WO2016093294A1 - アルコールの製造方法 - Google Patents

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WO2016093294A1
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alcohol
pathway
microorganism
producing
pentose
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PCT/JP2015/084599
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郁 雨貝
健司 澤井
亮太 合庭
山田　勝成
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東レ株式会社
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    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
    • C12P7/06—Ethanol, i.e. non-beverage
    • C12P7/065—Ethanol, i.e. non-beverage with microorganisms other than yeasts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
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    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
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    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
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    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
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    • Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing alcohol from a raw material containing a pentose using a microorganism having an enhanced Entner-Doudoroff (ED) pathway.
  • ED Entner-Doudoroff
  • hexose hexose
  • pentose pentose
  • various carbohydrates such as triose
  • various organic acids and alcohols
  • hexose include glucose, fructose, mannose, sorbose, galactose and the like.
  • pentose include arabinose, xylose, ribose and the like.
  • carbohydrates mentioned above and other conventional carbon sources currently used in the industry are somewhat more expensive. Therefore, lower cost alternative alcohol production sources are desired.
  • Cellulosic biomass is readily available and is cheaper than carbohydrates, corn, sugarcane or other carbon sources, so it is a suitable raw material for alcohol and organic acid production, cellulose in biomass, hemicellulose,
  • the usual amount of lignin is approximately 40-60% cellulose, 20-40% hemicellulose, 10-25% lignin, and 10% other components.
  • the cellulose fraction is composed of a polymer of hexose, usually glucose.
  • the hemicellulose fraction is mainly composed of pentose containing xylose and arabinose.
  • microorganisms used for alcohol production include yeasts of the genus Saccharomyces and bacteria of the genus Zymomonas. Usually, these microorganisms produce alcohol efficiently from sugars such as glucose, but cannot produce alcohol from pentose sugars such as xylose and arabinose. Therefore, in order to improve the yield of alcohol production using biomass as a raw material, an enzyme or gene involved in pentose metabolism is introduced into the microorganism used for alcohol production, and alcohol is produced using the pentose sugar as a substrate. There is a need to construct transformed microorganisms that can.
  • Patent Document 1 discloses that a microorganism capable of producing ethanol from xylose and arabinose was constructed by transforming a gene associated with metabolism of xylose and arabinose into a bacterium belonging to the genus Zymomonas.
  • Patent Document 2 discloses a yeast in which a gene involved in xylose metabolism is introduced into a yeast of the genus Saccharomyces and xylose is used as a sugar source to improve the fermentation yield of ethanol.
  • ED Entner-Doudoroff
  • EDD 6-phosphoglucone sundehydratase
  • 2-keto-3-deoxy-6-phosphogluconic acid catalyze the reaction of 6-phosphogluconic acid to 2-keto-3-deoxy-6-phosphogluconic acid. It consists of aldolase (EDA).
  • Patent Document 3 an attempt is made to introduce a gene related to the Entner-Doudoroff (ED) pathway into yeast of the genus Saccharomyces, reinforce the metabolic pathway of glucose, and improve ethanol fermentation via the Entner-Doudoroff (ED) pathway.
  • ED Entner-Doudoroff
  • Patent Document 4 discloses an attempt to improve the efficiency of isobutanol production from glucose by introducing a gene related to the Entner-Doudoroff (ED) pathway into Escherichia coli.
  • the main sugar component obtained by hydrolyzing cellulosic biomass is a mixture of hexose glucose, pentose xylose, and arabinose.
  • pentose sugars such as a method for producing alcohol from pentose-containing raw materials by microbial fermentation, has been studied. There was a problem in being low.
  • the present inventors have found that the ability to produce alcohol from a raw material containing a pentose can be improved by using a microorganism having an enhanced Entner-Doudoroff (ED) pathway, and thus completed the present invention. It was.
  • ED Entner-Doudoroff
  • the present invention is as follows (1) to (7).
  • the method for producing alcohol is characterized in that the yield of sugar consumed with respect to alcohol is improved as compared with that before strengthening the ED pathway.
  • the microorganism is at least one selected from the group consisting of glucose-6-phosphate dehydrogenase, 6-phosphogluconolactonase, phosphogluconate dehydratase and 2-dehydro-3-deoxy-6-phosphogluconate aldolase.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing a reaction pathway in activity measurement of the Entner-Doudoroff (ED) pathway.
  • the microorganism used in the present invention is a microorganism capable of producing alcohol as a main product from a raw material containing a pentose and having enhanced Entner-Doudoroff (hereinafter abbreviated as ED).
  • the “raw material containing pentose” refers to a hexose such as glucose, mannose, galactose and fructose in addition to pentose such as xylose, arabinose, ribulose, ribose and xylulose as a carbon source.
  • the raw material includes disaccharides such as sucrose, lactose, maltose, trehalose, cellobiose, or saccharides such as glycerol, but is not limited thereto.
  • “as a main product” means that a microorganism produces alcohol at least 20% or more.
  • “alcohol” means, for example, ethanol, butanol, isobutanol, 1,2-butanediol, 1,3-butanediol, 1,4-butanediol, butanediol including 2,3-butanediol,
  • Examples include methanol, sugar alcohols such as erythritol, sorbitol, and xylitol, 1,3-propanediol, glycerol, and the like, preferably ethanol, isobutanol, butanol, xylitol, and more preferably ethanol.
  • the fact that alcohol can be produced from a raw material containing pentose refers to the ability to assimilate and metabolize the pentose present in the medium when the microorganism of the present invention is cultured.
  • specific examples of the pentose assimilation ability include, but are not limited to, the assimilability of pentose sugars such as xylose, arabinose, ribulose, ribose and xylulose.
  • the pentose sugar assimilation ability may be a natural property of microorganisms, and is a property imparted or enhanced by breeding to microorganisms that do not inherently have pentose sugar utilization properties. May be.
  • the breeding used in the present invention includes techniques such as mutation, cell fusion, and gene recombination. Mutation techniques include drug treatment and ultraviolet treatment.
  • the following gene fragment encoding the enzyme related to assimilation of pentose can be introduced into a microorganism, or expression regulation of a gene promoter, etc.
  • the sequence can be replaced with a powerful one.
  • enzymes relating to pentose assimilation include xylose isomerase (XI), xylose reductase (XR), and xylose dehydrogenase (XDH).
  • Microorganism having inherent catabolism of a pentose is, Escherichia coli, Bacillus subtilis, Bacillus palidus, Bacillus stearothermophilus, Salmonella typhimurium, Mycobacterium smegmatis, Azospirillum brasiliense, Herbaspirillum seropedicae, Bifidobacterium longum, Trichoderma reesei, Lactobacillus plantarum, Ambrosiozyma monospora, Burkholderia uboniae, and also Pichia Guilliemondi, cheffersomyces stipitis (Pichia stipitis), Candida arabinofermentans, Candida intermedia, Candida tropicalis, Candida parapsilosis, Kluyveromyces maxianus, Brettanomyces bruxellensis, and the like Bretannomyces naardenensis. Breeding includes techniques such as mutation, cell fusion, and gene recombination
  • microorganism with enhanced Entner-Doudoroff (ED) pathway refers to a microorganism with an enhanced ED pathway by breeding as compared to a microorganism having a gene related to the ED pathway as an inherent property of the microorganism. It may be a microorganism that has been imparted and / or enhanced by breeding with respect to a microorganism that does not inherently have an ED pathway.
  • the genes related to the ED pathway include 6-phosphogluconate dehydratase (hereinafter abbreviated as EDD), 2-keto-3-deoxy-6-phosphogluconate aldolase (hereinafter abbreviated as EDA), glucose-6-phosphate dehydrogenase. (Hereinafter abbreviated as ZWF), a gene encoding 6-phosphogluconolactonase (hereinafter abbreviated as PGL).
  • EDD 6-phosphogluconate dehydratase
  • EDA 2-keto-3-deoxy-6-phosphogluconate aldolase
  • ZWF glucose-6-phosphate dehydrogenase
  • PGL 6-phosphogluconolactonase
  • a microorganism with enhanced ED pathway means that the activity of EDD and / or EDA and / or ZWF and / or PGL per cell is higher than that before enhancing the ED pathway. For example, when the number of EDD or EDA or ZWF or PGL molecules per cell increases, or when the specific activity of EDD or EDA or ZWF or PGL per EDD or EDA or ZWF or PGL molecule increases.
  • the method of measuring the activity of the ED pathway is determined, for example, by measuring the activity of a reaction that produces pyruvic acid from 6-phosphogluconic acid via 2-keto-3-oxy-6-phosphogluconic acid. Can do.
  • the reaction can be detected by the amount of NADH that decreases when 6-phosphogluconic acid is reacted with the cell disruption solution and the produced pyruvic acid is converted to lactic acid by lactate dehydrogenase.
  • a method for enhancing EDD activity and / or EDD activity and / or ZWF activity and / or PGL activity of a microorganism is not particularly limited.
  • a gene fragment encoding EDD and / or EDA and / or ZWF and / or PGL May be ligated to a vector that functions in the target microorganism, preferably a multi-copy type vector, to produce a recombinant DNA, which may be introduced into the microorganism.
  • gene fragments encoding EDD and EDA and ZWF and PGL may be separately mounted on different vectors, but they are mounted on the same vector. It is preferable to do.
  • genes derived from microorganisms having the ED pathway can be used as the genes edd and eda, zwf and pgl encoding the enzymes EDD and EDA and ZWF and PGL constituting the ED pathway, respectively. Specifically, it has been cloned from Escherichia coli, Zymomonas mobilis, and the like. PCR using primers prepared based on the sequences of these genes (PCR: white, TJ et al., Trends Genet. 5, 185 (1989)), or probes prepared based on the sequences of the above genes The edd and eda and zwf and pgl genes can be obtained by hybridization using.
  • an operon fragment containing edd and eda and zwf and pgl belonging to the genus Zymomonas can be obtained by the PCR method described below.
  • Other microorganisms edd and eda and zwf and pgl can be obtained in the same manner.
  • the hybridization conditions include conditions in which washing is performed at a salt concentration corresponding to 1 ⁇ SSC and 0.1% SDS at a temperature of 60 ° C.
  • Chromosomal DNA can be prepared from microorganisms that are DNA donors using, for example, “Gen Torkun” (manufactured by Takara Bio Inc.).
  • the edd and / or eda and / or zwf and / or pgl gene amplified by the PCR method is connected to a vector DNA capable of autonomous replication in cells such as Escherichia coli to prepare a recombinant DNA, which is Escherichia coli. If it is installed in, it will be easier to operate later.
  • vectors that can autonomously replicate in Escherichia coli cells include pMW219, pSTV28, pUC18, pUC19, pHSG299, pHSG399, pHSG398, RSF1010, pBR322, pACYC184, and the like.
  • selection markers for E. coli include antibiotic resistance genes such as ampicillin resistance gene or kanamycin resistance gene.
  • regulatory sequences include GAPDH (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) promoter, ADH (alcohol dehydrogenase) promoter, and GAPDH terminator.
  • GAPDH glycosyl dehydrogenase
  • ADH alcohol dehydrogenase
  • GAPDH terminator GAPDH terminator
  • Increasing the copy number of the edd and / or eda and / or zwf and / or pgl genes can also be achieved by having multiple copies of these genes on the chromosomal DNA.
  • homologous recombination is performed using a sequence present on the chromosomal DNA as a target.
  • edd and / or eda and / or zwf and / or pgl genes are loaded on transposons and transferred to introduce multiple copies onto chromosomal DNA. It is also possible.
  • EDD and / or EDA and / or ZWF and / or PGL activity is not limited by the genes mentioned above, such as edd and / or eda and / or zwf and / or pgl gene promoters on chromosomal DNA or on plasmids. It can also be achieved by replacing expression control sequences with strong ones. For example, lac promoter, trc promoter and the like are known as strong promoters. These modifications of expression control sequences may be combined with increasing the copy number of the edd and / or eda and / or zwf and / or pgl genes.
  • the ability to produce microbial alcohol may be a natural property of the microorganism, or may be imparted or enhanced by breeding.
  • gene fragments encoding enzymes that catalyze the biosynthesis of alcohols listed below are introduced into microorganisms, gene promoters, etc.
  • the expression control sequence of can be replaced with a strong one.
  • the target alcohol is ethanol, alcohol dehydrogenase, phosphoenolpyruvate carboxylase, pyruvate decarboxylase (pdc), pyruvate kinase (pyk), enolase (eno), phosphoglyceromutase (gpmA), phosphoglycerin Acid kinase (pgk), glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (gap), triose phosphate isomerase (tpi), fructose bisphosphate aldolase (fba), phosphofructokinase (pfk), glucose phosphate isomerase (pgi), etc. These enzymes are mentioned.
  • acetolactate synthase ketol acid reduct isomerase, dihydroxy acid dehydratase, 2-keto acid decarboxylase, alcohol dehydrogenase, ketol acid reduct isomerase, acetohydroxy acid dehydratase, valine dehydrogenase or Enzymes such as transaminase, valine carboxylase, omega transaminase, branched chain amino acid alcohol dehydrogenase and the like can be mentioned.
  • the activity of the enzyme that catalyzes the reaction of branching from the target alcohol biosynthetic pathway to produce other compounds is reduced or lost to impart alcohol bioperformance. Or you may strengthen.
  • the microorganism used in the present invention is not limited as long as it is a microorganism in which the ED pathway is enhanced, but Escherichia can be mentioned. Escherichia coli is preferable, and specifically, the KO11 strain is preferable.
  • alcohol By culturing the microorganism with enhanced ED pathway of the present invention, alcohol can be produced in the medium with a yield of sugar consumption of at least 20% or more. Producing alcohol in the medium at a sugar consumption yield of at least 20% or more is advantageous from the standpoint of energy efficiency, such as improving the distillation yield of alcohol, which is a subsequent step. More preferably, the alcohol can be produced in the medium at 30% or more, more preferably 40% or more.
  • the raw material containing pentose with higher yield of consumed sugar compared to before the enhancement of ED pathway Alcohol can be produced from the above, but the degree thereof is preferably improved by 5% or more as compared with that before strengthening the ED pathway.
  • the yield (%) of sugar consumption is determined by the following formula (1).
  • the medium used in the alcohol production method of the present invention is not particularly limited as long as it promotes the growth of the microorganism to be cultured and can produce the desired alcohol well.
  • the carbon source nitrogen source, inorganic salts
  • a liquid medium containing organic micronutrients such as amino acids and vitamins as appropriate is preferable.
  • the carbon source is saccharified starch containing these sugars, sweet potato molasses, sugar beet molasses, high test molasses, organic acids such as acetic acid, alcohols such as ethanol, glycerin Are used alone or in combination with other carbon sources.
  • glucose, xylose, and arabinose are preferable.
  • Organic nitrogen sources include, for example, oil cakes, soybean hydrolysates, casein degradation products, various amino acids, vitamins, corn steep liquor, yeast, yeast extract, meat extract, peptides such as peptone, various fermented bacterial cells or their It is a hydrolyzate.
  • inorganic salts phosphates, magnesium salts, calcium salts, iron salts, manganese salts, and the like can be appropriately added.
  • the microorganism used in the present invention requires a specific nutrient for growth, the nutrient is added as a preparation or a natural product containing it. An antifoaming agent is also used as necessary.
  • the expression vector to be introduced is retained in the microorganism, it is preferable to use a medium to which a selective pressure is applied by a selection marker.
  • the medium include a synthetic medium in which an amino acid encoded by a selection marker possessed by a vector is removed.
  • the method for culturing microorganisms is not particularly limited.
  • alcohol can be produced by the following cultivation method.
  • First, alcohol can be produced in a culture solution by pre-culturing the microorganism of the present invention, transferring the pre-culture solution to a new medium, and performing main culture.
  • the culture temperature is not particularly limited as long as the growth of the strain is not substantially inhibited and the target alcohol can be produced, but it is preferably a temperature in the range of 20 to 40 ° C. Any method of standing, stirring or shaking can be employed for the culture. Bacteria grow in both aerobic and anaerobic conditions. The reaction may be carried out continuously, fed-batch or batch.
  • the medium can be collected to separate and purify the alcohol.
  • the method for separation and purification is not particularly limited, and examples thereof include a method using distillation or a pervaporation membrane when the alcohol is ethanol, butanol, isobutanol, 2,3-butanediol, methanol or the like.
  • the alcohol is erythritol, sorbitol, xylitol, etc.
  • methods such as ammonium sulfate salting out, deproteinization by zinc hydroxide adsorption, decolorization by activated carbon adsorption, and desalting by ion exchange resin can be mentioned.
  • primers ED005 SEQ ID NO: 5
  • ED006 SEQ ID NO: 6
  • ED007 SEQ ID NO: 7
  • ED008 SEQ ID NO: 8
  • ED009 SEQ ID NO: 9
  • ED010 SEQ ID NO: 10.
  • gene fragments containing GAPDH promoter were amplified by PCR using the genomic DNA as a template.
  • the gene fragment obtained by using ED001 (SEQ ID NO: 1) and ED002 (SEQ ID NO: 2) as a GAPDH promoter fragment 1 and using ED003 (SEQ ID NO: 3) and ED004 (SEQ ID NO: 4) was designated GAPDH promoter fragment 2.
  • GAPDH promoter-zwf-edd was amplified using primers ED001 and ED006 using GAPDH promoter fragment 1 and zwf-edd described above as a template.
  • GAPDH promoter-eda was amplified by using GAPDH promoter fragment 2 and eda as a template and primers ED003 and ED008.
  • GAPDH promoter-zwf-edd fragment amplified GAPDH promoter-eda-pgl was treated with SacI and XbaI, and multi-pUC18 Inserted into the cloning site, pRA15 was prepared.
  • the GAPDH promoter-eda-pgl fragment was treated with XbaI and SalI and inserted into the multicloning site of pUC18 to prepare pRA16.
  • pRA15 was treated with SacI and XbaI, and the excised GAPDH promoter-zwf-edd fragment was inserted into pRA16 to prepare pRA17.
  • the prepared pRA17 was transformed into ethanol-fermented Escherichia coli KO11 to obtain E. coli RA34 strain with enhanced ED pathway. Further, as a microorganism before the ED pathway of the RA34 strain was enhanced, pUC18 was transformed into KO11 to produce the RA36 strain, and Escherichia coli without the enhanced ED pathway was prepared and used as a comparative example.
  • the amount of pyruvic acid produced is measured based on the amount of NADH that decreases when L-lactate dehydrogenase and NADH are reacted with the produced pyruvic acid and converted to L-lactic acid, and the activity of the ED pathway is indirectly measured. It was confirmed.
  • the method for measuring the activity of the ED pathway is shown below.
  • cells of RA36 and RA34 strains of 1 platinum ear were inoculated into a test tube containing 5 mL of LB medium, and cultured with reciprocal shaking at 125 ° C. for 16 hours (125 rpm).
  • an ED pathway reaction solution was prepared as follows. A solution of 200 ⁇ L mixed with 140 ⁇ L of the bacterial disruption solution to be a MgCl 2 solution (final concentration 10 mM) and a 6-polypropylene glycol solution (final concentration 2 mM) was incubated at 30 ° C. for 30 minutes as an ED pathway reaction solution. The remainder of the crushed liquid was used for protein amount measurement. For the protein amount measurement, Quick Start Bradford protein assay (manufactured by BIORAD) was used.
  • each solution of LDH reaction is bistris buffer (manufactured by Dojindo Laboratories) so that NADH solution (final concentration 1 mM) and LDH (final concentration 0.63 U / mL) are added to 100 ⁇ L of ED pathway reaction solution. Prepared and reacted.
  • the Bistris buffer was kept at 30 ° C., and the NADH and ED pathway reaction solutions were mixed immediately before the reaction, and added to the cuvette containing the L-lactic acid dehydrogenase solution (derived from Leuconostoc meseteroids, manufactured by Oriental yeast).
  • the decrease in absorbance at 340 nm accompanying the decrease in NADH was measured over time for 10 minutes from the start of the reaction.
  • the amount of decrease in NADH at this time is equal to the amount of pyruvate produced, and ED pathway activity is obtained.
  • the activity was standardized by the amount of protein.
  • the same measurement was performed for the RA34 strain.
  • the RA36 strain did not detect ED pathway activity, whereas RA34 detected ED pathway activity, confirming that the ED pathway was enhanced.
  • the concentration of xylose, arabinose, and ethanol in the culture solution was quantified by comparison with a standard under the following HPLC conditions.
  • Lactic acid, acetic acid, and formic acid in the culture solution were quantified by comparison with a standard under the following HPLC conditions.
  • Detection method electric conductivity temperature: 45 ° C.
  • Example 1 Ethanol production by Escherichia coli with enhanced ED pathway as a xylose raw material under aerobic conditions
  • the evaluation medium includes 20 g / L xylose, 20 g / L (NH 4 ) 2 SO 4 , 1 g / L NH 4 Cl, 0.4 g / LMgSO 4 .7H 2 O, 0.525 g / L NaCl, 3 g / L KH 2.
  • cells of RA34 strain of 1 platinum loop amount were inoculated into a test tube containing 5 mL of LB medium, and cultured by reciprocating shaking at 125 rpm for 16 hours at 37 ° C.
  • Example 1 Ethanol production by Escherichia coli not strengthening ED pathway using xylose as a raw material under aerobic conditions
  • Culture evaluation was performed under the same conditions as in Example 1 except that the RA36 strain prepared in Reference Example 2 was used instead of the RA34 strain.
  • the results after 24 hours of culture are shown in Table 1.
  • Table 1 As a result, it was shown that ethanol production by Escherichia coli not strengthening the ED pathway reduced ethanol consumption as well as the consumption of xylose, which is a pentose sugar, as compared with Example 1.
  • Example 2 Ethanol production by Escherichia coli with enhanced ED pathway using xylose under anaerobic conditions
  • a preculture cells of RA34 strain of 1 platinum loop amount were inoculated into a test tube containing 5 mL of LB medium, and cultured by reciprocating shaking at 125 rpm for 16 hours at 37 ° C.
  • 50 mL of the above-described evaluation medium 50 mL Erlenmeyer flask was put to 20 g / L xylose, and 500 ⁇ L of the preculture solution was inoculated and cultured.
  • a check valve was attached to keep the anaerobic state.
  • Table 1 shows the residual sugar concentration, the ethanol yield per consumed sugar, and the ethanol production rate.
  • Example 2 Ethanol Production by Escherichia coli Not Strengthening ED Pathway Using Xylose under Anaerobic Conditions
  • Culture evaluation was performed under the same conditions as in Example 2 except that the RA36 strain prepared in Reference Example 2 was used instead of the RA34 strain.
  • the results after 24 hours of culture are shown in Table 1.
  • Table 1 As a result, it was shown that ethanol production by Escherichia coli that did not enhance the ED pathway decreased ethanol productivity as well as the consumption of xylose, which is a pentasaccharide, compared to Example 2.
  • Example 3 Ethanol production by Escherichia coli with enhanced ED pathway using arabinose as a raw material under aerobic conditions
  • Culturing was carried out under the same conditions as in Example 1 except that the evaluation medium was prepared to be arabinose 20 g / L instead of xylose 20 g / L.
  • the arabinose concentration in the culture solution after 24 hours of culture was measured by the method shown in Reference Example 4.
  • the arabinose concentration and ethanol concentration in the culture solution after 24 hours of culture were measured by the method shown in Reference Example 4.
  • Table 1 shows the residual sugar concentration, the ethanol yield per consumed sugar, and the ethanol production rate.
  • Example 3 Ethanol Production by Escherichia coli Not Enhancing ED Pathway Using Arabinose under Aerobic Conditions
  • Culture evaluation was performed under the same conditions as in Example 3 except that the RA36 strain prepared in Reference Example 2 was used instead of the RA34 strain.
  • the results after 24 hours of culture are shown in Table 1.
  • Table 1 As a result, it was shown that ethanol production by Escherichia coli that did not enhance the ED pathway reduced ethanol productivity as well as the consumption of arabinose, which is a pentasaccharide, compared to Example 3.
  • Example 4 Ethanol production by Escherichia coli with enhanced ED pathway using arabinose as raw material under anaerobic conditions
  • Culturing was carried out under the same conditions as in Example 2 except that the evaluation medium was prepared to be arabinose 20 g / L instead of xylose 20 g / L.
  • the arabinose concentration and ethanol concentration in the culture solution after 24 hours of culture were measured by the method shown in Reference Example 4.
  • Table 1 shows the residual sugar concentration, the ethanol yield per consumed sugar, and the ethanol production rate.
  • Example 4 Ethanol Production by Escherichia coli Not Enhancing ED Pathway Using Arabinose under Anaerobic Conditions
  • Culture evaluation was carried out under the same conditions as in Example 4 except that the RA36 strain before enhancement of the ED pathway prepared in Reference Example 2 was used instead of the RA34 strain.
  • the results after 24 hours of culture are shown in Table 1.
  • Table 1 As a result, it was shown that ethanol production by Escherichia coli that did not enhance the ED pathway decreased ethanol productivity as well as the consumption of arabinose, which is a pentasaccharide, compared to Example 4.
  • Example 5 Byproduct produced in ethanol fermentation by E. coli with enhanced ED pathway Acetic acid, lactic acid and formic acid in the culture broth obtained in Example 1, Example 2, Example 3 and Example 4 were measured by the method shown in Reference Example 4. Table 2 shows the yields of acetic acid, lactic acid and formic acid per consumed sugar.
  • Example 6 Distillation of ethanol produced from a culture solution of Escherichia coli with enhanced ED pathway using pentose as a raw material
  • Example 6 Distillation of ethanol produced from a culture solution of Escherichia coli with enhanced ED pathway using pentose as a raw material
  • the culture solutions obtained in Example 1, Example 2, Example 3 and Example 4 were distilled.
  • the operation was performed in accordance with a method disclosed in a patent document (Japanese Patent Laid-Open No. 2008-182925). The results are shown in Table 3.
  • Comparative Example 6 Distillation of ethanol produced from a culture solution of Escherichia coli not strengthening the ED pathway using pentose as a raw material
  • the culture solution obtained in Comparative Example 1, Comparative Example 2, Comparative Example 3, and Comparative Example 4 was distilled in the same manner as in Example 6 under the same conditions as in Example 6.
  • the results are shown in Table 3.
  • ethanol fermentation by Escherichia coli that does not enhance the ED pathway has a large amount of by-products in the culture solution, so that the ethanol distillation yield also decreases. It has been shown.
  • the present invention is used in a method for producing alcohol from a raw material containing a pentose sugar.

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Abstract

　本発明は、五炭糖を含む原料から主たる生産物から主たる生産物として、アルコールを製造する方法において、エントナー・ドウドロフ（ＥＤ）経路が強化された微生物を用いると、対消費糖収率が向上することを技術的特徴とする。

Description

アルコールの製造方法
　本発明は、エントナー・ドウドロフ（ＥＤ）経路が強化された微生物を用いて、五炭糖を含む原料からアルコールを製造する方法に関する。
　従来、アルコールや有機酸は種々の微生物株を用いた発酵法により工業的に生産されてきた。通常、炭素源としてヘキソース（六炭糖）、ペントース（五炭糖）、トリオースのような各種炭水化物、各種有機酸、アルコール類が使用されている。六炭糖としては、グルコース、フルクトース、マンノース、ソルボース、ガラクトース等が挙げられる。五炭糖としては、アラビノース、キシロース、リボース等が挙げられる。しかし上述の炭水化物、および産業的に現在使用される他の従来の炭素源は、多少高価である。したがってもっと低い価格の代替のアルコール生産源が望まれている。
　セルロース系バイオマスは、容易に入手可能であり、炭水化物、トウモロコシ、サトウキビまたは他の炭素源よりも安価であることから、アルコールや有機酸生産用の好適な原料である、バイオマス中のセルロース、ヘミセルロース、およびリグニンの通常の量は、およそセルロース４０～６０％、ヘミセルロース２０～４０％、リグニン１０～２５％、他の構成成分１０％である。セルロース画分は、六炭糖、通常はグルコースのポリマーから構成される。ヘミセルロース画分は、キシロースおよびアラビノースを含む五炭糖から主として構成される。上に挙げたような炭水化物を各種アルコールや有機酸のような有用な化合物に変換するためには使用可能な発酵原料であるセルロース系バイオマスの変換効率を上げる必要がある。
　アルコール生産に用いられる主な微生物としてはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属の酵母やＺｙｍｏｍｏｎａｓ属の細菌が挙げられる。通常、これらの微生物は、グルコースなどの糖からは効率よくアルコールを生産するが、キシロース、アラビノースなどの五炭糖からはアルコールを生産することができない。そのため、バイオマスを原料としたアルコール生産の収率を向上させるためには、アルコール生産に用いられる微生物に五炭糖の代謝に関与する酵素あるいは遺伝子を導入し、五炭糖を基質としてアルコールを生産することができる形質転換微生物を構築する必要がある。特許文献１にはＺｙｍｏｍｏｎａｓ属の細菌にキシロース、アラビノースの代謝に関与する遺伝子を形質転換することにより、キシロース、アラビノースからエタノールを生産することができる微生物を構築したことが開示されている。特許文献２にはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属の酵母へ、キシロース代謝に関与する遺伝子を導入し、キシロースを糖源としてエタノールの発酵収率が向上した酵母が開示されている。
　ところで腸内細菌をはじめとする多くの微生物は、グルコース代謝経路としてエントナー・ドウドロフ（ＥＤ）経路を有している。同経路は６－ホスホグルコン酸から２－ケト－３－デオキシ－６－ホスホグルコン酸の反応を触媒する６－ホスホグルコンサンデヒドラターゼ（ＥＤＤ）と２－ケト－３－デオキシ－６－ホスホグルコン酸アルドラーゼ（ＥＤＡ）から成る。
　特許文献３では、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属の酵母にエントナー・ドウドロフ（ＥＤ）経路に関わる遺伝子を導入して、グルコースの代謝経路を補強し、エントナー・ドウドロフ（ＥＤ）経路を介したエタノール発酵を向上させる試みが記載されている。同様に特許文献４にはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉにエントナー・ドウドロフ（ＥＤ）経路に関わる遺伝子を導入し、グルコースからイソブタノール生産効率を向上させる試みが開示されている。
米国特許第５８４３７６０号明細書 特開２０１２－１１５２４８号公報 米国特許出願公開第２０１１／０１６５６６０号明細書 米国特許出願公開第２０１０／０１２０１０５号明細書
　前述の通り、セルロース系バイオマスを加水分解して得られる主な糖成分としては、六炭糖であるグルコースや、五炭糖であるキシロース、アラビノースが混合して含まれるため、アルコール発酵微生物を改良して五炭糖を含む原料から微生物発酵によってアルコールを製造する方法など、五炭糖の有効利用について検討されてきたが、依然、五炭糖を原料でアルコール発酵した場合にはアルコール生産性が低いことに課題があった。
　本発明者らは、エントナー・ドウドロフ（ＥＤ）経路が強化された微生物を用いることにより、五炭糖を含む原料からのアルコール生産能を向上させることができることを見出し、本発明を完成させるにいたった。
　すなわち本発明は、以下の（１）～（７）のとおりである。
（１）五炭糖を含む原料から主たる生産物としてアルコールを製造可能な微生物を培養することによるアルコールの製造方法であって、前記微生物がエントナー・ドウドロフ（ＥＤ）経路が強化された微生物であり、かつ、アルコールの対消費糖収率が、ＥＤ経路の強化前と比較して向上していることを特徴とする、アルコールの製造方法。
（２）前記微生物のアルコールの対消費糖収率が、ＥＤ経路の強化前と比較して、５％以上向上していることを特徴とする、（１）に記載のアルコールの製造方法。
（３）前記微生物が、グルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ、６－ホスホグルコノラクトナーゼ、ホスホグルコン酸デヒドラターゼおよび２－デヒドロ－３－デオキシ－６－ホスホグルコン酸アルドラーゼなる郡からから選ばれる少なくとも１種をコードする遺伝子の発現が強化されている微生物であることを特徴とする、（１）または（２）に記載のアルコールの製造方法。
（４）アルコールがエタノールであることを特徴とする、（１）～（３）のいずれかに記載のアルコールの製造方法。
（５）前記微生物がＥｓｃｈｅｒｉｃｉａ属に属する微生物であることを特徴とする（１）～（４）のいずれかに記載のアルコールの製造方法。
（６）前記微生物がＥｓｃｈｅｒｉｃｉａ ｃｏｌｉであることを特徴とする（１）～（５）のいずれかに記載のアルコールの製造方法。
（７）前記五炭糖がキシロースまたはアラビノースであることを特徴とする、（１）～（６）のいずれかに記載のアルコールの製造方法。
　微生物のエントナー・ドウドロフ（ＥＤ）経路を強化することによって、五炭糖を含む原料からの効率的なアルコール発酵が可能となり、食糧との競合が不可避のグルコースを主体とした原料（セルロースやでんぷん質）ではなく、食糧と競合せず、かつ容易に手に入るセルロース系バイオマスを加水分解して得られる糖成分に含まれるキシロース、アラビノースを原料とした効率的なアルコール生産法を達成することになり、大きな社会的効果が期待される。
図１は、エントナー・ドウドロフ（ＥＤ）経路の活性測定における反応経路を示す概略図である。
　以下、本発明を詳細に説明する。本発明において用いられる微生物は、五炭糖を含む原料から主たる生産物としてアルコールを製造可能であり、エントナー・ドウドロフ（以下ＥＤと略す）が強化された微生物である。
　本発明において、「五炭糖を含む原料」とは、炭素源としてキシロース、アラビノース、リブロース、リボース、キシルロースのような五炭糖に加えて、グルコース、マンノース、ガラクトース、フルクトースのような六炭糖、あるいはシュークロース、ラクトース、マルトース、トレハロース、セロビオースのような二糖類、あるいはグリセロール等の糖類を原料に含むことをいうが、これに限られるものではない。
　本発明において、「主たる生産物として」とは、微生物が少なくとも２０％以上でアルコールを製造することをいう。
　本発明において、「アルコール」とは、例えばエタノール、ブタノール、イソブタノール、１，２－ブタンジオール、１，３－ブタンジオール、１，４－ブタンジオール、２，３－ブタンジオールを含むブタンジオール、メタノール、あるいはエリスリトール、ソルビトール、キシリトールなどの糖アルコール、１，３－プロパンジオール、グリセロールなどが挙げられ、好ましくは、エタノール、イソブタノール、ブタノール、キシリトール、さらに好ましくはエタノールである。
　本発明において、五炭糖を含む原料からアルコールを製造可能であるとは、本発明の微生物を培養したときに、培地中に存在する五炭糖を資化し、代謝可能な能力をいう。五炭糖資化能は具体的には、キシロース、アラビノース、リブロース、リボース、キシルロースのような五炭糖の資化性が挙げられるが、これに限定されない。五炭糖資化能は、微生物の生来の性質として有するものであってもよく、本来的には五炭糖資化性を有しない微生物に対して、育種によって付与または増強された性質であってもよい。
　本発明で用いる育種は、例えば突然変異、細胞融合、遺伝子組換え等の技術がある。突然変異技術としては薬物処理や紫外線処理などが挙げられる。
　育種によって、五単糖の資化性能を付与および／または増強する場合、例えば以下に挙げる五単糖の資化に関する酵素をコードする遺伝子断片を微生物に導入したり、遺伝子のプロモーター等の発現調節配列を強力なものに置換したりすることができる。五炭糖の資化に関する酵素は、例えばキシロースイソメラーゼ（ＸＩ）、キシロースレダクダーゼ（ＸＲ）、キシロースデハイドロゲナーゼ（ＸＤＨ）などが候補として挙げられる。
　五炭糖の資化能を生来有する微生物は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｐａｌｉｄｕｓ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ，Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ，Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｓｍｅｇｍａｔｉｓ、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ　ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｅ，Ｈｅｒｂａｓｐｉｒｉｌｌｕｍ　ｓｅｒｏｐｅｄｉｃａｅ，Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｌｏｎｇｕｍ，Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ，Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｐｌａｎｔａｒｕｍ，Ａｍｂｒｏｓｉｏｚｙｍａ　ｍｏｎｏｓｐｏｒａ，Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｕｂｏｎｉａｅ、さらにはＰｉｃｈｉａ　Ｇｕｉｌｌｉｅｍｏｎｄｉｉ，Ｓｃｈｅｆｆｅｒｓｏｍｙｃｅｓ　ｓｔｉｐｉｔｉｓ（Ｐｉｃｈｉａ　ｓｔｉｐｉｔｉｓ），Ｃａｎｄｉｄａ　ａｒａｂｉｎｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ，Ｃａｎｄｉｄａ　ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ，Ｃａｎｄｉｄａ　ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ，　Ｃａｎｄｉｄａ　ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ，Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ　ｍａｘｉａｎｕｓ，Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ　ｂｒｕｘｅｌｌｅｎｓｉｓ，Ｂｒｅｔａｎｎｏｍｙｃｅｓ　ｎａａｒｄｅｎｅｎｓｉｓなどが挙げられる。育種には、突然変異、細胞融合、遺伝子組換え等の技術がある。突然変異技術としては薬物処理や紫外線処理がある。
　本発明において、「エントナー・ドウドロフ（ＥＤ）経路が強化された微生物」とは、微生物本来の性質として、ＥＤ経路に関する遺伝子を有している微生物に対して、育種によってＥＤ経路が強化された微生物であっても良いし、本来的にはＥＤ経路を有さない微生物に対し、育種によってＥＤ経路を付与および／または強化された微生物であってもよい。
　ＥＤ経路に関する遺伝子とは、６－ホスホグルコン酸デヒドラターゼ（以下、ＥＤＤと略す）、２－ケト－３－デオキシ－６－ホスホグルコン酸アルドラーゼ（以下、ＥＤＡと略す）、グルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ（以下、ＺＷＦと略す）、６－ホスホグルコノラクトナーゼ（以下、ＰＧＬと略す）をコードする遺伝子である。
　ＥＤ経路が強化された微生物は、細胞あたりのＥＤＤおよび／またはＥＤＡおよび／またはＺＷＦおよび／またはＰＧＬの活性が、ＥＤ経路を強化する前のそれよりも高くなったことをいう。例えば、細胞あたりのＥＤＤまたはＥＤＡまたはＺＷＦまたはＰＧＬ分子の数が増加した場合や、ＥＤＤまたはＥＤＡまたはＺＷＦまたはＰＧＬ分子あたりのＥＤＤまたはＥＤＡまたはＺＷＦまたはＰＧＬの比活性が上昇した場合などが該当する。ＥＤ経路の活性測定の方法は、例えば６－ホスホグルコン酸から２－ケト－３－オキシ－６－ホスホグルコン酸を経由して、ピルビン酸を産生する反応の活性を測定することで決定することができる。反応は、菌体破砕液に６－ホスホグルコン酸を反応させ、産生されたピルビン酸を乳酸脱水素酵素で乳酸に変換する際に減少するＮＡＤＨ量によって検出できる。
　微生物のＥＤＤ活性および／またはＥＤＤ活性および／またはＺＷＦ活性および／またはＰＧＬ活性の強化方法は、特に限定はないが、例えば、ＥＤＤおよび／またはＥＤＡおよび／またはＺＷＦおよび／またはＰＧＬをコードする遺伝子断片を、目的とする微生物で機能するベクター、好ましくはマルチコピー型のベクターと連結して組換えＤＮＡを作成し、これを同微生物に導入すればよい。ＥＤＤ活性およびＥＤＡ活性およびＺＷＦ活性およびＰＧＬ活性のすべてを強化する場合は、ＥＤＤおよびＥＤＡおよびＺＷＦおよびＰＧＬをコードする遺伝子断片は、それぞれ別個に異なるベクターに搭載しても良いが、同じベクターに搭載することが好ましい。
　ＥＤ経路を構成する酵素ＥＤＤおよびＥＤＡおよびＺＷＦおよびＰＧＬをそれぞれコードする遺伝子ｅｄｄおよびｅｄａおよびｚｗｆおよびｐｇｌは、ＥＤ経路を有する微生物由来の遺伝子のいずれも使用することができる。具体的には、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉやＺｙｍｏｍｏｎａｓ　ｍｏｂｉｌｉｓ等よりクローン化されている。これらの遺伝子の配列に基づいて作成したプライマーを用いたＰＣＲ（ＰＣＲ：ｗｈｉｔｅ，Ｔ．Ｊ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｔｒｅｎｄｓ　Ｇｅｎｅｔ．５，１８５（１９８９））、または上記遺伝子の配列に基づいて作成したプローブを用いたハイブリダイゼーションによって、ｅｄｄおよびｅｄａおよびｚｗｆおよびｐｇｌ遺伝子を取得することができる。例えばＺｙｍｏｍｏｎａｓ属のｅｄｄおよびｅｄａおよびｚｗｆおよびｐｇｌを含むオペロン断片は、後述のＰＣＲ法によって取得することができる。他の微生物のｅｄｄおよびｅｄａおよびｚｗｆおよびｐｇｌも同様にして取得されうる。前記ハイブリダイゼーションの条件は、１×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度で、温度は６０℃で洗浄が行われる条件が挙げられる。
　染色体ＤＮＡは、ＤＮＡ供与体である微生物から、例えば”Ｇｅｎとるくん”（タカラバイオ社製）等を用いて調製することができる。
　ＰＣＲ法により増幅されたｅｄｄおよび／またはｅｄａおよび／またはｚｗｆおよび／またはｐｇｌ遺伝子は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ等の細胞内において自律複製可能なベクターＤＮＡに接続して組換えＤＮＡを調整し、これをＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉに導入しておくと、後の操作がしやすくなる。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ細胞内において自律複製可能なベクターとしては、ｐＭＷ２１９、ｐＳＴＶ２８，ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＨＳＧ２９９、ｐＨＳＧ３９９、ｐＨＳＧ３９８、ＲＳＦ１０１０、ｐＢＲ３２２、ｐＡＣＹＣ１８４等が挙げられる。大腸菌の選択マーカーとしては、アンピシリン耐性遺伝子又はカナマイシン耐性遺伝子等の抗生物質耐性遺伝子が挙げられる。
　調節配列としては、ＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ）プロモーター、ＡＤＨ（アルコールデヒドロゲナーゼ）プロモーター、ＧＡＰＤＨターミネーターが挙げられる。しかしながら、発現ベクターはこれらに限定されるものではない。上記発現ベクターのプロモーター下流にＺｙｍｏｍｏｎａｓ等由来のｅｄｄおよび／またはｅｄａおよび／またはｚｗｆおよび／またはｐｇｌ遺伝子を導入することにより、該遺伝子を発現可能なベクターが得られる。
　上記で得られたＥＤ経路の遺伝子発現ベクターまたはＰＣＲ断片を微生物に導入するには、形質転換、形質導入、トランスフェクション、コトランスフェクションまたはエレクトロポレーション等の方法を用いることができる。
　ｅｄｄおよび／またはｅｄａおよび／またはｚｗｆおよび／またはｐｇｌ遺伝子のコピー数を高めることは、これらの遺伝子を染色体ＤＮＡ上に多コピー存在させることによっても達成できる。微生物の染色体ＤＮＡ上にｅｄｄおよび／またはｅｄａおよび／またはｚｗｆおよび／またはｐｇｌ遺伝子を多コピーで導入するには、染色体ＤＮＡ上に多コピー存在する配列を標的に利用して相同組換えにより行う。あるいは、特開平２－１０９９８５号公報に開示されているように、ｅｄｄおよび／またはｅｄａおよび／またはｚｗｆおよび／またはｐｇｌ遺伝子をトランスポゾンに搭載してこれを転移させて染色体ＤＮＡ上に多コピー導入することも可能である。
　ＥＤＤおよび／またはＥＤＡおよび／またはＺＷＦおよび／またはＰＧＬ活性の強化は、前記の遺伝子による以外に、染色体ＤＮＡ上またはプラスミド上のｅｄｄおよび／またはｅｄａおよび／またはｚｗｆおよび／またはｐｇｌ遺伝子のプロモーター等の発現調節配列を強力なものに置換することによっても達成される。例えば、ｌａｃプロモーター、ｔｒｃプロモーター等が強力なプロモーターとして知られている。これら発現調節配列の改変は、ｅｄｄおよび／またはｅｄａおよび／またはｚｗｆおよび／またはｐｇｌ遺伝子のコピー数を高めることと組み合わせてもよい。
　微生物のアルコールを製造する能力は、微生物の生来の性質として有するものであってもよいし、育種によって付与されたり、増強されたりしたものであってもよい。
　育種によって、微生物に目的とするアルコールを生産する能力を付与および／または増強する場合、例えば以下に挙げるアルコールの生合成を触媒する酵素をコードする遺伝子断片を微生物に導入したり、遺伝子のプロモーター等の発現調節配列を強力なものに置換したりすることができる。
　目的とするアルコールがエタノールである場合には、アルコールデヒドロゲナーゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ（ｐｄｃ）、ピルビン酸キナーゼ（ｐｙｋ）、エノラーゼ（ｅｎｏ）、ホスホグリセロムターゼ（ｇｐｍＡ）、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ｐｇｋ）、グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ｇａｐ）、トリオースリン酸イソメラーゼ（ｔｐｉ）、フルクトースビスリン酸アルドラーゼ（ｆｂａ）、ホスホフルクトキナーゼ（ｐｆｋ）、グルコースリン酸イソメラーゼ（ｐｇｉ）等の酵素が挙げられる。アルコールがブタノールあるいはイソブタノールである場合には、アセト乳酸シンターゼ、ケトール酸レダクトイソメラーゼ、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ、２－ケト酸デカルボキシラーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、ケトール酸レダクトイソメラーゼ、アセトヒドロキシ酸デヒドラターゼ、バリンデヒドロゲナーゼあるいはトランスアミナーゼ、バリンカルボキシラーゼ、オメガトランスアミナーゼ、分岐鎖アミノ酸アルコールデヒドロゲナーゼ等の酵素が挙げられる。
　また、上記の方法以外にも、目的とするアルコールの生合成経路から分岐して他の化合物を生成する反応を触媒する酵素の活性を低下、あるいは欠損させて、アルコールの生性能を付与および／または増強しても良い。
　本発明で使用する微生物はＥＤ経路が強化された微生物であれば制限はないが、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属が挙げられる。好ましくはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉであって、具体的には、ＫＯ１１株が好ましい。
　本発明のＥＤ経路が強化された微生物を培養することにより、対消費糖収率として少なくとも２０％以上で培地中にアルコールを製造することができる。対糖消費収率として少なくとも２０％以上で培地中にアルコールを製造することは、後の工程であるアルコールの蒸留収率を向上させるなど、エネルギー効率の面からも利点がある。アルコールは、さらに好ましくは、３０％以上、さらに好ましくは４０％以上で培地中に製造できる。
　本発明のＥＤ経路が強化された微生物を用いて、五単糖を含む原料からアルコールを製造した場合、ＥＤ経路の強化前と比較して、高い対消費糖収率で五単糖を含む原料からアルコールを製造することができるが、その程度として、ＥＤ経路の強化前と比較して５％以上向上していることが好ましい。対消費糖収率（％）は、次の式（１）により求められる。
　対消費糖収率（ｇ／ｇ）＝{培養後の培地中のアルコール濃度（ｇ／Ｌ）×培地の量（Ｌ）}÷{培養前の培地の糖濃度（ｇ／Ｌ）×培地の量－培養後の培地の残糖濃度（ｇ）×培地の量（Ｌ）}×１００・・・（式１）。
　本発明のアルコールの製造方法において使用する培地としては、培養する微生物の生育を促し、目的とするアルコールを良好に生産させうるものであれば特に限定はないが、炭素源、窒素源、無機塩類、及び必要に応じてアミノ酸、ビタミンなどの有機微量栄養素を適宜含有する液体培地が好ましい。炭素源としては、上記に示した通りだが、これら糖類を含有する澱粉糖化液、甘藷糖蜜、甜菜糖蜜、ハイテストモラセス、更には酢酸等の有機酸、エタノ－ルなどのアルコ－ル類、グリセリンなども単独、あるいは他の炭素源と併用して使用される。これらの中では、グルコース、キシロース、アラビノースが好ましい。窒素源としてはアンモニアガス、アンモニア水、アンモニウム塩類、尿素、硝酸塩類、その他補助的に使用される有機窒素源が使用される。有機窒素源は、例えば、油粕類、大豆加水分解液、カゼイン分解物、各種アミノ酸、ビタミン類、コーンスティープリカ－、酵母、酵母エキス、肉エキス、ペプトン等のペプチド類、各種発酵菌体またはその加水分解物である。無機塩類としてはリン酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、鉄塩、マンガン塩等を適宜添加することができる。本発明に使用する微生物が生育のために特定の栄養素を必要とする場合には、その栄養物を標品もしくはそれを含有する天然物として添加する。また、消泡剤も必要に応じて使用する。
　導入する発現ベクターを微生物内に保持させるのであれば、選択マーカーによる選択圧をかけた培地を用いることが好ましい。培地としては、例えば、ベクターの持つ選択マーカーに符号するアミノ酸を除去した合成培地などが挙げられる。
　本発明のアルコールの製造方法において微生物の培養方法は、特に限定されないが例えば、以下のような培養方法でアルコールを製造することができる。まず、本発明の微生物を前培養し、前培養液を新しい培地に移して本培養することにより、培養液中にアルコールを製造することができる。培養温度は、菌株の増殖が実質的に阻害されず目的とするアルコール生産し得る範囲であれば特に制限されるものでないが、好ましくは２０～４０℃の範囲の温度である。培養には、静置、撹拌または振とうのいずれの方法も採用し得る。菌体は好気条件、嫌気条件いずれの場合も増殖が進行する。反応は、連続式で行っても、フェドバッチ式でもバッチ式で行っても良い。培養開始から適当な時間が経過してから培地を回収してアルコールを分離、精製することができる。分離、精製する方法は、特に限定されないが、アルコールが、エタノール、ブタノール、イソブタノール、２，３－ブタンジオール、メタノールなどの場合、蒸留又は浸透気化膜を用いる方法などが挙げられる。アルコールが、エリスリトール、ソルビトール、キシリトールなどの場合、硫安塩析、水酸化亜鉛吸着などによる除タンパク、活性炭吸着による脱色、イオン交換樹脂による脱塩などの方法が挙げられる。
　得られたアルコールの測定法に特に制限はないが、例えば、ＨＰＬＣを用いる方法や、“Ｆ－キット”（ロシュ社製）を用いる方法などがある。
　以下、実施例を用いて本発明を説明する。しかし、本発明はこの実施例によって制限されないものとする。また、対消費糖収率は、式（１）に従って値を算出した。
　（参考例１　ＥＤ経路関連遺伝子強発現用プラスミドｐＲＡ１７の構築）
　ＥＤ経路に関連する遺伝子、ｚｗｆ，ｅｄｄ，ｅｄａ、ｐｇｌをＺｙｍｏｍｏｎａｓ　ｍｏｂｉｌｉｓ　ｓｕｂｓｐ．ｍｏｂｉｌｉｓ　ＺＭ４よりクローン化した。Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ　ｍｏｂｉｌｉｓ　ｓｕｂｓｐ．ｍｏｂｉｌｉｓ　ＺＭ４より“Ｇｅｎとるくん”（タカラバイオ社製）を用いてゲノムＤＮＡを抽出した後、該ゲノムＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲ法（タカラバイオ社製“ＫＯＤ　Ｐｌｕｓ”を使用）により各遺伝子ｚｗｆ－ｅｄｄ、ｅｄａ、ｐｇｌを増幅した。Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ　ｍｏｂｉｌｉｓ　ｓｕｂｓｐ．ｍｏｂｉｌｉｓ　ＺＭ４においては、ｚｗｆとｅｄｄはオペロンを形成している。そこで両遺伝子を同時に増幅できるプライマー、ＥＤ００５（配列番号５）及びＥＤ００６（配列番号６）を設計し、ＰＣＲにより両遺伝子を含むＤＮＡ断片を増幅した。同様に、ｅｄａを増幅させるプライマーとしてＥＤ００７（配列番号７）及びＥＤ００８（配列番号８）を、ｐｇｌを増幅させるプライマーとしてＥＤ００９（配列番号９）及びＥＤ０１０（配列番号１０）を設計しそれぞれの遺伝子断片を増幅した。
　また、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９より”Ｇｅｎとるくん”を用いてゲノムＤＮＡを抽出した後、該ゲノムＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲ法によりＧＡＰＤＨ　ｐｒｏｍｏｔｅｒを含む遺伝子断片を２組のプライマーでそれぞれ増幅した。ＥＤ００１（配列番号１）及びＥＤ００２（配列番号２）を使用して増幅した遺伝子断片をＧＡＰＤＨ ｐｒｏｍｏｔｅｒ断片１とし、ＥＤ００３（配列番号３）及びＥＤ００４（配列番号４）を使用して得られた遺伝子断片を、ＧＡＰＤＨ　ｐｒｏｍｏｔｅｒ断片２とした。
　ＧＡＰＤＨ　ｐｒｏｍｏｔｅｒ断片１と前述したｚｗｆ－ｅｄｄを鋳型として、プライマーＥＤ００１及びＥＤ００６を使用し、ＧＡＰＤＨ　ｐｒｏｍｏｔｅｒ－ｚｗｆ－ｅｄｄを増幅した。また、ＧＡＰＤＨ　ｐｒｏｍｏｔｅｒ断片２とｅｄａを鋳型として、プライマーＥＤ００３及びＥＤ００８を使用し、ＧＡＰＤＨ　ｐｒｏｍｏｔｅｒ－ｅｄａを増幅した。さらに、ＧＡＰＤＨ　ｐｒｏｍｏｔｅｒ－ｅｄａとｐｇｌを鋳型として、プライマーにＥＤ００３及びＥＤ０１０を使用することで、ＧＡＰＤＨ　ｐｒｏｍｏｔｅｒ－ｅｄａ－ｐｇｌを増幅したＧＡＰＤＨ　ｐｒｏｍｏｔｅｒ－ｚｗｆ－ｅｄｄ断片をＳａｃＩ及びＸｂａＩで処理し、ｐＵＣ１８のマルチクローニングサイトに挿入し、ｐＲＡ１５を作製した。また、ＧＡＰＤＨ　ｐｒｏｍｏｔｅｒ－ｅｄａ－ｐｇｌ断片はＸｂａＩ及びＳａｌＩで処理し、同じくｐＵＣ１８のマルチクローニングサイトに挿入し、ｐＲＡ１６を作製した。さらに、ｐＲＡ１５をＳａｃＩ及びＸｂａＩで処理し、切り出したＧＡＰＤＨ　ｐｒｏｍｏｔｅｒ－ｚｗｆ－ｅｄｄ断片をｐＲＡ１６に挿入し、ｐＲＡ１７を作製した。
　（参考例２　ＥＤ経路が強化された大腸菌の作製）
　作製したｐＲＡ１７をエタノール発酵大腸菌ＫＯ１１に形質転換し、ＥＤ経路が強化された大腸菌ＲＡ３４株とした。また、ＲＡ３４株のＥＤ経路が強化される前の微生物として、ｐＵＣ１８をＫＯ１１に形質転換し、ＲＡ３６株を作製し、ＥＤ経路が強化されていない大腸菌を作成し、比較例として用いた。
　（参考例３　ＥＤ経路の活性測定）
　ＥＤ経路が強化された大腸菌のＥＤ経路の活性が強化されていることを検証するため、参考例２で作製したＲＡ３６株とＲＡ３４株の菌体破砕を用いて活性測定を行った。ＥＤ経路活性測定に用いた反応経路を図１に示した。ＥＤ経路の活性測定方法は、ＲＡ３６株及びＲＡ３４株の菌体破砕液に６－ホスホグルコン酸を反応させ、６－ホスホグルコン酸から２－ケト－３－デオキシ－６－ホスホグルコン酸を経由して、ピルビン酸を産生する反応を利用して測定した。産生されたピルビン酸にＬ－乳酸脱水素酵素とＮＡＤＨを反応させＬ－乳酸に変換する際に減少するＮＡＤＨ量を元に、産生されたピルビン酸量を測定し、間接的にＥＤ経路の活性を確認した。
　以下ＥＤ経路の活性測定方法を示す。前培養として、ＬＢ培地５ｍＬが入った試験管に１白金耳量のＲＡ３６株及びＲＡ３４株の菌体を植菌し、３７℃、１６時間往復振とう培養した（１２５ｒｐｍ）。
　本培養として、ＬＢ培地５０ｍＬが入った５００ｍＬ容の三角フラスコに前培養液５００μＬ（１ｖｏｌ％）を植菌し、３７℃、６時間回転振とう培養した（１２５ｒｐｍ）。
　前処理として、本培養液１ｍＬを採取し、遠心分離装置を用いて菌体を沈殿させ、上清を捨てた後、Ｍ９ｓａｌｔで再懸濁した。次に、再び遠心分離装置を用いて菌体を沈殿させ、Ｍ９ｓａｌｔで２度洗浄し、ビストリスバッファー（同仁化学研究所製）１ｍＬで再懸濁した。また、ジルコニアビーズが１００μＬ程度入ったビーズ破砕用チューブに菌体懸濁液を添加し、４０００ｒｐｍ、１分間（インターバル３分間）のビーズ破砕を５回行った。また、１００００×ｇ 、１０分間、４℃で遠心分離を行い、上清を新しいチューブへ移した。
　活性測定として、ＥＤ経路反応液を次のように調製した。菌破砕液１４０μＬに対し、ＭｇＣｌ２溶液（最終濃度１０ｍＭ）、６－ポリプロピレングリコール溶液（最終濃度２ｍＭ）となるように混合した２００μＬの溶液をＥＤ経路反応液として、３０℃、３０分間インキュベートした。なお、破砕液の残りはタンパク量測定に使用した。タンパク量測定には、Ｑｕｉｃｋ　Ｓｔａｒｔ　Ｂｒａｄｆｏｒｄプロテインアッセイ（ＢＩＯＲＡＤ社製）を使用した。ＬＤＨ反応の各溶液の添加量は、ＥＤ経路反応液１００μＬに対し、ＮＡＤＨ溶液（最終濃度１ｍＭ）、ＬＤＨ（最終濃度０．６３Ｕ／ｍＬ）となるようにビストリスバッファー（同仁化学研究所製）で調製して反応させた。
　ビストリスバッファーは３０℃に保温しておき、反応直前にＮＡＤＨ、ＥＤ経路反応液を混合し、Ｌ－乳酸脱水素酵素液（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ　ｍｅｓｅｕｔｅｒｏｉｄｓ由来, オリエンタル酵母社製）の入ったキュベットに添加し、ＮＡＤＨの減少に伴う３４０ｎｍでの吸光度の減少を反応開始から１０分間経時的に測定した。このときのＮＡＤＨの減少量がピルビン酸産生量と等しく、ＥＤ経路活性が得られる。なお、活性はタンパク量で標準化した。ＲＡ３４株についても同様の測定を行った。ＲＡ３６株はＥＤ経路の活性が検出されなかったのに対し、ＲＡ３４はＥＤ経路の活性が検出され、ＥＤ経路が強化されていることが確認された。
　（参考例４　培地中の生成物の定量方法）
　以下に高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ、株式会社島津製作所製）による培養液中の成分の濃度測定条件を示す。
　培養液中のキシロース、アラビノース、エタノールの濃度は、下記に示すＨＰＬＣ条件で、標品との比較により定量した。
　カラム：Ｓｈｏｄｅｘ　ＳＨ１０１１（株式会社昭和電工製）
移動相：５ｍＭ　硫酸（流速０．６ｍＬ／分）
反応液：なし
検出方法：ＲＩ（示差屈折率）
温度：６５℃。
　培養液中の乳酸、酢酸、ギ酸を下記に示すＨＰＬＣ条件で標品との比較により定量した。
カラム：Ｓｈｉｍ－Ｐａｃｋ　ＳＰＲ－Ｈ（株式会社島津製作所製）
移動相：５ｍＭ　ｐ－トルエンスルホン酸（流速０．８ｍＬ／ｍｉｎ）
反応液：５ｍＭ　ｐ－トルエンスルホン酸、２０ｍＭ　ビストリス、０．１ｍＭ　ＥＤＴＡ・２Ｎａ（流速０．８ｍＬ／ｍｉｎ）
検出方法：電気伝導度
温度：４５℃。
　（実施例１　好気条件下でのキシロース原料とするＥＤ経路が強化された大腸菌によるエタノール生産）
　ＥＤ経路の強化が五炭糖を原料とするエタノール生産に与える影響を検討するために参考例２で作製したＲＡ３４株のエタノール生産性について、培養評価した。評価培地には２０ｇ／Ｌ キシロース、２０ｇ／Ｌ （ＮＨ４）２ＳＯ４、１ｇ／Ｌ ＮＨ４Ｃｌ、０．４ｇ／ＬＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．５２５ｇ／Ｌ ＮａＣｌ、３ｇ／Ｌ ＫＨ２ＰＯ４、６ｇ／Ｌ Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、７．３５ｍｇ／Ｌ ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、２０ｍｇ／Ｌ ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、２ｍｇ／Ｌ ＭｎＳＯ４・４Ｈ２Ｏ、０．０２ｍｇ／Ｌ ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．５４ｍｇ／Ｌ ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．０８ｍｇ／Ｌ （ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２４・４Ｈ２Ｏ、０．１７６ｍｇ／Ｌ Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ、０．１７６ｍｇ／Ｌ Ｎａ２Ｂ４Ｏ７・７Ｈ２Ｏ、１．７４ｍｇ／Ｌ ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ、０．０１４４ｍｇ／Ｌ ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、０．０３ｍｇ／Ｌ Ｂｉｏｔｉｎｅ、１ｍｇ／ＬＴｈｉａｍｉｎｅ・ＨＣｌを含む培地を調製した。培地はクエン酸－リン酸バッファーによりｐＨを６．０付近に保った。培養は、攪拌１２０ｒｐｍで行った。
　前培養として、ＬＢ培地５ｍＬが入った試験管に１白金耳量のＲＡ３４株の菌体を植菌し、３７℃、１６時間、１２５ｒｐｍで往復振とう培養した。
　本培養として、上述の評価培地２０ｍＬを５０ ｍＬ容の三角フラスコに入れ、前培養液５００μＬを植菌し培養を行った。培養２４時間後における培地中のキシロース濃度、エタノール濃度を参考例４に示した方法により測定した。残糖濃度、消費糖あたりのエタノール収率、エタノール生産速度を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　（比較例１　好気条件下におけるキシロースを原料とするＥＤ経路を強化していない大腸菌によるエタノール生産）
　ＲＡ３４株の代わりに参考例２で作製したＲＡ３６株を用いた以外は、実施例１と同様の条件で培養評価を行った。培養２４時間後の結果を表１に示す。この結果、ＥＤ経路を強化していない大腸菌によるエタノールの生産は、実施例１と比べて、五炭糖であるキシロースの消費量が低下すると同時に、エタノール生産性も低下することが示された。
　（実施例２　嫌気条件下でのキシロースを原料とするＥＤ経路が強化された大腸菌によるエタノール生産）
　前培養として、ＬＢ培地５ｍＬが入った試験管に１白金耳量のＲＡ３４株の菌体を植菌し、３７℃、１６時間、１２５ｒｐｍで往復振とう培養した。本培養として、２０ｇ／Ｌキシロースとなるよう上述の評価培地５０ｍＬ容の三角フラスコに５０ｍＬ入れ、前培養液５００μＬを植菌し培養を行った。培養中は、逆止弁をつけて嫌気状態を保った。培養２４時間後における培養液中のキシロース濃度、エタノール濃度を参考例４に示した方法により測定した。残糖濃度、消費糖あたりのエタノール収率、エタノール生産速度を表１に示す。
　（比較例２　嫌気条件下におけるキシロースを原料とするＥＤ経路を強化していない大腸菌によるエタノール生産）
　ＲＡ３４株の代わりに参考例２で作製したＲＡ３６株を用いた以外は実施例２と同様の条件で培養評価を行った。培養２４時間後の結果を表１に示す。この結果、ＥＤ経路を強化していない大腸菌によるエタノールの生産は、実施例２と比べて、五単糖であるキシロースの消費量が低下すると同時に、エタノール生産性も低下することが示された。
　（実施例３　好気条件下でのアラビノースを原料とするＥＤ経路が強化された大腸菌によるエタノール生産）
　キシロース ２０ｇ／Ｌの代わりにアラビノース ２０ｇ／Ｌとなるよう評価培地を調製したした以外は、実施例１と同様の条件で培養を行った。培養２４時間後における培養液中のアラビノース濃度を参考例４に示す方法により測定した。培養２４時間後における培養液中のアラビノース濃度、エタノール濃度を参考例４に示した方法により測定した。残糖濃度、消費糖あたりのエタノール収率、エタノール生産速度を表１に示す。
　（比較例３　好気条件下におけるアラビノースを原料とするＥＤ経路を強化していない大腸菌によるエタノール生産）
　ＲＡ３４株の代わりに参考例２で作製したＲＡ３６株を用いた以外は、実施例３と同様の条件で培養評価を行った。培養２４時間後の結果を表１に示す。この結果、ＥＤ経路を強化していない大腸菌によるエタノールの生産は、実施例３と比べて、五単糖であるアラビノースの消費量が低下すると同時に、エタノール生産性も低下することが示された。
　（実施例４　嫌気条件下でのアラビノースを原料とするＥＤ経路が強化された大腸菌によるエタノール生産）
　キシロース ２０ｇ／Ｌの代わりにアラビノース ２０ｇ／Ｌとなるよう評価培地を調製したした以外は、実施例２と同様の条件で培養を行った。培養２４時間後における培養液中のアラビノース濃度、エタノール濃度を参考例４に示した方法により測定した。残糖濃度、消費糖あたりのエタノール収率、エタノール生産速度を表１に示す。
　（比較例４　嫌気条件下におけるアラビノースを原料とするＥＤ経路を強化していない大腸菌によるエタノール生産）
　ＲＡ３４株の代わりに参考例２で作製したＥＤ経路の強化前のＲＡ３６株を用いた以外は、実施例４と同様の条件で培養評価を行った。培養２４時間後の結果を表１に示す。この結果、ＥＤ経路を強化していない大腸菌によるエタノールの生産は、実施例４と比べて、五単糖であるアラビノースの消費量が低下すると同時に、エタノール生産性も低下することが示された。
　（実施例５　ＥＤ経路が強化された大腸菌によるエタノール発酵において産生する副産物）
　実施例１、実施例２、実施例３及び実施例４で得られた培養液中の酢酸、乳酸、ギ酸を参考例４に示す方法により測定した。表２に消費糖あたりの酢酸、乳酸及びギ酸の収率を示した。
　（比較例５　ＥＤ経路を強化していない大腸菌によるエタノール発酵において産生する副産物）
　比較例１、比較例２、比較例３及び比較例４で得られた培養液中の酢酸、乳酸及びギ酸を参考例４に示す方法により測定した。表２に消費糖あたりの酢酸、乳酸、ギ酸の収率を示した。この結果、ＥＤ経路を強化していない大腸菌によるエタノールの生産は、エタノール以外の副産物が増加することが示された。
　実施例１～５、比較例１～５の結果より、ＥＤ経路が強化された微生物を用いて、五炭糖を含む原料からアルコールを製造すると、ＥＤ経路の強化前と比較して、対消費糖収率が５％以上向上することがわかった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　（実施例６　五炭糖を原料とするＥＤ経路が強化された大腸菌の培養液から産生したエタノールの蒸留）
　発酵工程だけでは濃度が数％であるエタノールを、燃料として使用可能な濃度にまで高めるため、実施例１、実施例２、実施例３及び実施例４で得られた培養液の蒸留を行った。操作は特許文献（特開２００８－１８２９２５号）等に開示されている手法に従った。結果を表３に示す。
　（比較例６　五炭糖を原料とするＥＤ経路を強化していない大腸菌の培養液から産生したエタノールの蒸留）
　実施例６と同様の条件で比較例１、比較例２、比較例３及び比較例４で得られた培養液の蒸留を実施例６と同じ方法で行った。結果を表３に示す。この結果、実施例５と比較例５で示されたように、ＥＤ経路を強化していない大腸菌によるエタノールの発酵では、培養液中の副産物量が多いため、エタノールの蒸留収率も低下することが示された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　本発明は、五炭糖を含む原料よりアルコールを製造する方法に利用される。

Claims (7)

  1. 　五炭糖を含む原料から主たる生産物としてアルコールを製造可能な微生物を培養することによるアルコールの製造方法であって、前記微生物がエントナー・ドウドロフ（ＥＤ）経路が強化された微生物であり、かつ、アルコールの対消費糖収率が、ＥＤ経路の強化前と比較して向上していることを特徴とする、アルコールの製造方法。
  2. 　前記微生物のアルコールの対消費糖収率が、ＥＤ経路の強化前と比較して、５％以上向上していることを特徴とする、請求項１に記載のアルコールの製造方法。
  3. 　前記微生物が、グルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ、６－ホスホグルコノラクトナーゼ、ホスホグルコン酸デヒドラターゼおよび２－デヒドロ－３－デオキシ－６－ホスホグルコン酸アルドラーゼなる郡からから選ばれる少なくとも１種をコードする遺伝子の発現が強化されている微生物であることを特徴とする、請求項１または２に記載のアルコールの製造方法。
  4. 　アルコールがエタノールであることを特徴とする、請求項１～３のいずれかに記載のアルコールの製造方法。
  5. 　前記微生物がＥｓｃｈｅｒｉｃｉａ属に属する微生物であることを特徴とする請求項１～４のいずれかに記載のアルコールの製造方法。
  6. 　前記微生物がＥｓｃｈｅｒｉｃｉａ ｃｏｌｉであることを特徴とする請求項１～５のいずれかに記載のアルコールの製造方法。
  7. 　前記五炭糖がキシロースまたはアラビノースであることを特徴とする、請求項１～６のいずれかに記載のアルコールの製造方法。
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