CN116103178B - 一种耐铜且高富集铜的毕赤酵母菌株及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于微生物领域、生物技术领域和畜牧与动物医学领域，提供了一种耐铜且高富集铜的毕赤酵母菌株及其应用。在本发明中，利用同源重组的方法，在巴氏毕赤酵母菌株X‑33的基础上，构建了过表达米曲霉来源的细胞色素b‑5还原酶基因Cyb5R的毕赤酵母工程菌，得到耐铜且高富集铜的巴氏毕赤酵母菌株X‑33‑Cyb5R，其能够在30℃条件下，以YPD为碳源，添加硫酸铜，实现高生物量生长以及高含量铜的富集，可作为饲粮抗生素替代物，具有绿色、环保、无污染、表达率高以及成本低等优势。

Description

一种耐铜且高富集铜的毕赤酵母菌株及其应用
技术领域
本发明属于微生物领域、生物技术领域和畜牧与动物医学领域，具体涉及一种耐铜且高富集铜的毕赤酵母菌株及其应用。
背景技术
铜（Cu）是一种资源丰富、成本低廉的过渡金属，是众多与生长发育等生物过程相关的酶的一部分，例如酪氨酸酶、对羟基苯基丙酮酸水解酶、多巴胺 β-羟化酶等，对生物有机体而言是必不可少的。在动物饲喂过程中，铜可以改善动物的性能，能够降低腹泻的患病率，改善脂肪消化率。铜纳米颗粒（CuNPs）由于其相对较低的毒性和优异的广谱抗菌活性，是一种很有潜力的饲用替代抗生素。在过去几年中，化学方法是合成CuNPs的最佳方法，因为在还原步骤中需要较少的能量，形成尺寸和形状精度较高的均匀颗粒。然而，化学方法对环境有害，因为使用了各种危险化学品（肼或酒石酸氢钾），这些化学品具有致癌性、遗传毒性和细胞毒性。因此，急需开发一种环境友好的CuNPs合成方法。
利用微生物（包括细菌、放线菌、真菌和酵母等）进行的生物介导合成已发展成为传统纳米颗粒合成方法的一种有希望的替代方法。其中，巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）是一种用途较广、研究较为深入的金属还原模型，能够通过与呼吸过程相关的直接电子转移、沉淀细胞外或细胞内的金属纳米颗粒，已经成功应用于银纳米颗粒和硒纳米颗粒的生物合成。虽然P. pastoris已被用作模型生物进行金属铜的吸附研究，但是P. pastoris本身对铜的耐受性和吸附能力较低，在一定程度上限制了P. pastoris
生物合成CuNPs的研究。因此提高P. pastoris的铜耐受和铜吸附含量是P. pastoris生物合成CuNPs研究的关键所在。
发明内容
本发明的目的在于构建一株耐铜的毕赤酵母菌株（Pichia pastoris），同时通过培养条件的优化，提高菌株对铜的富集含量。
为了克服现有技术不足，本发明提供了一株耐铜的巴斯德毕赤酵母菌株巴氏毕赤 酵母X-33-Cyb5R。X-33-Cyb5R菌株的出发菌株来源于野生型菌株巴氏毕赤酵母X-33。巴氏 毕赤酵母X-33-Cyb5R能够在30℃条件下，以YPD为培养基，在添加较高浓度硫酸铜下实现高生物量生长以此富集更多的铜，具有绿色、环保、无污染、表达率高以及成本低等优势。
本发明提供一种耐铜的巴氏毕赤酵母菌株X-33-Cyb5R。其是由野生型巴氏毕赤酵母菌株X-33通过用同源重组的方法过表达米曲霉来源的Cyb5R得到。优选地，所述细胞色素b-5还原酶基因Cyb5R的基因号为AO090003000873。
同时提供，所述的毕赤酵母菌株在饲料抗生素领域中的应用。
本发明提供一种饲用替代抗生素的制备方法，其通过在培养基中添加硫酸铜好氧发酵所述的毕赤酵母菌株得到。
优选地，其中用YPD作为碳源和能量来源，通过添加硫酸铜发酵所述毕赤酵母菌株。
进一步优选地，所述培养基中硫酸铜添加量浓度最高可达14 mmol/L，通常可以添加浓度为2-12 mmol/L，所述毕赤酵母菌株铜富集量最高可达27 mg/g DCW。所用硫酸铜溶液均过滤后使用。
更具体地，所述培养基以YPD培养基作为基础培养基，其组分：20 g/L葡萄糖、20g/L蛋白胨、10 g/L酵母浸粉，使用之前在115℃ 下灭菌20 min。
在具体实施方式中，发酵的培养条件为30℃、220 rpm。
本发明还提供由上述制备方法得到的饲用替代抗生素。
本发明与现有技术相比的有益效果是：
1.本发明提供的巴氏毕赤酵母X-33-Cyb5R对硫酸铜的耐受性可高达14 mmol/L。在12 mmol/L高浓度硫酸铜添加量条件下依旧保持较高生长速率，并且经过培养条件优化后铜富集含量可高达27 mg/g DCW。该菌株培养方法简单，后期生长迅速，适应性强，耐受性高。可作为饲粮抗生素替代物，具有良好的应用前景。
2.本发明提供的巴氏毕赤酵母X-33-Cyb5R在30℃、YPD+不同浓度硫酸铜条件下的生长均优于野生型巴氏毕赤酵母X-33。在30℃、YPD+12 mmol/L的高浓度硫酸铜条件下，其早期生长速率较巴氏毕赤酵母X-33提高97%。
3．在摇瓶培养条件下，本发明提供的巴氏毕赤酵母X-33-Cyb5R在30℃、YPD+不同浓度硫酸铜条件下对数中期的OD600均优于野生型巴氏毕赤酵母X-33。在30℃、YPD+12mmol/L的高浓度硫酸铜条件下，其OD600较巴氏毕赤酵母X-33提高16.84%。
4. 在摇瓶培养条件下，本发明提供的巴氏毕赤酵母-33-Cyb5R在30℃、YPD+不同浓度硫酸铜条件下的生物量均优于野生型巴氏毕赤酵母X-33。在30℃、YPD+12 mmol/L的高浓度硫酸铜条件下，其细胞干重较巴氏毕赤酵母X-33提高10.53%。
5. 在摇瓶培养条件下，本发明提供的巴氏毕赤酵母X-33-Cyb5R在30℃、pH为3、YPD+12 mmol/L硫酸铜条件下铜富集的含量可高达27 mg/g DCW。
因此，本发明得到的饲用替代抗生素可作为饲粮抗生素替代物，具有绿色、环保、无污染、表达率高以及成本低等优势。
附图说明
图1为米曲霉中所有编码Cyb5R基因在金属硒存在下的基因表达热图。
图2为pPICZA-Cyb5R质粒的构建图谱。
图3为AO090003000873基因改造菌株菌落PCR验证电泳图。
图4为改造菌株巴氏毕赤酵母X-33-Cyb5R与野生型巴氏毕赤酵母X-33在30℃、YPD+不同浓度硫酸铜(2,4,6,8,10,12 mmol/L) 下的OD600。
图5为改造菌株巴氏毕赤酵母X-33-Cyb5R与野生型巴氏毕赤酵母X-33在30℃、YPD+不同浓度硫酸铜(2,4,6,8,10,12 mmol/L) 下的细胞干重。
图6为改造菌株巴氏毕赤酵母X-33-Cyb5R与野生型巴氏毕赤酵母X-33在30℃、YPD+不同浓度硫酸铜(2,4,6,8,10,12 mmol/L) 下的铜富集含量。
图7为改造菌株巴氏毕赤酵母X-33-Cyb5R在30℃、YPD+12 mmol/L硫酸铜的不同pH条件下的铜富集含量。
具体实施方式
下面通过本发明的研发过程和具体实施方式进行介绍，但不构成对本发明的限制。
实施例1：Cyb5R基因的筛选和合成
本发明人前期研究米曲霉对金属硒的富集，并对硒富集前后的菌株进行了转录组分析。如图1所示，经金属硒（Se）处理后的米曲霉菌株中6个编码Cyb5R的基因在12h，24h和48h的表达量均高于空白对照组（BL）的表达量。其中，在米曲霉中的6个编码Cyb5R中的一个基因（KEGG数据库基因号为AO090003000873）对于金属硒的响应最为明显。因此，本发明进一步研究该基因，以探索其过表达是否有助于提高毕赤酵母对金属铜的耐受。
因此，从KEGG数据库中查询到米曲霉相关基因，获取基因序列，交由苏州金唯智生物科技有限公司对其进行克隆以及进行毕赤酵母的常规密码子优化，并在基因序列两端引入EcoRI和NotI粘性末端，再经过酶切、酶连手段连接到真核表达载体pPICZA的多克隆酶切位点，获得质粒pPICZA-Cyb5R（图2）。
实施例2：巴氏毕赤酵母X-33-Cyb5R菌株的构建
在本实施例中，通过同源重组的方法来实现对米曲霉来源的Cyb5R基因AO090003000873在野生型菌株巴氏毕赤酵母X-33中的整合表达。首先将质粒pPICZA-Cyb5R用Sac I单酶切，经纯化回收，获得线性化的pPICZA-Cyb5R片段。其次取10μL线性化的pPICZA-Cyb5R片段电转化进入100 μL 巴氏毕赤酵母X-33感受态细胞中，电击后立即加入1mL预冷的1mol/L的山梨醇，用移液枪轻轻吹打混匀。将电转化中的悬浮物移入1.5mL事先灭菌的离心管中，然后放入30℃摇床中培养1h。取10μL上述电击转化产物用涂布棒均匀的涂布于含有100 μg/mL Zeocin的YPD平板上，30℃恒温条件下培养72h。从YPD+Zeocin平板上挑取数个形态单一、长势良好的单菌落进行菌落PCR验证（图3）。其中泳道1为对照菌株巴氏毕赤酵母X-33的菌落PCR结果，泳道2-6为改造菌株巴氏毕赤酵母X-33-Cyb5R的菌落PCR结果。进一步通过基因测序证实Cyb5R基因成功整合到巴氏毕赤酵母X-33的基因组上。
实施例3：改造菌株巴氏毕赤酵母X-33-Cyb5R与野生型巴氏毕赤酵母X-33在不同硫酸铜浓度下早期生长速率的测定
使用全自动微生物生长曲线分析仪对巴氏毕赤酵母X-33-Cyb5R与巴氏毕赤酵母X-33在不同硫酸铜浓度条件下的生长进行评价，并进行早期生长速率的计算。将改造菌株巴氏毕赤酵母X-33-Cyb5R与野生型巴氏毕赤酵母X-33用新鲜的YPD+不同浓度的硫酸铜溶液 (0,2,4,6,8,10,12,14,20,40 mmol/L)培养基稀释至初始OD600=0.05，随后接入48孔板，每个样品做8个平行，每孔添加1 mL。用YPD+不同浓度的硫酸铜溶液的培养基为空白对照，于30℃、800 rpm条件下测定菌株的生长曲线，并计算其早期生长速率。结果如表1所示，随着硫酸铜浓度的增加，改造菌株巴氏毕赤酵母X-33-Cyb5R和野生型菌株巴氏毕赤酵母X-33的比生长速率均逐渐下降。但是在特定的硫酸铜浓度下，改造菌株巴氏毕赤酵母X-33-Cyb5R早期生长速率均高于野生型菌株X-33，例如在硫酸铜浓度为12 mmol/L时，改造菌株巴氏毕赤酵母X-33-Cyb5R早期生长速率较野生型菌株X-33提高97%；在硫酸铜浓度为14mmol/L时，改造菌株巴氏毕赤酵母X-33-Cyb5R依旧可以保持一定的生长速率，而此时野生型菌株巴氏毕赤酵母X-33已无法生长。这些数据表明，插入米曲霉来源的细胞色素b-5还原酶基因AO090003000873后，可以显著增强巴氏毕赤酵母X-33对铜的耐受性。
表1改造菌株巴氏毕赤酵母X-33-Cyb5R与野生型菌株巴氏毕赤酵母X-33在不同浓度硫酸铜条件下的早期生长速率
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注：GI表示生长受抑制。
实施例4：改造菌株巴氏毕赤酵母X-33-Cyb5R与野生型巴氏毕赤酵母X-33在不同硫酸铜浓度下OD600和细胞干重的测定
挑取单克隆菌株接种于装有100 mL YPD培养基的250 mL摇瓶中，在30℃、220 rpm条件下振荡培养24 h，制备种子液。以初始OD600=0.05接种于装有100 mL YPD+不同浓度硫酸铜 (2,4,6,8,10,12 mmol/L)培养基的250 mL摇瓶中，于30℃、220 rpm条件下继续培养36 h后进行取样，随后用紫外分光光度计测定OD600值（图4）。其次收集所有菌体于预先称重的无酶无菌的50 mL离心管中，采用低温低速离心 (4℃，5000 rpm，5 min)的方式去除培养基，再用ddH2O洗涤菌体3次除去残余的硫酸铜。处理好的菌体放置于烘箱中，在70℃环境中进行烘干，烘干完成后使用分析天平进行称重，并计算细胞干重，记录每组数据绘制干重图（图5）。从测定结果来看，在添加不同浓度的硫酸铜条件下，改造菌株X-33-Cyb5R的OD600和细胞干重始终高于野生型X-33，并且在硫酸铜添加量为12 mmol/L时，巴氏毕赤酵母X-33-Cyb5R对应的OD600较巴氏毕赤酵母X-33提高16.84%，其细胞干重较巴氏毕赤酵母X-33提高10.53%。
实施例5：改造菌株巴氏毕赤酵母X-33-Cyb5R与野生型巴氏毕赤酵母X-33在不同硫酸铜浓度下铜含量的测定
培养的方法与实施例4相同。培养36 h后进行收集菌体，收集方法与实施例4一致，处理好的菌体进行铜含量检测。根据EPA 3052生物样品使用微波辅助酸消化。简单地说，在PTEF容器中向样品中加入9 ml浓硝酸、1 ml发烟盐酸和2 ml H2O2。试剂在密封容器前反应约1 min。然后将管子放入微波炉 (Multiwave 3000™，PerkinElmer, USA)，加热至180°C至少15 min。冷却后，根据制造商的协议，使用ICP-OES (Optima, USA)分析TX-114富相中的铜来量化金属含量。从结果可以看出（图6），随着硫酸铜浓度的增加，改造菌株X-33-Cyb5R和野生型菌株X-33的铜富集含量均逐渐增加，并且在硫酸铜浓度为12 mmol/L的时候铜富集含量最高，均达到8.76 mg/g DCW。然而改造菌株X-33-Cyb5R在30℃、YPD+不同浓度硫酸铜 (2,4,6,8,10,12 mmol/L)条件下的铜富集含量较X-33并无明显差别。总的来说，过表达米曲霉来源的Cyb5R不会降低毕赤酵母菌株对铜的富集，并且能提高毕赤酵母菌株在硫酸铜存在下的生物量的积累，显著提升毕赤酵母菌株的耐铜性。
实施例6：改造菌株巴氏毕赤酵母X-33-Cyb5R在不同pH培养条件下铜含量的测定
根据实施例5的测定结果来看，改造菌株巴氏毕赤酵母X-33-Cyb5R在12 mmol/L硫酸铜的浓度下铜富集含量最高。在此条件下，我们设定了不同的pH梯度，进一步探索改造菌株巴氏毕赤酵母X-33-Cyb5R进行铜富集的最优培养条件。挑取单克隆菌株接种于装有100mL YPD培养基的250 mL摇瓶中，在30℃、220 rpm条件下振荡培养24 h，制备种子液。以初始OD600=0.05接种于装有100 mL YPD+12 mmol/L硫酸铜+不同pH (3,4,5,6,7) 培养基的250mL摇瓶中，于30℃、220 rpm条件下继续培养36 h后进行取样，随后进行铜含量测定的分析。测定方法与实施例5相同。从结果可以看出（图7），随着pH的升高，改造菌株巴氏毕赤酵母X-33-Cyb5R的铜富集含量均逐渐降低。在pH为3时，改造菌株巴氏毕赤酵母X-33-Cyb5R铜富集含量最高，能达到27 mg/gDCW。从该结果可以看出，低pH有利于促进改造菌株巴氏毕赤酵母X-33-Cyb5R对铜的吸附能力。

Claims (9)

1.一种耐铜且高富集铜的毕赤酵母菌株，其特征在于，其是通过同源重组的方法将米曲霉（Aspergillus oryzae）来源的细胞色素b-5还原酶基因Cyb5R在野生型巴氏毕赤酵母（Pichia pastoris）X-33菌株中的整合表达；所述细胞色素b-5还原酶基因Cyb5R在KEGG数据库中的基因号为AO090003000873。
2.如权利要求1所述的毕赤酵母菌株在制备铜纳米颗粒中的应用。
3.如权利要求1所述的毕赤酵母菌株在制备饲用替代抗生素中的应用。
4.一种饲用替代抗生素的制备方法，其特征在于，通过在基础培养基中添加硫酸铜好氧发酵如权利要求1所述的毕赤酵母菌株得到。
5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述基础培养基中硫酸铜添加浓度不超过14 mmol/L。
6.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述基础培养基为YPD培养基，所述毕赤酵母菌株的铜富集含量2-27 mg/g DCW。
7.如权利要求4至6任一项所述的制备方法，其特征在于，发酵培养的条件为20-32℃、200-240 rpm。
8.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，发酵培养的条件为30℃、220 rpm。
9.如权利要求4至8任一项所述的制备方法得到的饲用替代抗生素。
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