WO2012020833A1 - gntRを破壊することによって生産性が向上したイソプロピルアルコール生産細菌 - Google Patents

gntRを破壊することによって生産性が向上したイソプロピルアルコール生産細菌 Download PDF

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Definitions

  • the present invention relates to an isopropyl alcohol-producing bacterium and an isopropyl alcohol production method using the bacterium.
  • Propylene is an important basic raw material for synthetic resins such as polypropylene and petrochemical products, and is widely used in automotive bumpers, food containers, films, medical devices, and so on.
  • Isopropyl alcohol produced from plant-derived materials is promising as a carbon-neutral propylene material because it can be converted to propylene through a dehydration step.
  • Acetone is also widely used as a raw material for solvents and plastics.
  • Carbon neutral propylene is extremely important for the global environment because of its versatility. It is.
  • isopropyl alcohol-producing Escherichia coli since the raw material of isopropyl alcohol is glucose, all of a large number of compounds obtained by glycolysis and catabolism can be by-products. On the other hand, since these compounds may be essential substances for the growth of E. coli, the amount of glucose consumed by these side reactions cannot be completely suppressed. For this reason, various studies have been made to minimize by-products and increase the production of isopropyl alcohol.
  • Appl. Microbiol. Biotechnol. , 77 (6), pp. 1219-1224 (2008) discloses Escherichia coli that produces isopropyl alcohol by introducing genes of thiolase, CoA-transferase, acetoacetate decarboxylase, and primary-secondary alcohol dehydrogenase.
  • the ability of this bacterium is described as a production rate of 0.6 g / L / hr, a yield of 51%, and an accumulation amount of 13.6 g / L.
  • isopropyl alcohol dehydrogenase, secondary alcohol dehydrogenase, primary-secondary alcohol dehydrogenase and 2-propyl alcohol dehydrogenase are enzymes that catalyze the same reaction with different names, such as CoA transferase, acetoacetyl CoA transferase, acetyl CoA: acetate CoA -Transferases and CoA-transferases are enzymes that catalyze the same reaction with different names.
  • acetoacetate decarboxylase and acetoacetate decarboxylase are enzymes that catalyze the same reaction with different names
  • thiolase and acetyl CoA acetyltransferase are enzymes that catalyze the same reaction with different names. Therefore, although the isopropyl alcohol-producing Escherichia coli according to these documents has various differences in productivity, the enzyme used for producing isopropyl alcohol is acetoacetate deoxygenated as described in International Publication No. 2009/008377. These are the same four types of carboxylase, isopropyl alcohol dehydrogenase, CoA transferase, and thiolase, and conventionally, these four types of enzymes have been studied for the purpose of improving productivity and yield.
  • JP-A-5-260979 describes that in Bacillus subtilis, disruption of the GntR gene possessed by the E. coli increases the productivity of D-ribose.
  • Japanese Patent Laid-Open Nos. 7-53433 and 11-335315 use a copper-based catalyst as a solid catalyst for producing acetone by dehydrogenating isopropyl alcohol.
  • British Patent No. 665376 uses a catalyst in which zinc oxide fine particles and zirconium oxide fine particles are physically mixed.
  • impurities are contained when a substance is produced using a microorganism. In this respect, since none of these techniques is a production method using microorganisms, there is no description that isopropanol containing impurities is used as a raw material.
  • Acetone can be easily converted to isopropanol by hydrogenation, and this isopropanol is further converted into propylene by a dehydration reaction and then reacted with benzene to obtain cumene. That is, a process has been proposed in which acetone is reused as a raw material for the cumene process by converting it into propylene by a two-step reaction (see, for example, JP-A-2-174737). In the reuse as described above, it is necessary to establish industrially and practically a method for producing propylene with high selectivity from acetone. Also known is a method for obtaining propylene by hydrogenating acetone at 400 ° C.
  • the present invention relates to Escherichia coli having greatly improved isopropyl alcohol productivity, an isopropyl alcohol production method and an acetone production method using the Escherichia coli, and an isopropyl alcohol containing acetone obtained using the Escherichia coli. It aims to provide a method of producing.
  • the isopropyl alcohol production Escherichia coli of this invention is made
  • the isopropyl alcohol production Escherichia coli of this invention, the isopropyl alcohol production method, and the acetone production method are as follows. [1] An activity of the transcription repressing factor GntR is inactivated, an isopropyl alcohol production system, and an auxiliary enzyme group having an enzyme activity pattern that maintains or enhances the isopropyl alcohol production ability associated with the inactivation of the GntR activity. E. coli equipped with isopropyl alcohol.
  • the enzyme activity pattern of the auxiliary enzyme group is (1) maintenance of wild-type glucose-6-phosphate isomerase (Pgi) activity, glucose-6-phosphate-1-dehydrogenase (Zwf) activity and phosphogluconate dehydrogenase (Gnd) activity; (2) inactivation of glucose-6-phosphate isomerase (Pgi) activity and enhancement of glucose-6-phosphate-1-dehydrogenase (Zwf) activity; (3) inactivation of glucose-6-phosphate isomerase (Pgi) activity, enhancement of glucose-6-phosphate-1-dehydrogenase (Zwf) activity, inactivation of phosphogluconate dehydrogenase (Gnd) activity,
  • the glucose-6-phosphate-1-dehydrogenase (Zwf) activity is derived from a gene encoding glucose-6-phosphate-1-dehydrogenase (Zwf)
  • the isopropyl alcohol production system is constructed by the acetoacetate decarboxylase, isopropyl alcohol dehydrogenase, CoA transferase, and thiolase enzyme genes, and each enzyme gene is independently a Clostridium bacterium,
  • the isopropyl alcohol-producing Escherichia coli according to any one of [1] to [4], which is derived from at least one prokaryotic organism selected from the group consisting of Bacillus bacteria and Escherichia bacteria.
  • the acetoacetate decarboxylase activity is derived from a gene encoding an enzyme derived from Clostridium acetobutylicum
  • the isopropyl alcohol dehydrogenase activity is derived from a gene encoding an enzyme derived from Clostridium beigerinki.
  • the gene variant of the isopropyl alcohol dehydrogenase is a base sequence represented by SEQ ID NO: 40
  • the gene variant of the acetoacetate decarboxylase is a base sequence represented by SEQ ID NO: 43 Of isopropyl alcohol producing Escherichia coli.
  • a method for producing isopropyl alcohol comprising producing isopropyl alcohol from a plant-derived material using the isopropyl alcohol-producing Escherichia coli according to any one of [1] to [9].
  • a method for producing propylene comprising contacting a hydrogenation catalyst containing a solid acid substance and Cu as a catalyst.
  • propylene is produced from E. coli capable of producing isopropyl alcohol at a high rate, an isopropyl alcohol production method and an acetone production method using the E. coli, and further isopropyl alcohol containing acetone obtained using the E. coli.
  • a method can be provided.
  • the isopropyl alcohol-producing Escherichia coli of the present invention has an inactivated activity of the transcriptional repressor GntR, and an enzyme activity pattern that maintains or enhances the isopropyl alcohol production system and the isopropyl alcohol producing ability associated with the inactivation of the GntR activity.
  • An isopropyl alcohol-producing Escherichia coli provided with a group of auxiliary enzymes.
  • the GntR activity is inactivated and the auxiliary enzyme group having the predetermined enzyme activity pattern is provided, so that isopropyl alcohol can be produced at a high production rate.
  • the present invention inactivates the activity of GntR, which is a negative regulator of gluconic acid metabolism, to produce isopropyl alcohol as a product by the E. coli. It has been found that the nature goes up. At this time, it was also found that there is an enzyme that affects the ability to produce isopropyl alcohol improved by inactivating the activity of GntR. The activity pattern of these enzymes maintains or enhances the ability to produce isopropyl alcohol by inactivating the activity of GntR.
  • auxiliary enzyme group in the present invention refers to one or two or more enzymes that affect the ability to produce isopropyl alcohol. Moreover, each enzyme activity of the auxiliary enzyme group is inactivated, activated or strengthened, and the “enzyme activity pattern of the auxiliary enzyme group” in the present invention is obtained only by inactivating the activity of GntR. Improved isopropyl alcohol production refers to the enzyme activity pattern of each enzyme that can be maintained or increased, including one or a combination of two or more enzymes.
  • the auxiliary enzyme group has an isopropyl alcohol production system and is inactive except that GntR activity is inactivated (in the present invention, unless otherwise specified, “enzyme” does not exhibit enzyme activity alone ”. It may be an enzyme group composed only of “factor”.
  • production of isopropyl alcohol-producing Escherichia coli and isopropyl alcohol that are not artificially changed except that an isopropyl alcohol production system that exhibits a predetermined isopropyl alcohol production ability is provided and GntR is inactivated by genetic recombination technology
  • the isopropyl alcohol-producing Escherichia coli that has an isopropyl alcohol production system to which a modification for enhancing the performance is provided and that has not been artificially changed except that GntR is inactivated by genetic recombination technology is the isopropyl alcohol-producing Escherichia coli. Is included.
  • the enzyme activity pattern of the auxiliary enzyme group preferably, the following patterns can be mentioned: (1) maintenance of wild-type glucose-6-phosphate isomerase (Pgi) activity, glucose-6-phosphate-1-dehydrogenase (Zwf) activity and phosphogluconate dehydrogenase (Gnd) activity; (2) inactivation of glucose-6-phosphate isomerase (Pgi) activity and enhancement of glucose-6-phosphate-1-dehydrogenase (Zwf) activity; (3) Inactivation of glucose-6-phosphate isomerase (Pgi) activity, enhancement of glucose-6-phosphate-1-dehydrogenase (Zwf) activity, and inactivation of phosphogluconate dehydrogenase (Gnd) activity.
  • the enzyme activity pattern of the auxiliary enzyme group of (3) is more preferable from the viewpoint of isopropyl alcohol production ability.
  • auxiliary enzyme group and the enzyme activity pattern according to the present invention are not limited to these, and include an inactivation of GntR activity, and the auxiliary enzyme group and its enzyme capable of increasing isopropyl alcohol production in isopropyl alcohol-producing Escherichia coli. Any active pattern is included in the present invention.
  • the auxiliary enzyme group does not necessarily need to be composed of a plurality of enzymes, and may be composed of one enzyme.
  • activation means that the activity of the factor or enzyme measured by any existing measurement system is 1/10 or less when the activity in E. coli before inactivation is 100.
  • the term “by gene recombination technology” means that a change in the base sequence is caused by the insertion of another DNA into the base sequence of the native gene, or the replacement, deletion or combination of a part of the gene. It may be included as long as it is, for example, it may be obtained as a result of mutation.
  • E. coli in which the activity of a factor or enzyme is inactivated refers to a bacterium whose native activity has been impaired by some method from outside the cell to the cell. These bacteria can be produced, for example, by destroying a gene encoding the protein or enzyme (gene disruption).
  • the gene disruption includes a mutation in the base sequence of the gene, insertion of another DNA, and deletion of a certain part of the gene so that the function of the gene cannot be exhibited. Can be mentioned.
  • the gene cannot be transcribed into mRNA, and the structural gene is not translated.
  • the amino acid sequence of the translated structural protein is mutated or deleted, and the original function cannot be exhibited.
  • the gene-disrupted strain can be produced by any method as long as a disrupted strain that does not express the enzyme or protein is obtained.
  • Various methods of gene disruption have been reported (natural breeding, addition of mutagen, UV irradiation, irradiation, random mutation, transposon, site-specific gene disruption), but only certain genes can be disrupted Thus, gene disruption by homologous recombination is preferred. Methods by homologous recombination are described in J. Bacteriol., 161, 1219-1221 (1985), J. Bacteriol., 177, 1511-1519 (1995) and Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 6640-6645 ( 2000) and can be easily implemented by those in the same industry by using these methods and their applications.
  • enhancement of “activity” in the present invention broadly means that various enzyme activities in isopropyl alcohol-producing Escherichia coli before the enhancement increase after the enhancement. There are no particular restrictions on the method of strengthening as long as the activities of various enzymes possessed by isopropyl alcohol-producing Escherichia coli increase. Enhancing with enzyme genes introduced from outside the cells, enhancing by enhancing expression of enzyme genes in the cells , And combinations thereof.
  • the enhancement by an enzyme gene introduced from outside the cell body is introduced by introducing a gene encoding an enzyme having a higher activity than the host-derived enzyme from outside the host cell body. Adding the enzyme activity by the enzyme gene or replacing the enzyme activity with the enzyme activity inherent in the host, further increasing the number of host-derived enzyme genes or enzyme genes from outside the cell body to 2 or more, Or a combination thereof may be mentioned.
  • the enhancement of enzyme gene expression in the fungus can be enhanced by introducing a base sequence that enhances the expression of the enzyme gene into the fungus from outside the host bacteria, Enhancing the expression of the enzyme gene by substituting the promoter of the enzyme gene with another promoter, and combinations thereof can be mentioned.
  • “host” means the E. coli that becomes the isopropyl alcohol-producing E. coli of the present invention as a result of introducing one or more genes from outside the cell. The present invention will be described below.
  • GntR in the present invention refers to a transcription factor that negatively regulates an operon involved in gluconic acid metabolism via the Entner-Doudoroff pathway. It refers to the generic name of GntR transcriptional repressors that suppress the action of two gene groups (GntI and GntII) responsible for gluconic acid uptake and metabolism.
  • Glucose-6-phosphate isomerase (Pgi) in the present invention is classified into enzyme number 5.3.1.9 according to the report of the International Biochemical Union (I.U.B.) Enzyme Committee. The generic term for enzymes that catalyze the reaction of producing D-fructose-6-phosphate from glucose-6-phosphate.
  • the glucose-6-phosphate-1-dehydrogenase (Zwf) in the present invention is classified into enzyme number 1.1.1.149 according to the report of the International Biochemical Union (IUB) enzyme committee. , A generic term for enzymes that catalyze the reaction of producing D-glucono-1,5-lactone-6-phosphate from D-glucose-6-phosphate.
  • Deinococcus spp such as Deinococcus radiophilus, Aspergillus niger, Aspergillus genus such as Aspergillus aculeatus, Acetobacter genus, such as Acetobacter hansenii, Thermotoga genus, such as Thermotoga maritima, Cryptococcus genus, such as Cryptococcus neoformans Fungi, Dictyostelium genus such as Dictyostelium discoideum, Pseudomonas genus such as Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas aeruginosa, Saccharomyces ce Saccharomyces genus such evisiae, Bacillus genus, such as Bacillus megaterium, include those derived from Escherichia genus such as Escherichia coli.
  • the glucose-6-phosphate-1-dehydrogenase (Zwf) gene used in the present invention is based on DNA having a base sequence of a gene encoding a thiolase obtained from each of the aforementioned derived organisms or a known base sequence thereof. Synthetic DNA sequences synthesized in this way can be used.
  • Deinococcus spp such as Deinococcus radiophilus, Aspergillus niger, Aspergillus genus such as Aspergillus aculeatus, Acetobacter genus, such as Acetobacter hansenii, Thermotoga genus, such as Thermotoga maritima, Cryptococcus genus, such as Cryptococcus neoformans, Dictyostelium Dictyosterium genus such as discoidideum, Pseudomonas genus such as Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas aeruginosa, Saccharomyces c Saccharomyces genus such revisiae, Bacillus genus, such as Bacillus megaterium, DNA having the nucleotide sequence of the Escherichia genus derived from genes such as Escherichia coli can be exemp
  • More preferable examples include those derived from prokaryotes such as Deinococcus, Aspergillus, Acetobacterium, Thermotoga, Pseudomonas, Bacillus, and Escherichia. This is a DNA having a base sequence of a gene derived from Escherichia coli.
  • the phosphogluconate dehydrogenase (Gnd) in the present invention is classified into enzyme number 1.1.1.144 according to the report of the International Biochemical Union (I.U.B.) Enzyme Committee, and 6-phospho-D -A generic term for enzymes that catalyze the reaction of producing D-ribulose-5-phosphate and CO 2 from gluconic acid.
  • the isopropyl alcohol-producing Escherichia coli is an Escherichia coli equipped with an isopropyl alcohol production system and refers to Escherichia coli having an isopropyl alcohol production ability introduced or modified by a gene recombination technique.
  • Such an isopropyl alcohol production system may be any system as long as the target Escherichia coli produces isopropyl alcohol.
  • the enzyme activity involved in the production of isopropyl alcohol can be enhanced.
  • isopropyl alcohol-producing Escherichia coli in the present invention, four types of enzyme activities of acetoacetate decarboxylase activity, isopropyl alcohol dehydrogenase activity, CoA transferase activity, and thiolase activity described above are imparted from outside the cell or enhanced in the cell. Or it is still more preferable that both of these are made.
  • the thiolase in the present invention is classified into enzyme number 2.3.1.9 based on the report of the International Biochemical Union (I.U.B.) Enzyme Committee, and a reaction for producing acetoacetyl CoA from acetyl CoA.
  • This is a general term for enzymes that catalyze.
  • Clostridium acetobutylicum Clostridium acetobutylicum
  • Clostridium beijerinkii Clostridium beijerinkii
  • Clostridium beijerinckii genus Clostridium spp.
  • Escherichia coli Escherichia coli sp.
  • Bacteria, Zogroa bacteria such as Zoogloea ramigera, Rhizobium sp. Bacteria, Bradyrizobium japonicum, etc. (Candida tropicali ), Caulobacter crecentus, etc., Streptomyces collinus, Streptomyces genus, Enterococcus faecalis, etc. Can be mentioned.
  • thiolase gene used in the present invention it is possible to use a DNA having a base sequence of a gene encoding a thiolase obtained from each of the aforementioned derived organisms or a synthetic DNA sequence synthesized based on the known base sequence. it can.
  • Clostridium bacteria such as Clostridium acetobutylicum and Clostridium beigerinki
  • Escherichia bacteria such as Escherichia coli
  • Halobacteria species Zogroa bacteria such as Zugroa lamigera
  • Rhizobium species bacteria Brady Bradyrizobium bacteria such as Rhizobium japonica
  • Candida bacteria such as Candida tropicalis
  • Caulobacter bacteria such as Caulobacter crescentus
  • Streptomyces genus bacteria such as Streptomyces colinas
  • Enterococcus faecalis Examples thereof include DNA having a base sequence of a gene derived from Enterococcus bacteria such as.
  • More preferable examples include those derived from prokaryotes such as Clostridium bacteria or Escherichia bacteria, and particularly preferred is DNA having a nucleotide sequence of a gene derived from Clostridium acetobutylicum or Escherichia coli. .
  • the acetoacetate decarboxylase in the present invention is classified into enzyme number 4.1.1.4 based on the report of the International Biochemical Union (I.U.B.) Enzyme Committee and produces acetone from acetoacetate.
  • the generic name of the enzyme that catalyzes As such, for example, Clostridium acetobutylicum (Clostridium acetobutylicum), Clostridium beijerinkii (Clostridium beijerinkiii) and other Clostridium bacteria, Bacillus polymyxa (Bacillus polymyxa) and other bacteria such as Bacillus polymyxa.
  • the gene of acetoacetate decarboxylase introduced into the host bacterium of the present invention is synthesized based on DNA having the base sequence of the gene encoding acetoacetate decarboxylase obtained from each of the above-mentioned organisms or a known base sequence thereof.
  • the synthesized synthetic DNA sequence can be used.
  • Preferable examples include those derived from Clostridium bacteria or Bacillus bacteria, and examples thereof include DNA having a nucleotide sequence of a gene derived from Clostridium acetobutylicum or Bacillus polymixa. Particularly preferred is DNA having a base sequence of a gene derived from Clostridium acetobutylicum.
  • the isopropyl alcohol dehydrogenase in the present invention is classified into enzyme number 1.1.1.180 according to the report of the International Biochemical Union (I.U.B.) Enzyme Committee, and a reaction for producing isopropyl alcohol from acetone. This is a general term for enzymes that catalyze. As such a thing, the thing derived from Clostridium bacteria, such as Clostridium beijerinckii (Clostridium beijerinckii), is mentioned, for example.
  • the isopropyl alcohol dehydrogenase gene introduced into the host bacterium of the present invention was synthesized based on DNA having the base sequence of the gene encoding isopropyl alcohol dehydrogenase obtained from each of the above-mentioned derived organisms or a known base sequence thereof. Synthetic DNA sequences can be utilized. Preferable examples include those derived from Clostridium bacteria, for example, DNA having a base sequence of a gene derived from Clostridium begerinki.
  • the CoA transferase in the present invention is classified into enzyme number 2.8.3.8 based on the report of the International Biochemical Union (IUB) Enzyme Committee, and generates acetoacetate from acetoacetyl CoA.
  • the generic name of the enzyme that catalyzes As such, for example, Clostridium acetobutylicum (Clostridium acetobutylicum), Clostridium beijerinkii (Clostridium beijerinkiii) and other Clostridium bacteria, Roseburia intestinalis (Roseburia intestinalis) bacteria, Faucaribacterium prasnitzii and other bacteria, Coprococcus genus, Trypanosoma brucei Trypanosoma, Escherichia coli and other Escherichia coli They include those derived from.
  • a DNA having a base sequence of a gene encoding a CoA transferase obtained from each of the above-described organisms or a synthetic DNA sequence synthesized based on the known base sequence is used. be able to.
  • Suitable examples include Clostridium bacteria such as Clostridium acetobutylicum, Roseburia bacteria such as Roseburia intestinalis, Facalibacteria bacteria such as Fakaribacterium plausents, Coprococcus bacteria, Trypanosoma brucei, etc.
  • DNA having the base sequence of a gene derived from a bacterium belonging to the genus Escherichia such as Trypanosoma cerevisiae and Escherichia coli is exemplified. More preferable examples include those derived from Clostridium bacteria or Escherichia bacteria, and particularly preferred is DNA having a base sequence of a gene derived from Clostridium acetobutylicum or Escherichia coli.
  • the four types of enzymes are preferably derived from at least one selected from the group consisting of Clostridium bacteria, Bacillus bacteria, and Escherichia bacteria, from the viewpoint of enzyme activity, and in particular, acetoacetate decarboxylase More preferably, the isopropyl alcohol dehydrogenase is derived from a Clostridium bacterium, and the CoA transferase activity and the thiolase activity are derived from an Escherichia bacterium.
  • the four types of enzymes according to the present invention are preferably derived from any one of Clostridium acetobutylicum, Clostridium beijurinki or Escherichia coli, and acetoacetate decarboxylase is derived from Clostridium acetobutylicum.
  • the CoA transferase and the thiolase are each an enzyme derived from Clostridium acetobutylicum or Escherichia coli
  • the isopropyl alcohol dehydrogenase is an enzyme derived from Clostridium begerinki
  • the above four types of enzymes are: From the viewpoint of enzyme activity, the acetoacetate decarboxylase activity is derived from Clostridium acetobutylicum
  • Genaze active is derived from Clostridium beijerinckii
  • CoA transferase activities and thiolase activity is derived from Escherichia coli.
  • the activity of these enzymes in the present invention is determined by introducing the enzyme gene by enhancing the promoter activity of the enzyme gene introduced into the bacterial body from the outside of the bacterial body or by replacing it with another promoter. It can be expressed strongly.
  • the introduction of the enzyme activity can be performed, for example, by introducing a gene encoding the enzyme from outside the host bacterial cell into the bacterial cell using a gene recombination technique. At this time, the introduced enzyme gene may be the same or different from the host cell.
  • Preparation of genomic DNA necessary for introducing genes from outside the cell into the cell DNA cleavage and ligation, transformation, PCR (Polymerase Chain Reaction), design of oligonucleotides used as primers, synthesis, etc. This can be done by conventional methods well known to those skilled in the art. These methods are described in Sambrook, J., et al., “Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition”, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989).
  • E. coli with enhanced enzyme activity refers to E. coli with enhanced enzyme activity by some method.
  • These Escherichia coli for example, introduce a gene encoding the enzyme and protein by using a gene recombination technique similar to that described above from outside the cell body using a plasmid, or the host E. coli is placed on the genome.
  • the enzyme gene can be produced by a method such as enhancing the promoter activity of the enzyme gene possessed or by strongly expressing the enzyme gene by replacing it with another promoter.
  • the promoter of the gene in the present invention is not limited as long as it can control the expression of any of the above genes, but it is a strong promoter that constantly functions in microorganisms and is suppressed in the presence of glucose. A difficult promoter is good.
  • a promoter of glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase hereinafter sometimes referred to as GAPDH
  • GAPDH glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase
  • the promoter in the present invention means a site where RNA polymerase having sigma factor binds and initiates transcription.
  • the GAPDH promoter derived from Escherichia coli is represented by base numbers 397 to 440 in the base sequence information of GenBank accession number X02662.
  • the CoA transferase gene (atoD and atoA) and the thiolase gene (atoB) derived from E. coli form an operon on the E. coli genome in the order of atoD, atoA, and atoB (Journal of Baceteriology Vol. 169 pp 42-52 Lauren Sallus Jenkins et al.) It is possible to simultaneously control the expression of the CoA transferase gene and the thiolase gene by modifying the promoter of atoD. From this, when the CoA transferase activity and the thiolase activity are obtained from the genome gene of host E.
  • the promoter responsible for the expression of both enzyme genes is compared with other promoters from the viewpoint of obtaining sufficient isopropyl alcohol production ability. It is preferable to enhance the expression of both enzyme genes by substitution or the like.
  • Examples of the promoter used for enhancing the expression of CoA transferase activity and thiolase activity include the aforementioned Escherichia coli-derived GAPDH promoter.
  • pIPA / B strain or pIaaa / B strain described in WO2009 / 008377 can be exemplified as an example of isopropyl alcohol-producing Escherichia coli having an isopropyl alcohol production system.
  • the Escherichia coli is enhanced by enhancing the expression of each gene on the genome of the Escherichia coli to enhance CoA transferase activity and thiolase activity.
  • Enhancement of acetate decarboxylase activity includes strains in which expression of each gene is enhanced with a plasmid (sometimes referred to as pIa / B :: toDAB strain).
  • inactivated GntR activity is preferably included from the viewpoint of more effectively improving isopropyl alcohol productivity. It is further preferred that glucose-6-phosphate isomerase (Pgi) activity inactivated with inactivated GntR and enhanced glucose-6-phosphate-1-dehydrogenase (Zwf) activity are included. GntR activity, inactivated glucose-6-phosphate isomerase (Pgi) activity, inactivated phosphogluconate dehydrogenase (Gnd) activity and enhanced glucose-6-phosphate-1-dehydrogenase (Zwf) activity Is most preferably included. By these combinations, the productivity of isopropyl alcohol can be remarkably improved as compared with other combinations of factors or enzymes.
  • a preferred embodiment of the isopropyl alcohol-producing Escherichia coli in the present invention is a strain in which the GntR activity of the pIPA / B strain, pIaa / B strain or pIa / B :: atoDAB strain is inactivated.
  • the GntR activity and glucose-6-phosphate isomerase (Pgi) activity of the pIPA / B strain, pIaa / B strain or pIa / B :: atoDAB strain are inactivated, and glucose-6-phosphate is inactivated.
  • a strain with enhanced 1-dehydrogenase (Zwf) activity is provided.
  • the GntR activity, glucose-6-phosphate isomerase (Pgi) activity, and phosphogluconate dehydrogenase (Gnd) activity of the pIPA / B strain, pIaa / B strain or pIa / B :: atoDAB strain are inhibited.
  • This strain is activated and has enhanced glucose-6-phosphate-1-dehydrogenase (Zwf) activity.
  • the isopropyl alcohol-producing E. coli according to the present invention can be introduced with a gene group encoding a sucrose utilization enzyme.
  • the gene encoding a sucrose utilization enzyme includes genes encoding enzymes involved in PTS and non-PTS systems in the sucrose utilization pathway of microorganisms.
  • the genes encoding enzymes related to sucrose PTS include ScrA (incorporates sucrose), ScrY (performs phosphorylation of sucrose), ScrB (decomposes sucrose inside the microorganism), ScrR ( And a gene encoding ScrK (which phosphorylates fructose).
  • sucrose non-PTS genes that specifically encode enzymes related to sucrose non-PTS are CscB (sucrose permease: sucrose uptake), CscA (sucrose hydrolase: sucrose degradation inside microorganisms.
  • CscK structurally derived kinase
  • CscR repressor protein: controlling the expression of genes encoding CscB, A, and K
  • sucrose utilization enzyme gene to be introduced into isopropyl alcohol-producing Escherichia coli according to the present invention include genes encoding an enzyme group involved in a non-PTS system. Among them, a combination of one or more enzymes containing at least CscA. A gene can be mentioned. Examples include cscA only, a combination of cscA and cscK, a combination of cscA and cscB, a combination of cscA and cscR, a combination of cscA, cscR and cscK, a combination of cscA, cscR and cscB. Among these, from the viewpoint of efficiently producing isopropyl alcohol, it is also possible to select to introduce only a gene encoding CscA.
  • sucrose hydrolase DNA having a base sequence of a gene encoding sucrose hydrolase (invertase, CscA) obtained from an organism having this enzyme, or a known base sequence thereof
  • a synthetic DNA sequence synthesized based on the above can be used. Preferred are: Erwinia, Porteus, Proteus, Vibrio, Agrobacterium, Rhizobium, Staphylococcus (Staphylococcus) ), And those derived from Bifidobacterium and Escherichia. Examples include DNA having the base sequence of a gene derived from Escherichia coli O157 strain.
  • DNA having a base sequence of a gene derived from Escherichia coli O157 strain.
  • a signal sequence for transferring cscA to the periplasm of the microbial cell is added to cscA.
  • the repressor protein (CscR) gene was synthesized based on a DNA having a base sequence of a gene encoding a repressor protein (CscR) obtained from an organism having this enzyme, or a known base sequence thereof. Synthetic DNA sequences can be utilized. Preferred are: Erwinia, Porteus, Proteus, Vibrio, Agrobacterium, Rhizobium, Staphylococcus (Staphylococcus) ), And those derived from Bifidobacterium and Escherichia. Examples include DNA having the base sequence of a gene derived from Escherichia coli O157 strain. Particularly preferred is DNA having a base sequence of a gene derived from Escherichia coli O157 strain.
  • the fructokinase (CscK) gene was synthesized based on DNA having a base sequence of a gene encoding fructokinase (CscK) obtained from an organism having this enzyme, or a known base sequence thereof. Synthetic DNA sequences can be utilized. Preferred are: Erwinia, Porteus, Proteus, Vibrio, Agrobacterium, Rhizobium, Staphylococcus (Staphylococcus) ), And those derived from Bifidobacterium and Escherichia. Examples include DNA having the base sequence of a gene derived from Escherichia coli O157 strain. Particularly preferred is DNA having a base sequence of a gene derived from Escherichia coli O157 strain.
  • the sucrose permease (CscB) gene is synthesized based on DNA obtained from an organism having this enzyme and having a base sequence of a gene encoding sucrose permease (CscB), or a known base sequence thereof. Synthetic DNA sequences can be used. Preferred are: Erwinia, Porteus, Proteus, Vibrio, Agrobacterium, Rhizobium, Staphylococcus (Staphylococcus) ), And those derived from Bifidobacterium and Escherichia. Examples include DNA having the base sequence of a gene derived from Escherichia coli O157 strain. Particularly preferred is DNA having a base sequence of a gene derived from Escherichia coli O157 strain.
  • the activity of at least one of isopropyl alcohol dehydrogenase and acetoacetate dehydrogenase among the enzymes involved in the isopropyl alcohol production system preferably is genetically modified. It may be derived from a transgene introduced as a body.
  • the “gene variant” includes all the nucleotide sequences of the enzyme gene to which modifications such as deletion, substitution and addition are added.
  • the enzyme gene to be modified may be a native gene of the host or an enzyme gene derived from another kind of microorganism. Further, only the enzyme gene encoding isopropyl alcohol dehydrogenase or only the acetoacetate dehydrogenase enzyme gene may be genetically modified, or these may be genetically modified simultaneously.
  • the target substance-producing ability is enhanced.
  • Any modification may be made.
  • the genetically modified product is a modified gene obtained by modifying the codon used based on the codon usage frequency of E. coli. By using such a genetically modified product, the productivity of isopropyl alcohol can be increased.
  • modifying the codon used means modifying a codon which is a sequence of 3 bases corresponding to each amino acid on the base sequence encoding the amino acid sequence.
  • codon modification means that only the base sequence is modified without changing the amino acid sequence.
  • the genetically modified isopropyl alcohol dehydrogenase preferably has the base sequence represented by SEQ ID NO: 40.
  • the genetically modified acetoacetate dehydrogenase preferably has the base sequence represented by SEQ ID NO: 43.
  • Escherichia coli originally refers to E. coli that can have the ability to produce isopropyl alcohol from plant-derived materials by using any means, regardless of whether or not it has the ability to produce isopropyl alcohol from plant-derived materials. means.
  • the Escherichia coli to be subjected to the above gene recombination may be one that does not have the ability to produce isopropyl alcohol, and any Escherichia coli may be used as long as introduction and modification of each of the above genes are possible. . More preferably, it can be Escherichia coli preliminarily imparted with the ability to produce isopropyl alcohol, whereby isopropyl alcohol can be produced more efficiently.
  • isopropyl alcohol-producing Escherichia coli for example, acetoacetic acid decarboxylase activity, isopropyl alcohol dehydrogenase activity, CoA transferase activity, and thiolase activity described in WO2009 / 008377 pamphlet are imparted, and isopropyl alcohol is obtained from plant-derived materials. Examples include isopropyl alcohol-producing Escherichia coli that can be produced.
  • the isopropyl alcohol production method of the present invention includes producing isopropyl alcohol from a plant-derived material using the isopropyl alcohol-producing Escherichia coli, that is, contacting the isopropyl alcohol-producing Escherichia coli with a plant-derived material, It includes culturing (hereinafter, culturing step) and recovering isopropyl alcohol obtained by contact (hereinafter, recovering step).
  • the plant-derived material used in the above isopropyl alcohol production method is a carbon source obtained from a plant, and is not particularly limited as long as it is a plant-derived material.
  • plant-derived materials refer to organs such as roots, stems, trunks, branches, leaves, flowers, seeds, plants containing them, and degradation products of these plant organs.
  • the carbon sources obtained from the degradation products thereof those that can be used as a carbon source in culture by microorganisms are also included in the plant-derived raw materials.
  • Carbon sources included in such plant-derived materials generally include sugars such as starch, sucrose, glucose, fructose, xylose, and arabinose, and herbaceous degradation products and cellulose hydrolysates that contain a large amount of these components.
  • sugars such as starch, sucrose, glucose, fructose, xylose, and arabinose
  • herbaceous degradation products and cellulose hydrolysates that contain a large amount of these components.
  • vegetable oil-derived glycerin or fatty acid may also be included in the carbon source in the present invention.
  • Examples of plant-derived raw materials in the present invention can preferably include crops such as cereals, corn, rice, wheat, soybeans, sugar cane, beet, cotton, and the like, and combinations thereof. There are no particular restrictions on raw products, juice, pulverized products, and the like. Moreover, the form of only the above-mentioned carbon source may be sufficient.
  • the contact between the isopropyl alcohol-producing Escherichia coli and the plant-derived material in the culturing step is performed by culturing the isopropyl alcohol-producing Escherichia coli in a medium containing the plant-derived material.
  • the contact density between the plant-derived material and isopropyl alcohol-producing E. coli varies depending on the activity of the isopropyl alcohol-producing E. coli, but in general, the initial sugar concentration in terms of glucose relative to the total mass of the mixture as the concentration of the plant-derived material in the medium. From the viewpoint of E. coli sugar resistance, the initial sugar concentration can be preferably 15 mass% or less. Each of these other components may be added in an amount usually added to the microorganism medium, and is not particularly limited.
  • a medium used for culturing isopropyl alcohol-producing Escherichia coli a commonly used medium containing organic trace elements, nucleic acids, vitamins, etc. required by microorganisms to produce carbon source, nitrogen source, inorganic ions, and lactic acid. If there is no restriction in particular.
  • the culture conditions are not particularly limited.
  • the pH is 4 to 9, preferably 6 to 8, and the temperature is 20 ° C. to 50 ° C., preferably 25 ° C. to 42 ° C. under aerobic conditions. And culturing while appropriately controlling the temperature.
  • the amount of gas flow into the mixture is not particularly limited. However, when only air is used as the gas, generally 0.02 vvm to 2.0 vvm (vvm; aeration capacity [mL] / liquid capacity [mL] ] / Hour [minute]), and from the viewpoint of suppressing physical damage to E. coli, it is preferably performed at 0.1 vvm to 1.5 vvm.
  • the culture process can be continued from the start of culture until the plant-derived raw material in the mixture is consumed or until the activity of the isopropyl alcohol-producing Escherichia coli ceases.
  • the period of the culturing step varies depending on the number and activity of isopropyl alcohol-producing Escherichia coli in the mixture and the amount of plant-derived raw material, but is generally 1 hour or longer, preferably 4 hours or longer.
  • the culture period can be continued indefinitely. From the viewpoint of treatment efficiency, it is generally 5 days or less, preferably 72 hours or less. it can. For other conditions, the conditions used for normal culture may be applied as they are.
  • the method for recovering the isopropyl alcohol accumulated in the culture solution is not particularly limited.
  • the isopropyl alcohol is separated by a conventional separation method such as distillation or membrane separation. Can be used.
  • the method for producing isopropyl alcohol of the present invention includes a pre-culture step for bringing the isopropyl alcohol-producing Escherichia coli to be used into an appropriate number of cells or an appropriate active state before the culture step for producing isopropyl alcohol. May be.
  • the pre-culture process may be a culture under the culture conditions normally used according to the type of isopropyl alcohol-producing bacterium.
  • the isopropyl alcohol production method of the present invention is preferably produced by culturing the isopropyl alcohol-producing Escherichia coli while supplying gas into the mixture containing the isopropyl alcohol-producing bacteria and the plant-derived raw material, and the culture.
  • the produced E. coli is cultured while supplying gas to the mixture (aeration culture).
  • the produced isopropyl alcohol is released into the mixture and evaporated from the mixture.
  • the produced isopropyl alcohol can be easily separated from the mixture.
  • separates continuously from a mixture, the raise of the density
  • E._coli is just to use the basic medium generally used for culture
  • the above-mentioned matters are applied as they are.
  • isopropyl alcohol produced in the culture step and separated from the mixture is recovered.
  • Any recovery method may be used as long as it can collect gaseous or droplets of isopropyl alcohol evaporated from the mixture by normal culture. Examples of such a method include storing in a commonly used collection member such as a sealed container, etc. Among them, from the viewpoint that only isopropyl alcohol can be recovered with high purity, capturing for capturing isopropyl alcohol. It preferably includes contacting the liquid with isopropyl alcohol separated from the mixture.
  • isopropyl alcohol can be recovered as a form dissolved in a capture solution or mixture.
  • a recovery method include the method described in International Publication No. 2009/008377.
  • the recovered isopropyl alcohol can be confirmed using ordinary detection means such as HPLC.
  • the recovered isopropyl alcohol can be further purified as necessary. Examples of such a purification method include distillation.
  • the isopropyl alcohol production method may further include a dehydration step in addition to the recovery step. Isopropyl alcohol can be dehydrated by a conventional method.
  • FIG. 1 of International Publication No. 2009/008377 As an apparatus applicable to the production method of isopropyl alcohol which can be recovered as an embodiment dissolved in a capture liquid or a mixture, for example, a production apparatus shown in FIG. 1 of International Publication No. 2009/008377 can be given.
  • an infusion tube for injecting gas from the outside of the apparatus is connected to a culture tank in which a culture medium containing isopropyl alcohol-producing bacteria and plant-derived raw materials is accommodated, and aeration can be performed on the culture medium.
  • the trap tank in which the trap liquid as a capture liquid is accommodated is connected to the culture tank via a connecting pipe. At this time, the gas or liquid moved to the trap tank comes into contact with the trap liquid to cause bubbling.
  • cultivation in a culture tank is evaporated by aeration, and is easily isolate
  • isopropyl alcohol can be continuously and conveniently produced in a more purified form.
  • isopropyl alcohol can be produced at a high rate, and the amount of production usually obtained by the same method is larger than that in the case where the present invention is not applied.
  • the productivity can be 50 to 100 g / L / 72 hr, preferably 55 to 80 g / L / 72 hr, depending on the conditions of the production method and the state of the isopropyl alcohol-producing Escherichia coli used.
  • the isopropyl alcohol-producing Escherichia coli of the present invention can produce isopropyl alcohol at a high rate, for example, when isopropyl alcohol is produced using the Escherichia coli catalyst of the present invention, 75 g / L or more in 72 hours of culture. Thus, much higher productivity can be obtained as compared with conventional catalysts.
  • acetone which is a precursor of isopropyl alcohol
  • the obtained acetone is preferably converted to isopropyl alcohol by purification using a known method and then using a known method (for example, the method described in Japanese Patent No. 2786272). Thereby, the conversion efficiency from the sugar raw material to isopropyl alcohol can be further increased.
  • the acetone production method includes obtaining isopropyl alcohol from a plant-derived raw material using the isopropyl alcohol-producing Escherichia coli (hereinafter referred to as isopropyl alcohol production step), and using the obtained isopropyl alcohol as a catalyst, zinc oxide And an at least one oxide containing a Group 4 element and a composite oxide prepared by a coprecipitation method (hereinafter referred to as an acetone production step).
  • an acetone production step By contacting the composite oxide prepared by the coprecipitation method with isopropyl alcohol obtained using the isopropyl alcohol-producing Escherichia coli, dehydrogenation occurs, and acetone can be produced from isopropyl alcohol.
  • the isopropyl alcohol produced using the isopropyl alcohol-producing Escherichia coli can be effectively used to efficiently produce a substance.
  • a composite oxide containing zinc oxide and at least one oxide containing a Group 4 element and prepared by a coprecipitation method is used as a catalyst.
  • the group 4 element means a group 4 element in the periodic table, and examples thereof include titanium, zirconium, and hafhanium. Zirconium is preferable in terms of producing acetone with high selectivity.
  • Examples of the composite oxide that can be used as a catalyst include ZnO: ZrO 2 , ZnO: TiO 2 , CuO: ZnO: Al 2 O 3 , and the like. From the viewpoint of catalyst activity and acetone selectivity, ZnO: ZrO 2 is preferred.
  • the ratio of zinc oxide to at least one oxide containing a Group 4 element is not particularly limited, but is preferably 50:50 to 99: 1 from the viewpoint of catalyst activity and acetone selectivity. 65:35 to 95: 5 is more preferable. If the ratio of zinc oxide is 50 or more, higher catalytic activity can be exhibited, and if it is 99 or less, higher acetone selectivity can be exhibited, which is preferable.
  • the composite oxide is prepared by a coprecipitation method. Since the composite oxide that can be used as a catalyst is prepared by a coprecipitation method, it has advantages such as uniformity of catalyst composition and ease of control of catalyst preparation.
  • the coprecipitation coprecipitation method is a preparation method generally used as a method for producing a multicomponent composite oxide, and a precipitating agent such as an alkaline aqueous solution is added to a mixed aqueous solution of two or more metal salts. And can be uniformly precipitated as a solid.
  • a water-soluble zinc salt aqueous solution such as zinc nitrate and a water-soluble zirconium salt aqueous solution such as zirconium nitrate are mixed so as to have a desired metal oxide composition.
  • a solid is precipitated as a hydroxide by dropping the aqueous solution into an alkaline aqueous solution such as sodium carbonate to make it alkaline. The produced precipitate can be filtered, washed with water, dried and then fired.
  • the amount of catalyst to be used is not particularly limited.
  • the supply amount (mass) of raw material (isopropyl alcohol) per hour is the mass of the catalyst.
  • the value divided by, ie, WHSV is desirably in the range of 0.01 to 200 / h, more preferably in the range of 0.02 to 100 / h.
  • the dehydrogenation reaction in the present invention can be carried out in a reaction system such as a batch system or a continuous system.
  • a reaction system such as a batch system or a continuous system.
  • the raw material is circulated through a tubular reactor filled with a catalyst, and the reaction product discharged from the reactor is recovered.
  • the reaction temperature during the dehydrogenation reaction is usually 100 ° C to 500 ° C, preferably 150 ° C to 450 ° C, more preferably 200 ° C to 400 ° C.
  • Acetone, isopropyl alcohol, and hydrogen have an equilibrium relationship, and the higher the reaction temperature, the higher the equilibrium composition of acetone. For this reason, if the reaction temperature is 100 ° C. or higher, it is preferable that a large amount of isopropyl alcohol does not remain.
  • reaction pressure is not particularly limited and depends on the reaction temperature, but is preferably 0.1 MPa to 1.0 MPa.
  • purification and the like may be additionally performed as necessary.
  • the purification method of acetone and the like a well-known or known purification method in the art can be applied.
  • isopropyl alcohol containing acetone is obtained from a plant-derived raw material using the isopropyl alcohol-producing Escherichia coli (hereinafter referred to as isopropyl alcohol production step), and the obtained isopropyl alcohol containing acetone is used.
  • a hydrogenation catalyst containing Cu and a solid acid substance as a catalyst acetone and hydrogen are reacted at a reaction temperature in the range of 50 to 300 ° C.
  • the hydrogenation catalyst containing Cu is hereinafter simply referred to as “hydrogenation catalyst” in the specification.
  • isopropyl alcohol obtained from the isopropyl alcohol-producing Escherichia coli is dehydrated with the solid acid substance to produce propylene and water.
  • the conditions for producing isopropyl alcohol, and the like the matters described above regarding the production of isopropyl alcohol can be applied as they are.
  • acetone and hydrogen are reacted under predetermined conditions using a hydrogenation catalyst containing Cu and a solid acid substance using isopropyl alcohol containing acetone obtained in the isopropyl alcohol production step as a raw material.
  • molecular hydrogen gas may be used, or hydrogen derived from a hydrocarbon such as cyclohexane that generates hydrogen depending on reaction conditions.
  • hydrogen should be equimolar or more with respect to acetone.
  • hydrogen is preferably 1 to 10 times mol, more preferably 1 to 5 times mol with respect to acetone.
  • the supply amount of hydrogen per hour with respect to the supply amount of acetone per hour may be set within the above range.
  • the supplied hydrogen is combined with oxygen atoms of acetone to form water, which can be taken out from the reactor outlet. Further, hydrogen equal to or more than the equivalent amount of acetone is essentially not consumed unless an unexpected side reaction proceeds.
  • hydrogen gas is supplied to the reactor, it is normally supplied continuously, but the method is not particularly limited.
  • the supply during the reaction may be stopped and intermittent supply may be performed after a certain period of time has elapsed, or in the case of a liquid phase reaction, Hydrogen gas may be dissolved and supplied.
  • hydrogen can be reused by removing the hydrogen from the reactor.
  • a hydrogen recycling process for example, the reaction liquid and the reaction gas are separated by a gas-liquid separator at the rear part of the reactor, and the hydrogen gas is separated from the reaction gas by a separation membrane and supplied again to the inlet of the reactor. May be.
  • hydrogen gas recovered from the top of the column together with the light boiling fraction can be supplied to the reactor.
  • the pressure of hydrogen to be supplied is generally equal to the pressure in the reactor, but may be appropriately changed according to the hydrogen supply method.
  • the reaction may be carried out in a diluted state by supplying a solvent or gas inert to the catalyst and starting materials (acetone, isopropyl alcohol, and hydrogen) into the reaction system.
  • the reaction temperature applied to the catalytic reaction step is 50 ° C. to 300 ° C. If it is less than 50 ° C., sufficient conversion of acetone or isopropyl alcohol cannot be obtained, and if it exceeds 300 ° C., unexpected side reactions, polymerization of propylene, etc. occur, and sufficient propylene selectivity cannot be maintained.
  • the reaction temperature is preferably in the range of 150 ° C. to 250 ° C., more preferably 150 to 200 ° C.
  • the starting material, acetone, isopropyl alcohol, and hydrogen can be contacted or supplied with hydrogen by either gas-liquid counter-current or gas-liquid co-flow.
  • the liquid and gas directions can be liquid descending-gas rising, liquid rising. Any of gas down, liquid gas up, or liquid gas down.
  • the working pressure is preferably 0.1 to 500 atm, more preferably 0.5 to 100 atm.
  • the solid acid substance examples include metal oxides such as zeolite, silica, alumina, silica alumina, ⁇ alumina, titanium oxide, zinc oxide, and zirconium oxide, which are ordinary solid acids.
  • metal oxides such as zeolite, silica, alumina, silica alumina, ⁇ alumina, titanium oxide, zinc oxide, and zirconium oxide, which are ordinary solid acids.
  • zeolite is preferable in terms of high catalyst activity and high propylene selectivity.
  • a suitable zeolite may be selected depending on the molecular diameters of isopropyl alcohol and target propylene which are considered to exist as raw materials and intermediates in the reaction.
  • the zeolite is preferably a zeolite having pores of 10 to 12-membered oxygen because it is close to the molecular diameter of isopropyl alcohol or propylene.
  • Zeolite having a 10 to 12-membered ring of oxygen includes ferrierite, hurlandite, ZSM-5, ZSM-11, ZSM-12, NU-87, sheeter 1, weinebeite, X-type zeolite, Y-type zeolite, USY-type zeolite. Mordenite, dealuminated mordenite, ⁇ -zeolite, MCM-22, MCM-56 and the like. Of these, ⁇ -zeolite is preferred.
  • the composition ratio of silicon to aluminum in the zeolite is preferably in the range of 2/1 to 200/1 in order to obtain high activity, and 5/1 to 100 in terms of activity and thermal stability. It is particularly preferable that the ratio is in the range of / 1.
  • so-called isomorphously substituted zeolite in which aluminum contained in the zeolite skeleton is substituted with a metal other than aluminum such as Ga, Ti, Fe, Mn, and B can also be used.
  • a zeolite what modified itself with the metal ion can also be used.
  • the shape of the solid acid substance is not particularly limited, and may be spherical, cylindrical, extruded, or crushed. Further, the size of the particles is not particularly limited, and usually a particle size in the range of 0.01 mm to 100 mm may be selected according to the size of the reactor.
  • a solid acid substance may be used individually by 1 type, and may use 2 or more types.
  • Examples of the hydrogenation catalyst containing Cu include those containing Cu as a metal itself and those containing a metal compound.
  • the metal compound include metal oxides such as CuO and Cu 2 O; and metal chlorides such as CuCl 2 . These catalysts may be supported on a carrier.
  • the hydrogenation catalyst containing Cu further contains at least one element of Group 6, Group 12 and Group 13 of the periodic table, in order to obtain higher selectivity or longer catalyst life. ,preferable. Group 6 includes Cr, Mo and the like; Group 12 includes Zn and the like; Group 13 includes Al, In and the like. Examples of such hydrogenation catalysts include copper-based catalysts such as copper-chromium, Raney copper, and copper-zinc.
  • the hydrogenation catalyst containing Cu may be added with a metal salt such as PbSO 4 , FeCl 2 , SnCl 2 ; an alkali metal or alkali metal salt such as K or Na; BaSO 4 ; In some cases, the activity of the hydrogenation catalyst containing Cu and the selectivity of propylene may be improved.
  • the amount of the metal salt, alkali metal or alkali metal salt added to the hydrogenation catalyst is not particularly limited, but is 0.01% by mass to 10.00% by mass mainly in terms of selectivity. Is preferred.
  • Examples of commercially available hydrogenation catalysts containing Cu include CuO—ZnO—Al 2 O 3 and CuO—Cr 2 O 3 —BaO.
  • the shape of the hydrogenation catalyst is not particularly limited, and may be spherical, cylindrical, extruded, or crushed. Further, the size of the particles is not particularly limited, and usually a particle size in the range of 0.01 mm to 100 mm may be selected according to the size of the reactor.
  • the acetone and hydrogen can be supplied to the reactor filled with the hydrogenation catalyst and the solid acid substance, and the acetone and hydrogen can be reacted.
  • the total amount of the hydrogenation catalyst and the solid acid substance (hereinafter also referred to as “catalytic amount”) charged in the reactor is not particularly limited.
  • the catalyst amount (weight) of acetone as a starting material is divided by the catalyst amount (weight), that is, WHSV, it is preferably 0.1 to 200 / h, more preferably 0.2 to The range is 100 / h.
  • the amount ratio of the solid acid substance and the hydrogenation catalyst is not particularly limited, but the solid acid substance: hydrogenation catalyst (mass ratio) is usually 1: 0.01 to 1: 100, preferably 1: 0.05 to It is preferably 1:50. If the amount ratio of the solid acid substance: hydrogenation catalyst is 1: 0.01 or more, the conversion rate of acetone tends to be sufficient, and the ratio of the solid acid substance: hydrogenation catalyst is within 1: 100. If present, the dehydration reaction is sufficiently performed and the yield of propylene tends to be sufficient.
  • the reaction can be regenerated by a known method to recover the activity of the hydrogenation catalyst and the solid acid substance.
  • two components of a solid acid substance and a hydrogenation catalyst may be used as the catalyst.
  • the method of using the catalyst is not particularly limited, and for example, a solid acid substance that is an acid catalyst component and a hydrogenation catalyst that are physically mixed at a centimeter-size catalyst particle level may be used. Then, after finely mixing both of them, it may be formed again into centimeter-sized catalyst particles, a solid acid substance as a support, a hydrogenation catalyst may be supported thereon, and a hydrogenation catalyst may be As a carrier, a solid acid substance may be supported thereon. Moreover, you may use each, without mixing a hydrogenation catalyst and a solid acid substance.
  • the hydrogenation catalyst may be supported on zeolite.
  • a preparation method thereof a method of impregnating zeolite in an aqueous solution of Cu nitrate or the like and calcining; in order to make Cu soluble in an organic solvent, as a complex in which an organic molecule called a ligand is combined with Cu, A method of adding in an organic solvent, preparing a solution, impregnating the solution with zeolite and calcining; and further, a method of supporting a zeolite by vapor deposition or the like because some of the complexes are vaporized under vacuum. .
  • the hydrogenation catalyst may be supported on a carrier other than zeolite.
  • the carrier capable of supporting the hydrogenation catalyst include silica, alumina, silica alumina, titania, magnesia, silica magnesia, zirconia, zinc oxide, carbon (activated carbon), acid clay, and diatomaceous earth.
  • silica, alumina, silica alumina, titania, magnesia, silica magnesia, zirconia, zinc oxide, and carbon (activated carbon) is selected in terms of higher activity and higher selectivity. preferable.
  • Examples of the reactor used in the present invention include a fixed bed reactor, a fluidized bed reactor and the like. From the viewpoint of preventing catalyst abrasion and powdering, a fixed bed reactor is preferable.
  • the method for charging the hydrogenation catalyst and the solid acid substance into the reactor is not particularly limited.
  • the hydrogenation catalyst and the method of filling the solid acid substance may greatly affect the reaction results.
  • the hydrogenation and dehydration reactions are considered to occur in stages. Therefore, it is preferable to charge the reactor with appropriate catalyst species corresponding to each stage of the reaction in order to efficiently use the catalyst and to suppress unwanted side reactions. is there.
  • an appropriate catalyst type corresponding to each stage of the reaction may be charged in the reactor in order, or the mixing ratio of the hydrogenation catalyst and the solid acid substance may be inclined to be charged in the reactor.
  • Examples of the method for charging the hydrogenation catalyst and the solid acid substance into the reactor include, for example, (1) a method of mixing and charging the hydrogenation catalyst and the solid acid substance in the reactor, and (2) a hydrogenation catalyst A method of filling so as to form a layer (upstream side, i.e., inlet side) and a layer made of solid acid material (downstream side, i.e., outlet side), and (3) filling with a solid acid material carrying a hydrogenation catalyst.
  • a layer made of a hydrogenation catalyst and a solid acid substance upstream side, ie, inlet side
  • a layer made of a solid acid substance (7)
  • a layer made of a solid acid material carrying an hydrogenation catalyst upstream side, that is, the inlet side
  • a layer made of a solid acid material downstream
  • the upstream side refers to the inlet side of the reactor, that is, the layer through which the starting material passes in the first half of the reaction
  • the downstream side refers to the outlet side of the reactor, that is, the starting material, intermediate and reaction product.
  • the layer passing through the second half of the reaction is shown.
  • the starting materials mean acetone and hydrogen, but when acetone and hydrogen are supplied to the reactor by gas-liquid countercurrent, the upstream side (inlet side) means that acetone passes in the first half of the reaction. It means the layer to do.
  • two or three reactors are arranged in parallel, and the reaction is carried out in the remaining one or two reactors while the catalyst in one reactor is being regenerated. You can take a merry-go-round method. Further, when there are three reactors, it is possible to connect the other two reactors in series to reduce the fluctuation of the production amount. In addition, when carried out in a fluidized bed flow reaction system or a moving bed reaction system, a certain activity is obtained by continuously or intermittently extracting a part or all of the catalyst from the reactor and replenishing the corresponding amount. Can be maintained.
  • Example 1 ⁇ Preparation of B :: atoDAB strain>
  • the entire base sequence of the genomic DNA of Escherichia coli MG1655 strain is known (GenBank accession number U00096), and the gene encoding the CoA transferase ⁇ subunit of Escherichia coli MG1655 strain (hereinafter sometimes abbreviated as atoD) Base sequences have also been reported. That is, atoD is described in 232469-3232131 of the genome sequence of Escherichia coli MG1655 described in GenBank accession number U00096.
  • GAPDH The glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (hereinafter referred to as GAPDH) derived from Escherichia coli described in 397-440 in the base sequence information of GenBank accession number X02662 as the base sequence of the promoter necessary for expressing the above gene Promoter sequences) may be used.
  • GAPDH promoter the genomic DNA of Escherichia coli MG1655 strain was used as a template, and cgctcaattgcaatgattgaccacattttccg (SEQ ID NO: 1) and agagaattcgctattttgttgtgattagagt (SEQ ID NO: 2) were obtained by the PCR method.
  • a DNA fragment encoding the GAPDH promoter of about 100 bp was obtained by digestion with EcoRI.
  • the obtained DNA fragment was mixed with plasmid pUC19 (GenBank accession number X02514) digested with restriction enzyme EcoRI and further treated with alkaline phosphatase, and ligase was used for ligation, followed by Escherichia coli DH5 ⁇ strain competent cell ( Toyobo Co., Ltd. DNA-903) was transformed to obtain a transformant that grew on an LB agar plate containing 50 ⁇ g / mL of ampicillin.
  • the genomic DNA of Escherichia coli MG1655 strain was used as a template to obtain cgaattcgctggtggagaatatatgaaaaaaaatgacatatacaagac (SEQ ID NO: 3), and the DNA fragment obtained by the gcggtactttatttttgtctctgtgtgtggt restriction method. Digestion with EcoRI and KpnI yielded an approximately 690 bp atoD fragment.
  • This DNA fragment was mixed with pUCgapP previously digested with restriction enzymes EcoRI and KpnI, ligated with ligase, transformed into Escherichia coli DH5 ⁇ competent cell (Toyobo Co., Ltd. DNA-903), and ampicillin.
  • a transformant that grows on an LB agar plate containing 50 ⁇ g / mL was obtained.
  • a plasmid was recovered from the obtained cells, and it was confirmed that atoD was correctly inserted. This plasmid was named pGAPatoD.
  • Escherichia coli MG1655 strain can be obtained from the American Type Culture Collection.
  • a primer of SEQ ID NO: 4 prepared based on the sequence information of ggtctagagcaatgattagaacgagtccccg (SEQ ID NO: 7) prepared based on the sequence information of the GAPDH promoter of Escherichia coli MG1655 strain and atoD of Escherichia coli MG1655 strain was used. Then, PCR was performed using the expression vector pGAPatoD prepared earlier as a template to obtain a DNA fragment of about 790 bp consisting of the GAPDH promoter and atoD.
  • the fragments obtained above were digested with restriction enzymes PstI and XbaI, XbaI and KpnI, respectively, and this fragment was temperature-sensitive plasmid pTH18cs1 (GenBank accession number AB019610) [Hashimoto-Gotoh, T., Gene, 241, 185-191 (2000)] was mixed with a fragment obtained by digesting with PstI and KpnI, ligated with ligase, transformed into DH5 ⁇ strain, and applied to an LB agar plate containing 10 ⁇ g / ml of chloramphenicol at 30 ° C. A growing transformant was obtained. The obtained colony was cultured overnight at 30 ° C.
  • cgagctatacatgcaatgattgacagattttccg SEQ ID NO: 18
  • cgcgcgcatgctattttgttgatagatag SEQ ID NO: 19
  • the resulting DNA fragment and the plasmid pBR322 (GenBank accession number J01749) were mixed with fragments obtained by digesting with restriction enzymes NdeI and SphI, ligated with ligase, and then Escherichia coli DH5 ⁇ strain competent cell (Toyo) Spinning Co., Ltd. DNA-903) was transformed to obtain a transformant that grew on an LB agar plate containing 50 ⁇ g / mL of ampicillin. The obtained colonies were cultured overnight at 37 ° C. in an LB liquid medium containing 50 ⁇ g / mL of ampicillin, and the plasmid pBRgapP was recovered from the obtained cells.
  • the genomic DNA of Clostridium beijerinckii R NRRL B-593 was used as a template, aatatgcatgctgtgtgtgacatatgaatagttttgcaatgtctagg (SEQ ID NO: 8), and gtgt
  • the fragment was digested with restriction enzymes SphI and BamHI to obtain an isopropyl alcohol dehydrogenase fragment of about 1.1 kbp.
  • the obtained DNA fragment was mixed with a fragment obtained by digesting the plasmid pBRgapP with restriction enzymes SphI and BamHI, ligated with ligase, and then Escherichia coli DH5 ⁇ strain competent cell (Toyobo Co., Ltd. Sakai DNA-903) And a transformant that grows on an LB agar plate containing 50 ⁇ g / mL of ampicillin was obtained.
  • the obtained colony was cultured overnight at 37 ° C. in an LB liquid medium containing 50 ⁇ g / mL of ampicillin, and the plasmid was recovered from the obtained bacterial cells to confirm that IPAdh was correctly inserted. It was named IPAdh.
  • Clostridium acetobutyricum ATCC824 genomic DNA was used as a template, and the DNA sequence was obtained from the following: Digestion with restriction enzymes BamHI and EcoRI gave an acetoacetate decarboxylase fragment of about 700 bp.
  • the obtained DNA fragment and the previously prepared plasmid pGAP-IPAdh were digested with restriction enzymes BamHI and EcoRI, mixed together using ligase, and then Escherichia coli DH5 ⁇ strain competent cell (Toyo Spinning Co., Ltd. DNA-903) was transformed to obtain a transformant that grew on an LB agar plate containing 50 ⁇ g / mL of ampicillin.
  • the obtained colony was cultured overnight at 37 ° C. in an LB liquid medium containing 50 ⁇ g / mL of ampicillin, and the plasmid was recovered from the obtained bacterial cells to confirm that adc was correctly inserted. Named.
  • the genome DNA of Escherichia coli B strain (GenBank accession No. CP000819) was used as a template, and cagagtccccggaagactcttatggggcacacgaccatagccatac sequence number and The resulting DNA fragment was digested with restriction enzymes BamHI and XbaI to obtain an about 1500 bp glucose 6-phosphate 1-dehydrogenase fragment.
  • the obtained DNA fragment and the plasmid pIa prepared above were digested with the restriction enzymes BamHI and XbaI and mixed with ligase, and then ligase was used, followed by Escherichia coli DH5 ⁇ strain competent cell (Toyobo Co., Ltd.) DNA-903) was transformed to obtain transformants that grew on LB agar plates containing 50 ⁇ g / mL of ampicillin. The obtained colony was cultured overnight at 37 ° C. in an LB liquid medium containing 50 ⁇ g / mL of ampicillin, and the resulting plasmid was designated as pIaz.
  • This plasmid pIaz was transformed into Escherichia coli B :: atoDAB competent cells prepared in Example 1, and cultured overnight at 37 ° C. on LB Broth, Miller agar plates containing 50 ⁇ g / mL of ampicillin. Coli pIaz / B :: atoDAB was obtained.
  • Example 3 ⁇ Preparation of Escherichia coli B strain ⁇ pgi strain>
  • the entire base sequence of the genomic DNA of Escherichia coli MG1655 is known (GenBank accession number U00096), and the base sequence of a gene encoding Escherichia coli phosphoglucose isomerase (hereinafter sometimes referred to as pgi) has also been reported. (GenBank accession number X15196).
  • nucleotide sequence region near the gene (1,650Bp) encoding pgi caggaattcgctatatctggctctgcacg (SEQ ID NO: 14), cagtctagagcaatactcttctgattttgag (SEQ ID NO: 15), oligo shown in Shieijitictagatcatcgtcgatatgtaggcc (SEQ ID NO: 16) and Jieishishitgcagatcatccgtcagctgtacgc (SEQ ID NO: 17) Four types of nucleotide primers were synthesized.
  • the primer of SEQ ID NO: 14 has an EcoRI recognition site on the 5 ′ end side
  • the primers of SEQ ID NOS: 15 and 16 have an XbaI recognition site on the 5 ′ end side
  • the primer of SEQ ID NO: 17 has a PstI recognition site on the 5 ′ end side.
  • a genomic DNA of Escherichia coli MG1655 strain was prepared, and the obtained genomic DNA was used as a template, and a DNA fragment of about 1.0 kb was amplified by PCR using the primer pair of SEQ ID NO: 14 and SEQ ID NO: 15. (Hereinafter sometimes referred to as pgi-L fragment).
  • a DNA fragment of about 1.0 kb was amplified by PCR using the primer pair of SEQ ID NO: 16 and SEQ ID NO: 17 (hereinafter sometimes referred to as pgi-R fragment).
  • a transformant was obtained that grew on an LB agar plate containing 10 ⁇ g / ml of chloramphenicol at 30 ° C.
  • a plasmid was recovered from the obtained transformant, and it was confirmed that two fragments, a 5 'upstream vicinity fragment and a 3' downstream vicinity fragment of the gene encoding pgi were correctly inserted into pTH18cs1.
  • the obtained plasmid was digested with XbaI, and then blunt-ended with T4 DNA polymerase.
  • This DNA fragment and the pUC4K plasmid (GenBank accession number X06404) (Pharmacia) digested with EcoRI and the kanamycin resistance gene further blunt-ended with T4 DNA polymerase were ligated using T4 DNA ligase. did. Thereafter, the cells were transformed into Escherichia coli DH5 ⁇ competent cells to obtain transformants that grew at 30 ° C. on LB agar plates containing chloramphenicol 10 ⁇ g / ml and kanamycin 50 ⁇ g / ml.
  • the plasmid was recovered from the obtained transformant, and it was confirmed that the kanamycin resistance gene was correctly inserted between the 5 ′ upstream neighboring fragment and the 3 ′ downstream neighboring fragment of the gene encoding pgi, and pTH18cs1-pgi and did.
  • the plasmid pTH18cs1-pgi thus obtained was transformed into Escherichia coli B strain (ATCC 11303), and cultured on an LB agar plate containing 10 ⁇ g / ml of chloramphenicol and 50 ⁇ g / ml of kanamycin at 30 ° C. overnight. Got the body.
  • the obtained transformant was inoculated into an LB liquid medium containing kanamycin 50 ⁇ g / ml and cultured at 30 ° C. overnight. Next, a part of this culture solution was applied to an LB agar plate containing kanamycin 50 ⁇ g / ml to obtain colonies that grew at 42 ° C.
  • the obtained colonies were cultured in an LB liquid medium containing kanamycin 50 ⁇ g / ml for 24 hours at 30 ° C., and further applied to an LB agar plate containing kanamycin 50 ⁇ g / ml to obtain colonies that grew at 42 ° C.
  • B ⁇ pgi strain 100 colonies were picked up randomly from the appearing colonies and grown on LB agar plates containing 50 ⁇ g / ml kanamycin and LB agar plates containing 10 ⁇ g / ml chloramphenicol, and LB agar containing kanamycin. Chloramphenicol sensitive clones that grow only on plates were selected. Furthermore, from the chromosomal DNA of these target clones, a strain that can amplify an about 3.3 kbp fragment by selecting the pgi gene for the kanamycin resistance gene by PCR was selected, and the resulting strain was selected as a B strain pgi gene deficient. It was named a lost strain (hereinafter sometimes abbreviated as B ⁇ pgi strain).
  • Escherichia coli MG1655 strain and Escherichia coli B strain can be obtained from American Type Culture Collection.
  • Example 4 ⁇ Preparation of pIaaa / B ⁇ pgi strain>
  • the amino acid sequences of Escherichia coli thiolase and Escherichia coli CoA transferase and the nucleotide sequences of the genes have already been reported. That is, the gene encoding thiolase is described in 2324131 to 2325315 of the Escherichia coli MG1655 strain genome sequence described in GenBank accession number U00096. A gene encoding CoA transferase is described in the above-mentioned genome sequence of 232669 to 2322781 of Escherichia coli MG1655 strain. Together with these, isopropyl alcohol can be produced by expressing the acetoacetate decarboxylase gene and isopropyl alcohol dehydrogenase gene derived from Clostridium bacteria described later.
  • the genomic DNA of Clostridium in beijerinckii NRRL ⁇ ⁇ ⁇ B-593 was used as a template.
  • the fragment was digested with restriction enzymes SphI and BamHI to obtain an isopropyl alcohol dehydrogenase fragment of about 1.1 kbp.
  • the obtained DNA fragment and the fragment obtained by digesting the plasmid pBRgapP prepared in Example 2 with restriction enzymes SphI and BamHI were mixed and ligated using ligase, and then Escherichia coli DH5 ⁇ strain competent cell (Toyo Spinning Co., Ltd.
  • DNA-903 was transformed to obtain a transformant that grew on an LB agar plate containing 50 ⁇ g / mL of ampicillin.
  • the obtained colonies were cultured overnight at 37 ° C. in an LB liquid medium containing 50 ⁇ g / mL of ampicillin, and the plasmid pGAP-IPAdh was recovered from the obtained cells.
  • the genomic DNA of Escherichia coli MG1655 strain was used as a template, and it was obtained by atggatccgctgggtgagacatatgaaaaattgtgtcatcatgtcat (SEQ ID NO: 22) and gcagagtctgtcatccatccat Was digested with restriction enzymes BamHI and HindIII to obtain a thiolase fragment of about 1.2 kbp.
  • the obtained DNA fragment and the previously prepared plasmid pGAP-IPAdh were digested with restriction enzymes BamHI and HindIII, mixed together using ligase, and then Escherichia coli DH5 ⁇ strain competent cell (Toyo Spinning Co., Ltd. DNA-903) was transformed to obtain a transformant that grew on an LB agar plate containing 50 ⁇ g / mL of ampicillin.
  • Escherichia coli DH5 ⁇ strain competent cell Toyo Spinning Co., Ltd. DNA-903
  • the obtained colonies were cultured overnight at 37 ° C. in an LB liquid medium containing 50 ⁇ g / mL of ampicillin, and the plasmid pGAP-IPAdh-atoB was recovered from the obtained cells.
  • the resulting DNA fragment and the previously prepared plasmid pGAP-IPAdh-atoB were digested with restriction enzymes XbaI and HindIII, mixed together using ligase, and then Escherichia coli DH5 ⁇ strain competent cell (Toyobo Co., Ltd. Sakai DNA-903) was transformed to obtain a transformant that grows on an LB agar plate containing 50 ⁇ g / mL of ampicillin.
  • the obtained colonies were cultured overnight at 37 ° C. in an LB liquid medium containing 50 ⁇ g / mL of ampicillin, and the plasmid pGAP-IPAdh-atoB-atoD was recovered from the obtained cells.
  • a DNA fragment obtained by digestion with the DNA digested by the PCR method using DNA digested by DNA digestion with the enzyme method ahctctcgagctgggtggagacatatgat (SEQ ID NO: 26) and gggcaagctttataataccaccgtgtcc (gt. Gave a CoA transferase ⁇ subunit fragment of approximately 600 bp.
  • the obtained DNA fragment and the previously prepared plasmid pGAP-IPAdh-atoB-atoD were digested with the restriction enzymes XhoI and HindIII, mixed together using ligase, and then Escherichia coli DH5 ⁇ strain compilation Tent cells (Toyobo Co., Ltd.
  • Sakai DNA-903 were transformed to obtain transformants that grew on LB agar plates containing ampicillin 50 ⁇ g / mL.
  • the obtained colonies were cultured overnight at 37 ° C. in an LB liquid medium containing 50 ⁇ g / mL of ampicillin, and the plasmid pGAP-IPAdh-atoB-atoD-atoA was recovered from the obtained cells.
  • Clostridium acetobutylicum ATCC824 genomic DNA was used as a template, the DNA was obtained using the following method: Digestion with restriction enzymes KpnI and BamHI gave an acetoacetate decarboxylase fragment of about 700 bp. The obtained DNA fragment was mixed with the previously prepared plasmid pGAP-IPAdh-atoB-atoD-atoA by digestion with restriction enzymes KpnI and BamHI, ligated with ligase, and then Escherichia coli DH5 ⁇ A strain competent cell (Toyobo Co., Ltd.
  • Sakai DNA-903 was transformed to obtain a transformant that grew on an LB agar plate containing 50 ⁇ g / mL of ampicillin.
  • the obtained colonies were cultured overnight at 37 ° C. in an LB liquid medium containing 50 ⁇ g / mL of ampicillin, and the plasmid pGAP-IPAdh-Adc-atoB-atoD-atoA was recovered from the obtained bacterial cells and designated as pIaaa.
  • This plasmid pIaaa was transformed into the Escherichia coli B ⁇ pgi competent cell prepared in Example 3, and cultured overnight at 37 ° C. on an LB Broth, Miller agar plate containing 50 ⁇ g / mL of ampicillin, whereby Escherichia coli pIaaa / B ⁇ pgi strain was obtained.
  • Example 5 ⁇ Preparation of B :: atoDAB ⁇ pgi strain> B :: atoDAB prepared in Example 1 was transformed with pTH18cs1-pgi prepared in Example 3 and cultured overnight at 30 ° C. on an LB agar plate containing 10 ⁇ g / ml chloramphenicol and 50 ⁇ g / ml kanamycin. A transformant was obtained. The obtained transformant was inoculated into an LB liquid medium containing kanamycin 50 ⁇ g / ml and cultured at 30 ° C. overnight.
  • this culture solution was applied to an LB agar plate containing 50 ⁇ g / ml of kanamycin to obtain colonies that grew at 42 ° C.
  • the obtained colonies were cultured in an LB liquid medium containing 50 ⁇ g / ml of kanamycin for 24 hours at 30 ° C., and further applied to an LB agar plate containing 50 ⁇ g / ml of kanamycin to obtain colonies that grew at 42 ° C.
  • Escherichia coli MG1655 strain and Escherichia coli B strain can be obtained from American Type Culture Collection.
  • a genomic DNA of Escherichia coli B strain (GenBank accession No. CP000819) was prepared, and the resulting genomic DNA was used as a template, and PCR was performed with a primer pair of SEQ ID NO: 30 and SEQ ID NO: 31 to obtain about 1.0 kb.
  • a DNA fragment was amplified (hereinafter sometimes referred to as a gntR-L fragment).
  • a DNA fragment of about 1.0 kb was amplified by PCR using the primer pair of SEQ ID NO: 32 and SEQ ID NO: 33 (hereinafter sometimes referred to as gntR-R fragment).
  • DNA fragments were separated and collected by agarose electrophoresis, and PCR was performed using the gntR-L and gntR-R fragments as a template and the primer pair of SEQ ID NO: 30 and SEQ ID NO: 33 to obtain a DNA fragment of about 2.0 kb.
  • was amplified hereinafter sometimes referred to as a “gntR-LR fragment”.
  • the gntR-LR fragment was separated and collected by agarose electrophoresis, digested with EcoRI, mixed with an EcoRI digest of the temperature sensitive plasmid pTH18cs1 (GenBank accession number AB019610), reacted with T4 DNA ligase, and then Escherichia coli.
  • DH5 ⁇ competent cells manufactured by Toyobo Co., Ltd.
  • Toyobo Co., Ltd. were transformed to obtain transformants that grew at 30 ° C. on LB agar plates containing 10 ⁇ g / ml of chloramphenicol.
  • a plasmid was recovered from the obtained transformant, and it was confirmed that the gntLR fragment was correctly inserted into pTH18cs1, and this plasmid was designated as pTH18cs1-gntR.
  • the plasmid pTH18cs1-gntR thus obtained was transformed into the Escherichia coli B :: atoDAB strain prepared in Example 1, and cultured at 30 ° C. overnight on an LB agar plate containing 10 ⁇ g / ml of chloramphenicol.
  • a transformant was obtained.
  • the obtained transformant was inoculated into an LB liquid medium containing 10 ⁇ g / ml of chloramphenicol and cultured at 30 ° C. overnight.
  • a part of this culture solution was applied to an LB agar plate containing 10 ⁇ g / ml of kanamycin chloramphenicol to obtain colonies that grew at 42 ° C.
  • the obtained colonies were cultured in an LB liquid medium at 30 ° C. for 24 hours, and further applied to an LB agar plate to obtain colonies that grew at 42 ° C.
  • B atoDAB ⁇ gntR strain
  • Example 7 ⁇ Preparation of pGAP-Ia / B :: atoDAB ⁇ gntR strain> Escherichia coli prepared in Example 6, B :: atoDAB ⁇ gntR strain competent cells were transformed with the plasmid pIa prepared in Example 2 and LB Broth, Miller agar plate containing 50 ⁇ g / mL ampicillin at 37 ° C. By culturing overnight, Escherichia coli pIa / B :: atoDAB ⁇ gntR strain was obtained.
  • Example 8 ⁇ Preparation of pIaz / B :: atoDAB ⁇ gntR strain> Escherichia coli prepared in Example 6, B :: atoDAB ⁇ gntR strain competent cells were transformed with the plasmid pIaz prepared in Example 2 and LB Broth, Miller agar plate containing 50 ⁇ g / mL ampicillin at 37 ° C. By culturing overnight, Escherichia coli pIaz / B :: atoDAB ⁇ gntR strain was obtained.
  • Example 9 ⁇ Preparation of B :: atoDAB ⁇ pgi ⁇ gntR strain>
  • the Escherichia coli B :: atoDAB ⁇ pgi strain prepared in Example 5 was transformed with the plasmid pTH18cs1-gntR prepared in Example 6, and overnight on an LB agar plate containing 10 ⁇ g / ml chloramphenicol at 30 ° C. After culturing, a transformant was obtained. The obtained transformant was inoculated into an LB liquid medium containing 10 ⁇ g / ml of chloramphenicol and cultured at 30 ° C. overnight.
  • Escherichia coli MG1655 strain and Escherichia coli B strain can be obtained from American Type Culture Collection.
  • Example 10 ⁇ Preparation of pIa / B :: atoDAB ⁇ pgi ⁇ gntR strain> Escherichia coli prepared in Example 9, B :: atoDAB ⁇ pgi ⁇ gntR strain competent cells were transformed with the plasmid pIa prepared in Example 2, and 37 LB Broth, Miller agar plates containing 50 ⁇ g / mL ampicillin were used. By culturing overnight at 0 ° C., Escherichia coli pIa / B :: atoDAB ⁇ pgi ⁇ gntR was obtained.
  • Example 11 ⁇ Preparation of pIaz / B :: atoDAB ⁇ pgi ⁇ gntR strain> Escherichia coli prepared in Example 9, B :: atoDAB ⁇ pgi ⁇ gntR strain competent cells were transformed with the plasmid pIaz prepared in Example 2, and 37 LB Broth, Miller agar plates containing 50 ⁇ g / mL ampicillin were used. By culturing overnight at 0 ° C., Escherichia coli pIaz / B :: atoDAB ⁇ pgi ⁇ gntR strain was obtained.
  • the primer of SEQ ID NO: 34 has an NdeI recognition site on the 5 ′ end side, and the primers of SEQ ID NO: 35 and SEQ ID NO: 36 have a SacI recognition site on the 5 ′ end side.
  • the primer of SEQ ID NO: 37 has a BamHI recognition site on the 5 ′ end side.
  • a genomic DNA (GenBank accession No. CP000819) of Escherichia coli B strain was prepared, and a DNA fragment of about 1.0 kb was amplified by PCR using the primer pair of SEQ ID NO: 34 and SEQ ID NO: 35 (hereinafter referred to as gnd-). Sometimes called L fragment).
  • gnd-R fragment a DNA fragment of about 1.0 kb was amplified by PCR using the primer pair of SEQ ID NO: 36 and SEQ ID NO: 37 (hereinafter sometimes referred to as gnd-R fragment).
  • the plasmid was recovered from the obtained transformant, and it was confirmed that two fragments of the 5 ′ upstream neighboring fragment and the 3 ′ downstream neighboring fragment of the gene encoding gnd were correctly inserted into pTH18cs1, and pTH18cs1-gnd and did.
  • the plasmid pTH18cs1-gnd thus obtained was transformed into the Escherichia coli B :: atoDAB strain prepared in Example 1, and cultured overnight at 30 ° C. on an LB agar plate containing 10 ⁇ g / ml of chloramphenicol.
  • a transformant was obtained.
  • the obtained transformant was inoculated into an LB liquid medium containing 10 ⁇ g / ml of chloramphenicol and cultured at 30 ° C. overnight.
  • a part of this culture solution was applied to an LB agar plate containing 10 ⁇ g / ml of kanamycin chloramphenicol to obtain colonies that grew at 42 ° C.
  • the obtained colonies were cultured in an LB liquid medium at 30 ° C. for 24 hours, and further applied to an LB agar plate to obtain colonies that grew at 42 ° C.
  • Escherichia coli B stock can be obtained from American Type Culture Collection.
  • Example 13 ⁇ Preparation of pIa / B :: atoDAB ⁇ gnd strain> Escherichia coli prepared in Example 12, B :: atoDAB ⁇ gnd strain competent cells were transformed with the plasmid pIa prepared in Example 2 and overnight at 37 ° C. on LB Broth, Miller agar plates containing 50 ⁇ g / mL ampicillin. By culturing, Escherichia coli pIa / B :: atoDAB ⁇ gnd strain was obtained.
  • Example 14 ⁇ Preparation of pIaz / B :: atoDAB ⁇ gnd strain>
  • the Escherichia coli B,: toDAB ⁇ gnd strain competent cell prepared in Example 12 was transformed with the plasmid pIaz prepared in Example 2 and LB Broth, Miller agar plate containing 50 ⁇ g / mL of ampicillin at 37 ° C. By culturing overnight, Escherichia coli pIaz / B :: atoDAB ⁇ gnd was obtained.
  • Example 15 ⁇ Preparation of B :: atoDAB ⁇ pgi ⁇ gnd strain>
  • the Escherichia coli B strain, B :: atoDAB ⁇ pgi strain prepared in Example 5 was transformed with the plasmid pTH18cs1-gnd prepared in Example 12 and applied to an LB agar plate containing 10 ⁇ g / ml of chloramphenicol at 30 ° C. Then, a transformant was obtained. The obtained transformant was inoculated into an LB liquid medium containing 10 ⁇ g / ml of chloramphenicol and cultured at 30 ° C. overnight.
  • Example 16 ⁇ Preparation of pIa / B :: atoDAB ⁇ pgi ⁇ gnd strain> Escherichia coli prepared in Example 15, B :: atoDAB ⁇ pgi ⁇ gnd strain competent cells were transformed with the plasmid pIa prepared in Example 2, and 37 LB Broth, Miller agar plates containing 50 ⁇ g / mL ampicillin were used. By culturing overnight at 0 ° C., Escherichia coli pIa / B :: atoDAB ⁇ pgi ⁇ gnd was obtained.
  • Example 17 ⁇ Preparation of pIaz / B :: atoDAB ⁇ pgi, ⁇ gnd strain> Escherichia coli prepared in Example 15, B :: atoDAB ⁇ pgi ⁇ gnd strain competent cells were transformed with the plasmid pIaz prepared in Example 2, and 37 LB Broth, Miller agar plates containing 50 ⁇ g / mL ampicillin were used.
  • the Escherichia coli pIaz / B :: atoDAB ⁇ pgi ⁇ gnd strain was obtained by culturing overnight at ° C.
  • Example 18 ⁇ Preparation of B :: atoDAB ⁇ gnd ⁇ gntR strain> Escherichia coli prepared in Example 12, B :: atoDAB ⁇ gnd strain competent cells were transformed with the plasmid pTH18cs1-gntR prepared in Example 6 and 30 LB agar plates containing 10 ⁇ g / ml chloramphenicol were used. Cultivated overnight at 0 ° C. to obtain transformants. The obtained transformant was inoculated into an LB liquid medium containing 10 ⁇ g / ml of chloramphenicol and cultured at 30 ° C. overnight.
  • Example 19 ⁇ Preparation of pIa / B :: atoDAB ⁇ gnd ⁇ gntR strain> Escherichia coli prepared in Example 18, B :: atoDAB ⁇ gnd ⁇ gntR strain competent cells were transformed with the plasmid pIa prepared in Example 2, and 37 LB Broth, Miller agar plates containing 50 ⁇ g / mL ampicillin were used. The Escherichia coli pIa / B :: atoDAB ⁇ gnd ⁇ gntR strain was obtained by culturing overnight at ° C.
  • Example 20 ⁇ Preparation of pIaz / B :: atoDAB ⁇ gnd ⁇ gntR strain> Escherichia coli prepared in Example 18, B :: atoDAB ⁇ gnd ⁇ gntR strain competent cells were transformed with the plasmid pIaz prepared in Example 2, and 37 LB Broth, Miller agar plates containing 50 ⁇ g / mL ampicillin were used.
  • the Escherichia coli pIaz / B :: atoDAB ⁇ gnd ⁇ gntR strain was obtained by culturing overnight at ° C.
  • Example 21 ⁇ Preparation of B :: atoDAB ⁇ pgi ⁇ gnd ⁇ gntR strain> Escherichia coli prepared in Example 15, B :: atoDAB ⁇ pgi ⁇ gnd strain competent cells were transformed with the plasmid pTH18cs1-gntR prepared in Example 6 and LB agar plates containing 10 ⁇ g / ml chloramphenicol And cultured overnight at 30 ° C. to obtain transformants. The obtained transformant was inoculated into an LB liquid medium containing 10 ⁇ g / ml of chloramphenicol and cultured at 30 ° C. overnight.
  • Example 22 ⁇ Preparation of pIa / B :: atoDAB ⁇ pgi ⁇ gnd ⁇ gntR strain> Escherichia coli prepared in Example 21, B :: atoDAB ⁇ pgi ⁇ gnd ⁇ gntR strain competent cells were transformed with the plasmid pIa prepared in Example 2 and LB Broth, Miller agar plate containing 50 ⁇ g / mL of ampicillin was cultured at 37 ° C. overnight to obtain an Escherichia coli pIa / B :: atoDAB ⁇ pgi ⁇ gnd ⁇ gntR strain.
  • Example 23 ⁇ Preparation of pIaz / B :: atoDAB ⁇ pgi ⁇ gnd ⁇ gntR strain> Escherichia coli prepared in Example 21, B :: atoDAB ⁇ pgi ⁇ gnd ⁇ gntR strain competent cells were transformed with the plasmid pIaz prepared in Example 2 and LB Broth, Miller agar plate containing 50 ⁇ g / mL ampicillin was cultured at 37 ° C. overnight to obtain an Escherichia coli pIaz / B :: atoDAB ⁇ pgi ⁇ gnd ⁇ gntR strain.
  • Example 24 ⁇ Preparation of pIa / B :: toDAB strain> Escherichia coli prepared in Example 1, B :: atoDAB strain competent cells were transformed with the plasmid pIa prepared in Example 2, and overnight at 37 ° C. on LB Broth, Miller agar plates containing 50 ⁇ g / mL ampicillin. By culturing, an Escherichia coli pIa / B :: toDAB strain was obtained.
  • Example 25 ⁇ Preparation of pIaz / B :: atoDAB ⁇ pgi strain> Escherichia coli prepared in Example 5, B :: atoDAB strain ⁇ pgi competent cells were transformed with the plasmid pIaz prepared in Example 2 and LB Broth, Miller agar plate containing 50 ⁇ g / mL ampicillin at 37 ° C. By culturing overnight, Escherichia coli pIaz / B :: atoDAB ⁇ pgi strain was obtained.
  • each evaluation strain was inoculated into a 500 mL Erlenmeyer flask containing 50 mL of LB Broth, Miller culture solution (Difco244620) containing ampicillin 50 ⁇ g / mL, and stirred overnight at a culture temperature of 30 ° C. and 120 rpm. . 45 mL of the preculture was transferred to a 3 L culture tank (culture device BMS-PI manufactured by ABLE) containing 855 g of a medium having the composition shown below, and cultured.
  • a 3 L culture tank culture device BMS-PI manufactured by ABLE
  • Culturing was performed under atmospheric pressure with an aeration rate of 0.9 L / min, a stirring speed of 550 rpm, a culture temperature of 30 ° C., and a pH of 7.0 (adjusted with an NH 3 aqueous solution).
  • a 50 wt / wt% aqueous glucose solution was added at a flow rate of 10 g / L / hour.
  • a 50 wt / wt% aqueous glucose solution was added at a flow rate of 20 g / L / hour as appropriate so that glucose would not remain in the culture tank.
  • the production amount of the strain (pIaz / B :: atoDAB ⁇ pgi ⁇ gntR) in which gntR and pgi are destroyed and the expression of zwf is enhanced is 70.2 g / L / 72h, and the productivity is about 1.4 compared with the negative control. Doubled. From this, it was found that the productivity was further improved by destroying both gntR and pgi and enhancing the expression of zwf than when only gntR was destroyed.
  • the effect of improving the productivity seen in the pIaz / B :: atoDAB ⁇ pgi ⁇ gntR strain is that both gntR and pgi are destroyed and zwf is strongly expressed. It can be said that it can be obtained.
  • the productivity improvement effect seen in the pIaz / B :: atoDAB ⁇ pgi ⁇ gnd ⁇ gntR strain can be obtained only when gntR, pgi, and gnd are simultaneously destroyed and zwf is strongly expressed.
  • the obtained acetone can be used as a raw material for producing isopropyl alcohol after purification.
  • Example 27 The reaction was performed in the same manner as in Example 26 except that the reaction temperature was 400 ° C. The results are shown in Table 5. As shown in Table 5, acetone was produced at a high concentration.
  • Example 29 The same procedure as in Example 28 was performed except that the reaction temperature was 400 ° C. The results are shown in Table 5. As shown in Table 5, acetone was produced at a high concentration.
  • Example 30 ⁇ Preparation of plasmid pI * a * z>
  • the acetoacetate decarboxylase gene (adc) of Clostridium bacteria is described in GenBank accession number M55392, and the isopropyl alcohol dehydrogenase gene (IPAdh) is described in GenBank accession number AF157307.
  • IPAdh isopropyl alcohol dehydrogenase gene
  • a base sequence of a promoter necessary for expressing the above gene group glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase derived from Escherichia coli described in 397 to 440 in the base sequence information of GenBank accession number X02662 Promoter sequence (sometimes referred to as GAPDH).
  • Cgagctatacatgcaatgattgacagattttccg (SEQ ID NO: 38) and cgcgcgcatgctattttgttgatagatag (SEQ ID NO: 39) were obtained by PCR using the genomic DNA of Escherichia coli MG1655 strain as a template.
  • a DNA fragment corresponding to the GAPDH promoter of about 110 bp was obtained by digestion with SphI.
  • the obtained DNA fragment and the plasmid pBR322 (GenBank accession number J01749) were mixed with fragments obtained by digesting with restriction enzymes NdeI and SphI, ligated with ligase, and then Escherichia coli DH5 ⁇ strain competent cell (Toyoto) Spinning Co., Ltd. DNA-903) was transformed to obtain transformants that grew on LB agar plates containing 50 ⁇ g / mL ampicillin. The obtained colony was cultured overnight at 37 ° C. in an LB liquid medium containing 50 ⁇ g / mL of ampicillin, and the plasmid pBRgapP was recovered from the obtained cells.
  • IPAdh * codon-modified isopropyl alcohol dehydrogenase gene
  • a codon-modified isopropyl alcohol dehydrogenase gene was designed based on the amino acid sequence of the isopropyl alcohol dehydrogenase gene of Clostridium beijerinckii NRRL B-593.
  • a DNA fragment (SEQ ID NO: 40) was prepared. The sequence is described below.
  • the prepared DNA fragment is used as a template and amplified by the PCR method using acatgcatgcatgaaaggtttttgcaatgctg (SEQ ID NO: 41) and acgcgtcgactataataactactgctttaa (SEQ ID NO: 42), and the obtained DNA fragment is digested with restriction enzymes SphI and SalI. A 1 kbp codon modified isopropyl alcohol dehydrogenase fragment was obtained.
  • the obtained DNA fragment and the fragment obtained by digesting plasmid pUC119 with restriction enzymes SphI and SalI were mixed and ligated using ligase, and then Escherichia coli DH5 ⁇ strain competent cell (DNA-903, Toyobo Co., Ltd.). And a transformant that grows on an LB agar plate containing 50 ⁇ g / mL of ampicillin was obtained.
  • the obtained colony was cultured overnight at 37 ° C. in an LB liquid medium containing 50 ⁇ g / mL of ampicillin, and the plasmid was recovered from the obtained bacterial cells to confirm that the codon-modified IPAdh * was correctly inserted.
  • This plasmid was named pUC-I * .
  • a fragment containing IPAdh * obtained by digesting plasmid pUC-I * with restriction enzymes SphI and EcoRI and a fragment obtained by digesting plasmid pBRgapP with restriction enzymes SphI and EcoRI are mixed and ligated using ligase. Then, Escherichia coli DH5 ⁇ strain competent cells (Toyobo Co., Ltd. DNA-903) were transformed to obtain transformants that grew on LB agar plates containing ampicillin 50 ⁇ g / mL. The obtained colony was cultured overnight at 37 ° C.
  • the plasmid was recovered from the obtained bacterial cells to confirm that the codon-modified IPAdh * was correctly inserted.
  • the plasmid was named pGAP-I * .
  • a codon-modified acetoacetate decarboxylase gene (adc * )
  • a codon-modified acetoacetate decarboxylase gene was designed based on the amino acid sequence of the acetoacetate decarboxylase gene of Clostridium acetobutyricum ATCC824 and A DNA fragment (SEQ ID NO: 43) was prepared. The sequence is described below.
  • the DNA fragment obtained by digesting the DNA by the PCR method I obtained by digesting the DNA obtained by the PCR method with the digestion method b obtained by digesting the DNA by the digestion method b with the I
  • a codon-modified acetoacetate decarboxylase fragment was obtained.
  • the obtained DNA fragment and the previously prepared plasmid pGAP-I * were mixed with fragments obtained by digesting with restriction enzymes BamHI and EcoRI, ligated with ligase, Escherichia coli DH5 ⁇ strain competent cell ( Toyobo Co., Ltd. DNA-903) was transformed to obtain transformants that grew on LB agar plates containing 50 ⁇ g / mL ampicillin.
  • the obtained colony was cultured overnight at 37 ° C. in an LB liquid medium containing 50 ⁇ g / mL of ampicillin, the plasmid was recovered from the obtained bacterial cells, and it was confirmed that adc * was correctly inserted. It was named pI * a * .
  • the genomic DNA of the Escherichia coli B strain (GenBank accession No. CP000819) was used as a template.
  • the resulting DNA fragment was digested with restriction enzymes BamHI and XbaI to obtain a glucose 6-phosphate 1-dehydrogenase fragment of about 1500 bp.
  • the obtained DNA fragment and the previously prepared plasmid pI * a * were mixed with the fragments obtained by digesting with the restriction enzymes XbaI and BamHI, ligated with ligase, and then Escherichia coli DH5 ⁇ strain competent cell (Toyo Spinning Co., Ltd.
  • DNA-903 was transformed to obtain transformants that grew on LB agar plates containing ampicillin 50 ⁇ g / mL. The obtained colonies were cultured overnight at 37 ° C. in an LB liquid medium containing 50 ⁇ g / mL of ampicillin, and the plasmid pI * a * z was recovered from the obtained cells.
  • Example 31 ⁇ Preparation of pI * a * / B :: atoDAB ⁇ gntR strain> Escherichia coli prepared in Example 6, B :: atoDAB ⁇ gntR strain competent cells were transformed with the plasmid pI * a * prepared in Example 30 and LB Broth, Miller agar plate containing 50 ⁇ g / mL ampicillin. By culturing at 37 ° C. overnight, Escherichia coli pI * a * / B :: atoDAB ⁇ gntR strain was obtained.
  • Example 32 ⁇ Preparation of pI * a * z / B :: atoDAB ⁇ pgi ⁇ gntR strain> Escherichia coli prepared in Example 9, B :: atoDAB ⁇ pgi ⁇ gntR strain competent cells were transformed with the plasmid pIa * prepared in Example 30 and LB Broth, Miller agar plate containing 50 ⁇ g / mL ampicillin. By culturing at 37 ° C. overnight, Escherichia coli pI * a * z / B :: atoDAB ⁇ pgi ⁇ gntR was obtained.
  • Example 33 ⁇ Preparation of pI * a * z / B :: atoDAB ⁇ pgi ⁇ gnd ⁇ gntR strain> Escherichia coli prepared in Example 21, B :: atoDAB ⁇ pgi ⁇ gnd ⁇ gntR strain competent cells were transformed with the plasmid pI * a * z prepared in Example 30 and LB Broth containing ampicillin 50 ⁇ g / mL By culturing overnight at 37 ° C. on a Miller agar plate, Escherichia coli pI * a * z / B :: atoDAB ⁇ pgi ⁇ gnd ⁇ gntR strain was obtained.
  • Example 34 ⁇ Preparation of pI * a * / B :: toDAB strain> Escherichia coli prepared in Example 1, B :: atoDAB strain competent cells were transformed with the plasmid pI * a * prepared in Example 30, and 37 ° C. on LB Broth, Miller agar plate containing 50 ⁇ g / mL of ampicillin. Was obtained overnight to obtain Escherichia coli pI * a * / B :: toDAB strain.
  • Example 35 (Isopropyl alcohol production from sucrose) An enzyme invertase gene (cscA) for degrading sucrose was further introduced into the pI * a * z / B :: atoDAB ⁇ pgi ⁇ gnd ⁇ gntR strain, and isopropyl alcohol fermentation from sucrose was performed. Further, acetone or propylene was produced from the obtained fermentation broth.
  • cscA enzyme invertase gene for degrading sucrose was further introduced into the pI * a * z / B :: atoDAB ⁇ pgi ⁇ gnd ⁇ gntR strain
  • cscA the DNA fragment obtained by PCR using the genomic DNA of Escherichia coli O157 strain as a template was amplified by the PCR method using gctgggtggaacatatgaccacactctcgattgcatg (SEQ ID NO: 48) and ttaaccccagtgtcccagagtgc (SEQ ID NO: 49).
  • SEQ ID NO: 48 gctgggtggaacatatgaccacactctcgattgcatg
  • SEQ ID NO: 49 ttaaccccagtgtcccagagtgc
  • This DNA fragment and pI * a * z prepared in Example 30 were digested with restriction enzyme BamHI, blunt-ended with T4 DNA polymerase, and further dephosphorylated with alkaline phosphatase, and mixed with ligase. After binding, Escherichia coli DH5 ⁇ strain competent cells (Toyobo Co., Ltd. DNA-903) were transformed to obtain transformants that grew on LB agar plates containing ampicillin 50 ⁇ g / mL.
  • a plasmid was recovered from the obtained bacterial cells, and the 3 ′ end side of the glucose 6-phosphate-1-dehydrogenase gene (zwf) and the 5 ′ end side of cscA were ligated to confirm that cscA was correctly inserted.
  • zwf glucose 6-phosphate-1-dehydrogenase gene
  • cscA was correctly inserted.
  • pI * a * z-cscA The genome of Escherichia coli O157 can be obtained from reference materials and the Institute of Metrology.
  • Escherichia coli prepared in Example 21, B : atoDAB ⁇ pgi ⁇ gnd ⁇ gntR strain Competent cells were transformed with the plasmid pI * a * z-cscA and LB Broth, Miller containing ampicillin 50 ⁇ g / mL By culturing overnight at 37 ° C. on an agar plate, Escherichia coli pI * a * z-cscA / B :: atoDAB ⁇ pgi ⁇ gnd ⁇ gntR strain was obtained.
  • the isopropyl alcohol and acetone were concentrated and extracted from the trapped water containing isopropyl alcohol and acetone by distillation. Specifically, first, 9 L of the aqueous solution was passed through a column packed with 250 ml of a cation exchange resin (manufactured by Organo, Amberlyst 31WET) at a flow rate of 500 ml / h to remove remaining ammonia and the like. This treatment solution was distilled under normal pressure. As a result of taking out a fraction having a boiling point of 53 ° C. to 81.6 ° C.
  • a cation exchange resin manufactured by Organo, Amberlyst 31WET
  • Example 36 (Production of acetone) ⁇ Preparation of dehydrogenation catalyst ZnO: ZrO 2 (94: 6)>
  • 15.94 g (0.15 mol) of sodium carbonate and 130 ml of water were added and dissolved.
  • Example 37 The same procedure as in Example 36 was performed except that the reaction temperature was 400 ° C. The results are shown in Table 8. As shown in Table 8, acetone was produced at a high concentration.
  • Example 39 The same procedure as in Example 38 was performed except that the reaction temperature was 400 ° C. The results are shown in Table 8. As shown in Table 8, acetone was produced at a high concentration.
  • Example 40 (Production of propylene) Using a distillate obtained from the culture solution described in Test Example 3 of Example 35 as a raw material, a high-pressure feed pump, a high-pressure hydrogen mass flow, a high-pressure nitrogen mass flow, an electric furnace, a reactor having a catalyst-packed portion, and a back pressure valve Using a fixed bed reactor equipped with a pressure liquid phase flow reaction by downflow.
  • a copper-zinc catalyst manufactured by Sud Chemie, product name ShiftMax210, element mass% Cu 32 to 35%, Zn 35 to 40%, Al 6 to 7% was introduced into the reactor made of SUS316 having an inner diameter of 1 cm from the outlet side of the reactor.
  • 1.0 g of powder (classified to 250 to 500 ⁇ m) was packed as an upstream catalyst layer. Quartz wool was packed in order to separate the catalyst layer, and then 1.0 g of ⁇ -zeolite (produced by Catalyst Kasei Co., Ltd., compression-molded at 20 MPa and classified to 250 to 500 ⁇ ) was packed as the downstream catalyst layer.
  • ⁇ -zeolite produced by Catalyst Kasei Co., Ltd., compression-molded at 20 MPa and classified to 250 to 500 ⁇

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Abstract

 転写抑制因子GntRの活性が不活化されていると共に、イソプロピルアルコール生産系と、好ましくは更に、該GntRの活性の不活性化に伴うイソプロピルアルコール生産能を維持又は強化する酵素活性発現パターンの補助酵素群と、を備えたイソプロピルアルコール生産大腸菌と、このイソプロピルアルコール生産大腸菌を用いて植物由来原料からイソプロピルアルコールを生産することを含むイソプロピルアルコール生産方法と、該生産方法で得られたイソプロピルアルコールに、酸化亜鉛及び周期律表の第4族の少なくとも1種の酸化物を含有し且つ共沈法で調製された複合酸化物を接触させることを含むアセトン生産方法と、該生産方法で得られたイソプロピルアルコール及びアセトンに、触媒として固体酸物質及びCuを含む水添触媒を接触させることを含む、プロピレン製造方法。

Description

gntRを破壊することによって生産性が向上したイソプロピルアルコール生産細菌
 本発明は、イソプロピルアルコール生産細菌及びこれを用いたイソプロピルアルコール生産方法に関する。
 プロピレンは、ポリプロピレンなどの合成樹脂や石油化学製品の重要な基礎原料であり、自動車用バンパーや食品容器、フィルム、医療機器などに幅広く使われている。
 植物由来原料から製造されたイソプロピルアルコールは、脱水工程を経てプロピレンに変換できることから、カーボンニュートラルなプロピレンの原料として有望である。またアセトンも溶剤、プラスチックの原料として幅広く使われている。京都議定書によって2008年から2012年の間に先進国全体で二酸化炭素排出量を1990年比で5%削減することが義務付けられている現在、カーボンニュートラルなプロピレンはその汎用性から地球環境上極めて重要である。
 植物由来原料を資化してイソプロピルアルコールを生産する細菌は既に知られている。例えば国際公開2009/008377号には、グルコースを原料としてイソプロピルアルコールを生産するように改変された細菌が開示されており、イソプロピルアルコールの選択性が高いことから工業生産用生体触媒として優れた性質を持つと記載されている。
 イソプロピルアルコール製造大腸菌においては、イソプロピルアルコールの原料がグルコースであるため、解糖および異化によって得られる夥しい数の化合物全てが副生成物となり得る。一方これらの化合物は大腸菌が生育するために必須な物質となっている場合があるため、これらの副反応で消費されるグルコースの量を完全に抑制することはできない。このため、副生成物を最小化し且つイソプロピルアルコールの生産量を上げるために、種々の検討が為されている。
 例えば、国際公開2009/008377号パンフレットには、アセト酢酸デカルボキシラーゼ、イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ、CoAトランスフェラーゼ及びチオラーゼの各遺伝子が導入され、植物由来原料からイソプロピルアルコールを生成しうるイソプロピルアルコール生成細菌が開示されている。このイソプロピルアルコール生産細菌の能力は、生産速度0.6g/L/hr、蓄積量28.4g/Lであると記載されている。
 国際公開2009/049274号及びAppl.Environ.Biotechnol.,73(24),pp.7814-7818,(2007)には、アセチルCoAアセチルトランスフェラーゼ、アセトアセチルCoAトランスフェラーゼ、アセト酢酸デカルボキシラーゼ及び、セカンダリーアルコールデヒドロゲナーゼの各遺伝子が導入され、イソプロピルアルコールを製造する大腸菌が開示されている。これらの細菌の能力は生産速度0.4g/L/hr、収率43.5%、蓄積量4.9g/Lであると記載されている。
 国際公開2009/028582号には、アセト酢酸デカルボキシラーゼ、イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ、アセチルCoA:アセテートCoA-トランスフェラーゼ及びアセチルCoAアセチルトランスフェラーゼの各遺伝子が導入され、イソプロピルアルコールを製造する大腸菌が開示されている。この細菌の能力は、蓄積量9.7g/Lであると記載されている。
 Appl.Microbiol.Biotechnol.,77(6),pp.1219-1224,(2008)には、チオラーゼ、CoA-トランスフェラーゼ、アセトアセテートデカルボキシラーゼ、プライマリー-セカンダリーアルコールデヒドロゲナーゼの各遺伝子が導入され、イソプロピルアルコールを製造する大腸菌が開示されている。この細菌の能力は生産速度0.6g/L/hr、収率51%、蓄積量13.6g/Lであると記載されている。
 国際公開2009/103026号には、アセト酢酸デカルボキシラーゼ、アセチルCoA:アセテートCoA-トランスフェラーゼ及びアセチルCoAアセチルトランスフェラーゼ及びイソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼの各遺伝子が導入され、イソプロピルアルコールを製造し得る大腸菌が開示されている。この細菌の能力は、収率50%、生産速度0.4g/L/hr、最終生産量14g/Lと期待されると記載されている。
 国際公開2009/247217号には、アセトアセテートデカルボキシラーゼ、CoAトランスフェラーゼ、チオラーゼ及び2-プロピルアルコールデヒドロゲナーゼの各遺伝子が導入され、イソプロピルアルコールを製造し得る大腸菌が開示されている。この細菌の能力は、最終生産量2g/Lと記載されている。
 ここで、イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ、セカンダリーアルコールデヒドロゲナーゼ、プライマリー-セカンダリーアルコールデヒドロゲナーゼ及び2-プロピルアルコールデヒドロゲナーゼは、名称が異なるものの同じ反応を触媒する酵素であり、CoAトランスフェラーゼ、アセトアセチルCoAトランスフェラーゼ、アセチルCoA:アセテートCoA-トランスフェラーゼ及びCoA-トランスフェラーゼは、名称が異なるものの同じ反応を触媒する酵素である。また、アセト酢酸デカルボキシラーゼとアセトアセテートデカルボキシラーゼは名称が異なるものの同じ反応を触媒する酵素であり、チオラーゼとアセチルCoAアセチルトランスフェラーゼも名称が異なるものの同じ反応を触媒する酵素である。従って、これらの文献によるイソプロピルアルコール生産大腸菌は、生産性に種々違いはあるもののイソプロピルアルコールを製造するために利用している酵素は、国際公開第2009/008377号に記載されている、アセト酢酸デカルボキシラーゼ、イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ、CoAトランスフェラーゼ及びチオラーゼの4種と同様のものであり、生産性や収率を向上させるなどを目的とする場合、従来は、これら4種の酵素を検討していた。
 特開平5-260979号には、Bacillus subtillisにおいて、該大腸菌が保有するGntR遺伝子を破壊するとD-リボースの生産性が上がると記載されている。
 またイソプロピルアルコールをアセトンに変換する方法としては、特開平7-53433号及び特開平11-335315号に、イソプロピルアルコールを脱水素によりアセトンを製造する固体触媒として銅系の触媒が使用されている。また英国特許第665376号には酸化亜鉛微粒子と酸化ジルコニウム微粒子を物理的に混ぜ合わせた触媒が使用されている。一般に微生物を用いて物質を生産すると不純物が含まれることが知られている。この点で、これらの技術はいずれも、微生物を用いた製造方法ではないので、不純物を含むイソプロパノールを原料として用いたとの記載はない。
 アセトンは、水添することにより容易にイソプロパノールへ変換でき、このイソプロパノールをさらに脱水反応によりプロピレンとした後にベンゼンと反応させクメンを得るプロセス。すなわち、アセトンを二段階の反応により、プロピレンへと変換することにより、クメン法の原料として再使用するプロセスが提案されている(例えば、特開平2-174737号公報参照)。
 上記のような再使用においては、アセトンから高選択的にプロピレンを製造する方法を工業上、実用的に確立することが必要とされている。また、Cu(25%)-酸化亜鉛(35%)-酸化アルミニウム(40%)触媒の存在下、400℃でアセトンの水素化反応を行い、プロピレンを得る方法も知られている(例えば、東ドイツ特許 DD84378号公報参照)。しかし、この方法では、反応温度が400℃と高温であるにも関わらず、アセトン転化率が89%と低い。また該方法ではプロピレンが水添されることによりプロパンが生成する副反応のため、プロピレン選択性も89%と不充分である。
 しかしながら、イソプロピルアルコールを生産可能な上記大腸菌のいずれも、充分な生産能力を有しているとは言い難く、イソプロピルアルコール生産大腸菌においてイソプロピルアルコールの生産性を向上させることは、解決すべき大きな課題であった。また、得られたイソプロピルアルコールを効果的に利用する方法を提供することも求められていた。
 本発明は、イソプロピルアルコールの生産性を大幅に向上させた大腸菌、該大腸菌を用いたイソプロピルアルコール生産方法及びアセトン生産方法、更には該大腸菌を用いて得られたアセトンを含有するイソプロピルアルコールから、プロピレンを生産する方法を提供することを目的とする。
 本発明は上記状況を鑑みてなされたものであり、本発明のイソプロピルアルコール生産大腸菌、イソプロピルアルコール生産方法及びアセトン生産方法は、以下のとおりである。
 〔1〕 転写抑制因子GntRの活性が不活化されていると共に、イソプロピルアルコール生産系と、該GntRの活性の不活化に伴うイソプロピルアルコール生産能を維持又は強化する酵素活性パターンの補助酵素群とを備えたイソプロピルアルコール生産大腸菌。
 〔2〕 前記補助酵素群の酵素活性パターンが、
  (1)グルコース-6-リン酸イソメラーゼ(Pgi)活性、グルコース-6-リン酸-1-デヒドロゲナーゼ(Zwf)活性及びホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ(Gnd)活性の野生型の維持、
  (2)グルコース-6-リン酸イソメラーゼ(Pgi)活性の不活化と、グルコース-6-リン酸-1-デヒドロゲナーゼ(Zwf)活性の強化、
  (3)グルコース-6-リン酸イソメラーゼ(Pgi)活性の不活化と、グルコース-6-リン酸-1-デヒドロゲナーゼ(Zwf)活性の強化と、ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ(Gnd)活性の不活化、
 から選択されたものである[1]記載のイソプロピルアルコール生産大腸菌。
 〔3〕 前記グルコース-6-リン酸-1-デヒドロゲナーゼ(Zwf)活性が、エシェリヒア属細菌由来のグルコース-6-リン酸-1-デヒドロゲナーゼ(Zwf)をコードする遺伝子に由来するものである[2]に記載のイソプロピルアルコール生産大腸菌。
 〔4〕 前記イソプロピルアルコール生産系が、アセト酢酸デカルボキシラーゼ、イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ、CoAトランスフェラーゼ及びチオラーゼの各酵素遺伝子により構築されたものである[1]~[3]のいずれかに記載のイソプロピルアルコール生産大腸菌。
 〔5〕 前記イソプロピルアルコール生産系が、前記アセト酢酸デカルボキシラーゼ、イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ、CoAトランスフェラーゼ及びチオラーゼの各酵素遺伝子により構築されたものであり、かつ各酵素遺伝子が、それぞれ独立に、クロストリジウム属細菌、バチルス属細菌及びエシェリヒア属細菌からなる群より選択された少なくとも1種の原核生物に由来するものである[1]~[4]のいずれかに記載のイソプロピルアルコール生産大腸菌。
 〔6〕 前記アセト酢酸デカルボキシラーゼ活性が、クロストリジウム・アセトブチリカム由来の酵素をコードする遺伝子に由来するものであり、前記イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ活性がクロストリジウム・ベイジェリンキ由来の酵素をコードする遺伝子に由来するものであり、前記CoAトランスフェラーゼ活性及びチオラーゼ活性がエシェリヒア・コリ由来の各酵素をコードする遺伝子に由来するものである[4]又は[5]記載のイソプロピルアルコール生産大腸菌。
 〔7〕 前記イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ及び前記アセト酢酸デカルボキシラーゼの少なくとも1つの活性が遺伝子改変体として導入された遺伝子に由来する[4]に記載のイソプロピルアルコール生産大腸菌。
 〔8〕 前記イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼの遺伝子改変体が配列番号40で表される塩基配列であり、前記アセト酢酸デカルボキシラーゼの遺伝子改変体が配列番号43で表される塩基配列である[7]に記載のイソプロピルアルコール生産大腸菌。
 〔9〕 さらに、スクロース非PTS遺伝子群のうちスクロース加水分解酵素遺伝子を少なくとも有する[4]~[8]のいずれかに記載のイソプロピルアルコール生産大腸菌。
 〔10〕 [1]~[9]のいずれかに記載のイソプロピルアルコール生産大腸菌を用いて植物由来原料からイソプロピルアルコールを生産することを含むイソプロピルアルコール生産方法。
 〔11〕 [1]~[9]のいずれかに記載のイソプロピルアルコール生産大腸菌を用いて植物由来原料からイソプロピルアルコールを得ること、及び
 得られたイソプロピルアルコールに、触媒として、酸化亜鉛と、第4族の元素を含む少なくとも1種の酸化物とを含有し且つ共沈法で調製された複合酸化物を接触させることを含む、アセトン生産方法。
 〔12〕 [1]~[9]のいずれかに記載の記載のイソプロピルアルコール生産大腸菌を用いて植物由来原料から得られ且つアセトンを含有するイソプロピルアルコールに、反応温度50~300℃の範囲で、触媒として固体酸物質およびCuを含む水添触媒を接触させることを含む、プロピレンの製造方法。
 〔13〕 前記Cuを含む水添触媒が、さらに第6族、第12族、および第13族のうち少なくとも一つの元素を含む触媒である[12]に記載のプロピレンの製造方法。
 〔14〕 前記固体酸物質がゼオライトである[12]又は[13]に記載のプロピレンの製造方法。
 本発明によれば、イソプロピルアルコールを高生産できる大腸菌、該大腸菌を用いたイソプロピルアルコール生産方法及びアセトン生産方法、更には該大腸菌を用いて得られたアセトンを含有するイソプロピルアルコールから、プロピレンを生産する方法を提供することができる。
 本発明のイソプロピルアルコール生産大腸菌は、転写抑制因子GntRの活性が不活化されていると共に、イソプロピルアルコール生産系と、該GntRの活性の不活化に伴うイソプロピルアルコール生産能を維持又は強化する酵素活性パターンの補助酵素群とを備えたイソプロピルアルコール生産大腸菌である。
 本発明のイソプロピルアルコール生産大腸菌では、GntR活性が不活化されていると共に、上記所定の酵素活性パターンの補助酵素群を備えているため、イソプロピルアルコールを高生産することができる。
 即ち本発明は、イソプロピルアルコールの生産性を高めるために種々検討した結果、グルコン酸代謝の負の制御因子であるGntRの活性を不活化することによって、該大腸菌による生成物であるイソプロピルアルコールの生産性が上がることを見出したものである。
 また、この際、GntRの活性の不活化により向上したイソプロピルアルコール生産能に影響する酵素が存在することが見出された。これらの酵素の活性のパターンによって、GntRの活性の不活化により向上したイソプロピルアルコール生産能が維持又は強化される。
 本発明における「補助酵素群」とは、このようなイソプロピルアルコール生産能に影響する1つ又は2つ以上の酵素を指す。また、補助酵素群のそれぞれの酵素活性は、不活化、活性化又は強化されており、本発明における「補助酵素群の酵素活性パターン」とは、GntRの活性を不活化したことのみによって得られる向上したイソプロピルアルコール生産量が、維持又は増加し得る各酵素の酵素活性パターンを指し、1つ又は2つ以上の酵素の組み合わせを包含する。
 前記補助酵素群は、イソプロピルアルコール生産系を備え且つGntR活性を不活化した以外は生来の酵素(本発明では、除外することを特に断らない限り「酵素」には単独では酵素活性を示さない「因子」も含まれる)のみで構成された酵素群であってもよい。
 例えば、所定のイソプロピルアルコール生産能を発揮するイソプロピルアルコール生産系を備え、且つ遺伝子組み換え技術によりGntRを不活化した以外は、何ら人為的に変更していないイソプロピルアルコール生産大腸菌、及び、イソプロピルアルコールの生産能を高めるための改変が付与されたイソプロピルアルコール生産系を備え、且つ、遺伝子組み換え技術によりGntRを不活化した以外は、何ら人為的に変更していないイソプロピルアルコール生産大腸菌は、前記イソプロピルアルコール生産大腸菌に包含される。
 補助酵素群の酵素活性パターンとしては、好ましくは、以下のパターンを挙げることができる:
  (1)グルコース-6-リン酸イソメラーゼ(Pgi)活性、グルコース-6-リン酸-1-デヒドロゲナーゼ(Zwf)活性及びホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ(Gnd)活性の野生型の維持、
  (2)グルコース-6-リン酸イソメラーゼ(Pgi)活性の不活化と、グルコース-6-リン酸-1-デヒドロゲナーゼ(Zwf)活性の強化、
  (3)グルコース-6-リン酸イソメラーゼ(Pgi)活性の不活化と、グルコース-6-リン酸-1-デヒドロゲナーゼ(Zwf)活性の強化と、ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ(Gnd)活性の不活化。
 なかでも、上記(3)の補助酵素群の酵素活性パターンがイソプロピルアルコール生産能の観点からより好ましい。
 なお、本発明にかかる補助酵素群及びその酵素活性パターンは、これらに限定されず、GntRの活性の不活化を含み、イソプロピルアルコール生産大腸菌におけるイソプロピルアルコール生産量が増加し得る補助酵素群及びその酵素活性パターンであれば、いずれも本発明に包含される。また、補助酵素群は、必ずしも複数の酵素で構成されている必要はなく、1の酵素で構成していてもよい。
 なお、本発明における「不活化」とは、既存のあらゆる測定系によっても測定された当該因子又は酵素の活性が、不活化前の大腸菌での活性を100としたとき、その1/10以下の状態を指す。
 本発明における「遺伝子組換え技術により」との文言は、生来の遺伝子の塩基配列に対する別のDNAの挿入、あるいは遺伝子のある部分の置換、欠失又はこれらの組み合わせによって塩基配列上の変更が生じているものであれば全て包含し、例えば、突然変異が生じた結果得られたものであってもよい。
 本発明において因子又は酵素の活性が不活化された大腸菌とは、菌体外から菌体内への何らかの方法によって、生来の活性が損なわれた細菌を指す。これらの細菌は、例えば該蛋白質又は酵素をコードする遺伝子を破壊すること(遺伝子破壊)により作出することができる。
 本発明における遺伝子破壊としては、ある遺伝子の機能が発揮できないようにするために、その遺伝子の塩基配列に変異を入れる、別のDNAを挿入する、及び、遺伝子のある部分を欠失させることを挙げることができる。遺伝子破壊の結果、例えばその遺伝子がmRNAへ転写できなくなり、構造遺伝子が翻訳されなくなる。あるいは、転写されたmRNAが不完全なために翻訳された構造蛋白質のアミノ酸配列に変異又は欠失が生じて本来の機能の発揮が不可能になる。
 遺伝子破壊株の作製は、当該酵素又は蛋白質が発現しない破壊株が得られればいかなる方法も用いることが可能である。遺伝子破壊の方法は種々の方法(自然育種、変異剤添加、紫外線照射、放射線照射、ランダム突然変異、トランスポゾン、部位特異的遺伝子破壊)が報告されているが、ある特定の遺伝子のみ破壊できるという点で、相同組換えによる遺伝子破壊が好ましい。相同組換えによる手法はJ.Bacteriol.,161,1219-1221(1985)やJ.Bacteriol.,177,1511-1519(1995)やProc.Natl.Acad.Sci.U.S.A,97,6640-6645(2000)に記載されており、これらの方法及びその応用によって同業技術者であれば容易に実施可能である。
 本発明における「活性」の「強化」とは、強化前のイソプロピルアルコール生産大腸菌での各種酵素活性が強化後に高まることを広く意味する。
 強化の方法としては、イソプロピルアルコール生産大腸菌が有している各種酵素の活性が高まれば、特に制限はなく、菌体外から導入された酵素遺伝子による強化、菌体内の酵素遺伝子の発現増強による強化、及びこれらの組み合わせを挙げることができる。
 菌体外から導入された酵素遺伝子による強化としては、具体的には、宿主由来の酵素よりも高活性の酵素をコードする遺伝子を宿主細菌の菌体外から菌体内に導入して、導入された酵素遺伝子による酵素活性を追加するあるいはこの酵素活性に宿主が本来有する酵素活性と置換すること、更には宿主由来の酵素遺伝子又は菌体外からの酵素遺伝子の数を2以上に増加させること、又はこれらの組み合わせを挙げることができる。
 菌体内の酵素遺伝子の発現増強による強化としては、具体的には、酵素遺伝子の発現を増強する塩基配列を宿主細菌の菌体外から菌体内に導入すること、宿主細菌がゲノム上に保有する酵素遺伝子のプロモーターを他のプロモーターと置換することによって酵素遺伝子の発現を強化させること、及びこれらの組み合わせを挙げることができる。
 本発明において「宿主」とは、ひとつ以上の遺伝子を菌体外から導入された結果、本発明のイソプロピルアルコール生産大腸菌となる当該大腸菌を意味する。
 以下に、本発明について説明する。
 本発明におけるGntRとは、エントナードウドロフ経路を経由したグルコン酸代謝に関与するオペロンを負に制御する転写因子を指す。グルコン酸の取り込みと代謝を担う二つの遺伝子群(GntIとGntII)の働きを抑制するGntR転写抑制因子の総称を指す。
 本発明におけるグルコース-6-リン酸イソメラーゼ(Pgi)とは、国際生化学連合(I.U.B.)酵素委員会報告に準拠した酵素番号5.3.1.9に分類され、D-グルコース-6-リン酸からD-フルクトース-6-リン酸を生成する反応を触媒する酵素の総称を指す。
 本発明におけるグルコース-6-リン酸-1-デヒドロゲナーゼ(Zwf)とは、国際生化学連合(I.U.B.)酵素委員会報告に準拠した酵素番号1.1.1.49に分類され、D-グルコース-6-リン酸からD-グルコノ-1,5-ラクトン-6-リン酸を生成する反応を触媒する酵素の総称を指す。
 そのようなものとしては、例えば、Deinococcus radiophilus等のDeinococcus属菌、Aspergillus niger、Aspergillus aculeatus等のAspergillus属菌 、Acetobacter hansenii等のAcetobacter属菌、Thermotoga maritima等のThermotoga属菌、Cryptococcus neoformans等のCryptococcus属菌、Dictyostelium discoideum等のDictyostelium属菌、Pseudomonas fluorescens、Pseudomonas aeruginosa等のPseudomonas属、Saccharomyces cerevisiae等のSaccharomyces属、Bacillus megaterium等のBacillus属菌、Escherichia coli等のEscherichia属菌由来のものが挙げられる。
 本発明において用いられるグルコース-6-リン酸-1-デヒドロゲナーゼ(Zwf)の遺伝子としては、上述した各由来生物から得られるチオラーゼをコードする遺伝子の塩基配列を有するDNA又はその公知の塩基配列に基づいて合成された合成DNA配列を利用することができる。好適なものとしては、Deinococcus radiophilus等のDeinococcus属菌、Aspergillus niger、Aspergillus aculeatus等のAspergillus属菌 、Acetobacter hansenii等のAcetobacter属菌、Thermotoga maritima等のThermotoga属菌、Cryptococcus neoformans等のCryptococcus属菌、Dictyostelium discoideum等のDictyostelium属菌、Pseudomonas fluorescens、Pseudomonas aeruginosa等のPseudomonas属、Saccharomyces cerevisiae等のSaccharomyces属、Bacillus megaterium等のBacillus属菌、Escherichia coli等のEscherichia属菌由来の遺伝子の塩基配列を有するDNAが例示される。より好適なものとしては、Deinococcus属菌、Aspergillus属菌 、Acetobacter属菌、Thermotoga属菌、Pseudomonas属、Bacillus属菌、Escherichia属などの原核生物に由来するものを挙げることができ、特に好ましくは、Escherichia coli由来の遺伝子の塩基配列を有するDNAである。
 本発明におけるホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ(Gnd)とは、国際生化学連合(I.U.B.)酵素委員会報告に準拠した酵素番号1.1.1.44に分類され、6-ホスホ-D-グルコン酸からD-リブロース-5-リン酸とCOを生成する反応を触媒する酵素の総称を指す。
 本発明におけるイソプロピルアルコール生産大腸菌は、イソプロピルアルコール生産系を備えた大腸菌であり、遺伝子組換え技術により導入又は改変されたイソプロピルアルコール生産能力を保有する大腸菌をいう。このようなイソプロピルアルコール生産系は、対象となる大腸菌にイソプロピルアルコールを生産させるものであればいずれのものであってもよい。
 好ましくは、イソプロピルアルコールの生産に関与する酵素活性の強化を挙げることができる。本発明におけるイソプロピルアルコール生産大腸菌は、アセト酢酸デカルボキシラーゼ活性、イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ活性、CoAトランスフェラーゼ活性及び前述したチオラーゼ活性の4種類の酵素活性が、菌体外から付与され若しくは菌体内において発現増強され、又はこれら双方がなされていることが更に好ましい。
 本発明におけるチオラーゼとは、国際生化学連合(I.U.B.)酵素委員会報告に準拠した酵素番号2.3.1.9に分類され、アセチルCoAからアセトアセチルCoAを生成する反応を触媒する酵素の総称を指す。
 そのようなものとしては、例えば、クロストリジウム・アセトブチリカム(Clostridium acetobutylicum)、クロストリジウム・ベイジェリンキ(Clostridium beijerinckii)等のクロストリジウム属細菌、エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)等のエシェリヒア属細菌、ハロバクテリウム種(Halobacterium sp.)細菌、ズーグロア・ラミゲラ(Zoogloea ramigera)等のズーグロア属細菌、リゾビウム種(Rhizobium sp.)細菌、ブラディリゾビウム・ジャポニカム(Bradyrhizobium japonicum)等のブラディリゾビウム属細菌、カンジダ・トロピカリス(Candida tropicalis)等のカンジダ属細菌、カウロバクター・クレセンタス(Caulobacter crescentus)等のカウロバクター属細菌、ストレプトマイセス・コリナス(Streptomyces collinus)等のストレプトマイセス属細菌、エンテロコッカス・ファカリス(Enterococcus faecalis)等のエンテロコッカス属細菌由来のものが挙げられる。
 本発明において用いられるチオラーゼの遺伝子としては、上述した各由来生物から得られるチオラーゼをコードする遺伝子の塩基配列を有するDNA又はその公知の塩基配列に基づいて合成された合成DNA配列を利用することができる。好適なものとしては、クロストリジウム・アセトブチリカム、クロストリジウム・ベイジェリンキ等のクロストリジウム属細菌、エシェリヒア・コリ等のエシェリヒア属細菌、ハロバクテリウム種の細菌、ズーグロア・ラミゲラ等のズーグロア属細菌、リゾビウム種の細菌、ブラディリゾビウム・ジャポニカム等のブラディリゾビウム属細菌、カンジダ・トロピカリス等のカンジダ属細菌、カウロバクター・クレセンタス等のカウロバクター属細菌、ストレプトマイセス・コリナス等のストレプトマイセス属細菌、エンテロコッカス・ファカリス等のエンテロコッカス属細菌由来の遺伝子の塩基配列を有するDNAが例示される。より好適なものとしては、クロストリジウム属細菌又はエシェリヒア属細菌などの原核生物に由来するものを挙げることができ、特に好ましくは、クロストリジウム・アセトブチリカム又はエシェリヒア・コリ由来の遺伝子の塩基配列を有するDNAである。
 本発明におけるアセト酢酸デカルボキシラーゼとは、国際生化学連合(I.U.B.)酵素委員会報告に準拠した酵素番号4.1.1.4に分類され、アセト酢酸からアセトンを生成する反応を触媒する酵素の総称を指す。
 そのようなものとしては、例えば、クロストリジウム・アセトブチリカム(Clostridium acetobutylicum)、クロストリジウム・ベイジェリンキ(Clostridium beijerinckii)等のクロストリジウム属細菌、バチルス・ポリミクサ(Bacillus polymyxa)等のバチルス属細菌由来のものが挙げられる。
 本発明の宿主細菌に導入されるアセト酢酸デカルボキシラーゼの遺伝子としては、上述した各由来生物から得られるアセト酢酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子の塩基配列を有するDNA又はその公知の塩基配列に基づいて合成された合成DNA配列を利用することができる。好適なものとしては、クロストリジウム属細菌又はバチルス属細菌に由来するものを挙げることができ、例えばクロストリジウム・アセトブチリカム、バチルス・ポリミクサ由来の遺伝子の塩基配列を有するDNAが例示される。特に好ましくは、クロストリジウム・アセトブチリカム由来の遺伝子の塩基配列を有するDNAである。
 本発明におけるイソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼとは、国際生化学連合(I.U.B.)酵素委員会報告に準拠した酵素番号1.1.1.80に分類され、アセトンからイソプロピルアルコールを生成する反応を触媒する酵素の総称を指す。
 そのようなものとしては、例えば、クロストリジウム・ベイジェリンキ(Clostridium beijerinckii)等のクロストリジウム属細菌由来のものが挙げられる。
 本発明の宿主細菌に導入されるイソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼの遺伝子としては、上述した各由来生物から得られるイソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の塩基配列を有するDNA又はその公知の塩基配列に基づいて合成された合成DNA配列を利用することができる。好適なものとしては、クロストリジウム属細菌に由来するものを挙げることができ、例えばクロストリジウム・ベイジェリンキ由来の遺伝子の塩基配列を有するDNAである。
 本発明におけるCoAトランスフェラーゼとは、国際生化学連合(I.U.B.)酵素委員会報告に準拠した酵素番号2.8.3.8に分類され、アセトアセチルCoAからアセト酢酸を生成する反応を触媒する酵素の総称を指す。
 そのようなものとしては、例えば、クロストリジウム・アセトブチリカム(Clostridium acetobutylicum)、クロストリジウム・ベイジェリンキ(Clostridium beijerinckii)等のクロストリジウム属細菌、ローセブリア・インテスチナリス(Roseburia intestinalis)等のローセブリア属細菌、ファカリバクテリウム・プラウセンツ(Faecalibacterium prausnitzii)等ファカリバクテリウム属細菌、コプロコッカス(Coprococcus)属細菌、トリパノソーマ・ブルセイ(Trypanosoma brucei)等のトリパノソーマ、エシェリヒア・コリ(Escherichia coli:大腸菌)等エシェリヒア属細菌由来のものが挙げられる。
 本発明において用いられるCoAトランスフェラーゼの遺伝子としては、上述した各由来生物から得られるCoAトランスフェラーゼをコードする遺伝子の塩基配列を有するDNA又はその公知の塩基配列に基づいて合成された合成DNA配列を利用することができる。好適なものとしては、クロストリジウム・アセトブチリカム等のクロストリジウム属細菌、ローセブリア・インテスチナリス等のローセブリア属細菌、ファカリバクテリウム・プラウセンツ等のファカリバクテリウム属細菌、コプロコッカス属細菌、トリパノソーマ・ブルセイ等のトリパノソーマ、エシェリヒア・コリ等のエシェリヒア属細菌由来の遺伝子の塩基配列を有するDNAが例示される。より好適なものとしては、クロストリジウム属細菌又はエシェリヒア属細菌に由来するものを挙げることができ、特に好ましくは、クロストリジウム・アセトブチリカム又はエシェリヒア・コリ由来の遺伝子の塩基配列を有するDNAである。
 上記4種類の酵素はそれぞれ、クロストリジウム属細菌、バチルス属細菌及びエシェリヒア属細菌からなる群より選択された少なくとも1種由来のものであることが酵素活性の観点から好ましく、なかでも、アセト酢酸デカルボキシラーゼ及びイソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼがクロストリジウム属細菌由来であり、CoAトランスフェラーゼ活性及びチオラーゼ活性がエシェリヒア属細菌由来である場合が更に好ましい。
 なかでも本発明にかかる4種類の酵素はそれぞれ、クロストリジウム・アセトブチリカム、クロストリジウム・ベイジュリンキ又はエシェリヒア・コリのいずれか由来のものであることが酵素活性の観点から好ましく、アセト酢酸デカルボキシラーゼがクロストリジウム・アセトブチリカム由来の酵素であり、CoAトランスフェラーゼ及びチオラーゼが、それぞれクロストリジウム・アセトブチリカム又はエシェリヒア・コリ由来の酵素であり、イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼが、クロストリジウム・ベイジェリンキ由来の酵素であることがより好ましく、上記4種類の酵素は、酵素活性の観点から、アセト酢酸デカルボキシラーゼ活性がクロストリジウム・アセトブチリカム由来であり、前記イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ活性がクロストリジウム・ベイジェリンキ由来であり、CoAトランスフェラーゼ活性及びチオラーゼ活性がエシェリヒア・コリ由来であることが特に好ましい。
 本発明におけるこれらの酵素の活性は、菌体外から菌体内へ導入されたもの又は、宿主細菌がゲノム上に保有する酵素遺伝子のプロモーター活性を強化又は他のプロモーターと置換することによって酵素遺伝子を強発現させたものとすることができる。
 酵素活性の導入は、例えば酵素をコードする遺伝子を遺伝子組換え技術を用いて宿主細菌の菌体外から菌体内に導入することにより行うことができる。このとき、導入される酵素遺伝子は、宿主細胞に対して同種又は異種のいずれであってもよい。菌体外から菌体内へ遺伝子を導入する際に必要なゲノムDNAの調製、DNAの切断及び連結、形質転換、PCR(Polymerase Chain Reaction)、プライマーとして用いるオリゴヌクレオチドの設計、合成等の方法は、当業者によく知られている通常の方法で行うことができる。これらの方法は、Sambrook, J., et al., ”Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition”, Cold Spring Harbor Laboratory Press,(1989)などに記載されている。
 本発明において酵素の活性を強化した大腸菌とは、何らかの方法によって該酵素活性が強化された大腸菌を指す。これらの大腸菌は、例えば該酵素及び蛋白質をコードする遺伝子を、前述したものと同様の遺伝子組換え技術を用いて菌体外から菌体内にプラスミドを用いて導入する又は、宿主大腸菌がゲノム上に保有する酵素遺伝子のプロモーター活性を強化又は他のプロモーターと置換することによって酵素遺伝子を強発現させる、等の方法を用いて作出することができる。
 本発明における遺伝子のプロモーターとは、上記いずれかの遺伝子の発現を制御可能なものであればよいが、恒常的に微生物内で機能する強力なプロモーターで、かつグルコース存在下でも発現の抑制を受けにくいプロモーターがよい。具体的にはグリセルアルデヒド3-リン酸デヒドロゲナーゼ(以下GAPDHと呼ぶことがある)のプロモーターやセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼのプロモーターを例示することができる。
 本発明におけるプロモーターとはシグマ因子を有するRNAポリメラーゼが結合し、転写を開始する部位を意味する。例えばエシェリヒア・コリ由来のGAPDHプロモーターはGenBank accession number X02662の塩基配列情報において、塩基番号397-440に記されている。
 大腸菌由来のCoAトランスフェラーゼ遺伝子(atoD及びatoA)とチオラーゼ遺伝子(atoB)は、atoD、atoA、atoBの順番で大腸菌ゲノム上でオペロンを形成しているため(Journal of Baceteriology Vol.169 pp 42-52 Lauren Sallus Jenkinsら)、atoDのプロモーターを改変することによって、CoAトランスフェラーゼ遺伝子とチオラーゼ遺伝子の発現を同時に制御することが可能である。
 このことから、CoAトランスフェラーゼ活性及びチオラーゼ活性が宿主大腸菌のゲノム遺伝子より得られたものである場合、充分なイソプロピルアルコール生産能力を獲得する観点から、両酵素遺伝子の発現を担うプロモーターを他のプロモーターと置換する等によって両酵素遺伝子の発現を増強することが好ましい。CoAトランスフェラーゼ活性及びチオラーゼ活性の発現を増強するために用いられるプロモーターとしては、前述のエシェリヒア・コリ由来GAPDHプロモーター等を挙げることができる。
 本発明において、イソプロピルアルコール生産系を備えているイソプロピルアルコール生産大腸菌の例として、WO2009/008377号に記載のpIPA/B株又はpIaaa/B株を例示できる。また、該大腸菌には、イソプロピルアルコールの生産に関与する酵素のうち、CoAトランスフェラーゼ活性とチオラーゼ活性の増強は該大腸菌のゲノム上の各遺伝子の発現を強化することで行い、イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ活性とアセト酢酸デカルボキシラーゼ活性の増強は各遺伝子の発現をプラスミドで強化した株(pIa/B::atoDAB株と呼ぶことがある)を含む。
 本発明では、イソプロピルアルコール生産性をより効果的に向上させる観点から、不活化されたGntR活性が含まれることが好ましい。不活化されたGntRと共に不活化されたグルコース-6-リン酸イソメラーゼ(Pgi)活性と強化されたグルコース-6-リン酸-1-デヒドロゲナーゼ(Zwf)活性が含まれることが更に好ましく、不活化されたGntR活性、不活化されたグルコース-6-リン酸イソメラーゼ(Pgi)活性、不活化されたホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ(Gnd)活性と強化されたグルコース-6-リン酸-1-デヒドロゲナーゼ(Zwf)活性が含まれることが最も好ましい。これらの組み合わせにより、これ以外の各因子又は酵素の組み合わせと比してイソプロピルアルコールの生産性を驚異的に向上させることできる。
 本発明におけるイソプロピルアルコール生産大腸菌の好ましい態様としては、上記pIPA/B株、pIaaa/B株又はpIa/B::atoDAB株のGntR活性を不活化した株である。
 更に好ましい態様としては、上記pIPA/B株、pIaaa/B株又はpIa/B::atoDAB株のGntR活性とグルコース-6-リン酸イソメラーゼ(Pgi)活性を不活化し、グルコース-6-リン酸-1-デヒドロゲナーゼ(Zwf)活性を強化した株である。
 特に好ましい態様としては、上記pIPA/B株、pIaaa/B株又はpIa/B::atoDAB株のGntR活性とグルコース-6-リン酸イソメラーゼ(Pgi)活性とホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ(Gnd)活性を不活化し、グルコース-6-リン酸-1-デヒドロゲナーゼ(Zwf)活性を強化した株である。
 更に本発明におけるイソプロピルアルコール生産大腸菌は、にスクロース資化酵素をコードする遺伝子群を導入することができる。これにより、スクロースからイソプロピルアルコールを生産することが可能となる。
 スクロース資化酵素をコードする遺伝子としては、微生物のスクロース資化経路のうち、PTS系と非PTS系に関与する酵素群をコードする遺伝子が含まれる。
 具体的にスクロースPTSに関与する酵素群をコードする遺伝子としては、ScrA(スクロースの取り込みを行う)、ScrY(スクロースのリン酸化を行う)、ScrB(微生物内部でスクロースの分解を行う)、ScrR(ScrA,Y,Bをコードする遺伝子の発現を制御する)、ScrK(フルクトースのリン酸化を行う)をコードする遺伝子が挙げられる。
 また、具体的にスクロース非PTSに関与する酵素群をコードするスクロース非PTS遺伝子群は、CscB(スクロース透過酵素:スクロースの取り込みを行う)、CscA(スクロース加水分解酵素:微生物内部でスクロースの分解を行う)、CscK(フルクトキナーゼ:フルクトースのリン酸化を行う)、CscR(リプレッサー蛋白質:CscB、A、及びKをコードする遺伝子の発現を制御する)をコードする遺伝子で構成される遺伝子群である。
 本発明におけるイソプロピルアルコール生産大腸菌に導入するスクロース資化酵素遺伝子としては、このうち非PTS系に関与する酵素群をコードする遺伝子を挙げることができ、中でもCscAを少なくとも含む一種以上の酵素の組み合わせの遺伝子を挙げることができる。例えば、cscAのみ、cscA及びcscKの組み合わせ、cscA及びcscBの組み合わせ、cscA及びcscRの組み合わせ、cscA、cscR及びcscKの組み合わせ、cscA、cscR及びcscBの組み合わせ等が挙げられる。中でも、イソプロピルアルコールを効率よく生産する観点から、CscAをコードする遺伝子のみを導入することも選択できる。
 前記スクロース加水分解酵素(インベルターゼ、CscA)の遺伝子としては、この酵素を保有する生物から得られるスクロース加水分解酵素(インベルターゼ、CscA)をコードする遺伝子の塩基配列を有するDNA、又はその公知の塩基配列に基づいて合成された合成DNA配列を利用することができる。好適なものとしては、アーウィニア属菌(Erwinia)、ポルテウス属菌(Proteus)、ビブリオ属菌(Vibrio)、アグロバクテリウム属菌(Agrobacterium)、リヒゾビウム属菌(Rhizobium)、スタフィロコッカス属菌(Staphylococcus),ビフィドバクテリウム属菌(Bifidobacterium)、エシェリヒア属菌(Escherichia)に由来するものを挙げることができ、例えばエシェリヒア・コリO157株由来の遺伝子の塩基配列を有するDNAが例示される。特に好ましくは、エシェリヒア・コリO157株由来の遺伝子の塩基配列を有するDNAである。またcscAには、cscAを菌体のペリプラズムへ移行させるためのシグナル配列が付加されていることが好ましい。
 前記リプレッサー蛋白質(CscR)の遺伝子としては、この酵素を保有する生物から得られるリプレッサータンパク質(CscR)をコードする遺伝子の塩基配列を有するDNA、又はその公知の塩基配列に基づいて合成された合成DNA配列を利用することができる。好適なものとしては、アーウィニア属菌(Erwinia)、ポルテウス属菌(Proteus)、ビブリオ属菌(Vibrio)、アグロバクテリウム属菌(Agrobacterium)、リヒゾビウム属菌(Rhizobium)、スタフィロコッカス属菌(Staphylococcus),ビフィドバクテリウム属菌(Bifidobacterium)、エシェリヒア属菌(Escherichia)に由来するものを挙げることができ、例えばエシェリヒア・コリO157株由来の遺伝子の塩基配列を有するDNAが例示される。特に好ましくは、エシェリヒア・コリO157株由来の遺伝子の塩基配列を有するDNAである。
 前記フルクトキナーゼ(CscK)の遺伝子としては、この酵素を保有する生物から得られるフルクトキナーゼ(CscK)をコードする遺伝子の塩基配列を有するDNA、又はその公知の塩基配列に基づいて合成された合成DNA配列を利用することができる。好適なものとしては、アーウィニア属菌(Erwinia)、ポルテウス属菌(Proteus)、ビブリオ属菌(Vibrio)、アグロバクテリウム属菌(Agrobacterium)、リヒゾビウム属菌(Rhizobium)、スタフィロコッカス属菌(Staphylococcus),ビフィドバクテリウム属菌(Bifidobacterium)、エシェリヒア属菌(Escherichia)に由来するものを挙げることができ、例えばエシェリヒア・コリO157株由来の遺伝子の塩基配列を有するDNAが例示される。特に好ましくは、エシェリヒア・コリO157株由来の遺伝子の塩基配列を有するDNAである。
 前記スクロース透過酵素(CscB)の遺伝子としては、この酵素を保有する生物から得られる、スクロース透過酵素(CscB)をコードする遺伝子の塩基配列を有するDNA、又はその公知の塩基配列に基づいて合成された合成DNA配列を利用することができる。好適なものとしては、アーウィニア属菌(Erwinia)、ポルテウス属菌(Proteus)、ビブリオ属菌(Vibrio)、アグロバクテリウム属菌(Agrobacterium)、リヒゾビウム属菌(Rhizobium)、スタフィロコッカス属菌(Staphylococcus),ビフィドバクテリウム属菌(Bifidobacterium)、エシェリヒア属菌(Escherichia)に由来するものを挙げることができ、例えばエシェリヒア・コリO157株由来の遺伝子の塩基配列を有するDNAが例示される。特に好ましくは、エシェリヒア・コリO157株由来の遺伝子の塩基配列を有するDNAである。
 本発明にかかるイソプロピルアルコール生産大腸菌では、前記イソプロピルアルコール生産系にかかる各酵素、好ましくは上記イソプロピルアルコール生産系の酵素のうち、イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ及びアセト酢酸デヒドロゲナーゼの少なくとも一方の酵素の活性が、遺伝子改変体として導入された導入遺伝子に由来してもよい。
 本発明において「遺伝子改変体」とは、当該酵素遺伝子の塩基配列に、欠失、置換、付加等の改変を加えたものすべてが含まれる。具体的には、当該酵素遺伝子の塩基配列のうち、コドンのみに変更を加え、当該コドンのみに変更を加えた塩基配列を基に合成されるアミノ酸配列には変更がないものや、当該酵素遺伝子のプロモーター領域のみに変更を加え、当該プロモーター領域のみに変更を加えた塩基配列を基に合成されるアミノ酸配列には変更がないものなどが挙げられる。
 改変される酵素遺伝子は、宿主本来の遺伝子であってもよく、他種の微生物由来の酵素遺伝子であってもよい。
 またイソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼをコードする酵素遺伝子のみ又はアセト酢酸デヒドロゲナーゼ酵素遺伝子のみが、遺伝子改変されていてもよく、これらが同時に遺伝子改変されていてもよい。
 遺伝子改変体としては、遺伝子改変の上記いずれかの酵素遺伝子に対する変更の結果、宿主に対して対応する酵素の酵素活性が付与され又は強化されて、目的の物質生産能が増強するものであれば、どのような改変を加えてもよい。
 好ましくは、遺伝子改変体は、大腸菌のコドン使用頻度に基づいて使用コドンを改変した改変体遺伝子である。このような遺伝子改変体とすることにより、イソプロピルアルコールの生産性を上げることができる。
 本発明において「使用コドンを改変する」とは、アミノ酸配列をコード規定する塩基配列上において、各アミノ酸に対応する3塩基の並びであるコドンを改変することを意味する。本発明において「コドン改変」とは、アミノ酸配列を変えずに塩基配列のみを改変することを意味している。
 前記イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼの遺伝子改変体としては、好ましくは、配列番号40で示される塩基配列を有する。また、前記アセト酢酸デヒドロゲナーゼの遺伝子改変体としては、好ましくは、配列番号43で示される塩基配列を有する。これらの遺伝子改変体を用いることにより、イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ及びアセト酢酸デヒドロゲナーゼの各酵素活性をそれぞれ好ましく増強することができる。
 本発明において大腸菌とは、本来、植物由来原料からイソプロピルアルコールを生産する能力を有するか否かに関わらず、何らかの手段を用いることにより植物由来原料からイソプロピルアルコールを生産する能力を有し得る大腸菌を意味する。
 ここで上記の遺伝子組換えの対象となる大腸菌としては、イソプロピルアルコール生産能を有しないものであってもよく、上記の各遺伝子の導入及び変更が可能であればいずれの大腸菌であってもよい。
 より好ましくは、イソプロピルアルコール生産能が予め付与された大腸菌であることができ、これにより、より効率よくイソプロピルアルコールを生産させることができる。
 このようなイソプロピルアルコール生産大腸菌としては、例えばWO2009/008377号パンフレットに記載されているアセト酢酸デカルボキシラーゼ活性、イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ活性、CoAトランスフェラーゼ活性、及びチオラーゼ活性を付与され、植物由来原料からイソプロピルアルコールを生成しうるイソプロピルアルコール生成大腸菌などを挙げることができる。
 本発明のイソプロピルアルコール生産方法は、上記イソプロピルアルコール生産大腸菌を用いて植物由来原料からイソプロピルアルコールを生産させることを含むものであり、即ち、上記イソプロピルアルコール生産大腸菌と植物由来原料とを接触させて、培養すること(以下、培養工程)と、接触により得られたイソプロピルアルコールを回収すること(以下、回収工程)とを含むものである。
 上記イソプロピルアルコール生産方法に用いられる植物由来原料は、植物から得られる炭素源であり、植物由来原料であれば特に制限されない。本発明においては、植物由来原料とは、根、茎、幹、枝、葉、花、種子等の器官、それらを含む植物体、及びそれら植物器官の分解産物を指し、更に植物体、植物器官、及びそれらの分解産物から得られる炭素源のうち、微生物が培養において炭素源として利用し得るものも、植物由来原料に包含される。
 このような植物由来原料に包含される炭素源には、一般的なものとしてデンプン、スクロース、グルコース、フルクトース、キシロース、アラビノース等の糖類、及びこれら成分を多く含む草木質分解産物、セルロース加水分解物など、並びにこれらの組み合わせを挙げることができ、更には植物油由来のグリセリン又は脂肪酸も、本発明における炭素源に含んでもよい。
 本発明における植物由来原料の例示としては、穀物等の農作物、トウモロコシ、米、小麦、大豆、サトウキビ、ビート、綿等、及びこれらの組み合わせを好ましく挙げることができ、その原料としての使用形態は、未加工品、絞り汁、粉砕物等、特に限定されない。また、上記の炭素源のみの形態であってもよい。
 培養工程におけるイソプロピルアルコール生産大腸菌と植物由来原料との接触は、一般に、植物由来原料を含む培地でイソプロピルアルコール生産大腸菌を培養することにより行われる。
 植物由来原料とイソプロピルアルコール生産大腸菌との接触密度は、イソプロピルアルコール生産大腸菌の活性によって異なるが、一般に、培地中の植物由来原料の濃度として、グルコース換算で初発の糖濃度を混合物の全質量に対して20質量%以下とすることができ、大腸菌の耐糖性の観点から好ましくは、初発の糖濃度を15質量%以下とすることができる。この他の各成分は、微生物の培地に通常添加される量で添加されればよく、特に制限されない。
 また培地中のイソプロピルアルコール生産大腸菌の含有量としては、大腸菌の種類及び活性によって異なるが一般に、培養開始時に投入する前培養の菌液(OD660nm=4~8)の量を培養液に対して0.1質量%~30質量%、培養条件制御の観点から好ましくは1質量%~10質量%とすることができる。
 イソプロピルアルコール生産大腸菌の培養に用いられる培地としては、炭素源、窒素源、無機イオン、及び乳酸を生産するために微生物が要求する有機微量元素、核酸、ビタミン類等が含まれた通常用いられる培地であれば特に制限はない。
 本発明の培養に際して、培養条件は特別の制限はなく、例えば好気条件下でpH4~9、好ましくはpH6~8、温度20℃~50℃、好ましくは25℃~42℃の範囲内でpHと温度を適切に制御しながら培養することができる。
 前記混合物中への気体の通気量は、特に制限はないが、気体として空気のみを用いる場合には、一般的に0.02vvm~2.0vvm(vvm;通気容量〔mL〕/液容量〔mL〕/時間〔分〕)であり、大腸菌への物理的ダメージを抑制する観点から0.1vvm~1.5vvmで行うことが好ましい。
 培養工程は、培養開始から混合物中の植物由来原料が消費されるまで、又はイソプロピルアルコール生産大腸菌の活性がなくなるまで継続させることができる。培養工程の期間は、混合物中のイソプロピルアルコール生産大腸菌の数及び活性並びに、植物由来原料の量により異なるが、一般に、1時間以上、好ましくは4時間以上であればよい。一方、植物由来原料又はイソプロピルアルコール生産大腸菌の再投入を行うことによって、培養期間は無制限に連続することができるが、処理効率の観点から、一般に5日間以下、好ましくは72時間以下とすることができる。その他の条件は、通常の培養に用いられる条件をそのまま適用すればよい。
 培養液中に蓄積したイソプロピルアルコールを回収する方法としては、特に制限はないが、例えば培養液から菌体を遠心分離などで除去した後、蒸留や膜分離等通常の分離方法でイソプロピルアルコールを分離する方法が採用できる。
 なお、本発明のイソプロピルアルコールの生産方法は、イソプロピルアルコール生産のための培養工程の前に、使用するイソプロピルアルコール生産大腸菌を適切な菌数又は適度な活性状態とするための前培養工程を含んでいてもよい。前培養工程は、イソプロピルアルコール生産細菌の種類に応じた通常用いられる培養条件による培養であればよい。
 本発明のイソプロピルアルコールの生産方法は、好ましくは、前記イソプロピルアルコール生産細菌及び植物由来原料を含む混合物中に気体を供給しながら、該イソプロピルアルコール生産大腸菌を培養する培養工程と、前記培養により生成したイソプロピルアルコールを混合物から分離し回収する回収工程とを含む。
 この方法によれば、混合物に気体を供給しながら生産大腸菌を培養する(通気培養)。この通気培養により、生産されたイソプロピルアルコールは混合物中に放出されると共に、混合物から蒸散し、この結果、生成したイソプロピルアルコールを混合物から容易に分離することができる。また、生成したイソプロピルアルコールが混合物から連続的に分離するため、混合物中のイソプロピルアルコールの濃度の上昇を抑制することができる。これにより、イソプロピルアルコール生産大腸菌のイソプロピルアルコールに対する耐性を特に考慮する必要がない。
 なお、本方法における混合物とは、大腸菌の培養に一般的に用いられる基本培地を主体とすればよい。培養条件については、前述した事項がそのまま適用される。
 回収工程では、培養工程で生成され、混合物から分離したイソプロピルアルコールを回収する。この回収方法としては、通常培養により混合物から蒸散したガス状又は飛沫状のイソプロピルアルコールを収集することができるものであればよい。このような方法としては、一般に用いられる密閉容器等の収集部材へ収容すること等を挙げることができるが、なかでも、イソプロピルアルコールのみを純度高く回収できる観点から、イソプロピルアルコールを捕捉するための捕捉液と、混合物から分離したイソプロピルアルコールとを接触することを含むものであることが好ましい。
 本方法では、イソプロピルアルコールは、捕捉液又は混合物に溶解した態様として回収することができる。そのような回収方法としては、例えば国際公開2009/008377号パンフレットに記載された方法などが挙げられる。回収されたイソプロピルアルコールは、HPLC等の通常の検出手段を用いて確認することができる。回収されたイソプロピルアルコールは、必要に応じて更に精製することができる。このような精製方法としては、蒸留等をあげることができる。
 回収されたイソプロピルアルコールが水溶液の状態である場合には、本イソプロピルアルコールの生産方法は、回収工程に加えて、脱水工程を更に含んでいてもよい。イソプロピルアルコールの脱水は、常法により行なうことができる。
 捕捉液又は混合物に溶解した態様として回収可能なイソプロピルアルコールの生産方法に適用可能な装置としては、例えば、国際公開2009/008377号パンフレットの図1に示される生産装置を挙げることができる。
 この生産装置では、イソプロピルアルコール生産細菌と植物由来原料とを含む培地が収容された培養槽に、装置外部から気体を注入するための注入管が連結され、培地に対してエアレーションが可能となっている。
 また、培養槽には、連結管を介して、捕捉液としてのトラップ液が収容されたトラップ槽が連結されている。このとき、トラップ槽へ移動した気体又は液体がトラップ液と接触してバブリングが生じる。
 これにより、培養槽で通気培養により生成したイソプロピルアルコールは、エアレーションによって蒸散して培地から容易に分離される共に、トラップ槽においてトラップ液に補足される。この結果、イソプロピルアルコールを、より精製された形態で連続的に且つ簡便に生産することができる。
 本発明のイソプロピルアルコールの生産方法では、イソプロピルアルコールを高生産することができ、同様の方法で通常得られる生産量は本発明を適用しない場合と比較して多い。生産方法の条件や用いられるイソプロピルアルコール生産大腸菌の状態によって異なるが、生産性が50~100g/L/72hr、好ましくは55~80g/L/72hrとすることができる。
 このように本発明のイソプロピルアルコール生産大腸菌は、イソプロピルアルコールを高生産することができるため、例えば、本発明の大腸菌触媒を用いてイソプロピルアルコールの製造を行った場合、培養72時間で75g/L以上のイソプロピルアルコールを蓄積することができ、従来触媒と比較してはるかに高い生産性を獲得することができる。
 また、本発明のイソプロピルアルコール生産大腸菌では、イソプロピルアルコールの前駆体であるアセトンも同時に生産される。得られたアセトンは、公知の方法で精製後に、公知の方法(例えば特許第2786272号公報記載の方法)を用いることによって、イソプロピルアルコールに変換することが好ましい。これにより、糖原料からイソプロピルアルコールへの変換効率を更に高めることができる。
 本発明に係るアセトン生産方法は、前記イソプロピルアルコール生産大腸菌を用いて植物由来原料からイソプロピルアルコールを得ること(以下、イソプロピルアルコール生産工程という)、及び、得られたイソプロピルアルコールに、触媒として、酸化亜鉛と、第4族の元素を含む少なくとも1種の酸化物とを含有し且つ共沈法で調製された複合酸化物を接触させること(以下、アセトン生産工程という)を含むアセトン生産方法である。
 前記イソプロピルアルコール生産大腸菌を用いて得られたイソプロピルアルコールに、共沈法で調製された前記複合酸化物を接触させることにより、脱水素反応が生じて、イソプロピルアルコールからアセトンが生産できる。これにより、前記イソプロピルアルコール生産大腸菌を用いて生産されたイソプロピルアルコールを効果的に利用して、効率よく物質生産を行うことができる。
 イソプロピルアルコール生産工程で用いられるイソプロピルアルコール生産大腸菌及び植物由来原料並びに、イソプロピルアルコール生産の条件等については、イソプロピルアルコールの生産に関して前述した事項がそのまま適用できる。
 アセトン生産工程では、酸化亜鉛と、第4族の元素を含む少なくとも1種の酸化物とを含有し且つ共沈法で調製された複合酸化物を触媒として使用する。
 第4族の元素とは、周期律表の第4族の元素を意味し、チタン、ジルコニウム及びハフハニウム等を挙げることができる。アセトンを高選択的に生産するとの点で、ジルコニウムであることが好ましい。
 触媒として用いられ得る複合酸化物としては、ZnO:ZrO、ZnO:TiO、CuO:ZnO:Al等を挙げることができ、触媒活性、及びアセトンの選択性の点で、ZnO:ZrOが好ましい。
 酸化亜鉛と、第4族元素を含む少なくとも1種の酸化物との比率については、特に制限はないが、50:50~99:1とすることが、触媒活性及びアセトン選択性の点で好ましく、65:35~95:5とすることがより好ましい。酸化亜鉛の比率が50以上であればより高い触媒活性を示すことができ、99以下であればより高いアセトン選択性を示すことができるため好ましい。
 複合酸化物は、共沈法で調製されたものである。触媒として用いうる複合酸化物は、共沈法で調製されたものであるため、触媒組成の均一性、触媒調製のコントロールのし易さ等の利点を有する。
 共沈共沈法とは、多成分系の複合酸化物を製造する方法として一般的に用いられる調製法であり、2種類以上の金属塩の混合水溶液にアルカリ水溶液のような沈殿剤を加えることで、固体として均一に沈殿させることができる。
 具体的な触媒の調製方法としては、硝酸亜鉛等の水溶性の亜鉛塩水溶液と、硝酸ジルコニウム等の水溶性のジルコニウム塩水溶液とを、所望の金属酸化物の組成となるように混合し、この水溶液を炭酸ナトリウム等のアルカリ水溶液中に滴下しアルカリ性にすることで水酸化物として固体が沈殿する。この生成した沈殿物をろ別し、水洗、乾燥した後、焼成することで製造できる。
 また本発明を実施するに際し、使用する触媒量は特に限定されないが、例えば、固定床流通装置を用いて反応を行う場合、原料(イソプロピルアルコール)の時間あたりの供給量(質量)を触媒の質量で割った値、即ちWHSVで示すと、0.01~200/hの範囲であることが望ましく、より好ましくは0.02~100/hの範囲が好適である。
 本発明における脱水素の反応は、回分式や連続式等の反応形式で行うことができる。連続式の場合、例えば触媒を充填した管状の反応器に原料を流通させ反応器から出てきた反応生成物を回収する。
 脱水素反応を行う際の反応温度は通常100℃~500℃、好ましくは150℃~450℃、さらに好ましくは200℃~400℃とすることができる。アセトンとイソプロピルアルコール、水素には平衡関係があり、反応温度が高いほうがアセトンの平衡組成が高くなる。このため、反応温度が100℃以上であればイソプロピルアルコールが大量に残存することなく、好ましい。また500℃以下であれば、望ましくない副反応の増大を招くことがなく好ましい。反応圧力には特に限定はなく、反応温度にも依存するが、好ましくは0.1MPa~1.0MPaとすることができる。
 反応生成物の回収後には、必要に応じて、適宜、精製等を追加的に行ってもよい。アセトンの精製方法等については、当業界で周知又は公知の精製方法を適用することができる。
 本発明にかかるプロピレン生産方法は、前記イソプロピルアルコール生産大腸菌を用いて植物由来原料からアセトンを含むイソプロピルアルコールを得ること(以下、イソプロピルアルコール生産工程という)、及び、得られたアセトンを含むイソプロピルアルコールに、触媒として、Cuを含む水添触媒および固体酸物質の存在下で、反応温度50~300℃の範囲でアセトンと水素とを反応させること(以下、触媒反応工程という)を含む。なお、Cuを含む水添触媒を、明細書において以下、単に「水添触媒」とも記す。
 前記プロピレン生産方法では、前記イソプロピルアルコール生産大腸菌により得られたイソプロピルアルコールが、前記固体酸物質により、イソプロピルアルコールが脱水されてプロピレンおよび水が生成する。
 イソプロピルアルコール生産工程で用いられるイソプロピルアルコール生産大腸菌及び植物由来原料並びに、イソプロピルアルコール生産の条件等については、イソプロピルアルコールの生産に関して前述した事項がそのまま適用できる。
 前記触媒反応工程では、イソプロピルアルコール生産工程で得られたアセトンを含むイソプロピルアルコールを原料として、Cuを含む水添触媒および固体酸物質を用いて所定の条件下で、アセトンと水素を反応させる。
 前記触媒反応工程で使用される水素としては、分子状の水素ガスを用いてもよく、反応条件により水素を発生するシクロヘキサン等の炭化水素に由来する水素であってもよい。水素は原理的にはアセトンに対して等モル以上あればよく、分離回収の点からはアセトンに対して好ましくは1~10倍モル、より好ましくは1~5倍モルあればよい。例えば、アセトンの時間あたりの供給量に対する水素の時間当たりの供給量を前記範囲に設定すればよい。アセトンの転化率を100%以下に抑えたい場合は、水素の量をアセトンの量に対して1倍モルから低減させることで対応できる。
 前記触媒反応工程において、供給された水素は、アセトンの酸素原子と結合して水となり、反応器出口から取り出すことが可能である。またアセトンの当量以上の水素は、予想外の副反応が進行しない限り、本質的には消費されないことになる。
 反応器へ水素ガスを供給する場合には、通常は連続的に供給するが、この方法に特に限定されるものではない。水素の供給の形態としては、反応開始時に水素ガスを供給した後、反応中供給を停止し、ある一定時間経過後に再度供給する間欠的な供給でもよいし、液相反応の場合には溶媒に水素ガスを溶解させて供給してもかまわない。
 また、水素は、水素を反応器から取り出して再利用することができる。このような水素のリサイクルプロセスとしては、例えば、反応器後部で気液分離器により反応液と反応ガスに分離し、反応ガスから分離膜等で水素ガスを分離し、反応器の入り口に再度供給してもよい。このリサイクルプロセスの場合では、軽沸留分とともに塔頂から回収される水素ガスを、反応器に供給することができる。供給される水素の圧力は、反応器の圧力と同等であることが一般的であるが、水素の供給方法に応じて適宜変更すればよい。
 本発明を実施する際には、反応系内に触媒および出発物質(アセトン、イソプロピルアルコール、および水素)に対して不活性な溶媒または気体を供給して、前記反応を希釈した状態で行うことも可能である。
 前記触媒反応工程に適用される反応温度は、50℃~300℃である。50℃未満では、充分なアセトン、又はイソプロピルアルコールの転化率が得られず、また300℃を超えると予想外の副反応やプロピレンの重合等が生じて充分なプロピレンの選択率が維持できない。経済性の点で、反応温度は、好ましくは150℃~250℃、より好ましくは150~200℃の範囲である。
 前記反応を行う場合、その他の方法および条件としては特に制限はなく、例えば、以下に示すような条件および方法が採用できる。出発物質であるアセトン、イソプロピルアルコールと水素との接触や、水素の供給方法は、気液向流および気液併流の何れでもよく、また液およびガスの方向として、液下降-ガス上昇、液上昇-ガス下降、液ガス上昇、液ガス下降の何れでもよい。また実施圧力は、好ましくは0.1気圧~500気圧、更に好ましくは0.5気圧~100気圧である。
 前記固体酸物質としては、通常の固体酸である、ゼオライト、シリカ、アルミナ、シリカアルミナ、γアルミナ、酸化チタン、酸化亜鉛、酸化ジルコニウムなどの金属酸化物などが挙げられる。これらの中では、高い触媒活性、及び高いプロピレン選択性の点でゼオライトが好ましい。
 ゼオライトとしては、前記反応において原料および中間体として存在すると考えられるイソプロピルアルコールおよび目的とするプロピレンの分子径により、好適なゼオライトを選択すればよい。
 特にゼオライトとしては、イソプロピルアルコールやプロピレンの分子径に近いことから、酸素10~12員環の細孔を有するゼオライトが好ましい。酸素10~12員環を有するゼオライトとしては、フェリエライト、ヒューランダイト、ZSM-5、ZSM-11、ZSM-12、NU-87、シーター1、ウェイネベアイト、X型ゼオライト、Y型ゼオライト、USY型ゼオライト、モルデナイト、脱アルミニウムモルデナイト、β-ゼオライト、MCM-22、MCM-56などが挙げられる。これらの中でもβ-ゼオライトが好ましい。
 ゼオライトにおけるケイ素とアルミニウムとの組成比(ケイ素/アルミニウム)は、高い活性を得るため、2/1~200/1の範囲にあることが好ましく、活性および熱安定性の面から5/1~100/1の範囲にあることが特に好ましい。さらにゼオライト骨格に含まれるアルミニウムを、Ga、Ti、Fe、Mn、Bなどのアルミニウム以外の金属で置換した、いわゆる同型置換したゼオライトを用いることもできる。また、ゼオライトとしては、自身を金属イオンで修飾したものも用いることができる。
 固体酸物質の形状は特に制限は無く、球状、円柱状、押し出し状、破砕状の何れでもよい。また、その粒子の大きさも特に制限は無く、通常は0.01mm~100mmの範囲のものを反応器の大きさに応じて選択すればよい。固体酸物質は、一種単独で用いてもよく、二種以上を用いてもよい。
 前記Cuを含む水添触媒としては、Cuを金属そのものとして含むもの、金属化合物の形で含むものなどが挙げられる。前記金属化合物としては、例えば、CuO、CuOなどの金属酸化物;及び、CuClなどの金属塩化物などが挙げられる。また、これらの触媒を担体に担持させてもよい。
 前記Cuを含む水添触媒は、さらに周期律表の第6族、第12族および第13族のうち少なくとも一つの元素を含むことが、より高い選択性、又はより長い触媒ライフを得る点で、好ましい。第6族としてはCr、Moなど;第12族としてはZnなど;第13族としてはAl、Inなどが好ましい元素として挙げられる。このような水添触媒としては、銅-クロム、ラネー銅、銅-亜鉛などの銅系の触媒が挙げられる。
 また、前記Cuを含む水添触媒には、PbSO、FeCl、SnClなどの金属塩;K、Naなどのアルカリ金属やアルカリ金属塩;BaSO;などを添加してもよく、これにより、前記Cuを含む水添触媒の活性やプロピレンの選択率が向上する場合がある。前記金属塩、アルカリ金属又はアルカリ金属塩の前記水添触媒への添加量としては、特に制限はないが、主に選択性の点で、0.01質量%~10.00質量%であることが好ましい。
 市場で入手できるCuを含む水添触媒としては、例えば、CuO-ZnO-Al、CuO-Cr-BaOなどが挙げられる。
 水添触媒の形状は特に制限は無く、球状、円柱状、押し出し状、破砕状の何れでもよい。また、その粒子の大きさも特に制限は無く、通常は0.01mm~100mmの範囲のものを反応器の大きさに応じて選択すればよい。
 本発明にかかるプロピレンの製造方法では、前記水添触媒および固体酸物質が充填された反応器に、前記アセトンおよび水素を供給し、アセトンと水素とを反応させることができる。反応器に充填された水添触媒および固体酸物質の合計量(以下「触媒量」とも記す)は特に限定されないが、例えば、固定床反応器を備えた固定床流通装置を用いて反応を行う場合、出発物質であるアセトンの時間あたりの供給量(質量)を触媒量(重量)で割った値、すなわちWHSVで示すと、好ましくは0.1~200/h、更に好ましくは0.2~100/hの範囲である。
 固体酸物質と水添触媒との量比は特に限定されないが、固体酸物質:水添触媒(質量比)が、通常は1:0.01~1:100、好ましくは1:0.05~1:50であることが好ましい。固体酸物質:水添触媒の量比が1:0.01以上であれば、十分なアセトンの転化率となる傾向があり、また固体酸物質:水添触媒の量比が1:100以内であれば、脱水反応が十分に行われてプロピレンの収率が十分となる傾向がある。
 前記反応がある時間経過した後において触媒の活性が低下する場合には、公知の方法で再生を行い、水添触媒および固体酸物質の活性を回復することができる。
 本発明においては、触媒として固体酸物質と、水添触媒との2成分を用いればよい。また、その触媒の使用方法としては、特に限定はなく、例えば、酸触媒成分である、固体酸物質と、水添触媒とをセンチメートルサイズの触媒粒子レベルで物理混合したものを用いてもよいし、両者を微細化し混合した後に、改めてセンチメートルサイズの触媒粒子へ成形してもよいし、固体酸物質を担体として、その上に水添触媒を担持してもよいし、水添触媒を担体として、その上に固体酸物質を担持してよい。また、水添触媒と、固体酸物質とを混合等することなく、各々を用いてもよい。
 特に、高活性、及び高選択的で工業的に入手可能なの点で、水添触媒を用い、かつ固体酸物質を構成するゼオライトとしてβ-ゼオライトを用いることが好ましい。例えば、水添触媒は、ゼオライトに担持されていてもよい。その調製方法としては、Cuの硝酸塩などの水溶液にゼオライトを含浸させ、焼成する方法;Cuを有機溶媒に可溶にするため、配位子とよばれる有機分子をCuと結合させた錯体として、有機溶媒中に添加し、溶液を調製し、該溶液にゼオライトを含浸させ、焼成する方法;さらに錯体のうちあるものは真空下で気化するため、蒸着などでゼオライトに担持させる方法などが挙げられる。
 また、水添触媒は、ゼオライト以外の担体に担持されていてもよい。水添触媒を担持しうる担体としては、シリカ、アルミナ、シリカアルミナ、チタニア、マグネシア、シリカマグネシア、ジルコニア、酸化亜鉛、カーボン(活性炭)、酸性白土、けいそう土などが挙げられる。これらの中でも、シリカ、アルミナ、シリカアルミナ、チタニア、マグネシア、シリカマグネシア、ジルコニア、酸化亜鉛、カーボン(活性炭)のうち少なくとも1つを選択することが、より高活性、及びより高選択性の点で好ましい。
 本発明において使用される反応器としては、固定床反応器、流動床反応器などが挙げられるが、触媒の磨耗や粉化を防止するという観点から、固定床反応器が好ましい。
 本発明において、反応器に水添触媒および固体酸物質を充填する方法は特に限定されない。反応器として固定床反応器を用いる場合、水添触媒および固体酸物質の充填方法は反応成績に大きな影響を与えることがある。前述のように、本発明では水素化と脱水反応とが段階的に起こっていると考えられる。従って、反応の各段階に応じた適当な触媒種を順番に反応器に充填することは、触媒を効率よく使用するという意味で、また目的としない副反応を抑制するという意味で好ましい充填方法である。
 特に反応速度を上げるために水素圧や反応温度を上昇させる場合、低い水素圧や低い反応温度では見られなかった予想外の副反応が起こることは、一般的な化学反応においてよく見られる挙動である。このような場合においては、特に触媒の充填方法が反応成績に大きな影響を与える可能性がある。
 従って、反応の各段階に応じた適当な触媒種を順番に反応器に充填してもよく、水添触媒と固体酸物質との混合比に傾斜をつけて反応器に充填してもよい。水添触媒と固体酸物質とを反応器に充填する方法としては、例えば、反応器に、(1)水添触媒および固体酸物質を混合して充填する方法、(2)水添触媒からなる層(上流側即ち、入口側)と、固体酸物質からなる層(下流側即ち、出口側)とを形成するように充填する方法、(3)水添触媒を担持した固体酸物質を充填する方法、(4)水添触媒からなる層(上流側即ち、入口側)と、固体酸物質および水添触媒からなる層(下流側即ち、出口側)とを形成するように充填する方法、(5)水添触媒からなる層(上流側即ち、入口側)と、水添触媒を担持した固体酸物質からなる層(下流側即ち、出口側)とを形成するように充填する方法、(6)水添触媒および固体酸物質からなる層(上流側即ち、入口側)と、固体酸物質からなる層(下流側即ち、出口側)とを形成するように充填する方法、(7)水添触媒を担持した固体酸物質からなる層(上流側即ち、入口側)と、固体酸物質からなる層(下流側即ち、出口側)とを形成するように充填する方法が挙げられる。なお、上流側とは、反応器の入口側、すなわち出発物質が反応の前半に通過する層を示し、下流側とは、反応器の出口側、すなわち出発物質、中間体および反応生成物などが反応の後半に通過する層を示す。なお、出発物質とは、アセトンおよび水素を意味するが、気液向流でアセトンおよび水素を反応器に供給する場合には、前記上流側(入口側)とは、アセトンが反応の前半に通過する層を意味する。
 プロピレンの生産量を維持するために、反応器を2つまたは3つ並列に並べ、1つの反応器内の触媒が再生している間に、残った1つまたは2つの反応器で反応を実施するメリーゴーランド方式をとることができる。さらに反応器が3つある場合には、他の反応器2つを直列につなぎ、生産量の変動を少なくする方法をとることができる。また、流動床流通反応方式や移動床反応方式で実施する場合には、反応器から連続的または断続的に、一部または全部の触媒を抜き出して相当する分を補充することにより、一定の活性を維持することが可能である。
 以下に、本発明の実施例を記載するが、本発明はこれらによって制限されるものではない。なお、記載中の「%」は特に断らない限り、質量基準である。
(イソプロピルアルコール生産株の作製)
 本実施例で使用した大腸菌株とプラスミドの一覧表を表1及び表2に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001

 
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
[実施例1]
<B::atoDAB株の作製>
 エシェリヒア・コリMG1655株のゲノムDNAの全塩基配列は公知であり(GenBank accession number U00096)、エシェリヒア・コリMG1655株のCoAトランスフェラーゼ αサブユニットをコードする遺伝子(以下、atoDと略することがある)の塩基配列も報告されている。すなわちatoDはGenBank accession number U00096に記載のエシェリヒア・コリMG1655株ゲノム配列の2321469~2322131に記載されている。
 上記の遺伝子を発現させるために必要なプロモーターの塩基配列として、GenBank accession number X02662の塩基配列情報において、397-440に記されているエシェリヒア・コリ由来のグリセルアルデヒド3-リン酸デヒドロゲナーゼ(以下GAPDHと呼ぶことがある)のプロモーター配列を使用することができる。GAPDHプロモーターを取得するためエシェリヒア・コリMG1655株のゲノムDNAをテンプレートに用いてcgctcaattgcaatgattgacacgattccg(配列番号1)、及びacagaattcgctatttgttagtgaataaaagg(配列番号2)によりPCR法で増幅し、得られたDNAフラグメントを制限酵素MfeI及びEcoRIで消化することで約100bpのGAPDHプロモーターをコードするDNAフラグメントを得た。得られたDNAフラグメントとプラスミドpUC19(GenBank accession number X02514)を制限酵素EcoRIで消化し、さらにアルカリフォスファターゼ処理したものとを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリDH5α株コンピテントセル(東洋紡績株式会社 DNA-903)に形質転換し、アンピシリン50μg/mLを含むLB寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニー10個をそれぞれアンピシリン50μg/mLを含むLB液体培地で37℃で一晩培養し、プラスミドを回収し、制限酵素EcoRI及びKpnIで消化した際、GAPDHプロモーターが切り出されないものを選抜し、さらに、DNA配列を確認しGAPDHプロモーターが正しく挿入されたものをpUCgapPとした。得られたpUCgapPを制限酵素EcoRI及びKpnIで消化した。
 さらにatoDを取得するために、エシェリヒア・コリMG1655株のゲノムDNAをテンプレートに用いてcgaattcgctggtggaacatatgaaaacaaaattgatgacattacaagac(配列番号3)、及びgcggtaccttatttgctctcctgtgaaacg(配列番号4)によりPCR法で増幅し、得られたDNAフラグメントを制限酵素EcoRI及びKpnIで消化することで約690bpのatoDフラグメントを得た。このDNAフラグメントを先に制限酵素EcoRI及びKpnIで消化したpUCgapPと混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリDH5α株コンピテントセル(東洋紡績株式会社 DNA-903)に形質転換し、アンピシリン50μg/mLを含むLB寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られた菌体からプラスミドを回収し、atoDが正しく挿入されていることを確認し、このプラスミドをpGAPatoDと命名した。
 なおエシェリヒア・コリMG1655株はアメリカンタイプカルチャーコレクションより入手することができる。
 上述した通り、エシェリヒア・コリMG1655株のゲノムDNAにおけるatoDの塩基配列も報告されている。エシェリヒア・コリMG1655株のatoDの5’近傍領域の遺伝子情報に基づいて作成された、gctctagatgctgaaatccactagtcttgtc(配列番号5)とtactgcagcgttccagcaccttatcaacc(配列番号6)を用いて、エシェリヒア・コリMG1655株のゲノムDNAを鋳型としてPCRを行うことにより約1.1kbpのDNA断片を増幅した。
 また、エシェリヒア・コリMG1655株のGAPDHプロモーターの配列情報に基づいて作製されたggtctagagcaatgattgacacgattccg(配列番号7)とエシェリヒア・コリMG1655株のatoDの配列情報に基づいて作製された配列番号4のプライマーを用いて、先に作製した発現ベクターpGAPatoDを鋳型としてPCRを行い、GAPDHプロモーターとatoDからなる約790bpのDNAフラグメントを得た。
 上記により得られたフラグメントをそれぞれ、制限酵素PstIとXbaI、XbaIとKpnIで消化し、このフラグメントを温度感受性プラスミドpTH18cs1(GenBank accession number AB019610)〔Hashimoto-Gotoh, T., Gene, 241, 185-191 (2000)〕をPstIとKpnIで消化して得られるフラグメントと混合し、リガーゼを用いて結合した後、DH5α株に形質転換し、クロラムフェニコール10μg/mlを含むLB寒天プレートに30℃で生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをクロラムフェニコール10μg/mlを含むLB液体培地で30℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドを回収した。このプラスミドをエシェリヒア・コリB株(ATCC11303)に形質転換し、クロラムフェニコール10μg/mlを含むLB寒天プレートに30℃で一晩培養し、形質転換体を得た。得られた形質転換体をクロラムフェニコール10μg/mlを含むLB液体培地に接種し、30℃で一晩培養した。得られた培養菌体をクロラムフェニコール10μg/mlを含むLB寒天プレートに塗布し、42℃で培養しコロニーを得た。得られたコロニーを抗生物質を含まないLB液体培地で30℃で2時間培養し、抗生物質を含まないLB寒天プレートに塗布して42℃で生育するコロニーを得た。
 出現したコロニーの中から無作為に100コロニーをピックアップしてそれぞれを、抗生物質を含まないLB寒天プレートとクロラムフェニコール10μg/mlを含むLB寒天プレートに生育させ、クロラムフェニコール感受性のクローンを選んだ。さらにはこれらのクローンの染色体DNAからPCRによりGAPDHプロモーターとatoDを含む約790bp断片を増幅させ、atoDプロモーター領域がGAPDHプロモーターに置換されている株を選抜し、以上を満足するクローンをエシェリヒア・コリ、B::atoDABと命名した。
 なお、エシェリシア・コリB株(ATCC11303)は細胞・微生物・遺伝子バンクであるアメリカンタイプカルチャーコレクションより入手することができる。
[実施例2]
<プラスミドpIazの作製>
 クロストリジウム属細菌のアセト酢酸デカルボキシラーゼはGenBank accession number M55392に、イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼはGenBank accession number AF157307に記載されている。
 上記の遺伝子群を発現させるために必要なプロモーターの塩基配列として、GenBank accession number X02662の塩基配列情報において、397-440に記されているエシェリヒア・コリ由来のグリセルアルデヒド3-リン酸デヒドロゲナーゼ(以下GAPDHと呼ぶことがある)のプロモーター配列を使用することができる。
 GAPDHプロモーターを取得するためエシェリヒア・コリMG1655株のゲノムDNAをテンプレートに用いてcgagctacatatgcaatgattgacacgattccg(配列番号18)、及びcgcgcgcatgctatttgttagtgaataaaagg(配列番号19)によりPCR法で増幅し、得られたDNAフラグメントを制限酵素NdeI、SphIで消化することで約110bpのGAPDHプロモーターにあたるDNAフラグメントを得た。得られたDNAフラグメントとプラスミドpBR322(GenBank accession number J01749)を制限酵素NdeI及びSphIで消化することで得られるフラグメントを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリDH5α株コンピテントセル(東洋紡績株式会社 DNA-903)に形質転換し、アンピシリン50μg/mLを含むLB寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをアンピシリン50μg/mLを含むLB液体培地で37℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドpBRgapPを回収した。
 イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子を取得するために、Clostridium beijerinckii NRRL B-593のゲノムDNAをテンプレートに用いて、aatatgcatgctggtggaacatatgaaaggttttgcaatgctagg(配列番号8)、及びgcggatccttataatataactactgctttaattaagtc(配列番号9)によりPCR法で増幅し、得られたDNAフラグメントを制限酵素SphI、BamHIで消化することで約1.1kbpのイソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼフラグメントを得た。得られたDNAフラグメントとプラスミドpBRgapPを制限酵素SphI及びBamHIで消化することで得られるフラグメントを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリDH5α株コンピテントセル(東洋紡績株式会社 DNA-903)に形質転換し、アンピシリン50μg/mLを含むLB寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをアンピシリン50μg/mLを含むLB液体培地で37℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドを回収しIPAdhが正しく挿入されていることを確認し、このプラスミドをpGAP-IPAdhと命名した。
 アセト酢酸デカルボキシラーゼ遺伝子を取得するために、Clostridium acetobutylicum ATCC824のゲノムDNAをテンプレートに用いて、caggatccgctggtggaacatatgttaaaggatgaagtaattaaacaaattagc(配列番号10)、及びggaattcggtaccttacttaagataatcatatataacttcagc(配列番号11)によりPCR法で増幅し、得られたDNAフラグメントを制限酵素BamHI、EcoRIで消化することで約700bpのアセト酢酸デカルボキシラーゼフラグメントを得た。得られたDNAフラグメントと先に作成したプラスミドpGAP-IPAdhを制限酵素BamHI及びEcoRIで消化することで得られるフラグメントを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリDH5α株コンピテントセル(東洋紡績株式会社 DNA-903)に形質転換し、アンピシリン50μg/mLを含むLB寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをアンピシリン50μg/mLを含むLB液体培地で37℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドを回収し、adcが正しく挿入されていることを確認し、このプラスミドをpIaと命名した。
 グルコース6リン酸-1-デヒドロゲナーゼ遺伝子(zwf)を取得するためにエシェリヒア・コリB株のゲノムDNA(GenBank accession No.CP000819)をテンプレートに用いてcaggatcccggagaaagtcttatggcggtaacgcaaacagcccagg(配列番号12)、及びcgtctagattactcaaactcattccaggaacgac(配列番号13)を用いてPCR法で増幅し、得られたDNAフラグメントを制限酵素BamHI、XbaIで消化することで約1500bpのグルコース6リン酸1-デヒドロゲナーゼフラグメントを得た。得られたDNAフラグメントと先に作成したプラスミドpIaを制限酵素BamHI及びXbaI消化することで得られるフラグメントを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリDH5α株コンピテントセル(東洋紡績株式会社 DNA-903)に形質転換し、アンピシリン50μg/mLを含むLB寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをアンピシリン50μg/mLを含むLB液体培地にて37℃で一晩培養し、得られたプラスミドをpIazとした。
 このプラスミドpIazを実施例1で作製したエシェリヒア・コリB::atoDABコンピテントセルに形質転換し、アンピシリン50μg/mLを含むLB Broth,Miller寒天プレートで37℃で一晩培養することにより、エシェリヒア・コリpIaz/B::atoDABを得た。
[実施例3]
<エシェリヒア・コリB株Δpgi株の作製>
 エシェリヒア・コリMG1655のゲノムDNAの全塩基配列は公知であり(GenBank accession number U00096)、エシェリヒア・コリのホスホグルコースイソメラーゼ(以下pgiと呼ぶことがある)をコードする遺伝子の塩基配列も報告されている(GenBank accession number X15196)。pgiをコードする遺伝子(1,650bp)の塩基配列近傍領域をクローニングするため、caggaattcgctatatctggctctgcacg(配列番号14)、cagtctagagcaatactcttctgattttgag(配列番号15)、cagtctagatcatcgtcgatatgtaggcc(配列番号16)及びgacctgcagatcatccgtcagctgtacgc(配列番号17)に示すオリゴヌクレオチドプライマーを4種合成した。配列番号14のプライマーは5’末端側にEcoRI認識部位を、配列番号15および16のプライマーは5’末端側にXbaI認識部位を、配列番号17のプライマーは5’末端側にPstI認識部位をそれぞれ有している。
 エシェリヒア・コリMG1655株(ATCC700926)のゲノムDNAを調製し、得られたゲノムDNAを鋳型とし、配列番号14と配列番号15のプライマーペアで、PCRを行うことにより約1.0kbのDNA断片を増幅した(以下pgi-L断片と呼ぶことがある)。また、配列番号16と配列番号17のプライマーペアで、PCRを行うことにより約1.0kbのDNA断片を増幅した(以下pgi-R断片と呼ぶことがある)。これらのDNA断片をアガロース電気泳動にて分離、回収し、pgi-L断片をEcoRI及びXbaIで、pgi-R断片をXbaI及びPstIでそれぞれ消化した。この消化断片2種と、温度感受性プラスミドpTH18cs1(GenBank accession number AB019610)のEcoRI及びPstI消化物とを混合し、T4DNAリガーゼで反応した後、エシェリヒア・コリDH5αコンピテントセル(東洋紡績社製)に形質転換し、クロラムフェニコール10μg/mlを含むLB寒天プレートに30℃で生育する形質転換体を得た。得られた形質転換体からプラスミドを回収し、pgiをコードする遺伝子の5’上流近傍断片と3’下流近傍断片の2つの断片がpTH18cs1に正しく挿入されていることを確認した。得られたプラスミドをXbaIで消化した後、T4DNAポリメラーゼにより平滑末端化処理を行った。本DNA断片と、pUC4Kプラスミド(GenBank accession number X06404)(Pharmacia)をEcoRIで消化することで得られるカナマイシン耐性遺伝子をさらにT4DNAポリメラーゼにより平滑末端化処理を行ったDNA断片とをT4DNAリガーゼを用いて連結した。その後、エシェリヒア・コリDH5αコンピテントセルに形質転換し、クロラムフェニコール10μg/mlとカナマイシン50μg/mlを含むLB寒天プレートに30℃で生育する形質転換体を得た。得られた形質転換体からプラスミドを回収し、pgiをコードする遺伝子の5’上流近傍断片と3’下流近傍断片の間にカナマイシン耐性遺伝子が正しく挿入されていることを確認し、pTH18cs1-pgiとした。
 こうして得られたプラスミドpTH18cs1-pgiをエシェリヒア・コリB株(ATCC11303)に形質転換し、クロラムフェニコール10μg/mlとカナマイシン50μg/mlを含むLB寒天プレートに30℃で一晩培養し、形質転換体を得た。得られた形質転換体をカナマイシン50μg/mlを含むLB液体培地に接種し、30℃で一晩培養した。次にこの培養液の一部をカナマイシン50μg/mlを含むLB寒天プレートに塗布し、42℃で生育するコロニーを得た。得られたコロニーをカナマイシン50μg/mlを含むLB液体培地で、30℃で24時間培養し、更にカナマイシン50μg/mlを含むLB寒天プレートに塗布して42℃で生育するコロニーを得た。
 出現したコロニーの中から無作為に100コロニーをピックアップして、それぞれをカナマイシン50μg/mlを含むLB寒天プレートと、クロラムフェニコール10μg/mlを含むLB寒天プレートに生育させ、カナマイシンを含むLB寒天プレートにのみ生育するクロラムフェニコール感受性のクローンを選んだ。更にこれらの目的クローンの染色体DNAからPCRにより、pgi遺伝子がカナマイシン耐性遺伝子に置換されていることで約3.3kbp断片の増幅がえられる株を選抜し、得られた株をB株pgi遺伝子欠失株(以下B△pgi株と略することがある)と命名した。
 なおエシェリヒア・コリMG1655株およびエシェリヒア・コリB株はアメリカンタイプカルチャーコレクションより入手することができる。
[実施例4] 
<pIaaa/BΔpgi株の作製>
 エシェリヒア・コリのチオラーゼおよびエシェリヒア・コリのCoAトランスフェラーゼのアミノ酸配列と遺伝子の塩基配列は既に報告されている。すなわち、チオラーゼをコードする遺伝子はGenBank accession number U00096に記載のエシェリヒア・コリMG1655株ゲノム配列の2324131~2325315に記載されている。またCoAトランスフェラーゼをコードする遺伝子は上記エシェリヒア・コリMG1655株ゲノム配列の2321469~2322781に記載されている。これらと共に、後述するクロストリジウム属細菌由来のアセト酢酸デカルボキシラーゼ遺伝子、イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子を発現させることでイソプロピルアルコールの生産が可能である。
 イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子を取得するために、Clostridium beijerinckii NRRL B-593のゲノムDNAをテンプレートに用いて、aatatgcatgctggtggaacatatgaaaggttttgcaatgctagg(配列番号20)、及びgcggatccggtaccttataatataactactgctttaattaagtc(配列番号21)によりPCR法で増幅し、得られたDNAフラグメントを制限酵素SphI、BamHIで消化することで約1.1kbpのイソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼフラグメントを得た。得られたDNAフラグメントと実施例2で作製したプラスミドpBRgapPを制限酵素SphI及びBamHIで消化することで得られるフラグメントを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリDH5α株コンピテントセル(東洋紡績株式会社 DNA-903)に形質転換し、アンピシリン50μg/mLを含むLB寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをアンピシリン50μg/mLを含むLB液体培地で37℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドpGAP-IPAdhを回収した。
 エシェリヒア・コリ由来のチオラーゼ遺伝子を取得するためエシェリヒア・コリMG1655株のゲノムDNAをテンプレートに用いてatggatccgctggtggaacatatgaaaaattgtgtcatcgtcag(配列番号22)、及びgcagaagcttgtctagattaattcaaccgttcaatcaccatc(配列番号23)によりPCR法で増幅し、得られたDNAフラグメントを制限酵素BamHI、HindIIIで消化することで約1.2kbpのチオラーゼフラグメントを得た。得られたDNAフラグメントと先に作成したプラスミドpGAP-IPAdhを制限酵素BamHI及びHindIIIで消化することで得られるフラグメントを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリDH5α株コンピテントセル(東洋紡績株式会社 DNA-903)に形質転換し、アンピシリン50μg/mLを含むLB寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをアンピシリン50μg/mLを含むLB液体培地で37℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドpGAP-IPAdh-atoBを回収した。
 エシェリヒア・コリ由来のCoAトランスフェラーゼ遺伝子を取得するためエシェリヒア・コリMG1655株のゲノムDNAをテンプレートに用いてgctctagagctggtggaacatatgaaaacaaaattgatgacattacaagac(配列番号24)、及びtagcaagcttctactcgagttatttgctctcctgtgaaacg(配列番号25)によりPCR法で増幅し、得られたDNAフラグメントを制限酵素XbaI、HindIIIで消化することで約600bpのCoAトランスフェラーゼαサブユニットフラグメントを得た。得られたDNAフラグメントと先に作成したプラスミドpGAP-IPAdh-atoBを制限酵素XbaI及びHindIIIで消化することで得られるフラグメントを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリDH5α株コンピテントセル(東洋紡績株式会社 DNA-903)に形質転換し、アンピシリン50μg/mLを含むLB寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをアンピシリン50μg/mLを含むLB液体培地で37℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドpGAP-IPAdh-atoB-atoDを回収した。
 さらにエシェリヒア・コリMG1655株のゲノムDNAをテンプレートに用いてaagtctcgagctggtggaacatatggatgcgaaacaacgtattg(配列番号26)、及びggccaagcttcataaatcaccccgttgc(配列番号27)によりPCR法で増幅し、得られたDNAフラグメントを制限酵素XhoI、HindIIIで消化することで約600bpのCoAトランスフェラーゼβサブユニットフラグメントを得た。得られたDNAフラグメントと先に作成したプラスミドpGAP-IPAdh-atoB-atoDを制限酵素XhoI及びHindIIIで消化することで得られるフラグメントを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリDH5α株コンピテントセル(東洋紡績株式会社 DNA-903)に形質転換し、アンピシリン50μg/mLを含むLB寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをアンピシリン50μg/mLを含むLB液体培地で37℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドpGAP-IPAdh-atoB-atoD-atoAを回収した。
 アセト酢酸デカルボキシラーゼ遺伝子を取得するために、Clostridium acetobutylicum ATCC824のゲノムDNAをテンプレートに用いて、caggtaccgctggtggaacatatgttaaaggatgaagtaattaaacaaattagc(配列番号28)、及びgcggatccttacttaagataatcatatataacttcagc(配列番号29)によりPCR法で増幅し、得られたDNAフラグメントを制限酵素KpnI、BamHIで消化することで約700bpのアセト酢酸デカルボキシラーゼフラグメントを得た。得られたDNAフラグメントと先に作成したプラスミドpGAP-IPAdh-atoB-atoD-atoAを制限酵素KpnI及びBamHIで消化することで得られるフラグメントを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリDH5α株コンピテントセル(東洋紡績株式会社 DNA-903)に形質転換し、アンピシリン50μg/mLを含むLB寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをアンピシリン50μg/mLを含むLB液体培地で37℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドpGAP-IPAdh-Adc-atoB-atoD-atoAを回収し、pIaaaとした。
 このプラスミドpIaaaを実施例3で作製したエシェリヒア・コリBΔpgiコンピテントセルに形質転換し、アンピシリン50μg/mLを含むLB Broth,Miller寒天プレートで37℃で一晩培養することにより、エシェリヒア・コリpIaaa/B△pgi株を得た。
[実施例5]
 <B::atoDABΔpgi株の作製>
 実施例1で作製したB::atoDABに実施例3で作製したpTH18cs1-pgiを形質転換し、クロラムフェニコール10μg/mlとカナマイシン50μg/mlを含むLB寒天プレートに30℃で一晩培養し、形質転換体を得た。得られた形質転換体をカナマイシン50μg/mlを含むLB液体培地に接種し、30℃で一晩培養した。次にこの培養液の一部をカナマイシン50μg/mlを含むLB寒天プレートに塗布し、42℃で生育するコロニーを得た。得られたコロニーをカナマイシン50μg/mlを含むLB液体培地で、30℃で24時間培養し、更にカナマイシン50μg/mlを含むLB寒天プレートに塗布して42℃で生育するコロニーを得た。
 出現したコロニーの中から無作為に100コロニーをピックアップして、それぞれをカナマイシン50μg/mlを含むLB寒天プレートと、クロラムフェニコール10μg/mlを含むLB寒天プレートに生育させ、カナマイシンを含むLB寒天プレートにのみ生育するクロラムフェニコール感受性のクローンを選んだ。更にこれらの目的クローンの染色体DNAからPCRにより、pgi遺伝子がカナマイシン耐性遺伝子に置換されていることで約3.3kbp断片の増幅がえられる株を選抜し、得られた株をB株atoDゲノム強化、pgi遺伝子欠失株(以下B::atoDAB△pgi株と略することがある)と命名した。
 なおエシェリヒア・コリMG1655株およびエシェリヒア・コリB株はアメリカンタイプカルチャーコレクションより入手することができる。
[実施例6]
<B::atoDAB△gntR株の作製>
 エシェリヒア・コリB株のゲノムDNAの全塩基配列は公知であり(GenBank accession No.CP000819)、GntRをコードする塩基配列はGenBank accession No.CP000819に記載のエシェリヒア・コリB株ゲノム配列の3509184~3510179に記載されている。GntRをコードする塩基配列(gntR)の近傍領域をクローニングするため、ggaattcgggtcaattttcaccctctatc(配列番号30)、gtgggccgtcctgaaggtacaaaagagatagattctc(配列番号31)、ctcttttgtaccttcaggacggcccacaaatttgaag(配列番号32)、ggaattcccagccccgcaaggccgatggc(配列番号33)に示すオリゴヌクレオチドプライマーを4種合成した。配列番号30および33のプライマーは5’末端側にEcoRI認識部位をそれぞれ有している。
 エシェリヒア・コリB株のゲノムDNA(GenBank accession No.CP000819)を調製し、得られたゲノムDNAを鋳型とし、配列番号30と配列番号31のプライマーペアで、PCRを行うことにより約1.0kbのDNA断片を増幅した(以下gntR-L断片と呼ぶことがある)。また、配列番号32と配列番号33のプライマーペアで、PCRを行うことにより約1.0kbのDNA断片を増幅した(以下gntR-R断片と呼ぶことがある)。これらのDNA断片をアガロース電気泳動にて分離、回収し、gntR-LとgntR-R断片を鋳型に配列番号30と配列番号33のプライマーペアで、PCRを行うことにより約2.0kbのDNA断片を増幅した(以下gntR-LR断片と呼ぶことがある)。このgntR-LR断片をアガロース電気泳動にて分離、回収し、EcoRIで消化し、温度感受性プラスミドpTH18cs1(GenBank accession number AB019610)のEcoRI消化物とを混合し、T4DNAリガーゼで反応した後、エシェリヒア・コリDH5αコンピテントセル(東洋紡績社製)に形質転換し、クロラムフェニコール10μg/mlを含むLB寒天プレートに30℃で生育する形質転換体を得た。得られた形質転換体からプラスミドを回収し、gntLR断片がpTH18cs1に正しく挿入されていることを確認し、このプラスミドをpTH18cs1-gntRとした。
 こうして得られたプラスミドpTH18cs1-gntRを実施例1で作製したエシェリヒア・コリ、B::atoDAB株に形質転換し、クロラムフェニコール10μg/mlを含むLB寒天プレートに30℃で一晩培養し、形質転換体を得た。得られた形質転換体をクロラムフェニコール10μg/mlを含むLB液体培地に接種し、30℃で一晩培養した。次にこの培養液の一部をカナマイシンクロラムフェニコール10μg/mlを含むLB寒天プレートに塗布し、42℃で生育するコロニーを得た。得られたコロニーをLB液体培地で、30℃で24時間培養し、更にLB寒天プレートに塗布して42℃で生育するコロニーを得た。
 出現したコロニーの中から無作為に100コロニーをピックアップして、それぞれをLB寒天プレートと、クロラムフェニコール10μg/mlを含むLB寒天プレートに生育させ、クロラムフェニコール感受性のクローンを選んだ。更にこれらの目的クローンの染色体DNAからPCRにより、gntR遺伝子が欠失していることで約2.0kbp断片の増幅がえられる株を選抜し、得られた株をB株atoDゲノム強化、gntR遺伝子欠失株(以下B::atoDAB△gntR株と略することがある)と命名した。
[実施例7]
 <pGAP-Ia/B::atoDAB△gntR株の作成>
 実施例6で作製したエシェリヒア・コリ、B::atoDAB△gntR株コンピテントセルに実施例2で作製したプラスミドpIaを形質転換し、アンピシリン50μg/mLを含むLB Broth,Miller寒天プレートで37℃で一晩培養することにより、エシェリヒア・コリpIa/B::atoDAB△gntR株を得た。
[実施例8]
 <pIaz/B::atoDAB△gntR株の作成>
 実施例6で作製したエシェリヒア・コリ、B::atoDAB△gntR株コンピテントセルに実施例2で作製したプラスミドpIazを形質転換し、アンピシリン50μg/mLを含むLB Broth,Miller寒天プレートで37℃で一晩培養することにより、エシェリヒア・コリpIaz/B::atoDAB△gntR株を得た。
[実施例9]
<B::atoDAB△pgi△gntR株の作製>
 実施例5で作製したエシェリヒア・コリB::atoDAB△pgi株に実施例6で作製したプラスミドpTH18cs1-gntRを形質転換し、クロラムフェニコール10μg/mlを含むLB寒天プレートに30℃で一晩培養し、形質転換体を得た。得られた形質転換体をクロラムフェニコール10μg/mlを含むLB液体培地に接種し、30℃で一晩培養した。次にこの培養液の一部をカナマイシンクロラムフェニコール10μg/mlを含むLB寒天プレートに塗布し、42℃で生育するコロニーを得た。得られたコロニーをLB液体培地で、30℃で24時間培養し、更にLB寒天プレートに塗布して42℃で生育するコロニーを得た。
 出現したコロニーの中から無作為に100コロニーをピックアップして、それぞれをLB寒天プレートと、クロラムフェニコール10μg/mlを含むLB寒天プレートに生育させ、クロラムフェニコール感受性のクローンを選んだ。更にこれらの目的クローンの染色体DNAからPCRにより、gntR遺伝子が欠失していることで約2.0kbp断片の増幅がえられる株を選抜し、得られた株をB株atoDゲノム強化、pgi遺伝子欠失、gntR遺伝子欠失株(以下B::atoDAB△pgi△gntR株と略することがある)と命名した。
 なおエシェリヒア・コリMG1655株およびエシェリヒア・コリB株はアメリカンタイプカルチャーコレクションより入手することができる。
[実施例10]
 <pIa/B::atoDAB△pgi△gntR株の作成>
 実施例9で作製したエシェリヒア・コリ、B::atoDAB△pgi△gntR株コンピテントセルに実施例2で作製したプラスミドpIaを形質転換し、アンピシリン50μg/mLを含むLB Broth,Miller寒天プレートで37℃で一晩培養することにより、エシェリヒア・コリpIa/B::atoDAB△pgi△gntRを得た。
[実施例11]
 <pIaz/B::atoDAB△pgi△gntR株の作成>
 実施例9で作製したエシェリヒア・コリ、B::atoDAB△pgi△gntR株コンピテントセルに実施例2で作製したプラスミドpIazを形質転換し、アンピシリン50μg/mLを含むLB Broth,Miller寒天プレートで37℃で一晩培養することにより、エシェリヒア・コリpIaz/B::atoDAB△pgi△gntR株を得た。
[実施例12]
<B::atoDAB△gnd株の作製>
 ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子(gnd)の塩基配列近傍領域をクローニングするため、cgccatatgaatggcgcggcggggccggtgg(配列番号34)、tggagctctgtttactcctgtcaggggg(配列番号35)、tggagctctctgatttaatcaacaataaaattg(配列番号36)、cgggatccaccaccataaccaaacgacgg(配列番号37)に示すオリゴヌクレオチドプライマーを4種合成した。配列番号34のプライマーは5’末端側にNdeI認識部位を有し、配列番号35および配列番号36のプライマーは5’末端側にSacI認識部位を有している。また、配列番号37のプライマーは5’末端側にBamHI認識部位を有している。
 エシェリヒア・コリB株のゲノムDNA(GenBank accession No.CP000819)を調製し、配列番号34と配列番号35のプライマーペアで、PCRを行うことにより約1.0kbのDNA断片を増幅した(以下gnd-L断片と呼ぶことがある)。また、配列番号36と配列番号37のプライマーペアで、PCRを行うことにより約1.0kbのDNA断片を増幅した(以下gnd-R断片と呼ぶことがある)。これらのDNA断片をアガロース電気泳動にて分離、回収し、gnd-L断片をNdeI及びSacIで、gnd-R断片をSacI及びBamHIでそれぞれ消化した。この消化断片2種と、温度感受性プラスミドpTH18cs1(GenBank accession number AB019610)のNdeI及びBamHI消化物とを混合し、T4DNAリガーゼで反応した後、エシェリヒア・コリDH5αコンピテントセル(東洋紡績社製)に形質転換し、クロラムフェニコール10μg/mlを含むLB寒天プレートに30℃で生育する形質転換体を得た。得られた形質転換体からプラスミドを回収し、gndをコードする遺伝子の5’上流近傍断片と3’下流近傍断片の2つの断片がpTH18cs1に正しく挿入されていることを確認し、pTH18cs1-gndとした。
 こうして得られたプラスミドpTH18cs1-gndを実施例1で作製したエシェリヒア・コリ、B::atoDAB株に形質転換し、クロラムフェニコール10μg/mlを含むLB寒天プレートに30℃で一晩培養し、形質転換体を得た。得られた形質転換体をクロラムフェニコール10μg/mlを含むLB液体培地に接種し、30℃で一晩培養した。次にこの培養液の一部をカナマイシンクロラムフェニコール10μg/mlを含むLB寒天プレートに塗布し、42℃で生育するコロニーを得た。得られたコロニーをLB液体培地で、30℃で24時間培養し、更にLB寒天プレートに塗布して42℃で生育するコロニーを得た。
 出現したコロニーの中から無作為に100コロニーをピックアップして、それぞれをLB寒天プレートと、クロラムフェニコール10μg/mlを含むLB寒天プレートに生育させ、クロラムフェニコール感受性のクローンを選んだ。更にこれらの目的クローンの染色体DNAからPCRにより、gnd遺伝子が欠失していることで約2.0kbp断片の増幅がえられる株を選抜し、得られた株をB::atoDAB△gnd株と命名した。
 なおエシェリヒア・コリB株はアメリカンタイプカルチャーコレクションより入手することができる。
[実施例13]
 <pIa/B::atoDAB△gnd株の作製>
 実施例12で作製したエシェリヒア・コリ、B::atoDABΔgnd株コンピテントセルに実施例2で作製したプラスミドpIaを形質転換し、アンピシリン50μg/mLを含むLB Broth,Miller寒天プレートで37℃で一晩培養することにより、エシェリヒア・コリpIa/B::atoDAB△gnd株を得た。
[実施例14]
 <pIaz/B::atoDAB△gnd株の作製>
 実施例12で作製したエシェリヒア・コリ、B::atoDAB△gnd株コンピテントセルに実施例2で作製したプラスミドpIazを形質転換し、アンピシリン50μg/mLを含むLB Broth,Miller寒天プレートで37℃で一晩培養することにより、エシェリヒア・コリpIaz/B::atoDAB△gndを得た。
[実施例15]
<B::atoDAB△pgi△gnd株の作製>
 実施例5で作製したエシェリヒア・コリB株、B::atoDAB△pgi株に実施例12で作製したプラスミドpTH18cs1-gndを形質転換し、クロラムフェニコール10μg/mlを含むLB寒天プレートに30℃で一晩培養し、形質転換体を得た。得られた形質転換体をクロラムフェニコール10μg/mlを含むLB液体培地に接種し、30℃で一晩培養した。次にこの培養液の一部をカナマイシンクロラムフェニコール10μg/mlを含むLB寒天プレートに塗布し、42℃で生育するコロニーを得た。得られたコロニーをLB液体培地で、30℃で24時間培養し、更にLB寒天プレートに塗布して42℃で生育するコロニーを得た。
 出現したコロニーの中から無作為に100コロニーをピックアップして、それぞれをLB寒天プレートと、クロラムフェニコール10μg/mlを含むLB寒天プレートに生育させ、クロラムフェニコール感受性のクローンを選んだ。更にこれらの目的クローンの染色体DNAからPCRにより、gnd遺伝子が欠失していることで約2.0kbp断片の増幅がえられる株を選抜し、得られた株をB::atoDAB△pgi△gnd株と命名した。
[実施例16]
 <pIa/B::atoDAB△pgi△gnd株の作製>
 実施例15で作製したエシェリヒア・コリ、B::atoDAB△pgi△gnd株コンピテントセルに実施例2で作製したプラスミドpIaを形質転換し、アンピシリン50μg/mLを含むLB Broth,Miller寒天プレートで37℃で一晩培養することにより、エシェリヒア・コリpIa/B::atoDAB△pgi△gndを得た。
[実施例17]
 <pIaz/B::atoDAB△pgi,△gnd株の作製>
 実施例15で作製したエシェリヒア・コリ、B::atoDAB△pgi△gnd株コンピテントセルに実施例2で作製したプラスミドpIazを形質転換し、アンピシリン50μg/mLを含むLB Broth,Miller寒天プレートで37℃で一晩培養することにより、エシェリヒア・コリpIaz/B::atoDAB△pgi△gnd株を得た。
[実施例18]
<B::atoDAB△gnd△gntR株の作製>
 実施例12で作製したエシェリヒア・コリ、B::atoDAB△gnd株コンピテントセルに実施例6で作製したプラスミドpTH18cs1-gntRを形質転換し、クロラムフェニコール10μg/mlを含むLB寒天プレートに30℃で一晩培養し、形質転換体を得た。得られた形質転換体をクロラムフェニコール10μg/mlを含むLB液体培地に接種し、30℃で一晩培養した。次にこの培養液の一部をカナマイシンクロラムフェニコール10μg/mlを含むLB寒天プレートに塗布し、42℃で生育するコロニーを得た。得られたコロニーをLB液体培地で、30℃で24時間培養し、更にLB寒天プレートに塗布して42℃で生育するコロニーを得た。
 出現したコロニーの中から無作為に100コロニーをピックアップして、それぞれをLB寒天プレートと、クロラムフェニコール10μg/mlを含むLB寒天プレートに生育させ、クロラムフェニコール感受性のクローンを選んだ。更にこれらの目的クローンの染色体DNAからPCRにより、gntR遺伝子が欠失していることで約2.0kbp断片の増幅がえられる株を選抜し、得られた株をB::atoDAB△gnd△gntR株と命名した。
[実施例19]
 <pIa/B::atoDAB△gnd△gntR株の作製>
 実施例18で作製したエシェリヒア・コリ、B::atoDAB△gnd△gntR株コンピテントセルに実施例2で作製したプラスミドpIaを形質転換し、アンピシリン50μg/mLを含むLB Broth,Miller寒天プレートで37℃で一晩培養することにより、エシェリヒア・コリpIa/B::atoDAB△gnd△gntR株を得た。
[実施例20]
 <pIaz/B::atoDAB△gnd△gntR株の作成>
 実施例18で作製したエシェリヒア・コリ、B::atoDAB△gnd△gntR株コンピテントセルに実施例2で作製したプラスミドpIazを形質転換し、アンピシリン50μg/mLを含むLB Broth,Miller寒天プレートで37℃で一晩培養することにより、エシェリヒア・コリpIaz/B::atoDAB△gnd△gntR株を得た。
[実施例21]
<B::atoDAB△pgi△gnd△gntR株の作製> 
 実施例15で作製したエシェリヒア・コリ、B::atoDAB△pgi△gnd株コンピテントセルに実施例6で作製したプラスミドpTH18cs1-gntRを形質転換し、クロラムフェニコール10μg/mlを含むLB寒天プレートに30℃で一晩培養し、形質転換体を得た。得られた形質転換体をクロラムフェニコール10μg/mlを含むLB液体培地に接種し、30℃で一晩培養した。次にこの培養液の一部をカナマイシンクロラムフェニコール10μg/mlを含むLB寒天プレートに塗布し、42℃で生育するコロニーを得た。得られたコロニーをLB液体培地で、30℃で24時間培養し、更にLB寒天プレートに塗布して42℃で生育するコロニーを得た。
 出現したコロニーの中から無作為に100コロニーをピックアップして、それぞれをLB寒天プレートと、クロラムフェニコール10μg/mlを含むLB寒天プレートに生育させ、クロラムフェニコール感受性のクローンを選んだ。更にこれらの目的クローンの染色体DNAからPCRにより、gntR遺伝子が欠失していることで約2.0kbp断片の増幅がえられる株を選抜し、得られた株をB::atoDAB△pgi△gnd△gntR株と命名した。
[実施例22]
 <pIa/B::atoDAB△pgi△gnd△gntR株の作製>
 実施例21で作製したエシェリヒア・コリ、B::atoDAB△pgi△gnd△gntR株コンピテントセルに実施例2で作製したプラスミドpIaを形質転換し、アンピシリン50μg/mLを含むLB Broth,Miller寒天プレートで37℃で一晩培養することにより、エシェリヒア・コリpIa/B::atoDAB△pgi△gnd△gntR株を得た。
[実施例23]
 <pIaz/B::atoDAB△pgi△gnd△gntR株の作製>
 実施例21で作製したエシェリヒア・コリ、B::atoDAB△pgi△gnd△gntR株コンピテントセルに実施例2で作製したプラスミドpIazを形質転換し、アンピシリン50μg/mLを含むLB Broth,Miller寒天プレートで37℃で一晩培養することにより、エシェリヒア・コリpIaz/B::atoDAB△pgi△gnd△gntR株を得た。
[実施例24]
 <pIa/B::atoDAB株の作製>
 実施例1で作製したエシェリヒア・コリ、B::atoDAB株コンピテントセルに実施例2で作製したプラスミドpIaを形質転換し、アンピシリン50μg/mLを含むLB Broth,Miller寒天プレートで37℃で一晩培養することにより、エシェリヒア・コリpIa/B::atoDAB株を得た。
[実施例25]
 <pIaz/B::atoDAB△pgi株の作製>
 実施例5で作製したエシェリヒア・コリ、B::atoDAB株△pgiコンピテントセルに実施例2で作製したプラスミドpIazを形質転換し、アンピシリン50μg/mLを含むLB Broth,Miller寒天プレートで37℃で一晩培養することにより、エシェリヒア・コリpIaz/B::atoDAB△pgi株を得た。
[試験例1]
(イソプロピルアルコールの生産)
 本実施例では、WO2009/008377号パンフレット図1に示される生産装置を用いてイソプロピルアルコールの生産を行った。培養槽は3リットル容のガラス製のものを使用し、トラップ槽は10L容のポリプロピレン製のものを使用した。トラップ槽には、トラップ液としての水(トラップ水)を1槽あたり9Lの量で注入し、2台連結して使用した。なお、培養槽には廃液管を設置して、糖や中和剤の流加により増量した培養液を適宜培養槽外に排出した。
 イソプロピルアルコール生産評価に用いた株の一覧を表3として示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003

 
 前培養としてアンピシリン50μg/mLを含むLB Broth, Miller培養液(Difco244620)50mLを入れた500mL容三角フラスコに各評価株を植菌し、一晩、培養温度30℃、120rpmで攪拌培養を行った。前培養45mLを、以下に示す組成の培地855gの入った3L容の培養槽(ABLE社製培養装置BMS-PI)に移し、培養を行った。培養は大気圧下、通気量0.9L/min、撹拌速度550rpm、培養温度30℃、pH7.0(NH水溶液で調整)で行った。培養開始から8時間後までの間、50wt/wt%のグルコース水溶液を10g/L/時間の流速で添加した。その後は50wt/wt%のグルコース水溶液を20g/L/時間の流速で、培養槽内にグルコースがなるべく残存しないように適宜添加した。培養開始から72時間までに数回、菌体培養液をサンプリングし、遠心操作によって菌体を除いた後、得られた培養上清中及びトラップ水中のイソプロピルアルコールおよびアセトンの蓄積量をHPLCで定法に従って測定した。なお、測定値は、培養後の培養液とトラップ槽2台中の合算値である。結果を表4に示した。
<培地組成>
  コーンスティープリカー(日本食品化工製):20g/L
  FeSO・7HO:0.1g/L
  KHPO:2g/L
  KHPO:2g/L
  MgSO・7HO:2g/L
  (NHSO:2g/L 
  アデカノールLG126(株式会社ADEKA)0.1g/L
  (残部:水)
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
 評価の結果、陰性対照(pla/B::atoDAB)のイソプロピルアルコール生産量は48.7g/L/72hであり、gntRを破壊した株(pla/B::atoDABΔgntR)の生産量は57.3g/L/72hであった。これにより、gntRを破壊すると陰性対照と比較して生産性が約1.2倍に向上することが分かった。
 また、gntRとpgiを破壊し且つzwfの発現を強化した株(pIaz/B::atoDABΔpgiΔgntR)の生産量は70.2g/L/72hであり陰性対照と比較して生産性が約1.4倍となった。このことから、gntRのみを破壊したときよりもgntRとpgiを両方破壊し且つzwfの発現を強化した方が生産性が更に向上することが分かった。
 一方、pgiのみを破壊した場合(pIaaa/BΔpgi)ではイソプロピルアルコールは全く生産されず、zwfを強化しただけの場合(pIaz/B::atoDAB)は生産量が39.4g/L/72hであって、生産性は増加せずにむしろ低下した。
 gntRを破壊し且つzwfを強発現した場合(pIaz/B::atoDABΔgntR)、pgiを破壊し且つzwfを強発現した場合(pIaz/B::atoDABΔpgi)及びpgiとgntRを両方破壊した場合(pIa/B::atoDABΔpgiΔgntR)でも生産量が各々33.3g/L/72h、41.1g/L/72h、9.6g/L/72hとなり、イソプロピルアルコールの生産性は増加せずにむしろ低下した。
 従って、gntRの破壊に加えて他の因子の破壊又は強発現を行う場合、pIaz/B::atoDABΔpgiΔgntR株においてみられる生産性向上の効果は、gntRとpgiを両方破壊し且つzwfを強発現させたときに得られるといえる。
 また、生産性の向上が見られたpIaz/B::atoDABΔpgiΔgntR株に更にgnd破壊を施した場合、即ちpgiとgntRとgndを破壊し且つzwfを強発現させた場合(pIaz/B::atoDABΔpgiΔgndΔgntR)のイソプロピルアルコール生産量は75.6g/L/72hとなり、pIaz/B::atoDABΔpgiΔgntR株を上回る高い生産性を示した。
 一方で、gndのみを破壊した場合ではイソプロピルアルコール生産量は陰性対照より低い45.5g/L/72hであり、gnd破壊のみではイソプロピルアルコール生産性向上の効果はみられなかった。また、gntRとgndを破壊した場合(pIa/B::atoDABΔgndΔgntR)、pgiとgndを破壊した場合(pIa/B::atoDABΔpgiΔgnd)及びpgiとgntRとgndを破壊した場合(pIa/B::atoDABΔpgiΔgndΔgntR)の生産量は各々28.6g/L/72h、2.6g/L/72h、0.8g/L/72hであり、これらの株ではイソプロピルアルコールの生産性が増加せずにむしろ低下した。更にはgndを破壊し且つzwfを強発現させた場合(pIaz/B::atoDABΔgnd)、gntRとgndを破壊し且つzwfを強発現させた場合(pIaz/B::atoDABΔgndΔgntR)及びpgiとgndを破壊し且つzwfを強発現させた場合(pIaz/B::atoDABΔpgiΔgnd)においてもイソプロピルアルコールの生産性は増加せずにむしろ低下していた(生産性は各々、40.7g/L/72h、33.9g/L/72h、34.9g/L/72hであった)。
 従って、pIaz/B::atoDABΔpgiΔgndΔgntR株においてみられる生産性向上の効果は、gntRとpgiとgndを同時に破壊しかつzwfを強発現させたときのみに得られるといえる。
 また、得られたアセトンは、精製した後に、イソプロピルアルコール生産の原料として用いることができる。
(アセトンの製造)
[実施例26]
<イソプロピルアルコール、アセトンの取り出し>
 上記pIaz/B::atoDABΔpgiΔgndΔgntR株(実施例23)の培養評価時のトラップ水をGC分析した結果、アセトンが1.2g/L、イソプロピルアルコールは4.3g/L含有されていることがわかった。上記イソプロピルアルコールおよびアセトンを含む水溶液(培養開始72時間後のトラップ水)から蒸留により、イソプロピルアルコール及びアセトンを高濃度化し取り出した。
 具体的には最初に上記水溶液2Lを、陽イオン交換樹脂(オルガノ製、アンバーリスト31WET)250mlを充填したカラムに流速500ml/hで通液し、残存するアンモニア等を除去した。この処理液を常圧下蒸留した。沸点53~81.6℃の留分を取り出し、GC分析した結果、アセトン18.7質量%、イソプロピルアルコール62.6質量%、不明成分が0.2質量%、残りは水であった。これを以下の脱水素反応の原料として用いた。
<脱水素触媒ZnO:ZrO(94:6)の調製>
 500mlの攪拌羽付き丸底フラスコに、炭酸ナトリウム15.94g(0.15mol)及び水130mlを入れ溶解させた。得られた水溶液に、硝酸亜鉛六水和物34.36g(0.11mol)及び酸化二硝酸ジルコニウム二水和物1.30g(0.05mol)を150mlの水に溶解させた水溶液を、1時間半かけて滴下した。そのまま5日間熟成させた後、ろ過し、よく水洗した。得られた白色物を120℃で2時間、400℃で1時間乾燥し、最後に600℃で2時間焼成した。複合酸化物触媒ZnO:ZrO(94:6)を白色の粉末として9.50gを得た。
<アセトンの生産>
 直径1cm、長さ40cmのSUS製反応器に、前記の複合酸化物触媒ZnO:ZrO(94:6)1.0g(20MPaで圧縮成型後、250~500μmへ分級したもの)を充填し、10ml/minの窒素気流下、350℃で上記蒸留液(アセトン18.7質量%、イソプロピルアルコール62.6質量%、不明成分0.2質量%、残りは水)を1.50g/hrの割合で流通させた。反応器の出口を冷却し反応液と反応ガスとを捕集した。反応開始5時間後の生成物をガスクロマトグラフィーで分析した結果、表5に示したように高濃度でアセトンが生成していた。なお、表5中「IPA」はイソプロピルアルコールを表す(以下、同様)。
[実施例27]
 反応温度を400℃とした以外は実施例26と同様に行った。結果は表5に示した。表5に示したように高濃度でアセトンが生成していた。
[実施例28]
<脱水素触媒ZnO:ZrO(88:12)の調製>
 500mlの攪拌羽付き丸底フラスコに、炭酸ナトリウム15.94g(0.15mol)及び水130mlを入れ溶解させた。得られた水溶液に、硝酸亜鉛六水和物32.86g(0.11mol)及び酸化二硝酸ジルコニウム二水和物2.66g(0.10mol)を150mlの水に溶解させた水溶液を、1時間半かけて滴下した。そのまま5日間熟成させた後、ろ過し、よく水洗した。得られた白色物を120℃で2時間、400℃で1時間乾燥し、最後に600℃で2時間焼成した。複合酸化物触媒ZnO:ZrO(88:12)を白色の粉末として9.94gを得た。
<アセトンの生産>
 直径1cm、長さ40cmのSUS製反応器に、前記の複合酸化物触媒ZnO:ZrO(88:12)1.0g(20MPaで圧縮成型後、250~500μmへ分級したもの)を充填し、10ml/minの窒素気流下、350℃で上記蒸留液(アセトン18.7質量%、イソプロピルアルコール62.6質量%、不明成分0.2質量%、残りは水)を1.50g/hrの割合で流通させた。反応器の出口を冷却し反応液と反応ガスとを捕集した。反応開始5時間後の生成物をガスクロマトグラフィーで分析した結果、表5に示したように高濃度でアセトンが生成していた。
[実施例29]
 反応温度を400℃とした以外は実施例28と同様に行った。結果は表5に示した。表5に示したように高濃度でアセトンが生成していた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005

 
(イソプロピルアルコール生産大腸菌に含まれる遺伝子のコドン改変)
 本発明のイソプロピルアルコール生産大腸菌に含まれるイソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子とアセト酢酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のコドン配列を変更して、イソプロピルアルコール及びアセトンの生産性を以下に示すとおりに確認した。
[実施例30]
 <プラスミドpIzの作製>
 クロストリジウム属細菌のアセト酢酸デカルボキシラーゼ遺伝子(adc)はGenBank accession number M55392に、イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子(IPAdh)はGenBank accession number AF157307に記載されている。
 上記の遺伝子群を発現させるために必要なプロモーターの塩基配列として、GenBank accession number X02662の塩基配列情報において、397-440に記されているエシェリヒア・コリ由来のグリセルアルデヒド3-リン酸デヒドロゲナーゼ(以下GAPDHと呼ぶことがある)のプロモーター配列を使用することができる。
 GAPDHプロモーターを取得するためエシェリヒア・コリMG1655株のゲノムDNAをテンプレートに用いてcgagctacatatgcaatgattgacacgattccg(配列番号38)、及びcgcgcgcatgctatttgttagtgaataaaagg(配列番号39)によりPCR法で増幅し、得られたDNAフラグメントを制限酵素NdeI、SphIで消化することで約110bpのGAPDHプロモーターにあたるDNAフラグメントを得た。得られたDNAフラグメントとプラスミドpBR322(GenBank accession number J01749)を制限酵素NdeI及びSphIで消化することで得られるフラグメントを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリDH5α株コンピテントセル(東洋紡績株式会社 DNA-903)に形質転換し、アンピシリン50μg/mLを含むLB寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをアンピシリン50μg/mLを含むLB液体培地で37℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドpBRgapPを回収した。
 コドン改変したイソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子(IPAdh)を取得するために、Clostridium beijerinckii NRRL B-593のイソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子のアミノ酸配列をもとにコドン改変したイソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子を設計し、DNA合成により以下のDNAフラグメント(配列番号40)を作成した。配列を以下に記す。
ATGAAAGGTTTTGCAATGCTGGGTATTAATAAGCTGGGCTGGATCGAAAAAGAGCGCCCGGTTGCGGGTTCGTATGATGCGATTGTGCGCCCACTGGCCGTATCTCCGTGTACCTCAGATATCCATACCGTTTTTGAGGGAGCTCTTGGCGACCGCAAGAATATGATTTTAGGGCATGAAGCGGTGGGTGAAGTTGTGGAGGTAGGCAGTGAAGTGAAGGATTTCAAACCTGGTGACCGTGTTATCGTCCCTTGCACAACCCCGGATTGGCGGTCTTTGGAAGTTCAGGCTGGTTTTCAACAGCACTCAAACGGTATGCTCGCAGGATGGAAATTTTCCAACTTCAAGGATGGCGTCTTTGGTGAGTATTTTCATGTGAATGATGCGGATATGAATCTTGCGATTCTGCCTAAAGACATGCCCCTGGAAAACGCTGTTATGATCACAGATATGATGACTACGGGCTTCCACGGAGCCGAACTTGCAGATATTCAGATGGGTTCAAGTGTAGTGGTCATTGGCATTGGCGCGGTTGGCCTGATGGGGATAGCCGGTGCTAAATTACGTGGAGCAGGTCGGATCATTGGCGTGGGGAGCCGCCCGATTTGTGTCGAGGCTGCCAAATTTTACGGGGCCACCGACATTTTGAATTATAAAAATGGTCATATCGTTGATCAAGTCATGAAACTGACGAACGGAAAAGGCGTTGACCGCGTGATTATGGCAGGCGGTGGTAGCGAAACACTGTCCCAGGCCGTATCTATGGTCAAACCAGGCGGGATCATTTCGAATATAAATTATCATGGAAGTGGCGATGCGTTATTGATCCCGCGTGTGGAATGGGGGTGCGGAATGGCTCACAAGACTATCAAAGGCGGTCTTTGTCCCGGGGGACGTTTGAGAGCAGAGATGCTGCGAGATATGGTAGTGTACAACCGTGTTGATCTCAGCAAACTGGTCACGCATGTATATCATGGGTTCGATCACATCGAAGAAGCCCTGTTACTGATGAAAGACAAGCCAAAAGACCTGATTAAAGCAGTAGTTATATTATAA
 作成したDNAフラグメントをテンプレートに用いて、acatgcatgcatgaaaggttttgcaatgctg(配列番号41)、及びacgcgtcgacttataatataactactgctttaa(配列番号42)によりPCR法で増幅し、得られたDNAフラグメントを制限酵素SphI、SalIで消化することで約1.1kbpのコドン改変イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼフラグメントを得た。得られたDNAフラグメントとプラスミドpUC119を制限酵素SphI及びSalIで消化することで得られるフラグメントを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリDH5α株コンピテントセル(東洋紡績株式会社 DNA-903)に形質転換し、アンピシリン50μg/mLを含むLB寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをアンピシリン50μg/mLを含むLB液体培地で37℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドを回収してコドン改変したIPAdhが正しく挿入されていることを確認し、このプラスミドをpUC-Iと命名した。
 プラスミドpUC-Iを制限酵素SphI及びEcoRIで消化することで得られるIPAdhを含むフラグメント、とプラスミドpBRgapPを制限酵素SphI及びEcoRIで消化することで得られるフラグメントを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリDH5α株コンピテントセル(東洋紡績株式会社 DNA-903)に形質転換し、アンピシリン50μg/mLを含むLB寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをアンピシリン50μg/mLを含むLB液体培地で37℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドを回収しコドン改変したIPAdhが正しく挿入されていることを確認し、このプラスミドをpGAP-Iと命名した。
 コドン改変したアセト酢酸デカルボキシラーゼ遺伝子(adc)を取得するために、Clostridium acetobutylicum ATCC824のアセト酢酸デカルボキシラーゼ遺伝子のアミノ酸配列をもとにコドン改変したアセト酢酸デカルボキシラーゼ遺伝子を設計し、DNA合成により以下のDNAフラグメント(配列番号43)を作成した。配列を以下に記す。
ATGCTGAAAGATGAAGTGATTAAACAGATTAGCACGCCATTAACTTCGCCTGCATTTCCGCGCGGTCCGTATAAATTTCATAATCGTGAATATTTTAACATTGTATACCGTACCGATATGGACGCCCTGCGTAAAGTTGTGCCAGAGCCTCTGGAAATTGATGAGCCCTTAGTCCGGTTCGAAATCATGGCAATGCATGATACGAGTGGCCTGGGTTGCTATACAGAATCAGGTCAGGCTATTCCCGTGAGCTTTAATGGTGTTAAGGGCGACTACCTTCACATGATGTATCTGGATAACGAGCCGGCAATTGCCGTAGGTCGGGAATTAAGTGCATACCCTAAAAAGCTCGGGTATCCAAAGCTGTTTGTGGATTCAGACACTCTGGTGGGCACGTTAGACTATGGAAAACTGCGTGTTGCGACCGCGACAATGGGGTACAAACATAAAGCCCTGGATGCTAATGAAGCAAAGGATCAAATTTGTCGCCCGAACTATATGTTGAAAATCATCCCCAATTATGACGGCTCCCCTCGCATATGCGAGCTTATCAACGCGAAAATCACCGATGTTACCGTACATGAAGCTTGGACAGGACCGACTCGACTGCAGTTATTCGATCACGCTATGGCGCCACTGAATGACTTGCCGGTCAAAGAGATTGTTTCTAGCTCTCACATTCTTGCCGATATAATCTTGCCGCGCGCGGAAGTCATATACGATTATCTCAAGTAA
 作成したDNAフラグメントをテンプレートに用いて、acgcgtcgacgctggttggtggaacatatgctgaaagatgaagtgatta(配列番号44)、及びgctctagattacttgagataatcgtatatga(配列番号45)によりPCR法で増幅し、得られたDNAフラグメントを制限酵素SalI、XbaIで消化することで約700bpのコドン改変したアセト酢酸デカルボキシラーゼフラグメントを得た。得られたDNAフラグメントと先に作成したプラスミドpGAP-Iを制限酵素BamHI及びEcoRIで消化することで得られるフラグメントを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリDH5α株コンピテントセル(東洋紡績株式会社 DNA-903)に形質転換し、アンピシリン50μg/mLを含むLB寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをアンピシリン50μg/mLを含むLB液体培地で37℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドを回収し、adcが正しく挿入されていることを確認し、このプラスミドをpIと命名した。
 グルコース6リン酸-1-デヒドロゲナーゼ遺伝子(zwf)を取得するためにエシェリヒア・コリB株のゲノムDNA(GenBank accession No.CP000819)をテンプレートに用いてgctctagacggagaaagtcttatggcggtaacgcaaacagcccagg(配列番号46)、及びcgggatccttactcaaactcattccaggaacgac(配列番号47)を用いてPCR法で増幅し、得られたDNAフラグメントを制限酵素BamHI、XbaIで消化することで約1500bpのグルコース6リン酸1-デヒドロゲナーゼフラグメントを得た。得られたDNAフラグメントと先に作成したプラスミドpIを制限酵素XbaI及びBamHI消化することで得られるフラグメントを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリDH5α株コンピテントセル(東洋紡績株式会社 DNA-903)に形質転換し、アンピシリン50μg/mLを含むLB寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをアンピシリン50μg/mLを含むLB液体培地にて37℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドpIzを回収した。
[実施例31]
 <pI/B::atoDAB△gntR株の作成>
 実施例6で作製したエシェリヒア・コリ、B::atoDAB△gntR株コンピテントセルに実施例30で作製したプラスミドpIを形質転換し、アンピシリン50μg/mLを含むLB Broth,Miller寒天プレートで37℃で一晩培養することにより、エシェリヒア・コリpI/B::atoDAB△gntR株を得た。
[実施例32]
 <pIz/B::atoDAB△pgi△gntR株の作成>
 実施例9で作製したエシェリヒア・コリ、B::atoDAB△pgi△gntR株コンピテントセルに実施例30で作製したプラスミドpIaを形質転換し、アンピシリン50μg/mLを含むLB Broth,Miller寒天プレートで37℃で一晩培養することにより、エシェリヒア・コリpIz/B::atoDAB△pgi△gntRを得た。
[実施例33]
 <pIz/B::atoDAB△pgi△gnd△gntR株の作製>
 実施例21で作製したエシェリヒア・コリ、B::atoDAB△pgi△gnd△gntR株コンピテントセルに実施例30で作製したプラスミドpIzを形質転換し、アンピシリン50μg/mLを含むLB Broth,Miller寒天プレートで37℃で一晩培養することにより、エシェリヒア・コリpIz/B::atoDAB△pgi△gnd△gntR株を得た。
[実施例34]
 <pI/B::atoDAB株の作製>
 実施例1で作製したエシェリヒア・コリ、B::atoDAB株コンピテントセルに実施例30で作製したプラスミドpIを形質転換し、アンピシリン50μg/mLを含むLB Broth,Miller寒天プレートで37℃で一晩培養することにより、エシェリヒア・コリpI/B::atoDAB株を得た。
[試験例2]
(イソプロピルアルコールの生産)
 上記[試験例1]と同様にイソプロピルアルコールの生産評価を行った。評価に用いた株の一覧を表6に示した。また、評価結果を表7に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
 表7の結果を表4の結果と比較したところ、イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子とアセト酢酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のコドンを改変すると、イソプロピルアルコールの生産性が大きく向上することが分かった。
 [実施例35]
(スクロースからのイソプロピルアルコール生産)
 pIz/B::atoDAB△pgi△gnd△gntR株に更にスクロースを分解するための酵素インベルターゼ遺伝子(cscA)を導入し、スクロースからのイソプロピルアルコール発酵生産を行った。更に得られた発酵液からアセトン又はプロピレンを製造した。
 <pIz-cscA/B::atoDAB△pgi△gnd△gntR株の作製>
 エシェリヒア・コリO157株のゲノムDNAの全塩基配列は公知であり(GenBank accession number AE005174 )、エシェリヒア・コリO157株のインベルターゼをコードする遺伝子(以下、cscAと略することがある)の塩基配列も報告されている。すなわちcscAはGenBank  accession  number  AE005174に記載のエシェリヒア・コリO157株ゲノム配列の3274383~3275816に記載されている。
 cscAを取得するために、エシェリヒア・コリO157株のゲノムDNAをテンプレートに用いてgctggtggaacatatgacgcaatctcgattgcatg(配列番号48)、及びttaacccagttgccagagtgc(配列番号49)によりPCR法で増幅し、得られたDNAフラグメントをT4ポリヌクレオチドキナーゼで末端リン酸化することで約1470bpのcscAフラグメントを得た。このDNAフラグメントと実施例30で作成したpIzを制限酵素BamHIで消化の後、T4DNAポリメラーゼで平滑末端とし、さらにアルカリフォスファターゼで末端を脱リン酸化したものとを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリDH5α株コンピテントセル(東洋紡績株式会社  DNA-903)に形質転換し、アンピシリン50μg/mLを含むLB寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られた菌体からプラスミドを回収し、グルコース6リン酸-1-デヒドロゲナーゼ遺伝子(zwf)の3’末端側とcscAの5’末端側が連結されcscAが正しく挿入されていることが確認されたプラスミドをpIz-cscAと命名した。
 なおエシェリヒア・コリO157のゲノムは標準物質及び計量技術研究所より入手することができる。
 実施例21で作製したエシェリヒア・コリ、B::atoDAB△pgi△gnd△gntR株コンピテントセルに作製したプラスミドpIz-cscAを形質転換し、アンピシリン50μg/mLを含むLB Broth,Miller寒天プレートで37℃で一晩培養することにより、エシェリヒア・コリpIz-cscA/B::atoDAB△pgi△gnd△gntR株を得た。
[試験例3]
(イソプロピルアルコールおよびアセトンの製造)
 エシェリヒア・コリpIz-cscA/B::atoDAB△pgi△gnd△gntR株を用いた以外は上記[試験例1]と同様にして、イソプロピルアルコールおよびアセトンの製造を行った。ただし培地は50wt/wt%グルコース水溶液の代わりに40wt/wt%スクロース水溶液を用いて行った。その結果、培養72時間目で82.0g/Lのイソプロピルアルコールと23.7g/Lのアセトンが生成した。1台目のトラップ水をHPLC分析した結果、アセトンが0.14質量%、イソプロピルアルコールは0.55質量%含有されていることが分かった。
(イソプロピルアルコール、アセトンの取り出し)
 上記イソプロピルアルコールおよびアセトンを含むトラップ水から蒸留により、イソプロピルアルコール及びアセトンを高濃度化し取り出した。
 具体的には最初に上記水溶液9Lを、陽イオン交換樹脂(オルガノ製、アンバーリスト31WET)250mlを充填したカラムに流速500ml/hで通液し、残存するアンモニア等を除去した。この処理液を常圧下蒸留した。沸点53℃~81.6℃の留分を取り出し、GC分析した結果、アセトン19.1質量%、イソプロピルアルコール60.5質量%、不明成分が0.5質量%、残りは水であった。これを以下の実施例36~実施例39の脱水素反応、及び実施例40のプロピレン生産の原料として用いた。
[実施例36]
(アセトンの製造)
<脱水素触媒ZnO:ZrO(94:6)の調製>
 500mlの攪拌羽付き丸底フラスコに、炭酸ナトリウム15.94g(0.15mol)及び水130mlを入れ溶解させた。得られた水溶液に、硝酸亜鉛六水和物34.36g(0.11mol)及び酸化二硝酸ジルコニウム二水和物1.30g(0.05mol)を150mlの水に溶解させた水溶液を、1時間半かけて滴下した。そのまま5日間熟成させた後、ろ過し、よく水洗した。得られた白色物を120℃で2時間、400℃で1時間乾燥し、最後に600℃で2時間焼成した。複合酸化物触媒ZnO:ZrO(94:6)を白色の粉末として9.50gを得た。
<アセトンの生産>
 直径1cm、長さ40cmのSUS製反応器に、前記の複合酸化物触媒ZnO:ZrO2(94:6)1.0g(20MPaで圧縮成型後、250~500μmへ分級したもの)を充填し、10ml/minの窒素気流下、350℃で上記蒸留液(アセトン19.1質量%、イソプロピルアルコール60.5質量%、不明成分0.5質量%、残りは水)を1.50g/hrの割合で流通させた。反応器の出口を冷却し反応液と反応ガスとを捕集した。反応開始5時間後の生成物をガスクロマトグラフィーで分析した結果、表8に示したように大量の水、およびバイオ由来の不純物を含んだアセトンとイソプロピルアルコールを用いた場合でも高濃度でアセトンが生成していた。なお、表8中「IPA」はイソプロピルアルコールを表す(以下、同様)。
[実施例37]
 反応温度を400℃とした以外は実施例36と同様に行った。結果は表8に示した。表8に示したように高濃度でアセトンが生成していた。
[実施例38]
<脱水素触媒ZnO:ZrO(88:12)の調製>
 500mlの攪拌羽付き丸底フラスコに、炭酸ナトリウム15.94g(0.15mol)及び水130mlを入れ溶解させた。得られた水溶液に、硝酸亜鉛六水和物32.86g(0.11mol)及び酸化二硝酸ジルコニウム二水和物2.66g(0.10mol)を150mlの水に溶解させた水溶液を、1時間半かけて滴下した。そのまま5日間熟成させた後、ろ過し、よく水洗した。得られた白色物を120℃で2時間、400℃で1時間乾燥し、最後に600℃で2時間焼成した。複合酸化物触媒ZnO:ZrO(88:12)を白色の粉末として9.94gを得た。
<アセトンの生産>
 直径1cm、長さ40cmのSUS製反応器に、前記の複合酸化物触媒ZnO:ZrO(88:12)1.0g(20MPaで圧縮成型後、250~500μmへ分級したもの)を充填し、10ml/minの窒素気流下、350℃で上記蒸留液(アセトン19.1質量%、イソプロピルアルコール60.5質量%、不明成分0.5質量%、残りは水)を1.50g/hrの割合で流通させた。反応器の出口を冷却し反応液と反応ガスとを捕集した。反応開始5時間後の生成物をガスクロマトグラフィーで分析した結果、表8に示したように高濃度でアセトンが生成していた。
[実施例39]
 反応温度を400℃とした以外は実施例38と同様に行った。結果は表8に示した。表8に示したように高濃度でアセトンが生成していた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
[実施例40]
(プロピレンの製造)
 実施例35の試験例3に記載の培養液より得られた蒸留液を原料とし、高圧用フィードポンプ、高圧用水素マスフロー、高圧用窒素マスフロー、電気炉、触媒充填部分を有する反応器、背圧弁を設置した固定床反応装置を用い、ダウンフローによる加圧液相流通反応を行った。
 内径1cmのSUS316製反応器に、反応器の出口側からまず、銅-亜鉛触媒(SudChemie社製、製品名ShiftMax210、元素質量%Cu 32~35%、Zn 35~40%、Al 6~7%)粉末(250~500μへ分級したもの)を上流側の触媒層として1.0g充填した。触媒層を分離するため石英ウールを詰めた後、β-ゼオライト(触媒化成社製、20MPaで圧縮成型後、250~500μへ分級したもの)1.0gを下流側の触媒層として充填した。
 水素で2.5Mpaまで加圧した後、反応器入口側より20ml/分の水素気流下、180℃で、反応器入口側より上記蒸留液(アセトン19.1質量%、イソプロピルアルコール60.5質量%、不明成分0.5質量%、残りは水)を0.60g/Hrで流通させた。 反応器出口と背圧弁の中間に高圧窒素マスフローにより200ml/分の窒素を導入した。背圧弁直後のラインに気液分離管を設置し、採取したガス成分、液成分をそれぞれGC分析して生成物を定量した。反応結果を表9に示したように大量の水、およびバイオ由来の不純物を含んだアセトンとイソプロピルアルコールを用いた場合でも、高転化率でプロピレンが生成することがわかった。なお、表9中「DIPE」はジイソプロピルエーテルを表す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
 2010年8月12日に出願された日本国特許出願第2010-181150号の開示及び2011年3月7日に出願された日本国特許出願第2011-049531号の開示は、その全体が参照により本明細書に取り込まれる。
 本明細書に記載された全ての文献、特許出願、および技術規格は、個々の文献、特許出願、および技術規格が参照により取り込まれることが具体的かつ個々に記された場合と同程度に、本明細書中に援用されて取り込まれる。
 

Claims (14)

  1.  転写抑制因子GntRの活性が不活化されていると共に、イソプロピルアルコール生産系と、該GntRの活性の不活化に伴うイソプロピルアルコール生産能を維持又は強化する酵素活性発現パターンの補助酵素群とを備えたイソプロピルアルコール生産大腸菌。
  2.  前記補助酵素群の酵素活性発現パターンが、
      (1)グルコース-6-リン酸イソメラーゼ(Pgi)活性、グルコース-6-リン酸-1-デヒドロゲナーゼ(Zwf)活性及びホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ(Gnd)活性の野生型の維持、
      (2)グルコース-6-リン酸イソメラーゼ(Pgi)活性の不活化と、グルコース-6-リン酸-1-デヒドロゲナーゼ(Zwf)活性の強化、
      (3)グルコース-6-リン酸イソメラーゼ(Pgi)活性の不活化と、グルコース-6-リン酸-1-デヒドロゲナーゼ(Zwf)活性の強化と、ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ(Gnd)活性の不活化、
     から選択されたものである請求項1記載のイソプロピルアルコール生産大腸菌。
  3.  前記グルコース-6-リン酸-1-デヒドロゲナーゼ(Zwf)活性が、エシェリヒア属細菌由来のグルコース-6-リン酸-1-デヒドロゲナーゼ(Zwf)をコードする遺伝子に由来するものである請求項2記載のイソプロピルアルコール生産大腸菌。
  4.  前記イソプロピルアルコール生産系が、アセト酢酸デカルボキシラーゼ、イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ、CoAトランスフェラーゼ及びチオラーゼの各酵素遺伝子により構築されたものである請求項1~請求項3のいずれか1項記載のイソプロピルアルコール生産大腸菌。
  5.  前記イソプロピルアルコール生産系が、前記アセト酢酸デカルボキシラーゼ、イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ、CoAトランスフェラーゼ及びチオラーゼの各酵素遺伝子により構築されたものであり、かつ各酵素遺伝子が、それぞれ独立に、クロストリジウム属細菌、バチルス属細菌及びエシェリヒア属細菌からなる群より選択された少なくとも1種の原核生物に由来するものである請求項1~請求項4のいずれか1項記載のイソプロピルアルコール生産大腸菌。
  6.  前記アセト酢酸デカルボキシラーゼ活性が、クロストリジウム・アセトブチリカム由来の酵素をコードする遺伝子に由来するものであり、前記イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ活性がクロストリジウム・ベイジェリンキ由来の酵素をコードする遺伝子に由来するものであり、前記CoAトランスフェラーゼ活性及びチオラーゼ活性がエシェリヒア・コリ由来の各酵素をコードする遺伝子に由来するものである請求項4又は請求項5記載のイソプロピルアルコール生産大腸菌。
  7.  前記イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ及び前記アセト酢酸デカルボキシラーゼの少なくとも1つの活性が、遺伝子改変体として導入された遺伝子に由来する請求項4に記載のイソプロピルアルコール生産大腸菌。
  8.  前記イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼの遺伝子改変体が配列番号40で表される塩基配列であり、前記アセト酢酸デカルボキシラーゼの遺伝子改変体が配列番号43で表される塩基配列である請求項7に記載のイソプロピルアルコール生産大腸菌。
  9.  さらに、スクロース非PTS遺伝子群のうちスクロース加水分解酵素遺伝子を少なくとも有する請求項4~請求項8のいずれか1項記載のイソプロピルアルコール生産大腸菌。
  10.  請求項1~請求項9のいずれか1項記載のイソプロピルアルコール生産大腸菌を用いて植物由来原料からイソプロピルアルコールを生産することを含むイソプロピルアルコール生産方法。
  11.  請求項1~請求項9のいずれか1項記載のイソプロピルアルコール生産大腸菌を用いて植物由来原料からイソプロピルアルコールを得ること、及び
     得られたイソプロピルアルコールに、触媒として、酸化亜鉛と、第4族の元素を含む少なくとも1種の酸化物とを含有し且つ共沈法で調製された複合酸化物を接触させることを含む、アセトン生産方法。
  12.  請求項1~請求項9のいずれかの1項記載のイソプロピルアルコール生産大腸菌を用いて植物由来原料から得られ且つアセトンを含有するイソプロピルアルコールに、反応温度50~300℃の範囲で、触媒として固体酸物質およびCuを含む水添触媒を接触させることを含む、プロピレンの製造方法。
  13.  前記Cuを含む水添触媒が、さらに第6族、第12族、および第13族のうち少なくとも一つの元素を含む触媒である請求項12に記載のプロピレンの製造方法。
  14.  前記固体酸物質がゼオライトである請求項12又は請求項13に記載のプロピレンの製造方法。
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