CN101802178A - 用于乙醇生产的嗜热微生物 - Google Patents
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Abstract
一种嗜热微生物，包含一种与野生型相比增加了淀粉酶表达和淀粉水解的修饰，其中所述修饰为插入一种异源淀粉酶基因。
Description
技术领域
本发明涉及适合用于生产乙醇的微生物的生产。具体而言，本发明涉及使微生物能够利用淀粉作为发酵底物的修饰。
背景技术
细菌代谢可以通过多种机制进行，取决于细菌的种类和环境条件。包括所有病原体在内的异养细菌由有机化合物的氧化来获取能量，碳水化合物(特别是葡萄糖)、脂质和蛋白质为最常见的可被氧化的化合物。细菌对这些有机化合物的生物氧化导致一种化学能源——ATP的合成。该过程还允许产生细菌细胞进行生物合成反应所需的更加简单的有机化合物(前体分子)。
淀粉是一种丰富的天然碳水化合物，并且是植物中主要的葡萄糖贮存络合物。淀粉分子由分别被称为直链淀粉和支链淀粉的两种多糖构成。直链淀粉为含500-20000个D葡萄糖单元的线性聚合物，其经由α-1，4糖苷键连接在一起形成螺旋结构。另外存在α-1，6糖苷键可形成支链淀粉，这种淀粉具有一个分支结构。淀粉通常包括20-30％的直链淀粉和70-80％的支链淀粉。在植物细胞中，不可溶的淀粉被包装成固体颗粒，其中支链淀粉聚集在晶质区域，而直链淀粉在整个颗粒的各处均有分布。淀粉的溶解度随温度而增加；支链淀粉晶体变成凝胶状，颗粒最终解体。
淀粉酶是一种钙依赖性糖苷水解酶类金属酶。存在三种形式的淀粉酶(α、β和γ)，所述淀粉酶的形式根据其水解的具体键而变化。α淀粉酶催化内部α-D-1，4糖苷键的随机水解，释放简单的发酵糖，包括葡萄糖、麦芽糖(由两个葡萄糖单元形成的二糖)。糊精(短的低分子量α-1，4-连接的D葡萄糖聚合物)由支链淀粉水解释放，而麦芽三糖和麦芽糖由淀粉酶水解释放。β淀粉酶从淀粉链的非还原端开始起作用，催化第二个α-1，4糖苷键的水解以切割出两个葡萄糖单元(麦芽糖)。γ淀粉酶具备切割支链淀粉中α-1，6键的能力。α淀粉酶在自然界中被广泛合成，理由是许多生物体可以消化淀粉。在人体生理学中，α淀粉酶主要存在于唾液和胰液中。微生物α淀粉酶分为溶解型(随机切割多糖以形成短链)或糖化型(产生单糖、二糖或三糖单元)，取决于对葡萄糖聚合物链进行水解的位点。
细菌对合适底物进行代谢的一般过程是糖酵解，它是将葡萄糖转化为丙酮酸并产生ATP的一系列反应。丙酮酸在产生代谢能过程中的代谢方向根据微生物和环境条件会不同。四种主要的丙酮酸反应在图1中示出。
第一种反应，在有氧条件下，许多微生物可利用柠檬酸循环并由丙酮酸脱氢酶(PDH)催化将丙酮酸转化为乙酰辅酶A产生能量。
第二种反应，在缺氧条件下，某些产乙醇的生物可以通过下述途径进行乙醇发酵：由丙酮酸脱羧酶(PDC)催化将丙酮酸脱羧成乙醛，并随后由乙醇脱氢酶(ADH)催化通过NADH将乙醛还原为乙醇。
第三种反应，也是在缺氧条件下，由丙酮酸甲酸裂解酶(PFL)催化将丙酮酸转化为乙酰辅酶A。乙酰辅酶A随后被乙醛脱氢酶(AcDH)转化为乙醛，并且由ADH催化通过还原乙醛产生乙醇。
第四种反应为通过乳酸脱氢酶(LDH)的催化将丙酮酸转化为乳酸。
目前利用微生物来生产乙醇的研究已受到诸多关注，这些研究利用了可进行天然无氧发酵的微生物或利用了整合有丙酮酸脱羧酶和乙醇脱氢酶基因的重组微生物。使用这类经修饰以增强对作为代谢底物的淀粉的利用的微生物，能够由廉价的、丰富的、未精制的植物材料有效地生产乙醇。
嗜热细菌已被提出用于乙醇生产，并且使用它们的优势是可使发酵在较高的温度下进行，这使得所产生的乙醇在50℃以上的温度下有可能作为蒸气移除；这还允许使用较高的底物浓度进行发酵。然而，需要用于由淀粉基培养基生产乙醇的改良微生物。
发明内容
根据本发明的第一方面，对一种嗜热微生物进行修饰以与野生型相比增加淀粉酶基因表达，其中第一种修饰为插入一种异源淀粉酶基因，该基因处于一种适合的启动子或一系列不同启动子的控制之下。
还可对所述微生物进行进一步修饰以使得乙醇生产增加，所述修饰为上调天然丙酮酸脱氢酶基因，以及使天然丙酮酸甲酸裂解酶和乳酸脱氢酶基因失活。
本发明的微生物与野生型相比显示出增强的淀粉水解和增加的乙醇生产。
根据本发明的第二方面，一种用于生产乙醇的方法包括，在存在淀粉的情况下，在适合的条件下培养根据上文的定义的微生物。
附图说明
参照附图来描述本发明，其中：
图1图解示出了糖酵解的代谢途径；
图2示出了pGEM-T
载体；
图3示出了推定的PDH复合体的启动子区域和基因；
图4示出了使用pTMO111对淀粉酶基因——amyS进行整合；
图5为amyS的核酸编码序列；
图6的曲线图示出了TM304菌株在5％w/v可溶性淀粉培养物中的分批发酵结果；和
图7的曲线图示出了TM333菌株在5％w/v可溶性淀粉培养物中的分批发酵结果。
具体实施方式
本发明基于对嗜热微生物进行修饰以使得淀粉酶基因表达增强。
淀粉酶基因表达的增加使得所述微生物可以将淀粉水解为葡萄糖单体单元，所述葡萄糖单体单元随后可以被用作糖分解底物用于形成丙酮酸，然后形成乙醇。增加淀粉酶表达和酶活性的方法优选地包括使用强的上游启动子来调节该基因的转录，以及整合表达频率高于天然淀粉酶基因的其他淀粉酶基因。
可对本发明的嗜热微生物进行进一步的修饰，以破坏天然乳酸脱氢酶基因的表达和上调PDH基因。
乳酸脱氢酶基因的失活有助于阻止丙酮酸分解为乳酸，从而通过使用丙酮酸脱羧酶和乙醇脱氢酶(在合适的条件下)促进丙酮酸分解为乙醇。优选地，通过基因内缺失或者通过基因缺失来破坏乳酸脱氢酶基因。
上调PDH基因可促进丙酮酸转化成乙酰辅酶A，在合适的条件下乙酰辅酶A可用于产生乙醛，并且最终使用乙醛脱氢酶产生乙醇。上调PDH的另一个优点是可降低丙酮酸水平，丙酮酸对葡萄糖摄取和糖酵解具有抑制效应。这也会促进乙醇的产生。
本文所定义的术语“强启动子”是指使对应蛋白的表达水平超过0.5％的细胞内可溶性蛋白的启动子。
所述微生物可以是任何嗜热微生物，但优选地，所述微生物为杆菌属(Bacillus)种。具体而言，所述微生物优选为地芽胞杆菌属(Geobacillus)种的野生型微生物，特别是热葡糖苷酶地芽孢杆菌(Geobacillus thermoglucosidasius)。
在优选的实施方案中，被选择进行修饰的微生物被称为“野生型”，即它们不是实验室产生的突变体。所述微生物可从预计含有嗜热生物的环境样品中分离。分离的野生型微生物具有有限的淀粉酶活性，但当在含有淀粉作为主要碳源的培养基中培养时该淀粉酶活性不足以进行乙醇生产。分离的野生型微生物具有从丙酮酸产生乙醇的能力，但由于没有经过修饰，乳酸可能会是主要的发酵产物。
优选地，本发明的微生物具有某些所需的特征，所述特征使得可在发酵过程中使用该微生物。所述微生物应优选地不具有限制系统，由此避免需要进行体内甲基化。优选地，所述微生物可以被高频率转化。此外，所述微生物应在至少3％w/v乙醇，优选至少5-10％w/v乙醇的条件下是稳定的。所述微生物在连续培养中的生长速率应能支持0.3h-1及以上的稀释速率。
所述微生物应是嗜热生物并可在40℃-85℃的温度范围内生长。优选地，所述微生物可在50℃-70℃的温度范围内生长。另外，微生物的理想生长条件在pH 7.2或以下，尤其是pH 4.5-pH 6.9。
所述培养基优选包含至少1％w/v的淀粉，优选至少10％w/v的淀粉，最优选至少20％w/v的淀粉。淀粉可以是可溶性的或不可溶的(例如谷物淀粉)。所述培养基的其他优选组分可包括但不限于表1中所列出的那些。
表1
| 化学药品 | Vol./L | 终浓度 |
| NaH2PO4.2H2O | 10ml | 20mM |
| K2SO4 | 20ml | 10mM |
| 柠檬酸.H2O | 8ml | 8mM |
| MgSO4.7H2O | 20ml | 5mM |
| 化学药品 | Vol./L | 终浓度 |
| CaCl2.2H2O | 4ml | 0.08mM |
| 硫酸盐微量元素储备溶液 | 5ml | 参见表2 |
| Na2MoO4.2H2O | 0.1ml | 1.65μM |
| (NH4)2SO4 | 12.5ml | 25μM |
| 1％生物素＊ | 0.3ml | 12μM |
| 40％葡萄糖＊＊ | 3×25ml | 3％w/v |
| 消泡剂 | 2.5ml |
＊通过在每10ml DMSO中溶解0.1g生物素来制备
＊＊葡萄糖终浓度优选地为1-4％w/v
硫酸盐微量元素储备溶液的组分在表2中示出。
表2
| 化学药品 | gl-1(ml) | 终培养基浓度 |
| 浓H2SO4 | 5.000 | |
| ZnSO4.7H2O | 1.440 | 25μM |
| Fe SO4.7H2O | 5.560 | 100μM |
| Mn SO4.H2O | 1.690 | 50μM |
| Cu SO4.5H2O | 0.250 | 5μM |
| Co SO4.7H2O | 0.562 | 10μM |
| Ni SO4.6H2O | 0.886 | 16.85μM |
| H3BO3 | 0.080 | |
| 去离子H2O(终体积) | 1000ml |
在一个优选的实施方案中，一种异源淀粉酶基因编码α-淀粉酶(α-1，4-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶，EC 3.2.1.1)。优选地，所述淀粉酶基因源自地芽胞杆菌属种，特别是嗜热脂肪地芽胞杆菌(Geobacillusstearothermophilus)。
α-淀粉酶的编码序列已被阐明，并且能够分离和扩增该基因的技术在本领域中是公知的。为了使得本发明的微生物与野生型相比能够表现出增加的淀粉酶表达，优选将所述淀粉酶基因置于强启动子的控制之下，所述强启动子在有利于嗜热微生物生产乙醇的低通气条件或缺氧条件下起作用。所述启动子优选为ldh启动子，其可以是自体同源的，但是优选是异源的，最优选来自与所述淀粉酶基因相同的物种。适合的启动子的实例包括但不限于嗜热脂肪地芽胞杆菌NCA1503的P_ldh、嗜热脂肪地芽胞杆菌DSM13240的P_ferrA和蜡质芽孢杆菌(B.cereus)ATCC14579的P_pfl。
在本发明的另一个实施方案中，将一系列不同的强启动子置于所述淀粉酶基因的上游以进一步增强表达。适合的强启动子的实例包括但不限于嗜热脂肪地芽胞杆菌NCA1503的甘油醛3-磷酸启动子(P_GAPDH)和淀粉酶启动子。
P_ldh的核酸序列也是已知的，并且用于将启动子序列克隆和组装到所述淀粉酶基因上游的技术是本领域技术人员公知的。
可以将启动子/淀粉酶序列克隆到均含有多个限制性酶切位点的适合质粒或表达载体中。存在许多市售的适合表达载体，例如Easy载体(图2)。可以使用限制性内切酶将所述P_ldh/淀粉酶构建体切割为特定的片段，所述片段可被连接至温度敏感型质粒如pUC19(New England Biolabs)的相应限制性酶切位点中。优选使用丙酮酸甲酸裂解酶敲除质粒。然后将含有所述淀粉酶基因/ldh启动子的质粒构建体电穿孔至本发明的微生物中，并且实现与基因组DNA的同源重组。可以根据染色体整合体对抗菌剂(如氨苄青霉素或卡那霉素)的抗性来对其进行选择。淀粉酶活性还可以例如在进行板测定时被显示为淀粉清亮区域。
在一个优选的实施方案中，还可通过使乳酸脱氢酶基因失活来对本发明的微生物进行进一步修饰。乳酸脱氢酶的核酸序列现在是已知的。技术人员通过使用该序列可以靶向乳酸脱氢酶基因以通过不同不同机制使该基因失活。可以通过插入转座子使乳酸脱氢酶基因失活。然而，优选通过缺失乳酸脱氢酶基因序列或该基因序列的一部分来使其失活。优选进行缺失，因为这可避免该基因序列被再激活的问题，使用转座子失活时经常会遇到这个问题。在一个优选的实施方案中，乳酸脱氢酶基因通过温度敏感型质粒(例如PCT/GB06/01586中所公开的质粒pUB190-ldh)的整合来失活，这实现了所述质粒与所述微生物染色体之间的天然同源重组或整合。可以根据染色体整合体对抗菌剂的抗性来对其进行选择。整合至乳酸脱氢酶基因可通过单次交叉重组事件或通过两次(或多次)交叉重组事件来进行。
在另一个优选的实施方案中，对所述微生物进行进一步修饰以上调PDH。PDH是一种大的酶复合体，包含三个单位——E1：丙酮酸脱羧酶(EC 1.2.4.1，非EC 4.1.1.1)、E2：二氢硫辛酰胺乙酰基转移酶和E3：二氢硫辛酰胺脱氢酶。该复合体需要几种辅因子，其中包括NAD、FAD、辅酶A硫辛酸和硫胺素焦磷酸(TPP)。四个基因编码该复合体，这是因为单位E1是α和β亚基的异源二聚体，这四个基因一般被称为pdhA、pdhB、pdhC和pdhD(分别对应于E1α、E1β、E2和E3)。PDH的单位E1以与PDC(EC 4.1.1.1)需要TPP的方式相同的方式需要TPP，并催化类似的脱羧反应，不同之处是在存在辅酶A和硫辛酸时——由其他酶单位进行——产物是乙酰辅酶A而不是乙醛。然而，在单位E1未与PDH中其他单位复合的时候，已经测定到了它的PDC活性(Lessard& Perham；The Journal of Biological Chemistry；1994，269：14，10378-10383；Tomar et al；Applied Microbiology and Biotechnology；2003，62，76-82；Frank et al；Science；2004，306：Oct 29，872-876，补充数据)。因此，可通过上调PDH提高EC 1.2.4.1的PDC活性，使得乙醛的产生超过及高于乙酰辅酶A。还寻求通过提高的PDH活性来消除出现于LDH失活株中的丙酮酸瓶颈，以使得产生更多的乙醇及更少的副产物乙酸和甲酸。
为此，使用标准的“基因组行走(genome walking)”技术分离了所述PDH基因和周围序列。分离到了约8.8kb的DNA，对其进行测序，发现其包含图3和表3中所示的以下基因。
表3
| 基因 | 位置(bp) | 推定的功能 | 阅读框(5’和3’氨基酸) | 大小(氨基酸) |
| pdf2 | 746-192 | 肽脱甲酰基酶 | -3(MIT-IER) | 184 |
| orf2 | 868-1497 | 未知功能-推定的蛋白质 | +1(MQR-IWK) | 209 |
| pdhA(α) | 1875-2984 | 丙酮酸氢化酶α-亚基 | +3(MGA-ESK) | 369 |
| pdhA(β) | 3003-3965 | 丙酮酸脱氢酶β-亚基 | +3(MIQ-INF) | 320 |
| pdhB | 4058-5368 | 二氢硫辛酰胺乙酰基转移酶 | +2(VAF-MEA) | 436 |
| lpd | 5373-6785 | 硫辛酰胺脱氢酶 | +3(MVV-ISK) | 470 |
| orf7 | 7432-6833 | 未知功能-推定的蛋白质 | -1(MNK-CTE) | 199 |
| orf8 | 7964-8647 | 转座酶 | +2(MDL-SPP) | 227 |
推定的启动子区域显示于图3中(箭头)——一个来自pdhA起始位点的上游区，以及pdhB前面可能的第二启动子。以前已经报道了枯草杆菌(Bacillus subtilis)的PDH簇中的第二启动子的实例(Gao et al；Journal of Bacteriology，2002，184：10，2780-2788)，但是大多数有记载的PDH基因簇仅具有一个位于簇上游的启动子(Neveling et al；BiochimicaActa；19981385，367-372)。可以使用本领域已知的技术进行所述上调。具体而言，上调可以通过在PDH复合体的上游引入合适的启动子或增强子序列进行。
已知该酶复合体在有氧和缺氧两种条件下都发挥功能(Carlsson etal；Infection and Immunity；1985，49：3，674-678)，但一般认为它是需氧酶(Ch 15；Principles of Biochemistry；Lehninger，Nelson & Cox；2nd Ed，Worth Publishers，New York，1993，p447)，并以丙酮酸甲酸裂解酶(PFL)为它的缺氧条件的对应物。这两种酶都将糖酵解中形成的丙酮酸转化成乙酰辅酶A，以进料至TCA循环，但TCA循环仅在有氧条件下完全工作。然而，由于需要使用无氧条件，因此本发明优选使用在缺氧条件下起作用的启动子。因此，可以使用被认为在缺氧条件下起作用的酶的启动子——实例有LDH启动子(来自嗜热脂肪地芽胞杆菌NCA1503的P_ldh)、PFL启动子(来自蜡质芽孢杆菌ATCC14579和热葡糖苷酶地芽孢杆菌NCIMB11955的P_pfl)和铁氧还蛋白启动子(来自嗜热脂肪芽胞杆菌DSM13240的P_ferrA)，如通过引用的方式纳入本文的PCT/GB2007/03699中所述。
在一个优选的实施方案中，引入另一个修饰以增强PDC活性，从而促进丙酮酸向乙醛的转化。这可以通过激活E2；二氢硫辛酰胺乙酰基转移酶(EC2.3.1.12)来实现。可以以类似于使LDH失活的方式进行失活，不同之处是E2基因作为破坏的靶位。
在另一个实施方案中，本发明的微生物还包含另一个修饰以使丙酮酸甲酸裂解酶基因失活，从而防止/减少丙酮酸向乙酰辅酶A和甲酸的转化。丙酮酸甲酸裂解酶(PFL)是丙酮酸脱氢酶(PDH)的“缺氧条件的对应物”，它将丙酮酸转化成乙酰辅酶A和甲酸(见图1)。虽然乙酰辅酶A可经乙醛脱氢酶(AcHD)转化成乙醇，但甲酸是一种可能会抑制产乙醇生物生长的不利的副产物。
选择PFL作为敲除的靶位，目的是为了促进代谢流向乙醇产生方向，并且是为了改良其余乙醇合成途径的氧化还原平衡。该工作的另一个优点是消除甲酸的产生。可以通过转座子插入、基因缺失或部分基因缺失来使PFL失活，以产生一个不依赖于抗生素选择来延续改变的表型的突变体。在该实施方案中，所述微生物优选同时包含乳酸脱氢酶的失活及丙酮酸脱氢酶的上调，从而使得在缺氧条件下乙醇产生增加。
在另一个优选的实施方案中，所述微生物将还包含异源丙酮酸脱羧酶和醇脱氢酶基因。这些异源基因的表达会产生能够重定向代谢方向以使得乙醇成为主要发酵产物的酶。这种基因可从通常进行无氧发酵的微生物中获得，所述微生物包含发酵单胞菌属(zymomonas)种，包含运动发酵单胞菌(zymomonas mobilis)。
制备这些基因并将其整合到微生物中的方法是已知的，例如见Ingram et al，Biotech & BioEng，1998；58(2+3)：204-214和US5916787，上述每篇文献的内容均通过引用的方式纳入本文。本领域技术人员应知晓，该基因可以被引入到质粒中或者被整合到染色体中。
可以通过使用可溶性淀粉作为原料的一部分来培养本发明微生物。可以根据已知的培养需求来选择温度、pH和其他生长条件。
现在将在下述实施例中参照附图描述本发明的一个实施方案。用于在热葡糖苷酶地芽孢杆菌NCIMB 11955基因组中生成嗜热脂肪地芽胞杆菌DSM22α-淀粉酶基因的整合体的两种方法在下文中示出。通过这些方法举例说明而非限制本发明。
实施例
淀粉酶基因的整合
方法1：使用源自现有克隆pGEM-LA的NotI片段的快速通道策略(Fast-track strategy)
通过使用本领域中公知的技术，利用PCR生成α-淀粉酶序列(amyS)并且将其连接至源自11955的ldh启动子(P_ldh)上。将该构建体克隆到市售的pGEM-T
表达载体中，生成pGEM-LA。如图2中所示，pGEM-T Easy载体中的连接位点侧接有多个限制性酶切位点。因此可以切割NotI/NotI片段上插入的P_ldh/淀粉酶序列。
将源自pGEM-LA的NotI片段连接到所述pfl敲除质粒构建体pTMO111的NotI位点中，以生成两种同胞质粒构建体pTMO139和pTMO140。和经由电穿孔将这些质粒导入到稳定的PFL阴性11955菌株TM242中。在68℃下选择推定的整合体。
通过以下方式测试原代转化体(自体同源质粒)和原代整合体的淀粉酶生产，即将其以补片(patch)形式于60℃下在TGP+0.4％可溶性淀粉平板上生长3天，然后用革兰氏碘溶液进行液泛。与DSM22对照相比，在这些菌株周围见到大的清亮区域(淀粉水解)。在该测试中TM242显示出远低于DSM22的微弱活性，表明存在某些背景活性。将原代整合体在不含卡那霉素的液体培养中传代培养，然后让菌落在TGP卡那霉素上复制，以鉴别潜在的双交叉突变体(DCO)。在TGP+0.4％可溶性淀粉上测试了总计32个卡那霉素敏感性菌落的淀粉酶活性(12孔Costar板，每孔中3ml，在60℃下培养3天)。除阳性对照DSM22外，没有大的清亮区域。大多数菌株显示出与TM242类似的微量清亮，但是5种显示出不大但仍然明显的清亮区域。对这些菌株中的两种——TM319和TM320的基因组制品进行诊断PCR，使用简并引物bamr66a和bamr72，所述引物是基于已知的芽胞杆菌PFL序列之间的序列同源性设计的。对于这两种菌株，均获得了一种约3.1kb的单PCR产物，将其用NotI消化会产生约0.6kb的双带和一条约2.0kb的带。这与预计的基因置换/插入一致。对照显示出预计的结果，由11955(野生型)获得未用NotI切割的约1.7kb的产物，以及由TM242获得约1.3kb的产物，所述1.3kb的产物用NotI消化时可产生约0.6kb的双带。因此，这些菌株(TM319和TM320)表明所述淀粉酶构建体整合到pfl基因座上。
方法2：生成带有P_ldh(NCA)启动子的淀粉酶构建体
用于将源自DSM22的淀粉酶编码序列置于P_ldh(NCA)控制之下的策略在图4中示出。pTMO31为一种含有插入至pUC19(NEB)多克隆位点(mcs)中的ECOR1/SnaB1 pUB110片段的质粒载体。
使用pGEM-LA构建体为模板，经由PCR将所述淀粉酶编码序列扩增为一条NdeI/NotI片段。使用pTMO49(通过将P_ldh(NCA 1503)克隆到pTM023中产生)为模板将P_ldh(NCA)扩增为一条NdeI/NotI片段，并且将产物克隆和组装到pTMO23(移除NdeI位点的pUC19)中以生成插入(基因置换)构建体pTMO146和pTMO147(同胞质粒)。表4详述了用于生成用于插入到11955中的P_ldh(NCA)/amyS构建体的PCR组分。
表4
| PCR片段 | 模板 | 引物 | 大小(bp) |
| AmyS cds NdeI/NotI | pGEM-LA | Bamr87Bamr88 | 1657+引物 |
| P_ldh(NCA)NotI/NdeI | pTMO49 | Bamr89Bamr38 | 180+引物 |
淀粉酶克隆的测序
将使用bamr87和bamr88寡核苷酸(参见表4)生成的淀粉酶编码序列的克隆PCR产物测序以检查完整性。对两个独立的克隆进行测序。每个均显示出不同的单碱基对突变，其大概是通过PCR引入的。选择使用的克隆为pTMO135(将PCR产物平端连接到pTMO23的SmaI位点中得到)。如利用公开的嗜热地芽胞杆菌(G.kaustophilus)的密码子选择所判断的，该克隆中的PCR诱导突变代表一种沉默突变，显示出相同的氨基酸和类似的密码子选择。源自pTMO135的淀粉酶编码序列(删除起始密码子)在图5中示出。对应于该序列与所述公开的DSM22 amyS序列(登录号M57457)之间差异的核苷酸用下划线标出。在所述pTMO135序列(覆盖15bp)和所公开的DSM22amyS序列(M57457)之间存在9个差异。在位置1449处的错配代表pTMO135中的PCR诱导的突变。
对pTMO139(其具有源自pGEM-LA的NotI片段)中的淀粉酶插入片段的测序结果显示与pTMO135完全一致(除所述第1449bp处突变外)。然后利用PCR直接从嗜热脂肪地芽胞杆菌DSM22基因组DNA(该菌株获取自DSMZ收藏中心(DSMZ collection))中扩增所述淀粉酶编码序列。将所获得的PCR产物(使用上文所述的bamr87和88寡核苷酸)克隆至pTMO23中(以产生pTMO145)并且将其测序。除第904bp之外，该序列与pTMO135(除第1449bp突变之外)和pTMO139相同。在pTMO135和pTMO139中，第904bp为“A”，而在pTMO145中为“G”。这样在该位置会引入一个从天冬氨酸向天冬酰胺的突变。已证明该密码子(天冬氨酸的GAC)在所有检测的地芽孢杆菌淀粉酶序列中都是保守的，因此这可能是在从DSM22通过PCR克隆淀粉酶序列过程中引入的一个突变。所述序列中的其他差异不得不认为是所述公开序列中的错误；与其他地芽孢杆菌淀粉酶序列的比对表明该序列(即在pTMO135和pTMO145中)远比所述公开序列(M57457)更接近共有序列。
尽管存在所述904突变，仍然使用pTMO145和pTMO146构建体继续进行实验研究，因为很显然源自pGEM-LA的所述克隆NotI片段确实在淀粉平板上显示出了明显的淀粉酶活性。
pTMO145和pTMO146(P_ldh(NCA)/amyS)的DCO的生成和表征
通过电穿孔将pTMO145和pTMO146导入TM242中，并且如上文所示步骤选择推定的双交叉(DCO)突变体。用平板测定法测试了总计48个推定DCO(卡那霉素敏感的)的淀粉酶活性。18个给出非常强的淀粉酶活性(其他看上去与对照TM242类似)。当被贴到较大的扇形板上时，其显示出至少与DSM22对照一样大的清亮区域。选择这些菌株中的四种——TM304、TM305、TM311和TM315，用于进一步的研究。制备基因组DNA，用于诊断PCR。所有四种菌株的结果均表明amyS基因插入到pfl基因座上。首先以葡萄糖作为碳源，然后以可溶性淀粉作为碳源，在ASYE(0.5％)中测试了两种淀粉酶突变体菌株——TM304和TM305的乙醇产生。测试分别在低充气条件和高充气条件下进行。结果在表5中示出。在高和低充气模型中，TM304和TM305从可溶性淀粉产生的乙醇量都与从葡萄糖产生的乙醇量相当。TM242使用淀粉产生的乙醇水平明显低于使用葡萄糖，但是该效应在较高充气条件下非常不明显。但使用葡萄糖进行培养时，TM304和TM305产生的乙醇量与TM242类似，而当用淀粉培养这三种菌株时，显而易见的是，TM304和TM305的超强的淀粉酶功能使得这些微生物可以将基本上全部的淀粉转化为乙醇。在低充气条件下，使用淀粉产生乙醇的水平与使用葡萄糖产生乙醇的水平几乎相同，而TM242由淀粉产生乙醇的能力约为其将葡萄糖转化为乙醇的能力的三分之一。
表5
| 菌株 | 碳源 | O2 | 葡萄糖 | 乙醇 | 乙酸 | 淀粉＊ |
| TM304 | 2％葡萄糖 | 低 | 15.9 | 144.6 | 3.1 | |
| TM305 | 2％葡萄糖 | 低 | 14.3 | 141.8 | 3.4 | |
| TM242 | 2％葡萄糖 | 低 | 8.7 | 142.7 | 3.8 | |
| TM304 | 2％可溶性淀粉 | 低 | 3.8 | 138.4 | 4.1 | |
| TM305 | 2％可溶性淀粉 | 低 | 4.6 | 135.9 | 3.8 | |
| TM242 | 2％可溶性淀粉 | 低 | 0.0 | 52.5 | 7.6 | 是 |
| TM304 | 2％葡萄糖 | 高 | 18.2 | 113.4 | 19.7 | |
| TM305 | 2％葡萄糖 | 高 | 10.4 | 119.8 | 20.8 | |
| TM242 | 2％葡萄糖 | 高 | 7.9 | 127.8 | 17.3 | |
| TM304 | 2％可溶性淀粉 | 高 | 16.8 | 98.9 | 20.7 | |
| TM305 | 2％可溶性淀粉 | 高 | 6.7 | 117.9 | 25.2 | |
| TM242 | 2％可溶性淀粉 | 高 | 6.5 | 78.0 | 23.5 | 是 |
＊对残余淀粉进行测试；0.5ml培养物+0.2ml革兰氏碘。除那些标记的之外均为阴性。
接种物；100μl冷冻储液
接种；50ml锥形管中的10ml 2TY，52℃ O/N，250rpm，1ml转移缓冲液(10％)
生产；15或20ml falcon管中的10ml ASYE(0.5％)+C源，60℃，250rpm，24小时
在5％w/v可溶性淀粉中培养的菌株TM304的分批发酵结果在图6中示出。使用革兰氏碘进行的简单测试表明，DCO与TM242不同，它水解了所有的淀粉。这些结果清楚地支持了处于P_ldh(NCA)启动子控制之下的插入异源淀粉酶对于低充气条件下淀粉利用的实用性。
pTMO150和pTMO151(P_ldh(NCA)/amyS-无突变)的DCO的生成和表征
将源自DSM22基因组DNA的新amyS PCR产物用于生成“空白”DCO构建体，命名为pTMO150和pTMO151。这两种质粒含有以反方向插入至pfl基因中的P_ldh(NCA)。pTMO150中的与pfl转录方向相同。pTMO151中的与pfl方向相反，如pTMO146和pTMO147中的P_ldh(NCA)那样。从两种质粒形成DCO，并通过PCR验证源自每种质粒的两个突变体(源自pTMO150的TM328和329，源自pTMO151的TM333和335)。对两种淀粉酶突变体——TM304和TM305进行了测试。首先以2％w/v葡萄糖作为碳源，然后以2％w/v可溶性淀粉作为碳源，最后以3％w/v可溶性淀粉作为碳源，在ASYE(0.5％)中在低充气条件下测试所有四种突变体菌株以及TM304、TM305和TM242的乙醇产生。
表6中所示的结果表明，所有突变体菌株在2％w/v可溶性淀粉中表现得基本同样好，产生的乙醇量为亲株TM242的两倍多。在3％w/v淀粉中，TM333产生了比其他突变体更多的乙醇以及在淀粉板上更大的清亮区域，表明TM333可能是优于TM304的乙醇生产菌株。
表6
| 菌株 | C源 | 葡萄糖(mM) | EtOH(mM) | 淀粉区域 |
| TM328 | 2％葡萄糖 | 25.1 | 128.6 | 852 |
| TM329 | 2％葡萄糖 | 26.7 | 121.3 | 871 |
| TM333 | 2％葡萄糖 | 12.7 | 135.4 | 871 |
| TM335 | 2％葡萄糖 | 37.5 | 102.8 | 860 |
| TM304 | 2％葡萄糖 | 3.9 | 149.8 | 882 |
| TM305 | 2％葡萄糖 | 9.5 | 151.5 | 886 |
| TM242 | 2％葡萄糖 | 20.4 | 130.8 | 879 |
| TM328 | 2％淀粉 | 5.0 | 127.5 | 1817 |
| TM329 | 2％淀粉 | 4.8 | 132.2 | 1816 |
| TM333 | 2％淀粉 | 4.8 | 133.3 | 1626 |
| TM335 | 2％淀粉 | 12.0 | 124.8 | 1836 |
| 菌株 | C源 | 葡萄糖(mM) | EtOH(mM) | 淀粉区域 |
| TM304 | 2％淀粉 | 6.7 | 135.0 | 1727 |
| TM305 | 2％淀粉 | 6.6 | 136.1 | 1716 |
| TM242 | 2％淀粉 | 0.0 | 62.2 | 3803 |
| TM328 | 3％淀粉 | 13.9 | 139.3 | 2817 |
| TM329 | 3％淀粉 | 14.1 | 137.4 | 2824 |
| TM333 | 3％淀粉 | 30.6 | 151.3 | 2333 |
| TM335 | 3％淀粉 | 16.9 | 121.4 | 2991 |
| TM304 | 3％淀粉 | 31.0 | 141.2 | 2440 |
| TM305 | 3％淀粉 | 30.0 | 140.1 | 2510 |
| TM242 | 3％淀粉 | 0.0 | 75.6 | 6306 |
这些结果被TM333分批发酵(在与菌株TM304发酵相同的条件下进行(图6))的结果支持，在图7中示出，并且这些结果表明TM333能够利用从淀粉释放的全部葡萄糖。
进行比较测试以确保突变体菌株TM304和TM333以与亲株TM242类似的方式进行，并且没有形成任何不需要的突变。结果在表7A和7B中示出。
表7A
| 菌株 | 充气转换 | 完成糖消耗的时间(小时) | OD | 剩余的葡萄糖/mM | 丙酮酸/mM | 乳酸/mM |
| TM304 | 3小时/OD5.9 | 6.2 | 10.1 | 0 | 1 | 8 |
| TM333 | 3小时/OD5.5 | 7.4 | 9.1 | 0 | 1 | 10 |
| TM242 | 2.5小时/OD5.6 | 7.5 | 9.8 | 0 | 1 | 10 |
表7B
| 菌株 | 甲酸/mM | 乙酸/mM | 乙醇/mM | 转换为缺氧条件后的乙醇产量g/g | 总乙醇产量：乙醇峰值 |
| TM304 | 0 | 12 | 336 | 0.41 | 0.40 |
| TM333 | 0 | 16 | 293 | 0.44 | 0.38 |
| TM242 | 0 | 13 | 314 | 0.44 | 0.42 |
序列表
<110>TMO可再生能源有限公司
<120>用于乙醇生产的嗜热微生物
<130>JWJ01370WO
<140>0715751.4
<141>2007-08-13
<160>1
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>1654
<212>DNA
<213>嗜热脂肪地芽抱杆菌(Geobacillus stearothermophilus)
<400>1
ctaacgtttc accgcatcat tcgaaaagga tggatgttcc tgctcgcgtt tttgctcact 60
gccttgctgt tctgcccaac cggacagccc gccaaggctg ccgcaccgtt taacggcacc 120
atgatgcagt attttgaatg gtacttgccg gatgatggca cgttatggac caaagtggcc 180
aatgaagcca acaacttatc cagccttggc atcaccgctc tttggctgcc gcccgcttat 240
aaaggaacaa gccgcagcga cgtagggtac ggagtatacg acttgtatga cctcggtgaa 300
ttcaatcaaa aaggggccgt ccgcacaaaa tacggaacaa aagctcaata tcttcaagcc 360
attcaagccg cccacgccgc tggaatgcaa gtgtacgccg atgtcgtgtt cgaccataaa 420
ggcggcgccg acggcacgga atgggtggac gccgtcgaag tcaatccgtc cgaccgcaac 480
caagaaatct cgggcaccta tcaaatccaa gcatggacga aatttgattt tcccgggcgg 540
ggcaacacct actccagctt taagtggcgc tggtaccatt ttgatggcgt tgattgggac 600
gaaagccgaa aattgagccg catttacaaa ttccgcggca tcggcaaagc gtgggattgg 660
gaagtagaca cggaaaacgg aaactatgac tacttaatgt atgccgacct tgatatggat 720
catcccgaag tcgtgactga gctgaaaagc tgggggaaat ggtatgtcaa cacaacgaac 780
attgatgggt tccggcttga tgccgtcaag catattaagt tcagtttttt tcctgattgg 840
ttgtcgtatg tgcgttctca gactggcaag ccgctattta ccgttgggga atattggagc 900
tataacatca acaagttgca caattacatt atgaaaacaa acggaacgat gtctttgttt 960
gatgccccgt tacacaacaa attttatacc gcttccaaat cagggggcac atttgatatg 1020
cgcacgttaa tgaccaatac tctcatgaaa gatcaaccaa cattggccgt caccttcgtt 1080
gataatcatg acaccgaacc cggccaagcg ctgcagtcat gggtcgaccc atggttcaaa 1140
ccgttggctt acgcctttat tctaactcgg caggaaggat acccgtgcgt cttttatggt 1200
gactattatg gcattccaca atataacatt ccttcgctga aaagcaaaat cgatccgctc 1260
ctcatcgcgc gcagggatta tgcttacgga acgcaacatg attatcttga tcactccgac 1320
atcatcgggt ggacaaggga aggggtcact gaaaaaccag gatccggact ggccgcattg 1380
atcaccgatg ggccgggagg aagcaaatgg atgtacgttg gcaaacaaca cgccggaaaa 1440
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ggggaattca aagtcaatgg cggttcggtt tcggtttggg ttcctagaaa aacgaccgtc 1560
tctactatcg cttggtcgat cacaacccga ccgtggactg atgaattcgt ccgttggacc 1620
gaaccacggt tggtggcatg gccttgatgc ctgc 1654
Claims (41)
1.一种嗜热微生物，包括一种与野生型相比增加淀粉酶基因表达的修饰。
2.权利要求1的微生物，其中所述修饰为将一种异源淀粉酶基因插入至所述嗜热微生物的基因组中，该基因处于一个适合的启动子的控制之下。
3.权利要求2的微生物，其中所述启动子在缺氧条件下起作用。
4.权利要求3的微生物，其中所述启动子为ldh启动子。
5.权利要求4的微生物，其中所述ldh启动子为自体同源的。
6.权利要求4的微生物，其中所述ldh启动子为异源的。
7.权利要求6的微生物，其中所述ldh启动子来源自嗜热脂肪地芽胞杆菌(Geobacillus stearothermophilus)。
8.权利要求2的微生物，其中所述淀粉酶处于一系列强启动子的控制之下。
9.权利要求8的微生物，其中所述强启动子为异源的。
10.权利要求9的微生物，其中所述强启动子包括3-磷酸甘油醛脱氢酶启动子。
11.权利要求9的微生物，其中所述强启动子包括淀粉酶启动子。
12.权利要求10或11的微生物，其中所述启动子来源自嗜热脂肪地芽胞杆菌。
13.前述权利要求任一项的微生物，还包含一种使天然乳酸脱氢酶基因失活的修饰。
14.权利要求13的微生物，其中所述乳酸脱氢酶基因或其一部分已被缺失。
15.权利要求13或其从属权利要求的微生物，其中所述微生物的乳酸脱氢酶基因中不含整合元件。
16.前述权利要求任一项的微生物，还包含一种使天然丙酮酸甲酸裂解酶基因失活的修饰。
17.权利要求16的微生物，其中所述丙酮酸甲酸裂解酶基因或其一部分已被缺失。
18.前述权利要求任一项的微生物，还包括一种上调丙酮酸脱氢酶基因的修饰。
19.权利要求18的微生物，其中将一个基因启动子插入至所述丙酮酸脱氢酶基因的上游，并且其中所述启动子在缺氧条件下起作用。
20.前述权利要求任一项的微生物，还包含一种上调丙酮酸脱羧酶活性的修饰。
21.权利要求20的微生物，其中所述修饰使天然二氢硫辛酰胺乙酰基转移酶基因(EC 2.3.1.12)失活。
22.权利要求20或21的微生物，其中所述二氢硫辛酰胺乙酰基转移酶基因或其一部分已被缺失。
23.前述权利要求任一项的微生物，其中所述淀粉酶基因来源自地芽胞杆菌属(Geobacillus)种。
24.前述权利要求任一项的微生物，其中所述淀粉酶基因来源自嗜热脂肪地芽胞杆菌。
25.前述权利要求任一项的微生物，其中所述淀粉酶基因编码α淀粉酶(EC 3.2.1.1)。
26.前述权利要求任一项的微生物，其中所述微生物为地芽胞杆菌属种。
27.前述权利要求任一项的微生物，其中所述微生物为热葡糖苷酶地芽孢杆菌(Geobacillus thermoglucosidasius)。
28.前述权利要求任一项的微生物，其中所述微生物含有异源丙酮酸脱羧酶基因。
29.前述权利要求任一项的微生物，其中所述微生物含有异源乙醇脱氢酶基因。
30.前述权利要求任一项的微生物，其中所述微生物不含有限制系统。
31.前述权利要求任一项的微生物，其中所述微生物在含有最高达10％w/v乙醇的培养基中是稳定的。
32.前述权利要求任一项的微生物，其中所述微生物可以被高频率转化。
33.前述权利要求任一项的微生物，其中所述微生物在40℃至85℃，优选50℃至70℃的温度下生长。
34.一种用于乙醇生产的方法，包括在存在淀粉的情况下在适合条件下培养前述权利要求任一项的微生物。
35.权利要求34的方法，其中所述培养基含有至少1％w/v的淀粉。
36.权利要求34或35的方法，其中所述培养基含有至少10％w/v的淀粉。
37.权利要求34至36任一项的方法，其中所述培养基含有至少20％w/v的淀粉。
38.权利要求34至37任一项的方法，其中所述方法在40℃至70℃的温度下实施。
39.权利要求38的方法，其中所述温度为52℃至65℃。
40.权利要求34至39任一项的方法，其中所述微生物被保持于pH为4至7.5的培养物中。
41.一种动物饲料，含权利要求1至33任一项的微生物。
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