KR20160130183A - 수소 및 에탄올의 동시 생산을 위한 고효율 유전자 재조합 대장균 균주 및 포도당을 이용한 수소 및 에탄올의 고효율 동시 생산 방법 - Google Patents

수소 및 에탄올의 동시 생산을 위한 고효율 유전자 재조합 대장균 균주 및 포도당을 이용한 수소 및 에탄올의 고효율 동시 생산 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20160130183A
KR20160130183A KR1020160142139A KR20160142139A KR20160130183A KR 20160130183 A KR20160130183 A KR 20160130183A KR 1020160142139 A KR1020160142139 A KR 1020160142139A KR 20160142139 A KR20160142139 A KR 20160142139A KR 20160130183 A KR20160130183 A KR 20160130183A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
ethanol
hydrogen
production
strain
pathway
Prior art date
Application number
KR1020160142139A
Other languages
English (en)
Other versions
KR101697466B1 (ko
Inventor
박성훈
설은희
Original Assignee
부산대학교 산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 부산대학교 산학협력단 filed Critical 부산대학교 산학협력단
Publication of KR20160130183A publication Critical patent/KR20160130183A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101697466B1 publication Critical patent/KR101697466B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P3/00—Preparation of elements or inorganic compounds except carbon dioxide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
    • C12P7/06—Ethanol, i.e. non-beverage
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
    • C12Y101/01—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.1.1)
    • C12Y101/01043—Phosphogluconate 2-dehydrogenase (1.1.1.43)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
    • C12Y101/01—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.1.1)
    • C12Y101/01049—Glucose-6-phosphate dehydrogenase (1.1.1.49)
    • C12R1/19—
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/185—Escherichia
    • C12R2001/19—Escherichia coli
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
    • Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
    • Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel
    • Y02E50/17—
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

본 발명은 수소 및 에탄올의 동시 생산을 위한 고효율 유전자 재조합 대장균 균주 및 포도당을 이용한 수소 및 에탄올의 고효율 동시 생산 방법에 관한 것으로서, 본 발명에서 고효율의 수소와 에탄올의 동시 생산을 위해 대장균의 해당경로를 변형하였으며, 이들 변이주의 적응진화 또는 율속 단계의 효소 과발현으로 혐기 조건에서 세포 성장이 가능하게 하고 수소와 에탄올의 동시 생산이 이루어지게 하였다. 본 발명에 따른 재조합 대장균은 포도당을 이용한 발효로부터 수소와 에탄올을 고효율로 동시 생산하였다. 포도당으로부터 수소와 에탄올의 최대 생산 수율은 각각 약 1.7 및 1.4 mol/mol이었다. 에탄올 생산 수율의 경우 야생 균주 대비 적어도 70 % 이상 증가한 것이다. 또한 본 발명을 통해 확보된 PP 경로의 활성화 균주는 PP 경로를 통해 생산되는 NAD(P)H와 같은 환원력이 요구되는 생물연료나 유용한 케미칼 생산 연구에 활용될 수 있을 것이다.

Description

수소 및 에탄올의 동시 생산을 위한 고효율 유전자 재조합 대장균 균주 및 포도당을 이용한 수소 및 에탄올의 고효율 동시 생산 방법{Highly efficient Recombinant Escherichia coli strains for co-production of hydrogen and ethanol and highly efficient method for co-production of hydrogen and ethanol from glucose}
본 발명은 수소 및 에탄올의 동시 생산을 위한 고효율 유전자 재조합 대장균 균주 및 포도당을 이용한 수소 및 에탄올의 고효율 동시 생산 방법에 관한 것이다.
생물학적 수소 생산 방법에는 광분해 (Photolysis), 광발효 (Photo-fermentation), 혐기 발효 (Dark fermentation), 수성가스 반응 (Water-gas shift reaction) 등 여러 가지 형태가 있다. 이 중 혐기 발효를 통한 수소 생산은 여러 가지 생물학적 생산 방법 중에서 가장 현실적인 생물학적 공정으로 인정되고 있다. 하지만 포도당 대비 낮은 수소 생산 수율 때문에 산업적 적용에 많은 어려움이 있으며, 이를 해결하기 위한 대사공학 및 효소공학 분야의 연구가 활발히 진행되어 왔다. 대장균과 같은 통성 혐기성 미생물의 경우 산소와 같은 외부 전자 수용체가 공급되지 않는 혐기 발효 조건에서 일반적으로 젖산 (lactate), 초산 (acetate), 숙신산 (succinate), 개미산 (formate), 이산화탄소, 수소 등 다양한 발효 산물을 생산하는 혼합산 발효(mixed-acid fermentation)를 한다. 이 때 수소와 같이 생산되는 에탄올 또한 각광 받는 바이오연료 중 하나이다. 포도당은 엠덴-마이어호프-파나스(Embden-Meyerhof-Parnas: EMP)와 같은 해당과정을 거쳐 중간 대사산물인 피루브산(pyruvate)으로 전환되고, 피루브산은 다시 피루브산-개미산 분해효소 (pyruate -formate lyase: PFL)에 의해 아세틸-CoA (acetyl-coA) 및 개미산으로 분해된다. 일반적인 발효 조건에서 야생 대장균 균주는 동일한 몰(equimolar ratio)의 아세트산과 에탄올을 생산하고, 개미산은 포름산 분해효소(Formate-hydrogen lyase: FHL) 복합체에 의해 수소 및 이산화탄소로 분해된다. 수소생산 수율을 향상시키기 위해 현재까지 개미산 생산 경로와 경쟁하는 반응 경로들을 결실시키는 연구들이 상당히 진행되었다. 예를 들어 피루브산에서 젖산 생산을 촉매하는 젖산 탈수소효소 (lactate dehydrogenase, LDH)를 결실하거나, 피루브산의 전구체인 포스포엔올리루브산 (phosphoenolpyruvate:PEP)에서 숙신산으로의 전환을 촉매하는 푸마르산 환원효소(fumarate reductase)를 결실하는 연구들이 진행되었다. 또한 생산된 수소를 다시 소모하는 수소 소비효소 (uptake hydrogenase)를 결실하여 수소생산 수율을 증가시켜 왔다. 하지만 이러한 노력에도 불구하고 수소생산의 이론 수율인 포도당 mol 당 2 mol 수소, 즉 2 mol H2/mol glucose를 초과할 수 없는 한계를 지닌다.
한편, 이론 수율의 한계를 극복하기 위하여 대장균과 같은 중온성 미생물을 호스트로 사용하여 수소 생산을 향상시키기 위한 합성 생물학 기법도 연구되었다. NAD(P)H로부터 전자를 받을 수 있는 특정 수소화효소 (hydrogenase)를 도입하여 수소 생산 향상을 시도하는 방법이 대표적이다. 그러나 NAD(P)H 의존형 수소화효소는 수소 분압이 극도로 낮은 조건이나 또는 높은 온도에서 그 활성이 나타나는 열역학적, 동력학적 문제들을 가지고 있다. 이러한 연구들을 통해 보고된 수소생산은 단지 NAD(P)H를 전자 주게로 사용할 수 있다는 개념 정도만 확인하였을 뿐 수소 생산 수율이 매우 낮았다. 특징적으로 현재까지의 연구를 통해 생산된 모든 균주는 포도당과 같은 사용된 원료가 가진 에너지 함량과 비교하여 매우 낮은 에너지 회수율을 보여준다.
낮은 수소 생산 수율과 에너지 회수율을 극복하기 위한 또 다른 방안으로 이 단계 (two-stage) 발효 공정도 활발히 연구되었다. 이 중 대표적인 것이 일 단계 수소 생산 및 이 단계 메탄 생산, 이른바 Hythane 공정이다. 이 공정에서는 1단계에서 수소와 유기산을 빠른 속도로 생산하고 2단계에서는 1단계에서 생산된 유기산을 이용하여 메탄을 생산하는 공정이다. 이 공정은 상당한 수준으로 연구가 진행되었고 일부 상업화도 진행되었다. 그러나 메탄을 생산하는데 오랜 시간이 소요되고 유기산의 메탄 전환에는 많은 환원력이 필요하며, 또한 메탄의 가치가 수소보다 현저히 낮다는 단점을 지닌다. 특히 1단계 수소 발효와 2 단계 메탄 발효의 속도차이 때문에 2단계 메탄 발효조가 1단계 발효조보다 보통 3-4배 이상 커야한다는 문제점도 지적되고 있다. 또 다른 2단계 공정으로 1, 2단계 모두 수소 생산을 위한 공정이 있다. 이 경우 1 단계는 혐기 발효, 2단계는 광발효로 진행된다. 이 경우 1단계 및 2 단계 모두 수소를 생산한다는 장점이 있다. 또한 2단계 수소 생산을 위한 환원력을 광으로부터 얻을 수 있다는 장점이 있다. 그러나 광발효의 경우 메탄발효 보다 속도가 더욱 느리고 광생물반응기의 제작에 많은 비용이 들기 때문에 상업적 규모로는 연구되지 못하였다. 이 외에도 2단 수소 생산 반응기로 1단계 혐기 발효, 2단계 전기화학 반응기가 연구된 바 있다. 이 경우는 느린 광생물 반응을 대체하기 위하여 2 단계 반응에서 전기적으로 에너지를 공급하여 (anode에서 유기산 등을 산화시킬 때 나오는 낮은 potential의 전자를 activation 시킴) 양성자를 수소로 환원시키는 것이다. 이 반응기 역시 작은 규모에서 그 개념을 보여 주는 데는 성공하였지만 전기화학 반응기의 특성상 대규모 반응기를 경제적으로 설계 운영하는데는 성공하지 못하였다. 종합적으로 이러한 노력은 모두 혐기 발효의 낮은 수소 생산 및 에너지 회수율 문제를 해결하기 위해 2단계 반응기를 쓴다는 공통점이 있었다.
한국공개특허 10-2011-0000775(2011.01.06 공개)
본 발명의 목적은 혐기 배양 조건에서 수소 및 에탄올을 동시에 고효율로 생산하는 Escherichia coli SH5p_Z 재조합 균주(KCTC 12762BP) 또는 Escherichia coli SH8AE 재조합 균주(KCTC 12764BP)를 제공하는 데에 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 Escherichia coli SH5p_Z 재조합 균주(KCTC 12762BP)에 6-인산글루코네이트 탈수소효소 (6-phosphogluconate dehydrogenase; Gnd)를 형질도입하여 과발현시킨, 혐기 배양 조건에서 수소 및 에탄올을 동시에 고효율로 생산하는 Escherichia coli SH5p_ZG 재조합 균주(KCTC 12763BP)를 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 Escherichia coli SH8AE 재조합 균주(KCTC 12764BP)에 포도당-6-인산탈수소효소 (glucose-6-phosphate dehydrogenase; Zwf) 및 6-인산글루코네이트 탈수소효소 (6-phosphogluconate dehydrogenase; Gnd)를 형질도입하여 과발현시킨, 혐기 배양 조건에서 수소 및 에탄올을 동시에 고효율로 생산하는 Escherichia coli SH8AE_ZG 재조합 균주(KCTC 12765BP)를 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 균주를 배양하여 수소 및 에탄올의 고효율 동시 생산방법을 제공하는 데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 혐기 배양 조건에서 수소 및 에탄올을 동시에 고효율로 생산하는 Escherichia coli SH5p_Z 재조합 균주(KCTC 12762BP)를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 균주에 6-인산글루코네이트 탈수소효소 (6-phosphogluconate dehydrogenase; Gnd)를 형질도입하여 과발현시킨, 혐기 배양 조건에서 수소 및 에탄올을 동시에 고효율로 생산하는 Escherichia coli SH5p_ZG 재조합 균주(KCTC 12763BP)를 제공한다.
또한, 본 발명은 혐기 배양 조건에서 수소 및 에탄올을 동시에 고효율로 생산하는 Escherichia coli SH8AE 재조합 균주(KCTC 12764BP)을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 균주에 포도당-6-인산탈수소효소 (glucose-6-phosphate dehydrogenase; Zwf) 및 6-인산글루코네이트 탈수소효소 (6-phosphogluconate dehydrogenase; Gnd)를 형질도입하여 과발현시킨, 혐기 배양 조건에서 수소 및 에탄올을 동시에 고효율로 생산하는 Escherichia coli SH8AE_ZG 재조합 균주(KCTC 12765BP)를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 균주를 탄소원이 포함된 배지에서 배양하는 단계; 및 상기 배양한 배양액으로부터 수소 및 에탄올을 동시에 수득하는 단계를 포함하는 수소 및 에탄올의 고효율 동시 생산방법을 제공한다.
본 발명은 수소 및 에탄올의 동시 생산을 위한 고효율 유전자 재조합 대장균 균주 및 포도당을 이용한 수소 및 에탄올의 고효율 동시 생산 방법에 관한 것으로서, 본 발명에 따른 재조합 대장균 균주를 이용하여 수소 및 에탄올의 효율적인 동시 생산이 가능하다. 이는 유용한 대체 생물 연료 생산에 있어 원료 물질 대비 에너지 회수율이 향상된 고효율의 1 단계 발효 공정의 개발을 의미한다. 또한 혐기 조건에서 PP 경로가 활성화된 균주는 향후 PP 경로를 통해 생산되는 NAD(P)H를 환원력으로 필요로 하는 다양한 케미칼 생산에 활용될 수 있다.
도 1은 대장균의 포도당 대사를 위한 세 가지 해당경로와 수소 및 에탄올의 동시 생산을 위한 반응 경로를 간략화 하여 보여준다. 본 발명에서 활성화 하고자 하는 PP 경로는 점선으로 둘러싸인 박스 안에 표시하였다. 약어: GLU, glucose; G6P, glucose-6-phosaphate; F6P, fructose-6-phosphate; 6PG, 6-phosphogluconate; F6P, fructose-6-phosphate; G3P, glyceraldehyde-3-phosphate; PG, phosphoglycerate; PEP, phosphoenolpyruvate; PYR, pyruvate; AcCoA, acetyl-CoA; FOR, formate; ACE, acetate; ETH, ethanol; 6PG, 6-phospho gluconate; RL5P, Ribulose-5-phosphate; X5P, xylulose-5-phosphate; R5P, ribose-5-phosphate; S7P, sedoheptuloas-7-phosphate; E4P, erythrose-4-phosphate; KDPG, 2-keto-3-deoxy-6-phosphogluconate.
도 2는 SH8 균주의 적응진화(adaptive evolution)을 통한 세포 성장속도의 변화를 보여준다.
도 3은 SH5ped 균주에 동시 과발현한 Zwf, Gnd 단백질의 발현을 SDS-PAGE로 조사한 결과이다. 세포 파쇄액 내 가용성 단백질을 분리하여 분석하였다. 1: 단백질 marker, 2: 비교균주 (0 mM IPTG), 3: 인덕션 균주 (0.1 mM IPTG)
도 4는 SH5pZ와 SH5pZG의 포도당 발효를 통해 최종 얻어진 에탄올 및 아세트산 생산 수율의 변화를 보여준다.
도 5는 SH5pZ와 SH5pZG의 발효 대사산물 분석을 통해 in silico 모델링을 통한 Metabolic Flux Analysis (MFA) 결과를 보여준다.
이에 본 발명자들은 1 단계 반응기를 이용하는 생물학적 방법으로는 수소를 고 효율, 고 에너지 수율로 생산하는 것이 불가능하다는 것을 인지하고, 2 단계 반응기를 대체하는 새로운 개념으로 하나의 반응기에서 하나의 균주를 통해 수소와 에탄올을 동시에 생산하는 방법을 제안하게 되었다. 즉 통성 혐기성 미생물이 수소와 동시에 에탄올, 아세트산 등을 생산하는 데 착안하여, 수소 생산은 변화시키지 않으면서 아세트산의 생산을 에탄올로 바꾸는 방법을 연구 개발하게 되었다. 이 경우 수소는 기체이고 에탄올은 액체이므로 분리 정제에 특별한 어려움이 없으며 저급 에너지원인 메탄대신 에탄올을 생산한다는 장점, 값비싼 광생물 반응기나 전기화학 반응기를 사용하지 않고 하나의 혐기 반응기만을 사용한다는 등의 장점이 있다. 본 발명에서는 이를 위해 포도당 대사 경로가 수정된 다양한 유전자 재조합 대장균 균주를 개발하고, 실제 발효를 통해 그 성능을 확인하였다. 구체적으로, 선행 연구에서 개발한 유전자 결실 대장균 균주인 SH5 균주를 모균주로 사용하여, 아세트산 생산을 막고 대신 에탄올 생산을 극대화하기 위한 다양한 전략들을 시도하였다. 이 전략의 핵심은 아세틸-CoA에서 아세트산으로 전환되는 탄소 흐름을 에탄올로 전환해 주는 것이다(도 1). 이를 위해 해야 하는 첫 번째 일은 아세트산 생산 경로의 유전자를 결실하는 것이었다. 하지만 이 전략은 전혀 도움이 되지 않았다. 그 이유는 크게 두 가지인데, 첫째, 아세트산 생산 경로는 혐기 조건에서 ATP를 공급하는 중요한 수단이며, 둘째, 아세트산 경로를 차단한다 하더라도 에탄올 생산을 위해서는 NADH와 같은 환원력을 추가로 필요로 하기 때문이다. 특히 아세틸-CoA에서 에탄올을 1몰 생산하기 위해서는 2몰의 NADH를 요구하며 따라서 이의 공급은 반드시 필요하다. 한편 NAD(P)H의 공급을 극대화하는 전략은 (i) EMP 경로가 아닌 오탄당 인산 (Pentose phosphate: PP) 회로를 이용하거나, (ii) TCA 회로 (TriCarboxylic Acid Cycle)를 사용하는 것이다. 하지만 TCA 회로는 호기 조건에서만 작용하며 혐기조건에서 작용하는 효소를 필요로 하는 수소와 에탄올의 동시 생산에 이를 이용하는 것은 불가능하다. 따라서 EMP 경로의 (부분적) 비활성화를 통해 PP 경로를 활성화시키고 이를 통해 NAD(P)H의 공급을 향상시키는 것이 현실적인 전략이라 할 수 있다.
본 발명에서는 PP 경로를 포도당의 해당 경로로 사용함으로써 에탄올 생산에 필요한 환원력을 충분히 생산하고자 하였다. 대부분 미생물들이 가장 선호하는 해당과정인 EMP 경로 대신 PP 경로를 활성화시키는 것은 쉬운 일이 아니다. 더구나 혐기 조건에서 PP 경로를 활성화 시키는 연구는 세계적으로 아직까지 시도된 바가 없다. 본 발명에서는 EMP 경로를 막기 위해 EMP를 이끄는 핵심 효소인 인산포도당이성화 (phosphoglucose isomerase, Pgi) 효소 또는 인산-프럭토스 키나아제 (phosphofructokinase, Pfk) 효소의 비활성화 전략을 사용하였다. Pgi의 경우 포도당-6-인산에서 프럭토스-6-인산으로의 양방향 반응을 촉매하는 유일한 효소로 이 효소의 결실은 EMP 경로를 완전히 차단시킨다. 한편 Pfk는 프럭토스(과당)-6-인산에서 프럭토스(과당)-1,6-이인산으로의 정반응을 촉매하는 효소로 아이소자임(isozyme)으로 PfkA와 PfkB가 존재한다. 이 중 PfkA가 major 아이소자임으로 알려져 있다. 또한 PP 경로의 율속 반응으로 알려진 포도당-6-인산탈수소효소 (glucose-6-phosphate dehydrogenase; Zwf)와 6-인산글루코네이트 탈수소효소 (6-phosphogluconate dehydrogenase; Gnd)의 과발현을 통해 동시 생산의 수율에 미치는 영향을 조사하였다.
본 발명은 혐기 배양 조건에서 수소 및 에탄올을 동시에 고효율로 생산하는 Escherichia coli SH5p_Z 재조합 균주(KCTC 12762BP)을 제공한다.
상세하게는, 상기 재조합 균주는 hycA, hyaAB, hybBC, ldhA, frdAB 및 pgi 유전자가 결실된 Escherichia coli BW25113 균주(Escherichia coli △ hycA △ hyaAB △ hybBC △ ldhA △ frdAB △ pgi; Escherichia coli SH5p)에 포도당-6-인산탈수소효소 (glucose-6-phosphate dehydrogenase; Zwf)를 형질도입하여 과발현시킬 수 있다.
특히, 본 발명에서 사용한 모균주인 SH5 균주는 본 발명자들이 선행 연구에서 개발한 유전자 결실 대장균 균주이다(international journal of hydrogen energy 34 (2009) 7417-7427).
한편, 본 발명에서 사용한 균주는 표 1에 자세하게 설명되어 있다. 특히, Escherichia coli SH5p 균주는 hycA, hyaAB, hybBC, ldhA, frdAB 및 pgi 유전자가 결실된 Escherichia coli BW25113 균주(Escherichia coli △ hycA △ hyaAB △ hybBC △ldhA△ frdAB △ pgi)이다.
hycA는 포름산 분해효소(Formate-Hydrogen Lyase; FhlA)의 조절유전자이고, hyaAB 및 hybBC는 수소화효소(hydrogenase)를 코딩하고 있으며, ldhA는 락테이트 디하이드로게나제(lactate dehydrogenase)를 코딩하고 있다. 또한, frdAB는 푸마레이트 리덕타제(fumarate reductase)를 코딩하고 있고, pgi는 인산포도당이성화효소 (phosphoglucose isomerase)를 코딩하고 있다.
또한, 본 발명은 상기 Escherichia coli SH5p_Z 재조합 균주(KCTC 12762BP)에 6-인산글루코네이트 탈수소효소 (6-phosphogluconate dehydrogenase; Gnd)를 형질도입하여 과발현시킨, 혐기 배양 조건에서 수소 및 에탄올을 동시에 고효율로 생산하는 Escherichia coli SH5p_ZG 재조합 균주(KCTC 12763BP)를 제공한다.
또한, 본 발명은 혐기 배양 조건에서 수소 및 에탄올을 동시에 고효율로 생산하는 Escherichia coli SH8AE 재조합 균주(KCTC 12764BP)를 제공한다.
상세하게는, 상기 재조합 균주는 hycA, hyaAB, hybBC, ldhA, frdAB, pta -ackA 및 pfkA 유전자가 결실된 Escherichia coli BW25113 균주(Escherichia coli △ hycA △ hyaAB △ hybBC △ ldhA △ frdAB △ pta - ackA △ pfkA; Escherichia coli SH8)의 적응 진화(adaptive evolution)를 통해 제작된 균주일 수 있다.
한편, Escherichia coli SH8 균주는 hycA, hyaAB, hybBC, ldhA, frdAB, pta -ackA 및 pfkA 유전자가 결실된 Escherichia coli BW25113 균주(Escherichia coli △h y cA△ hyaAB △ hybBC △ ldhA △ frdAB △ pta - ackA △ pfkA)이다. pta - ackA는 포스포트랜스아세틸라제(phosphotransacetylase)-아세테이트 키나아제(acetate kinase)를 코딩하고 있고, pfkA는 인산-프럭토스 키나아제 (phosphofructokinase)를 코딩하고 있다.
상세하게는, 상기 재조합 균주는 적응 진화(adaptive evolution)를 통해 혐기 배양 조건에서 포도당을 탄소원으로 하여 세포 성장 속도가 향상된 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 Escherichia coli SH8AE 재조합 균주(KCTC 12764BP)에 포도당-6-인산탈수소효소 (glucose-6-phosphate dehydrogenase; Zwf) 및 6-인산글루코네이트 탈수소효소 (6-phosphogluconate dehydrogenase; Gnd)를 형질도입하여 과발현시킨, 혐기 배양 조건에서 수소 및 에탄올을 동시에 고효율로 생산하는 Escherichia coli SH8AE_ZG 재조합 균주(KCTC 12765BP)를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 균주를 탄소원이 포함된 배지에서 배양하는 단계; 및 상기 배양한 배양액으로부터 수소 및 에탄올을 동시에 수득하는 단계를 포함하는 수소 및 에탄올의 고효율 동시 생산방법을 제공한다.바람직하게는, 상기 배양하는 단계는 혐기 조건에서 수행될 수 있고, 상기 탄소원은 포도당일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
< 실험예 >
하기의 실험예들은 본 발명에 따른 각각의 실시예에 공통적으로 적용되는 실험예를 제공하기 위한 것이다.
1. 실험균주
(1) 유전자 클로닝
목표 유전자를 대량으로 증폭시키기 위해 중합효소연쇄반응(PCR)을 이용하였다. 먼저 PCR에 필요한 프라이머는 목표 유전자의 양 끝부분에 제한효소를 포함하도록 디자인하였다. 이 프라이머를 이용하여 Escherichia coli BW25113 염색체로부터 목표 유전자를 증폭하였다. 증폭된 PCR 산물은 아가로즈 젤에서 전기영동 하여 PCR 단편을 분리 정제하였다. 분리 정제된 PCR 단편은 각각의 제한효소로 절단한 다음 T4 DNA ligase를 사용하여 벡터에 라이게이션(ligation)시켰다. 라이게이션된 산물은 열충격(heat shock) 방법을 이용하여 형질전환(transformation) 하였다.
(2) 유전자 제거
본 발명에서는 염색체로부터 유전자를 제거하기 위해서 λ red recombinase 방법과 pKOV 방법을 사용하였다.
i) λ red recombinase 방법
제거하고자 하는 유전자의 일부분이 포함된 antibiotic cassette (FRT-kan-FRT)를 PCR을 이용하여 증폭한 다음 pKD4 벡터에 클로닝하였다. 재조합 된 pKD4 벡터를 전기천공방법으로 형질전환(transformation) 하였다. 카나마이신에 저항을 가지는 콜로니는 PCR 방법으로 유전자가 제거되었는지 확인하였다.
ii) pKOV 방법
PCR을 이용하여 제거하고자 하는 유전자의 일부분을 증폭한 다음 PCR 산물을 pKOV 벡터에 클로닝하였다. 재조합된 pKOV 벡터는 전기천공방법으로 형질전환(transformation) 하였으며, 클로람페니콜이 포함된 한천 평판에 도말하여 42도에서 약 16시간 동안 배양시켜 삽입(integration)이 일어나도록 유도하였다. PCR을 통해 삽입(integration)이 일어난 균주를 스크리닝 한 다음 수크로오스가 포함된 한천 평판에 도말하여 30도에서 약 16시간 동안 배양시켜 curing이 일어나도록 하였다. Curing이 일어난 균주는 PCR을 통해 확인하였다.
2. 배양조건
재조합 균주의 개발 및 유지를 위해서는 Luria Bertani (LB) 배지가 이용되었다. 동시생산을 위한 세포 배양은 3단계로 진행되었다. 우선 plate로부터 싱글 콜로니를 취하여 호기조건의 LB 배지에서 약 10시간 가량 배양된다. 그 후 배양액은 5g/L의 포도당과 1g/L의 효모 추출액이 포함된 변형된 M9 배양배지가 포함된 혐기 플라스크에 접종되었다. 이렇게 overnight 배양된 배양액은 다시 M9 배양액이 포함된 혐기 플라스크에 옮겨져 세포 성장 및 동시 생산이 조사되었다. 2차, 3차 혐기배양은 M9 배양배지가 포함된 serum bottle를 고무마개와 알루미늄 캡으로 밀폐한 다음, 아르곤 가스로 치환하여 혐기상태를 조성하고 미리 배양해놓은 배양액을 접종함으로써 시작하였다. 접종은 세포 농도 0.05 ~ 0.1 OD에서 이루어졌으며, 모든 배양은 37℃, 200 rpm에서 이루어졌다. 과발현 유전자의 발현을 위해서는 혐기 배양을 시작함과 동시에 0.1 ~ 0.2 mM IPTG를 넣어줌으로써 진행되었다. 필요에 따라 카나마이신(50 ㎍/mL), 클로람페니콜(25 ㎍/mL)이 사용되었다.
3. 분석방법
세포성장은 분광광도계(Spectrophotometer)를 이용하여 600 nm에서 세포의 흡광도를 측정하여 조사하였다.
수소, 이산화탄소와 같은 가스 생산량은 TCD 검출기가 장착된 가스크로마토그래피를 이용하여 분석하였다. 가스 분석을 위한 컬럼은 Molecular sieve 5A와 Hayesep Q (Alltech Deerfield, IL, USA)가 사용되었고, 오븐(oven), 주입부(injector) 및 검출부(detector) 온도는 각각 80, 90 및 120℃였다. 배양액에 포함된 탄소원 및 대사산물들은 refractive index (RI), photodiode array (PDA) 검출기가 장착된 액체크로마토그래피 (Agilent Technologies, HP, 1160 series)로 분석되었다. 이 때 사용된 컬럼은 Aminex 87H (Bio-Rad)이다.
SDS-PAGE 분석은 배양된 세포를 원심분리하여 침전시킨 후 potassium phosphate buffer(50 mM, pH 7.0)으로 세척하고, 다시 동일한 buffer 및 농도로 재현탁하여 프렌치프레스를 사용하여 파쇄하였다. 파쇄된 세포 파쇄액은 원심분리를 통해 상득액을 취한 후 전기영동 분석이 이루어졌다. 단백질 밴드는 Coomassie Brillaint Blue로 염색하여 image analyzer (BIO_RAD Gel Doc 2000)을 이용하여 확인하였다.
4. 정량 PCR
정량 PCR 분석을 위해서는 지수성장기에 있는 세포를 수확한 후 RNA protect reagent (Qiagen, Inc, USA) 처리를 거친 후 RNA가 추출되고, 이를 이용해 cDNA 합성이 이루어졌다. cDNA 합성을 위해서는 SuperScript III first-strand synthesis system (Invitrogen, USA)가 사용되었다. 실시간 정량 PCR은 SYBR green method를 이용한 Step One Real Time PCR system (Applied Biosystems, USA)을 이용해 이루어졌다. 각각의 반응 샘플의 총량은 20 uL이며 300 ng의 cDNA, 10 uL의 2x Power SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, UK), 각각 5 pmol의 정방향 프라이머(forward primer), 역방향 프라이머(reverse primer), 그리고 DEPC-처리된 물이 포함되어 있다. 정량 PCR 조건은 다음과 같다. 변성(Denaturation): 1 cycle, 95 ℃, 30 sec; 결합(Amplification): 40 cycle, 95 ℃, 15 sec/ 62 ℃, 30 sec/ 72 ℃, 30 sec. 모든 정량 PCR분석은 duplicate로 이루어졌다.
< 실시예 1> 수소와 에탄올의 고효율 동시 생산을 위한 유전자 재조합 대장균 균주 개발
수소와 에탄올은 당을 이용한 대장균의 혼합산 발효시 생산되는 물질들이다. 하지만 야생균주를 생촉매로 사용 시 이들 생물연료의 생산 수율은 상당히 낮으며, 수율 향상을 위해서는 대대적인 대사 경로의 변형이 필요하다. 잘 알려진 대로 수소는 해당경로를 통해 생산된 피루브산(pyruvate)이 아세틸-CoA (acetyl-CoA)와 개미산(formate)으로 전환된 후 혐기 발효 조건에서 개미산의 산화를 통해 생산된다. 또한 에탄올의 경우 알코올탈수소효소(alcohol dehydrogenase, AdhE)의 작용을 통해 아세틸-CoA로부터 생산된다. 하지만 아세틸-CoA의 에탄올 전환은 에탄올 1 mol 생산 당 2 mol의 NADH, 즉 환원된 형태의 보조인자(cofactor)를 필요로 한다. 한편 NADH의 산화로 재생된 NAD+는 포도당의 피루브산 전환에 이용되어 해당과정을 지속시키는 원동력이 된다. 정상적인 포도당 발효 조건에서 NAD+/NADH 균형은 1 mol의 포도당에서 1 mol의 에탄올과 1 mol의 아세트산이 생산될 때 잘 유지된다. 아세트산 역시 아세틸-CoA로부터 생산되며 이때는 환원력을 필요로 하지 않는다. 아세트산으로의 전환은 ATP 생산을 동반하여 혐기 세포의 성장에 사용된다. 따라서 아세틸-CoA에서 아세트산 대신 에탄올을 생산하기 위해서는 환원력인 NAD(P)H를 추가적으로 공급해 주어야 한다.
일반적으로 대장균은 포도당을 포함한 당의 대사를 위해 EMP 경로를 주로 사용한다. EMP 경로를 통해 1mol의 포도당은 2mol의 피루브산로 전환되고 이때 2 mol의 NADH를 생산한다. 따라서 1몰의 포도당으로부터 최대 생산 가능한 에탄올은 1몰 이상이 불가능하다.
따라서 본 발명에서는 에탄올 생산을 위한 보조인자(NAD(P)H)의 충분한 공급을 위해 EMP 경로의 부분적 또는 완전한 차단을 통한 PP 경로의 활성화를 시도하였다 (도 1). EMP 경로의 첫 번째 유전자인 pgi의 결실을 통해 EMP 경로를 완전히 차단하고, 탄소 흐름을 PP 경로로 유도한 뒤 PP 경로의 대사산물이 프럭토스-6-인산 또는 글리세르알데히드-3-인산(glyceraldehyde-3-phosphate) 형태로 다시 EMP 경로로 합류할 때 동시 생산을 위한 탄소 (pyruvate) 및 NAD(P)H와 같은 환원력의 생산을 최대화 할 수 있다. 또는 pfkA 유전자의 결실을 통해 EMP 경로를 통한 탄소 흐름을 감소시키고 대신 PP경로로의 탄소 흐름을 증가시키거나 또는 일부 탄소 흐름을 완전한 PP 회로를 작동시키는 데 사용하여 환원력의 생산 증가를 기대 할 수 있다.
표 1은 이러한 전략에 기반하여 본 발명에서 개발되고 조사된 균주 및 플라스미드를 나타내고 있다. 특히, 본 발명에서 사용한 모균주인 SH5 균주는 본 발명자들이 선행 연구에서 개발한 유전자 결실 대장균 균주이다(international journal of hydrogen energy 34 (2009) 7417-7427).
본 발명에 사용된 균주 및 플라스미드
사용된 균주 및
플라스미드		 유전적 특성
균주
SH5 BW25113 Δ hycAΔ hyaABΔ hybBCΔ ldhAΔ frdAB
SH6 SH5 Δ pta - ackA
SH5p SH5 Δ pgi Km resistant
SH5p_Z SH5p_pZwf
SH5p_ZG SH5p_pZwGn
SH5ped SH5p Δ edd Δ eda
SH5ped_Z SH5ped_pZwf
SH5ped_ZG SH5ped_pZwGn
SH8 SH6 Δ pfkA Km resistant
SH8AE SH8 with adaptive evolution
SH8AE_ZG SH8AE_pZwGn
SH8AEed SH8AE Δ edd Δ eda
SH8AEed_ZG SH8AEed_pZwGn
플라스미드
pDK7 Cm resistant
pZwf pDK7 carries zwf of Escherichia coli
pZwGn pDK7 carries zwf , gnd of Escherichia coli
< 실시예 2> 아세트산 생산 경로의 결실을 통한 에탄올 생산 향상 조사
실시예 1에서 서술된 바와 같이 피루브산으로부터 PFL 작용으로 생산된 아세틸-CoA는 아세트산 또는 에탄올로 전환된다. 먼저 에탄올 수율 향상을 위해 아세트산 생산 효소인 pta-ackA 유전자의 결실이 이루어졌다 (SH6). SH6 균주의 세포 성장 속도는 SH5 균주에 비해 상당히 감소하였다. 이는 아세트산 생산반응을 통해 생산되는 ATP 수율의 감소와 아세틸-CoA의 축적 때문인 것으로 보인다. 이 경우 아세트산 생산은 거의 무시할 만한 수준으로 관찰되었다. 표 2는 SH5와 SH6의 대사산물 생성 결과를 비교한 것이다. 아세트산 생산 경로의 결실에도 불구하고 에탄올 생산 수율은 약 10 % 상승에 머물렀다. 반면 수소 생산 수율은 50% 이상 감소하였다. 또 해당과정의 중간 대사산물인 피루브산의 생산이 매우 높게 관찰되었다. 피루브산의 분비는 아세틸-CoA가 지속적으로 에탄올과 아세트산으로 대사되지 못하는데 따라 발생하며 탄소 대사가 피루브산에서 막히게 되면 수소와 에탄올의 생산 수율이 높게 나올 수가 없게 된다. 이 결과로부터 아세트산 생산 경로의 단순한 결실은 아세트산 생산을 막아주기는 하지만 아세틸-CoA의 에탄올 전환에는 전혀 도움이 되지 않는다는 것을 알 수 있다. 아세틸-CoA가 에탄올로 전환되지 않는 주된 이유는 NADH 공급의 부족 때문이며, 이를 해결하기 위한 PP 경로의 활성화가 필수적이다.
SH5, SH6, SH8AE 균주의 대사산물 수율 비교
SH5
( Glucose ) 		SH6
( Glucose ) 		SH8AE
( Glucose ) 		SH8AE
( Sorbitol )
Yield ( mol / mol glucose )
H2 1.42 0.69 1.03 1.25
Ethanol 0.84 0.95 1.04 1.49
Acetate 0.73 0.02 0.04 0.05
Pyruvate 0.02 0.73 0.74 0.24
Formate 0.12 0.19 0.11 0.25
Carbon distribution (%)
Pyruvate 1.07 37.67 39.17 11.31
Ethanol 28.58 31.25 34.64 51.60
Acetate 24.86 2.45 1.47 1.68
Formate 2.09 2.47 1.80 4.22
Biomass 18.39 8.74 8.15 5.96
CO2 24.23 11.50 17.25 19.79
Recovery (%) 99.22 94.10 101.44 94.56
< 실시예 3> EMP 경로의 유전자 ( pgi , pfkA ) 결실 균주의 세포 성장 조사
에탄올 생산에 필요한 환원력 공급을 위해 EMP 경로의 부분적 또는 완전한 차단을 통해 PP 경로의 활성화가 시도 되었다. 이는 앞서 개발된 SH6 균주에 pfkA 유전자의 결실을 통한 EMP 경로의 부분적 차단과 SH5 균주에 pgi 유전자 결실을 통한 EMP 경로의 완전한 차단이 각각 시도되었다. 우선 이들 pfkA 및 pgi 결실 균주의 세포 성장을 호기 및 혐기조건에서 조사하였다. pfkA의 결실은 pfkB 아이소자임(minor)의 존재로 완전한 EMP 경로의 차단이 어렵지만, pfkA가 major 아이소자임인만큼 pfkA 유전자 결실을 통해 EMP 경로로의 탄소흐름을 감소시키고 PP 또는 ED 경로로의 탄소 흐름을 증가시킬 수 있을 것으로 기대하였다 (SH8 균주). SH8 균주를 호기 조건에서 배양할 경우 세포 성장 속도는 저하되었지만 성장이 가능하였고, 혐기 조건에서는 거의 성장하지 못하였다. 이는 pfkB isozyme이 비록 존재하지만 pfkA가 major isozyme으로 작용하고 있음을 재확인하는 결과이다.
한편, EMP의 완전한 차단을 위하여 pta-ackA 유전자가 살아있는 SH5에서 pgi 유전자 결실을 시도하였다 (SH5p 균주). 결실 균주는 호기 조건에서 사용된 모든 탄소원 (포도당, 글루코네이트, 프럭토스)을 이용하여 세포 성장이 가능하였다. 하지만 혐기 조건에서는 포도당을 이용한 세포 성장이나 포도당의 소모는 전혀 관찰되지 않았다. 이에 글루코네이트와 프럭토스를 탄소원으로 사용하여 발효를 시도하였다 (표 3). 포도당과는 달리 프럭토스 및 글루코네이트를 이용한 세포 성장은 혐기에서도 잘 이루어지는 것을 확인하였다. 이러한 결과는 pgi 유전자의 결실이 EMP 경로의 나머지 반응에는 영향이 없음을 확인한다. 특히 글루코네이트 탄소원 하에서 pgi-와 pgi+ 의 성장 차이는, 대장균 내에서 PP나 ED 경로에 필수적인 포도당-6-인산 (glucose-6-phosphate)에서 6-인산글루코네이트(6-phosphogluconate)로의 전환 반응이 원활하지 않음을 의미한다.
SH5p 균주의 세포 성장 비교
Carbon source Condition Relative Cell growth rate Biomass yield
(g cell/g carbon)
Glucose + O2 +++ 0.37
- O2 - -
Gluconate + O2 +++ 0.15
- O2 +++ 0.09
Fructose + O2 +++ 0.29
- O2 ++ 0.16
< 실시예 4> pfkA 결실 균주의 적응진화를 통한 혐기 미생물 획득 및 이를 이용한 동시생산
실시예 3의 pfkA 결실 균주인 SH8은 혐기 조건에서 포도당을 탄소원으로 거의 성장하지 못하였다. 이에 이 균주를 혐기 발효 조건에서 성장할 수 있는 균주로 바꾸기 위하여 적응진화 (adaptive evolution) 방법을 시도하였다. 적응진화를 위해 5 g/L의 포도당과 3g/L의 효모추출물 (yeast extract)를 포함한 M9 배양 배지가 사용되었다. SH8의 적응진화는 혐기 조건에서 지수성장기의 세포를 반복 계대함으로써 세포성장 속도를 향상시키는 방법이다 (도 2). 반복 계대는 성장속도의 변화에 따라 희석배수 1/104~1/105 범위 내에서 이루어졌으며, 적응진화를 위한 계대 반복 실험은 약 40일 동안 진행되었다. 적응진화를 통해 SH8 균주는 지속적으로 성장속도가 향상되었고, 최종 SH8 균주는 혐기조건에서 모균주인 SH6 균주보다 높은 세포 성장 속도를 보여주었다. 최종적으로 얻어진 적응진화 SH8 균주를 SH8AE (KCTC 12764BP)로 명명하였다.
한편, 적응진화를 통해 얻어진 SH8AE 균주를 이용해 포도당으로부터 산물 생산을 조사하였다. SH8AE의 수소 생산은 SH6 균주에 비해 40% 이상 증가하였지만 여전히 상당량의 피루브산이이 분비되었고 에탄올 수율에는 거의 변화가 없었다(표2). 이는 여전히 에탄올 생산에 필요한 NAD(P)H의 공급이 충분하지 못함을 의미한다. EMP가 거의 차단된 조건에서 에탄올 생산이 증가하지 않고 여전히 피루브산이 다량 축적된다는 것은 의외의 결과 이었다. 여러 가지 가능성 중에서 NADH 공급 부족이 가장 높을 것으로 추정되었는데 그 이유는 EMP가 차단된 상태에서 PP 경로가 활성화 되는 대신 ED 경로가 활성화 될 수 있기 때문이다. ED 경로는 EMP에 비해 NADH 생산을 향상시켜 주지 못한다. NADH 공급 부족 유무를 확인하기 위해 소비톨을 탄소원으로 SH8AE의 발효를 조사하였다. 소비톨은 포도당보다 환원된 형태의 탄소원이며 해당과정을 통해 피루브산 생산과정 동안 1 mol의 NADH를 추가로 생산하다. 소비톨 사용 시 세포성장 속도 및 탄소원 소모 속도는 포도당에 비해 낮았지만 에탄올과 수소 생산 수율이 각각 1.49, 1.25 mol/mol로 크게 증가하였다. 뿐만 아니라 피루브산 분비량도 0.74 mol/mol에서 0.24 mol/mol로 크게 감소하였다. 이러한 결과는 EMP 경로 차단 시 포도당이 PP 경로보다는 ED 경로를 통해 대사되고 따라서 EMP 경로의 차단에도 불구하고 NADH 의 공급은 증대되진 않았을 가능성을 보여준다. 한편 SH8AE 대사산물 분석으로 이루어진 인실리코(in silico) MFA (Metabolic Flux Analysis) 결과도 이러한 사실을 뒷받침 했다. SH8AE 균주는 pfkA 결실로 EMP 경로로의 탄소흐름의 70 % 이상 감소하였지만 이들 탄소들은 PP가 아닌 ED 경로로 흘러가는 것으로 확인되었다.
< 실시예 5> Zwf 과발현을 통한 pgi 결실 균주의 세포 성장
실시예 3에서 pgi 유전자가 결실된 SH5p 균주의 경우 포도당-6-인산(glucose-6-phosphate)에서 6-인산글루코네이트(6-phosphogluconate)로의 탄소 흐름이 원활하지 못함을 확인하였다. 이 반응 단계에 참여하는 효소로는 Zwf, Pgl 두 효소가 있으며 이 중 Zwf는 PP 경로의 일반적인 율속 단계로 알려져 있다. 따라서 혐기 조건에서 pgi 결실 균주가 포도당대사를 가능하도록 하기 위해 PP 경로의 첫 번째 효소이자 포도당-6-인산(glucose-6-phosphate)의 6-인산글루코노락톤 (6-phosphogluconolactone)으로의 전환을 촉매하는 zwf 유전자를 과발현하였다 (SH5p_Z; KCTC 12762BP). Zwf 과발현은 발효 시작 시점부터 세포 성장과 동시에 이루어졌다.
Zwf 과발현 균주는 혐기조건에서도 포도당을 이용하여 성장할 수 있었다. 이는 Pgl 보다는 Zwf의 낮은 효소 활성이 pgi 결실 균주의 혐기 성장을 막는 요인임을 의미한다.
하지만 EMP 경로의 결실로 인한 해당과정의 변형에도 불구하고 수소와 에탄올의 동시 생산성은 SH5 균주와 비교하여 높지 않았다 (표 4). 이는 실시예 4에서 기술한 pfkA 결실 변이주와 마찬가지로 pgi 결실 변이주도 대부분의 탄소를 PP 경로가 아닌 ED 경로로 대사하였기 때문으로 추정되었다. SH5p_Z 균주의 포도당 대사산물 분석을 바탕으로 이루어진 인실리코 MFA 결과도 이러한 사실을 뒷받침 한다 (도 5). 이는 해당과정의 중심 대사 경로인 EMP 경로가 막힐 경우 대장균은 혐기 조건에서 PP 경로보다는 ED 경로를 선호한다는 것을 의미한다. 또한 EMP를 막고 PP경로를 활성화시키는 것이 매우 어려운 작업임을 의미한다.
한편 SH5p 균주의 글루코네이트 발효의 경우 에탄올 생산 수율이 SH5p_Z보다 낮으며 아세트산 생산 수율은 높았다. 이는 Zwf 반응에 의해 생산된 NADPH가 에탄올 생산에 직접적인 영향을 준다는 것을 의미한다. 글루코네이트는 Zwf를 거치지 않고 PP 경로나 ED 경로를 통해 대사되며 Zwf 과정이 생략되므로 포도당에 비해 NAD(P)H를 하나 적게 생산하게 된다.
SH5p_Z, SH5, SH5p 균주의 동시 생산성 비교
Strains Carbon source Yield (mol/mol)
H2 Ethanol Acetate
SH5 Glucose 1.67 0.86 0.85
SH5p Gluconate 1.64 0.57 1.29
SH5p_Z Glucose 1.71 0.81 0.83
< 실시예 6> ED 경로의 edd , eda 유전자의 결실
실시예 4, 5에서 관찰된 대사산물 생산 수율 및 MFA 분석에 의하면 pfkA, pgi 결실 균주가 혐기 조건에서 성장하기 위해 PP 경로가 아닌 ED 경로에 의존하였다. 따라서 탄소대사흐름을 ED 경로에서 PP 경로로 전환하기 위해 SH5p, SH8AE 각각의 균주에서 ED 경로의 두 유전자인 edd, eda를 결실하였다 (SH5ped, SH8AEed).
SH5p 균주에서 추가적으로 edd, eda 유전자를 결실시킨 경우 (SH5ped_Z), Zwf의 과발현에도 불구하고 글루코오즈 배지에서 세포성장이 관찰되지 않았다. 또 글루코네이트를 탄소원으로 사용한 경우에도 세포 성장이 없었다. 이 결과를 통해 혐기 조건에서 pgi 결실 균주가 ED 경로를 통해 포도당을 대사한다는 사실을 다시 한 번 확인하게 되었다. 뿐만 아니라 글루코네이트에서도 성장하지 않는 것으로 보아 PP 경로의 활성화를 위한 또 다른 작업이 필요함을 알 수 있었다. 즉, ED와 PP 경로가 나누어지는 6-인산글루코네이트 (6-phosphogluconate) node 이후의 비산화적 PP 경로의 어떤 효소가 율속 단계일 가능성을 제시한다. 이를 확인하기 위해 SH5ped 균주를 이용해 비산화적 PP 경로에 있는 효소 중 Gnd (6-phosphogluconate dehydrogense) 또는 TktA (transketolase)의 과발현을 시도하였다. 각각의 과발현 균주를 글루코네이트를 탄소원으로 하여 그 성장을 조사하였다. Gnd가 과발현된 균주(SH5ped_ZG)는 글루코네이트를 이용하여 혐기 조건에서 세포 성장이 가능하였다. 하지만 최종 얻어진 바이오매스는 상당히 낮았다. 반면, TktA 과발현은 SH5ped_ZT 균주의 세포 성장에 전혀 영향을 미치지 못했다. 이는 Zwf와 마찬가지로 Gnd의 과발현이 PP 경로의 활성화를 위해 중요함을 보여준다.
하지만 SH5ped 균주에 Zwf, Gnd의 동시 과발현된 균주는 포도당을 이용하여 성장을 하지 못했다. 우선 동시 과발현 균주의 Zwf, Gnd 효소의 과발현을 확인하기 복합배지 또는 호기 조건에서의 배양된 뒤, SDS-PAGE 분석 및 세포 파쇄액을 이용해 활성을 측정하였다. SDS-PAGE 분석과 효소 활성 측정은 이들 단백질이 세포내 발현에는 문제가 없음을 확인하였다. 도 3은 이들 효소의 동시 과발현 결과를 SDS-PAGE 분석으로 보여주고 있다.
한편 SH8AE 균주에서도 eda, edd 유전자가 결실될 경우 (SH8AEed) 세포성장이 크게 저해되었다. 또한, Zwf, Gnd 과발현(SH8AEed_ZG)으로도 세포 성장 속도는 별로 향상되지 않았다.
이러한 결과들은 혐기 조건에서 PP 경로를 유일한 해당과정으로 사용하는 것을 대장균은 선호하지 않으며 PP 경로만 이용해서는 세포가 잘 자라지 않는다는 것을 보여준다. 그 이유로 첫 번째 생각할 수 있는 것은 NADPH 생산과 소모간의 불균형이다. 즉 PP 경로를 유일한 해당경로로 작동시킬 경우 Zwf나 Gnd와 같은 효소에 의해 생성되는 NADHP의 농도 증가가 전체적인 NADPH 생산과 소비 사이의 불균형을 초래하여 해당과정을 지속시킬 수 없는 상황을 만들 가능성이 있다. (NADPH는 NADH로 전환되어야 에탄올 생성에 쓰일 수 있다.) 이 가능성을 조사하기 위해 NADPH를 NADH로 전환시키는 효소인 Udh를 SH5ped_ZG 및 SH8AEed_ZG 균주에서 과발현시켰다. 그러나 이 경우도 세포 성장이 개선되지 못했다. 이론적 계산에 의하면 모든 포도당의 탄소가 PP 경로를 통해 분해될 경우 아세트산 생산 없이 에탄올만 생산하게 되어도 잉여의 NAD(P)H가 발생하게 된다. 만일 잉여의 NAD(P)H가 발생하면 산화-환원 불균형으로 탄소대사가 완전히 중단될 수 있을 것으로 추정되었다.
또 한가지 가능성은 과 생산된 NADPH가 세포 내 축적되어 효소 수준에서 PP 경로에 있는 중요 효소들의 활성을 저하시켜 PP 경로를 중단시키는 경우이다. 효소 수준의 NADPH 저해를 확인하기 위해 Zwf, Gnd 효소를 각각 과발현, 분리, 정제 하여 NADPH 농도에 따른 활성에 미치는 영향을 조사하였다. 사용된 배지 조건과 동일한 Mg2+이온(1.0 mM)이 포함된 혼합액에서 세포 활성을 조사한 결과 NADPH 농도가 증가할수록 활성도 감소하였으며, 150 uM의 NADPH 농도에서 최대 50%의 활성 저하가 관찰되었다.
이러한 결과를 토대로 혐기 해당과정에서 PP 경로만을 사용하는 것은, 산화환원 불균형과 효소 차원의 저해 등에 있어 모두 심각한 문제를 야기하는 것을 알 수 있었다. 결국 수소와 에탄올을 동시 생산하려면, 해당과정을 가능하면 PP 경로로 가져가되 ED나 EMP를 적절히 열어 주어 산화환원 불균형을 막고 또한 효소 차원의 저해를 막아주는 것이 필수적이라는 사실을 확인하였다.
< 실시예 7> SH8AE 균주를 이용한 PP 경로의 효소( Zwf , Gnd ) 과발현
아세트산 생산 효소가 비활성화되고, pfkA 유전자 결실로 EMP 경로를 통한 탄소원의 흐름이 감소된 SH8AE 균주를 사용하여 PP 경로의 활성화를 시도하였다. PP 경로의 활성화는 율속 단계 효소로 조사된 Zwf와 Gnd의 동시 과발현으로 이루어졌다 (SH8AE_ZG, KCTC 12765BP). 이 경우 edd, eda 가 제거되지 않고, 또한 Zwf, Gnd의 과발현으로 인해 세 가지 해당경로를 모두 이용할 것으로 예측되었다. 표 5는 Zwf 와 Gnd의 과발현이 동시 생산에 미치는 영향을 대사산물 생산으로 보여주고 있다. SH8AE의 경우 아세트산 생산 경로의 결실로 상당량의 pyruvate (0.74 mol/mol)이 생산되었지만 Zwf, Gnd 두 효소의 과발현으로 수소와 에탄올의 생산 수율이 각각 1.38, 1.17 mol/mol로 증가하였다. 이는 PP 경로의 활성화와 동시에 EMP 및 ED 경로가 적절히 작동한 결과로 추측된다. 동시 생산의 수율이 향상되었을 뿐 아니라 부산물인 피루브산의 분비가 약 50 % 감소하였다. 이러한 결과는 소비톨을 사용한 것보다 높은 효율은 아니다. 그러나 혐기조건에서 PP 경로의 활성화가 가능하며, 이것이 에탄올과 같이 환원된 형태의 연료나 케미컬 생산에 활용될 수 있다는 사실을 보여준다.
Zwf, Gnd의 과발현이 SH8AE의 동시 생산에 미치는 영향
Yield (mol/mol glucose)
H2 Ethanol Pyruvate
SH8AE 1.03 1.04 0.74
SH8AE_ZG 1.38 1.17 0.39
표 6은 SH8AE_ZG 균주의 유전자 발현을 SH8AE 균주와 비교하여 보여주는 정량 PCR 결과이다. mRNA 정량을 위해 RNA 중합효소 내 시그마 인자 70을 코딩하는 하우스키핑(house-keeping) 유전자 rpoD를 비교기준(reference)로 사용하였다. 결실된 pfkA 유전자의 전사량은 관찰되지 않았으며 대신 minor isozyme인 pfkB의 발현이 확인되었다. Zwf, Gnd유전자의 과발현으로 EMP 경로의 첫 번째 효소를 암호화하는 pgi 유전자의 발현량이 80% 이상 감소하였다. 하지만 gapA 유전자의 발현량은 큰 차이가 없었다. 그리고 ED 경로의 첫 번째 유전자인 edd, 혐기조건에서 피루브산을 분해하는 효소 유전자인 pflB 또한 증가하였다. 하지만 NADPH와 NAD+를 각각 NADP+, NADH로 전환한다고 알려진 soluble transhydrogenase 유전자인 udhA의 발현량은 증가하지 않았다. 흥미롭게도 에탄올 생산에 관여하는 adhE 유전자의 발현은 1.8 배 증가하였다.
SH8AE 균주의 Zwf, Gnd 과발현에 따른 유전자 발현 비교
Gene SH8AE SH8AEZG
pgi 13.7 2.5
pfkA 0.0 0.0
pfkB 125.9 55.1
gapA 68.9 61.2
edd 0.3 0.7
zwf 1.0 5316.6
gnd 8.1 4689.6
tktA 8.7 6.1
pflB 73.6 116.1
fhlA 0.3 0.2
udhA 0.4 0.1
adhE 9.1 16.7
< 실시예 8> SH5p 균주를 이용한 PP 경로의 효소( Zwf , Gnd ) 과발현
SH8AE과 마찬가지로 ED 경로가 남아있는 (그러나 EMP는 완전히 block 된) SH5p 균주를 이용하여 PP 경로의 활성화를 시도하였다. PP 경로의 활성화는 SH8AE와 동일하게 율속 단계 효소로 조사된 Zwf와 Gnd의 동시 과발현으로 이루어졌다 (SH5p_ZG; KCTC 12763BP). 포도당을 탄소원으로 사용하고 혐기 조건에서 이들 Zwf, Gnd 효소를 발효 개시와 함께 과발현시켰다. 표 7은 SH5p_Z 균주와 SH5p_ZG 균주의 혐기 발효 결과를 비교한다. 대부분의 탄소원을 ED 경로에 의존할 것으로 예상되는 SH5p_Z의 경우 에탄올과 아세트산의 생산량이 거의 비슷하였다. 하지만 Gnd의 추가 발현된 SH5p_ZG 균주의 경우 에탄올 생산 농도를 증가시키고 대신 아세트산 생산을 감소시켰다. 또한 수소 생산 수율도 현저히 증가되고 대신 피루브산 생성이 현저히 저하되었다. SH8AE_ZG에서 관찰된 바와 같이 PP경로의 활성화를 통해 NAD(P)H와 같은 보조인자의 공급이 증가되었음을 확인하는 결과이다. 또 아세트산 생산 경로를 완전히 닫는 대신 에탄올 생산을 위한 보조인자의 공급을 증가시킴으로써 탄소흐름을 아세트산에서 에탄올로 전환시킬 수 있음을 보여준다.
이론적인 수율 계산에 의하면 PP 경로만을 이용할 경우 얻어질 수 있는 수소와 에탄올의 양이 포도당 한 분자당 각각 1.67 분자인데 세포 성장 및 maintenance energy 생산 등에 상당량의 탄소 및 에너지가 소모되는 것을 감안할 때 이론적 수율의 80-90%가 현실적으로 달성 가능한 값으로 예측된다. 반면 일부 탄소원이 ED 경로를 통해 대사됨으로써 PP 경로에서 CO2 형태로 손실되는 (Gnd 반응을 통해) 탄소양을 줄여 에탄올과 아세트산 또는 수소 생산을 위한 탄소수율이 증가될 수 있으며 최소한의 양으로 배양 배지에 포함된 효모추출액의 양(1g/L)을 감안할 때, SH5p_ZG 균주의 경우 우리가 의도한 수소와 에탄올의 동시 생산을 거의 달성하게 하는 것으로 판단되었다. 표 7의 결과는 이러한 목표가 거의 달성되었음을 보여주는 결과이다.
Zwf 또는 Zwf 및 Gnd가 과발현된 SH5p를 이용한 수소 및 에탄올의 동시 생산
Yield (mol/mol glucose)
H2 Ethanol Acetate Pyruvate
SH5p_Z 1.71 0.81 0.83 -
SH5p_ZG 1.74 1.39 0.29 -
도 4는 SH5p_Z 균주와 SH5p_ZG 균주에서 아세테이트와 에탄올 생산양을 비교하여 보여준다. Gnd 발현을 통해 에탄올 생산이 높아지고 IPTG 농도를 증가하여 그 발현량을 높일 경우 그 차이는 더욱 확연하게 증가하는 것으로 나타났다.
정량 PCR을 통한 유전자의 발현량도 비교되었다 (표 8). 결실된 pgi 유전자의 전사량은 전혀 관찰되지 않았고, Zwf 및 Gnd 과발현으로 인한 PP 경로가 활성화 될 때 pfkA 발현량은 증가하는 경향을 보였다. 이는 탄소 흐름이 ED 경로에서 PP 경로로 증가됨에 따라 EMP 중간 경로로의 탄소 흐름이 증가하였기 때문으로 보인다 (도 1). gapA의 발현량도 증가하였는데 이는 pfkA의 발현 증가와 비슷한 원인으로 판단된다. 반면, ED 경로의 edd 유전자의 발현량은 조금씩 감소하는 경향을 보였다. SH8AE와 마찬가지로 udhA 발현에는 큰 변화가 없었으며 에탄올 생산 효소인 adhE 유전자의 발현은 많게는 3배 이상 증가하였다.
이러한 결과를 뒷받침하기 위해 발효산물 분석을 통한 세포내 Metabolic Flux analysis (MFA)가 이루어졌다 (도 5). Zwf만 과발현 한 경우, 대부분의 탄소가 ED 경로를 통해 대사되는 것을 알 수 있다. 하지만 Gnd이 추가 발현된 경우 6-인산글루코네이트 (6-phosphogluconate) 가지(branch)에서 탄소 흐름의 약 절반을 PP 경로로 가져가는 것으로 예측되었다. 또한 acetate 경로를 적절히 열어줌으로써 에탄올 생산을 증가시키면서도 피루브산 생산을 억제할 수 있었다. 즉, pyruvate node 에서의 탄소 흐름도 적절히 조절할 수 있는 것으로 나타났다.
SH5p_Z, SH5p_ZG 균주의 유전자 발현 비교
Gene SH5p _Z SH5p _ ZG
(0.1 mM IPTG ) 		SH5p _ ZG
(0.2 mM IPTG )
pgi 0.0 0.0 0.0
pfkA 2.2 3.6 5.5
pfkB 2.6 1.3 1.2
gapA 34.1 43.7 80.9
edd 1.4 1.1 0.9
zwf 2090.9 2656.5 8001.8
gnd 6.0 2090.7 6041.7
tktA 12.2 5.7 7.3
pflB 43.0 21.7 37.0
fhlA 0.4 0.5 0.4
udhA 0.4 0.5 0.3
adhE 4.5 7.2 13.8
한국생명공학연구원 KCTC12762BP 20150216 한국생명공학연구원 KCTC12763BP 20150216 한국생명공학연구원 KCTC12764BP 20150216 한국생명공학연구원 KCTC12765BP 20150216

Claims (7)

  1. 혐기 배양 조건에서 수소 및 에탄올을 동시에 생산하는 Escherichia coli SH8AE 재조합 균주(KCTC 12764BP).
  2. 제1항에 있어서, 상기 재조합 균주는 hycA, hyaAB, hybBC, ldhA, frdAB, pta-ackA 및 pfkA 유전자가 결실된 Escherichia coli BW25113 균주(Escherichia coli △ hycA △ hyaAB △ hybBC △ ldhA △ frdAB △pta- ackA △ pfkA; Escherichia coli SH8)의 적응 진화(adaptive evolution)를 통해 제작된 균주인 것을 특징으로 하는 Escherichia coli SH8AE 재조합 균주(KCTC 12764BP).
  3. 제2항에 있어서, 상기 재조합 균주는 적응 진화(adaptive evolution)를 통해 혐기 배양 조건에서 포도당을 탄소원으로 하여 세포 성장 속도가 향상된 것을 특징으로 하는 Escherichia coli SH8AE 재조합 균주(KCTC 12764BP).
  4. 제1항의 재조합 균주에 포도당-6-인산탈수소효소 (glucose-6-phosphate dehydrogenase; Zwf) 및 6-인산글루코네이트 탈수소효소 (6-phosphogluconate dehydrogenase; Gnd)를 형질도입하여 과발현시킨, 혐기 배양 조건에서 수소 및 에탄올을 동시에 생산하는 Escherichia coli SH8AE_ZG 재조합 균주(KCTC 12765BP).
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 재조합 균주를 탄소원이 포함된 배지에서 배양하는 단계; 및
    상기 배양한 배양액으로부터 수소 및 에탄올을 동시에 수득하는 단계를 포함하는 수소 및 에탄올의 동시 생산방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 배양하는 단계는 혐기 조건에서 수행되는 것을 특징으로 하는 수소 및 에탄올의 동시 생산방법.
  7. 제5항에 있어서, 상기 탄소원은 포도당인 것을 특징으로 하는 수소 및 에탄올의 동시 생산방법.
KR1020160142139A 2014-02-18 2016-10-28 수소 및 에탄올의 동시 생산을 위한 고효율 유전자 재조합 대장균 균주 및 포도당을 이용한 수소 및 에탄올의 고효율 동시 생산 방법 KR101697466B1 (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR20140018442 2014-02-18
KR1020140018442 2014-02-18

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020150025029A Division KR101734957B1 (ko) 2014-02-18 2015-02-23 수소 및 에탄올의 동시 생산을 위한 고효율 유전자 재조합 대장균 균주 및 포도당을 이용한 수소 및 에탄올의 고효율 동시 생산 방법

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20160130183A true KR20160130183A (ko) 2016-11-10
KR101697466B1 KR101697466B1 (ko) 2017-01-17

Family

ID=54059705

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020150025029A KR101734957B1 (ko) 2014-02-18 2015-02-23 수소 및 에탄올의 동시 생산을 위한 고효율 유전자 재조합 대장균 균주 및 포도당을 이용한 수소 및 에탄올의 고효율 동시 생산 방법
KR1020160142139A KR101697466B1 (ko) 2014-02-18 2016-10-28 수소 및 에탄올의 동시 생산을 위한 고효율 유전자 재조합 대장균 균주 및 포도당을 이용한 수소 및 에탄올의 고효율 동시 생산 방법

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020150025029A KR101734957B1 (ko) 2014-02-18 2015-02-23 수소 및 에탄올의 동시 생산을 위한 고효율 유전자 재조합 대장균 균주 및 포도당을 이용한 수소 및 에탄올의 고효율 동시 생산 방법

Country Status (1)

Country Link
KR (2) KR101734957B1 (ko)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20110000775A (ko) 2009-06-29 2011-01-06 포항공과대학교 산학협력단 재조합 미생물을 이용한 수소 생산 방법
WO2012020833A1 (ja) * 2010-08-12 2012-02-16 三井化学株式会社 ｇｎｔＲを破壊することによって生産性が向上したイソプロピルアルコール生産細菌

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20110000775A (ko) 2009-06-29 2011-01-06 포항공과대학교 산학협력단 재조합 미생물을 이용한 수소 생산 방법
WO2012020833A1 (ja) * 2010-08-12 2012-02-16 三井化学株式会社 ｇｎｔＲを破壊することによって生産性が向上したイソプロピルアルコール生産細菌

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Kim 등. International Association for Hydrogen Energy. Vol. 34, No. 17, 페이지 7417-7427 (2009.06.12.) *

Also Published As

Publication number Publication date
KR101697466B1 (ko) 2017-01-17
KR20150098231A (ko) 2015-08-27
KR101734957B1 (ko) 2017-05-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11634735B2 (en) Production of propanols, alcohols, and polyols in consolidated bioprocessing organisms
Sun et al. Advances in bioconversion of glycerol to 1, 3-propanediol: prospects and challenges
Yang et al. Metabolic engineering strategies for acetoin and 2, 3-butanediol production: advances and prospects
Huang et al. Simultaneous production of 3-hydroxypropionic acid and 1, 3-propanediol from glycerol by a recombinant strain of Klebsiella pneumoniae
Hoelzle et al. Regulation mechanisms in mixed and pure culture microbial fermentation
Liu et al. Redox potential control and applications in microaerobic and anaerobic fermentations
KR101390085B1 (ko) 글리세롤의 혐기성 발효
Gonzalez et al. A new model for the anaerobic fermentation of glycerol in enteric bacteria: trunk and auxiliary pathways in Escherichia coli
CN105121637B (zh) 酿酒酵母中替代甘油形成的消耗电子的乙醇生产途径
Tran et al. Metabolic engineering of Escherichia coli to enhance hydrogen production from glycerol
Yun et al. Co-fermentation of glycerol and glucose by a co-culture system of engineered Escherichia coli strains for 1, 3-propanediol production without vitamin B12 supplementation
Jo et al. Dual utilization of NADPH and NADH cofactors enhances xylitol production in engineered Saccharomyces cerevisiae
Bao et al. Regulation of the NADH pool and NADH/NADPH ratio redistributes acetoin and 2, 3‐butanediol proportion in Bacillus subtilis
US20140106424A1 (en) Reducing Carbon Dioxide Production and Increasing Ethanol Yield During Microbial Ethanol Fermentation
US10767196B2 (en) Engineering an increase in ethanol production by altering cofactor specificity
Bao et al. Engineering Clostridium cellulovorans for highly selective n‐butanol production from cellulose in consolidated bioprocessing
Cha et al. Deletion of a gene cluster for [Ni-Fe] hydrogenase maturation in the anaerobic hyperthermophilic bacterium Caldicellulosiruptor bescii identifies its role in hydrogen metabolism
Yang et al. Mevalonate production from ethanol by direct conversion through acetyl-CoA using recombinant Pseudomonas putida, a novel biocatalyst for terpenoid production
Wang et al. Biohydrogen production from anaerobic fermentation
Krishnan et al. Recent advances in process improvement of dark fermentative hydrogen production through metabolic engineering strategies
Soo et al. Improvement of hydrogen yield of ethanol-producing Escherichia coli recombinants in acidic conditions
CN108603179B (zh) 发酵产物生产增加的真核细胞
Liu et al. Metabolic engineering and adaptive evolution of Clostridium beijerinckii to increase solvent production from corn stover hydrolysate
Chu et al. Metabolic regulation and optimization of oxygen supply enhance the 2, 3‐butanediol yield of the novel Klebsiella sp. isolate FSoil 024
Sim et al. Unraveling the effect of redox potential on dark fermentative hydrogen production

Legal Events

Date Code Title Description
A107 Divisional application of patent
A201 Request for examination
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20191231

Year of fee payment: 4