures with hydrolysates (A-F) in a system of mini-fermenters (fleakers).
  • the inventors of the present invention also carried out experiments to examine the contribution of supplementing nutrients to the culture medium both in productivity and in lactate yield.
  • the inorganic salts of the AM2 medium were selected and the concentrations were varied to supplement the hemicellulosic hydrolysates of plant tissues obtained, such as cane bagasse, and select the most suitable culture medium to subsequently carry out the scaling of the fermentation process to a 10 L scale of operating volume. Therefore, when using the hydrolysates, the concentrations of both sugars (xylose, glucose and arabinose) and acetic acid are summarized in Table 5.
  • the main results obtained from fermentation with hydrolysates of plant tissues, such as cane bagasse are shown in Table 9 and Figures 20, 21 and 22 show the behavior of JU15A in AF cultures.
  • a nitrogen source salts ( NH 4 ) 2 HPO 4 and NH 4 H 2 PO 4
  • the inventors carried out the characterization of the new strain of Escherichia coli JU15A in the hemicellulosic hydrolysates of plant tissues, such as cane bagasse, added with betaine, citric acid and phosphate salts, in a pilot regulator of 10 L. of operation as the temperature and pH were the same as those used in the mini-fermenters and the stirring was empirically estimated to achieve a homogeneous mixing of the hydrolyzate in the bi-reactor (240 revolutions / min).
  • the data obtained from the fermentation process are shown in Table 10 and Figure 23. These results showed rapid growth, being reflected in a value of ⁇ of 0.28 h "1. On the other hand, a yield greater than the theoretical maximum was obtained.
  • strain JU 15 In the present invention, the ability of strain JU 15 to use lactose as a carbon source in AM2 mineral medium with 4% lactose was evaluated to produce Lactate, the following being found: a) JIM strain 5 consumes lactose with The same speed as its parent JU01 (See Figure 24); and b) is capable of converting lactose to D-lactate with yields greater than 95% and productivity of about 1 g / L.h. The data obtained from the fermentation process in the present invention are shown in Figures 24 and 25.
  • Example 11 Milk Serum Fermentation
  • this plasmid was constructed with the purpose of being used as a temper for the PCR with which the chromosome integration was carried out.
  • plasmid pTrdctE Vázquez-Limón et al., 2007
  • the inventors constructed plasmid pLDH Ss C, by cloning a PCR fragment containing the gene that confers chloramphenicol resistance (Cm r ) flanked by FRT sites , which facilitated recombination on the chromosome.
  • This fragment was obtained from plasmid pKD3 (Datsenko and Wanner 2000).
  • the Cm r gene was downstream of the B. subtilis lactate dehydrogenase gene (ldh Bs ) (see Figure 27).
  • the inventors of the present invention required designing a pair of oligos with homology regions at the initial and final ends of the Idh gene of E.coli in order to integrate the ldh Bs gene into the JU 15 strains.
  • the integration of the ldh Bs gene into the chromosome of JU 15 Ia made by modification of the strategy of Datsenko and Wanner 2000.
  • the inventors designed a pair of oligos to amplify by PCR a DNA fragment containing the gene of ldh Bs and the chloramphenicol resistance cassette flanked by the sites FRT using the plasmid pLDH Ss C. as tempered.
  • EcLDHBsIntFw SEQ. ID NO: 13
  • EcLDHBsIntRv SEQ. ID NO: 14
  • the specific oligos EcLDHBsIntFw SEQ. ID NO: 13
  • EcLDHBsIntRv SEQ. ID NO: 14
  • H1 and H2 the regions adjacent to the gene to be inactivated
  • pKD3 temperate plasmid
  • Figure 28 shows a gel with the analysis of the colonies previously described, in lane 1 the molecular weight marker is shown, lanes 5 and 6 correspond to strain LL1 (JU15 AldhA :: ⁇ dh Bs Cm). A PCR product that coincides with the expected molecular weight (2663 bp) was amplified when it was integrated into the heterologous gene.
  • the inventors transformed strain LL1 with plasmid pCP20, which contains FLP recombinase, which recognizes FRT sites, which in this case flank the gene responsible for conferring chloramphenicol resistance. They carried out a simple recombination in which the cat gene was cleaved leaving a single FRT site on the chromosome.
  • oligo 1189 Fwd SEQ. ID NO: 15
  • Oligo 1190 Rvs SEQ. ID NO: 16
  • the inventors obtained a product close to 1093 bp, which corresponded to the adjacent sites of the gene and the FRT sequences for recognition of FLP recombinase. In this way they obtained the strain that in the present invention was named as LL2 (E. coli MG 1655, ⁇ pflB, AadhE, AfrdA, ⁇ xylFGH, IdhBs, knri) (LL2 is lacking in Cm r ).
  • strain LL2 (2) and LL2 (3) had a lag phase of 12 and 24 h respectively, so they decided to submit them to the adaptive evolution process.
  • Example 14 Adaptive evolution of strain LL2 in xylose 40 g / L
  • the adaptive evolution consisted of transferring the crop when it was in the exponential phase, from a mini-fermenter to another mini-fermentor.
  • fermenter with 40 g / L of the carbon source (xylose), which was inoculated at an optical density of 0.01 (0.0037 gocw / L).
  • the strain finally obtained Ia was named LL26, whose correlation of optical density and base consumption proved to be the highest and the shortest, respectively.
  • Previously in this invention it was described how the adaptive evolution of strain JU15 was performed, which ferments the xylose obtaining yields of 95% conversion to D-Lactate, results mentioned above.
  • strain LL26 converts all the carbon source into L-Lactate with a yield close to the theoretical one (> 95%) and with a volumetric productivity of 1.17 g / L * h
  • volumetric productivity was reduced to 0.68 g / Lh (see Figures 38 and 39).
  • Example 15 Construction of an ethanologenic strain derived from JU15A
  • the inventors used the method described by Datsenko and Wanner (2000), which uses the phage Red ⁇ recombination system to inactivate genes on the E. coli chromosome by Homologous recombination using linear PCR products.
  • the interruption protocol of the IdhA gene of the E. coli strain JU15A (E. coli MG 1655 ⁇ pflB, ⁇ adhE, ⁇ frd, ⁇ xilFGH :: Km R , tolerant to acetic) by this method is described below.
  • oligos 716FWF SEQ. ID NO: 17
  • 717RVF SEQ. ID NO: 18
  • the PCR product was transformed by electroporation at 2,500 V to the E. coli strain JU15A (pKD46).
  • the cells, 100 ⁇ l_ were seeded in boxes with LB medium and Cm 30 ( ⁇ g / mL) to recover recombinant strains that would have replaced the IdhA gene with the Cm gene flanked by the PS1 and PS2 sites.
  • the recovered strains with resistance to Cm 30 were then analyzed by PCR to verify the interruption of the IdhA gene.
  • E. coli MS01 with the genotype ( ⁇ pflB, ⁇ adhE, ⁇ frd, ⁇ xilFGH :: Km R , ⁇ ldhA) and is unable to grow under anaerobic conditions in mineral medium and with glucose as the only carbon source.
  • the integration of the pdc and adhB genes of Z. mobilis was planned to be under the pfIB promoter that is strongly expressed in anaerobic conditions in E. coli and thus have a good level of transcripts of these genes for the production of ethanol in anaerobiosis. .
  • the strain MS01 ( ⁇ pflB, ⁇ adhE, ⁇ frd, ⁇ xilFGH :: Km R , ⁇ ldhA, acetate tolerant) has the pfIB gene interrupted by what oligos were designed with homology several bp before and after the pfIB gene to amplify and sequence the region of the pfIB gene and know if the sequences of its promoters were intact.
  • the oligos used to generate the PCR of this region are oligos 4166 (SEQ ID NO: 21) and 4167 (SEQ ID NO: 22).
  • coli strain MS01 were made chemocompetent, transformed with the plasmid pKD46, were isolated and selected for ampicillin resistance (Amp 100) and then cultured in SOB medium with arabinose (1 mM) to induce the Red recombination system and, made electrocompetent, were electroporated with a PCR product containing both genes (pdc and adhB) in tandem flanked by regions of homology to the pflB gene.
  • the oligos designed to amplify this PCR product were 4512 FWF (SEQ ID NO: 23) and 4513 RVF (SEQ ID NO: 24).
  • the PCR product was transformed by electroporation in strain MS01 (pKD46) and immediately afterwards the cells were recovered in SOC medium (1 ml_) for 12 h at 30 and 37 0 C, since previously when the cells were recovered at 37 0 C by 2 hours no colonies were obtained, so they were allowed to incubate for longer at these two temperatures without agitation under anaerobic conditions, so that only the cells that had integrated the pdc and adhB genes were selected and could grow.
  • E. coli MS02 ( ⁇ pflB, ⁇ adhE, ⁇ frd, ⁇ xilFGH :: Km R , ⁇ ldhA, PpflB :: pdc Zm -adhB Zm , acetic tolerant) which produces ethanol compared to strain MS01.
  • E. coli MS02 ⁇ pflB, ⁇ adhE, ⁇ frd, ⁇ xilFGH :: Km R , ⁇ ldhA, PpflB :: pdc Zm -adhB Zm , acetic tolerant
  • E. coli MS04 Ia which can grow in glucose and xylose, in the presence of acetic acid, producing ethanol (See Figure 36 and 37).
  • Example 15 Production of ethanol from fast-growing grass hydrolysates using E. coli strain MS04 derived from JU15
  • the inventors of the present invention carried out the production of ethanol using the E. coli strain MS04 (NRRL B-50138) derived from Escherichia coli JU 15 (NRRL B-50140) using sugars derived from the thermochemical hydrolysis of the growth grass fast "gramalote" (Paspalum fasciculat ⁇ m).
  • the gramalote develops naturally in several regions of southeastern Mexico and has not been previously reported for ethanol production.
  • Other fast-growing grasses such as "elephant" grass or "switchgrass” have been proposed, in the United States of America and in several countries of the European Union, as raw material to hydrolyze them and generate sugars that can be fermented to ethanol.
  • Latin America there have been no experiences to use fast-growing grasses in the production of second generation ethanol.
  • the gramalote collected from the Tabasco region, was dried in the sun.
  • the material was characterized and contains 15-25% xylan, 30-40% glucan, 2 to 3% arabinano, 2.5-3.5% acetate, 12 to 16% lignin, 1 to 3% ashes and the rest of extractive material.
  • the hemicellulosic fraction of the gramalote was hydrolyzed by a thermochemical method at 121 0 C, using sulfuric acid with different concentrations (1, 2 and 4% w / w), times (10, 30 and 60 min.) And reaction conditions (3 ratios of biomass to liquid, 1: 2, 1: 5 and 1: 10).
  • a syrup was generated to perform fermentability tests using E.
  • coli strain MS04 (NRRL B-50138) derived from JU15 (NRRL B-50140).
  • the syrup used contained on average a total of 28.8 g / L of sugars, mainly xylose (in g / L: 5.5 of glucose, 19.6 of xylose and 3.7 of arabinose), 6.2 g / of acetate and a small amount of furans.
  • the syrup was treated with calcium hydroxide, neutralized and added with salts to ferment the sugars present in it.
  • the cultures were carried out in minifermentadores with an operating volume of 200 mL, at a temperature of 37 0 C and pH of 7 controlled by the automatic addition of 2N KOH.
  • Figure 42 shows the results of ethanol production that in this example the yield of conversion of sugars into ethanol was 95% of theory, converting practically all sugars into ethanol in 36 hours.
  • Example 16 Production of ethanol from agave bagasse hydrolysates using E. coli strain MS04 derived from JU15
  • the inventors of the present invention carried out the production of ethanol using the E. coli strain MS04 (NRRL B-50138) derived from Escherichia coli JU15 (NRRL B-50140) using sugars derived from the thermochemical hydrolysis of the agave bagasse obtained of blue agave distillate production plants.
  • Agave bagasse is a waste of the tequila, mezcal and other distilled beverages factories in various regions of Mexico and now in other countries in Latin America and Africa. This material is essentially lignocellulose that does not have a practical application in distillate factories since which cannot be used as fuel and potentially constitutes an alternate source in obtaining sugars of five and six carbons, to be fermented by the microorganisms object of the invention of this patent.
  • the blue agave bagasse collected from the region of an agave distillate factory in the southern region of the State of Morelos, Mexico, was sun dried. The material was characterized and contains 12-18% xylan, 35-45% glucan, 3-5% acetate, 22-30% lignin, 2.5-5.5% ash and the rest of extractive material.
  • the hemicellulosic fraction of agave bagasse was hydrolyzed by a thermochemical method, using sulfuric acid with different concentrations, and reaction conditions.
  • the syrup was treated with calcium hydroxide, neutralized and added with salts to ferment the sugars present in it.
  • a syrup rich in xylose was generated, which also contained glucose and arabinose, which was concentrated to obtain 51 g / L of total sugars, with 87.5% xylose, 8.8% glucose and 3.7% arabinose. It also contained 0.2 g / L of hydroxymethyl-furfural, 0.2 g / L of furfural and 20.3 g / L of acetate.
  • the syrup was fermented, in a bioreactor with an operating volume of 1 Liter, at a temperature of 37 0 C, stirring it with conventional impellers at 360 revolutions per minute and at a pH of 7, controlled by the automatic addition of KOH 2N, using The E. coli strain MS04 (NRRL B-50138) derived from JU15 (NRRL B-50140). The results obtained in this last example of the present invention indicate that the efficiency of conversion of sugars into ethanol was 85% of theory at 61 hours of fermentation, see Figure 43.
  • Escher ⁇ chia coli catabolite repression mutants engineered for production of L-lactic acid J. Ind. Microbe /. Biotechnol 29: 221-227.
  • Escherichia coli strain is influenced by NAD + regeneration. Biotechnol Lett. 29:
  • Escherichia coli D (-) - Lactate Dehydrogenase gene (IdhA) whit the L - (+) - Lactate
  • IdhL Dehydrogenase gene

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Abstract

La presente invención se refiere a nuevas cepas de Escherichia coli denominadas JU15, JU15A, LL26, MS04 y derivadas que producen metabolitos de forma preferencial, particularmente D-lactato, L-lactato e inclusive etanol, con un alto rendimiento y alta selectividad a partir de una variedad de fuentes de carbono como: medios de cultivo abundantes en xilosa (como fuente de carbono principal), particularmente medios formulados con hidrolizados de fibras vegetales, como el bagazo de caña, agave y pastos, además de una amplia variedad de residuos agroindus tríales, como el suero de leche o desechos forestales, celulosa, pastos, arbustos y en general cualquier material derivado de lignocelulosa. Dichas cepas tienen inactivados los genes de la piruvato formato liasa (pflB), la alcohol deshidrogenasa (adhE), la fumarato reductasa (frdA) y los genes que codifican para el sistema de transporte de xilosa dependiente de ATP (xylFGH). Además, pueden tener inactivado de manera adicional el gen de la lactato deshidrogenasa (IdhA) e insertado un gen codificante para la síntesis de otro producto químico. Estas cepas usan la producción del metabolito de interés (particularmente D-lactato, L-lactato o etanol) como única vía de regeneración del poder reductor del microorganismo. También se refiere a los métodos fermentativos para producir dichos metabolitos a partir de medios con fuentes de carbono diversas, incluyendo glucosa, lactosa o xilosa.

Description

CEPAS DE ESCHERICHIA COU MODIFICADAS POR INGENIERÍA METABÓLICA PARA LA PRODUCCIÓN DE COMPUESTOS QUÍMICOS A PARTIR DE LIGNOCELULOSA HIDROLIZADA, PENTOSAS, HEXOSAS U
OTRAS FUENTES DE CARBONO
CAMPO TÉCNICO
La presente invención se refiere a nuevas cepas de Escherichia coli denominadas JU15, JU15A, LL26, MS04, depositadas en el Agricultural Research Service (ARS) Patent Culture Collection (NRRL), del Departamento de Agricultura de los Estados Unidos, con los números de acceso NRRL B-50140, NRRL B-50137, NRRL B-50139 y NRRL B-50138, y derivadas que producen metabolitos, particularmente D-Lactato, L-Lactato e inclusive etanol, con un alto rendimiento y alta selectividad a partir de una amplia variedad de fuentes de carbono. Particularmente medios formulados con hidrolizados de fibras vegetales, como el bagazo de caña, agave y pastos, además de una amplia variedad de residuos agroindustriales, como el suero de leche o desechos forestales, celulosa, pastos, bagazo de agave, papel de desecho, viruta y aserrín, arbustos y en general cualquier material derivado de lignocelulosa, así como glicerol proveniente de Ia industria del biodiesel y de azúcares derivados del almidón y de Ia sacarosa. Los cuales mediante el uso de las cepas de E. coli, antes referidas, se usan en Ia producción del metabolito de interés (particularmente D-lactato, L- lactato o etanol) como única vía de regeneración del poder reductor del microorganismo. También se refiere a los métodos fermentativos para producir dichos metabolitos a partir de medios con fuentes de carbono diversas, incluyendo glucosa, lactosa o xilosa.
Antecedentes de Ia invención
En años recientes el empleo de Ia tecnología del ADN recombinante y el análisis sistemático de datos biológicos han aumentado considerablemente, dando lugar a Ia Ingeniería de Vías Metabólicas (IVM), Ia cual se define como Ia modificación y/o introducción de nuevas reacciones bioquímicas para el mejoramiento directo de propiedades celulares mediante tecnología de ADN recombinante (Stephanopoulos, 1999; Bailey, 1991). Particularmente, se ha iniciado el desarrollo de nuevas cepas, mediante IVM, con Ia propiedad de crecer en medios minerales y producir principalmente un solo metabolito microbiano como por ejemplo un solo isómero de lactato (Bai et al. 2003; Dien et al., 2002; Zhou et al 2003a y 2003b; Zhu y Shimizu 2004; Zhou et al., 2006a; Zhou et al 2006b; Zhou er a/., 2005).
El ácido láctico.
En Ia industria química, particularmente en fabricación de materias primas para producción de plásticos de origen biológico, Ia producción biotecnológica de ácido láctico ha recibido gran interés recientemente, pues ofrece una alternativa sustentable para su uso en Ia manufactura de plásticos biodegradables de alta calidad, conocidos por el nombre genérico de polilactatos (PLA): por ejemplo el polilactato y el etil-lactato (Dien et al., 2002; Skory, 2003). La síntesis de PLA biodegradable requiere de Ia producción por separado de los isómeros D y L del lactato, además las propiedades físicas y de biodegradación del PLA dependen de Ia proporción usada en Ia fabricación del polímero de las formas D y L.
El lactato puede ser producido ya sea por fermentación microbiana o por síntesis química (Narayanan et al., 2004). El proceso químico más utilizado es Ia hidrólisis de lactonitrilo por ácidos fuertes; sin embargo existen otras rutas químicas (John et al., 2007) tales como: oxidación de propilenglicol; reacción del acetaldehído; monóxido de carbono y agua a elevadas temperaturas e hidrólisis del ácido cloro- propiónico, entre otras. Todas estas rutas tienen como producto final una mezcla de los isómeros D y L y dependen de materias primas derivadas del petróleo, Io que Ie resta sustentabilidad a estos procesos de producción. Por otro lado, Ia producción biotecnológica del ácido láctico tiene varias ventajas sobre Ia síntesis química: 1) bajo costo de sustratos; 2) baja temperatura de producción; 3) bajo consumo de energía; y 4) especificidad por el estereoisómero deseado. El lactato es producido por un proceso de fermentación microbiana de medios de cultivo con una fuente de carbón de fácil asimilación, como Io es Ia glucosa.
El etanol
Probablemente uno de los retos más difíciles de Ia presente búsqueda de sustitutos de combustibles derivados del petróleo son los carburantes líquidos alternos. La producción de etanol a partir de Ia biomasa es una de las pocas opciones que es viable actualmente (Mielenz, 2001 ; Martínez et al., 2006). Existen tecnologías que están en proceso de maduración; se pueden utilizar una gran variedad de materias primas; y el etanol producido es un compuesto valioso y versátil, ya que puede ser utilizado como oxigenante, carburante, solvente o ser transformado, mediante tecnologías ya establecidas, en otros combustibles (p. ej. biodiesel) (Bungay, 2004).
El etanol puede ser usado para una gran variedad de aplicaciones, Ia principal aplicación discutida en este documento es Ia de carburante líquido que permita oxigenar, sustituir o complementar a los combustibles fósiles que actualmente se utilizan en los motores de combustión interna. Otras aplicaciones del etanol son como combustible en calderas industriales, lámparas, estufas, turbinas, etc.
Comparados en términos volumétricos, el contenido energético del etanol es de aproximadamente dos tercios de Ia energía contenida en Ia gasolina o diesel. Sin embargo, el etanol tiene un alto valor de número de octano, Io cual ocasiona que los motores que usan mezclas gasolina-etanol tengan una mejor eficiencia. Las mezclas que contienen hasta un 22% (v/v) de etanol pueden ser usadas exitosamente en los motores a gasolina actuales, esto es sin Ia necesidad de realizar modificaciones a los motores de combustión interna.
Otra alternativa de uso del etanol es Ia de oxigenante. Con el fin de mejorar Ia combustión y reducir los niveles producidos de monóxido de carbono, las gasolinas necesitan elevar su octanaje sin utilizar plomo, para ello se han venido usando alcoholes y esteres. Actualmente en México se usan los éteres de terbutilo, de los cuales el terbutil metil éter (MTBE, por sus siglas en inglés) es el más utilizado. No obstante, hoy día se sabe que estos compuestos se pueden acumular en los mantos freáticos, que son recalcitrantes a Ia degradación química o biológica, y que en concentraciones de partes por millón son cancerígenos para los humanos. En algunos estados, como el de California en los EUA se ha prohibió su uso.
Tradicionalmente, el etanol se obtiene a partir de Ia fermentación de glucosa o sacarosa, obtenidas de almidón de maíz y azúcar de caña respectivamente. Esta fermentación se lleva a cabo con organismos etanologénicos como Saccharomyces cerevisiae, que es el organismo que tradicionalmente se usa para Ia producción de etanol a partir de glucosa, proveniente de Ia hidrólisis del almidón de granos y de sacarosa, proveniente de caña de azúcar o remolacha. Este microorganismo carece de Ia habilidad para metabolizar los azúcares de cinco carbones conocidos como pentosas que se encuentran de forma abundante en hidrolizados de material vegetal (Hahn-Hagerdal et al., 1993). Otro organismo etanologénico silvestre es Zymomonas mobilis, es una bacteria Gram negativa, que tiene Ia habilidad nativa para producir etanol con buenos rendimientos, debido a sus características metabólicas, entre las que destacan dos actividades enzimáticas muy eficientes: piruvato descarboxilasa (Pdc) y alcohol deshidrogenasa (Adh), que convierten el piruvato en acetaldehído y etanol, respectivamente. Sin embargo, como también sucede con S. cerevisiae, Z. mobilis está limitada en los azúcares que puede metabolizar; únicamente puede utilizar sacarosa, glucosa y fructosa, y no utiliza a Ia xilosa ni otras pentosas, ni otros disacáridos.
Fuentes de carbono.
Glucosa
La celulosa es el mayor constituyente de Ia lignocelulosa (20-50%), es un polímero lineal compuesto de subunidades de dextrosa (D-glucosa), unidos por enlaces glucosídicos β-(1-4) y debido a su conformación estructural es altamente resistente a hidrólisis. Para aprovechar Ia celulosa es necesario hidrolizarla con celulasas, al hidrolizar Ia celulosa se obtiene glucosa, esta hexosa es fermentable por las cepas mencionadas en Ia presente invención. La glucosa también puede ser obtenida principalmente de Ia hidrólisis del almidón.
La xilosa y otros monomeros
A diferencia de Ia celulosa, Ia hemicelulosa no es químicamente homogénea, pues está compuesta de un polísacárido heterogéneo con monomeros de hexosas (glucosa, mañosa y galactosa), y pentosas (xilosa y arabinosa) y algunos ácidos (ácido acético y ácido glucurónico), Io que hace problemática su bioconversión a productos de fermentación de interés para uso industrial. Además, Ia hemicelulosa es el segundo polisacárido más común en Ia naturaleza pues representa del 20-35% de Ia biomasa lignocelulósica. La proporción de pentosas y de hexosas en Ia hemicelulosa es de 85 y 15 % respectivamente, donde la xilosa es Ia más abundante, seguido por glucosa y arabinosa (75, 15 y 10%, respectivamente) (Saha, 2003; Martínez et al., 2000). La hemicelulosa puede ser convertida a azúcares monoméricos mediante hidrólisis a temperaturas por debajo de los 2000C, empleando bajas concentraciones de ácido, entre otros métodos, ya que existen diversos métodos de hidrólisis: físicos, físico-químicos, químicos y/o biológicos (Sun et al., 2002).
De Io anterior se puede concluir que después de Ia glucosa, Ia xilosa es el monosacárido más abundante en Ia naturaleza y generalmente se encuentra polimerizado en Ia fracción hemicelulósica del tejido vegetal, sin embargo, Ia variedad de microorganismos que metabolizan tanto pentosas como hexosas es muy limitada, más aún, no existen microorganismos silvestres que puedan catabolizar eficientemente pentosas o mezclas de pentosas-hexosas, mediante procesos fermentativos a productos de interés industrial con altos rendimientos (Hernández-Montalvo et al., 2001).
Por Io tanto Ia conversión de los materiales lignocelulósicos presenta serias limitantes, debido a que están compuestos por polímeros de azúcares, principalmente glucosa-xilosa, donde Ia xilosa es una pentosa que no es fermentable por Ia mayoría de los microorganismos silvestres o modificados genéticamente y que son utilizados industrialmente como Saccharomyces cerevissiae, Corynebacterium glutamicum, algunos lactobacilos, Zymomonas mobilis o Bacillus subtillis (Dien et al., 2001). Otra desventaja para su aprovechamiento industrial, es que Ia mayoría de los microorganismos empleados para este fin, como los lactobacilos, requieren de medios de cultivos complejos, incrementando con esto los costos de producción por nutrientes, por purificación del producto, etc. Además, para el caso del ácido láctico, Ia mayoría sintetiza solamente el isómero D-láctico o una mezcla de D y L-láctico.
Lactosa
La lactosa es un disacárido compuesto por moléculas de glucosa y galactosa unidas por enlaces beta 1-4. Este disacárido se encuentra presente en Ia leche de los mamíferos y es común encontrarlo en el suero de leche como residuo agroindustrial obtenido en Ia elaboración de quesos. Escheríchia coli.
Entre los microorganismos empleados industrialmente para Ia producción de D- lactato se encuentra principalmente los del género Lactobacillus, Rhizopus y Escherichia. De éstos microorganismos, Escherichia coli tiene muchas características ventajosas como microorganismo base para desarrollar cepas y obtener productos biotecnológicos. Entre éstas están: rápido crecimiento bajo condiciones aeróbicas o anaeróbicas; se conoce su genoma completo; se dispone de metodologías para modificar su genoma; puede metabolizar tanto hexosas como pentosas, disacáridos, otra amplia variedad de azúcares y otras fuentes de carbono, usando solamente sales minerales como nutrientes. Por esta razón, las estrategias de ingeniería metabólica plantean cambios en las vías fermentativas para modificar el balance de carbono hacia el producto deseado manteniendo el balance redox y evitar Ia formación de subproductos, con el fin de mejorar Ia acumulación de un solo producto de fermentación, como ejemplo el ácido láctico (Zhu et al., 2007), obteniéndose en este caso un microorganismo homoláctico y cuando solo se produce etanol un microorganismo homoetanologénico (Zhou et al., 2008).
Por otro lado, de acuerdo a Ia red metabólica funcional de E. coli en condiciones de fermentación, por cada mol de glucosa (GIc) catabolizada hasta piruvato se obtienen dos moles de ATP, si Ia mitad del piruvato generado es convertido en ácido acético el rendimiento se incrementa a 3 molATp/molcic- En el caso de Ia xilosa (XiI) el rendimiento es 0.67 molAτp/molχM cuando E. coli cataboliza este azúcar hasta piruvato. De tal manera que las enzimas piruvato formato Nasa (PfI) y acetato cinasa (Ack) son esenciales en el crecimiento de E. coli a partir de xilosa en condiciones de fermentación, dado que Ia conversión de un mol de piruvato en acetil-CoA y a su vez en acetato genera un mol extra de ATP, aumentando el rendimiento del mismo a 1.5 molAτp/molχ¡ι. En consecuencia las cepas de E. coli W3110 interrumpidas en pflB no pueden crecer en dicha pentosa, debido a que únicamente obtienen 0.67 molAτp/molx¡ι. La insuficiencia de ATP fue confirmada inactivando el gen de Ia acetato cinasa (ack) en E. coli W3110, Ia muíante fue incapaz de crecer en medio mínimo suplementado con xilosa en condiciones anaeróbicas, confirmando Ia necesidad del ATP producido por Ia Ack (Hasona et al., 2004). Para Ia glucosa, el transporte y fosforilación se lleva a cabo por el sistema PTS con el gasto de un equivalente de ATP, en cambio para xilosa Ia célula gasta dos moléculas de ATP, una para el transporte (Transportador de alta afinidad ABC) y Ia segunda para Ia fosforilación (Lin, 1996; Linton y Higgins 1998). En arabinosa Ia internalización de Ia pentosa a Ia célula se lleva a cabo por simporte (arabinosa/H+) mediante AraE, un transportador de baja afinidad y alta capacidad, esto conserva una molécula de ATP gastada en el transporte de pentosas mediante el transportador ABC y ambas mutantes (pfl y ack) crecen en arabinosa (Hasona et al., 2004). El uso de E. coli en Ia producción de ácido láctico.
Para Ia producción de ácido láctico, E. coli contiene un gen que codifica para una enzima indispensable para Ia producción de lactato como Io es Ia lactato deshidrogenasa (IdhA), Ia cual se expresa en condiciones anaerobias (Zhou et al., 2003a), sin embargo E. coli al ser cultivada en presencia de glucosa o xilosa es heterofermentativa, produciendo también los ácidos: acético, fórmico, láctico, succínico; además del etanol, hidrógeno y bióxido de carbono (Bóck y Sawers 1996). Mediante técnicas de IVM se han modificado cepas de E. coli para Ia interrupción de las vías que compiten por Ia disponibilidad del piruvato, para convertir al microorganismo en homofermentativo y producir mayoritariamente D- lactato (Solicitud de Patente Estadounidense No US2007/0037265) a partir del piruvato, pero esas cepas fueron modificadas únicamente para utilizar solo glucosa como fuente de carbono y producir D-lactato, con altos rendimientos de conversión. Por otra parte existen reportes que detallan Ia incapacidad de las cepas de E. coli productoras de D-lactato para crecer con xilosa como principal fuente de carbono, debido al bajo rendimiento de ATP que se obtiene con este azúcar (Hasona et al., 2004).
La estrategia más empleada para Ia generación de cepas de E. coli productoras de D-lactato de alta pureza óptica consiste en Ia interrupción del gen que codifica para Ia enzima piruvato formato liasa (pflB) (Zhou et al., 2003a y 2003b; Zhu y Shimizu 2004; Zhou et al. 2006a; Zhou et al., 2006b; Zhou et al., 2005). Con esta estrategia se han obtenido rendimientos de conversión de Ia fuente de carbono en D-lactato superiores al 95% del teórico (Zhou et al., 2003a y 2003b), pero restringiendo el proceso industrial a usar solo glucosa como fuente de carbono. Otra desventaja se da, como respuesta a una baja disponibilidad de acetil-CoA (metabolito clave en Ia aportación de esqueletos de carbono a Ia biomasa), obteniéndose cepas con muy baja o nula velocidad de crecimiento en condiciones de cultivo anaeróbicas con glucosa como única fuente de carbono. Típicamente estas cepas son incapaces de crecer a menos que el medio sea suplementado con acetato (Zhou et al. ,2003a), encareciendo el medio de cultivo y/o complicando el proceso industrial.
Por otra parte E. coli tiene una ruta para producir otros compuestos de interés industrial como el etanol de manera natural, sin embargo Ia cantidad de alcohol que se produce de esta manera es muy baja: Además del producto de interés, produce una mezcla de otros productos de fermentación, entre los que se encuentran los ácidos acético, fórmico, succínico, y láctico (González et al., 2002; Dien et al., 2003; Lawford y Rousseau 1996; Lawford y Rousseau, 1997), siendo así un microorganismo heterofermentativo Mediante el uso de Ia Ingeniería de Vías Metabólicas (IVM) se ha logrado desviar el flujo de carbono hacia una vía heteróloga de producción de etanol en E. coli, obteniendo cepas, con diferente fondo genético a las reportadas en Ia presente invención, capaces de dar buenos rendimientos en Ia fermentación de básicamente glucosa o xilosa a etanol (Otha er a/., 1991).
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA FIGURAS
Figura 1. Imagen que muestra las vías interrumpidas en el diagrama del metabolismo de glucosa y xilosa en E. coli y los principales productos de fermentación, incluyendo el de ATP, en Ia cepa CL3.
Figura 2. Imagen que muestra las vías interrumpidas en el diagrama del metabolismo de glucosa y xilosa en E. coli y los principales productos de fermentación, incluyendo el ATP, en Ia cepa JU15.
Figura 3. Imagen que muestra las vías bloqueadas en el diagrama del metabolismo de glucosa y xilosa en E. coli y los principales productos de fermentación, incluyendo el ATP, en Ia cepa JU15A.
Figura. 4. Imagen que muestra un gel con los productos de PCR en colonia de posibles mutantes ΔpfIB. (los encabezados de los carriles representan el numero de colonia) (C: Control). Carriles 12, 15, 17,18 corresponden al tamaño del gene interrumpido. 13,14, y 16 corresponden al gene intacto.
Figura 5. Gráficas que muestran Ia producción de: A) Ácido Láctico y B) Ácido
Acético, en las colonias seleccionadas (12, 15, 17, 18, 25, 26,46) así como
W3110 pfl" y MG1655.
Figura 6. Gráficas que muestran Ia producción de: A) Ácido Fórmico y B) Etanol, en las colonias seleccionadas (12, 15, 17, 18, 25, 26,46) así como W3110 pfl" y
MG1655.
Figura 7. Imagen que muestra un gel con el producto de 1.9 Kpb correspondiente al gen adhE inactivado.
Figura 8. Gráficas que muestran una comparación de las cepas CL3 y CL1 en: A)
Velocidad de crecimiento y B) Cinéticas de consumo de xilosa.
Figura 9. Gráficas que muestran una comparación de las cepas CL3 y CL1 en: C)
Cinéticas de crecimiento y D) Cinéticas de producción de lactato.
Figura 10. Imagen que muestra un gel con el producto de PCR que corresponde a los genes xylFGH inactivados.
Figura 11. Gráficas que muestran cinéticas de crecimiento de las cepas JU01 y
CL3 en medio AM2 xilosa 40 g/L.
Figura 12. Gráficas que muestran cinéticas de crecimiento durante Ia evolución adaptativa de Ia cepa JU01 en AM2-xilosa 120 g/L y una gráfica de barras de Ia productividad de ácidos orgánicos a las 48 h.
Figura 13. Gráficas que muestran el efecto del pH en el crecimiento de JU 15.
Figura 14. Gráfica que muestra Ia cinética de crecimiento de E. coli JIM 5 en el hidrolizado simulado 1.
Figura 15. Gráfica que muestra Ia cinética de crecimiento de E. coli JU15 y
JU15A en el hidrolizado simulado
Figura 16. Gráfica que muestra Ia cinética de fermentación de JU15A en el hidrolizado simulado 1.
Figura 17. Gráfica que muestra las cinéticas de crecimiento y de consumo de sustrato por JU15A en el hidrolizado simulado 1.
Figura 18. Gráfica que muestra Ia cinética de fermentación de JU15A en el hidrolizado simulado 2. Figura 19. Gráfica que muestra las cinéticas de crecimiento y consumo de sustrato por JU15A en el hidrolizado simulado 2.
Figura 20. Gráficas que muestran cinéticas de: A) crecimiento y B) producción de lactato en los hidrolizados hemicelulósicos del bagazo de caña de 6 corridas independientes (A, B, C, D, E, F) por E. coli JU15A.
Figura 21. Gráficas que muestran cinéticas de: A) consumo de glucosa B) consumo de xilosa en los hidrolizados hemicelulósicos del bagazo de caña de 6 corridas independientes (A, B, C, D, E, F) por E. coli JU15A.
Figura 22. Gráficas que muestran cinéticas de: A) consumo de Arabinosa B) acumulación de acético en los hidrolizados hemicelulósicos del bagazo de caña de 6 corridas independientes (A, B, C, D, E, F) por E. coli JU15A.
Figura 23. Gráficas que muestran cinéticas de fermentación en los hidrolizados hemicelulósicos del bagazo de caña por E. coli JU15A.
Figura 24. Gráfica que muestra cinéticas de consumo de lactosa por tres cepas diferentes: MG1655, JU01 y JU15.
Figura 25. Gráfica que muestra cinéticas de producción de D-lactato a partir de lactosa por tres cepas diferentes: MG1655, JU01 y JIM 5.
Figura 26. Gráfica que muestra cinéticas de consumo de base de tres medios diferentes con suero de leche con Ia cepa JU15.
Figura 27. Imagen que muestra el plásmido pLDHfísC conteniendo el gen LDHSs, los sitios: P1 , FRT, el gen que codifica para Ia cloranfenicol acetil transferasa, y los sitios FRT y P2.
Figura 28. Imagen que muestra un gel con el producto de PCR correspondiente a
Ia integración del gen heterólogo. Carril 1 : marcadores de peso molecular; carriles 2 y 3: controles negativos; carriles 5 y6: producto de PCR de 2.6 kpb correspondiente a Ia verificación del gen en Ia cepa LL1.
Figura 29. Imagen que muestra un gel con Ia verificación de Ia integración del gen heterólogo y Ia eliminación del gen codifica para Ia cloranfenicol acetil transferasa.
Los productos de PCR de las colonias interrumpidas en el gen IdhA y carentes del gen que confiere Ia resistencia a Cm se muestran del carril 2 al 6, así como Ia cepa control JU15 carriles 7 y 9 cuyo producto es de 1069 pb, el carril 8 corresponde a un control negativo de 1860 pb. Figura 30. Gráfica que ilustra Ia evolución adaptativa de Ia cepa LL2 vs JU15 en xilosa a 40 g/L y el consumo de KOH 2N.
Figura 31. Imagen que muestra un gel de agarosa al 1% con el producto de PCR en que comprende el gen codifica para Ia cloranfenicol acetil transferasa (Cm), los sitios FRT, PS1 y PS2 y las secuencias de homología al gen IdhA de E. coli JU15A. Carril 1 : marcador de peso molecular, carril 3: Producto de PCR.
Figura 32. Imagen que muestra un gel con Ia verificación de Ia interrupción del gen IdhA por PCR. Carril 1 : Marcador de peso molecular, Carril 3: control CmR , carriles 4 a 7: de 4 colonias transformadas utilizando un oligo con homología a una región del gen Cm y el oligo 1190 RVF.
Figura 33. Imagen que muestra un gel de agarosa al 1 %: carriles 1 y 2 marcador de peso molecular carriles; 3-6: Ia verificación de Ia interrupción del gen IdhA y de Ia eliminación del gen Cm por PCR de 4 colonias transformadas con el pCP20, tamaño de producto: 619 pb, carril 7: Cepa control JU15A ldhA+ (1482 pb).
Figura 34. Imagen que muestra un gel con el producto de PCR en gel de agarosa (1 %) que contiene los genes pdc y adhB de Z. mobilis flanquedos por secuencias de homología con regiones río arriba y río abajo del gen pflB de E. coli MS01. Carril 1 : marcador de peso molecular, carril 2: producto de PCR.
Figura 35. Imagen que muestra un gel con los productos de PCR con oligos 250 pb rio arriba y río abajo del gen pflB .Carril 1 : marcador de peso molecular, Carriles 2 y 9: cepa control MS01 ; 569 pb, y carriles 3-8: cepas con Ia integración de los genes pdc y adhB de Z. mobilis bajo Ia región promotora de pflB: 3361 pb. Figura 36. Gráfica que muestra cinéticas de fermentación de Ia cepa E. coli MS04 en medio AM2 con: A) glucosa y B)xilosa (50 g/L) todas con acetato (2.05 g/L). Figura 37. Gráfica que muestra cinéticas de fermentación de Ia cepa E. coli MS04 en medio AM2 con Ia mezcla: glucosa-xilosa (7.5 - 42.5 g/L) y con acetato (2.05 g/L).
Figura 38. Gráfica que muestra cinéticas de fermentación de Ia cepa E. coli LL26 en medio AM2 con glucosa (4%). El rendimiento fue cercano al teórico (100%) y Ia productividad volumétrica 1.17 g de lactato por litro por hora para glucosa.
Figura 39. Gráfica que muestra cinéticas de fermentación de Ia cepa E. coli LL26 en medio AM2 con xilosa (4%). El rendimiento fue cercano al teórico (100%) y Ia productividad volumétrica 0.68 g de lactato por litro por hora para xilosa. Figura 40. Imagen que muestra las vías interrumpidas en el diagrama del metabolismo de glucosa y xilosa en E. coli y los principales productos de fermentación, incluyendo el ATP, en Ia cepa LL6.
Figura 41. Imagen que muestra las vías bloqueadas en el diagrama del metabolismo de glucosa y xilosa en E. coli y los principales productos de fermentación, incluyendo el ATP, en Ia cepa MS4.
Figura 42. Gráfica que muestra una Cinética de producción de etanol a partir del jarabe de hidrolizado de pasto gramalote (Paspalum fasciculatum).
Figura 43. Gráfica que muestra una Cinética de producción de etanol a partir del jarabe de hidrolizado de agave.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
En Ia presente invención, mediante el uso de un original diseño de técnicas de Ingeniería de Vías Metabólicas (IVM) y evolución adaptativa se han logrado obtener cepas de E. coli capaces de crecer con diferentes fuentes básicas de carbono como Io son Ia glucosa, Ia xilosa, Ia arabinosa, y/o Ia lactosa, entre otros, y convertirlas en un solo metabolito de interés, particularmente L-lactato, D-lactato o inclusive etanol, con altas productividades y rendimientos, partiendo de una cepa homoláctica que mostró habilidades superiores, en términos de velocidad específica de crecimiento, de consumo de glucosa y de producción de D-Lactato, respecto a las cepas de E. coli previamente reportadas. Por ejemplo se construyó una cepa de E. coli, nombrada en Ia presente invención como Ia cepa JU 15, depositada en el ARS Patent Culture Collection (NRRL), del Departamento de Agricultura de los Estados Unidos, con el número de acceso NRRL B-50140, capaz de fermentar fuentes de muy difícil asimilación como Io son los hidrolizados de Ia fracción hemicelulósica de tejidos vegetales (abundantes en xilosa), como el bagazo de caña y producir en D-lactato con rendimiento del 95% del valor teórico y velocidades comparables a las bacterias lácticas (cepas comúnmente empleadas para producir D-Lactato).
En este mundo tan afectado por el cambio climático , como consecuencia de un uso indiscriminado de tecnologías sucias, que consumen materias primas finitas, existe Ia necesidad de contar con tecnologías sustentables capaces de producir materias primas intermedias para Ia industria química, farmacéutica, petroquímica o de proceso, que permitan sustituir el uso de granos o semillas (base para Ia fabricación de cereales industrializados, edulcorantes, pan, tortilla, etc., de primordial importancia en Ia alimentación humana) o derivados del petróleo (finitos y en continuo aumento de precio). Adicionalmente se vislumbra Ia oportunidad de aprovechar los abundantes residuos agroindustriales o tejidos vegetales, que actualmente se subutilizan en el mejor de los casos, si no es que hasta constituyen fuentes significativas de contaminación. Por otro lado, como ya se mencionó con anterioridad, son muy pocos los microorganismos naturales capaces de crecer y producir metabolitos de interés industrial, a partir de azúcares menos convencionales, como Ia xilosa, que además es el segundo monosacárido más abundante en Ia naturaleza (aunque en su forma polimerizada), o como un disacárido residual de Ia industria de alimentos lácteos: Ia lactosa. De este modo se identifica un problema técnico que consiste en construir cepas para uso industrial que produzcan de manera eficiente y preferente metabolitos de interés industrial, a partir no solo de glucosa, sino de azúcares menos convencionales como Ia xilosa y Ia lactosa, con otros carbohidratos e inclusive con altas concentraciones de ácido acético.
Los inventores de Ia presente invención, buscando proponer una solución a ese problema técnico, han generado nuevas cepas microbianas capaces de crecer y fermentar glucosa, pero Io más importante es que también se pueden aprovechar Ia xilosa e incluso lactosa, y convertirlas eficientemente en un solo metabolito de interés industrial. Entre los metabolitos que se pueden producir con las cepas de Ia presente invención destacan los ácidos orgánicos, tales como acético, succínico, málico, pirúvico y lactato, este último ya sea en su isómero D o su isómero L, con un alto grado de pureza óptica, otros posibles metabolitos son alcoholes, tales como el etanol, 1 ,2 y 1 ,3 propanodiol, entre otros. Para lograr este fin, los inventores emplearon las más recientes técnicas de Ia ingeniería de vías metabólicas, bajo un criterio original.
En otro alcance, Ia presente invención se refiere a métodos o procesos para bioconvertir azúcares en metabolitos de interés industrial, mediante el empleo de las cepas de Ia presente invención. Mediante estos métodos se logran convertir los azúcares presentes en tejidos vegetales, como el bagazo de caña, en diferentes metabolitos de interés industrial como Io es el D-y L- lactato con rendimientos del orden de 95% y productividades volumétricas alrededor de 1g /(L* h) y etanol con rendimiento del 90% y productividad de 1 g/(L.h) Una gran ventaja de los métodos de Ia presente invención es que Ia obtención de tales metabolitos puede llevarse a cabo por fermentación en un medio mineral simple y barato, utilizando los azúcares encontrados, por ejemplo, en hidrolizados de Ia fracción hemicelulósica de tejidos vegetales, como el bagazo de caña, o en residuos agroindustriales como el suero de leche, con alto rendimiento y productividad comparando con otras cepas de E. coli previamente reportadas que no metabolizan eficientemente Ia xilosa y que necesitan medios complejos para crecer.
En Ia presente invención se obtuvieron varias cepas bacterianas que fueron modificadas genéticamente de manera incremental para Ia producción de lactato como única vía principal de regeneración del poder reductor, como Ia cepa recombinante denominada como CL3 (Utrilla et al., 2009) modificada, inactivando los genes pflB, adhE y frd, para estimular Ia producción homofermentativa de D- lactato (ver Figura 1), que mostró habilidades superiores en términos de velocidad específica de crecimiento, de velocidad específica de consumo de glucosa y de velocidad específica de producción de D-lactato que las previamente reportadas. A diferencia de las cepas reportadas en los antecedentes, esta cepa es capaz de crecer eficientemente, a una velocidad específica de 0.22 h"1, en un medio mineral simple formulado con glucosa como única fuente de carbono. Esta cepa muestra un rendimiento de conversión de glucosa a D-lactato del 95%, una velocidad específica de consumo de glucosa de 6 g/gcélulas.h; y como resultado de su inusual habilidad para crecer a densidades celulares de alrededor de 1 g/L tiene Ia productividad volumétrica de D-lactato más alta alcanzada en un cultivo en lote por una cepa sin evolucionar. Por las características antes mencionadas, esta cepa se utilizó como cepa de partida para las posteriores modificaciones en cuanto al metabolismo eficiente de xilosa y producción de otros metabolitos. La habilidad, sin precedentes, mostrada por Ia cepa CL3 para crecer óptimamente en condiciones anaerobias se consideró una habilidad clave como punto de arranque del desarrollo de Ia presente invención.
Esta cepa CL3 se usó como cepa de partida para Ia posterior modificación y lograr Ia eficiente conversión de xilosa en lactato, para Io cual se llevaron a cabo modificaciones en el transporte de xilosa, inactivando el transportador dependiente de ATP (xylFGhi) (ver Figura 2) y sometiendo a dicha cepa bacteriana a un proceso de evolución adaptativa en medio mineral (AM2) con 12% de xilosa. Con Io que se obtuvo Ia nueva cepa nombrada en Ia presente invención como JU15 (depositada en ARS Patent Culture Collection (NRRL), del Departamento de Agricultura de los Estados Unidos, con el número de acceso NRRL B-50140) y mediante un segundo proceso de evolución adaptativa usando en esta ocasión un medio que contiene xilosa y acetato, para evitar Ia inhibición de crecimiento por acetato, se obtuvo una cepa derivada nombrada en Ia presente invención JU15A (ver diagrama de su metabolismo en Ia Figura 3) (depositada en ARS Patent Culture Collection (NRRL), del Departamento de Agricultura de los Estados Unidos, con el número de acceso NRRL B-50137), que a diferencia de las cepas predecesoras, esta es capaz de crecer aún en medios de cultivo con altas concentraciones de acetato, incluso mayores a 15 g/L, concentración de acetato que llegan a presentar los hidrolizados vegetales, porque usualmente el acetato es liberado al hidrolizar Ia hemicelulosa, ya que ésta se encuentra acetilada.
A fin de demostrar Ia versatilidad de las cepas de Ia presente invención, ambas cepas, JU 15 y JU15A fueron inactivadas en el gen que codifica para Ia lactato deshidrogenasa homologa de E. coli (IdhA), para inhabilitarles Ia producción de D- Lactato, y se les insertó el (los) gen(es) codifica nte(s) necesarios para Ia síntesis de otros metabolitos de interés industrial, a modo de ejemplo se utilizaron en Ia presente invención el L-Lactato y el etanol. A manera ilustrativa, más no limitativa de Ia versatilidad de las cepas JU 15 y JU15A, a Ia primera adicionalmente se Ie introdujo el gen que codifica para Ia lactato deshidrogenasa de B. subitilis (ver Figura 40) y se Ie sujetó a un proceso de evolución adaptativa en presencia de acetato, con Io que Ia nueva cepa recombinante así obtenida, denominada en Ia presente invención LL26 (depositada en ARS Patent Culture Collection (NRRL), del Departamento de Agricultura de los Estados Unidos, con el número de acceso NRRL B-50139) (ejemplos 12 y 13), fue capaz no solo de crecer con Xilosa como principal fuente de carbono y en presencia de acetato, sino ahora de producir L- Lactato. De manera similar a Ia cepa JU15A tras inhabilitarle el gen IdhA, se Ie introdujeron los genes pdc y adhB de Z. mobilis, (ver Figura 41), se obtuvo otra nueva cepa recombinante que fue capaz de crecer con xilosa como principal fuente de carbono en presencia de acetato y además producir etanol, siendo Ia primera vez que se reporta esto para cepas de E. coli, para consumir eficientemente Ia xilosa. Esta cepa se denominó como MS04 en Ia presente invención, depositada en ARS Patent Culture Collection (NRRL), del Departamento de Agricultura de los Estados Unidos, con el número de acceso NRRL B-50138.
Así pues, Ia presente invención se refiere también a los métodos para producir D- Lactato, L-Lactato o inclusive etanol, a partir de xilosa como principal fuente de carbono, mediante diferentes procesos de fermentación con las cepas de Ia presente invención.
Adicionalmente, con Ia finalidad de mostrar Ia versatilidad de las cepas de Ia presente invención en cuanto a su uso de diversas fuentes de carbono, se evaluó Ia posibilidad de crecimiento y conversión en acetato de Ia cepa JU 15 en lactosa como principal fuente de carbono, en un medio mineral y con un residuo agroindustrial como el suero de leche, demostrando que es capaz de utilizar Ia lactosa tanto para crecimiento como para convertirla en un solo metabolito de interés, en este caso el D-Lactato. Dado que esta vía es inherente a Ia cepa parental utilizada para las modificaciones genéticas realizadas, es obvio que las otras cepas tales como JU15A, MS04, CL3 y LL26 poseen Ia misma capacidad.
Así pues, Ia presente invención provee nuevas cepas de Escherichia coli genéticamente modificadas para Ia producción versátil, eficiente y preferente de metabolitos a partir de un consumo versátil de una variedad de fuentes de carbono de bajo costo. Así mismo, provee métodos para a producción de dichos metabolitos a partir de tales fuentes de carbono mediante su fermentación por dichas nuevas cepas. Para la construcción de las cepas de Ia presente invención se utilizó como cepa parental, una cepa derivada (ver materiales y métodos) de Ia cepa de E. coli MG 1655 que fue previamente secuenciada (Hayashi K., et al 2006). Para una eficiente conversión de azúcares (glucosa, xilosa, lactosa, entre otros) en un producto preferente de interés industrial (D o L-lactato, etanol, etc.) se eliminó el flujo de carbono hacia otros metabolitos, mediante Ia inactivación de los genes que codifican para las enzimas del metabolismo fermentativo y que compiten por piruvato (pflB y dhE, en un primer paso y frdA en un segundo paso, ver Ejemplos 1, 2 y 3), con Io que se obtuvieron las cepas CL1 y CL3, esta última fue capaz crecer y de convertir glucosa en D-lactato en tasas elevadas, 0.22 h"1 y 4 gLact/(gDcw*h), respectivamente [DCW: dry cellular weigth, por las siglas en inglés de peso celular seco] (ver Ejemplo 4 para detalles). Mediante Ia inactivación de los genes que codifican para el transportador de xilosa dependiente de ATP en Ia presente invención se obtuvo otra cepa mejorada de E. coli, aquí nombrada como JU01 , (E. coli MG1655 ApflB AadhE Afrd AxylFGH). Es decir que por primera vez, mediante el uso del transportador del tipo simporte (xilosa/ H+) se logró aumentar el rendimiento de ATP por mol de xilosa metabolizada, mejorando notoriamente Ia capacidad de las cepas para crecer en xilosa como única (o principal) fuente de carbono, esto mediante Ia inactivación de los genes xylF, xylG y xylH (para detalles ver Ejemplo 5), sin embargo esta cepa tardó mucho tiempo para consumir Ia xilosa presente. Por ello, posteriormente mediante un proceso de transferencias subsecuentes en medio mineral con xilosa al 12% (evolución adaptativa), en Ia presente invención se obtuvo una cepa mutante con una capacidad mejorada de crecer en xilosa y de producir ácidos orgánicos, como Io es el D-Lactato, esta nueva cepa fue nombrada en Ia presente invención como JU15, por los inventores de Ia presente invención (para detalles ver ejemplo 6). Esta cepa fue caracterizada en medio mineral con xilosa.
Posteriormente en un medio con un hidrolizado de tejidos vegetales simulado, abundante en xilosa aunque con concentraciones relativamente altas de acetato (porque usualmente es liberado al hidrolizar Ia hemicelulosa, ya que ésta se encuentra acetilada y dichas concentraciones pueden retardar en alguna medida el crecimiento de microorganismos en tal medio), se observó que Ia cepa JU 15 presentaba una fase de crecimiento retardado (fase lag) inconvenientemente prolongado de 12 horas, por Io que los inventores de esta invención decidieron mejorar nuevamente Ia cepa. Para ello sometieron a Ia cepa JU15 a dos pases de evolución adaptativa en presencia de acetato, con el fin de obtener una mutante que disminuya significativamente Ia fase lag, Ia nueva cepa así obtenida se nombró JU15A (ver ejemplo 7) que posteriormente fue caracterizada (ver ejemplos 8 y 9).
Así mismo se probó Ia capacidad de utilizar otras fuentes de carbono como Io son algunos residuos industriales, tal como el suero de leche, rico en el disacárido denominado lactosa (ver ejemplos 10 y 11). El suero de leche es considerado un problema ambiental ya que al verterse a los mantos acuíferos genera problemas de contaminación, debido a que aumenta considerablemente Ia demanda bioquímica de oxígeno, disminuyendo Ia disponibilidad de este importante nutriente para Ia fauna y flora silvestre. Para ejemplificar esto en Ia presente invención se demostró que Ia cepa JU15 es capaz de convertir Ia lactosa presente en el suero de leche en D-Lactato (Ver ejemplo 11).
También es objeto de Ia presente invención presentar un método para producir D o L- Lactato ópticamente puro a partir de medios ricos en xilosa, como Io son los hidrolizados de tejidos vegetales, como el bagazo de caña, usando estas nuevas cepas de Escherichia coli, con esta finalidad los inventores de Ia presente invención decidieron modificar genéticamente Ia cepa JU15, mediante Ia inactivación del gen que codifica para Ia lactato deshidrogenase de E. coli y Ia introducción del gen que codifica para Ia lactato deshidrogenasa de B. subitilis en Ia misma cepa JU 15, con estas modificaciones se logró obtener una cepa productora de L-lactato aquí nombrada como cepa LL2 (Ejemplo 12 y 13), para mejorar su capacidad de crecimiento en medios de cultivo abundantes en xilosa, los inventores procedieron a someter a Ia cepa LL2 a un procedimiento de evolución adaptativa, obteniendo una mejor cepa aquí nombrada como LL26 (E. coli JU15,:: ldhBs, para detalles ver Ejemplo 14).
Por último con Ia finalidad de ejemplificar Ia aplicación de las técnicas de ingeniería de vías metabólicas y de evolución adaptativa, para Ia producción de otras materias primas de sumo interés industrial y comercial, como Io es el bioetanol, los inventores de Ia presente invención obtuvieron una cepa mutante de E. coli derivada de Ia cepa JU15A, con Ia interrupción del gen Idha y Ia integración de los genes pdc y adhB de Z. mobilis, en Ia cepa derivada de JU15A, bajo el promotor de pflB, además de un proceso de evolución adaptativa. La cepa mutante finalmente obtenida fue nombrada en Ia presente invención como cepa MS04, (E. coli JU15A ΔldhA, PpflB::pdcZm-adhBzm), siendo capaz de crecer en medios de cultivo abundantes en xilosa, como Ia fuente de carbono más importante, y producir etanol con una alta productividad y rendimiento (93% respecto al máximo teórico) (para detalles ver Ejemplo 15).
Así pues en Ia presente invención se demuestra que mediante las modificaciones a las vías fermentativas, y al transporte de xilosa, seguidas por el proceso de selección en transferencias subsecuentes se logró obtener varias nuevas cepas bacterianas modificadas genéticamente, capaces de crecer apropiadamente en medios minerales abundantes en xilosa, glucosa o lactosa, entre otros azúcares, y de convertir los azúcares presentes en los hidrolizados vegetales, como el bagazo de caña, solo en D o L- lactato, inclusive en solo etanol y que dichas cepas pueden ser utilizadas para Ia obtención de dichos productos a partir de medios de cultivo formulados en base a hidrolizados vegetales como el de bagazo de caña. De manera similar a Io aquí ejemplificado con L-lactato y etanol, a las cepas de Ia presente invención, se les puede inactivar el gen \dhA e integrárseles el o los genes necesarios para Ia producción de algún otro metabolito. A modo de ejemplo, se les pueden inactivar las vías de consumo de piruvato y tener una cepa productora del mismo o se Ie puede forzar a utilizar las vía homologas de producción de succinato, 1 ,2 propanodiol o malato como única vía de regeneración del poder reductor, también se pueden integrar vías heterólogas como Ia del 1.3 propanodiol para regenerar el poder reductor, o inclusive utilizar a Ia L-alanina como un aminoácido que permita también Ia regeneración de poder reductor etc.
La selección de Ia cepa de partida, de entre las aquí descritas dependerá de varios criterios, entre ellos, Ia fuente de carbono sobre Ia cual se desea fermentar y Ia posible presencia de acetato en el medio de cultivo. Así por ejemplo si se desea fermentar a partir de glucosa, se puede partir de Ia cepa CL3, en cambio en medios abundantes en xilosa, se pude partir de JU15, y si el medio se espera que contendrá acetato, se puede partir de JU15A, mientras que si se fermentará a partir de lactosa, cualquiera de ellas puede ser utilizada. Incluso, aunque no seria Ia manera más óptima, se puede partir de las cepas LL26 o MS04, inactivándoles en lugar del gen IdhA, el gen ldhBs o los genes pdCzmV adhBZme integrándoles el o los genes que posibiliten Ia producción del metabolito de interés.
MATERIALES Y MÉTODOS
Los microorganismos y plásmidos utilizados en Ia presente invención se presentan en las Tablas 1 y 2, además del anexo de LISTADO DE SECUENCIAS.
Tabla 1. Cepas de E. co// empleadas en este trabajo
Figure imgf000022_0001
Nomenclatura:
Δ interrumpir, inactivar
P Promotor
pflB gen de piruvato formato liasa
adhE gen de alcohol deshidrogenasa de E. coli frdA gen de fumarato reductasa
xylFGH sistema de transporte de xilosa dependiente de ATP
E15 evolución adaptativa cepa 15
JU15A derivada de JU15 tolerante a acetato
ldhBs gen de L-lactato deshidrogenasa de S. subitilis
IdhA gen de lactato deshidrogenasa
pdCzm-adhBzm gen de piruvato descarboxilasa y gen de alcohol deshidrogenasa Z. mobilis
Ad Tolerante a acetato
Tabla 2. Plásmidos empleados en este trabajo
Figure imgf000023_0001
Tanto el producto de PCR como los plásmidos empleados en este trabajo se analizaron en geles de agarosa al 1.0 -1.2 % por patrones de restricción. Hidrolizados hemicelulósicos de tejidos vegetales, como del bagazo de caña
En Ia presente invención se utilizó a manera de ejemplo bagazo de caña adquirido del Ingenio Emiliano Zapata del municipio de Zacatepec, Morelos, México. El proceso de hidrólisis para Ia obtención de azúcares fermentables se llevó a cabo con ácido sulfúrico a diferentes concentraciones, condiciones de temperatura, relación líquido: sólido y tiempo, como se muestra en Ia siguiente sección. Algunas pruebas de hidrólisis se llevaron a cabo en autoclave de vapor y Ia mayoría a nivel planta piloto en un reactor enchaquetado.
La obtención de hidrolizados hemicelulósicos del bagazo de caña se llevó a cabo en varias etapas: a) homogenizado del bagazo de caña; b) mezclado de ácido sulfúrico diluido con bagazo de caña con diferentes relaciones líquido:sólido; c) hidrólisis ácido-diluido a temperatura, concentración y tiempo seleccionados; d) obtención de hidrolizados hemicelulósicos a partir del bagazo; e) neutralización y detoxificación del hidrolizado mediante Ia adición de Ca(OH)2 (30.5 g de Ca(OH)2/L hidrolizado) en base a los miliequivalentes necesarios para elevar el pH -10-11 a temperatura ambiente; y f) concentración del hidrolizado.
Condiciones para Ia obtención hidrolizados
Se llevaron a cabo 8 lotes de hidrolizados hemicelulósicos de bagazo de caña con ácido sulfúrico a nivel planta piloto, divididos en dos grupos: 1) lotes 1-4 y 2) lotes 5-8; y 2 lotes de hidrolizados en autoclave de vapor. Las condiciones de hidrólisis ácido-diluido para los diferentes grupos en planta piloto y de autoclave se encuentran señalados en Ia tabla 3.
Tabla 3. Formación de los grupos según Ia relación ácido: bagazo; tiempo de hidrólisis; temperatura y concentración.
NIVEL PLANTA PILOTO - HIDROLIZADOR
GRUPO 1
Relación Temperatura Concentración
Lote Tiempo (h)
H2SO4:Bagazo ("C) del ácido (%)
1 4:1 2 121 2
2 4:1 1 121 2
3 3:1 1 121 2
4 2:1 1 121 2
GRUPO 2
Relación Temperatura Concentración
Lote Tiempo (h)
H2SO4:Bagazo CQ del ácido (%)
5 2:1 2 140 4
6 2:1 1 121 4
7 2:1 2 121 2
8 2:1 1 140 2
Figure imgf000025_0001
En el grupo 1 se llevó a cabo Ia evaluación de Ia relación líquido:sólido (H2SO4:bagazo) y tiempo sobre Ia formación de azúcares fermentables, manteniendo Ia temperatura y Ia concentración del ácido constantes. A partir de los resultados obtenidos se optó por mantener Ia relación 2:1 constante (grupo 2) y llevar a cabo un diseño experimental factorial, considerando como variables dependientes temperatura (121 y 140 0C), concentración del ácido (2 y 4 %) y tiempo (1 y 2 h) del proceso de hidrólisis, quedando un diseño de 4 experimentos (tabla 4):
Tabla 4. Condiciones de hidrólisis con ácido-diluido del bagazo de caña
H2SO4 T Tiempo
(%) (X) (horas)
2 121 2
4 121 1
2 140 1
4 140 2
A partir del análisis de azúcares en los hidrolizados, se seleccionaron los lotes 4-8 para ser mezclados, detoxificados con Ca(OH)2 a temperatura ambiente y concentrados en un rotavapor Büchi 185 Ex., con Ia finalidad de aumentar Ia concentración de azúcares de -29 g/L a 70 g/L. Como última etapa, se retiró Ia mayor cantidad de residuos en una centrífuga tubular MiniSharples CL-M . Para evitar problemas por contaminación los hidrolizados detoxificados se almacenaron en un cuarto frío (4 0C), antes de iniciar una prueba éstos se esterilizaron por filtración (0.2 μm). Cepa y banco celular
En esta invención se manejó en algunos casos Ia cepa de E. coli JU15, Ia cual fue obtenida de E. coli JU01 derivada de Ia cepa MG1655, está ultima se obtuvo del cepario del laboratorio de los inventores de Ia presente invención. Tiene interrumpidas las vías de producción de etanol, formato-acetato, succinato y el sistema de transporte de xilosa dependiente de ATP. Los inventores de Ia presente invención asumen que utiliza Ia vía simporter para transportar Ia xilosa. Su genotipo es E. coli ΔadhE ApflB Δfrd ΔxylFGH. En los casos donde se tenía acetato en el medio de cultivo, se utilizó una cepa derivada de E. coli JU15, Ia JU15A. Dicha cepa fue adaptada para crecer de manera más rápida y eficientemente en presencia de acetato. La cepa JU15A fue obtenida a partir de dos pases de E. coli JU 15 en medio AM2 conteniendo xilosa y acetato como fuente de carbono. Se generaron bancos celulares, por separado, con las cepas JU15 y JU15A para llevar a cabo los experimentos. A partir de células creciendo en fase exponencial, las cepas JU 15 y JU15A se congelaron en un mL de cultivo y un mL de glicerol al 80% en crioviales de 2 mL, haciendo uso de hielo seco para lograr un congelamiento muy rápido después de mezclar el cultivo con el glicerol. Posteriormente se almacenó a -70 0C en un ultracongelador, con Ia finalidad de tener un inoculo en las mismas condiciones a Io largo de todo el estudio.
Condiciones y medio de cultivo
Inoculo: Escherichia co/i JU15 y JU15A
En un mini-fermentador (fleaker) con 200 mL de medio mineral (AM2, Martínez et al., 2007) y 20 g/L de xilosa ó glucosa, ésta última sólo en cultivos donde se tomaba Ia glucosa como única fuente de carbono, se adicionó las células provenientes de un glicerol. Se controló Ia temperatura a 37 0C con un baño térmico y Ia agitación a 100 rpm. El inoculo se incubó durante 24 h hasta alcanzar una DO6Oo aprox. de 1.5 - 2. Los cultivos fueron inoculados centrifugando (4000 rpm, 10 minutos a temperatura ambiente), condiciones necesarias para tener una DO6Oo inicial aproximada de 0.1 (0.037 gocw/L) en el cultivo. Posteriormente, las células del paquete celular fueron transferidas a cada cultivo suspendiéndolas en el medio. El inoculo correspondiente a Ia cepa JU15A se lleva a cabo bajo las mismas condiciones que para Ia cepa JU 15, con Ia única diferencia en el medio de cultivo: 200 ml_ de medio mineral (AM2), conteniendo 20 g/L xilosa y 1.48 g/L acetato.
Medio de cultivo y Cultivos control
La composición del medio AM2 (Martínez et. al., 2007) para el cultivo en fleakers (mini-fermentadores) fue: 2.63 g/L (NhU)2HPO4, 0.87 g/L NH4H2PO4, 1.0 ml_/L MgSO47H2O (1 M), 1.5 mL/L elementos traza, 1.0 mL/L KCI (2M), 1.0 mL/L Betaina HCI (1 M), 100 mg/L ácido cítrico. El medio fue suplementado con concentraciones diferentes de xilosa, glucosa, arabinosa y/o acetato de sodio. Los elementos traza contienen (en g/L): 1.6 de FeCI3, 0.2 de CoCI26H2O, 0.1 de CuCI2, 0.2 de ZnCI24H2O, 0.2 de Na2MoO4, 0.05 de H3BO3 y 0.33 de MnCI2.4H2O2.
Cultivos con hidrolizados etiquetados de A a Ia F
En los cultivos A-F, los elementos del medio AM2 se encuentran en proporciones diferentes pero en Ia misma concentración arriba mencionada. Por Io que en Ia tabla 5 se resumen las proporciones de cada uno de estos elementos, haciendo uso de Ia siguiente nomenclatura, Sales: (NH4)2HPO4 y NH4H2PO4; Mg:
MgSO47H2O; Bet: betaina HCI; E.T.: elementos traza; A.C.: ácido cítrico y KCI:
KCI. Los medios para los cultivos A-F fueron suplementados con: 50 g/L xilosa, 6.7 g/L glucosa, 3.3 g/L arabinosa y 1.48 g/L acetato de sodio.
Nota: En Ia siguiente tabla, "X" significa el número de veces con que se encuentra el elemento con respecto a Ia composición original del medio AM2.
Tabla 5. Composición del medio AM2 para los cultivos A-F
Figure imgf000028_0001
Condiciones de cultivo
Fleakers (mini-fermentadores 250 ml_)
Se llevaron a cabo cultivos anaerobios en fleakers (mini-fermentadores) (Beall et al., 1991) con un volumen de trabajo de 200 mL El control de temperatura a 37 0C se mantuvo con un termocirculador y un baño de agua. El pH fue controlado en el intervalo de 6.6 - 7.0 con Ia adición automática de KOH 2 ó 4N, mientras que Ia velocidad de agitación se mantuvo en 100 rpm usando un magneto en forma de cruz con un diámetro de 2.54 cm. Los experimentos fueron llevados a cabo al menos por duplicado y Ia mayoría de los casos por triplicado.
El sistema de fleakers utilizado en el presente trabajo consta de los siguientes elementos: a) 6 mini-fermentadores (300 mL) con agitador magnético; b) control de temperatura, integrado por un termociclador y el baño de agua; c) control de pH, integrado por seis controladores automáticos con válvulas para Ia liberación de Ia base y seis electrodos de pH; y d) control de agitación, integrada por una plancha magnética (100 - 850 rpm).
Fermentador 10 L
Los cultivos anaerobios a un volumen de trabajo mayor se llevaron a cabo en un fermentador piloto (Microferm, New Brunswick, New Jersey, USA) de 10L . Las condiciones controladas de pH, temperatura y velocidad de agitación se mantuvieron en los valores de 6.6-7.0, 37 0C y 240 rpm respectivamente. El pH se controló con Ia adición de base KOH 4N y Ia temperatura se mantuvo con un serpentín interno. Se utilizó un impulsor tipo propela marina para mantener Ia agitación.
Métodos analíticos
Determinación de Ia concentración de células por Espectrofotometría
La densidad óptica fue medida a 600 nm (DO6oo) en un espectrofotómetro Beckman (DU-70) (Beckman instrument, Inc. Fullerton, CA, USA) y convertida a peso seco de células (DCW: dry cellular weigth, por sus siglas en inglés), de acuerdo a una curva de calibración: 1 unidad de DOβoo equivale a 0.37 gocw/l. Todas las muestras fueron centrifugadas (5,000 rpm a temperatura ambiente); el paquete celular se desechó y el sobrenadante se congeló para su posterior análisis.
Cuenta viable (UFC)
La cantidad de células en los cultivos con hidrolizados, donde el medio no permitía medir Ia densidad óptica, fue medida por cuenta viable de las unidades formadoras de colonias (UFC) y convertida a número de células por mililitro (cel/mL) considerando Ia dilución respectiva. De igual manera, todas las muestras fueron centrifugadas (5,000 rpm a temperatura ambiente) separando el sobrenadante para su posterior análisis.
Determinación de ácidos orgánicos y azúcares
Cálculo a partir del consumo de base KOH (Ácidos orgánicos)
El consumo de base, por el control de pH, en un cultivo para obtener una cinética de crecimiento da un dato aproximado de Ia cantidad de ácidos orgánicos (ácido láctico) presentes en el medio de cultivo. El cálculo para Ia determinación de Ia concentración de ácidos orgánicos (CA) se hace en base a los siguientes datos conocidos: concentración de Ia base (CB); volumen de base consumida (VBA); volumen inicial de trabajo en el mini-fermentador (Vτ); y con Ia Ecuación 1. c (Q XO Ecuación 1
Vτ donde:
CA y CB, está dada en concentración molar (mol/L)
VBA y Vτ, está dado en ml_ Cuantificación de ácidos orgánicos y azúcares por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC)
La determinación de ácidos orgánicos y azúcares por HPLC, se llevó a cabo por cromatografía ¡socrática con una solución de H2SO4 5 mM como fase móvil a un flujo de 0.5 mL/min en una columna Aminex HPX-87H (Biorad) a 500C. La detección de los compuestos separados, se llevó a cabo simultáneamente con un detector de arreglo de diodos (Waters 996) y un detector de índice de refracción (Waters 410). El análisis y procesamiento de datos se realizó con el sistema "Millenium" (Versión 3.01 Waters). Las temperaturas interna y externa de Ia columna fueron ajustadas a 45 y 50 0C respectivamente. Los sobrenadantes de las muestras a analizar se filtraron con membranas de 0.45 μm y se inyectaron automáticamente con ayuda del autoinyector (Waters 717). Para Ia confirmación de los azúcares y los productos analizados por HPLC se inyectaron estándares de xilosa, glucosa, arabinosa, acetato de sodio y ácidos orgánicos. Los datos obtenidos de las concentraciones de cada uno de los compuestos medidos, se calcularon con un método de calibración-Interpolado del mismo software.
Evaluación de parámetros cinéticos de los procesos de fermentación
Los parámetros evaluados fueron: velocidad específica de crecimiento (μ); rendimiento biomasa/sustrato (Yx/s); rendimiento producto/sustrato (Yp/s); rendimiento producto/biomasa (Yp/χ); productividad volumétrica del producto deseado (P); velocidad específica de consumo de sustrato (qs); velocidad específica de formación de producto-láctico (qP), los cuales se determinaron durante Ia fase de crecimiento exponencial de las diferentes cepas bacterianas generadas en Ia presente invención. Para calcular los parámetros cinéticos se consideró el factor de dilución ocasionado por Ia adición de base para el control de pH. El factor de dilución (FD) esta determinado por Ia cantidad de base adicionada al volumen inicial de trabajo (Ecuación 2). La forma de corregir las mediciones de sustrato, producto y biomasa es con Ia multiplicación por el factor de dilución.
FD = ( vV/ 1 + V H 11 AA > ) Ecuación 2
V1
donde:
Vi, es el volumen inicial de trabajo en ml_
VBA, es el volumen de base adicionada para controlar el pH en ml_ EJEMPLOS
En los siguientes ejemplos se ilustra mejor Ia presente invención, pero sin restringir su alcance.
Inactivación de genes fermentativos en las cepas bacterianas
Los microorganismos plásmidos y oligos utilizados en Ia presente invención se presentan Ia sección de MATERIALES Y MÉTODOS o en el anexo de LA LISTA DE SECUENCIAS.
Ejemplo 1. Interrupción del gene pfíB.
Como primera parte de Ia presente invención se interrumpió el gene pflB de Ia cepa de E. coli MG1655 utilizando el plásmido PKO3-p/7β (Lara et al., 2006). La interrupción de pflB se verificó mediante PCR (Figura 4) usando como control Ia cepa progenitora y otra mutante ΔpflB de E. coli W3110.
El producto de PCR esperado en las mutantes, corresponde a un producto de 1.7 Kpb, o a 4.5 Kpb en las falsas positivas, el cual es del tamaño correspondiente a Ia amplificación del gene intacto. A partir de análisis en varios geles se seleccionaron 7 mutantes. A partir de estas cepas se realizaron cultivos en tubos estáticos en medio AM2-10 g/L de glucosa y 37 0C para verificar productos de fermentación a las 24 h (Figuras 5 y 6).
El fenotipo observado en las colonias que presentan Ia interrupción en pflB fue una disminución notable en los productos que se obtienen a partir de Ia reacción catalizada por Ia piruvato formato liasa, es decir fórmico, acético y etanol, con un consecuente incremento sustancial en Ia producción de láctico. Como se observa en las Figuras 5 y 6 a excepción de Ia colonia número 46 (falso positivo), este fenotipo se encontró en todas las colonias analizadas. Ejemplo 2. Inactivación del gene adhE.
Para llevar a cabo Ia inactivación del gene adhE se obtuvo el producto de PCR con las regiones de homología a dicho gene utilizando los oligos AdhForw (SEQ. ID NO: 1) y AdhRev (SEQ. ID NO: 2) y se utilizó el plásmido pKD4 como templado (Datsenko y Wanner 2000). Se electroporó dicho producto en células inducidas con arabinosa y llevando el plásmido ayudador (pKD46). Se obtuvieron varias colonias resistentes a kanamicina y fueron analizadas por PCR con los oligos adhck forward (SEQ. ID NO: 3) y reverso (SEQ. ID NO: 4), que amplifican un producto de 3.0 Kpb, correspondiente a regiones de 200 pb río abajo y río arriba más el gen adhE (2.6 Kpb), cuando Ia interrupción se ha llevado a cabo se obtiene un producto de 1.9 Kpb correspondiente al cassete de resistencia a kanamicina y las regiones adyacentes ya mencionadas.
En Ia Figura 7 se observa el fragmento de 1.9 Kpb obtenido por Ia inactivación de adhE, de tal manera que se obtuvo Ia cepa E. coli MG1655 ApflB AadhE a Ia que se llamó en Ia presente invención como CL1.
Ejemplo 3. Inactivación del gen frd
Para llevar a cabo Ia inactivación del gen frd se obtuvo el producto de PCR con las regiones de homología a dicho gen utilizando los oligos frd Forw (SEQ. ID NO: 5) y frd Rev (SEQ. ID NO: 6) y se utilizó el plásmido pKD4 como templado (Datzenko y Wanner 2001). Se electroporó dicho producto en células inducidas con arabinosa y llevando el plásmido ayudador (pKD46). Se obtuvieron varias colonias resistentes a kanamicina y fueron analizadas por PCR con los oligos frdck forward (SEQ. ID NO: 7) y reverso (SEQ. ID NO: 8), que amplifican un producto de 1.9 Kpb, correspondiente a regiones de 50 pb río abajo y río arriba, más el gen frd (1.8 Kpb), cuando Ia interrupción se ha llevado a cabo se obtiene un producto de 1.6 Kpb correspondiente al cassette de resistencia a kanamicina y las regiones adyacentes ya mencionadas. La cepa de E. coli obtenida, resistente a kanamicina, fue transformada con el plásmido pCP20 que porta el gen de Ia FLP recombinasa, se crecieron en cajas de petri con ampicilina obteniéndose una colonia sencilla. Se seleccionó para Ia perdida de Ia resistencia a kanamicina. De las colonias obtenidas sensibles a kanamicina, se evaluaron por PCR con los oligos diseñados para verificar Ia interrupción obteniéndose un producto cercano a las 200 pb, que corresponde a los sitios adyacentes del gen y las secuencias FRT de reconocimiento de Ia FLP recombinasa. De esta manera se obtuvo Ia cepa denominada en Ia presente invención como CL3 (E. coli MG 1655 ΔpflB adhE Afrd )
Ejemplo 4. Caracterización fenotípica de CL3
Para caracterizar a Ia cepa CL3 (E. coli MG1655 ApflB AadhE Afrd), obtenida por UtNIIa et al., 2009, se llevaron a cabo cultivos en mini-fermentadores con pH controlado en el medio AM2, el cual tiene un bajo contenido de sales y está optimizado para el crecimiento anaeróbico de E. coli (Martínez et al., 2007), con 40 g/L de xilosa o glucosa. Se midió Ia velocidad específica de crecimiento y Ia producción de lactato, etanol, acetato, formato y succínato. La cepa CL1 , de Ia cual proviene Ia cepa CL3, fue caracterizada en un medio mineral con xilosa o glucosa a una concentración de 40 g/L. En xilosa y glucosa Ia cepa CL3 en el medio AM2 presenta una velocidad de crecimiento similar a Ia encontrada para CL1 en el medio mineral con xilosa o glucosa, pero se obtuvo un aumento en Ia producción de biomasa del 38% y del 14% en xilosa y glucosa respectivamente. A diferencia de otras cepas mutantes en pfl reportadas (Zhou et al. 2003a), las cepas CL1 y CL3 tienen Ia capacidad de crecer a 0.22 h"1. Este aumento en Ia producción de biomasa tuvo efecto en el consumo de azúcar y en Ia productividad de lactato. En glucosa se consumieron los 40 g/L del azúcar en 24 h aproximadamente y se obtuvo un rendimiento de lactato cercano al teórico (1 g de lactato/g de glucosa), dando una productividad volumétrica de 1.66 g de Lactato/h (Figura 8). En xilosa, los 40 g/L de azúcar se consumieron en aproximadamente 72 horas con Ia cepa CL3 en el medio AM2, en contraste con Io encontrado en el medio mineral Ia cepa CL1 en 96 horas restaban aproximadamente 10 g de xilosa (Figura 9). Para ambos azúcares se encontró que Ia inactivación del gen frd eliminó Ia producción de succinato y de esta forma los únicos productos de Ia cepa CL3 son el D-Lactato (Figura 9) y acetato, este último en concentraciones menores a 2 g/L en medio con glucosa y 5 g/L en medio con xilosa al final de Ia fermentación (datos no mostrados). Ejemplo 5. Inactivación del sistema de transporte de xilosa dependiente de ATP
Los inventores de Ia presente invención inactivaron el sistema de transporte de xilosa dependiente de ATP (genes xylF, xylG, xylH) utilizando Ia técnica de inactivación cromosomal de genes por producto de PCR (Datsenko y Wanner, 2000). Los inventores obtuvieron un producto de PCR de 1.6 Kpbs utilizando los oligos XyI frw (SEQ. ID NO: 9) y XyI Rev (SEQ. ID NO: 10) y el plásmido pKD4 como templado correspondiente al cassete de kanamicina con regiones de homología a los genes a inactivar, los oligos xylckFor (SEQ. ID NO: 11) y xylck rev (SEQ. ID NO: 12) fueron diseñados para amplificar las regiones adyacentes a los genes xylFGH los cuales tienen un tamaño de 3.7 kpbs en Ia cepa silvestre y de 1.6 en el caso de Ia cepa inactivada (Figura 10).
Los inventores obtuvieron Ia cepa llamada en Ia presente invención como JU01 (E. coli MG1655 ApflB AadhE Afrd AxylFGH), Ia cual fue evaluada en medio AM2 con 40 g/L de xilosa. Se encontró que crece 37% más rápido que Ia cepa CL3 (μ=0.14 h'1) (Figura 11) y completó Ia fermentación de 40 g/L de xilosa en 72 h. Esto sugiere que se está obteniendo un mayor rendimiento de ATP por mol de xilosa metabolizada al usar sistemas alternativos de transporte de xilosa no dependientes de ATP (probablemente XyIE). Sin embargo, comparando con Io obtenido en glucosa, JU01 tarda el triple de tiempo en consumir 40 g/L de xilosa y se afecta Ia productividad volumétrica de ácidos orgánicos, siendo tan solo una tercera parte de Ia obtenida en glucosa. Este resultado indica que mejorando Ia velocidad de consumo de xilosa potencialmente se pueden lograr velocidades de producción de lactato similares a las obtenidas con glucosa. Ejemplo 6. Evolución adaptativa de Ia cepa JU01 y optimización del pH de producción para Ia cepa derivada.
Por Io mencionado en el párrafo anterior los inventores de Ia presente invención decidieron someter a Ia cepa JU01 a un proceso de evolución adaptativa en medio AM2 con 40 g/L de xilosa (como única fuente de carbono), se hicieron 9 transferencias y en estas no se logró aumentar significativamente Ia velocidad de crecimiento ni Ia producción de ácidos orgánicos evaluada por medio del consumo de base utilizada para controlar el pH. Se decidió utilizar una concentración de 120 g/L de xilosa, para aumentar Ia presión de selección y así obtener mutantes con mejor capacidad de crecer en xilosa, se hicieron 6 transferencias y en Ia presente invención se lograron mejorar las capacidades de crecimiento y de producción de ácidos orgánicos de Ia cepa JU01 (Figura 12), obteniéndose una nueva cepa de E. coli nombrada en Ia presente invención como JU15. Comparación de parámetros cinéticos a diferentes valores de pH.
Existen reportes donde se llevan a cabo fermentaciones a diferentes valores de pH para Ia producción de ácido láctico, empleando cepas derivadas de E coli B y E. coli K12 (Dien et al., 2001); sin embargo, en el caso de E. coli JU 15, por ser una cepa nueva no se conocía su comportamiento en fermentaciones a diferentes valores de pH, por Io que en Ia presente invención se llevaron a cabo Ia caracterización del proceso de fermentación con los siguientes valores de pH 5.8, 6.2, 6.6, 7.0, 7.4 y 7.8 en medio mineral enriquecido con xilosa al 6%, en procesos de fermentación con una duración de de 72 horas, para obtener las condiciones óptimas de pH, para el mejor crecimiento de Ia cepa. La Figura 13 muestra el comportamiento obtenido al variar el pH y Ia Tabla 6 resume los parámetros cinéticos experimentales.
Como se observa en Ia Tabla 6 uno de los mejores valores de pH para el proceso desarrollado en Ia presente invención es de 7.0, pero se puede producir lactato sin problema desde un valor de 5.8 hasta 7.8. Tabla 6. Parámetros cinéticos de E. coli JIM 5 a diferentes valores de pH
Figure imgf000036_0001
El asterisco indica los valores obtenidos durante Ia fase de crecimiento exponencial. Ejemplo 7. Caracterización de E. coli JU15 y JU15A en el medio mineral simulando Ia composición del hidrolizado
En Ia presente invención también se caracterizó Ia nueva cepa JIM 5 en un hidrolizado de tejido vegetal simulado, numerándolo como 1 (hidrolizado simulado 1), para ello usaron medio mineral AM2 con Ia adición de otros componentes principales en las siguientes concentraciones: xilosa 50 g/L, glucosa 6.7 g/L, arabinosa 3.3 g/L y ácido acético 1.1 g/L, para tener una concentración de azúcares totales de 60 g/L, iniciando a un valor de pH 6.6 y cambiando a pH 7.0, al iniciar Ia fermentación. En este medio de cultivo se observó que Ia cepa presentaba una fase de crecimiento retardado de 12 horas debido a Ia presencia del ácido acético, causando un posible efecto de inhibición del crecimiento de Ia cepa JU15 (Figura 14). Finalmente esta cepa alcanzó una velocidad especifica de crecimiento (μ) de 0.12 h"1 y una qP de 1.93 giactato/gbiomasa h después de 96 horas. Debido a Ia fase de crecimiento retardado presentada, los inventores llevaron a cabo dos pases en presencia de acetato, para mejorar el crecimiento de Ia cepa, con Io que se obtuvo otra nueva cepa nombrada en Ia presente invención JU15A. Para ejemplificar su comportamiento se realizó otro cultivo control con esta cepa evolucionada, adicionando acetato de sodio al inoculo. El comportamiento obtenido por los inventores de Ia presente invención se muestra en Ia Figura 15, demostrando que los inventores eliminaron Ia fase lag que presenta Ia cepa JU 15, Io que demostró mejor tolerancia al ácido acético que otras cepas previamente reportadas (Lawford y Rousseau, 1992). Porque este hecho contrastó con el comportamiento presentado por E. coli K12 Ia cual fue inhibida por Ia adición de 35 mM de acetato de sodio (Lawford y Rousseau, 1992), Io que demuestra que a pesar de que el microorganismo es el mismo (Escherichia coli), Ia diferencia entre cepas marca Ia tolerancia a inhibición por el ácido acético.
Para Ia nueva cepa JU15A, tanto Ia qp, como Ia productividad (P) no se vieron afectados por Ia adición de 1.1 g/L de ácido acético al hidrolizado simulado 1 (medio AM2 adicionado con xilosa, glucosa y arabinosa) (ver Tabla 7). La Figura 21 muestra Ia cinética de E. coli JU15A en el hidrolizado simulado 1 , llevado a cabo por los inventores de Ia presente invención a 100 rpm, controlando el pH en el intervalo de 6.6-7.0 y a una temperatura de 37 0C. Bajo estas condiciones y con Ia cepa evolucionada, Ia velocidad específica de crecimiento aumentó 1.5 veces. La productividad volumétrica (P, gιactato/L/h) se obtuvo dividiendo Ia concentración final de ácido láctico entre el tiempo total de Ia fermentación. El rendimiento final de producto, fue calculado con Ia máxima concentración de lactato obtenida entre Ia concentración de azúcar total consumida en el medio, obteniéndose en este caso el 100% del teórico. La Tabla 7 resume los parámetros cinéticos obtenidos en Ia presente invención.
Tabla 7. Parámetros cinéticos al evaluar E. coli JU15A en el hidrolizado simulado 1.
Figure imgf000037_0001
Yp/S en giactato/gazúcarl Yχ/S βn gbiomasa/gazúcan Qp βn giactato/gbiomasa-h; qs βn gazúcar/gb¡omasa-h; y P en giactato/L h. Los valores indicados con un asterisco indican los parámetros obtenidos durante Ia fase de crecimiento exponencial.
A partir de las Figuras 16 y 17 se puede observar en primera instancia el consumo simultáneo de 2 fuentes de carbono: glucosa-arabinosa y posteriormente, agotada Ia glucosa, el consumo simultáneo de xilosa-arabinosa. La formación de biomasa, muestra que no se da el fenómeno de represión catabólica por Ia preferencia de una fuente de carbono, y el comportamiento no muestra un crecimiento diaúxico (en dos etapas). De Ia misma manera, en Ia Figura 16 se muestra que el acetato no se consumió, por Io que no es considerado como fuente de carbono para Ia nueva cepa E. coli JU15A, en ese proceso de fermentación de Ia presente invención solamente hay una producción total de 2.3 g/L de ácido acético, considerando Ia concentración inicial y final al término de Ia fermentación.
Entre otros detalles los inventores de Ia presente invención determinaron, que en Ia fermentación con Ia nueva cepa JU15A hubo un consumo total de las fuentes de carbono (xilosa, glucosa y arabinosa), producción de lactato con un rendimiento del 100% del teórico, no hubo consumo de acetato pero si producción a partir de las 24 horas, no hubo formación de etanol ni formato y se detectaron concentraciones traza para el caso del fumarato.
Al comparar las nuevas cepas JU15 y JU15A, se ve reflejado el efecto del acetato causando una fase de crecimiento retardado más grande, Io que repercute en una disminución en Ia velocidad específica de crecimiento y Ia productividad. Regularmente, el ácido acético es usado como agente antimicrobiano en Ia industria alimenticia, por ser conocido como inhibitorio tanto para bacterias como levaduras. La forma en que inhibe el crecimiento es debido a que tiene Ia habilidad de atravesar Ia membrana libremente, acidificando el citoplasma, colapsando el gradiente de pH transmembranal y destruyendo Ia homeostasis con respecto al pH intracelular.
Posteriormente, los inventores de Ia presente invención evaluaron a Ia nueva cepa E. coli JU15A en un segundo cultivo control (hidrolizado simulado 2) con las mismas condiciones de pH, temperatura y rpm, pero cambiando las concentraciones de los componentes presentes en el medio AM2, es decir se redujeron una cuarta parte Ia cantidad de sales de (NH4)2HPO4 y NH4H2PO4; sin agregar KCI, MgSO47H2O ni elementos traza, y manteniendo Ia concentración de betaína y ácido cítrico constante, así como Ia concentración de Ia fuente de carbono (xilosa, glucosa y arabinosa), además del acetato. La Tabla 8 y las Figuras 18 y 19 resumen los resultados obtenidos este proceso de fermentación. Tabla 8. Parámetros cinéticos al evaluar E. coli JU15A en el hidrolizado simulado 2.
Figure imgf000039_0001
Yp/S en giactato/Qazúcar; Yχ/S en gbiomasa/gazúcan ^P en giactato/Qbiomasa h¡ Qs βn gazúcar/gb¡omasa"h¡ y P en giactato/L-h. Los valores indicados con un asterisco indican los parámetros obtenidos durante Ia fase de crecimiento exponencial.
Al comparar los cultivos control con los hidrolizados simulados 1 y 2 los inventores de Ia presente invención observaron claramente que Ia ausencia de sales de potasio, magnesio y elementos traza y una menor cantidad de sales fosfatos (fuente de nitrógeno) afectan directamente el crecimiento de Ia nueva cepa JU15A, aún con velocidades especificas de crecimiento (μ) similares entre los dos cultivos, los demás parámetros cinéticos se ven disminuidos drásticamente e incluso Ia biomasa máxima alcanzada en el hidrolizado simulado 2 fue 11 veces menor que el hidrolizado simulado 1. De manera inesperada y a pesar de que Ia cantidad de biomasa es menor en el cultivo control 2, Ia qs tiene un mayor valor (1.7 veces en fase exponencial) para el cultivo control 2, Io que demuestra, junto con el valor de Ia μ, que en un inicio el crecimiento es bueno y rápido, pero después Ia falta de elementos nutritivos esenciales provoca una insuficiencia para mantener el crecimiento, por Io que JU15A se ve limitada en este tipo de medio de cultivo.
Ejemplo 8. Caracterización de E. coli JU15A en cultivos con hidrolizados (A- F) en un sistema de mini-fermentadores (fleakers).
Los inventores de Ia presente invención también llevaron cabo experimentos para examinar Ia contribución de suplementar nutrientes al medio de cultivo tanto en Ia productividad como en el rendimiento de lactato. Se seleccionaron las sales inorgánicas del medio AM2 y se variaron las concentraciones para suplementar los hidrolizados hemicelulósicos de tejidos vegetales obtenidos, como el bagazo de caña, y seleccionar el medio de cultivo más adecuado para posteriormente llevar a cabo el escalamiento del proceso de fermentación a una escala de 10 L de volumen de operación. Por Io tanto al utilizar los hidrolizados las concentraciones tanto de azúcares (xilosa, glucosa y arabinosa) como de acético se encuentran resumidos en Ia Tabla 5. Los principales resultados obtenidos a partir de las fermentaciones con hidrolizados de tejidos vegetales, como del bagazo de caña se muestran en Ia Tabla 9 y las Figuras 20, 21 y 22 muestran el comportamiento de JU15A en los cultivos A-F. Mientras Ia velocidad específica de crecimiento, Ia productividad volumétrica y el rendimiento producto-sustrato permanecieron similares para los cultivos A-E, Ia biomasa alcanzada en los hidrolizados donde ya no tenían suplemento de magnesio, potasio y elementos traza fue de 7.5 veces menor, Io que demuestra una limitación causada por el medio de fermentación y que posiblemente afecta parámetros tales como el rendimiento biomasa-sustrato y producto-biomasa, Ia velocidad específica de consumo de sustrato y de formación de producto, por depender directamente de Ia formación de biomasa.
Tabla 9. Parámetros cinéticos de los diferentes hidrolizados hemicelulósicos del bagazo de caña.
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Los valores indicados con un asterisco indican los parámetros obtenidos durante Ia fase de crecimiento exponencial. La adición de nutrientes al hidrolizado se detalla en Ia Tablaδ.
En el caso de los azúcares, Ia glucosa fue consumida totalmente en todas las fermentaciones en un periodo de 24 horas; Ia arabinosa se terminó totalmente para las fermentaciones A-D en un periodo no mayor a 48 horas, sin embargo para las fermentaciones E y F donde el suplemento de sales es muy bajo o nada, Ia arabinosa fue consumida a las 72 horas para el primer caso y no hubo un consumo total para el segundo caso. Similar a Io anterior, Ia xilosa fue consumida en su totalidad a las 72 h para los casos (A-D), existiendo xilosa remanente en las últimas fermentaciones (E y F). Por otro lado y de manera diferente a Io sucedido en los hidrolizados simulados, el acetato fue consumido en algunos casos, indicando su participación como fuente de carbono bajo ciertas condiciones y señalando que no actúa como compuesto inhibitorio para el crecimiento de E. coli JU15A.
Cuando los inventores de Ia presente invención compararon el cultivo A con el hidrolizado simulado 1 , este presentó resultados similares a los reportados en las tablas anteriores de Ia presente invención en relación a los parámetros cinéticos, con una ligera disminución en Ia cantidad de biomasa formada (4.8x1010 & 5.9x1010 UFC/mL); sin embargo al contrastar el cultivo D, similar en cuanto a composición del medio, con el hidrolizado simulado 2, se obtuvo una μ 1.4 veces mayor, un rendimiento producto-sustrato ~6 veces mayor y una productividad volumétrica 5 veces mas grande, por parte del cultivo D, indicando que los componentes encontrados en los hidrolizados benefician el metabolismo de JU15A.
De manera inesperada las velocidades específicas de crecimiento obtenidas para los cultivos A-F, fueron mayores a las anteriormente reportadas, en Ia presente invención, al evaluar en medio mineral dicha cepa a diferentes condiciones para glucosa/xilosa; y a pesar de no haberse consumido completamente los azúcares totales en las fermentaciones, el rendimiento superó sorprendentemente al teórico máximo reportado en Ia mayoría de los casos, por Io que se deduce que los hidrolizados cuentan con otras fuentes de carbono que son convertidas a D(- )lactato y que no fueron consideradas en los cultivos control. Además Ia presente caracterización demostró sorprendentemente que no se requiere Ia adición de compuestos tales como KCI, MgSO4ZH2O o elementos traza, ya que Ia nueva cepa JU15A tiene Ia capacidad de crecer con Ia sola adición de una fuente de nitrógeno (sales (NH4)2HPO4 y NH4H2PO4) y producir una muy buena cantidad y de manera rápida de D(-) lactato, demostrando que los hidrolizados hemicelulósicos de tejidos vegetales, como del bagazo de caña, proveen un ambiente adecuado como medio de fermentación. De tal manera que para llevar a cabo Ia ejemplificación de Ia presente invención de una fermentación de 10 L se eligió Ia composición del medio del cultivo D porque se obtuvieron buenos rendimientos y productividad, a pesar de no llegar a formar Ia cantidad máxima de biomasa alcanzada en otras fermentaciones reportadas en Ia presente invención. Ejemplo 9. Caracterización de E. coli JU15A en el medio de cultivo D en un termentador de 10 L
Los inventores llevaron a cabo Ia caracterización de Ia nueva cepa de Escherichia coli JU15A en los hidrolizados hemicelulósicos de tejidos vegetales, como del bagazo de caña, adicionados con betaina, ácido cítrico y sales de fosfatos, en un termentador piloto de 10 L. Los parámetros de operación como Ia temperatura y pH fueron iguales a los utilizados en los mini-fermentadores y Ia agitación fue estimada empíricamente para lograr un mezclado homogéneo del hidrolizado en el birreactor (240 revoluciones/min). Los datos obtenidos del proceso de fermentación se muestran en Ia Tabla 10 y Ia Figura 23. Estos resultados mostraron un crecimiento rápido, viéndose reflejado en un valor de μ de 0.28 h"1. Por otro lado, se obtuvo un rendimiento mayor al teórico máximo, Yp/s de 1.3 giactato/gazúcar, debido a Ia cantidad de otros compuestos diferentes a los azucares, que hay en los hidrolizados y que también sirven como fuente de carbono, pero no se consumió totalmente Ia xilosa, Ia productividad volumétrica final alcanzada fue de 0.50 giactato/L-h, menor en comparación con las fermentaciones llevadas a cabo en los minifermentadores (fleakers) a condiciones similares.
Tabla 10. Parámetros cinéticos de E. co/i JU15A en una fermentación de 10
L.
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* Fase exponencial
El hidrolizado utilizado en este experimento fue almacenado por varios meses a 4 grados centígrados, el mismo que presentó una concentración de 15.9 g/L de acético al inicio del cultivo de 10 litros. En Ia Figura 23 se puede observar que el acetato no se consumió, más bien tuvo un ligero aumento en su concentración (+ 6 g/L), demostrando de nuevo Ia sorprendente capacidad que posee Ia nueva cepa de E. coli JU15A para mantener su crecimiento en concentraciones de hasta 15.9 g/L de ácido acético (265 mM) o de hasta 36 g/L de acetato de sodio. La cantidad de biomasa formada no alcanzó los valores máximos logrados por los cultivos realizados en los mini-fermentadores. Esto puede deberse a Ia alta concentración de acetato en el medio, que aunque no es completamente inhibitoria si puede tener un ligero impacto en el crecimiento de Ia cepa.
Ejemplo 10. Fermentación de Lactosa
En Ia presente invención se evaluó Ia capacidad de Ia cepa JU 15 de utilizar a Ia lactosa como fuente de carbono en medio mineral AM2 con lactosa al 4%, para producir Lactato, encontrándose Io siguiente: a) Ia cepa JIM 5 consume Ia lactosa con Ia misma velocidad que su progenitora JU01 (Ver Figura 24); y b) es capaz de convertir lactosa a D-lactato con rendimientos superiores al 95% y productividades de alrededor de 1 g/L.h. Los datos obtenidos del proceso de fermentación en Ia presente invención se muestran en las Figuras 24 y 25. Ejemplo 11. Fermentación de Suero de Leche
En Ia presente invención se consideró importante evaluar Ia capacidad de Ia cepa JU15 para fermentar otras fuentes de materias primas de bajo costo, como Io es el suero de leche. Al considerar Ia composición química del suero de leche (Nutting, 1970), se decidió agregar únicamente betaína (a una concentración de 1 mM) como osmoprotector al mismo. Adicionalmente, en Ia presente invención se evaluó Ia fermentación de suero de leche suplementado ya sea con 50 g/L de lactosa o bien de xilosa. En estas fermentaciones, por Ia turbidez inicial del suero de leche fue imposible cuantificar el crecimiento de Ia cepa por densidad óptica, por Io tanto se evaluó Ia fermentación del suero mediante el consumo de base utilizada para neutralizar el ácido láctico producido.
Los resultados obtenidos en esta parte de Ia presente invención mostraron dos cosas relevantes: a) Ia cepa JU15 puede crecer y fermentar los azúcares presentes en el suero de leche; y b) La productividad del proceso fue menor que utilizando medio mineral AM2, esto probablemente debido a que el suero de leche está limitado en minerales para el crecimiento de JU 15 (Figura 26).
Ejemplo 12. Integración de Ia L-Lactato deshidrogenasa de Bacillus subtilis para Ia producción de L-lactato Construcción del plásmido pLDHβsC
Durante el desarrollo de Ia presente invención este plásmido se construyó con Ia finalidad de utilizarse como templado para el PCR con el cual se llevó a cabo Ia integración en cromosoma. Partiendo del plásmido pTrdctE (Vázquez-Limón et al., 2007) los inventores construyeron el plásmido pLDHSsC, mediante Ia clonación de un fragmento de PCR que contiene el gen que confiere Ia resistencia a cloranfenicol (Cmr) flanqueado por los sitios FRT, que facilitaron Ia recombinación en el cromosoma. Este fragmento se obtuvo a partir del plásmido pKD3 (Datsenko y Wanner 2000). En el plásmido pLDHβsC el gen Cmr quedó río abajo del gen lactato deshidrogenasa de B. subtilis (ldhBs) (ver Figura 27).
Ejemplo 13. Integración del gen Idh de B. subtilis en el cromosoma de JU15
Los inventores de Ia presente invención requirieron diseñar un par de oligos con regiones de homología a extremos iniciales y finales del gen Idh de E.coli para poder integrar el gen ldhBs en las cepa JU 15. La integración del gen ldhBs en el cromosoma de JU 15 Ia realizaron mediante modificación de Ia estrategia de Datsenko y Wanner 2000. Inicialmente los inventores diseñaron un par de oligos para amplificar mediante PCR un fragmento de ADN que contiene el gen de ldhBs y el cassette de resistencia a cloranfenicol flanqueado por los sitios FRT utilizando como templado el plásmido pLDHSsC.
Los oligos específicos EcLDHBsIntFw (SEQ. ID NO: 13) y EcLDHBsIntRv (SEQ. ID NO: 14) tienen homología, con las regiones adyacentes al gen que se desea inactivar (H1 y H2) y al plásmido (pKD3) templado (P1 y P2) que contiene el gen de resistencia a cCloranfenicol flanqueado por los sitios FRT.
En Ia Figura 28 se muestra un gel con el análisis de las colonias previamente descritas, en el carril 1 se muestra el marcador de peso molecular, los carriles 5 y 6 corresponden a Ia cepa LL1 (JU15 AldhA::\dhBsCm). Se amplificó un producto de PCR que coincide con el peso molecular esperado (2663 pb), cuando se ha integrado al gen heterólogo.
Los inventores obtuvieron cepas resistentes a Cm y mediante PCR confirmaron un fragmento que correspondió al tamaño del gen de ldhSs y el cassette de resistencia a Cm, por Io que asumieron que lograron Ia integración del gen ldhβS heterólogo y del cassette de resistencia a Cm. El PCR les indicó que el gen ldhBs está bajo el control del promotor nativo de E. coli.
Los inventores transformaron Ia cepa LL1 con el plásmido pCP20, el cual contiene Ia recombinasa FLP, que reconoce los sitios FRT, que en este caso flanquean al gen responsable de confiere Ia resistencia a cloranfenicol. Llevaron a cabo una recombinación sencilla en Ia cual se escindió el gen cat dejando un único sitio FRT en el cromosoma.
En Ia presente invención se diseñaron los siguientes oligos Oligo 1189 Fwd (SEQ. ID NO: 15) y Oligo 1190 Rvs (SEQ. ID NO: 16) para verificar Ia interrupción, presentaron regiones de homología de 200 pb antes y después de IdhA de E.coli. Los inventores obtuvieron un producto cercano a las 1093 pb, que correspondió a los sitios adyacentes del gen y las secuencias FRT de reconocimiento de Ia FLP recombinasa. De esta manera obtuvieron Ia cepa que en Ia presente invención se nombró como LL2 (E. coli MG 1655, ΔpflB, AadhE, AfrdA, ΛxylFGH, IdhBs, knri ) (LL2 es carente de Cmr). Los productos de PCR de las colonias interrumpidas en el gen IdhA y carentes del gen que confiere Ia resistencia a Cm, esto se muestra en Ia Figura 29 del carril 2 al 6, así como Ia cepa control JU15 carriles 7 y 9 cuyo producto es de 1069 pb, el carril 8 corresponde a un control negativo de 1860 pb. De Ia cepa LL2, los inventores obtuvieron 5 colonias para ser caracterizadas fenotípicamente, las denominaron LL2 adicionando un número entre paréntesis de rango (1-5). Evaluaron los siguientes parámetros: crecimiento, consumo de glucosa y consumo de base KOH 2N¡ todo esto empleando un medio mínimo AM2, en condiciones no aireadas a una temperatura de 37 0C y un agitación de 150 rpm.
Los inventores observaron que las cepas seleccionadas LL2(2) y LL2(3) presentaban una fase lag de 12 y 24 h respectivamente, por Io que decidieron someterlas al proceso de evolución adaptativa. Ejemplo 14. Evolución adaptativa de Ia cepa LL2 en xilosa 40 g/L
La evolución adaptativa consistió en efectuar transferencias del cultivo cuando éste se encontraba en Ia fase exponencial, de un mini-fermentador a otro mini- fermentador con 40 g/L de Ia fuente de carbono (xilosa), mismo que se inoculaba a una densidad óptica de 0.01 (0.0037 gocw/L).
Los inventores requirieron de 6 pases para obtener un comportamiento constante, es decir, ya no se mejoraron Ia capacidad para crecer en xilosa. A Ia cepa finalmente obtenida Ia nombraron como LL26, cuya correlación de densidad óptica y consumo de base resultaron ser el más alto y en menor tiempo, respectivamente. Previamente en esta invención se describió como se realizó Ia evolución adaptativa de Ia cepa JU15, Ia cual fermenta Ia xilosa obteniéndose rendimientos del 95% de conversión a D-Lactato, resultados arriba mencionados. En Ia Figura 30 se comparan las transferencias en condiciones de fermentación de xilosa 40 g/L de LL2(1) hasta LL2(7), el 7o pase es réplica del comportamiento de LL2(6), del pase 7 al 9 no existe ya una mejora (datos no mostrados) por Io que se decidió elegir el pase 6 como Ia cepa evolucionada, como control se tuvo a Ia cepa JU15, el comportamiento de las transferencias de LL26 es muy similar. Los inventores observaron que el máximo consumo de KOH 2N ocurre en el intervalo de Ia hora 12 a Ia hora 14 para todas las cepas, el consumo de base permite inferir el crecimiento de Ia cepa así como el consumo de xilosa, dado que se trata de una cepa homofermentativa, cuya capacidad de regeneración de poder reductor está restringida a Ia producción de L-lactato a partir de xilosa.
A partir de cultivos en glucosa se obtuvo que Ia cepa LL26 convierte toda Ia fuente de carbono en L-Lactato con rendimiento cercano al teórico (>95%) y con una productividad volumétrica de 1.17 g/L*h Para xilosa se encontró una conversión del 95% pero Ia productividad volumétrica se redujo a 0.68 g/L.h (ver Figuras 38 y 39).
Ejemplo 15. Construcción de una cepa Etanologénica derivada de JU15A
Interrupción del gen IdhA que codifica para Ia enzima lactato deshídrogenasa
Para Ia interrupción del gen IdhA en Ia cepa E. coli JU15A, los inventores usaron el método descrito por Datsenko y Wanner (2000), el cual usa el sistema de recombinación Red del fago λ para inactivar genes en el cromosoma de E. coli por recombinación homologa usando productos lineales de PCR. El protocolo de interrupción del gen IdhA de Ia cepa E. coli JU15A (E. coli MG 1655 ΔpflB, ΔadhE, Δfrd, ΔxilFGH::KmR, tolerante a acético) por este método se describe a continuación.
Al utilizar los inventores los oligos 716FWF (SEQ. ID NO: 17) y 717RVF (SEQ. ID NO: 18) obtuvieron un producto de PCR que consistía del gen de resistencia a cloramfenicol (caf) flanqueado por secuencias de homología al gen IdhA de E. coli (Ver Figura 31).
El producto de PCR fue transformado por electroporación a 2,500 V a Ia cepa E. coli JU15A (pKD46). Las células, 100 μl_ fueron sembrados en cajas con medio LB y Cm 30 (μg/ mL) para recuperar cepas recombinantes que hubieran sustituido el gen IdhA por el gen Cm flanqueado por los sitios PS1 y PS2. Así, las cepas recuperadas con resistencia a Cm 30 fueron después analizadas por PCR para verificar Ia interrupción del gen IdhA.
Para confirmar fenotípicamente que Ia recombinación se había llevado a cabo, algunas de las colonias obtenidas en el paso anterior y Ia cepa control (JU 15A, IdhA*) se sembraron por réplica en cajas con medio mínimo M9 con glucosa 20 g/L y Cm 30 mg/L en condiciones aerobias y en sistemas anaerobios a 37°C/24 h, el hecho de sembrar las colonias en medio mínimo y en anaerobiosis fue para verificar Ia interrupción del gen IdhA, pues esta vía era Ia única que Ie permitía a Ia cepa E. coli JU15A regenerar poder reductor (NAD+) y sobrevivir metabolizando sólo glucosa en condiciones anaeróbicas. Así, las colonias que no crecieron después de 24 h en condiciones anaerobias (IdhA') pero sí en condiciones aerobias fueron escogidas para su análisis por PCR. Para hacer los PCR's de estas cepas y Ia cepa control (JU 15A) se diseñaron los oligos 1189 FWF (SEQ ID NO: 19) y Oligo 1190 RVF (SEQ ID NO: 20) de 20 pb aproximadamente de homología a regiones 200 pb antes y después del gen IdhA, con estos oligos y DNA cromosomal de las cepas que no crecieron en anaerobiosis y resistentes a cloramfenicol se realizaron PCR's, sin embargo, debido a que el tamaño del inserto del gen Cm y los sitios FRT y PS fue muy similar al del gen IdhA, los productos de PCR de Ia cepa IdhA' y de Ia cepa control (JU15A, ldhA+) difirieron sólo en 66 pb y no pudieron diferenciarse en gel de agarosa (datos no mostrados). De esta manera se consiguió un nuevo oligo con homología a una región intermedia al gen Cm y junto con el oligo 1190 RVF (SEQ ID NO: 20) se volvieron a realizar PCR s con DNA cromosomal de 4 colonias y 3 de ellas amplificaron un producto de 522 pb correspondiente al tamaño esperado utilizando el oligo de Cm (Figura 32), Io cual aseguró que estas tres colonias tenían insertado el gen de Cm en lugar del gen IdhA.
Eliminación del Cassete de Resistencia a Cm
Los productos de PCR de 4 colonias interrumpidas en el gen IdhA y sin el gen de resistencia a cloramfenicol, además de Ia cepa control JU15A (ldhA+) se muestran en Ia Figura 33.
Teniendo aisladas e identificadas las colonias con Ia interrupción de IdhA y Ia eliminación de resistencia a cloramfenicol, se sembraron en medio LB y se guardaron en glicerol al 40% a -7O0C, esta nueva cepa se denominó E. coli MS01 con el genotipo ( ΔpflB, ΔadhE, Δfrd, ΔxilFGH::KmR, ΔldhA) y es incapaz de crecer en condiciones anaerobias en medio mineral y con glucosa como única fuente de carbono.
Integración de los genes pdc y adhB de Z mobilis en E. coli MT01 bajo el control del promotor de pfIB.
La integración de los genes pdc y adhB de Z. mobilis se planeó que fuera bajo el promotor de pfIB que se expresa fuertemente en condiciones anaerobias en E. coli y así tener un buen nivel de transcritos de estos genes para Ia producción de etanol en anaerobiosis.
La cepa MS01 (ΔpflB, ΔadhE, Δfrd, ΔxilFGH::KmR, ΔldhA, tolerante a acetato) tiene el gen pfIB interrumpido por Io que se diseñaron oligos con homología varias pb antes y después del gen de pfIB para amplificar y secuenciar Ia región del gen pfIB y saber si las secuencias de sus promotores estaban íntegras. Los oligos utilizados para generar el PCR de esta región son los oligos 4166 (SEQ ID NO: 21) y 4167 (SEQ ID NO: 22). Obtenido el producto de PCR de Ia región antes-después del gen pflB de 569 pb se mandó a secuenciar y los resultados de Ia secuenciación muestran que el método utilizado para interrumpir pflB no tocó Ia región de los promotores de este gen y que dejó 30 pb desde el codón de inicio (ATG) al codón de término (TAA) como se muestra en Ia secuencia posterior.
Secuenciación de Ia región del gen pflB:
5'- tac gca gta aat aaa aaa tcc act taa gaa ggt agg tgt tac ATG TCC GAG CAA GCT TCT CAA
TCT ATG TAA tta gat ttg act gaa ate gta cag taa aaa gcg tac aat -3' En Ia secuencia anterior los codones en mayúsculas representan los 30 pb del gen pflB con una secuencia de restricción para Hind III, mientras que los codones en minúsculas muestran regiones 40 pb aproximadamente antes del codón de inicio (ATG) y después del codón de término (TAA) del gen pflB sin tocar Ia región promotora de este gen (Sawers y Bóck, 1989).
Utilizando los datos de Ia secuencia anterior se buscó insertar los genes pdc y adhB de Z. mobilis bajo el control de Ia secuencia promotora del gen pflB de E. coli MS01 por medio de una recombinación homologa doble intercambiando esos dos genes por Ia región que quedaba del gen pflB (codones en mayúscula de Ia secuenciación de pflB). Para este fin se utilizó nuevamente el sistema de recombinación Red del fago λ con Ia metodología descrita anteriormente para modificar Ia cepa MS01 , por Io cual células de Ia cepa E. coli MS01 se hicieron quimiocompetentes, se transformaron con el plásmido pKD46, se aislaron y seleccionaron por resistencia a ampicilina (Amp 100) para después cultivarlas en medio SOB con arabinosa (1 mM) para inducir el sistema de recombinación Red y, hechas electrocompetentes, fueron electroporadas con un producto de PCR que contenía los dos genes (pdc y adhB) en tándem flanqueados por regiones de homología al gen pflB. Los oligos diseñados para amplificar este producto de PCR fueron 4512 FWF (SEQ ID NO: 23) y 4513 RVF (SEQ ID NO: 24). Estos oligos junto con el plásmido pLOI510 purificado se utilizaron para generar un producto de PCR que amplificó los dos genes en tándem (pdc y adhB) del plásmido pLOI510 y que incluye las secuencias de homología inmediatas antes y después al gen pflB de E. coli MS01 que fueron utilizadas como secuencias para llevar a cabo Ia recombinación homologa doble mediada por el sistema de recombinación Red del pKD46 y así insertar los genes pdc y adhB bajo el promotor de pflB en Ia cepa MS01. El producto de PCR digerido con Dpnl y purificado corrido en gel de agarosa (1%) se muestra en Ia Figura 34.
El producto de PCR fue transformado por electroporación en Ia cepa MS01 (pKD46) e inmediatamente después las células fueron recuperadas en medio SOC (1 ml_) por 12 h a 30 y 370C, pues previamente cuando las células fueron recuperadas a 370C por 2 horas no se obtuvieron colonias, así que se dejaron incubar por más tiempo a estas dos temperaturas sin agitación en condiciones anaerobias, para que sólo las células que hubieran integrado los genes pdc y adhB se seleccionaran y pudieran crecer. Después de las 12 h de incubación a 30 y 370C, 200 μl_ de cada cultivo fueron inoculados en cajas con medio mineral con glucosa (20 g/L) y Km 40 e incubados a 370C por 48 h en condiciones anaerobias para aislar colonias que hubieran integrado los genes pdc y adhB, pues sólo las células transformadas serían capaces de crecer en condiciones anaerobias ya que tendrían una nueva vía para regenerar el poder reductor (NAD+) y sobrevivir en tales condiciones. A las 48 h de incubación se recuperaron algunas colonias, principalmente cuando estas se incubaron a 3O0C en el medio SOC, sin embargo, al aislarlas y resembrarlas en el mismo medio en condiciones anaerobias, crecieron de forma más rápida.
De esta manera se escogieron 3 colonias para analizarlas por PCR junto con Ia cepa control MS01 utilizando los oligos 4166 FWF y 4167 RVF que amplifican desde regiones 250 pb antes y después de pflB obteniéndose productos de PCR de 3361 pb para las cepas transformadas con los genes pdc y adhB de Z. mobilis y 569 pb para Ia cepa control MS01 Ia cual está interrumpida en pflB (Figura 35).
Una vez demostrada Ia integración de los genes pdc y adhB en estas colonias fenotípicamente por crecimiento en condiciones anaerobias y genotípicamente por PCR (Figura 5) a esta cepa se Ie denominó E. coli MS02 (ΔpflB, ΔadhE, Δfrd, ΔxilFGH::KmR, ΔldhA, PpflB::pdcZm-adhBZm, tolerante a acético) Ia cual produce etanol en comparación a Ia cepa MS01. Posteriormente a Ia cepa E. coli MS02 se Ie sometió a un proceso de evolución a adaptativa en medio mineral AM2 con glucosa o xilosa (50 g/L) adicionado con acetato de sodio (2.05 g/L) efectuando varios pases cuando las células estaban en fase exponencial, a Ia cepa obtenida después del proceso de evolución adaptativa se Ie denominó E. coli MS04 Ia cual puede crecer en glucosa y xilosa, en presencia de acético, produciendo etanol (Ver Figura 36 y 37).
Parámetros cinéticos de Ia cepa E. coli MS04 en medio AM2 con Glucosa, Xilosa (50 g/L) o Ia mezcla de ambas: glucosa-xilosa (7.5 - 42.5 g/L) todas con acetato (2.05 g/L).
Figure imgf000051_0001
Ejemplo 15. Producción de etanol a partir de hidrolizados de pasto de crecimiento rápido utilizando Ia cepa de E. coli MS04 derivada de JU15
Los inventores de Ia presente invención llevaron a cabo Ia producción de etanol usando Ia cepa de E. coli MS04 (NRRL B-50138) derivada de Escherichia coli JU 15 (NRRL B-50140) usando azúcares provenientes de Ia hidrólisis termoquímica del pasto de crecimiento rápido "gramalote" (Paspalum fasciculatυm). El gramalote se desarrolla de forma natural en varias regiones del sureste de México y no ha sido reportado anteriormente para Ia producción de etanol. Otros pastos de crecimiento rápido como el pasto "elefante" o el "switchgrass" han sido propuestos, en los Estados Unidos de América y en varios países de Ia Unión Europea, como materia prima para hidrolizarlos y generar azúcares que pueden ser fermentados a etanol. Sin embargo, en Latinoamérica no se han realizado experiencias para utilizar pastos de crecimiento rápido en Ia producción de etanol de segunda generación.
El gramalote, recolectado de Ia región de Tabasco, fue secado al sol. El material se caracterizó y contiene 15-25% de xilano, 30-40% de glucano, 2 a 3% de arabinano, 2.5-3.5% de acetato, 12 a 16% de lignina, 1 a 3% de cenizas y el resto de material extractivo. La fracción hemicelulósica del gramalote fue hidrolizada por un método termoquímico a 121 0C, usando ácido sulfúrico con diferentes concentraciones (1 , 2 y 4% w/w), tiempos (10, 30 y 60 min.) y condiciones de reacción (3 relaciones de biomasa a líquido, 1 :2, 1 :5 y 1 :10). Se generó un jarabe para realizar pruebas de fermentabilidad usando Ia cepa de E. coli MS04 (NRRL B-50138) derivada de JU15 (NRRL B-50140). El jarabe utilizado contenía en promedio un total de 28.8 g/L de azúcares, principalmente xilosa (en g/L: 5.5 de glucosa, 19.6 de xilosa y 3.7 de arabinosa), 6.2 g/ de acetato y una pequeña cantidad de furanos. El jarabe fue tratado con hidróxido de calcio, neutralizado y adicionado con sales para fermentar los azúcares presentes en él. Los cultivos se llevaron a cabo en minifermentadores con un volumen de operación de 200 mL, a una temperatura de 37 0C y pH de 7 controlado mediante Ia adición automática de KOH 2N. La Figura 42 muestra los resultados de producción de etanol que en este ejemplo el rendimiento de conversión de azúcares en etanol fue del 95% del teórico, convirtiendo prácticamente todos los azúcares en etanol en 36 horas.
Ejemplo 16. Producción de etanol a partir de hidrolizados de bagazo de agave utilizando Ia cepa de E. coli MS04 derivada de JU15
Los inventores de Ia presente invención llevaron a cabo Ia producción de etanol usando Ia cepa de E. coli MS04 (NRRL B-50138) derivada de Escherichia coli JU15 (NRRL B-50140) usando azúcares provenientes de Ia hidrólisis termoquímica del bagazo de agave obtenido de plantas de producción de destilados de agave azul. El bagazo de agave es un desperdicio de las fábricas de tequila, mezcal y otras bebidas destiladas en varias regiones de México y ahora en otros países de Latinoamérica y África. Este material es esencialmente lignocelulosa que no tiene una aplicación práctica en las fabricas de destilados ya que no se puede usar como combustible y potencialmente constituye una fuente alterna en Ia obtención de azúcares de cinco y seis carbonos, para ser fermentados por los microorganismos objeto de invención de Ia presente patente. El bagazo de agave azul, colectado de Ia región de una fábrica de destilados de agave en Ia región sur del Estado de Morelos, México, fue secado al sol. El material se caracterizó y contiene 12-18% de xilano, 35-45% de glucano, 3-5% de acetato, 22 a 30% de lignina, 2.5 a 5.5% de cenizas y el resto de material extractivo. La fracción hemicelulósica del bagazo de agave fue hidrolizada por un método termoquímico, usando ácido sulfúrico con diferentes concentraciones, y condiciones de reacción. El jarabe fue tratado con hidróxido de calcio, neutralizado y adicionado con sales para fermentar los azúcares presentes en él. Se generó un jarabe rico en xilosa, que además contenía glucosa y arabinosa, el cual fue concentrado hasta obtener 51 g/L de azúcares totales, con un 87.5% de xilosa, 8.8% glucosa y 3.7% de arabinosa. Además contenía 0.2 g/L de hidroximetil-furfural, 0.2 g/L de furfural y 20.3 g/L de acetato. El jarabe fue fermentado, en un bioreactor con un volumen de operación de 1 Litro, a una temperatura de 37 0C, agitándolo con impulsores convencionales a 360 revoluciones por minuto y a un pH de 7, controlado mediante Ia adición automática de KOH 2N, usando Ia cepa de E. coli MS04 (NRRL B-50138) derivada de JU15 (NRRL B-50140). Los resultados obtenidos en este último ejemplo de Ia presente invención indican que Ia eficiencia de conversión de azúcares en etanol fue del 85% del teórico a las 61 horas de fermentación, ver Figura 43. REFERENCIAS
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Claims

REIVINDICACIONES
1. Una cepa de Escherichia coli modificada por ingeniería metabólica para Ia producción de compuestos químicos de interés a partir de pentosas y/o hexosas o lactosa como fuentes de carbono, caracterizada porque posee las siguientes modificaciones genéticas: a) ΔpflB, es decir Ia interrupción o inactivación del gen codificante de piruvato formato liasa, b) ΔadhE, es decir Ia interrupción o inactivación del gen codificante de alcohol deshidrogenasa de E. coli, c) AfrdA, es decir Ia interrupción o inactivación del gen codificante de fumarato reductasa, d) ΔxylFGH, es decir Ia interrupción o inactivación de los genes que codifican para el sistema de transporte de xilosa dependiente de ATP, permitiéndole metabolizar Ia xilosa con un mayor rendimiento de ATP por mol de xilosa, y opcionalmente e) Ia interrupción o inactivación del gen codificante de lactato deshidrogenasa (AldhA), más Ia inserción del gen codificante de otro producto químico de interés.
2. La cepa de Ia reivindicación 1 , caracterizada por que su fondo genético es el de E. coli MG 1655.
3. La cepa de Ia reivindicación 2, caracterizada por que produce D-Lactato, por que posee una evolución adaptativa obtenida al cultivarla en un medio mineral con hasta 12 % de xilosa, que Ie permite un mejor crecimiento en xilosa y caracterizada por estar depositada en el ARS Patent Culture Collection (NRRL) con el número de acceso NRRL B-50140.
4. La cepa de Ia reivindicación 3, caracterizada por que produce D-Lactato, por que adicionalmente posee una segunda evolución adaptativa obtenida al cultivarla en presencia de acetato, que Ia hace tolerante a acetato hasta 15 g/l, y caracterizada por estar depositada en el ARS Patent Culture Collection (NRRL) con el número de acceso NRRL B-50137.
5. La cepa de Ia reivindicación 3, caracterizada por que produce L-Lactato, por que posee Ia modificación genética ΔldhA que Ie impide producir el D-Lactato aunada a Ia modificación genética PldhA:: lctEBs, que Ie permite producir L- Lactato, y caracterizada por estar depositada en el ARS Patent Culture Collection (NRRL) con el número de acceso NRRL B-50139.
6. La cepa de Ia reivindicación 4, caracterizada por que produce Etanol, por que posee Ia modificación genética ΔldhA que Ie impide producir el D-Lactato aunada Ia modificación genética PpflB::pdcZm-adhBZm que Ie permite producir etanol, denominada E. coli MS04 y por estar depositada en el ARS Patent Culture Collection (NRRL) con el número de acceso NRRL B-50139.
7. La cepa de Ia reivindicación 1 , caracterizada por que las pentosas son xilosa o arabinosa y Ia hexosa es glucosa.
8. La cepa de Ia reivindicación 1 , caracterizada por que produce el producto químico de interés a partir de una o más fuentes de carbono seleccionadas del grupo que consiste de i) xilosa, arabinosa, glucosa, lactosa, lignocelulosa hidrolizada y suero de leche.
9. La cepa de Ia reivindicación 1 , caracterizada por que el producto químico de interés es etanol, alanina o una sal de un ácido orgánico seleccionado del grupo que consiste de acético, succínico, málico, pirúvico y láctico.
10. La cepa de Ia reivindicación 9, caracterizada por que Ia sal de ácido orgánico es D-Lactato y se obtiene con alta pureza óptica.
11. La cepa de Ia reivindicación 9, caracterizada por que Ia sal de ácido orgánico es L-Lactato y se obtiene con alta pureza óptica.
12. Un proceso para producir un compuesto químico de interés a partir de lignocelulosa hidrolizada, xilosa, arabinosa, glucosa, o suero de leche, caracterizado por que comprende los siguientes pasos: a) Cultivar Ia cepa de E. coli de Ia reivindicación 1 , en un medio adecuado que contiene una o más fuentes de carbono seleccionadas del grupo que consiste de i) xilosa, arabinosa, glucosa, lactosa, lignocelulosa hidrolizada y suero de leche, en condiciones adecuadas y por un tiempo suficiente para permitir Ia acumulación del producto químico de interés, b) Opcionalmente, Ia recuperación del compuesto de interés por operaciones unitarias adecuadas; c) Opcionalmente, Ia subsiguiente purificación del compuesto de interés por operaciones unitarias adecuadas.
13. El proceso de Ia reivindicación 12, caracterizado porque los valores de los principales parámetro de control, para el cultivo anaerobio de E. coli, están en los siguientes rangos: pH de 6.0 a 7.8; temperatura de 25 a 42 0C y agitación de 20- 400 rpm.
14. El proceso de Ia reivindicación 13, caracterizado porque el producto químico de interés es etanol, alanina o una sal de un ácido orgánico seleccionado del grupo que consiste de acético, succínico, málico, pirúvico y láctico.
15. El proceso de Ia reivindicación 14, caracterizado porque Ia sal es del ácido D- Láctico o L-Láctico, con alto grado de pureza óptica.
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