CN104838005B - 用于制造生物醇的改性细菌 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种能够对己糖和戊糖进行发酵以制造生物醇的改性细菌菌株，其中丙酮酸脱氢酶操纵子(PDH)的启动子被在厌氧条件下表达的基因的启动子替代。本发明还提供获得能够对己糖和戊糖进行发酵以制造生物醇的改性细菌菌株的方法。本发明还提供一种利用改性细菌对具有己糖和戊糖的木质纤维素生物质进行发酵以制造生物质的方法。

Description

用于制造生物醇的改性细菌
发明领域
本发明涉及对天然途径进行工程改造以增强细菌中的生物醇制造的生物醇制造领域。更具体而言，本发明提供能够使己糖和戊糖发酵的改性细菌、获得这样的改性细菌的方法和对具有己糖和戊糖的木质纤维素生物质进行发酵的方法。
背景技术
人们在很大程度上依赖于化石燃料来满足我们的能量需求。生物醇、特别是乙醇是替代至少部分石油的有吸引力的替代运输燃料。来自可再生源的燃料如农业和林业残余物保持了降低其对化石燃料的依赖性而不与食物竞争的希望。农业和林业废弃物大部分由木质纤维素构成，所述木质纤维素由被半纤维素和木质素包围的高度结构化的纤维素组成。原理上，将木质纤维素分解成单糖并将其发酵成乙醇是可能的。然而，与该过程相关的成本是商业应用的主要障碍。从木质纤维素生物质进行乙醇制造的经济性的关键进展之一将会是将在木质纤维素水解之后释放的己糖和戊糖有效发酵成乙醇。
令人遗憾的是，用于乙醇发酵的常规微生物如酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)和运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)不具有利用戊糖的能力。已经尝试将来自其它微生物的用于戊糖降解途径的基因转移进酿酒酵母和运动发酵单胞菌。然而，与大规模的外源基因表达相关的缺点如不稳定性、毒性、遏制等阻止了其广泛的用途。另一方面，大肠杆菌(Escherichia coli)具有对己糖和戊糖两者进行发酵的能力并且被用于通过各种基因操纵来制造乙醇。已经尝试了不引入外源基因的大肠杆菌的基因操纵并取得了一些成功，并且这些技术在经改造的菌株的长期基因稳定性方面具有优点。
在厌氧条件下，大肠杆菌通过涉及丙酮酸甲酸裂解酶(PFL)的途径来制造乙醇，所述丙酮酸甲酸裂解酶(PFL)将丙酮酸转化成乙酰辅酶A和甲酸(图1)。然而，该途径不是氧化还原平衡的，原因是在将1摩尔葡萄糖代谢成乙醇的过程中，消耗4摩尔NADH，但是仅产生2摩尔NADH。该氧化还原不平衡性会对乙醇的收率产生不利影响。然而，存在其中将葡萄糖转化成乙醇或丁醇的过程为氧化还原平衡过程的替代途径。这时，丙酮酸经由丙酮酸脱氢酶复合物(PDH)转化成乙酰辅酶A和CO2，并且在该过程中产生1摩尔NADH。然而，PDH的表达在厌氧条件下被抑制，而在需氧生长的细胞中保持活性。为了在厌氧条件下激活PDH的表达，PDH的启动子应当用在厌氧条件下有高度活性的启动子替代。已经发现，用PFL启动子替代PDH启动子的尝试不是非常成功，因为尽管在厌氧条件下表现出增强的PDH表达和增加的乙醇收率，但是乙醇净生产率低。
因而，需要能够对己糖和戊糖两者进行发酵来以高生产率制造生物醇如乙醇的具有基因改变的改性细菌菌株。
发明内容
相应地，在一般性方面中，本发明提供细菌中的天然途径改造以增强通过对己糖和戊糖发酵来进行的生物醇制造。
在一个方面中，本发明提供能够对己糖和戊糖两者进行发酵以制造生物醇的改性细菌菌株。
在一个实施方案中，本发明提供能够对己糖和戊糖两者进行发酵以由木质纤维素生物质制造生物乙醇的改性细菌菌株。
在一个实施方案中，本发明提供其中一种基因的启动子可以被在厌氧条件下表达的另一种基因的启动子替代的改性细菌菌株。
在一个实施方案中，本发明提供一种改性的大肠杆菌菌株，其中大肠杆菌通过一种基因的启动子被在厌氧条件下表达的另一种基因的启动子替代来改性。
在一个实施方案中，本发明提供一种改性的大肠杆菌菌株，其中丙酮酸脱氢酶操纵子(PDH)的启动子被在厌氧条件下表达的基因的启动子替代。
在一个实施方案中，本发明提供一种改性的大肠杆菌菌株，其中丙酮酸脱氢酶操纵子(PDH)的启动子被选自frdA、ldhA、pflB、adhE和gapA的基因的启动子替代。
在一个实施方案中，本发明提供一种改性的细菌菌株，其中丙酮酸脱氢酶操纵子(PDH)的启动子被gapA启动子替代。
在一个实施方案中，本发明提供一种改性的大肠杆菌菌株，其中导致竞争产物的基因被删除，所述竞争产物由乳酸、琥珀酸、乙酸和甲酸构成。
在一个实施方案中，本发明提供一种改性的细菌菌株，其中导致竞争产物的一种或更多种基因的基础水平表达可以被再次引入。
在一个方面，本发明提供一种获得能够对己糖和戊糖两者进行发酵以制造生物醇的改性细菌菌株的方法。
在一个实施方案中，本发明提供一种获得改性的大肠杆菌菌株的方法，其中所述方法包括以下步骤：
a.用在厌氧条件下以高水平表达的基因的启动子替代丙酮酸脱氢酶操纵子(PDH)的启动子；
b.通过删除导致竞争产物的基因引入突变，所述竞争产物为乳酸、琥珀酸、乙酸和甲酸，和
c.再次引入编码乙酸激酶的基因的基础水平表达。
在一个实施方案中，本发明提供一种获得改性细菌菌株的方法，其中用选自frdA、ldhA、pflB、adhE和gapA的基因的启动子替代丙酮酸脱氢酶操纵子(PDH)的启动子。
在一个实施方案中，本发明提供一种获得改性细菌菌株的方法，其中用gapA基因的启动子替代PDH的启动子。
在一个实施方案中，本发明提供一种利用改性的大肠杆菌菌株对己糖和/或戊糖进行发酵以制造生物醇的方法。
在一个实施方案中，本发明提供一种通过利用改性的细菌菌株来对包含己糖和戊糖的木质纤维素生物质进行发酵的方法。
在本发明的一些实施方案中，通过利用改性的细菌菌株在需氧、微需氧和/或厌氧条件下对包含在木质纤维素生物质中的己糖和戊糖进行发酵以制造生物醇的方法。
在一个实施方案中，本发明提供一种利用改性的大肠杆菌菌株对木质纤维素生物质进行发酵的方法，其中所述方法包括以下步骤：
-使包含己糖和戊糖的木质纤维素生物质水解；
-将改性的大肠杆菌菌株与经水解的包含己糖和戊糖的木质纤维素生物质混合；
-使混合物在微需氧条件下进行发酵。
附图说明
图1是显示在葡萄糖和木糖发酵期间大肠杆菌在厌氧条件下起作用的代谢途径的图。
图2A是显示启动子经改造的大肠杆菌B菌株(SSY01-05)的功能特性和PDH操纵子启动子替代对丙酮酸脱氢酶活性的影响的图。
图2B是显示启动子经改造的大肠杆菌B菌株(SSY01-05)的功能特性和PDH操纵子启动子替代对乙醇制造的影响的图。
图3是显示删除SSY05的突变体的产物收率比较的图。
图4A是显示在经改造的SSY09菌株中在ack基因的基础水平表达上的细胞生长改善的图。SSY09菌株利用pZSack改造，并且在LB培养基+2.5g/l葡萄糖中生长。
图4B是显示在经改造的SSY09菌株中在ack基因的基础水平表达上的细胞生长改善的图。SSY09菌株利用pZSack改造，并且在LB培养基+2.5g/l木糖中生长。
图5A是显示在生物反应器中在以葡萄糖作为碳源的确定成分的培养基中生长的大肠杆菌B的发酵曲线的图。
图5B是显示在生物反应器中在以木糖作为碳源的确定成分的培养基中生长的大肠杆菌B的发酵曲线的图。
图6A是显示在生物反应器中在以葡萄糖作为碳源的确定成分的培养基中生长的SSY10(SSY09+pZSack)的发酵曲线的图。菌株描述：
SSY10-PgapAPDH ΔldhA ΔfrdA Δack ΔpflB(pZSack)。
图6B是显示在生物反应器中在以木糖作为碳源的确定成分的培养基中生长的SSY10(SSY09+pZSack)的发酵曲线的图。菌株描述：
SSY10-PgapAPHD ΔldhA ΔfrdA Δack ΔpflB(pZAack)。
图7A是显示在生物反应器中在以葡萄糖作为碳源的复合培养基中生长的大肠杆菌B的发酵曲线的图。
图7B是显示在生物反应器中在以木糖作为碳源的复合培养基中生长的大肠杆菌B的发酵曲线的图。
图8A是显示在生物反应器中在以葡萄糖作为碳源的复合培养基中生长的SSY10(SSY09+pZSack)的发酵曲线的图。菌株描述：
SSY10-PgapAPDH ΔldhA ΔfrdA Δack ΔpflB(pZSack)。
图8B是显示在生物反应器中在以木糖作为碳源的复合培养基中生长的SSY10(SSY09+pZSack)的发酵曲线的图。菌株描述：
SSY10-PgapAPDH ΔldhA ΔfrdA Δack ΔpflB(pZSack)。
图9A是显示在生物反应器中在以木糖作为碳源的复合培养基中在微需氧条件下生长的SSY10(SSY09+pZSack)菌株的发酵曲线的图。菌株描述：
SSY10-PgapAPDH ΔldhA ΔfrdA Δack ΔpflB(pZSack)。
图9B是显示在生物反应器中在以葡萄糖和木糖的混合物作为碳源的复合培养基中在微需氧条件下生长的SSY10(SSY09+pZSack)菌株的发酵曲线的图。菌株描述：SSY10-PgapAPDH ΔldhA ΔfrdA Δack ΔpflB(pZSack)。
图10是显示通过定量的实时PCR确认的PDH操纵子在启动子替代的SSY05菌株中的表达的图。
图11是显示利用微需氧条件在LB培养基中在pH 7.0下在具有经氨处理的水解产物的情况下SSY10的发酵曲线的图。
发明详述
虽然已经关于本发明的实施方案说明了本发明，但是应当理解，在不脱离以下公开的本发明精神和范围的情况下可以做出许多其它可能的修改方案和变化方案。另外，说明书仅用于举例说明的目的，应当理解，所使用的术语在性质上为描述性的而非限制性的，因此，本发明可以以具体描述之外的方式实施。
本发明涉及细菌中的天然途径的改造以增强生物醇的制造。
本发明提供能够对己糖和戊糖两者进行发酵以制造生物醇的改性细菌菌株。在另外的方面中，本发明提供获得能够对己糖和戊糖两者进行发酵以制造生物醇的改性细菌菌株的方法。本发明还提供一种利用改性细菌对具有己糖和戊糖的木质纤维素生物质进行发酵以制造生物醇的方法。
在一个实施方案中，本发明提供一种能够对己糖和戊糖进行发酵以由木质纤维素生物质制造生物乙醇的改性细菌菌株。
在一些实施方案中，本发明提供一种改性的细菌菌株，其中一种基因的启动子被在厌氧条件下表达的另一种基因的启动子替代。在一些实施方案中，本发明提供不涉及引入外源基因的改性细菌菌株。
在一个实施方案中，改性的细菌菌株是大肠杆菌。
在一个实施方案中，改性的细菌菌株是大肠杆菌MTCC 5852。
在一个实施方案中，通过改性的大肠杆菌菌株制造的生物醇是乙醇。
在一些实施方案中，改性的大肠杆菌菌株可以发酵的己糖可以选自葡萄糖、半乳糖、阿洛糖、阿卓糖、甘露糖、古罗糖、艾杜糖和塔罗糖。在一个实施方案中，改性的大肠杆菌菌株可以发酵的己糖可以是葡萄糖和/或半乳糖。在一个实施方案中，改性的大肠杆菌菌株可以发酵的己糖是葡萄糖。
在一些实施方案中，改性的大肠杆菌菌株可以发酵的戊糖可以选自木糖、阿拉伯糖、核糖、来苏糖、核酮糖和木酮糖。在一个实施方案中，改性的大肠杆菌菌株可以发酵的戊糖可以是木糖和/或阿拉伯糖。在一个实施方案中，改性的大肠杆菌菌株可以发酵的戊糖可以是木糖。
在一些实施方案中，改性的大肠杆菌菌株中操纵子的启动子被可以在厌氧条件下以高水平表达的基因的启动子替代。
在一个实施方案中，在改性的大肠杆菌菌株中可以被替代的基因的启动子可以是丙酮酸脱氢酶操纵子(PDH)。
在本发明的一个实施方案中，改性的大肠杆菌菌株中的丙酮酸脱氢酶操纵子(PDH)的启动子可以被可以在厌氧条件下以高水平表达的基因的启动子替代。
在一些实施方案中，可以替代大肠杆菌中的天然基因的启动子并且可以在厌氧条件下以高水平表达的基因的启动子可以选自但不限于frdA、ldhA、pflB、adhE和gapA中的至少一种。
在一个实施方案中，在替代天然基因的启动子的改性大肠杆菌菌株中的操纵子的启动子和可以在厌氧条件下以高水平表达的这样的替代的启动子是gapA。
在本发明的一个实施方案中，改性的大肠杆菌菌株中的丙酮酸脱氢酶操纵子(PDH)的启动子被gapA基因的启动子替代。
在一些实施方案中，改性的大肠杆菌菌株包括竞争产物的基因中的删除突变。
在本发明的一个实施方案中，改性的大肠杆菌包括导致竞争产物的基因的删除，所述竞争产物为乳酸、琥珀酸、乙酸和甲酸。
在一个实施方案中，改性的大肠杆菌包括导致竞争产物乳酸的基因的删除，所述基因为乳酸脱氢酶(ldhA)。
在一些实施方案中，改性的大肠杆菌包括导致竞争产物乙酸的基因的删除，所述基因可以选自磷酸乙酰转移酶(pta)、乙酸激酶(ack)。
在一个实施方案中，改性的大肠杆菌包括导致竞争产物乙酸的基因的删除，所述基因为乙酸激酶(ack)。乙酸激酶(ack)基因可以为乙酸激酶A(ack A)或乙酸激酶B(ackB)。
在一个实施方案中，改性的大肠杆菌包括导致竞争产物琥珀酸的基因的删除，所述基因可以选自延胡索酸还原酶A(frdA)、延胡索酸还原酶B(frdB)、延胡索酸还原酶C(frdC)、延胡索酸还原酶D(frdD)、琥珀酰辅酶A合成酶和异柠檬酸裂解酶。
在一个实施方案中，改性的大肠杆菌包括导致竞争产物琥珀酸的基因的删除，所述基因为延胡索酸还原酶A(frdA)。
在一个实施方案中，改性的大肠杆菌包括导致竞争产物甲酸的基因的删除，所述基因可以选自丙酮酸甲酸裂解酶A(pflA)、丙酮酸甲酸裂解酶B(pflB)、丙酮酸甲酸裂解酶C(pflC)和丙酮酸甲酸裂解酶D(pflD)。
在一个实施方案中，改性的大肠杆菌包括导致竞争产物甲酸的基因的删除，所述基因为丙酮酸甲酸裂解酶B(pflB)。
在一些实施方案中，在改性的大肠杆菌中，导致竞争产物的一种或更多种基因的基础水平表达可以被再次引入。
在一个实施方案中，在改性的大肠杆菌菌株中，乙酸激酶(ack)的基础水平表达被再次引入。
在一个实施方案中，本发明提供改性的大肠杆菌菌株，其包括丙酮酸脱氢酶操纵子(PDH)的启动子被gapA基因的启动子替代、导致为乳酸、琥珀酸、乙酸和甲酸的竞争产物的基因的删除的突变和乙酸激酶的基础水平表达的再次引入。
在一些实施方案中，本发明提供一种获得改性的细菌菌株的方法，所述改性的细菌菌株可以对己糖和戊糖两者进行发酵以增强生物醇的制造。
在一个实施方案中，本发明提供一种获得改性的大肠杆菌菌株的方法，其中所述改性的大肠杆菌菌株能够对包含在木质纤维素生物质中的己糖和戊糖进行发酵以增强生物醇制造。
在本发明的一些实施方案中，用于获得改性的大肠杆菌的方法包括用可以在厌氧条件下以高水平表达的基因的启动子替代改性的大肠杆菌菌株中的操纵子的启动子。
在一些实施方案中，用于获得改性的大肠杆菌菌株的方法包括用可以在厌氧条件下以高水平表达的基因的启动替代操纵子的启动子。
在一个实施方案中，用于获得改性的大肠杆菌菌株的方法包括替代丙酮酸脱氢酶操纵子(PDH)的启动子。
在一些实施方案中，用于获得改性的大肠杆菌菌株的方法包括用可以在厌氧条件下以高水平表达的启动子替代大肠杆菌中的PDH的启动子，其中替代PDH启动子的启动子可以为选自但不限于frdA、ldhA、pflB、adhE和gapA中的至少一种。
在一个实施方案中，用于获得改性的大肠杆菌菌株的方法包括用gapA启动子替代PDH的启动子。
在一些实施方案中，用于获得改性的大肠杆菌菌株的方法包括删除导致竞争产物的基因，所述竞争产物为乳酸、琥珀酸、乙酸和甲酸。
在一个实施方案中，用于获得改性的大肠杆菌菌株的方法包括删除导致竞争产物乳酸的基因，所述基因为乳酸脱氢酶(ldhA)。
在一些实施方案中，用于获得改性的大肠杆菌菌株的方法包括删除导致竞争产物乙酸的基因，所述基因可以选自磷酸乙酰转移酶(pta)和乙酸激酶(ack)。
在一个实施方案中，用于获得改性的大肠杆菌菌株的方法包括删除导致竞争产物乙酸的基因，所述基因为乙酸激酶(ack)。乙酸激酶(ack)基因可以为乙酸激酶A(ack A)或乙酸激酶B(ack B)。
在一个实施方案中，用于获得改性的大肠杆菌菌株的方法包括删除导致竞争产物琥珀酸的基因，所述基因可以选自延胡索酸还原酶A(frdA)、延胡索酸还原酶B(frdB)、延胡索酸还原酶C(frdC)、延胡索酸还原酶D(frdD)、琥珀酰辅酶A合成酶和异柠檬酸裂解酶。
在一个实施方案中，用于获得改性的大肠杆菌菌株的方法包括删除导致竞争产物琥珀酸的基因，所述基因为延胡索酸还原酶A(frdA)。
在一个实施方案中，用于获得改性的大肠杆菌菌株的方法包括删除导致竞争产物甲酸的基因，所述基因可以选自丙酮酸甲酸裂解酶A(pflA)、丙酮酸甲酸裂解酶B(pflB)、丙酮酸甲酸裂解酶C(pflC)和丙酮酸甲酸裂解酶D(pflD)。
在一个实施方案中，用于获得改性的大肠杆菌菌株的方法包括删除导致竞争产物甲酸的基因，所述基因为丙酮酸甲酸裂解酶B(pflB)。
在一些实施方案中，用于获得改性的大肠杆菌菌株的方法包括再次引入竞争产物的一种或更多种基因的基础水平表达。
在一个实施方案中，用于获得改性的大肠杆菌菌株的方法包括再次引入乙酸激酶(ack)的基础水平表达。
在一个实施方案中，本发明提供一种获得改性的大肠杆菌菌株的方法，其中所述方法包括以下步骤：
a.用在厌氧条件下以高水平表达的基因的启动子替代丙酮酸脱氢酶操纵子(PDH)的启动子；
b.通过删除导致为乳酸、琥珀酸、乙酸和甲酸的竞争产物的基因引入突变；
c.再次引入编码乙酸激酶的基因的基础水平表达。
在一个实施方案中，本发明提供一种获得改性的大肠杆菌菌株的方法，其中所述方法包括以下步骤：
a.用选自frdA、ldhA、pflB、adhE和gapA的基因的启动子替代丙酮酸脱氢酶操纵子(PDH)的启动子；
b.通过删除导致为乳酸、琥珀酸、乙酸和甲酸的竞争产物的基因引入突变；
c.再次引入编码乙酸激酶的基因的基础水平表达。
在优选的实施方案中，本发明提供一种获得改性的大肠杆菌菌株的方法，其中所述方法包括以下步骤：
a.用gapA基因的启动子替代丙酮酸脱氢酶操纵子(PDH)的启动子；
b.通过删除导致为乳酸、琥珀酸、乙酸和甲酸的竞争产物的基因引入突变；
c.再次引入编码乙酸激酶的基因的基础水平表达。
在一个实施方案中，本发明提供一种利用改性的大肠杆菌菌株对己糖和/或戊糖进行发酵以制造生物醇的方法。
在一个实施方案中，本发明提供一种对己糖进行发酵的方法，其中己糖可以选自葡萄糖、半乳糖、阿洛糖、阿卓糖、甘露糖、古罗糖、艾杜糖和塔罗糖。在一个实施方案中，本发明提供一种对己糖进行发酵的方法，其中所述己糖可以是葡萄糖和/或半乳糖。在一个实施方案中，本发明提供一种对己糖进行发酵的方法，其中所述己糖是葡萄糖。
在一个实施方案中，本发明提供一种对戊糖进行发酵的方法，其中戊糖可以选自木糖、阿拉伯糖、核糖、来苏糖、核酮糖和木酮糖。在一个实施方案中，本发明提供一种对戊糖进行发酵的方法，其中所述戊糖可以是木糖和/或阿拉伯糖。在一个实施方案中，本发明提供一种对戊糖进行发酵的方法，其中所述戊糖是木糖。
在一个实施方案中，本发明提供一种通过利用改性的细菌菌株对包含己糖和戊糖的木质纤维素生物质进行发酵的方法。
在本发明的一些实施方案中，通过利用改性的细菌菌株对包含在木质纤维素生物质中的己糖和戊糖进行发酵以制造生物醇的方法在需氧、微需氧和/或厌氧条件下实施。
在本发明的一个实施方案中，通过利用改性的细菌菌株对包含在木质纤维素生物质中的己糖和戊糖进行发酵的方法在微需氧和/或厌氧条件下实施。
在本发明的一个实施方案中，通过利用改性的细菌菌株对包含在木质纤维素生物质中的己糖和戊糖进行发酵的方法在微需氧条件下实施。
在一个实施方案中，本发明提供一种利用改性的大肠杆菌菌株对木质纤维素生物质进行发酵的方法，其中所述方法包括以下步骤：
-使包含己糖和戊糖的木质纤维素生物质水解；
-将改性的大肠杆菌菌株与经水解的包含己糖和戊糖的木质纤维素生物质混合；
-使混合物在微需氧条件下进行发酵以制造乙醇。
在一个实施方案中，对木质纤维素生物质进行预处理以获得水解的木质纤维素生物质。
本发明的获得改性大肠杆菌菌株的方法是氧化还原平衡的。其中丙酮酸脱氢酶操纵子(PDH)的启动子被在厌氧条件下表达的各种基因的启动子替代的改性大肠杆菌菌株表现出提高的乙醇收率，尤其是当其启动子被gapA启动子替代时更是如此。导致竞争产物的基因的删除进一步增加了乙醇收率。基础水平的乙酸激酶的表达帮助恢复细胞生长速率并且明显提高乙醇生产率。微需氧条件进一步提高细胞对葡萄糖和木糖两者的生长速率。此外，本发明方法的改性细菌菌株没有引入外源基因，从基因方面来说更稳定，并且能够以提高的乙醇制造对木质纤维素生物质进行发酵。
通过以下非限制性实施例来举例说明本发明。
实施例：
材料和方法：
细菌菌株、质粒、引物、酶和方法：
在研究中使用的细菌菌株、质粒和引物的清单在表1中提供。使用大肠杆菌DH5α菌株(Invitrogen)进行所有的克隆工作，并且使用大肠杆菌B(Coli Genetic Stock Centre(CGSC)，美国耶鲁大学)作为所有的基因组操纵的亲本菌株。限制性内切酶和T4DNA连接酶得自New England Biolabs。定制寡核苷酸(引物)由Sigma-Aldrich合成以用于PCR扩增。使用Taq DNA聚合酶(Bangalore Genei)进行经改造的菌株的验证PCR。使用质粒pKD4、pKD46和pCP20(CGSC，美国)分别作为FRT-kan-FRT片段、λRed重组酶和翻转酶的源，用于进行基因操纵。根据标准程序(Sambrook等人，1989)进行重组DNA技术。利用Qiagen试剂盒进行DNA纯化。通过Phusion High Fidelity聚合酶(Finnzymes)对DNA片段进行扩增以用于克隆和同源重组的模板准备。
表1：研究中使用的菌株、质粒和引物
注：用于重组的同源区域用斜体表示，并且酶位点加下划线
替代大肠杆菌B基因组中的PDH操纵子：
来自pKD4的FRT-kan-FRT序列利用FRT-kan-FRT-F和FRT-kan-FRT-R引物(表1)进行扩增，利用EcoRl和BamHl消化，并且连接至pUC19质粒的相应限制性内切酶位点以产生质粒pSSY01。(在pSSY01中FRT-kan-FRT的3’端处产生质粒pSSY02-06(表1)。将在PDH操纵子的pdhR编码区上游的针对-202至-157bp的45个碱基同源序列添加至FRT-kan-FRT序列的5’端的20个碱基以设计引物H1，并且将对应于PDH操纵子的aceE的编码区+1至+45的45个碱基的同源序列添加至每个启动子的3’端的20-22个碱基以获得引物H2(表1)。利用H1和H2引物和作为模板的相应质粒pSSY02-06在以下条件下进行PCR：98℃下2分钟，然后进行30个以下循环：在98℃变性15秒、在59℃退火15秒、在72℃延伸2分钟，并且在72℃进行最终延伸10分钟。PCR产物用凝胶洗脱，用Dpnl消化，再次纯化并且电穿孔(2.5KV、25μF和200Ω)至携带pKD46的大肠杆菌B(在30℃的含有1mM L-阿拉伯糖的LB肉汤中生长，直至OD600nm达到约0.3-0.4)以用同源启动子(Datsenko和Wanner，2000)替代丙酮酸脱氢酶(PDH)操纵子的启动子、RBS和pdhR基因。在卡那霉素LB-琼脂板上选择转化株。通过进行两组菌落PCR来验证改造的菌株(SSY01-05)(表1)的PDH启动子替代，一组利用v-PDH-F(pdhR上游的-372bp)和v-PDH-R(aceF编码区起点下游的+163bp)引物来验证天然启动子删除，第二组利用v-PDH-R和同源启动子的正向引物来验证同源启动子的引入(数据未显示)。在进一步的操纵之前，在FLP重组酶的帮助下通过使用温度敏感性辅助质粒pCP20(Datsenko和Wanner，2000)从选定的菌株的染色体中去除卡那霉素抗性标记基因。
利用从CGSC单基因敲除Keio菌株(美国耶鲁大学，Baba等人，2006)通过P1转导法(Miller，1972)来完成宿主基因删除。如上所述去除卡那霉素抗性标记基因，并且使用所得菌株用于之后的多组基因敲除。
pZSack质粒的构建
对pET28a(+)(Novagen)的MCS进行扩增并且在pZSblank质粒中克隆(Yazdani和Gonzalez，2008)以获得pZS*mcs。利用pZS-ack-F和pZS-ack-R引物从大肠杆菌B基因组扩增编码乙酸激酶的ackA基因，利用BamHl和Sall消化，并且将所得片段连接到pZS*mcs的BamHl-Sall位点中以产生pZSack。然后将pZSack质粒电穿孔至SSY09以增强生长速率。
培养基和培养条件
将细菌菌株在LB培养基或吗啉代丙磺酸(MOPS)成分明确的培养基中生长。根据需要添加适量抗生素，50μg/ml的氨苄西林、30μg/ml的卡那霉素和34μg/ml的氯霉素。为了检验试管中经改造的菌株的代谢物产生，将菌株在37℃在含有相关抗生素的LB琼脂板上生长过夜并且将分离的菌落在填充到边缘的Hungate管(17.5ml)中孵育，其中含有补充有抗生素和作为碳源的期望的糖(葡萄糖、木糖、半乳糖或阿拉伯糖)的1×MOPS或LB培养基。在利用pZSack或pZS*mcs质粒转化经改造菌株的研究中，将细胞在填充有包含0、0.1或100ng/ml的无水四环素作为诱导物和34μg/ml氯霉素作为抗生素的培养基的Hungate管中生长。将试管在37℃在旋转条件下孵育并且以不同的时间间隔收获。记录所生长的培养物在600nm处的光学密度并且保存上清液以用于经由HPLC进行代谢物分析。
将经改造的菌株在生物反应器中培养以评价其在各操纵阶段在受控环境中的行为。通过将从琼脂板分离的菌落在含有2.5g/l葡萄糖的17.5mlMOPS培养基的Hungate管中在37℃下孵育24小时来制备初代培养物。在其中删除了ack和pflB基因的经改造细胞(即SSY09和SSY10)的情况下，使初代培养物在厌氧室中适应37℃下容纳2.5g/l葡萄糖或木糖的250ml烧瓶中的100ml LB培养基中的厌氧条件48小时(Bactron II，Shel实验室)。将适当体积的培养物以4000rpm离心4分钟以实现生物反应器中0.05的初始OD600nm并再次悬浮在新鲜培养基中。将培养物在容纳350ml具有适量糖的LB培养基或MOPS的Biostat Q plus发酵罐(Sartorius)的六个0.5L容器之一中孵育。容器在37℃、300rpm和pH 6.8下独立控制。以0.02L/分钟的速率在培养基中吹扫高纯度氩气以建立厌氧环境。在微需氧条件下发酵的情况下，以0.02L/分钟的速率使压缩空气在容器的顶部空间中穿过；在该速率下溶解氧探针在整个发酵过程中显示出零读数。使用在各个时间间隔时从发酵罐容器收集的样品来计算细胞生长、底物利用和产物合成。
酶活性测定
为了检验PDH酶在厌氧条件下的活性，将具有同源PDH启动子的经改造的大肠杆菌B菌株连同作为对照的野生型菌株在填充有LB培养基+2％葡萄糖的Hungate管中在37℃下生长12小时。通过离心(5分钟，5000rpm)收获细胞，用9g/l NaCl清洗两次并且作为细胞团在-20℃保藏。将细胞团再次悬浮在0.1M磷酸钾缓冲液(pH 8.0)中以获得10的OD600并且利用氯仿渗透。在含有50mM磷酸钾缓冲液(pH 8.0)、2.0mM丙酮酸钠、2.5mM NAD+、0.2mM焦磷酸硫胺素、1.0mM MgCl2、0.13mM辅酶A、2.6mM半胱氨酸盐酸盐的比色皿中以1ml进行反应。添加经渗透的细胞(25μl)以开始反应，并且通过检测340nm处吸光度的变化来测量丙酮酸脱氢酶的活性(Ultrospec3100pro，Amersham Bioscience)(Danson等人，1978)。未添加丙酮酸钠的空白底物用作对照。酶活性以纳摩尔形成的NADH/分钟/mg细胞蛋白计算。在这些计算中假定相对于干细胞质量的蛋白含量为50％(重量/重量)。利用单侧未配对学生t测试来测定测试细胞和对照细胞之间的酶活性的差异显著性。0.05和更低的P值据认为具有统计学意义。
分析方法
按以下测定所生长的培养物的胞外代谢物。将所生长的细胞的培养物在13200rpm下离心5分钟。过滤含水上清液并用于HPLC分析。利用附接有Aminex HPX-87H阴离子交换柱(Bio-Rad)的HPLC系统(Agilent技术)实现代谢物分离。以0.3ml/分钟的恒定速率使用经过滤的和脱气的流动相(4mM H2SO4)，其中柱和RI检测器温度分别维持在40℃和35℃。在HPLC柱上分离1g/l的代谢物标准(美国Absolute Standards)并且使用所得区域来计算测试样品中的代谢物浓度。在分光光度计中(BioRad)以光学密度600nm(OD600)测量细胞密度。通过将限定的OD600的细胞团在75℃在烘箱中干燥20小时来计算干细胞质量。1.0的OD600对应于0.56mg干细胞/ml培养物。
使用细胞生物质、底物利用和产物合成得到的值来计算生物质和产物收率(毫摩尔/毫摩尔底物)、比生产率(毫摩尔/g细胞/小时)和体积生产率(毫摩尔/L/小时)。为了计算生物质收率，使用细胞分子式CH1.9O0.5N0.2，其平均分子量为24.7。
补充方法：
定量实时RCR：
如上所述生长大肠杆菌B和SSY05菌株。分离总RNA，并且利用Superscript RT III(Invitrogen)对来自每一个的2μg RNA进行逆转录。将2μg的该反应混合物添加到20μl的最终体积中并且利用具有基因特异性引物的QuantiMix Easy HRM试剂盒(Biotools)进行扩增。在50℃初次活化2分钟并在95℃进行预孵育步骤10分钟之后，将反应混合物经受40个以下循环：在95℃变性15秒、在56℃退火30秒、并且在72℃下延伸35秒(Bio-Rad iCycler)。之后进行解离曲线分析在95℃下进行15秒，在60℃下进行20秒，并且在95℃下进行15秒。如Pfaffl法(Pfaffl，2001)所描述的那样进行数据分析，并且采用dnaA基因作为内部对照。采用没有进行逆转录且没有RNA模板的反应混合物作为实验的阴性对照。所有的实验都进行三次。
表2：生物反应器水平上的细胞生长、糖利用和产物合成的发酵参数
a发酵罐中的生长条件在本文中的前文描述。
b％乙醇理论收率是通过考虑2毫摩尔乙醇/毫摩尔葡萄糖和1.67毫摩尔乙醇/毫摩尔木糖为100％的理论最大收率情况下计算的。
c乙醇的最大比生产率(毫摩尔乙醇/g细胞/小时)和体积生产率(毫摩尔/L培养物/小时)是通过对消耗最大底物和形成最大产物和细胞生物质的时间间隔进行计数来计算的。
丙酮酸脱氢酶(PDH)操纵子的启动子替代增强其在厌氧条件下的活性和乙醇收率
通过丙酮酸甲酸裂解酶(PFL)途径的大肠杆菌中的乙醇制造缺少经由戊糖和己糖发酵来实现理论最大收率的还原当量(图1)。图1显示了在葡萄糖和木糖发酵期间在厌氧条件下的大肠杆菌起作用的代谢途径。显示了相关的基因和相应的酶。丙酮酸脱氢酶(PDH)操纵子在厌氧条件下经由启动子替代而表达，并且用粗线表示。对乙醇的竞争途径被阻断，如用两条平行的条线所示的。虚线箭头代表途径的多个反应。胞外代谢物被置于框内。缩写如下：ADH，乙醛/醇脱氢酶；ACK，乙酸激酶；FHL，甲酸氢-裂解酶；FRD，延胡索酸还原酶；LDH，乙酸脱氢酶；PDH，丙酮酸脱氢酶；PFL，丙酮酸甲酸-裂解酶；PTA，磷酸乙酰转移酶；PYK，丙酮酸激酶。因此，野生型大肠杆菌通常在发酵条件下产生混合酸，仅部分碳转化成醇。用于制造同型乙醇的氧化还原平衡可以在厌氧条件下对丙酮酸脱氢酶(PDH)途径最佳活化来实现(图1)。编码PDH复合物的操纵子通常通过结合至其启动子的球状抑制子而在厌氧条件下被抑制。为了防止这种抑制，决定用已知在厌氧条件下表达的基因的启动子替代PDH操纵子的启动子。在关于在厌氧条件下表达的基因的启动子的相对强度文献中没有信息的情况下，选择了五个基因即frdA、ldhA、pflB、adhE和gapA的启动子，并且替代PDH操纵子的天然启动子。所得转化株通过基于内部模板的和基于外部宿主染色体的引物验证，并且分别针对PldhAPDH、PfrdAPDH、PadhEPDH、PpflBPDH和PgapAPDH启动子被指定为SSY01至SSY05(表1)。
经改造的细胞在厌氧条件下生长，并且用于测量丙酮酸脱氢酶(PDH)活性。结果表明在各种启动子经改造的菌株之间存在0.6-2.2倍的PDH活性变化(图2A)。图2A是显示启动子经改造的大肠杆菌B菌株(SSY01-05，表1)的功能特性的图，并且显示PDH操纵子启动子替代对丙酮酸脱氢酶活性的影响。细胞在完全填充的Hungate管中厌氧生长并且被收获和渗透以测量PDH活性。使用在需氧条件下生长的大肠杆菌B作为阳性对照。使用培养物的上清液来经由HPLC分析代谢物浓度。乙醇收率提高的百分比通过将每种菌株的乙醇收率(摩尔乙醇/摩尔糖)与大肠杆菌B相比较来计算。
在SSY03(P＝0.045)和SSY05(P＝0.033)菌株中的PDH活性比野生型高得多。与野生型相比，PDH操纵子的aceE、aceF和lpd基因的转录水平也显示在SSY05菌株中的表达为2-7倍(补充的图10)。图10是显示通过定量实时PCR验证PDH操纵子在启动子替代的SSY05菌株中的表达的图。大肠杆菌B和SSY05菌株在填充有LB+2％葡萄糖的Hungate管中厌氧生长12小时，并且分离RNA以利用与PDH操纵子的aceE、aceF和lpdA对应的基因特异性引物进行实时PCR。将每个基因的值归一化为dnaA基因并且相对于任意地取为1的对照大肠杆菌B绘图。
在厌氧条件下启动子经改造的菌株的更高的PDH活性的原因可能在于更高的NADH可用性和更大的指向乙醇的碳通量。在将SSY01至SSY05菌株在Hungate管中生长之后测量其代谢产物的浓度，所述Hungate管填充有包含木质纤维素生物质中通常存在的四种糖即葡萄糖、木糖、阿拉伯糖或半乳糖之一的成分明确的培养基。除了SSY01(PldhAPDH)不同之外，所有的启动子经改造的菌株在使用己糖葡萄糖和半乳糖时都表现出乙醇收率提高(图2B，表1)。图2B是显示启动子经改造的大肠杆菌B菌株(SSY01-05，表1)的功能特性的图，并且显示PDH操纵子启动子替代对乙醇制造的影响。细胞在完全填充的Hungate管中厌氧生长并且被收获和渗透以测量PDH活性。使用在需氧条件下生长的大肠杆菌B作为阳性对照。使用培养物的上清液来经由HPLC分析代谢物浓度。乙醇收率提高的百分比通过将每个菌株的乙醇收率(摩尔乙醇/摩尔糖)相对于大肠杆菌B进行比较来计算。然而，结果在戊糖木糖和阿拉伯糖的情况下是可变的。不过，SSY05菌株对于所有的四种糖均表现出最高的乙醇收率增加，因此考虑对其进行进一步的研究。
竞争途径的删除提高了经改造的SSY05菌株中的乙醇收率：
尽管经PDH启动子改造的SSY05与野生型菌株相比表现出乙醇水平的明显提高，但是其仍然产生大量的竞争副产物如乳酸、琥珀酸、乙酸和甲酸(表1)。为了进一步提高乙醇收率，在基因中对分别导致形成乳酸、琥珀酸、乙酸和甲酸的乳酸脱氢酶(ldhA)、延胡索酸还原酶(frdA)、乙酸激酶(ack)和丙酮酸甲酸裂解酶(pflB)进行删除以获得SSY06(PgapAPDH ΔldhA)、SSY07(PgapA PDH ΔldhA ΔfrdA)、SSY08(PgapA PDH ΔldhA ΔfrdA Δack)和SSY09(PgapA PDH ΔldhA ΔfrdA Δack ΔpflB)菌株(表1)。当厌氧条件下在容纳成分明确的培养基的Hungate管中生长时，SSY06和SSY07正常生长，并且分别以0.87和1.11毫摩尔/毫摩尔葡萄糖的收率制造乙醇(图3)。图3是显示SSY05的删除突变体的产物收率比较的图。细胞在37℃在填充有LB培养基和2.5g/L葡萄糖的Hungate管中生长24小时并收获，使用上清液来检测和分析产物收率。数据代表来自三个独立实验的平均和标准偏差，并且表明在删除竞争途径之后成功提高了乙醇收率。然而，SSY08生长非常缓慢并且SSY09根本就不生长。该观察结果表明ack的删除对细胞生长具有有害的影响，可能的原因是相应删除了ATP池。为了使细胞再次生长，通过非常低拷贝的质粒在SSY09菌株中引入ack基因以获得SSY10菌株。与利用对照质粒(SSY11)转化的菌株相比，即使没有添加诱导物，在利用含有ack基因的质粒(SSY10)转化之后的细胞生长中发现了明显的提高，这表明具有ack基因的少量泄露表达(图4A和4B)。图4是显示在经改造的SSY09菌株中在ack基因基础水平表达之后细胞生长的改善的图。利用pZSack转化的SSY09菌株在37℃在完全填充有LB培养基+2.5g/l葡萄糖(A)或2.5g/l木糖(B)的Hungate管中生长36小时。利用0、0.1、100ng/ml的无水四环素诱导乙酸激酶表达。分别使用利用pZS*mcs质粒转化的大肠杆菌B和SSY09作为阳性和阴性对照。结果表明，与对照质粒相比经PZSack转化的细胞的生长改善，与野生型菌株相比乙酸的产生较少。在未经诱导的SSY10菌株中的乙酸水平比野生型菌株少50％，并且该菌株表现出1.9毫摩尔/毫摩尔葡萄糖的乙醇收率(图3)。在受控环境条件下在生物反应器水平上对所有的经改造的菌株的乙醇制造能力进行进一步测试。
在成分明确的培养基中在生物反应器水平上经改造的菌株的乙醇制造的比较：
当在生物反应器中生长时，野生型大肠杆菌B在厌氧条件下在成分明确的培养基中分别以0.65和0.61毫摩尔/毫摩尔葡萄糖和木糖的收率制造乙醇，而理论最大收率为2和1.67毫摩尔/毫摩尔这些糖；原因是产生了竞争性的副产物(图5A和5B，表2)。图5是显示在具有葡萄糖(A)和木糖(B)作为碳源的成分明确的培养基中在生物反应器中生长的大肠杆菌B的发酵曲线的图。在大肠杆菌B中的葡萄糖和木糖两者的发酵期间以显著的水平产生乙醇的竞争产物。与野生型菌株相比，启动子经改造的SSY05菌株表现出高10％的乙醇收率，其表明氧化还原平衡有利于乙醇制造(表2)。如在Hugate管数据的情形中一样，依次删除竞争途径以产生SSY06、SSY07和SSY10菌株导致了相应的乙醇收率增加和副产物收率降低(表2)。在生物反应器水平上在具有20g/l葡萄糖或木糖的成分明确的培养基中生长的SSY10菌株分别以83％或68％的理论最大收率制造乙醇(图6A和6B，表2)。图6是显示在具有葡萄糖(A)和木糖(B)作为碳源的成分明确的培养基中在生物反应器中生长的SSY10(SSY09+pZSack)的发酵曲线的图。SSY10主要产生乙醇。菌株描述：SSY10-PgapA PDH ΔldhA ΔfrdAΔack ΔpflB(pZSack)。然而，约25％底物在约200小时的发酵时仍未被利用，并且以1.6-1.9毫摩尔/l/小时的低体积生产率制造乙醇。
经改造的菌株在复合培养基中在生物反应器水平上的乙醇制造的比较：
为了改善生长、底物利用和乙醇制造率，将经改造的细胞在具有50g/l底物的LB培养基中生长。野生型菌株产生乳酸和乙酸作为主要的代谢产物，分别以0.31和0.79毫摩尔/毫摩尔葡萄糖和木糖的收率产生乙醇(图7A和7B，表2)。图7是显示在具有葡萄糖(A)和木糖(B)作为碳源的复合培养基中在生物反应器中生长的大肠杆菌B的发酵曲线的图。仅少部分的碳被大肠杆菌B细胞用来制造乙醇。在SSY10菌株的情况下观察到了生长速率的提高，当使用葡萄糖作为碳源时，其以12.34毫摩尔/l/小时的速率制造乙醇，理论收率为95％(表2)。在80小时内所实现的最终乙醇浓度为21g/l(457mM)，来自44g/l(242mM)的葡萄糖(图8A)。图8A是显示在具有葡萄糖作为碳源的复合培养基中在生物反应器中生长的SSY10(SSY09+pZSack)的发酵曲线的图。SSY10菌株利用葡萄糖并且以相当高的速率制造乙醇。菌株描述：SSY10-PgapA PDH ΔldhA ΔfrdA Δack ΔpflB(pZSack)。
然而，木糖利用率在SSY10菌株中仍然低，其中在发酵260小时之后25％的木糖仍未被利用，并且仅以1.67毫摩尔/l/小时的速率产生乙醇(图8B，表2)。图8B是显示在具有木糖作为碳源的复合培养基中在生物反应器中生长的SSY10(SSY09+pZSack)的发酵曲线的图。然而，SSY10菌株的木糖利用率仍然低。菌株描述：SSY10-PgapA PDH ΔldhA ΔfrdA Δack ΔpflB(pZSack)。当培养的pH维持在6.3时木糖利用率略有增加(数据未示出)，原因可能是较高的木糖/质子共体输送的活性。为了增强细胞的生长速率，通过使压缩空气以非常低的流速穿过生物反应器的顶部空间来引入微需氧条件。细胞生长和木糖利用率显著提高，在115小时内利用50g/l木糖，并且以6.84毫摩尔/l/小时的速率制造25g/l乙醇，最大理论收率为97％(图9A)。图9A是显示在具有木糖作为碳源的复合培养基中在生物反应器中在微需氧条件下生长的SSY10(SSY09+pZSack)菌株的发酵曲线的图。该曲线表明在微需氧条件下有效利用木糖，并且以高收率和生产率制造乙醇。菌株描述：SSY10-PgapA PDH ΔldhAΔfrdA Δack ΔpflB(pZSack)。来自木糖的该乙醇收率高于文献中报道的来自经改造但没有外源基因的大肠杆菌的值。在微需氧条件下以各自25g/l进一步测试了葡萄糖和木糖的混合物的利用，并且发现在55小时内完全利用糖，以14.94毫摩尔/l/小时(约0.7g/l/小时)的速率制造乙醇，最大理论收率为85％(图9B)。图9B是显示在具有葡萄糖和木糖的混合物作为碳源的复合培养基中在生物反应器中在微需氧条件下生长的SSY10(SSY09+pZSack)的发酵曲线的图。该曲线表明在微需氧条件下有效利用葡萄糖和木糖的混合物，并且以高收率和生产率制造乙醇。菌株描述：SSY10-PgapA PDH ΔldhA ΔfrdA Δack ΔpflB(pZSack)。该乙醇制造速率接近于0.8-0.9g/l/小时的共发酵重组体大肠杆菌K011菌株。之前公开的对于没有外源基因的经改造大肠杆菌的报道均未证实葡萄糖和木糖的共同利用。
经改造的大肠杆菌SSY10菌株对于没有导致乙醇制造的任何外源基因的其它经改造的大肠杆菌菌株如KO11当然具有优势。已经发现大肠杆菌KO11在恒化器培养中的半纤维性糖上培养时逐渐丧失了其产乙醇性(ethanologenicity)，原因可能在于基因的不稳定性。由于大肠杆菌SSY10不具有外源基因，所以预计其产乙醇性在更长的代中保持稳定，因此考虑对该菌株进行进一步的研究以评价从木质纤维素水解产物的乙醇制造。
本发明显示，用在厌氧条件下表达的各种基因的启动子替代大肠杆菌中的丙酮酸脱氢酶操纵子(PDH)，并且当其启动子用gapA启动子替代时在厌氧条件下的PDH表达和乙醇收率最大。然而，细胞生长速率存在明显降低。基础水平的乙酸激酶表达帮助恢复细胞生长速率，并且明显提高了乙醇生产率。微需氧条件进一步提高了细胞对葡萄糖和木糖两者的生长速率。
利用SSY10菌株对在生物质水解产物中糖的发酵：
制备经碱(氨)处理的生物质。将尺寸减小的稻草(平均5mm长；3.5g)与100ml 30％体积/体积液氨在水中混合，15℃。将所得稻草-氨浆料装入高压容器中。反应在125℃在反应器容器中进行30分钟以获得第一浆料。将第一浆料的温度降低至至少95℃，并且随后过滤浆料以获得包含木质素的第一滤液和包含纤维素和半纤维素的第一残余物。将包含纤维素和半纤维素的第一残余物进行酶水解以回收C5和C6糖。在50℃通过缓慢添加生物质来将生物质利用纤维素分解酶以100pfu/g干重进行进一步的水解4小时，并且在相同的条件下保持过夜。在糖被提取之后，以5000rpm使溶液成团20分钟。将上清液转移至新鲜的瓶并且在100℃下热灭活20分钟，并且通过将其放置在冰上立即冷却。这帮助纤维素酶变性和沉淀，所述纤维素酶之后以8000rpm离心分离20分钟。将上清液的pH设定为7.0，无菌过滤，并且在4℃保存。使用SSY10在厌氧条件下在pH 6.8的LB肉汤中对经氨处理的生物质水解产物进行发酵。在发酵罐中添加总计50g/l的糖，其中葡萄糖为34g/l，木糖为16g/l。在63小时内，经改造的菌株消耗了所有的糖，即34g/l的葡萄糖和16g/l的木糖，并且产生19.64g/l乙醇，最大乙醇生产率为0.85g/l/小时，收率为0.4g/g(图11)。在发酵结束时乙酸水平略有增加。因此，其显示经改造的菌株SSY10能够以优异的乙醇收率非常有效地对水解产物中的糖进行发酵。
根据本发明的改性大肠杆菌菌株SSY10表现出68-83％的理论乙醇收率。根据本发明的改性大肠杆菌菌株SSY10在使用葡萄糖作为碳源时表现出95％的理论乙醇收率，并且在微需氧条件下引入时表现出85-97％的最大理论乙醇收率。
尽管在本文中详细描述了本发明的优选方案，但是本领域的普通技术人员会理解，在不脱离本发明的精神或所附权利要求的范围的情况下可以对其进行变化。

Claims (19)

1.一种能够使己糖和戊糖发酵以制造生物醇的改性细菌菌株，其中丙酮酸脱氢酶操纵子的启动子被在厌氧条件下表达的基因gapA的启动子替代，其中所述细菌菌株是大肠杆菌，所述生物醇是乙醇。
2.根据权利要求1所述的改性细菌菌株，其中导致竞争产物乙酸的基因被删除，其中被删除的导致竞争产物乙酸的基因是乙酸激酶，其中编码乙酸激酶的基因的基础水平表达被再次引入。
3.根据权利要求1所述的改性细菌菌株，其中导致竞争产物乳酸的基因被删除，其中被删除的导致竞争产物乳酸的基因是乳酸脱氢酶。
4.根据权利要求1所述的改性细菌菌株，其中导致竞争产物琥珀酸的基因被删除，其中被删除的导致竞争产物琥珀酸的基因选自延胡索酸还原酶A、延胡索酸还原酶B、延胡索酸还原酶C、延胡索酸还原酶D、琥珀酰辅酶A合成酶或异柠檬酸裂解酶。
5.根据权利要求1所述的改性细菌菌株，其中导致竞争产物甲酸的基因被删除，其中被删除的导致竞争产物甲酸的基因选自丙酮酸甲酸裂解酶A、丙酮酸甲酸裂解酶B、丙酮酸甲酸裂解酶C或丙酮酸甲酸裂解酶D。
6.根据权利要求3-5中任一项所述的改性细菌菌株，其中导致竞争产物中的一种或更多种基因的基础水平表达被再次引入。
7.一种获得权利要求1至6中任一项所述的改性细菌菌株的方法，其中所述方法包括以下步骤：
a.用在厌氧条件下以高水平表达的基因gapA的启动子替代丙酮酸脱氢酶操纵子的启动子；
b.通过删除导致竞争产物的基因引入突变，所述竞争产物为乳酸、琥珀酸、乙酸和甲酸，和
c.再次引入编码乙酸激酶的基因的基础水平表达。
8.根据权利要求7所述的获得改性细菌菌株的方法，其中被删除的导致竞争产物乳酸的基因是乳酸脱氢酶。
9.根据权利要求7所述的获得改性细菌菌株的方法，其中被删除的导致竞争产物乙酸的基因是乙酸激酶。
10.根据权利要求7所述的获得改性细菌菌株的方法，其中被删除的导致竞争产物琥珀酸的基因选自延胡索酸还原酶A、延胡索酸还原酶B、延胡索酸还原酶C、延胡索酸还原酶D、琥珀酰辅酶A合成酶和异柠檬酸裂解酶。
11.根据权利要求10所述的获得改性细菌菌株的方法，其中被删除的导致竞争产物琥珀酸的基因为延胡索酸还原酶A。
12.根据权利要求7所述的获得改性细菌菌株的方法，其中被删除的导致竞争产物甲酸的基因选自丙酮酸甲酸裂解酶A、丙酮酸甲酸裂解酶B、丙酮酸甲酸裂解酶C和丙酮酸甲酸裂解酶D。
13.根据权利要求12所述的获得改性细菌菌株的方法，其中被删除的导致竞争产物甲酸的基因为丙酮酸甲酸裂解酶B。
14.一种利用根据权利要求1所述的改性细菌菌株使己糖和/或戊糖发酵以制造生物醇的方法，其中所述生物醇是乙醇。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述己糖是葡萄糖和/或半乳糖。
16.根据权利要求14所述的方法，其中所述戊糖选自木糖、阿拉伯糖、核糖、来苏糖、核酮糖和木酮糖。
17.根据权利要求14所述的方法，其中所述戊糖是木糖和/或阿拉伯糖。
18.一种利用根据权利要求1所述的改性细菌菌株在需氧、微需氧和/或厌氧条件下使包含己糖和戊糖的木质纤维素生物质发酵以制造生物醇的方法，其中所述生物醇是乙醇。
19.一种利用根据权利要求1所述的改性细菌菌株使木质纤维素生物质发酵的方法，其中所述方法包括以下步骤：
-使包含己糖和戊糖的木质纤维素生物质水解；
-将改性的细菌菌株与经水解的包含己糖和戊糖的木质纤维素生物质混合；和
-使混合物在微需氧条件下进行发酵以制造乙醇。
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