CN113957000A - 一株热带醋杆菌及其在高酸度水果发酵醋中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株热带醋杆菌及其在高酸度水果发酵醋中的应用，属于酿造工程领域。本发明筛选的热带醋杆菌J‑27具有较高的酸耐受性，并可耐受9％vol酒精度。本发明将热带醋杆菌J‑27用于高酸度青梅醋酿造，在初始pH＝2.7的条件下能快速地将酒精转化成醋酸，发酵结束后醋酸的含量最高可达到45.51g/L，残存酒精度为0.27％vol，酒精‑醋酸转化率高达58.17％，显著优于目前常用的商业化菌株沪酿1.01。本发明公开的热带醋杆菌J‑27能够解决目前高酸度水果发酵醋酒精转化率低的问题，可以用来生产高酸度水果发酵醋，例如青梅醋、山楂醋、石榴醋、猕猴桃醋、柠檬醋、枇杷醋等。

Description

一株热带醋杆菌及其在高酸度水果发酵醋中的应用

技术领域

本发明涉及一株热带醋杆菌及其在高酸度水果发酵醋中的应用，属于微生物应用和食品酿造领域。

背景技术

在目前果醋工业生产中，生产高酸度水果发酵醋(青梅醋、山楂醋、石榴醋、猕猴桃醋、柠檬醋、枇杷醋等)缺少专用的醋酸菌，常用的醋酸菌是用于酿造粮食醋的醋酸杆菌(Acetobacter pasteurianus)沪酿1.01。与粮食醋酿造相比，高酸度水果中的有机酸含量偏高(15～20g/L)，其中青梅和山楂的柠檬酸含量占总酸的80％以上，导致发酵液pH偏低(2.5～2.9)，而常用的发酵菌株沪酿1.01(Acetobacter pasteurianus)的最适pH值通常在3.5～6.5 之间，不能较好的适应这类高酸果醋的特点，影响菌种的生长及其各种酶的活性，进而导致发酵时间长和酒精转化率低等问题。

因此，获得专用于高酸度水果发酵醋的醋酸菌，可以保证醋酸菌优良的发酵性能和有效平衡果醋中的各种风味物质，进而提高高酸度水果发酵醋的品质，对高酸度水果发酵醋行业的发展具有重要的学术价值和经济效益。

发明内容

针对现有技术中存在的高酸度水果发酵醋酿造时pH偏低，缺少专用的醋酸菌，导致其发酵时间较长和风味不足，进而影响产品品质等问题，本发明提供了一种适用于高酸度水果发酵醋酿造的醋酸菌，并将其用于高酸度水果发酵。

本发明提供了一株热带醋杆菌Acetobacter tropicalis J-27，分类命名为热带醋杆菌 (Acetobacter tropicalis)，已于2021年07月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.22882，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3 号。

本发明还提供了一种微生物菌剂，所述菌剂含有所述热带醋杆菌J-27。

在一种实施方式中，所述菌剂中热带醋杆菌J-27的含量≥1×10⁷CFU/mL，或≥1×10⁷CFU/g。

本发明还提供了所述热带醋杆菌J-27或所述的微生物菌剂在食品领域中的应用。

本发明还提供了所述热带醋杆菌J-27或所述的微生物菌剂在高酸度水果发酵醋中的应用。

在一种实施方式中，所述应用是用于高酸度水果发酵醋的酿造。

在一种实施方式中，所述高酸度水果发酵醋包括但不限于：青梅醋、山楂醋、石榴醋、猕猴桃醋、柠檬醋、枇杷醋。

在一种实施方式中，所述果醋的酿造方法包括如下步骤：

1)热带醋杆菌J-27的菌株种子液制备；

2)接种菌株种子液进行果醋的发酵。

在一种实施方式中，所述步骤1)中的热带醋杆菌J-27的菌株种子液制备包括一级种子液的制备和二级种子的制备，用于一级种子液制备的培养基含有：葡萄糖10g/L，酵母提取物 10g/L，乙酸5ml/L，乙醇30ml/L，pH值自然。

在一种实施方式中，所述步骤2)在接种前，对发酵原料进行了酶解、调糖、调酸的预处理。

在一种实施方式中，所述步骤1)中的二级种子液的制备方法如下：将一级种子液以10％的接种量接入6％vol青梅酒中，30℃，220r/min摇床培养36h。

在一种实施方式中，所述青梅酒按如下方法制备：青梅去核打浆，调节料液比1：(2～3)，加入纤维素酶酶解，调pH≥2.7，白砂糖调糖至≥15％，接种酿酒酵母至数量级≥1×10⁷个/mL，静置发酵。

在一种实施方式中，所述酿酒酵母为酿酒酵母ET008-c54，保藏编号为CGMCCNo.20815。

在一种实施方式中，所述纤维素酶酶解具体是：按300U纤维素酶/100g青梅果浆加入纤维素酶，在50℃酶解2h。

有益效果：

1、本发明从自然发酵的青梅醋中分离筛选得到一株适合高酸度水果果醋酿造的优良热带醋杆菌(Acetobacter tropicalis)。该菌株可耐受9％vol酒精度，在酒精度为6％vol的培养基中发酵7d结束，总酸含量达到54.41g/L，酒精转化率可达69.54％。

2、本发明将热带醋杆菌J-27用于高酸度青梅醋酿造，初始pH＝2.7，该菌株可以快速地将酒精转化成醋酸，风味较好，具有淡淡的香气，发酵结束后醋酸的含量最高可达到45.51g/L，酒精转化率达到58.17％。本发明的发酵方法极大地提高了设备的利用率，降低了生产、储存和运输成本，显著提高企业的经济效益。

生物材料保藏

热带醋杆菌(Acetobacter tropicalis)J-27，分类命名为热带醋杆菌(Acetobacter tropicalis)，已于2021年07月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.22882，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

附图说明

图1为分离的醋酸菌在碳酸钙培养基上的菌落形态。

图2为不同醋酸菌在酒精度为6％青梅酒中发酵5d后的乙醇转化率。

图3为菌株J-27的系统发育树。

图4为热带醋杆菌的乙醇耐受性。

图5为热带醋杆菌J-27和沪酿1.01发酵性能比较。

具体实施方式

下面申请人将结合具体的实施例对本发明产品的制备过程及应用过程做详细说明，便于本领域技术人员清楚地理解本发明。但应该理解，以下实施例不应以任何方式被解释为对本申请权利要求书请求保护范围的限制。

本发明在一些实施方式下使用的实验材料和培养基信息：

酿酒酵母ET008-c54(Saccharomyces cerevisiae)，保藏编号为CGMCC No.20815，已公开于2020年的论文《基于转录组学的酿酒酵母耐酸机制解析》中；沪酿1.01(Acetobacter pasteurianus)购于上海保藏生物技术中心(SHBCC)。

纤维素酶购自白银赛诺生物科技有限公司。

Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒(B518255)购于生工生物工程上海股份有限公司公司。

通用引物由苏州金唯智生物科技有限公司合成。

27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'(SEQ ID NO.2所示)，

1492R：5'-GGTTACCTTGTTAC GACTT-3'(SEQ ID NO.3所示)。

富集培养基：葡萄糖10g/L，酵母提取物10g/L，乙酸5ml/L，乙醇30ml/L，pH值自然。

碳酸钙分离培养基：葡萄糖10g/L，酵母提取物10g/L，无水碳酸钙20g L，琼脂粉20g/L，乙醇30ml/L，柠檬酸调pH＝3.0。

种子培养基：葡萄糖10g/L，酵母提取物10g/L，乙酸5ml/L，乙醇30ml/L，pH值自然。

发酵培养基：葡萄糖10g/L，酵母提取物10g/L，乙酸5ml/L，乙醇60ml/L，pH值自然。

本发明所涉及的检测方法：

酒精度：密度瓶法，参照国标GBT 15038-2006葡萄酒、果酒通用分析方法进行分析。

总酸：用移液管准确移取l mL样品至150mL烧杯中，加蒸馏水50mL，放入一粒转子后在恒温磁力搅拌器上边搅拌边慢慢滴入0.1mol/LNaOH标准溶液至pH＝8.2，记录读数,总酸，(以醋酸计)含量计算方式如下：

式中，V₀是NaOH滴定空白消耗量，mL；

V₁是NaOH滴定消耗量，mL；

V₂是吸取样品体积，mL；

C是标准NaOH的浓度，mol/L；

60是醋酸的摩尔质量，g/mol。

酒精转化率：按如下公式计算：

式中，C_acid是发酵过程中生成的醋酸浓度(g/L)；

△C_alcohol是培养基中消耗的乙醇浓度(g/L)；

1.304是醋酸与乙醇的质量比。

实施例1高耐酸醋酸菌菌株的分离

(1)微生物富集培养

取腐烂一周的青梅10g加入到装有100mL富集培养基的摇瓶中，30℃、220r/min摇床培养36h。

(2)菌株分离

将上述步骤(1)获得的发酵液用无菌水梯度稀释至10^-7，选取10^-5、10^-6、10^-7三个稀释梯度均匀涂布于的碳酸钙分离培养基上，于30℃培养箱倒置培养72h。如图1所示，菌落灰白色，因培养基中加有无水碳酸钙，可通过观察醋酸菌在无水碳酸钙周围产生透明圈的大小，选取透明圈较大的单菌落即为产酸能力较强的菌株，进一步纯化培养，获得10株产酸能力较强的醋酸发酵菌株，分别命名为J-3、J-9、J-11、J-12、J-19、J-23、J-27、J-30、J-35、J-41。

实施例2酒精转化率较高的醋酸菌菌株的筛选

(1)菌株种子液制备

种子液的制备：挑取纯化后的菌株接种于种子培养基中，30℃，220r/min摇瓶培养36h，至数量级≥10⁸CFU/ml。按照10％(v/v)的接种量，接种到新鲜的种子培养基中30℃，220 r/min摇瓶培养36h制备二级种子液，至数量级≥10⁸CFU/ml。

(2)醋酸发酵

按照10％(v/v)的接种量，将上述种子培养液接种到发酵培养基中，30℃、220r/min 摇瓶发酵7d，以0.1mol/L NaOH滴定总酸(以醋酸计)含量，计算酒精转化率。如图2所示，10株菌的酒精转化率为43.25％～69.54％，其中J-27转化率最高，为69.54％，其发酵7d结束发酵液总酸含量达到54.41g/L。

实施例3醋酸菌的鉴定

从斜面取实施例2筛选获得的J-27菌株接种于种子培养基中，30℃、220r/min摇瓶培养36h。利用细菌DNA提取试剂盒的操作说明对所筛选的菌株进行菌株DNA提取。并对所提的DNA样品，选用细菌16S rDNA的通用引物(27F/1492R)对16S rDNA进行PCR扩增。 PCR扩增体系为25μL PCR Mix、1μL引物27F、1μL引物1492R、1μL DNA模板及22μL无菌水。PCR反应程序：95℃变性2min，95℃复性30s，55℃延伸30s，72℃退火90s，整个过程循环30次后72℃再保温5min，使反应物充分扩增后再逐渐冷却至4℃。

将PCR样品送至苏州金唯智生物科技有限公司，进行16SrDNA基因序列分析。根据公司提供的检测结果中的16S rDNA基因序列(如SEQ ID NO.1所示)，在NCBI数据库中找到同源性最大的相关菌种，之后进行系统发育分析，利用MEGA6对所得到的DNA序列进行同源性比对，并构建其系统发育进化树，如图3所示，J-27与热带醋杆菌4070同源性最高，分析确定菌株J-27为热带醋杆菌(Acetobacter tropicalis)。

实施例4乙醇耐受性

(1)种子液的制备：挑取纯化后的菌株接种于种子培养基中，30℃，220r/min摇瓶培养36h至数量级≥10⁸CFU/ml。按照10％(v/v)的接种量，接种到新鲜的种子培养基中30℃， 220r/min摇瓶培养36h制备二级种子液至数量级≥10⁸CFU/ml。

(2)将发酵培养基初始酒精度分别调整为6％、7％、8％、9％、10％、11％vol，接入10％的种子液，温度设定为30℃，转速为220r/min摇瓶培养36h，用722型紫外-可见分光光度计计在600nm波长下测定细胞培养液的吸光度(即OD值)。

如图4所示，热带醋杆菌J-27在酒精度大于10％vol后停止生长，故热带醋杆菌J-27能耐受的酒精度可达9％。

实施例5高酸度青梅酒的制备

青梅去核打浆，按料液比1：2加水，加入纤维素酶300U/100g青梅果浆，在50℃酶解2h，于95℃、5min灭酶，此时原料pH为2.3，用白砂糖调初始糖度至16％，焦亚硫酸钾120mg/kg，KHCO₃调pH＝2.7。

酿酒酵母ET008-c54接种量2.5×10⁷个/mL，20℃静置发酵，每天称重，至失重小于0.2g 发酵结束。此时发酵液酒精度为8.01％，总酸含量18.68g/L，总糖含量18.52g/L。

实施例6热带醋杆菌J-27和醋酸菌沪酿1.01发酵青梅醋性能比较

按照实施例2的方法，分别制备热带醋杆菌J-27和沪酿1.01的种子液，然后按照10％(v/v) 的接种量，将种子液分别接种到酒精度调节至6％vol的青梅酒中，30℃、220r/min摇瓶发酵，每天测定总酸含量，至总酸含量不再变化为止。

结果如图5所示，热带醋杆菌J-27产酸能力明显优于沪酿1.01，发酵7d后总酸含量达到45.51g/L，酒精转化率为58.17％，残存酒精度0.27％vol，而沪酿1.01发酵液中总酸含量为16.33g/L，酒精转化率为20.87％，残存酒精度2.96％vol，酒精发酵不彻底，其酒精转化率仅为热带醋杆菌J-27的35.9％。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一株热带醋杆菌及其在高酸度水果发酵醋中的应用

<130> BAA211088A

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1364

<212> DNA

<213> Acetobacter tropicalis

<400> 1

catgcagtcg cacgaaggtt tcggccttag tggcggacgg gtgagtaacg cgtaggaatc 60

tatccatggg tgggggataa ctctgggaaa ctggagctaa taccgcatga tacctgaggg 120

tcaaaggcgt aagtcgcctg tggaggagcc tgcgttcgat tagcttgttg gtggggtaat 180

ggcctaccaa ggcgatgatc gatagctggt ctgagaggat gatcagccac actgggactg 240

agacacggcc cagactccta cgggaggcag cagtggggaa tattggacaa tgggggcaac 300

cctgatccag caatgccgcg tgtgtgaaga aggttttcgg attgtaaagc actttcggcg 360

gggacgatga tgacggtacc cgcagaagaa gccccggcta acttcgtgcc agcagccgcg 420

gtaatacgaa gggggctagc gttgctcgga atgactgggc gtaaagggcg tgtaggcggt 480

ttgtacagtc agatgtgaaa tccccgggct taacctggga gctgcatttg atacgtgcag 540

actagagtgt gagagagggt tgtggaattc ccagtgtaga ggtgaaattc gtagatattg 600

ggaagaacac cggtggcgaa ggcggcaacc tggctcatga ctgacgctga ggcgcgaaag 660

cgtggggagc aaacaggatt agataccctg gtagtccacg ctgtaaacga tgtgtgctgg 720

atgttgggca acttagttgt tcagtgtcgt agctaacgcg ataagcacac cgcctgggga 780

gtacggccgc aaggttgaaa ctcaaaggaa ttgacggggg cccgcacaag cggtggagca 840

tgtggtttaa ttcgaagcaa cgcgcagaac cttaccaggg cttgtatgtg taggctgtgt 900

ccagagatgg gcattttccc gcaagggacc tacagcacag gtgctgcatg gctgtcgtca 960

gctcgtgtcg tgagatgttg ggttaagtcc cgcaacgagc gcaaccccta tcttwrkttg 1020

ccagcatgtt tgggtgggca cyytmkwrag agaagactgc cggtgacaag ccggaggaag 1080

gtggggatga cgtcaagtcc tcatggccct tatgtcctgg gctacacacg tgctacaatg 1140

gcggtgacag tgggaagcta gatggcgaca tcgtgctgat ctctaaaagc cgtctcagtt 1200

cggattgcac tctgcaactc gagtgcatga aggtggaatc gctagtaatc gcggatcagc 1260

atgccgcggt gaatacgttc ccgggccttg tacacaccgc ccgtcacacc atgggagttg 1320

gtttgacctt aagccggtga gcgaacccgc aaggggcgca gccg 1364

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

agagtttgat cctggctcag 20

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ggttaccttg ttacgactt 19

Claims (10)

1.热带醋杆菌(Acetobacter tropicalis)J-27，分类命名为热带醋杆菌，已于2021年07月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.22882。

2.含有权利要求1所述热带醋杆菌J-27的微生物制剂。

3.根据权利要求2所述的微生物制剂，其特征在于，热带醋杆菌J-27的含量≥1×10⁷CFU/mL，或≥1×10⁷CFU/g。

4.权利要求1所述的热带醋杆菌J-27或权利要求2～3任一所述的微生物制剂在高酸度水果发酵醋中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述高酸度水果发酵醋包括但不限于：青梅醋、山楂醋、石榴醋、猕猴桃醋、柠檬醋、枇杷醋。

6.根据权利要求4或5所述的应用，其特征在于，所述应用是将所述热带醋杆菌J-27或含有所述热带醋杆菌J-27的发酵剂用于高酸度水果原料的发酵；所述高酸度水果原料在发酵前经过了酶解、调糖、调酸的预处理。

7.一种青梅醋的发酵方法，其特征在于，包括如下步骤：将热带醋杆菌J-27的细胞培养液接种至酒精度不高于6％vol的青梅酒中，28～30℃发酵至少24h。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述青梅酒按如下方法制备：青梅去核打浆，调节料液比1：(2～3)，加入纤维素酶酶解，调pH≥2.7，白砂糖调糖至≥15％，接种酿酒酵母至数量级≥1×10⁷个/mL，静置发酵。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述纤维素酶酶解具体是：按200～400U纤维素酶/100g青梅果浆加入纤维素酶，在40～60℃酶解至少1h。

10.权利要求1所述的热带醋杆菌J-27或权利要求2～3任一所述的微生物制剂在制备发酵饮品或发酵调味品中的应用。

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