ES2668457T3 - Bacteria productora de alcohol isopropílico que tiene una productividad mejorada por destrucción de GntR - Google Patents

Bacteria productora de alcohol isopropílico que tiene una productividad mejorada por destrucción de GntR Download PDF

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Abstract

Una Escherichia coli productora de alcohol isopropílico que comprende un sistema de producción de alcohol isopropílico, en el que se inactiva una actividad del represor transcripcional GntR para mejorar la eficacia de la producción de alcohol isopropílico y la Escherichia coli productora de alcohol isopropílico comprende un grupo de enzimas auxiliares que tienen un patrón de expresión de la actividad enzimática con el que se mantiene o aumenta la capacidad de producción de alcohol isopropílico conseguida mediante la inactivación de la actividad GntR, en el que el patrón de expresión de la actividad enzimática del grupo de enzimas auxiliares se selecciona del grupo que consiste en: (1) mantenimiento de las actividades de tipo silvestre de la actividad glucosa-6-fosfato isomerasa (Pgi), la actividad glucosa-6-fosfato-1-deshidrogenasa (Zwf) y la actividad fosfogluconato deshidrogenasa (Gnd); (2) inactivación de la actividad glucosa-6-fosfato isomerasa (Pgi) y aumento de la actividad glucosa-6-fosfato-1-deshidrogenasa (Zwf); e (3) inactivación de la actividad glucosa-6-fosfato isomerasa (Pgi), aumento de la actividad glucosa-6-fosfato-1-15 deshidrogenasa (Zwf) e inactivación de la actividad fosfogluconato deshidrogenasa (Gnd), y en la que el sistema de producción de alcohol isopropílico está constituido por genes de las enzimas acetoacetato descarboxilasa, alcohol isopropílico deshidrogenasa, CoA transferasa y tiolasa.

Description

DESCRIPCIÓN
Bacteria productora de alcohol isopropílico que tiene una productividad mejorada por destrucción de GntR
Campo de la invención 5
La presente invención se refiere a una Escherichia coli productora de alcohol isopropílico y a un método para producir alcohol isopropílico usando Escherichia coli.
Antecedentes de la técnica 10
El propileno es una materia prima básica importante para las resinas sintéticas como el polipropileno y para productos petroquímicos, y se usa ampliamente, como parachoques de automóviles, envases de alimentos, películas e instrumentos médicos.
15
El alcohol isopropílico producido a partir de materias primas procedentes de plantas puede convertirse en propileno a través de un proceso de deshidratación. Por lo tanto, el alcohol isopropílico es una prometedora materia prima para el propileno neutra en cuanto a emisiones de carbono. La acetona también se usa ampliamente como disolventes y materias primas para plásticos. El Protocolo de Kyoto hizo un llamamiento para que las naciones industrializadas reduzcan sus emisiones totales de dióxido de carbono de los niveles de 1990 en un 5 por ciento en 20 el período 2008-2012. Por lo tanto, el propileno neutro en cuanto a emisiones de carbono es actualmente extremadamente importante debido a su versatilidad, en vista del panorama global.
Ya se conocen bacterias que asimilan las materias primas procedentes de plantas y producen alcohol isopropílico. Por ejemplo, el documento WO 2009/008377 divulga una bacteria que se modifica para producir alcohol isopropílico 25 usando glucosa como materia prima, y describe que la bacteria tiene excelentes propiedades como biocatalizador para la producción industrial debido a su alta selectividad para el alcohol isopropílico.
En el caso de la Escherichia coli productora de alcohol isopropílico, debido a que la materia prima para el alcohol isopropílico es la glucosa, una gran cantidad de compuestos formados por la glucólisis y el catabolismo pueden ser 30 subproductos. Sin embargo, estos compuestos son sustancias esenciales para el crecimiento de Escherichia coli en algunos casos, y, por lo tanto, la cantidad de glucosa consumida por estas reacciones secundarias no puede eliminarse por completo. Por consiguiente, se han llevado a cabo diversos estudios con el fin de minimizar los subproductos y aumentar la cantidad de alcohol isopropílico producido.
35
Por ejemplo, el documento WO 2009/008377 divulga una bacteria productora de alcohol isopropílico en la que se han introducido los genes de la acetoacetato descarboxilasa, la alcohol isopropílico deshidrogenasa, la CoA transferasa y la tiolasa, y que es capaz de producir alcohol isopropílico a partir de una materia prima procedente de plantas. Se describe que la capacidad de la bacteria productora de alcohol isopropílico proporciona una tasa de producción de 0,6 g/l/h y una cantidad de acumulación de 28,4 g/l. 40
El documento WO 2009/049274 y Appl. Environ. Biotechnol., 73(24), pp.7814-7818, (2007) divulga una variante de Escherichia coli en la que se han introducido los genes de la acetil-CoA acetiltransferasa, la acetoacetil-CoA transferasa, la acetoacetato descarboxilasa y la alcohol deshidrogenasa secundaria, y que produce alcohol isopropílico. Se describe que la capacidad de las bacterias proporciona una tasa de producción de 0,4 g/l/h, un 45 rendimiento de 43,5 % y una cantidad de acumulación de 4,9 g/l.
El documento WO 2009/028582 divulga una variante de Escherichia coli en la que se han introducido los genes de la acetoacetato descarboxilasa, la alcohol isopropílico deshidrogenasa, la acetil CoA:acetato CoA-transferasa y la acetil-CoA acetiltransferasa, y que produce alcohol isopropílico. Se describe que la capacidad de la bacteria 50 proporciona una cantidad de acumulación de 9,7 g/l.
En Appl. Microbiol. Biotechnol., 77 (6), pp.1219-1224, (2008) divulga una variante de Escherichia coli en la que se han introducido los genes de la tiolasa, la CoA-transferasa, la acetoacetato descarboxilasa y la alcohol deshidrogenasa primaria-secundaria, y que produce alcohol isopropílico. Se describe que la capacidad de la bacteria 55 proporciona una tasa de producción de 0,6 g/l/h, un rendimiento del 51 % y una cantidad de acumulación de 13,6 g/l.
El documento WO 2009/103026 divulga una variante de Escherichia coli en la que se han introducido los genes de la acetoacetato descarboxilasa, la acetil CoA:acetato CoA-transferasa, la acetil-CoA acetiltransferasa y la alcohol isopropílico deshidrogenasa, y que es capaz de producir alcohol isopropílico. Se describe que se espera que la 60 bacteria tenga una capacidad que proporcione un rendimiento del 50 %, una tasa de producción de 0,4 g/l/h y una cantidad de producción final de 14 g/l.
El documento WO 2009/247217 desvela una variante de Escherichia coli en la que se han introducido los genes de la acetoacetato descarboxilasa, la CoA transferasa, la tiolasa y la 2-propil alcohol deshidrogenasa, y que es capaz 65 de producir alcohol isopropílico. Se describe que la capacidad de la bacteria proporciona una cantidad de producción
final de 2 g/l.
Aquí, la alcohol isopropílico deshidrogenasa, la alcohol deshidrogenasa secundaria, la alcohol deshidrogenasa primaria-secundaria y la 2-propil alcohol deshidrogenasa son enzimas que tienen diferentes nombres pero catalizan la misma reacción. La CoA transferasa, la acetoacetil-CoA transferasa, la acetil CoA:acetato CoA-transferasa y la 5 CoA transferasa son enzimas que tienen diferentes nombres pero que catalizan la misma reacción. La ácido acetoacético descarboxilasa y la acetoacetato descarboxilasa son enzimas que tienen diferentes nombres pero que catalizan la misma reacción. La tiolasa y la acetil-CoA acetiltransferasa son enzimas que tienen diferentes nombres pero que catalizan la misma reacción. En consecuencia, aunque la productividad de las variantes de Escherichia coli productoras de alcohol isopropílico divulgadas en estos documentos varía, las enzimas utilizadas para producir 10 alcohol isopropílico son equivalentes a los cuatro tipos de enzimas de acetoacetato descarboxilasa, alcohol isopropílico deshidrogenasa, CoA transferasa y tiolasa, que se describen en el documento WO 2009/008377. En este caso en el que se desea mejorar la productividad o el rendimiento, hasta el momento se han examinado estos cuatro tipos de enzimas.
15
La Solicitud de patente japonesa abierta a inspección pública (JP-A) N.º 5-260979 describe que, en Bacillus subtillis, la alteración del gen GntR poseído por Escherichia coli mejora la producción de D-ribosa.
Además, con respecto a un método para convertir alcohol isopropílico en acetona, en los documentos JP-A N.º 7-53433 y JP-A N.º 11-335315 se utiliza un catalizador a base de cobre como catalizador sólido para la producción de 20 acetona a través de la deshidrogenación del alcohol isopropílico. Además, en la Patente del Reino Unido N.º GB665376 se utiliza un catalizador obtenido por mezcla física de partículas finas de óxido de zinc y partículas finas de óxido de zirconio. Se sabe que cuando se produce una sustancia usando un microorganismo generalmente hay presente impurezas. En este sentido, ninguna de estas técnicas es un método de producción que utilice microorganismos y, por lo tanto, no describe que el isopropanol que contiene impurezas se use como materia prima. 25
La acetona se puede convertir fácilmente en isopropanol por hidrogenación. Se ha propuesto un proceso (véase, por ejemplo, el documento JP-A N.º 2-174737) que incluye la obtención de propileno a partir del isopropanol a través de una reacción de deshidratación, y posteriormente obtener cumeno permitiendo que el propileno reaccione con el benceno, es decir, un proceso en el cual la acetona se reutiliza como materia prima para el método del cumeno al 30 convertirse en propileno mediante reacciones en dos etapas.
En la reutilización tal como se describió anteriormente, existe la necesidad de establecer un método industrial y práctico para producir propileno a partir de acetona con alta selectividad. También se conoce un método (véase, por ejemplo, la Patente de Alemania Oriental N.º DD84378) que incluye llevar a cabo una reacción de hidrogenación de 35 acetona a 400 °C en presencia de un catalizador de Cu (25 %) - óxido de zinc (35 %) - óxido de aluminio (40 %) para obtener propileno. Sin embargo, aunque la temperatura de reacción en este método es alta (400 °C), la tasa de conversión de acetona es baja (89 %). Además, dado que en el método se produce una reacción secundaria que genera propano a través de la hidrogenación de propileno, la selectividad del propileno también es insuficiente (89 %). 40
Sumario de la invención
Problema técnico
45
Sin embargo, ninguna de las variantes de Escherichia coli descritas anteriormente capaces de producir alcohol isopropílico tienen una capacidad de producción completamente satisfactoria. Mejorar la eficiencia en la producción de alcohol isopropílico en la Escherichia coli productora de alcohol isopropílico ha sido un objetivo importante para lograr. Además, también se ha deseado la provisión de un método para la utilización eficaz del alcohol isopropílico obtenido. 50
Un objeto de la presente invención es proporcionar una Escherichia coli que tenga una eficiencia significativa de producción de alcohol isopropílico, un método de producción de alcohol isopropílico y un método de producción de acetona que utiliza la Escherichia coli, así como un método de producción de propileno a partir de alcohol isopropílico que contenga acetona y que se obtenga utilizando la Escherichia coli 55
Solución al problema
La presente invención se realizó a la vista de las circunstancias descritas anteriormente. Una Escherichia coli productora de alcohol isopropílico de acuerdo con la invención, un método de producción de alcohol isopropílico de 60 acuerdo con la invención, y un método de producción de acetona de acuerdo con la presente invención son como se describe a continuación.
[1] Una Escherichia coli productora de alcohol isopropílico que comprende un sistema de producción de alcohol isopropílico, en el que se inactiva una actividad del represor transcripcional GntR para mejorar la eficacia de la 65 producción de alcohol isopropílico y la Escherichia coli productora de alcohol isopropílico comprende un grupo de
enzimas auxiliares que tienen un patrón de expresión de la actividad enzimática con el que se mantiene o aumenta la capacidad de producción de alcohol isopropílico conseguida mediante la inactivación de la actividad de GntR, seleccionándose el patrón de actividad enzimática del grupo de enzimas auxiliares del grupo que consiste en:
5
(1) mantenimiento de las actividades de tipo silvestre de la actividad glucosa-6-fosfato isomerasa (Pgi), la actividad glucosa-6-fosfato-1-deshidrogenasa (Zwf) y la actividad fosfogluconato deshidrogenasa (Gnd);
(2) inactivación de la actividad glucosa-6-fosfato isomerasa (Pgi) y aumento de la actividad glucosa-6-fosfato-1-deshidrogenasa (Zwf); e
(3) inactivación de la actividad glucosa-6-fosfato isomerasa (Pgi), aumento de la actividad glucosa-6-fosfato-10 1-deshidrogenasa (Zwf) e inactivación de la actividad fosfogluconato deshidrogenasa (Gnd), y
en el que el sistema de producción de alcohol isopropílico está constituido por genes de las enzimas acetoacetato descarboxilasa, alcohol isopropílico deshidrogenasa, CoA transferasa y tiolasa.
[2] La Escherichia coli productora de alcohol isopropílico de acuerdo con [1], en la que la actividad glucosa-6-15 fosfato-1-deshidrogenasa (Zwf) es una actividad glucosa-6-fosfato-1-deshidrogenasa codificada por un gen de la glucosa-6-fosfato-1-deshidrogenasa de una bacteria del género Escherichia.
[3] La Escherichia coli productora de alcohol isopropílico de acuerdo con [1] o [2], en la que:
(a) el gen de la enzima acetoacetato descarboxilasa es un gen de la acetoacetato descarboxilasa de un 20 procariota seleccionado del grupo que consiste en una bacteria del género Clostridium, una bacteria del género Bacillus y una bacteria del género Escherichia,
(b) el gen de la enzima alcohol isopropílico deshidrogenasa es un gen de la alcohol isopropílico deshidrogenasa de un procariota seleccionado del grupo que consiste en una bacteria del género Clostridium, una bacteria del género Bacillus y una bacteria del género Escherichia, 25
(c) el gen de la enzima de la CoA transferasa es un gen de la CoA transferasa de un procariota seleccionado del grupo que consiste en una bacteria del género Clostridium, una bacteria del género Bacillus y una bacteria del género Escherichia, y
(d) el gen de la enzima tiolasa es un gen de la tiolasa de un procariota seleccionado del grupo que consiste en una bacteria del género Clostridium, una bacteria del género Bacillus y una bacteria del género 30 Escherichia.
[4] La Escherichia coli productora de alcohol isopropílico de acuerdo con [1] o [3], en la que:
(a) la actividad acetoacetato descarboxilasa es una actividad acetoacetato descarboxilasa codificada por un 35 gen que codifica la acetoacetato descarboxilasa de Clostridium acetobutylicum,
(b) la actividad alcohol isopropílico deshidrogenasa es una actividad alcohol isopropílico deshidrogenasa codificada por un gen que codifica la alcohol isopropílico deshidrogenasa procedente de Clostridium beijerinckii,
(c) la actividad CoA transferasa es una actividad CoA transferasa codificada por un gen que codifica la CoA 40 transferasa de Escherichia coli, y
(d) la actividad tiolasa es una actividad tiolasa codificada por un gen que codifica la tiolasa de Escherichia coli.
[5] La Escherichia coli productora de alcohol isopropílico de acuerdo con [1], en la que: 45
(a) la actividad alcohol isopropílico deshidrogenasa es una actividad alcohol isopropílico deshidrogenasa codificada por un gen que codifica la alcohol isopropílico deshidrogenasa introducida como un gen modificado, y/o
(b) la actividad acetoacetato descarboxilasa es una actividad la acetoacetato descarboxilasa codificada por 50 un gen que codifica la acetoacetato descarboxilasa introducida como un gen modificado.
[6] La Escherichia coli productora de alcohol isopropílico de acuerdo con [5], en la que el gen modificado de la alcohol isopropílico deshidrogenasa tiene una secuencia de bases de SEQ ID NO: 40, y el gen modificado de la acetoacetato descarboxilasa tiene una secuencia de bases de SEQ ID NO: 43. 55
[7] La Escherichia coli productora de alcohol isopropílico de acuerdo con cualquiera de [1] y [3] a [6], que comprende además al menos un gen de sacarosa hidrolasa de entre los genes de sacarosa no PTS.
[8] Un método de producción de alcohol isopropílico, que comprende la producción de alcohol isopropílico a partir de una materia prima procedente de plantas usando la Escherichia coli productora de alcohol isopropílico cualquiera de [1] a [7]. 60
[9] Un método para producir acetona, que comprende:
obtener alcohol isopropílico a partir de una materia prima procedente de plantas utilizando la Escherichia coli productora de alcohol isopropílico de cualquiera de [1] a [7]; y
poner en contacto el alcohol isopropílico obtenido con un óxido complejo como catalizador que incluye óxido 65 de zinc y al menos un óxido que contiene un elemento del Grupo 4, y que se prepara por coprecipitación.
[10] Un método para producir propileno, que comprende:
obtener alcohol isopropílico que contiene acetona a partir de una materia prima procedente de plantas utilizando la Escherichia coli productora de alcohol isopropílico de cualquiera de [1] a [7] y
poner en contacto el alcohol isopropílico con una sustancia ácida sólida y un catalizador de hidrogenación 5 que contiene Cu como catalizadores, a una temperatura de reacción dentro de un intervalo de 50 a 300 °C.
[11] El método para producir propileno de acuerdo con [10], en el que el catalizador de hidrogenación que contiene Cu es un catalizador que incluye además al menos un elemento seleccionado del grupo que consiste en elementos del Grupo 6, Grupo 12 y Grupo 13. 10
[12] El método para producir propileno de acuerdo con [10] u [11], en el que la sustancia ácida sólida es zeolita.
Efecto ventajoso de la invención
De acuerdo con la presente invención, se puede proporcionar una Escherichia coli que tiene una eficiencia 15 significativa de producción de alcohol isopropílico, un método de producción de alcohol isopropílico y un método de producción de acetona que utilizan la Escherichia coli, así como un método de producción de propileno a partir de alcohol isopropílico que contiene acetona y que se obtiene utilizando la Escherichia coli.
Descripción de las realizaciones 20
Una Escherichia coli productora de alcohol isopropílico de la presente invención es un Escherichia coli productora de alcohol isopropílico que comprende un sistema de producción de alcohol isopropílico, en el que la actividad del represor transcripcional GntR se inactiva para mejorar la eficacia de la producción de alcohol isopropílico y la Escherichia coli productora de alcohol isopropílico comprende un grupo de enzimas auxiliares que tienen un patrón 25 de actividad enzimática con el que se mantiene o aumenta la capacidad de producción de alcohol isopropílico conseguida mediante la inactivación de la actividad GntR.
En la Escherichia coli productora de alcohol isopropílico de acuerdo con la invención, la inactivación de la actividad GntR en combinación con la posesión de un grupo de enzimas auxiliares que tienen el patrón de actividad 30 enzimática especificado permite una alta producción de alcohol isopropílico.
Es decir, como resultado de diversos estudios que apuntan a mejorar la eficacia de la producción de alcohol isopropílico, la invención ha descubierto que la inactivación de la actividad de GntR, que es un regulador negativo del metabolismo del gluconato, mejora la eficacia de la producción de alcohol isopropílico por la Escherichia coli. 35
Además, también se encontró que hay enzimas que afectan a la capacidad mejorada de producción de alcohol isopropílico lograda por la inactivación de la actividad GntR. La capacidad mejorada de producción de alcohol isopropílico conseguida por la inactivación de GntR se mantiene o aumenta, dependiendo del patrón de actividad de estas enzimas. 40
Como se usa en la invención, la expresión “grupo de enzimas auxiliares” se refiere a enzimas que afectan a la capacidad de producción de alcohol isopropílico. Además, la actividad de enzimas incluidas en el grupo de enzimas auxiliares se inactiva, activa o aumenta, y la frase “patrón de actividad enzimática del grupo de enzimas auxiliares” como se usa en la invención se refiere a un patrón de actividad enzimática de las enzimas que es capaz de 45 mantener o aumentar la cantidad de producción mejorada de alcohol isopropílico conseguida mediante la inactivación de la actividad de GntR sola. El patrón de actividad enzimática se selecciona del grupo que consiste en:
(1) mantenimiento de las actividades de tipo silvestre de la actividad glucosa-6-fosfato isomerasa (Pgi), actividad glucosa-6-fosfato-1-deshidrogenasa (Zwf) y actividad fosfogluconato deshidrogenasa (Gnd); 50
(2) inactivación de la actividad glucosa-6-fosfato isomerasa (Pgi) y aumento de la actividad glucosa-6-fosfato-1-deshidrogenasa (Zwf); e
(3) inactivación de la actividad glucosa-6-fosfato isomerasa (Pgi), aumento de la actividad glucosa-6-fosfato-1-deshidrogenasa (Zwf) e inactivación de la actividad fosfogluconato deshidrogenasa (Gnd).
55
El grupo de enzimas auxiliares puede ser un grupo de enzimas compuesto solo de enzimas nativas excepto que se proporciona un sistema de producción de alcohol isopropílico constituido por genes de las enzimas acetoacetato descarboxilasa, alcohol isopropílico deshidrogenasa, CoA transferasa y tiolasa, y que la actividad GntR está inactivada (en la invención, los factores que no muestran actividad enzimática por sí mismos también se incluyen en el alcance de “enzimas”, a menos que se indique específicamente que se excluyen). 60
El alcance de la Escherichia coli productora de alcohol isopropílico descrito anteriormente abarca, por ejemplo:
la Escherichia coli productora de alcohol isopropílico en la que no se realiza ninguna alteración artificial, excepto que se proporciona el sistema de producción de alcohol isopropílico que ejerce la capacidad de producción de 65 alcohol isopropílico predeterminada, y que GntR se inactivó mediante tecnología de recombinación génica; y
la Escherichia coli productora de alcohol isopropílico en la que no se realiza ninguna alteración artificial, excepto que se proporciona el sistema de producción de alcohol isopropílico modificado para mejorar la capacidad de producción de alcohol isopropílico, y que GntR se inactiva mediante tecnología de recombinación génica.
El patrón de actividad enzimática del grupo de enzimas auxiliares descrito en el punto (3) anterior es más preferible 5 desde el punto de vista de la capacidad de producción de alcohol isopropílico.
Como se usa en la invención, el término “inactivación” se refiere a una condición en la que la actividad del factor o enzima medida por cualquier sistema de medición existente no es superior a 1/10 de la actividad en la Escherichia coli antes de la inactivación, suponiendo que la actividad en la Escherichia coli antes de la inactivación es 100. 10
Como se usa en la invención, la frase “mediante tecnología de recombinación genética” abarca cualquier alteración de la secuencia de bases causada por la inserción de otro ADN en la secuencia de bases de un gen nativo, la sustitución o eliminación de un determinado sitio de un gen, o combinación de los mismos Por ejemplo, la alteración puede ser el resultado de una mutación. 15
En la invención, Escherichia coli en la que la actividad de un factor o enzima se inactiva se refiere a una bacteria en la que la actividad nativa se ve afectada por algún método aplicado desde el exterior de la célula bacteriana hacia el interior de la célula bacteriana. La bacteria puede generarse, por ejemplo, alterando un gen que codifica la proteína o enzima (interrupción del gen). 20
Los ejemplos de la alteración génica en la invención incluyen la adición de una mutación a la secuencia de bases de un gen, la inserción de otro ADN en la secuencia de bases y la eliminación de una cierta parte de un gen, que se llevan a cabo con el fin de prevenir la función del gen a realizar. Como resultado de la alteración génica, por ejemplo, el gen no puede transcribirse en ARNm, y el gen estructural deja de traducirse. En otra alternativa, debido a que el 25 ARNm transcrito está incompleto, la mutación o deleción aparece en la secuencia de aminoácidos de la proteína estructural traducida, y por lo tanto, no pueden realizarse las funciones intrínsecas de la proteína estructural.
Se puede emplear cualquier método para la preparación de un alterador génico siempre que se obtenga un alterador en el que la enzima o proteína no se expresa. Se han descrito varios métodos de alteración génica (reproducción 30 natural, adición de un agente mutagénico, irradiación ultravioleta, exposición a radiación, mutagénesis aleatoria, transposón, alteración génica dirigida al sitio). La alteración génica por recombinación homóloga es preferible debido a su capacidad de alterar solo un gen específico. Las técnicas por recombinación homóloga se describen en J. Bacteriol., 161, 1219 - 1221 (1985)), J. Bacteriol., 177, 1511-1519 (1995)) y Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A, 97,6640-6645 (2000)), y los expertos en la materia pueden llevar a cabo fácilmente la alteración génica usando estos 35 métodos y aplicaciones de los mismos.
En la invención, el “aumento” de “actividad” significa, en términos generales, que una actividad enzimática en la Escherichia coli productora de alcohol isopropílico aumenta después del aumento en comparación con la actividad de la enzima antes del aumento. 40
Los métodos de aumento no están particularmente restringidos siempre que la actividad de una enzima poseída por la Escherichia coli productora de alcohol isopropílico aumente. Los ejemplos de los mismos incluyen el aumento mediante un gen de una enzima introducido desde el exterior de la célula bacteriana, aumento por expresión aumentada de un gen de una enzima dentro de la célula bacteriana, y una combinación de los mismos. 45
Los ejemplos de aumento por un gen de una enzima introducido desde el exterior de la célula bacteriana incluyen, específicamente: la introducción de un gen que codifica una enzima que tiene una actividad mayor que la enzima del hospedador desde el exterior de la célula bacteriana de la bacteria hospedadora hacia dentro de la célula bacteriana, añadiendo así el actividad enzimática del gen de la enzima introducido; sustituir la actividad enzimática 50 introducida por una actividad enzimática intrínseca que posee originalmente el hospedador; aumentar el número de copias de un gen de una enzima del hospedador o un gen de una enzima introducido desde el exterior de la célula bacteriana a 2 o más; y cualquier combinación de los mismos.
Los ejemplos de aumento por expresión aumentada de un gen de una enzima dentro de la célula bacteriana 55 incluyen, específicamente: la introducción de una secuencia de bases que aumenta la expresión de un gen de una enzima desde el exterior de la célula bacteriana de la bacteria hospedadora hacia dentro de la célula bacteriana; la sustitución de otro promotor por el promotor de un gen de una enzima que posee la bacteria hospedadora en su genoma, aumentando así la expresión del gen de la enzima; y cualquier combinación de los mismos.
60
En la invención, el término “hospedadora” significa Escherichia coli que se convertirá en la Escherichia coli productora de alcohol isopropílico de acuerdo con la invención como resultado de la introducción de uno o más genes desde el exterior de la célula de la misma.
La invención se describe a continuación. 65
GntR en la invención se refiere a un factor de transcripción que regula negativamente un operón que participa en el metabolismo de gluconato a través de la vía Entner-Doudoroff, y es un nombre genérico para el represor transcripcional GntR que suprime las funciones de dos grupos de genes (GntI y GntII), que son responsables de la absorción y del metabolismo del ácido glucónico.
5
Glucosa-6-fosfato isomerasa (Pgi) en la invención se refiere a un nombre genérico de enzimas que están clasificadas con el código de enzima número 5.3.1.9 basado en el informe de la Comisión de Enzimas de la Unión Internacional de Bioquímica (IUB), y que cataliza una reacción de producción de D-fructosa-6-fosfato a partir de D-glucosa-6-fosfato.
10
Glucosa-6-fosfato-1-deshidrogenasa (Zwf) en la invención se refiere a un nombre genérico de enzimas que están clasificadas con el código de enzima número 1.1.1.49 basado en el informe de la Comisión de Enzimas de la Unión Internacional de Bioquímica (IUB), y que catalizan una reacción de producción de D-glucono-1,5-lactona-6-fosfato a partir de D-glucosa-6-fosfato.
15
Ejemplos de tales enzimas incluyen las procedentes de bacterias del género Deinococcus como Deinococcus radiophilus, bacterias del género Aspergillus como Aspergillus niger y Aspergillus aculeatus, bacterias del género Acetobacter como Acetobacter hansenii, bacterias del género Thermotoga como Thermotoga maritima, bacterias del género Cryptococcus como Cryptococcus neoformans, bacterias del género Dictyostelium como Dictyostelium discoideum, el género Pseudomonas como Pseudomonas fluorescens y Pseudomonas aeruginosa, el género 20 Saccharomyces como Saccharomyces cerevisiae, bacterias del género Bacillus como Bacillus megaterium, y bacterias del género Escherichia como Escherichia coli.
Como gen de la glucosa-6-fosfato-1-deshidrogenasa (Zwf) usado en la invención, se puede utilizar un ADN que tiene la secuencia de bases de un gen que codifica una glucosa-6-fosfato-deshidrogenasa obtenida de cualquiera de los 25 organismos de origen de las enzimas descritos anteriormente, o la secuencia de ADN sintético que se sintetiza basado en una secuencia de bases conocida del gen. Los ejemplos preferibles incluyen un ADN que tiene la secuencia de bases de un gen procedente de una bacteria del género Deinococcus como Deinococcus radiophilus, una bacteria del género Aspergillus como Aspergillus niger o Aspergillus aculeatus, una bacteria del género Acetobacter como Acetobacter hansenii, una bacteria del género Thermotoga como Thermotoga maritima, una 30 bacteria del género Cryptococcus como Cryptococcus neoformans, una bacteria del género Dictyostelium como Dictyostelium discoideum, el género Pseudomonas como Pseudomonas fluorescens o Pseudomonas aeruginosa, el género Saccharomyces como Saccharomyces cerevisiae, una bacteria del género Bacillus como Bacillus megaterium, o una bacteria del género Escherichia como Escherichia coli. Un ADN que tiene la secuencia de bases de un gen procedente de un procariota tal como una bacteria del género Deinococcus, una bacteria del género 35 Aspergillus, una bacteria del género Acetobacter, una bacteria del género Thermotoga, una bacteria del género Pseudomonas, una bacteria del género Bacillus o una bacteria del género Escherichia es más preferible, y un ADN que tiene la secuencia de bases de un gen procedente de Escherichia coli es particularmente preferible.
La fosfogluconato deshidrogenasa (Gnd) en la invención se refiere a un nombre genérico de enzimas que están 40 clasificadas con el código de enzima número 1.1.1.44 basado en el informe de la Comisión de Enzimas de la Unión Internacional de Bioquímica (IUB), y que cataliza una reacción de producción de D-ribulosa-5-fosfato y CO2 a partir de 6-fosfo-D-gluconato.
La Escherichia coli productora de alcohol isopropílico de acuerdo con la invención es Escherichia coli que tiene un 45 sistema de producción de alcohol isopropílico, y tiene capacidad de producción de alcohol isopropílico que se introduce o altera mediante una tecnología de recombinación génica. El sistema de producción de alcohol isopropílico es un sistema que habilita el objetivo Escherichia coli para producir alcohol isopropílico
En la Escherichia coli productora de alcohol isopropílico de acuerdo con la invención, se confieren cuatro tipos de 50 actividades enzimáticas, actividad acetoacetato descarboxilasa, actividad alcohol isopropílico deshidrogenasa, actividad CoA transferasa y la actividad tiolasa descrita anteriormente desde el exterior de la célula bacteriana, o se aumenta la expresión de las actividades en la célula bacteriana, o, más preferiblemente, se confieren y se aumentan.
55
En la invención, tiolasa se refiere a un nombre genérico de enzimas que se clasifican con el número de código de enzima: 2.3.1.9 basado en el informe de la Comisión de Enzimas de la Unión Internacional de Bioquímica (IUB) y que cataliza una reacción de producción de acetoacetilo CoA a partir de acetil CoA.
Los ejemplos de la enzima incluyen las procedentes de las bacterias del género Clostridium como Clostridium 60 acetobutylicum y Clostridium beijerinckii, bacterias del género Escherichia como Escherichia coli, bacterias del género Halobacterium, bacterias del género Zoogloea como Zoogloea ramigera, bacterias del género Rhizobium, bacterias del género Bradyrhizobium como Bradyrhizobium japonicum, bacterias del género Candida como Candida tropicalis, bacterias del género Caulobacter como Caulobacter crescentus, bacterias del género Streptomyces como Streptomyces collinus, y bacterias del género Enterococcus como Enterococcus faecalis. 65
Como un gen de la tiolasa para usar en la invención, se puede usar un ADN que tiene la secuencia de bases de un gen que codifica una tiolasa obtenida de cualquiera de los organismos de origen de las enzimas enumerados anteriormente, o una secuencia de ADN sintetizada que se sintetiza basándose en una secuencia de bases del gen conocida. Los ejemplos preferibles incluyen un ADN que tiene la secuencia de bases de un gen procedente de una bacteria del género Clostridium como Clostridium acetobutylicum o Clostridium beijerinckii, una bacteria del género 5 Escherichia como Escherichia coli, una bacteria de la especie Halobacterium, una bacteria del género Zoogloea como Zoogloea ramigera, una bacteria de la especie Rhizobium, una bacteria del género Bradyrhizobium como Bradyrhizobium japonicum, una bacteria del género Candida como Candida tropicalis, una bacteria del género Caulobacter como Caulobacter crescents, una bacteria del género Streptomyces como Streptomyces collinus, o una bacteria del género Enterococcus como Enterococcus faecalis. Los ejemplos más preferibles incluyen un ADN que 10 tiene la secuencia de bases de un gen procedente de un procariota tal como una bacteria del género Clostridium o una bacteria del género Escherichia, y un ADN que tiene la secuencia de bases de un gen procedente de Clostridium acetobutylicum o Escherichia coli es particularmente preferible.
En la invención, la acetoacetato descarboxilasa se refiere a un nombre genérico de enzimas que se clasifican con el 15 número de código de enzima: 4.1.1.4 basado en el informe de la Comisión de Enzimas de la Unión Internacional de Bioquímica (IUB), y que cataliza una reacción de producción de acetona a partir de acetoacetato.
Los ejemplos de las enzimas incluyen las procedentes de las bacterias del género Clostridium, como Clostridium acetobutylicum y Clostridium beijerinckii, y bacterias del género Bacillus como Bacillus polymyxa. 20
Como un gen de la acetoacetato descarboxilasa a introducir en la bacteria hospedadora en la invención, se puede usar un ADN que tiene la secuencia de bases de un gen que codifica una acetoacetato descarboxilasa obtenida a partir de cualquiera de los organismos de origen de las enzimas enumerados anteriormente, o una secuencia de ADN sintético que se sintetiza basándose en una secuencia base conocida del gen. Los ejemplos preferibles 25 incluyen los procedentes de bacterias del género Clostridium o bacterias del género Bacillus. Un ejemplo es un ADN que tiene la secuencia de bases de un gen procedente de Clostridium acetobutylicum o Bacillus polymyxa. Un ADN que tiene la secuencia de bases de un gen procedente de Clostridium acetobutylicum es particularmente preferible.
En la invención, la alcohol isopropílico deshidrogenasa se refiere a un nombre genérico de enzimas que se clasifican 30 con el número de código de enzima: 1.1.1.80 basado en el informe de la Comisión de Enzimas de la Unión Internacional de Bioquímica (IUB), y que cataliza una reacción de producción de alcohol isopropílico a partir de acetona. Los ejemplos de la enzima incluyen las procedentes de las bacterias del género Clostridium, como Clostridium beijerinckii.
35
Como un gen de la alcohol isopropílico deshidrogenasa para ser introducido en la bacteria hospedadora en la invención, se puede usar un ADN que tiene la secuencia de bases de un gen que codifica una alcohol isopropílico deshidrogenasa obtenida de cualquiera de los organismos de origen de las enzimas enumerados anteriormente, o una secuencia de ADN sintético que se sintetiza basándose en una secuencia de bases conocida del gen. Los ejemplos preferibles incluyen los procedentes de bacterias del género Clostridium, como un ADN que tiene la 40 secuencia de bases de un gen procedente de Clostridium beijerinckii.
En la invención, CoA transferasa se refiere a un nombre genérico de enzimas que se clasifican con el número de código de enzima: 2.8.3.8 basado en el informe de la Comisión de Enzimas de la Unión Internacional de Bioquímica (IUB) y que cataliza una reacción de producción de acetoacetato a partir de acetoacetil CoA. 45
Los ejemplos de la enzima incluyen las procedentes de las bacterias del género Clostridium, como Clostridium acetobutylicum y Clostridium beijerinckii, bacterias del género Roseburia, como Roseburia intestinalis, bacterias del género Faecalibacterium como Faecalibacterium prausnitzii, bacterias del género Coprococcus, Trypanosoma como Trypanosoma brucei, y bacterias del género Escherichia como Escherichia coli. 50
Como un gen de la CoA transferasa para usar en la invención, se puede usar un ADN que tiene la secuencia de bases de un gen que codifica una CoA transferasa obtenida de cualquiera de los organismos de origen de las enzimas enumerados anteriormente, o una secuencia de ADN sintético que se sintetiza basándose en una secuencia de bases conocida del gen. Los ejemplos preferibles incluyen un ADN que tiene la secuencia de bases de 55 un gen procedente de una bacteria del género Clostridium como Clostridium acetobutylicum, una bacteria del género Roseburia como Roseburia intestinalis, una bacteria del género Faecalibacterium como Faecalibacterium prausnitzii, una bacteria del género Coprococcus, Trypanosoma como Trypanosoma brucei, o una bacteria del género Escherichia como Escherichia coli. Los ejemplos más preferibles incluyen los procedentes de una bacteria del género Clostridium o una bacteria del género Escherichia, y un ADN que tiene la secuencia de bases de un gen 60 procedente de Clostridium acetobutylicum o Escherichia coli es particularmente preferible.
Desde el punto de vista de la actividad de la enzima, es preferible que cada uno de los cuatro tipos de enzima sea una enzima procedente de al menos una seleccionado del grupo que consiste en una bacteria del género Clostridium, una bacteria del género Bacillus, y una bacteria del género Escherichia. En particular, un caso en el que 65 la acetoacetato descarboxilasa y la alcohol isopropílico deshidrogenasa se derivan de una bacteria o bacteria del
género Clostridium, y en la cual la actividad CoA transferasa y la actividad tiolasa se derivan de una bacteria o bacterias del género Escherichia, es más preferible
En particular, desde el punto de vista de la actividad enzimática, es preferible que cada uno de los cuatro tipos de enzima en la invención proceda de cualquiera de Clostridium acetobutylicum, Clostridium beijerinckii, o Escherichia 5 coli. Un caso en el que la acetoacetato descarboxilasa es una enzima procedente de Clostridium acetobutylicum, y en la que cada una de la CoA transferasa y la tiolasa es una enzima procedente de Clostridium acetobutylicum o Escherichia coli, y en la cual la alcohol isopropílico deshidrogenasa es una enzima procedente de Clostridium beijerinckii, es más preferible Con respecto a los cuatro tipos de enzimas, un caso en el cual la actividad acetoacetato descarboxilasa se deriva de Clostridium acetobutylicum, y en la cual la actividad alcohol isopropílico 10 deshidrogenasa se deriva de Clostridium beijerinckii, y en la cual la actividad CoA transferasa y la actividad tiolasa se derivan de Escherichia coli, es particularmente preferible desde el punto de vista de la actividad de la enzima.
Cada una de las actividades de estas enzimas en la invención puede ser una actividad introducida desde el exterior de la célula bacteriana dentro de la célula bacteriana o una actividad obtenida por la elevada expresión del gen de la 15 enzima que la bacteria hospedadora posee en su genoma a través del aumento de la actividad del promotor para el gen de la enzima o reemplazo del promotor con otro promotor.
La introducción de la actividad enzimática puede llevarse a cabo, por ejemplo, introduciendo un gen que codifica la enzima desde el exterior de la célula bacteriana de la bacteria hospedadora hasta el interior de la célula bacteriana 20 utilizando una tecnología de recombinación génica. Aquí, el gen de la enzima que se va a introducir puede derivarse de la misma especie que la de la célula hospedadora o de una especie diferente de la de la célula hospedadora. Métodos para la preparación de un ADN genómico necesario para introducir un gen desde el exterior de la célula bacteriana hasta el interior de la célula bacteriana, corte y ligación del ADN, transformación, PCR (reacción en cadena de la polimerasa), diseño y síntesis de oligonucleótidos para ser utilizados como cebadores, etc. pueden 25 llevarse a cabo mediante métodos habituales bien conocidos por los expertos en la materia. Estos métodos se describen en Sambrook, J., et al., “Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition”, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989)) etc.
En la invención, la Escherichia coli en la cual se aumenta una actividad de la enzima se refiere a Escherichia coli en 30 la cual la actividad enzimática se aumenta mediante algún método. Tal Escherichia coli pueden prepararse utilizando, por ejemplo, un método en el que un gen que codifica la enzima o proteína se introduce desde el exterior de la célula bacteriana hasta el interior de la célula bacteriana utilizando un plásmido y una tecnología de recombinación génica similar a la descrita anteriormente, un método en el que la elevada expresión de un gen de la enzima que posee la Escherichia coli hospedadora en su genoma se logra mediante el aumento de la actividad 35 promotora para el gen de la enzima o la sustitución del promotor por otro promotor.
El promotor del gen en la invención puede ser cualquier promotor que sea capaz de controlar la expresión de cualquiera de los genes descritos anteriormente. El promotor del gen es preferiblemente un potente promotor que funciona constitutivamente en el microorganismo, y que no es susceptible a la represión de la expresión incluso en 40 presencia de glucosa. Los ejemplos específicos del mismo incluyen el promotor de la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (en lo sucesivo denominado en ocasiones “GAPDH”) o el promotor de la serina hidroximetil transferasa.
El promotor en la presente invención significa una región a la que se une una ARN polimerasa que tiene un factor 45 sigma para iniciar la transcripción. Por ejemplo, un promotor GAPDH procedente de Escherichia coli se describe en las bases número 397-440 en la información de la secuencia de bases con número de acceso de GenBank X02662.
Los genes de la CoA transferasa (atoD y atoA) y un gen de la tiolasa (atoB), cada uno de los cuales se deriva de Escherichia coli, forman un operón en el genoma de Escherichia coli en el orden de atoD, atoA y atoB (Journal of 50 Baceteriology vol. 169 pp 42-52 Lauren Sallus Jenkins, et al.) Por lo tanto, la expresión de los genes de la CoA transferasa y el gen de la tiolasa puede controlarse simultáneamente modificando el promotor de atoD.
En vista de lo anterior, cuando la actividad CoA transferasa y la actividad tiolasa se obtienen de los genes genómicos de la Escherichia coli hospedadora, es preferible aumentar la expresión de ambos genes de las enzimas, 55 por ejemplo, reemplazando el promotor responsable de la expresión de ambos genes de las enzimas por otro promotor, desde el punto de vista de obtener suficiente capacidad de producción de alcohol isopropílico. Los ejemplos del promotor que se usan para aumentar la expresión de la actividad CoA transferasa y la actividad tiolasa incluyen el promotor GAPDH procedente de Escherichia coli anteriormente descrito.
60
En la presente invención, ejemplos de Escherichia coli productora de alcohol isopropílico que tienen un sistema de producción de alcohol isopropílico incluyen la variante pIPA/B o la variante pIaaa/B descritas en el documento WO 2009/008377. El alcance de tal Escherichia coli incluye una variante en la que, entre las enzimas implicadas en la producción de alcohol isopropílico, el aumento de la actividad la CoA transferasa y de la actividad tiolasa se lleva a cabo aumentando la expresión de los respectivos genes en el genoma de la Escherichia coli, y en el que el aumento 65 de la actividad alcohol isopropílico deshidrogenasa y la actividad acetoacetato descarboxilasa se lleva a cabo
mediante el aumento de la expresión de los genes respectivos usando un plásmido o plásmidos (a veces denominada “variante pla/B::atoDAB”).
En la invención, la actividad GntR inactivada se incluye preferiblemente desde el punto de vista de mejorar más eficazmente la eficacia de la producción de alcohol isopropílico. Es más preferible incluir la actividad glucosa-6-5 fosfato isomerasa (Pgi) inactivada y la actividad glucosa-6-fosfato-1-deshidrogenasa (Zwf) aumentada además de la GntR inactivada. Lo más preferible es que se incluyan la actividad GntR inactivada, la actividad glucosa-6-fosfato isomerasa (Pgi) inactivada, la actividad fosfogluconato deshidrogenasa (Gnd) inactivada y la actividad glucosa-6-fosfato-1-deshidrogenasa (Zwf) aumentada. Estas combinaciones permiten una mejora drástica de la eficacia de la producción de alcohol isopropílico, en comparación con otras combinaciones de factores o enzimas. 10
Un aspecto preferible de la Escherichia coli productora de alcohol isopropílico de acuerdo con la invención es una variante obtenida mediante la inactivación de la actividad GntR de la variante pIPA/B, la variante pIaaa/B o la variante pIa/B::atoDAB.
15
Un aspecto más preferible de la misma es una variante obtenida mediante la inactivación de la actividad GntR y la actividad glucosa-6-fosfato isomerasa (Pgi) de la variante pIPA/B, la variante pIaaa/B o la variante pIa/B::atoDAB, y el aumento de la actividad glucosa-6-fosfato-1-deshidrogenasa (Zwf) de la misma.
Un aspecto particularmente preferible es una variante obtenida mediante la inactivación de la actividad GntR, la 20 actividad glucosa-6-fosfato isomerasa (Pgi) y la actividad fosfogluconato deshidrogenasa (Gnd) de la variante pIPA/B, la variante pIaaa/B o la variante pIa/B::atoDAB, y el aumento de la actividad glucosa-6-fosfato-1-deshidrogenasa (Zwf) de la misma.
Además, los genes que codifican enzimas de asimilación de sacarosa pueden introducirse en la Escherichia coli 25 productora de alcohol isopropílico de acuerdo con la invención. La introducción de tales genes permite la producción de alcohol isopropílico a partir de sacarosa.
Los genes que codifican enzimas de asimilación de sacarosa incluyen genes que codifican enzimas implicadas en el sistema PTS y el sistema no PTS entre las vías de asimilación de sacarosa de microorganismos. 30
Específicamente, ejemplos de genes que codifican enzimas implicadas en el sistema PTS de la sacarosa incluyen genes que codifican ScrA (que incorpora sacarosa), ScrY (que fosforila sacarosa), ScrB (que degrada la sacarosa dentro del microorganismo), ScrR (que regula la expresión de genes que codifican ScrA, Y, y B), y ScrK (que fosforila la fructosa). 35
Además, un grupo de genes no PTS de sacarosa que codifica las enzimas implicadas en el sistema no PTS de sacarosa es, específicamente, un grupo de genes compuestos por genes que codifican CscB (sacarosa permeasa, que incorpora sacarosa), CscA (sacarosa hidrolasa, que degrada sacarosa dentro del microorganismo), CscK (fructoquinasa, que fosforila la fructosa) y CscR (proteína represora, que regula la expresión de genes que codifican 40 CscB, A y K).
Entre estos, ejemplos de un gen de una enzima de asimilación de sacarosa para ser introducido en la Escherichia coli productora de alcohol isopropílico de acuerdo con la invención incluyen genes que codifican enzimas implicadas en el sistema no PTS, y, especialmente, genes que codifican una combinación de una o más enzimas que incluyen 45 al menos CscA. Los ejemplos de los mismos incluyen cscA solo, una combinación de cscA y cscK, una combinación de cscA y cscB, una combinación de cscA y cscR, una combinación de cscA, cscR y cscK, y una combinación de cscA, cscR y cscB. En particular, es posible elegir introducir solo un gen que codifica CscA desde el punto de vista de la producción eficiente de alcohol isopropílico.
50
Como un gen de la sacarosa hidrolasa (invertasa, CscA), se puede usar un ADN que tiene la secuencia de bases de un gen que codifica una sacarosa hidrolasa (invertasa, CscA) obtenida de un organismo que posee la enzima, o una secuencia de ADN sintético que se sintetiza basándose en la secuencia de bases conocida del gen. Los ejemplos preferibles incluyen los procedentes de bacterias del género Erwinia, bacterias del género Proteus, bacterias del género Vibrio, bacterias del género Agrobacterium, bacterias del género Rhizobium, bacterias del género 55 Staphylococcus, bacterias del género Bifidobacterium, y bacterias del género Escherichia. Un ejemplo es un ADN que tiene la secuencia de bases de un gen procedente de una cepa de Escherichia coli O157. Un ADN que tiene la secuencia de bases de un gen procedente de una cepa de Escherichia coli O157 es particularmente preferible. Es preferible que una secuencia señal para transferir cscA al periplasma de la célula bacteriana se haya añadido a cscA. 60
Como un gen de la proteína represora (CscR), se puede usar un ADN que tiene la secuencia base de un gen que codifica una proteína represora (CscR) obtenida de un organismo que posee la enzima, o una secuencia de ADN sintético que se sintetiza basándose en una secuencia base conocida del gen. Los ejemplos preferibles incluyen los procedentes de bacterias del género Erwinia, bacterias del género Proteus, bacterias del género Vibrio, bacterias del 65 género Agrobacterium, bacterias del género Rhizobium, bacterias del género Staphylococcus, bacterias del género
Bifidobacterium, y bacterias del género Escherichia. Un ejemplo es un ADN que tiene la secuencia de bases de un gen procedente de una cepa de Escherichia coli O157. El ADN que tiene la secuencia de bases de un gen procedente de una cepa de Escherichia coli O157 es particularmente preferible.
Como un gen de la fructoquinasa (CscK), se puede usar un ADN que tiene la secuencia base de un gen que codifica 5 una fructoquinasa (CscK) obtenida de un organismo que posee la enzima, o una secuencia de ADN sintético que se sintetiza basándose en una secuencia de bases conocida del gen. Los ejemplos preferibles incluyen los procedentes de bacterias del género Erwinia, bacterias del género Proteus, bacterias del género Vibrio, bacterias del género Agrobacterium, bacterias del género Rhizobium, bacterias del género Staphylococcus, bacterias del género Bifidobacterium, y bacterias del género Escherichia. Un ejemplo es un ADN que tiene la secuencia de bases de un 10 gen procedente de una cepa de Escherichia coli O157. El ADN que tiene la secuencia de bases de un gen procedente de una cepa de Escherichia coli O157 es particularmente preferible.
Como un gen de la sacarosa permeasa (CscB), se puede usar un ADN que tiene la secuencia base de un gen que codifica una sacarosa permeasa (CscB) obtenida de un organismo que posee la enzima, o una secuencia de ADN 15 sintético que se sintetiza basándose en una secuencia base conocida de el gen. Los ejemplos preferibles incluyen los procedentes de bacterias del género Erwinia, bacterias del género Proteus, bacterias del género Vibrio, bacterias del género Agrobacterium, bacterias del género Rhizobium, bacterias del género Staphylococcus, bacterias del género Bifidobacterium, y bacterias del género Escherichia. Un ejemplo es un ADN que tiene la secuencia de bases de un gen procedente de una cepa de Escherichia coli O157. El ADN que tiene la secuencia de bases de un gen 20 procedente de una cepa de Escherichia coli O157 es particularmente preferible.
En la Escherichia coli productora de alcohol isopropílico de acuerdo con la invención, la actividad de una enzima del sistema de producción de alcohol isopropílico, preferiblemente la actividad de al menos una de alcohol isopropílico deshidrogenasa o acetoacetato deshidrogenasa entre las enzimas del sistema de producción de alcohol isopropílico, 25 puede derivarse de un gen introducido como un gen modificado.
Como se usa en la invención, la frase “gen modificado” abarca cualquier producto obtenido tras someter la secuencia de bases del gen de la enzima a modificación, tal como deleción, sustitución o adición. Específicamente, sus ejemplos incluyen un producto en el que la modificación se realiza solo en codones de la secuencia de bases del 30 gen de la enzima y en el que la secuencia de aminoácidos sintetizada basada en la secuencia de bases modificada solo para codones no cambia, y un producto en el que la modificación se hace solo para la región promotora de un gen de una enzima y en el que la secuencia de aminoácidos sintetizada basada en la secuencia de bases modificada solo en la región promotora no cambia.
35
El gen de la enzima a modificar puede ser un gen innato del hospedador o un gen de la enzima procedente de un microorganismo de una especie diferente.
Además, solo un gen de la enzima que codifica la alcohol isopropílico deshidrogenasa o solo un gen de la enzima acetoacetato deshidrogenasa puede modificarse genéticamente, o ambos genes pueden modificarse genéticamente 40 al mismo tiempo.
El gen modificado puede tener cualquier modificación siempre que la modificación génica de cualquiera de los genes de la enzima descritos anteriormente tenga como resultado un aumento de la capacidad para producir una sustancia diana mediante la provisión de la actividad enzimática de una enzima correspondiente a un hospedador o mediante 45 el aumento de la actividad enzimática.
El gen modificado es preferiblemente un gen modificado cuyos codones empleados se han modificado de acuerdo con la frecuencia del uso de los codones en Escherichia coli. Tal gen modificado permite un aumento de la eficacia de la producción de alcohol isopropílico. 50
Como se usa en la invención, la frase “modificar los codones empleados” significa la modificación de codones, que son secuencias de tripletes de bases correspondientes a los aminoácidos respectivos, en la secuencia de bases que codifica y define una secuencia de aminoácidos. Tal como se usa en la invención, la expresión “modificación de codón” significa la modificación solo de la secuencia de bases sin alteración de la secuencia de aminoácidos. 55
El gen modificado de la alcohol isopropílico deshidrogenasa preferiblemente tiene una secuencia de bases representada por la SEQ ID NO: 40. El gen modificado de la acetoacetato deshidrogenasa preferiblemente tiene una secuencia de bases representada por la SEQ ID NO: 43. La actividad de cada una de la alcohol isopropílico deshidrogenasa y la acetoacetato deshidrogenasa preferiblemente puede aumentarse usando los genes 60 modificados.
En la presente invención, Escherichia coli significa Escherichia coli que se puede producir para que tenga la capacidad de producir alcohol isopropílico a partir de una materia prima procedente de una planta mediante el uso de ciertos medios, independientemente de si la Escherichia coli originalmente tiene la capacidad de producir alcohol 65 isopropílico a partir de una materia prima procedente de plantas.
Aquí la Escherichia coli que se someterá a recombinación genética es Escherichia coli que no tiene capacidad de producción de alcohol isopropílico, y puede ser cualquier Escherichia coli que permite la introducción o modificación de los genes respectivos.
La Escherichia coli es Escherichia coli a la cual se le ha conferido la capacidad de producción de alcohol isopropílico 5 por adelantado. Al usar tal Escherichia coli, el alcohol isopropílico se puede producir de manera más eficiente.
La Escherichia coli productora de alcohol isopropílico es un Escherichia coli productora de alcohol isopropílico a la que se le ha conferido impartido la actividad acetoacetato descarboxilasa, la actividad alcohol isopropílico deshidrogenasa, la actividad CoA transferasa y la tiolasa para poder producir alcohol isopropílico a partir de una 10 materia prima procedente de plantas, y que se describe, por ejemplo, en el documento WO 2009/008377.
Un método para producir alcohol isopropílico de acuerdo con la invención incluye producir alcohol isopropílico a partir de una materia prima procedente de plantas usando la Escherichia coli productora de alcohol isopropílico descrita anteriormente, e incluye específicamente cultivar la Escherichia coli productora de alcohol isopropílico en un 15 estado en el que la Escherichia coli productora de alcohol isopropílico se pone en contacto con una materia prima procedente de plantas (en lo sucesivo, proceso de cultivo), y recoger el alcohol isopropílico obtenido por el contacto (en lo sucesivo, proceso de recogida).
La materia prima procedente de plantas que se utilizará en el método de producción de alcohol isopropílico es una 20 fuente de carbono obtenida de una planta, y no está restringida siempre que sea una materia prima procedente de plantas. En la invención, la materia prima procedente de plantas se refiere a órganos tales como raíces, cañas, tallos, ramas, hojas, flores y semillas, cuerpos de las plantas incluyendo los órganos de la planta y productos de descomposición de los órganos de la planta, y además abarca fuentes de carbono que pueden ser utilizadas como fuentes de carbono por microorganismos durante el cultivo a partir de fuentes de carbono obtenidas de los cuerpos 25 de las plantas, los órganos de las plantas y sus productos de descomposición.
Las fuentes de carbono incluidas en tales materias primas procedentes de plantas generalmente incluyen azúcares como almidón, sacarosa, glucosa, fructosa, xilosa y arabinosa, o productos de descomposición herbácea y leñosa o hidrolizados de celulosa, cada uno de los cuales contiene los ingredientes anteriores en grandes cantidades y 30 combinaciones de los mismos. Las fuentes de carbono de la invención pueden incluir además glicerina y ácidos grasos derivados de aceite vegetal.
Los ejemplos preferidos de la materia prima procedente de plantas en la invención incluyen productos agrícolas tales como granos, maíz, arroz, trigo, soja, caña de azúcar, remolacha, algodón y similares, o combinaciones de los 35 mismos. La forma de la misma como materia prima no está específicamente limitada, y puede ser un producto crudo, jugo exprimido, un producto triturado o similar. En otra alternativa, la materia prima procedente de plantas puede estar en una forma que consiste únicamente en la fuente de carbono descrita anteriormente.
En el proceso de cultivo, el contacto entre la Escherichia coli productora de alcohol isopropílico y una materia prima 40 procedente de plantas generalmente se elabora cultivando la Escherichia coli productora de alcohol isopropílico en un medio de cultivo que contiene la materia prima procedente de plantas.
La densidad de contacto entre la materia prima procedente de plantas y la Escherichia coli productora de alcohol isopropílico puede variar según la actividad de la Escherichia coli productora de alcohol isopropílico. En general, la 45 concentración de la materia prima procedente de plantas en el medio de cultivo puede ser tal que la concentración inicial de azúcar en términos de glucosa se puede establecer en un 20 % en masa o menos con respecto a la masa total de la mezcla. Desde el punto de vista de la tolerancia al azúcar de Escherichia coli, la concentración inicial de azúcar se establece preferiblemente en 15 % en masa o inferior. Se pueden añadir otros componentes en las cantidades de adición habituales para medios de cultivo de microorganismos, sin limitación particular. 50
El contenido de la Escherichia coli productora de alcohol isopropílico en el medio de cultivo puede variar con el tipo y la actividad de la Escherichia coli, y la cantidad de un líquido bacteriano precultivo (DO 660 nm = 4 a 8) que se añadirá al comenzar el cultivo generalmente se puede fijar para que sea de 0,1 % en masa a 30 % en masa en relación con el líquido de cultivo, y preferiblemente se fija para que sea del 1 % en masa al 10 % en masa en 55 relación con el líquido de cultivo desde el punto de vista del control de las condiciones de cultivo.
El medio de cultivo que se utilizará para el cultivo de Escherichia coli productora de alcohol isopropílico puede ser cualquier medio de cultivo habitualmente empleado que incluya una fuente de carbono, una fuente de nitrógeno, iones inorgánicos y oligoelementos orgánicos, ácidos nucleicos, vitaminas, etc. requeridos por los microorganismos 60 para producir ácido láctico, sin limitación particular.
Las condiciones de cultivo para el cultivo en la invención no están particularmente restringidas, y el cultivo puede llevarse a cabo, por ejemplo, en condiciones aeróbicas a un pH y temperatura adecuadamente controlados dentro de un intervalo de pH 4 a 9, preferiblemente de pH 6 a 8, y dentro de un intervalo de 20 °C a 50 °C, preferiblemente 65 de 25 °C a 42 °C.
El volumen de aireación del gas en la mezcla descrita anteriormente no está particularmente restringido. Cuando solo se usa aire como gas, el volumen de aireación es generalmente de 0,02 wm a 2,0 wm (wm; volumen de aireación [ml]/volumen líquido [ml]/tiempo [min]), y, desde el punto de vista de la evitación de daños físicos a Escherichia coli, la aireación se lleva a cabo preferiblemente a 0,1 vvm a 1,5 wm.
5
El proceso de cultivo puede ser continuo desde el comienzo del cultivo hasta que la materia prima procedente de plantas en la mezcla se agote, o hasta que la actividad de la Escherichia coli productora de alcohol isopropílico desaparece. La duración del proceso de cultivo puede variar con el número y la actividad de la Escherichia coli productora de alcohol isopropílico en la mezcla y la cantidad de materia prima procedente de plantas. En general, la duración puede ser de al menos una hora, y preferiblemente de al menos cuatro horas. La duración del cultivo puede 10 continuar ilimitadamente mediante una nueva adición de la materia prima procedente de plantas o la Escherichia coli productora de alcohol isopropílico. Sin embargo, desde el punto de vista de la eficacia del proceso, la duración generalmente puede fijarse en 5 días o menos, preferiblemente 72 horas o menos. Con respecto a otras condiciones, las condiciones empleadas para el cultivo habitual pueden aplicarse tal cual.
15
Los métodos para recoger el alcohol isopropílico acumulado en el medio de cultivo no están particularmente restringidos. Por ejemplo, puede emplearse un método que incluye eliminar células bacterianas del líquido de cultivo mediante, por ejemplo, separación centrífuga, y después separar el alcohol isopropílico usando un método de separación habitual tal como destilación o separación por membrana.
20
El método de producción de alcohol isopropílico de acuerdo con la invención puede incluir además un proceso de precultivo antes del proceso de cultivo para producir alcohol isopropílico, con vistas a lograr un número de células apropiado o un estado activado apropiado de la Escherichia coli productora de alcohol isopropílico a ser utilizada. El proceso de precultivo puede ser cualquier cultivo realizado en condiciones de cultivo habitualmente empleadas adecuadas para el tipo de bacteria productora de alcohol isopropílico empleada. 25
El método para producir alcohol isopropílico de acuerdo con la invención preferiblemente incluye un proceso de cultivo en el cual la Escherichia coli productora de alcohol isopropílico se cultiva mientras se suministra gas a la mezcla que contiene la bacteria productora de alcohol isopropílico y la materia prima procedente de plantas; y un proceso de recogida en el que el alcohol isopropílico producido por el cultivo se separa y se recoge de la mezcla. 30
De acuerdo con este método, la Escherichia coli productora se cultiva mientras se suministra gas a la mezcla (cultivo de aireación). En este cultivo de aireación, el alcohol isopropílico producido se libera en la mezcla y se evapora de la mezcla. Como resultado, el alcohol isopropílico producido se puede separar fácilmente de la mezcla. Además, dado que el alcohol isopropílico producido se separa continuamente de la mezcla, se puede regular un aumento en la 35 concentración de alcohol isopropílico en la mezcla. Por lo tanto, no es necesario prestar especial atención a la tolerancia al alcohol isopropílico de la Escherichia coli productora de alcohol isopropílico.
La mezcla en este método puede estar compuesta principalmente de un medio básico generalmente utilizado en cultivo de Escherichia coli. Con respecto a las condiciones de cultivo, las descritas anteriormente se aplicarán tal 40 como cual.
En el proceso de recogida, se recoge el alcohol isopropílico producido en el proceso de cultivo y se separado de la mezcla. El método de recogida puede ser cualquier método capaz de recoger alcohol isopropílico en estado gaseoso o en gotas evaporado de la mezcla mediante cultivo habitual. Los ejemplos de dicho método incluyen un método de 45 recogida en un elemento de recogida, tal como un recipiente hermético comúnmente empleado. En particular, el método incluye preferiblemente poner en contacto una solución trampa para atrapar alcohol isopropílico con alcohol isopropílico separado de la mezcla, desde el punto de vista de recoger solamente alcohol isopropílico de alta pureza.
En el presente método, el alcohol isopropílico puede recogerse en un estado en el que el alcohol isopropílico se 50 disuelve en una solución trampa o en la mezcla. Los ejemplos de dicho método de intercalación incluyen un método descrito en el documento WO 2009/008377. El alcohol isopropílico recogido se puede confirmar usando un medio de detección habitual tal como HPLC. El alcohol isopropílico recogido puede purificarse adicionalmente, si es necesario. Los ejemplos del método de purificación incluyen destilación, etc.
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En el caso en el que el alcohol isopropílico recogido está en el estado de solución acuosa, el presente método de producción de alcohol isopropílico puede incluir además un proceso de deshidratación además del proceso de recogida. La deshidratación del alcohol isopropílico se puede llevar a cabo usando un método ordinario.
Un ejemplo de aparatos aplicables al método de producción de alcohol isopropílico en el que el alcohol isopropílico 60 se puede recoger en el estado de disolución en la solución trampa o la mezcla es el aparato de producción que se muestra en la Fig. 1 del documento WO 2009/008377.
En el aparato de producción, un tubo de inyección para inyectar un gas desde el exterior del aparato está conectado a un tanque de cultivo que contiene un medio de cultivo que incluye una bacteria productora de alcohol isopropílico y 65 una materia prima procedente de plantas, permitiendo así la aireación del medio de cultivo.
Un tanque trampa que contiene una solución trampa donde la solución trampa se conecta al tanque de cultivo a través de un tubo de conexión. Un gas o líquido que se ha movido al tanque trampa entra en contacto con la solución trampa y se produce el burbujeo.
Como resultado, el alcohol isopropílico, que se ha producido en el tanque de cultivo por cultivo bajo aireación, se 5 evapora debido a la aireación, y así se separa fácilmente del medio de cultivo, y queda atrapado en la solución trampa en el tanque trampa. Como resultado, el alcohol isopropílico se puede producir en un estado más purificado de una manera simple y continua.
El método de producción de alcohol isopropílico de acuerdo con la invención permite una alta producción de alcohol 10 isopropílico, y la cantidad de producción habitualmente obtenida empleando el método de acuerdo con la invención es mayor que las cantidades de producción habitualmente obtenidas empleando métodos similares a los que no se aplica la invención. Aunque la productividad varía con las condiciones del método de producción y el estado de la Escherichia coli productora de alcohol isopropílico que se utiliza, se puede lograr una productividad de 50 a 100 g/l/72 h, preferiblemente de 55 a 80 g/l/72 h. 15
Como se explicó anteriormente, la Escherichia coli productora de alcohol isopropílico de acuerdo con la invención es capaz de una alta producción de alcohol isopropílico. Por lo tanto, por ejemplo, se pueden acumular 75 g/l o más de alcohol isopropílico después de cultivar durante 72 horas en el caso de la producción de alcohol isopropílico usando el catalizador de Escherichia coli de acuerdo con la invención, por lo que puede obtenerse una productividad mucho 20 mayor que la conseguida por los catalizadores convencionales.
En la Escherichia coli productora de alcohol isopropílico de acuerdo con la invención, la acetona, que es un precursor del alcohol isopropílico, se produce al mismo tiempo. La acetona obtenida se convierte preferiblemente en alcohol isopropílico usando un método conocido (por ejemplo, un método descrito en la Publicación de Patente 25 Japonesa N.º 2786272) después de su purificación usando un método conocido. Esto aumenta aún más la eficiencia de conversión del azúcar como materia prima al alcohol isopropílico.
El método de producción de acetona de acuerdo con la invención es un método de producción de acetona que incluye: 30
obtener alcohol isopropílico a partir de una materia prima procedente de plantas utilizando la Escherichia coli productora de alcohol isopropílico (en lo sucesivo denominado el proceso de producción de alcohol isopropílico); y
poner en contacto el alcohol isopropílico obtenido con un óxido complejo como catalizador que incluye óxido de 35 zinc y al menos un óxido que contiene un elemento del Grupo 4, y que se prepara mediante coprecipitación (en lo sucesivo denominado el proceso de producción de acetona).
El alcohol isopropílico obtenido usando la Escherichia coli productora de alcohol isopropílico se pone en contacto con el óxido complejo preparado por coprecipitación, mediante la cual se produce una reacción de deshidrogenación 40 y se produce acetona a partir de alcohol isopropílico. De esta manera, el alcohol isopropílico producido usando la Escherichia coli productora de alcohol isopropílico se puede utilizar de manera efectiva para realizar una producción eficiente de sustancias.
Con respecto a la Escherichia coli productora de alcohol isopropílico, la materia prima procedente de plantas, las 45 condiciones de producción de alcohol isopropílico, etc. empleadas en el proceso de producción de alcohol isopropílico, se aplicarán tal cual las descritas anteriormente para la producción de alcohol isopropílico.
En el proceso de producción de acetona, se usa como catalizador un óxido complejo que incluye óxido de zinc y al menos un óxido que contiene un elemento del Grupo 4, y que se prepara por coprecipitación. 50
Un elemento del Grupo 4 se refiere a un elemento del Grupo 4 de la tabla periódica, y ejemplos de este incluyen titanio, zirconio, hafnio, etc. El zirconio es preferible desde el punto de vista de la producción altamente selectiva de acetona.
55
Los ejemplos de óxidos complejos que se pueden usar como catalizador incluyen ZnO:ZrO2, ZnO:TiO2, CuO:ZnO:Al2O3, etc. ZnO:ZrO2 es preferible en términos de actividad catalítica y selectividad de la acetona.
La relación entre óxido de zinc y al menos un óxido que contiene un elemento del Grupo 4 no está particularmente restringida, y es preferiblemente de 50:50 a 99:1 desde el punto de vista de la actividad catalítica y selectividad de la 60 acetona, y más preferiblemente de 65:35 a 95:5. Cuando la proporción de óxido de zinc es 50 o más, se puede exhibir una actividad catalítica más alta. Cuando la proporción de óxido de zinc es 99 o menos, se puede exhibir una mayor selectividad de la acetona. Por lo tanto, es preferible una relación dentro del rango anterior.
El óxido complejo se prepara por coprecipitación. Dado que el óxido complejo que puede usarse como catalizador se 65 prepara por coprecipitación, el óxido complejo tiene una ventaja tal como la uniformidad de la composición del
catalizador o la facilidad de control sobre la preparación del catalizador.
La coprecipitación es un método de preparación comúnmente empleado como método para la producción de un complejo de óxido multicomponente, y la adición de un precipitante como una solución acuosa alcalina a una solución acuosa mixta de dos o más tipos de sales metálicas permite la precipitación uniforme del óxido complejo 5 como un sólido.
En un método específico para preparar el catalizador, se mezclan una solución acuosa de una sal de zinc soluble en agua tal como nitrato de zinc y una solución acuosa de una sal de zirconio soluble en agua tal como nitrato de zirconio para obtener una composición de óxido metálico deseada. Esta solución acuosa se añade gota a gota a una 10 solución acuosa alcalina tal como carbonato de sodio para la alcalinización, para precipitar un sólido en forma de un hidróxido. El precipitado generado se filtra, se lava con agua y se seca, y luego se calcina, como resultado de lo cual se produce el catalizador.
La cantidad de catalizador utilizada cuando se practica la invención no está particularmente restringida. Por ejemplo, 15 cuando se lleva a cabo una reacción usando un reactor de lecho fijo, el valor obtenido al dividir la cantidad (masa) de la materia prima (alcohol isopropílico) suministrada por hora por la masa del catalizador, - WHSV - está preferiblemente en un intervalo de 0,01 a 200/h, y más preferiblemente en un intervalo de 0,02 a 100/h.
La reacción de deshidrogenación en la invención puede llevarse a cabo de una manera de reacción tal como una 20 manera discontinua o una manera continua. En el caso de la manera continua, las materias primas, por ejemplo, fluyen a través de un reactor tubular lleno de un catalizador, y se recogen los productos de reacción que salen del reactor.
La temperatura de reacción para llevar a cabo la reacción de deshidrogenación puede ser habitualmente de 100 °C 25 a 500 °C, preferiblemente de 150 °C a 450 °C, y aún más preferiblemente de 200 °C a 400 °C. Hay una relación de equilibrio entre la acetona, el alcohol isopropílico y el hidrógeno. Una temperatura de reacción más alta da como resultado una composición de acetona más alta en equilibrio. Por lo tanto, es preferible una temperatura de reacción de 100 °C o superior, ya que el alcohol isopropílico no permanece en una gran cantidad a dicha temperatura. Es preferible una temperatura de reacción de 500 °C o inferior ya que las reacciones secundarias no deseadas no 30 aumentan a dicha temperatura. La presión de reacción no está particularmente restringida. Aunque la presión de reacción depende de la temperatura de reacción, la presión de reacción se fija preferiblemente entre 0,1 MPa y 1,0 MPa.
Después de recoger el producto de reacción, se puede llevar a cabo adicionalmente la purificación, etc., según 35 corresponda, de acuerdo con la necesidad. Con respecto al método de purificación de acetona, etc., pueden aplicarse métodos de purificación conocidos o bien conocidos en la técnica.
El método de producción de propileno de acuerdo con la invención incluye:
40
obtener alcohol isopropílico que contiene acetona a partir de una materia prima procedente de plantas utilizando la Escherichia coli productora de alcohol isopropílico (en lo sucesivo denominado “proceso de producción de alcohol isopropílico”); y
permitir que la acetona y el hidrógeno reaccionen entre sí en presencia de, como catalizadores, un catalizador de hidrogenación que contiene Cu y una sustancia ácida sólida en un intervalo de temperatura de reacción de 50 a 45 300 °C usando el alcohol isopropílico que contiene acetona obtenido (en lo sucesivo denominado “proceso de reacción catalítica”). En la presente memoria descriptiva, el catalizador de hidrogenación que contiene Cu también se denomina en lo sucesivo simplemente “catalizador de hidrogenación”.
En el método de producción de propileno, el alcohol isopropílico obtenido por la Escherichia coli productora de 50 alcohol isopropílico es deshidratado por la sustancia ácida sólida para producir propileno y agua.
Con respecto a la Escherichia coli productora de alcohol isopropílico, la materia prima procedente de plantas, las condiciones de producción de alcohol isopropílico, etc., empleadas en el proceso de producción de alcohol isopropílico, pueden aplicarse tal cual las descritas anteriormente para la producción de alcohol isopropílico. 55
En el proceso de reacción catalítica, la acetona y el hidrógeno se hacen reaccionar en condiciones predeterminadas utilizando el alcohol isopropílico que contiene acetona obtenido en el proceso de producción de alcohol isopropílico como materia prima y usando un catalizador de hidrogenación que contiene Cu y una sustancia ácida sólida.
60
El hidrógeno que se utilizará en el proceso de reacción catalítica puede ser hidrógeno gaseoso molecular, o puede ser hidrógeno procedente de un hidrocarburo, tal como ciclohexano, que genera hidrógeno, dependiendo de las condiciones de reacción. La cantidad de hidrógeno puede ser, en principio, cualquier cantidad que no sea inferior a una cantidad equimolar a acetona. Desde el punto de vista de la separación y la recogida, la cantidad molar de hidrógeno es preferiblemente de 1 a 10 veces la de la acetona, y más preferiblemente de 1 a 5 veces la de la 65 acetona. Por ejemplo, la cantidad de hidrógeno suministrado por unidad de tiempo con relación a la cantidad de
acetona suministrada por unidad de tiempo puede ajustarse dentro del rango descrito anteriormente. En un caso en el que se desea una tasa de conversión de acetona del 100 % o inferior, la relación de conversión se puede lograr reduciendo la cantidad de hidrógeno de la cantidad equimolar a la acetona.
En el proceso de reacción catalítica, el hidrógeno suministrado se une al átomo de oxígeno de la acetona para 5 formar agua, la cual puede descargarse desde la salida del reactor. Además, el hidrógeno en exceso de la cantidad equimolar a la acetona no se consumirá esencialmente a menos que se produzcan reacciones secundarias inesperadas.
El suministro de gas hidrógeno al reactor normalmente se lleva a cabo mediante suministro continuo, pero no está 10 particularmente limitado a ello. Con respecto a la forma de suministro de hidrógeno, el suministro puede ser un suministro intermitente que incluye suministrar gas hidrógeno al inicio de la reacción, detener después el suministro durante la reacción, y reiniciar el suministro después de un cierto período de tiempo. En el caso de una reacción en fase líquida, el gas hidrógeno puede suministrarse disolviéndolo en un disolvente.
15
Además, el hidrógeno puede recuperarse del reactor y reutilizarse. El proceso de reciclado para el hidrógeno puede incluir, por ejemplo, separar la solución de reacción y el gas de reacción entre sí en la parte posterior del reactor usando un separador de gas-líquido; separar el gas hidrógeno del gas de reacción usando una membrana de separación, etc. y volver a suministrar el gas hidrógeno a la entrada del reactor. En el caso de este proceso de reciclado, el gas hidrógeno recogido de la cabeza junto con la fracción de bajo punto de ebullición puede 20 suministrarse al reactor. La presión de hidrógeno a suministrar es generalmente igual a la presión del reactor, pero puede cambiarse, según sea apropiado, de acuerdo con el método de suministro de hidrógeno.
Cuando se pone en práctica la invención, la reacción se puede llevar a cabo en un estado diluido obtenido suministrando un disolvente o gas que es inerte a catalizadores y materiales de partida (acetona, alcohol isopropílico 25 e hidrógeno) al sistema de reacción.
La temperatura de reacción aplicada en el proceso de reacción catalítica es de 50 °C a 300 °C. Con una temperatura de reacción por debajo de 50 °C, no se obtiene una relación de conversión suficiente entre acetona o alcohol isopropílico. Con una temperatura de reacción superior a 300 °C, se producen reacciones secundarias inesperadas, 30 polimerización de propileno, etc. como resultado de lo cual no se puede mantener una relación de selección suficiente para el propileno. Desde el punto de vista de la eficiencia económica, la temperatura de reacción está preferiblemente en un intervalo de 150 °C a 250 °C, y más preferiblemente en un intervalo de 150 a 200 °C.
En un caso en el que se lleva a cabo la reacción, otros métodos y condiciones no están particularmente restringidos, 35 y, por ejemplo, se pueden emplear las condiciones y métodos mencionados a continuación. El contacto de la acetona y el alcohol isopropílico, que son materiales de partida, con el hidrógeno, y el método de suministro de hidrógeno, puede ser cualquiera de flujo en contracorriente gas-líquido o flujo en paralelo gas-líquido. Las direcciones de flujo de líquido y gas pueden ser cualquiera de: líquido descendente - gas ascendente; líquido ascendente - gas descendente; líquido ascendente - gas ascendente; y líquido descendente - gas descendente. 40 Además, la presión aplicada es preferiblemente de 0,1 atm a 500 atm y más preferiblemente de 0,5 atm a 100 atm.
Los ejemplos de la sustancia ácida sólida incluyen óxidos metálicos tales como zeolita, sílice, alúmina, sílice alúmina, γ-alúmina, óxido de titanio, óxido de zinc y óxido de zirconio, que son ácidos sólidos ordinarios. Entre estos, la zeolita es preferible desde el punto de vista de la alta actividad catalítica y la alta selectividad para el propileno. 45
Una zeolita que es favorable en vista de los tamaños moleculares del alcohol isopropílico, que se cree que está presente como materia prima y un intermedio en la reacción descrita anteriormente, y el propileno, que es la sustancia diana, se puede elegir como la zeolita para ser usada.
50
Las zeolitas que tienen poros de 10 anillos a 12 anillos son preferibles porque sus tamaños moleculares son similares a los tamaños moleculares del alcohol isopropílico y el propileno. Los ejemplos de zeolitas que tienen poros de 10 anillos a 12 anillos incluyen ferrierita, heulandita, ZSM-5, ZSM-11, ZSM-12, NU-87, theta-1, weinebeneita, zeolita-X, zeolita-Y, zeolita USY, mordenita, mordenita desaluminada, β-zeolita, MCM-22, MCM-56, etc. De estas, es preferible la β-zeolita. 55
La relación de composición de silicio a aluminio (silicio/aluminio) en la zeolita está preferiblemente en un intervalo de 2/1 a 200/1 con el fin de obtener una alta actividad, y particularmente preferiblemente en un intervalo de 5/1 a 100/1 desde los puntos de vista de la actividad y la estabilidad térmica. Además, se puede utilizar una denominada zeolita sustituida isomorfa en la que el aluminio contenido en el marco de zeolita se reemplaza por un metal distinto del 60 aluminio, como Ga, Ti, Fe, Mn o B. La zeolita que se utilizará también puede ser una zeolita modificada con iones metálicos.
La forma de la sustancia ácida sólida no está particularmente restringida, y puede ser cualquiera de las formas esféricas, cilíndricas, extruidas y trituradas. El tamaño de partícula de la misma tampoco está particularmente 65 restringido, y la sustancia ácida sólida puede seleccionarse entre aquellas que tienen tamaños en un intervalo de
0,01 mm a 100 mm, de acuerdo con el tamaño del reactor. Una sustancia ácida sólida se puede usar por separado, o se pueden usar dos o más sustancias ácidas sólidas.
Los ejemplos del catalizador de hidrogenación que contiene Cu incluyen aquellos que contienen Cu metálico, y los que contienen Cu en forma de compuestos metálicos, etc. Ejemplos de los compuestos metálicos incluyen óxido de 5 metal tal como CuO y Cu2O, cloruros metálicos como CuCl2, etc. El catalizador puede retenerse en un soporte.
Es preferible que el catalizador de hidrogenación que contiene Cu incluya además al menos un elemento seleccionado del grupo que consiste en elementos del Grupo 6, Grupo 12 y Grupo 13 en la tabla periódica desde el punto de vista de obtener mayor selectividad o mayor vida del catalizador. Los elementos preferidos del Grupo 6 10 incluyen Cr, Mo, etc., los elementos preferibles del Grupo 12 incluyen Zn, etc., y los elementos preferibles del Grupo 13 incluyen Al, In, etc. Ejemplos de tal catalizador de hidrogenación incluyen un catalizador a base de cobre tal como cobre-cromo, cobre Raney y cobre-zinc.
Al catalizador de hidrogenación que contiene Cu se puede añadir una sal de metal como PbSO4, FeCl2 o SnCl2, un 15 metal alcalino como K o Na o una sal de metal alcalino, BaSO4, o similares. Hay casos en los que la adición mejora la actividad del catalizador de hidrogenación que contiene Cu y la relación de selección para el propileno. La cantidad de sal metálica, metal alcalino o sal de metal alcalino a añadir al catalizador de hidrogenación no está particularmente restringida, y es preferiblemente de 0,01 % en masa a 10,00 % en masa, principalmente desde el punto de vista de la selectividad. 20
Ejemplos de catalizadores de hidrogenación que contienen Cu comercializados incluyen CuO-ZnO-Al2O3, CuO-Cr2O3-BaO, etc.
La forma del catalizador de hidrogenación no está particularmente restringida, y puede ser cualquiera de las formas 25 esféricas, cilíndricas, extruidas y trituradas. El tamaño de partícula del mismo tampoco está particularmente restringido, y el catalizador de hidrogenación se puede elegir habitualmente entre aquellos que tienen tamaños en un intervalo de 0,01 mm a 100 mm de acuerdo con el tamaño del reactor.
En el método de producción de propileno de acuerdo con la invención, la acetona y el hidrógeno pueden 30 suministrarse a un reactor lleno con el catalizador de hidrogenación y la sustancia ácida sólida, y la acetona y el hidrógeno pueden reaccionar entre sí. La cantidad total del catalizador de hidrogenación y la sustancia ácida sólida cargada en el reactor (en lo sucesivo también denominada “cantidad de catalizador”) no está particularmente restringida. Por ejemplo, en un caso en el que la reacción se lleva a cabo utilizando un dispositivo de flujo de lecho fijo equipado con un reactor de lecho fijo, el valor obtenido al dividir la cantidad (masa) de acetona (material de 35 partida) suministrada por unidad de tiempo por la cantidad de catalizador (peso), que es WHSV, está preferiblemente en un intervalo de 0,1 a 200/h, y más preferiblemente en un intervalo de 0,2 a 100/h.
La relación cuantitativa entre la sustancia ácida sólida y el catalizador de hidrogenación no está particularmente restringida, y es preferible que la relación, sustancia ácida sólida:catalizador de hidrogenación (relación másica), sea 40 habitualmente de 1:0,01 a 1:100, y preferiblemente de 1:0,05 a 1:50. Existe una tendencia a que una relación cuantitativa de sustancia ácida sólida:catalizador de hidrogenación de 1:(0,01 o más) proporcione una relación de conversión de acetona suficiente. También hay una tendencia a que una relación cuantitativa de sustancia ácida sólida: catalizador de hidrogenación de 1:(100 o menos) permita que la reacción de deshidratación proceda adecuadamente para proporcionar un rendimiento de propileno suficiente. 45
En un caso en el que la actividad de los catalizadores disminuye después de que la reacción se continúa durante un cierto período de tiempo, la regeneración puede llevarse a cabo usando métodos conocidos, recuperando de este modo la actividad del catalizador de hidrogenación y la sustancia ácida sólida.
50
En la invención, los dos componentes, la sustancia ácida sólida y el catalizador de hidrogenación, pueden usarse como catalizadores. Los modos de uso de los catalizadores no están particularmente restringidos. Por ejemplo, la sustancia ácida sólida, que es un componente de catalizador ácido, y el catalizador de hidrogenación pueden mezclarse físicamente en el nivel de partículas de catalizador de un tamaño de un centímetro, o la sustancia ácida sólida y el catalizador de hidrogenación pueden estar finamente divididos, mezclados y a continuación se vuelve a 55 formar en partículas de catalizador de un tamaño de un centímetro, o el catalizador de hidrogenación puede retenerse en la sustancia ácida sólida que sirve como vehículo, o la sustancia ácida sólida puede retenerse en el catalizador de hidrogenación que sirve como un vehículo. En otra alternativa, el catalizador de hidrogenación y la sustancia ácida sólida se pueden usar individualmente sin estar, por ejemplo, mezclados entre sí.
60
En particular, desde el punto de vista de la alta actividad, alta selectividad y disponibilidad industrial, es preferible usar el catalizador de hidrogenación y usar β-zeolita como zeolita para constituir la sustancia ácida sólida. Por ejemplo, el catalizador de hidrogenación se puede retener en zeolita. Los ejemplos de métodos de preparación para los mismos incluyen: un método que incluye impregnar zeolita con una solución acuosa de una sal de nitrato de Cu y calcinar el resultante; un método que incluye añadir un complejo en el cual las moléculas orgánicas llamadas ligando 65 se unen al Cu con el fin de proporcionar al Cu una solubilidad en un disolvente orgánico, a un solvente orgánico para
preparar una solución, impregnar la zeolita con la solución y calcinar el resultante; un método que incluye permitir que el complejo se retenga sobre la zeolita mediante, por ejemplo, deposición de vapor, considerando el hecho de que algunos complejos se pueden vaporizar al vacío; etc.
El catalizador de hidrogenación se puede retener en un vehículo distinto de la zeolita. Ejemplos de vehículos 5 capaces de retener el catalizador de hidrogenación incluyen sílice, alúmina, sílice-alúmina, titania, magnesia, sílice-magnesia, zirconia, óxido de zinc, carbono (carbón activado), arcilla ácida, tierra de diatomeas, etc. De estos, es preferible seleccionar al menos uno seleccionado del grupo que consiste en sílice, alúmina, sílice-alúmina, titania, magnesia, sílice-magnesia, zirconia, óxido de zinc y carbono (carbón activado), desde el punto de vista de una mayor actividad y una mayor selectividad, 10
Los ejemplos del reactor usado en la invención incluyen un reactor de lecho fijo, un reactor de lecho fluidizado, etc. El reactor de lecho fijo es preferible desde el punto de vista de evitar el desgaste y la desintegración de los catalizadores.
15
En la invención, los métodos para añadir el catalizador de hidrogenación y la sustancia ácida sólida al reactor no están particularmente restringidos. Cuando se usa un reactor de lecho fijo como reactor, el método para añadir el catalizador de hidrogenación y la sustancia ácida sólida puede afectar significativamente al rendimiento de la reacción. Como se describió anteriormente, se supone que la hidrogenación y una reacción de deshidratación ocurren gradualmente en la invención. Por lo tanto, un método que incluye la adición secuencial de especies de 20 catalizador apropiadas para las etapas respectivas de la reacción en el reactor es un método de llenado preferible, en términos de uso eficiente de los catalizadores y eliminación de reacciones secundarias no deseadas.
Es un comportamiento frecuentemente observado en reacciones químicas generales que se produzcan reacciones secundarias inesperadas no observadas a baja presión de hidrógeno o a baja temperatura de reacción, 25 particularmente en el caso de aumentar la presión de hidrógeno o la temperatura de reacción para aumentar la velocidad de reacción. En tal caso, el método para llenar los catalizadores, en particular, tiene la posibilidad de afectar significativamente al rendimiento de la reacción.
Por consiguiente, las especies de catalizador apropiadas para las etapas respectivas de la reacción se pueden 30 añadir secuencialmente al reactor, o el catalizador de hidrogenación y la sustancia ácida sólida se pueden añadir al reactor de manera que la relación de mezcla del catalizador de hidrogenación y la sustancia ácida sólida formen un gradiente Los ejemplos de métodos para añadir el catalizador de hidrogenación y la sustancia ácida sólida al reactor incluyen (1) un método en el que el catalizador de hidrogenación y la sustancia ácida sólida se mezclan y añaden al reactor; (2) un método en el que la adición al reactor se lleva a cabo para formar una capa formada por el catalizador 35 de hidrogenación (en el lado aguas arriba, es decir, el lado de entrada) y una capa formada por la sustancia ácida sólida (en el lado aguas abajo, es decir, el lado de salida); (3) un método en el que se añade al reactor una sustancia ácida sólida sobre la que se retiene el catalizador de hidrogenación; (4) un método en el que la adición al reactor se lleva a cabo para formar una capa formada por el catalizador de hidrogenación (en el lado aguas arriba, es decir, el lado de entrada) y una capa formada por la sustancia ácida sólida y el catalizador de hidrogenación (en el lado 40 aguas abajo, es decir, el lado de salida); (5) un método en el que la adición al reactor se lleva a cabo para formar una capa formada por el catalizador de hidrogenación (en el lado aguas arriba, es decir, el lado de entrada) y una capa formada por una sustancia ácida sólida sobre la que el catalizador de hidrogenación se retiene (en el lado de aguas abajo, es decir, el lado de salida); (6) un método en el que la adición al reactor se lleva a cabo para formar una capa formada por el catalizador de hidrogenación y la sustancia ácida sólida (en el lado aguas arriba, es decir, 45 el lado de entrada) y una capa formada por la sustancia ácida sólida (en el lado aguas abajo, es decir, el lado de salida); y (7) un método en el que la adición al reactor se lleva a cabo para formar una capa formada por una sustancia ácida sólida sobre la que se retiene el catalizador de hidrogenación (en el lado aguas arriba, es decir, el lado de entrada) y una capa formada por la sustancia ácida sólida (en el lado aguas abajo, es decir, el lado de salida). El lado de aguas arriba se refiere al lado de entrada del reactor, es decir, una capa a través de la cual pasan 50 los materiales de partida en la etapa anterior de la reacción, y el lado de aguas abajo se refiere al lado de salida del reactor, es decir, una capa a través de la cual los materiales de partida, los intermedios y los productos de reacción pasan en la última etapa de la reacción. Los materiales de partida son acetona e hidrógeno. En un caso en el que la acetona y el hidrógeno se suministran al reactor por flujo en contracorriente gas-líquido, el lado aguas arriba (lado de entrada) significa una capa a través de la cual la acetona pasa en la etapa anterior de la reacción. 55
Para mantener la cantidad de producción de propileno, se puede adoptar un método de tiovivo en el que dos o tres reactores se disponen en paralelo y, mientras se lleva a cabo la regeneración de los catalizadores en uno de los reactores, se lleva a cabo la reacción en el uno o dos reactores restantes. Además, en un caso en el que hay tres reactores, se puede usar un método en el que los dos reactores restantes están conectados en serie, reduciendo así 60 la variación en la cantidad de producción. En un caso en el que la invención se lleva a cabo utilizando un sistema de reacción de flujo de lecho fluidizado o un sistema de reacción de lecho móvil, se puede mantener una actividad constante mediante la eliminación continua o intermitente de una parte o la totalidad de los catalizadores y la reposición de una cantidad equivalente de los catalizadores.
65
Ejemplos
Los ejemplos de la invención se describen a continuación. Sin embargo, la invención no está de ninguna manera limitada a estos ejemplos. Como se usa en la presente memoria, “%” se basa en la masa a menos que se especifique lo contrario. 5
(Preparación de la variante productora de alcohol isopropílico)
La lista de variantes de Escherichia coli y los plásmidos usados en los presentes ejemplos se muestran en la Tabla 1 y en la Tabla 2. 10
Tabla 1
Plásmido
Característica Origen de la descripción referenciada
pBRgapP
pBR322, promotor que contiene GADPH Ejemplo 2
pla
pBRgapP-lPAdh-adc Ejemplo 2
plaz
pBRgapP-lPAdh-adc-zwf Ejemplo 2
plaaa
pBRgapP-lPAdh-adc-atoB-atoD-atoA Ejemplo 4
pTH18cs1
pBR322, promotor que contiene GADPH GenBank AB019610
Tabla 2
Escherichia coli
Característica Origen de la descripción referenciada
B
tipo silvestre ATCC11303
MG1655
tipo silvestre ATCC
B::atoDAB
cepa B, el promotor para atoDAB se ha sustituido por el promotor GADPH Ejemplo 1
BΔpgi
cepa B, Δpgi Ejemplo 3
B::atoDABΔpgi
cepa B, el promotor para atoDAB se ha sustituido por el promotor GADPH, Δpgi Ejemplo 5
B::atoDABΔgntR
cepa B, el promotor para atoDAB se ha sustituido por el promotor GADPH, ΔgntR Ejemplo 6
B::atoDABΔpgiΔgntR
cepa B, el promotor para atoDAB se ha sustituido por el promotor GADPH, Δpgi, ΔgntR Ejemplo 9
B::atoDABΔgnd
cepa B, el promotor para atoDAB se ha sustituido por el promotor GADPH, Δgnd Ejemplo 12
B::atoDABΔpgiΔgnd
cepa B, el promotor para atoDAB se ha sustituido por el promotor GADPH, Δpgi, Δgnd Ejemplo 15
B::atoDABΔgndΔgntR
cepa B, el promotor para atoDAB se ha sustituido por el promotor GADPH, Δgnd, ΔgntR Ejemplo 18
B::atoDABΔpgiΔgndΔgntR
cepa B, el promotor para atoDAB se ha sustituido por el promotor GADPH, Δpgi, Δgnd, ΔgntR Ejemplo 21
15
[Ejemplo 1]
<Preparación de la variante B::atoDAB>
Se conoce la secuencia de bases completa del ADN genómico de la cepa de Escherichia coli MG1655 (número de 20 acceso de GenBank U00096) y también se ha descrito la secuencia de bases de un gen que codifica la subunidad α de la CoA transferasa (en lo sucesivo abreviada a veces como “atoD”) de la cepa de Escherichia coli MG1655. Es decir, atoD está descrita en 2321469 a 2322131 de la secuencia genómica de la cepa de Escherichia coli MG1655, que se describe en el número de acceso GenBank U00096.
25
La secuencia promotora de la gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa (en lo sucesivo denominada a veces “GAPDH”) de Escherichia coli, que está descrita en 397 a 440 en la información de la secuencia de bases con un número de acceso de GenBank X02662, puede usarse como la secuencia de bases de un promotor necesario para expresar el gen mencionado anteriormente. Con el fin de obtener el promotor GAPDH, se llevó a cabo la amplificación por un método de PCR usando el ADN genómico de la cepa de Escherichia coli MG1655 como molde 30 y utilizando cgctcaattgcaatgattgacacgattccg (SEQ ID NO: 1) y acagaattcgctatttgttagtgaataaaagg (SEQ ID NO: 2), y el fragmento de ADN obtenido se digirió con las enzimas de restricción MfeI y EcoRI, obteniendo de este modo un fragmento de ADN de aproximadamente 100 pb que codifica el promotor GAPDH. Se mezcló el fragmento de ADN obtenido y un fragmento obtenido digiriendo el plásmido pUC19 (número de acceso de GenBank X02514) con una enzima de restricción EcoRI seguido de tratamiento con fosfatasa alcalina, y los fragmentos mezclados se ligaron 35 usando una ligasa. A continuación, se transformaron las células competentes de la cepa DH5α de Escherichia coli (Toyobo Co., Ltd. DNA-903) con el producto de ligación y se obtuvieron los transformantes que crecieron en una
placa de agar LB que contenía 50 μg/ml de ampicilina. Diez de las colonias obtenidas se cultivaron individualmente a 37 °C durante la noche en un medio líquido LB que contenía 50 μg/ml de ampicilina, y se recuperaron los plásmidos, y se seleccionaron los plásmidos en los que se cortó el promotor GAPDH cuando se digirieron con las enzimas de restricción EcoRI y KpnI. Además, se verificó la secuencia de ADN de la misma, y un plásmido en el que el promotor GAPDH se insertó apropiadamente se denominó pUCgapP. El pUCgapP obtenido se digirió con las enzimas de 5 restricción EcoRI y KpnI.
Además, para obtener atoD, se llevó a cabo la amplificación por un método de PCR utilizando el ADN genómico de la cepa de Escherichia coli MG1655 como molde y usando cgaattcgctggtggaacatatgaaaacaaaattgatgacattacaagac (SEQ ID NO: 3) y gcggtaccttatttgctctcctgtgaaacg (SEQ ID NO: 4), y el fragmento de ADN obtenido se digirió con las 10 enzimas de restricción EcoRI y KpnI, obteniendo de este modo un fragmento atoD de aproximadamente 690 pb. Este fragmento de ADN se mezcló con pUCgapP que se había digerido previamente con las enzimas de restricción EcoRI y KpnI. Los fragmentos mezclados se ligaron usando una ligasa. A continuación, se transformaron células competentes de la cepa de Escherichia coli DH5α (Toyobo Co., Ltd. DNA-903) con el producto de ligación, y se obtuvieron transformantes que crecieron en una placa de agar LB que contenía 50 μg/ml de ampicilina. Se recuperó 15 un plásmido de las células bacterianas obtenidas, y se confirmó que atoD se había insertado adecuadamente. El plásmido obtenido se denominó pGAPatoD.
Aquí, la cepa de Escherichia coli MG1655 está disponible en la Colección Americana de Cultivos Tipo (American Type Culture Collection). 20
Como se describió anteriormente, también se ha descrito la secuencia de bases de atoD en el ADN genómico de la cepa de Escherichia coli MG1655. La PCR se llevó a cabo utilizando el ADN genómico de la cepa de Escherichia coli MG1655 como molde y usando gctctagatgctgaaatccactagtcttgtc (SEQ ID NO: 5) y tactgcagcgttccagcaccttatcaacc (SEQ ID NO: 6), las cuales se prepararon basándose en la información génica de la región flanqueante 5' de atoD de 25 la cepa de Escherichia coli MG1655, como resultado de lo cual se amplificó un fragmento de ADN de aproximadamente 1,1 kpb.
Además, la PCR se llevó a cabo utilizando el vector de expresión pGAPatoD preparado anteriormente como molde y usando ggtctagagcaatgattgacacgattccg (SEQ ID NO: 7) preparada basándose en la información de secuencia del 30 promotor GAPDH de la cepa de Escherichia coli MG1655 y un cebador de SEQ ID NO: 4 preparado basándose en la información de secuencia de atoD de la cepa de Escherichia coli MG1655, como resultado de lo cual se obtuvo un fragmento de ADN de aproximadamente 790 pb que tiene el promotor GAPDH y atoD.
Los fragmentos obtenidos de los anteriores se digirieron con las enzimas de restricción PstI y XbaI, y XbaI y KpnI, 35 respectivamente, y los fragmentos resultantes se mezclaron con un fragmento obtenido por digestión de un plásmido pTH18cs1 sensible a la temperatura (número de acceso de GenBank AB019610) [Hashimoto-Gotoh, T., Gene, 241, 185-191 (2000))] con PstI y KpnI, y los fragmentos mezclados se ligaron usando una ligasa. A continuación, se transformó la cepa DH5α con el producto de ligación, y se obtuvieron transformantes que crecieron en una placa de agar LB que contenía 10 μg/ml de cloranfenicol a 30 °C. Las colonias obtenidas se cultivaron a 30 °C durante la 40 noche en un medio líquido LB que contenía 10 μg/ml de cloranfenicol, y se recuperó un plásmido a partir de las células bacterianas obtenidas. La cepa de Escherichia coli B (ATCC11303) se transformó con el plásmido y se cultivó a 30 °C durante la noche en una placa de agar LB que contenía 10 μg/ml de cloranfenicol, como resultado de lo cual se obtuvieron los transformantes. Los transformantes obtenidos se inocularon en un medio líquido LB que contenía 10 μg/ml de cloranfenicol y se cultivaron a 30 °C durante la noche. Las células bacterianas cultivadas 45 obtenidas se aplicaron a una placa de agar LB que contenía 10 μg/ml de cloranfenicol, y se cultivaron a 42 °C, como resultado de lo cual se obtuvieron colonias. Las colonias obtenidas se cultivaron a 30 °C durante 2 horas en un medio líquido LB exento de antibióticos, y se aplicaron a una placa de agar LB exenta de antibióticos, como resultado de lo cual se obtuvieron colonias que crecieron a 42 °C.
50
De las colonias que aparecieron, se seleccionaron aleatoriamente 100 colonias, y cada una creció individualmente en una placa de agar LB exenta de antibióticos y se seleccionó una placa de agar LB que contenía 10 μg/ml de cloranfenicol, y se seleccionaron clones sensibles al cloranfenicol. Además, se amplificó un fragmento de aproximadamente 790 pb que contenía el promotor GAPDH y atoD, por PCR, a partir del ADN cromosómico de estos clones, y se seleccionó una variante en la que se reemplazó una región promotora atoD por el promotor 55 GAPDH. Así, un clon que satisface las condiciones anteriores se llamó Escherichia coli B::atoDAB.
Aquí, la cepa de Escherichia coli B (ATCC11303) está disponible en la Colección Americana de Cultivos Tipo (American Type Culture Collection), que es un banco de células, microorganismos y genes.
60
[Ejemplo 2]
<Preparación del plásmido pIaz>
La acetoacetato descarboxilasa de bacterias del género Clostridium se describe en el número de acceso GenBank 65 M55392, y la alcohol isopropílico deshidrogenasa del género Clostridium se describe en el número de acceso de
GenBank AF157307.
La secuencia promotora de la gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa (en lo sucesivo algunas veces denominada “GAPDH”) de Escherichia coli, que se describe en 397 a 440 en la información de la secuencia de bases con un número de acceso de GenBank X02662, se puede usar como la secuencia de bases de un promotor necesario para 5 expresar el grupo de genes mencionado anteriormente.
Con el fin de obtener el promotor GAPDH, la amplificación por un método de PCR se llevó a cabo usando el ADN genómico de la cepa de Escherichia coli MG1655 como molde y usando cgagctacatatgcaatgattgacacgattccg (SEQ ID NO: 18) y cgcgcgcatgctatttgttagtgaataaaagg (SEQ ID NO: 19), y el fragmento de ADN obtenido se digirió con las 10 enzimas de restricción NdeI y SphI, como resultado de lo cual se obtuvo un fragmento de ADN de aproximadamente 110 pb correspondiente al promotor GAPDH. El fragmento de ADN obtenido se mezcló con un fragmento obtenido digiriendo el plásmido pBR322 (número de acceso de GenBank J01749) con las enzimas de restricción NdeI y SphI, y los fragmentos mezclados se ligaron usando una ligasa. A continuación, las células competentes de la cepa de Escherichia coli DH5α (Toyobo Co., Ltd. DNA-903) se transformaron con el producto de ligación, y se obtuvieron 15 transformantes que crecieron en una placa de agar LB que contenía 50 μg/ml de ampicilina. Las colonias obtenidas se cultivaron a 37 °C durante la noche en un medio líquido LB que contenía 50 μg/ml de ampicilina y el plásmido pBRgapP se recuperó de las células bacterianas obtenidas.
Con el fin de obtener el gen de la alcohol isopropílico deshidrogenasa, se llevó a cabo la amplificación por un 20 método de PCR usando el ADN genómico de Clostridium beijerinckii NRRL B-593 como molde y usando aatatgcatgctggtggaacatatgaaaggttttgcaatgctagg (SEQ ID NO: 8) y gcggatccttataatataactactgctttaattaagtc (SEQ ID NO: 9), y el fragmento de ADN obtenido se digirió con las enzimas de restricción SphI y BamHI, como resultado de lo cual se obtuvo un fragmento de alcohol isopropílico deshidrogenasa de aproximadamente 1,1 kpb. El fragmento de ADN obtenido se mezcló con un fragmento obtenido digiriendo el plásmido pBRgapP con las enzimas de 25 restricción SphI y BamHI, y los fragmentos mezclados se ligaron usando una ligasa. A continuación, las células competentes de la cepa de Escherichia coli DH5α (Toyobo Co., Ltd. DNA-903) se transformaron con el producto de ligación, y se obtuvieron transformantes que crecieron en una placa de agar LB que contenía 50 μg/ml de ampicilina. Las colonias obtenidas se cultivaron a 37ºC durante la noche en un medio líquido LB que contenía 50 μg/ml de ampicilina, y se recuperaron plásmidos de las células bacterianas obtenidas, y se confirmó que IPAdh se había 30 insertado adecuadamente. El plásmido obtenido se denominó pGAP-IPAdh.
Con el fin de obtener el gen de la acetoacetato descarboxilasa, se llevó a cabo la amplificación por un método de PCR usando el ADN genómico de Clostridium acetobutylicum ATCC824 como molde y usando caggatccgctggtggaacatatgttaaaggatgaagtaattaaacaaattagc (SEQ ID NO: 10) y 35 ggaattcggtaccttacttaagataatcatatataacttcagc (SEQ ID NO: 11), y el fragmento de ADN obtenido se digirió con las enzimas de restricción BamHI y EcoRI, como resultado de lo cual se obtuvo un fragmento de acetoacetato descarboxilasa de aproximadamente 700 pb. El fragmento de ADN obtenido se mezcló con un fragmento obtenido digiriendo el plásmido pGAP-IPAdh preparado anteriormente con las enzimas de restricción BamHI y EcoRI, y los fragmentos mezclados se ligaron usando una ligasa. A continuación, células competentes de la cepa de Escherichia 40 coli DH5α (Toyobo Co., Ltd. DNA-903) se transformaron con el producto de ligación, y se obtuvieron transformantes que crecieron en una placa de agar LB que contenía 50 μg/ml de ampicilina. Las colonias obtenidas se cultivaron a 37 °C durante la noche en un medio líquido LB que contenía 50 µg/ml de ampicilina, y se recuperaron plásmidos de las células bacterianas obtenidas, y se confirmó que adc se había insertado correctamente. El plásmido obtenido se denominó pIa. 45
Con el fin de obtener el gen de la glucosa-6-fosfato-1-deshidrogenasa (zwf), se llevó a cabo la amplificación por un método de PCR utilizando el ADN genómico de la cepa de Escherichia coli B (número de acceso GenBank CP000819) como molde y usando caggatcccggagaaagtcttatggcggtaacgcaaacagcccagg (SEQ ID NO: 12) y cgtctagattactcaaactcattccaggaacgac (SEQ ID NO: 13), y el fragmento de ADN obtenido se digirió con las enzimas de 50 restricción BamHI y XbaI, como resultado de lo cual se obtuvo un fragmento de glucosa-6-fosfato-1-deshidrogenasa de aproximadamente 1500 pb. El fragmento de ADN obtenido se mezcló con un fragmento obtenido digiriendo el plásmido pla preparado anteriormente con las enzimas de restricción BamHI y XbaI, y los fragmentos mezclados se ligaron usando una ligasa. A continuación, las células competentes de la cepa de Escherichia coli DH5α (Toyobo Co., Ltd. DNA-903) se transformaron con el producto de ligación, y se obtuvieron transformantes que crecieron en 55 una placa de agar LB que contenía 50 μg/ml de ampicilina. Las colonias obtenidas se cultivaron a 37 °C durante la noche en un medio líquido LB que contenía 50 μg/ml de ampicilina, y este plásmido se denominó pIaz.
Las células competentes de Escherichia coli B::atoDAB preparadas en el Ejemplo 1 se transformaron con el plásmido pIaz, y se cultivaron a 37 °C durante la noche en un caldo LB, placa de agar Miller que contenía 50 μg/ml 60 de ampicilina, como resultado de lo cual se obtuvo Escherichia coli pIaz/B::atoDAB.
[Ejemplo 3]
<Preparación de la variante Δpgi de la cepa de Escherichia coli B> 65
Se conoce toda la secuencia de bases del ADN genómico de la cepa de Escherichia coli MG1655 (número de acceso GenBank U00096), y también está descrita la secuencia de bases de un gen que codifica la fosfoglucosa isomerasa (en lo sucesivo denominada a veces “pgi”) de Escherichia coli (número de acceso de GenBank X15196). Con el fin de clonar una región que flanquea la secuencia de bases del gen que codifica pgi (1.650 pb), se sintetizaron cuatro tipos de cebadores oligonucleotídicos representados por caggaattcgctatatctggctctgcacg (SEQ ID 5 NO: 14), cagtctagagcaatactcttctgattttgag (SEQ ID NO: 15), cagtctagatcatcgtcgatatgtaggcc (SEQ ID NO: 16) y gacctgcagatcatccgtcagctgtacgc (SEQ ID NO: 17). El cebador de SEQ ID NO: 14 tiene un sitio de reconocimiento EcoRI en el lado 5' terminal del mismo, cada uno de los cebadores de SEQ ID NOs: 15 y 16 tiene un sitio de reconocimiento XbaI en el lado 5' terminal del mismo, y el cebador de SEQ ID NO: 17 tiene un sitio de reconocimiento PstI en el lado 5'-terminal del mismo. 10
Se preparó el ADN genómico de la cepa de Escherichia coli MG1655 (ATCC700926) y se llevó a cabo la PCR usando el ADN genómico obtenido como molde y usando un par de cebadores de SEQ ID NO: 14 y SEQ ID NO: 15, como resultado de lo cual se amplificó un fragmento de ADN de aproximadamente 1,0 kb (en lo sucesivo denominado en ocasiones “fragmento pgi-L”). Además, la PCR también se llevó a cabo usando un par de cebadores 15 de SEQ ID NO: 16 y SEQ ID NO: 17, como resultado de lo cual se amplificó un fragmento de ADN de aproximadamente 1,0 kb (en lo sucesivo denominado en ocasiones “fragmento pgi-R”). Estos fragmentos de ADN se separaron mediante electroforesis en agarosa y se recogieron. El fragmento pgi-L se digirió con EcoRI y XbaI, y el fragmento pgi-R se digirió con XbaI y PstI. Los dos tipos de fragmentos digeridos y un fragmento obtenido digiriendo un plásmido pTH18cs1 sensible a la temperatura (número de acceso de GenBank AB019610) con EcoRI y PstI se 20 mezclaron y se dejaron reaccionar usando ADN ligasa de T4. A continuación, las células competentes de Escherichia coli DH5α (fabricado por Toyobo Co., Ltd.) se transformaron con el producto de ligación, y se obtuvieron transformantes que crecieron en una placa de agar LB que contenía 10 μg/ml de cloranfenicol a 30 °C. Los plásmidos se recuperaron de los transformantes obtenidos y se confirmó que los dos fragmentos, un fragmento de región flanqueante en dirección 5' y un fragmento de región flanqueante en dirección 3' del gen que codifica pgi, se 25 habían insertado adecuadamente en pTH18cs1. El plásmido obtenido se digirió con XbaI, y luego se sometió a tratamiento de generación de extremos romos con ADN polimerasa de T4. El fragmento de ADN resultante se mezcló con un fragmento de ADN obtenido digiriendo el plásmido pUC4K (número de acceso de GenBank X06404) (Pharmacia) con EcoRI y sometiendo adicionalmente el gen resistente a la kanamicina al tratamiento de generación de extremos romos con una ADN polimerasa de T4, y los fragmentos mezclados se ligaron usando ADN ligasa de 30 T4. Posteriormente, células competentes de Escherichia coli DH5α se transformaron con el producto de ligación, y se obtuvieron transformantes que crecieron en una placa de agar LB que contenía 10 μg/ml de cloranfenicol y 50 μg/ml de kanamicina a 30 °C. Los plásmidos se recuperaron de los transformantes obtenidos, y se confirmó que el gen resistente a kanamicina se había insertado adecuadamente entre el fragmento de la región flanqueante en dirección 5' y el fragmento de la región flanqueante en dirección 3' del gen que codifica pgi. El plásmido obtenido se 35 denominó pTH18cs1-pgi.
La cepa de Escherichia coli B (ATCC11303) se transformó con el plásmido pTH18cs1-pgi así obtenido, y se cultivó a 30 °C durante la noche en una placa de agar LB que contenía 10 μg/ml de cloranfenicol y 50 μg/ml de kanamicina, como resultado de lo cual se obtuvieron transformantes. Los transformantes obtenidos se inocularon en un medio 40 líquido LB que contenía 50 μg/ml de kanamicina, y se cultivaron a 30 °C durante la noche. A continuación, se aplicó parte de este líquido de cultivo a una placa de agar LB que contenía 50 μg/ml de kanamicina, como resultado de lo cual se obtuvieron colonias que crecieron a 42 °C. Las colonias obtenidas se cultivaron a 30 °C durante 24 horas en un medio líquido LB que contenía 50 μg/ml de kanamicina, y se aplicaron a una placa de agar LB que contenía 50 μg/ml de kanamicina, como resultado de lo cual se obtuvieron colonias que crecieron a 42 °C. 45
De las colonias que aparecieron, se seleccionaron aleatoriamente 100 colonias, y cada una creció individualmente en una placa de agar LB que contenía 50 μg/ml de kanamicina y una placa de agar LB que contenía 10 μg/ml de cloranfenicol, y se seleccionaron los clones sensibles al cloranfenicol que crecieron solo en la placa de agar LB que contenía kanamicina. Además, los ADN cromosómicos de estos clones diana se amplificaron mediante PCR, y se 50 seleccionó una variante de la cual se pudo amplificar un fragmento de aproximadamente 3,3 kpb que indica la sustitución del gen pgi con el gen resistente a la kanamicina. La variante obtenida se denominó variante de deleción del gen pgi de la cepa B (en lo sucesivo abreviado en ocasiones como “variante BΔpgi”).
Aquí, la cepa de Escherichia coli MG1655 y la cepa de Escherichia coli B están disponibles en la Colección 55 Americana de Cultivos Tipo (American Type Culture Collection).
[Ejemplo 4]
<Preparación de la variante pIaaa/BΔpgi> 60
Las secuencias de aminoácidos y las secuencias de bases de genes de tiolasa y CoA transferasa de Escherichia coli ya han sido publicadas. Es decir, el gen que codifica la tiolasa se describe en 2324131 a 2325315 de la secuencia genómica de la cepa de Escherichia coli MG1655 descrita en el número de acceso de GenBank U00096. Además, el gen que codifica la CoA transferasa se describe en 2321469 a 2322781 de la secuencia genómica de la 65 cepa de Escherichia coli MG1655 antes mencionada. La expresión de estos genes junto con el gen de la
acetoacetato descarboxilasa descrito más adelante y el gen de la alcohol isopropílico deshidrogenasa de las bacterias del género Clostridium permite la producción de alcohol isopropílico.
Con el fin de obtener el gen de la alcohol isopropílico deshidrogenasa, se llevó a cabo la amplificación por un método de PCR usando el ADN genómico de Clostridium beijerinckii NRRL B-593 como molde y usando 5 aatatgcatgctggtggaacatatgaaaggttttgcaatgctagg (SEQ ID NO: 20) y gcggatccggtaccttataatataactactgctttaattaagtc (SEQ ID NO: 21), y el fragmento de ADN obtenido se digirió con las enzimas de restricción SphI y BamHI, como resultado de lo cual se obtuvo un fragmento de alcohol isopropílico deshidrogenasa de aproximadamente 1,1 kpb. El fragmento de ADN obtenido se mezcló con un fragmento obtenido digiriendo el plásmido pBRgapP preparado en el Ejemplo 2 con las enzimas de restricción SphI y BamHI, y los fragmentos mezclados se ligaron usando una ligasa. A 10 continuación, células competentes de la cepa de Escherichia coli DH5α (Toyobo Co., Ltd. DNA-903) se transformaron con el producto de ligación, y se obtuvieron transformantes que crecieron en una placa de agar LB que contenía 50 μg/ml de ampicilina. Las colonias obtenidas se cultivaron a 37 °C durante la noche en un medio líquido LB que contenía 50 μg/ml de ampicilina y el plásmido pGAP-IPAdh se recuperó de las células bacterianas obtenidas. 15
Para obtener el gen de tiolasa de Escherichia coli, se llevó a cabo la amplificación por un método de PCR utilizando el ADN genómico de la cepa de Escherichia coli MG1655 como molde y usando atggatccgctggtggaacatatgaaaaattgtgtcatcgtcag (SEQ ID NO: 22) y gcagaagcttgtctagattaattcaaccgttcaatcaccatc (SEQ ID NO: 23), y el fragmento de ADN obtenido se digirió con las enzimas de restricción BamHI y HindIII, como 20 resultado de lo cual se obtuvo un fragmento de tiolasa de aproximadamente 1,2 kpb. El fragmento de ADN obtenido se mezcló con un fragmento obtenido digiriendo el plásmido pGAP-IPAdh preparado anteriormente con las enzimas de restricción BamHI y HindIII, y los fragmentos mezclados se ligaron usando una ligasa. A continuación, las células competentes de la cepa de Escherichia coli DH5α (Toyobo Co., Ltd. DNA-903) se transformaron con el producto de ligación, y se obtuvieron transformantes que crecieron en una placa de agar LB que contenía 50 μg/ml de ampicilina. 25 Las colonias obtenidas se cultivaron a 37 °C durante la noche en un medio líquido LB que contenía 50 μg/ml de ampicilina, y el plásmido pGAP-IPAdh-atoB se recuperó de las células bacterianas obtenidas.
Para obtener el gen de la CoA transferasa de Escherichia coli, se llevó a cabo la amplificación por un método de PCR utilizando el ADN genómico de la cepa de Escherichia coli MG1655 como molde y usando 30 gctctagagctggtggaacatatgaaaacaaaattgatgacattacaagac (SEQ ID NO: 24) y tagcaagcttctactcgagttatttgctctcctgtgaaacg (SEQ ID NO: 25), y el fragmento de ADN obtenido se digirió con las enzimas de restricción XbaI y HindIII, como resultado de lo cual se obtuvo un fragmento de la subunidad α de la CoA transferasa de aproximadamente 600 pb. El fragmento de ADN obtenido se mezcló con un fragmento obtenido digiriendo el plásmido pGAP-IPAdh-atoB preparado anteriormente con las enzimas de restricción XbaI y HindIII, y los 35 fragmentos mezclados se ligaron usando una ligasa. A continuación, las células competentes de la cepa de Escherichia coli DH5α (Toyobo Co., Ltd. DNA-903) se transformaron con el producto de ligación, y se obtuvieron transformantes que crecieron en una placa de agar LB que contenía 50 μg/ml de ampicilina. Las colonias obtenidas se cultivaron a 37 °C durante la noche en un medio líquido LB que contenía 50 μg/ml de ampicilina, y el plásmido pGAP-IPAdh-atoB-atoD se recuperó de las células bacterianas obtenidas. 40
La amplificación por un método de PCR se llevó a cabo usando el ADN genómico de la cepa de Escherichia coli MG1655 como molde y usando aagtctcgagctggtggaacatatggatgcgaaacaacgtattg (SEQ ID NO: 26) y ggccaagcttcataaatcaccccgttgc (SEQ ID NO: 27) y el fragmento de ADN obtenido se digirió con las enzimas de restricción XhoI y HindIII, como resultado de lo cual se obtuvo un fragmento de la subunidad β de la CoA transferasa 45 de aproximadamente 600 pb se obtuvo. El fragmento de ADN obtenido se mezcló con un fragmento obtenido digiriendo el plásmido pGAP-IPAdh-atoB-atoD preparado anteriormente con las enzimas de restricción XhoI y HindIII, y los fragmentos mixtos se ligaron usando una ligasa. A continuación, células competentes de la cepa de Escherichia coli DH5α (Toyobo Co., Ltd. DNA-903) se transformaron con el producto de ligación, y se obtuvieron transformantes que crecieron en una placa de agar LB que contenía 50 μg/ml de ampicilina. Las colonias obtenidas 50 se cultivaron a 37 °C durante la noche en un medio líquido LB que contenía 50 μg/ml de ampicilina, y el plásmido pGAP-IPAdh-atoB-atoD-atoA se recuperó de las células bacterianas obtenidas.
Con el fin de obtener el gen de la acetoacetato descarboxilasa, se llevó a cabo la amplificación por un método de PCR usando el ADN genómico de Clostridium acetobutylicum ATCC824 como molde y usando 55 caggtaccgctggtggaacatatgttaaaggatgaagtaattaaacaaattagc (SEQ ID NO: 28) y gcggatccttacttaagataatcatatataacttcagc (SEQ ID NO: 29) y el fragmento de ADN obtenido se digirió con las enzimas de restricción KpnI y BamHI, como resultado de lo cual se obtuvo un fragmento de acetoacetato descarboxilasa de aproximadamente 700 pb. El fragmento de ADN obtenido se mezcló con un fragmento obtenido digiriendo el plásmido pGAP-IPAdh-atoB-atoD-atoA preparado anteriormente con las enzimas de restricción KpnI y BamHI, y los 60 fragmentos mixtos se ligaron usando una ligasa. A continuación, las células competentes de la cepa de Escherichia coli DH5α (Toyobo Co., Ltd. DNA-903) se transformaron con el producto de ligación, y se obtuvieron transformantes que crecieron en una placa de agar LB que contenía 50 μg/ml de ampicilina. Las colonias obtenidas se cultivaron a 37 °C durante la noche en un medio líquido LB que contenía 50 μg/ml de ampicilina, y el plásmido pGAP-IPAdh-Adc-atoB-atoD-atoA se recuperó de las células bacterianas obtenidas, y se denominó pIaaa. 65
Las células competentes de Escherichia coli BΔpgi preparadas en el Ejemplo 3 se transformaron con el plásmido pIaaa, y se cultivaron a 37 °C durante la noche en un caldo LB, en una placa de agar Miller que contenía 50 μg/ml de ampicilina, como resultado de lo cual se obtuvo la variante de Escherichia coli pIaaa/BΔpgi.
[Ejemplo 5] 5
<Preparación de la variante B::atoDABΔpgi>
B::atoDAB preparada en el Ejemplo 1 se transformó con pTH18cs1-pgi preparado en el Ejemplo 3, y se cultivó a 30 °C durante la noche en una placa de agar LB que contenía 10 μg/ml de cloranfenicol y 50 μg/ml de kanamicina, 10 como resultado de lo cual se obtuvieron transformantes. Los transformantes obtenidos se inocularon en un medio líquido LB que contenía 50 μg/ml de kanamicina, y se cultivaron a 30 °C durante la noche. A continuación, se aplicó parte de este líquido de cultivo a una placa de agar LB que contenía 50 μg/ml de kanamicina, como resultado de lo cual se obtuvieron colonias que crecieron a 42 °C. Las colonias obtenidas se cultivaron a 30 °C durante 24 horas en un medio líquido LB que contenía 50 μg/ml de kanamicina, y se aplicaron a una placa de agar LB que contenía 50 15 μg/ml de kanamicina, como resultado de lo cual se obtuvieron colonias crecieron a 42 °C.
De las colonias que aparecieron, se seleccionaron 100 colonias aleatoriamente, y cada una creció individualmente en una placa de agar LB que contenía 50 μg/ml de kanamicina y una placa de agar LB que contenía 10 μg/ml de cloranfenicol, y se seleccionaron los clones sensibles al cloranfenicol que crecieron solo en la placa de agar LB que 20 contenía kanamicina. Además, los ADN cromosómicos de estos clones diana se amplificaron mediante PCR, y se seleccionó una variante a partir de la cual se pudo amplificar un fragmento de aproximadamente 3,3 kpb que indica el reemplazo del gen pgi con el gen resistente a la kanamicina. La variante obtenida se denominó variante cepa B genoma atoD mejorado - deleción del gen pgi (en lo sucesivo abreviado en ocasiones como “variante B::atoDABΔpgi”). 25
Aquí, la cepa de Escherichia coli MG1655 y la cepa de Escherichia coli B están disponibles en la Colección Americana de Cultivos Tipo (American Type Culture Collection).
[Ejemplo 6] 30
<Preparación de la variante B::atoDABΔgntR>
Se conoce la secuencia de bases completa del ADN genómico de Escherichia coli (número de acceso GenBank CP000819), y la secuencia de bases que codifica GntR está descrita en 3509184 a 3510179 de la secuencia 35 genómica de la cepa de Escherichia coli B, la cual está descrita en el número de acceso GenBank CP000819. Con el fin de clonar una región que flanquea a una secuencia de bases que codifica GntR (gntR), se sintetizaron cuatro tipos de cebadores de oligonucleótidos representados por ggaattcgggtcaattttcaccctctatc (SEQ ID NO: 30), gtgggccgtcctgaaggtacaaaagagatagattctc (SEQ ID NO: 31), ctcttttgtaccttcaggacggcccacaaatttgaag (SEQ ID NO: 32) y ggaattcccagccccgcaaggccgatggc (SEQ ID NO: 33). Cada uno de los cebadores de SEQ ID NOs: 30 y 33 tiene un 40 sitio de reconocimiento de EcoRI en el lado 5' terminal del mismo.
Se preparó el ADN genómico de la cepa de Escherichia coli B (número de acceso GenBank CP000819) y se llevó a cabo la PCR usando el ADN genómico obtenido como molde y usando un par de cebadores de SEQ ID NO: 30 y SEQ ID NO: 31, como resultado de lo cual se amplificó un fragmento de ADN de aproximadamente 1,0 kb (en lo 45 sucesivo denominado en ocasiones “fragmento gntR-L”). Además, la PCR se llevó a cabo usando un par de cebadores de SEQ ID NO: 32 y SEQ ID NO: 33, como resultado de lo cual se amplificó un fragmento de ADN de aproximadamente 1,0 kb (en lo sucesivo denominado en ocasiones fragmento “gntR-R”). Estos fragmentos de ADN se separaron mediante electroforesis en agarosa y se recuperaron. La PCR se llevó a cabo usando los fragmentos gntR-L y gntR-R como moldes y usando un par de cebadores de SEQ ID NO: 30 y SEQ ID NO: 33, como resultado 50 de lo cual se amplificó un fragmento de ADN de aproximadamente 2,0 kb (en lo sucesivo denominado en ocasiones como “fragmento gntR-LR”). Este fragmento gntR-LR se separó por electroforesis en agarosa, se recuperó, se digirió con EcoRI, y se mezcló con un fragmento obtenido digiriendo un plásmido pTH18cs1 sensible a la temperatura (número de registro de GenBank AB019610) con EcoRI. Los fragmentos mezclados se hicieron reaccionar usando ADN ligasa de T4. A continuación, las células competentes de Escherichia coli DH5α (fabricado por Toyobo Co., 55 Ltd.) se transformaron con el producto de ligación, y se obtuvieron transformantes que crecieron en una placa de agar LB que contenía 10 μg/ml de cloranfenicol a 30 °C. Los plásmidos se recuperaron de los transformantes obtenidos, y se confirmó que el fragmento gntLR se había insertado adecuadamente en pTH18cs1. El plásmido obtenido se denominó pTH18cs1-gntR.
60
La variante de Escherichia coli B::atoDAB preparada en el Ejemplo 1 se transformó con el plásmido pTH18cs1-gntR así obtenido, y se cultivó a 30 °C durante la noche en una placa de agar LB que contenía 10 μg/ml de cloranfenicol, como resultado de lo cual se obtuvieron transformantes. Los transformantes obtenidos se inocularon en un medio líquido LB que contenía 10 μg/ml de cloranfenicol y se cultivaron a 30 °C durante la noche. A continuación, se aplicó parte de este líquido de cultivo a una placa de agar LB que contenía 10 μg/ml de kanamicina y cloranfenicol, como 65 resultado de lo cual se obtuvieron colonias que crecieron a 42 °C. Las colonias obtenidas se cultivaron a 30 °C
durante 24 horas en un medio líquido LB, y se aplicaron a una placa de agar LB, como resultado de lo cual se obtuvieron colonias que crecieron a 42 °C.
De las colonias que aparecieron, se seleccionaron aleatoriamente 100 colonias, y cada una creció individualmente en una placa de agar LB y en una placa de agar LB que contenía 10 μg/ml de cloranfenicol, y se seleccionaron 5 clones sensibles al cloranfenicol. Además, los ADN cromosómicos de estos clones diana se amplificaron mediante PCR, y se seleccionó una variante a partir de la cual se pudo amplificar un fragmento de aproximadamente 2,0 kpb que indica la eliminación del gen gntR. La variante obtenida se denominó variante cepa B genoma atoD mejorado - deleción del gen gntR (en lo sucesivo abreviado en ocasiones como “variante B::atoDABΔgntR”).
10
[Ejemplo 7]
<Preparación de la variante pGAP-Ia/B::atoDABΔgntR>
Las células competentes de la variante de Escherichia coli B::atoDABΔgntR preparada en el Ejemplo 6 se 15 transformaron con el plásmido pIa preparado en el Ejemplo 2, y se cultivaron a 37 °C durante la noche en un caldo LB, placa de agar Miller que contenía 50 μg/ml de ampicilina, como resultado de lo cual se obtuvo la variante de Escherichia coli pIa/B::atoDABΔgntR.
[Ejemplo 8] 20
<Preparación de la variante pIaz/B::atoDABΔgntR>
Las células competentes de la variante de Escherichia coli B::atoDABΔgntR preparada en el Ejemplo 6 se transformaron con el plásmido pIaz preparado en el Ejemplo 2, y se cultivaron a 37 °C durante la noche en un caldo 25 LB, placa de agar Miller que contenía 50 μg/ml de ampicilina, como resultado de lo cual se obtuvo la variante de Escherichia coli pIaz/B::atoDABΔgntR.
[Ejemplo 9]
30
<Preparación de la variante B::atoDABΔpgiΔgntR>
La variante de Escherichia coli B::atoDABΔpgi preparada en el Ejemplo 5 se transformó con el plásmido pTH18cs1 - gntR preparado en el Ejemplo 6, y se cultivó a 30 °C durante la noche en un Caldo LB, placa de agar Miller que contenía 10 µg/ml de cloranfenicol, como resultado de lo cual se obtuvieron transformantes. Los transformantes 35 obtenidos se inocularon en un medio líquido LB que contenía 10 μg/ml de cloranfenicol y se cultivaron a 30 °C durante la noche. A continuación, se aplicó parte de este líquido de cultivo a una placa de agar LB que contenía 10 μg/ml de kanamicina y cloranfenicol, como resultado de lo cual se obtuvieron colonias que crecieron a 42 °C. Las colonias obtenidas se cultivaron a 30 °C durante 24 horas en un medio líquido LB, y se aplicaron a una placa de agar LB, como resultado de lo cual se obtuvieron colonias que crecieron a 42 °C. 40
De las colonias que aparecieron, se seleccionaron aleatoriamente 100 colonias, y cada una creció individualmente en una placa de agar LB y una placa de agar LB que contenía 10 μg/ml de cloranfenicol, y se seleccionaron clones sensibles al cloranfenicol. Además, los ADN cromosómicos de estos clones diana se amplificaron mediante PCR, y se seleccionó una variante a partir de la cual se pudo amplificar un fragmento de aproximadamente 2,0 kpb que 45 indica la deleción del gen gntR. La variante obtenida se denominó variante cepa B genoma atoD mejorado - deleción del gen pgi - deleción del gen gntR (en adelante abreviado en ocasiones como “variante B::atoDABΔpgiΔgntR”).
Aquí, la cepa de Escherichia coli MG1655 y la cepa de Escherichia coli B están disponibles en la Colección Americana de Cultivos Tipo (American Type Culture Collection). 50
[Ejemplo 10]
<Preparación de la variante pIa/B::atoDABΔpgiΔgntR>
55
Las células competentes de la variante de Escherichia coli B::atoDABΔpgiΔgntR preparada en el Ejemplo 9 se transformaron con el plásmido pIa preparado en el Ejemplo 2, y se cultivaron a 37 °C durante la noche en un caldo LB, placa de agar Miller que contenía 50 μg/ml de ampicilina, como resultado de lo cual se obtuvo Escherichia coli pIa/B::atoDABΔpgiΔgntR.
60
[Ejemplo 11]
<Preparación de la variante pIaz/B::atoDABΔpgiΔgntR>
Las células competentes de la variante de Escherichia coli B::atoDABΔpgiΔgntR preparada en el Ejemplo 9 se 65 transformaron con el plásmido pIaz preparado en el Ejemplo 2, y se cultivaron a 37 °C durante la noche en un caldo
LB, placa de agar Miller que contenía 50 μg/ml de ampicilina, como resultado de lo cual se obtuvo la variante de Escherichia coli pIaz/B::atoDABΔpgiΔgntR.
[Ejemplo 12]
5
<Preparación de la variante B::atoDABΔgnd>
Con el fin de clonar una región que flanquea la secuencia de bases de un gen que codifica la fosfogluconato deshidrogenasa (gnd), se sintetizaron cuatro tipos de cebadores de oligonucleótidos representados por cgccatatgaatggcgcggcggggccggtgg (SEQ ID NO: 34), tggagctctgtttactcctgtcaggggg (SEQ ID NO: 35), 10 tggagctctctgatttaatcaacaataaaattg (SEQ ID NO: 36) y cgggatccaccaccataaccaaacgacgg (SEQ ID NO: 37). El cebador de SEQ ID NO: 34 tiene un sitio de reconocimiento NdeI en el lado 5' terminal del mismo, y cada uno de los cebadores de SEQ ID NO: 35 y SEQ ID NO: 36 tiene un sitio de reconocimiento SacI en el lado 5' terminal del mismo. Además, el cebador de SEQ ID NO: 37 tiene un sitio de reconocimiento BamHI en el lado 5' terminal del mismo. 15
El ADN genómico de la cepa de Escherichia coli B (N.° de acceso GenBank CP000819), y la PCR se llevó a cabo usando un par de cebadores de SEQ ID NO: 34 y SEQ ID NO: 35, como resultado de lo cual se amplificó un fragmento de ADN de aproximadamente 1,0 kb (en lo sucesivo denominado en ocasiones como “fragmento gnd-L”). Además, la PCR se llevó a cabo utilizando un par de cebadores de SEQ ID NO: 36 y SEQ ID NO: 37, como 20 resultado de lo cual se amplificó un fragmento de ADN de aproximadamente 1,0 kb (en lo sucesivo denominado como “fragmento gnd-R”). Estos fragmentos de ADN se separaron mediante electroforesis en agarosa y se recuperaron. El fragmento gnd-L se digirió con NdeI y SacI, y el fragmento gnd-R se digirió con SacI y BamHI. Estos dos tipos de fragmentos digeridos se mezclaron con un fragmento obtenido digiriendo un plásmido pTH18cs1 sensible a la temperatura (número de acceso de GenBank AB019610) con NdeI y BamHI, y los fragmentos 25 mezclados se dejaron reaccionar usando ADN ligasa de T4. A continuación, células competentes de Escherichia coli DH5α (fabricado por Toyobo Co., Ltd.) se transformaron con el producto de ligación, y se obtuvieron transformantes que crecieron en una placa de agar LB que contenía 10 μg/ml de cloranfenicol a 30 °C. Los plásmidos se recuperaron de los transformantes obtenidos, y se confirmó que los dos fragmentos de un fragmento de la región flanqueante en dirección 5' y un fragmento de la región flanqueante en dirección 3' del gen que codifica gnd se 30 habían insertado adecuadamente en pTH18cs1. El plásmido obtenido se denominó pTH18cs1-gnd.
La variante de Escherichia coli B::atoDAB preparada en el Ejemplo 1 se transformó con el plásmido pTH18cs1-gnd así obtenido, y se cultivó a 30 °C durante la noche en una placa de agar LB que contenía 10 μg/ml de cloranfenicol, como resultado de lo cual se obtuvieron transformantes. Los transformantes obtenidos se inocularon en un medio 35 líquido LB que contenía 10 μg/ml de cloranfenicol y se cultivaron a 30 °C durante la noche. A continuación, se aplicó parte de este líquido de cultivo a una placa de agar LB que contenía 10 μg/ml de kanamicina y cloranfenicol, como resultado de lo cual se obtuvieron colonias que crecieron a 42 °C. Las colonias obtenidas se cultivaron a 30 °C durante 24 horas en un medio líquido LB, y se aplicaron a una placa de agar LB, como resultado de lo cual se obtuvieron colonias que crecieron a 42 °C. 40
De las colonias que aparecieron, se seleccionaron aleatoriamente 100 colonias, y cada una creció individualmente en una placa de agar LB y una placa de agar LB que contenía 10 μg/ml de cloranfenicol, y se seleccionaron clones sensibles al cloranfenicol. Además, los ADN cromosómicos de estos clones diana se amplificaron mediante PCR, y se seleccionó una variante a partir de la cual se pudo amplificar un fragmento de aproximadamente 2,0 kpb que 45 indica la eliminación del gen gnd. La variante obtenida se denominó variante B::atoDABΔgnd.
Aquí, la cepa de Escherichia coli B está disponible en la Colección Americana de Cultivos Tipo (American Type Culture Collection).
50
[Ejemplo 13]
<Preparación de la variante pIa/B::atoDABΔgnd>
Las células competentes de la variante de Escherichia coli B::atoDABΔgnd preparada en el Ejemplo 12 se 55 transformaron con el plásmido pIa preparado en el Ejemplo 2, y se cultivaron a 37 °C durante la noche en un caldo LB, placa de agar Miller que contenía 50 μg/ml de ampicilina, como resultado de lo cual se obtuvo la variante de Escherichia coli pIa/B::atoDABΔgnd.
[Ejemplo 14] 60
<Preparación de la variante pIaz/B::atoDABΔgnd>
Las células competentes de la variante de Escherichia coli B::atoDABΔgnd preparada en el Ejemplo 12 se transformaron con el plásmido pIaz preparado en el Ejemplo 2, y se cultivaron a 37 °C durante la noche en un caldo 65 LB, placa de agar Miller que contenía 50 μg/ml de ampicilina, como resultado de lo cual se obtuvo la variante de
Escherichia coli pIaz/B::atoDABΔgnd.
[Ejemplo 15]
<Preparación de la variante B::atoDABΔpgiΔgnd> 5
La variante de Escherichia coli B::atoDABΔpgi preparada en el Ejemplo 5 se transformó con el plásmido pTH18cs1-gnd preparado en el Ejemplo 12, y se cultivó a 30 °C durante la noche en una placa de agar LB que contenía 10 µg/ml de cloranfenicol, como resultado de lo cual se obtuvieron transformantes. Los transformantes obtenidos se inocularon en un medio líquido LB que contenía 10 μg/ml de cloranfenicol y se cultivaron a 30 °C durante la noche. A 10 continuación, se aplicó parte de este líquido de cultivo a una placa de agar LB que contenía 10 μg/ml de kanamicina y cloranfenicol, como resultado de lo cual se obtuvieron colonias que crecieron a 42 °C. Las colonias obtenidas se cultivaron a 30 °C durante 24 horas en un medio líquido LB, y se aplicaron a una placa de agar LB, como resultado de lo cual se obtuvieron colonias que crecieron a 42 °C.
15
De las colonias que aparecieron, se seleccionaron aleatoriamente 100 colonias, y cada una creció individualmente en una placa de agar LB y una placa de agar LB que contenía 10 μg/ml de cloranfenicol, y se seleccionaron clones sensibles al cloranfenicol. Además, los ADN cromosómicos de estos clones diana se amplificaron mediante PCR, y se seleccionó una variante a partir de la cual se pudo amplificar un fragmento de aproximadamente 2,0 kpb que indica la eliminación del gen gnd. La variante obtenida se denominó variante B::atoDABΔpgiΔgnd. 20
[Ejemplo 16]
<Preparación de la variante pIa/B::atoDABΔpgiΔgnd>
25
Las células competentes de la variante de Escherichia coli B::atoDABΔpgiΔgnd preparadas el Ejemplo 15 se transformaron con el plásmido pIa preparado en el Ejemplo 2, y se cultivaron a 37 °C durante la noche en un caldo LB, placa de agar Miller que contenía 50 μg/ml de ampicilina, como resultado de lo cual se obtuvo Escherichia coli pIa/B::atoDABΔpgiΔgnd.
30
[Ejemplo 17]
<Preparación de la variante pIaz/B::atoDABΔpgiΔgnd>
Las células competentes de la variante de Escherichia coli B::atoDABΔpgiΔgnd preparada en el Ejemplo 15 se 35 transformó con el plásmido pIaz preparado en el Ejemplo 2, y se cultivaron a 37 °C durante la noche en un caldo LB, placa de agar Miller que contenía 50 μg/ml de ampicilina, como resultado de lo cual se obtuvo la variante de Escherichia coli pIaz/B::atoDABΔpgiΔgnd.
[Ejemplo 18] 40
<Preparación de la variante B::atoDABΔgndΔgntR>
Las células competentes de la variante de Escherichia coli B::atoDABΔgnd preparada en el Ejemplo 12 se transformaron con el plásmido pTH18cs1-gntR preparado en el Ejemplo 6, y se cultivaron a 30ºC durante la noche 45 en una placa de agar LB que contenía 10 μg/ml de cloranfenicol, como resultado de lo cual se obtuvieron transformantes. Los transformantes obtenidos se inocularon en un medio líquido LB que contenía 10 μg/ml de cloranfenicol y se cultivaron a 30 °C durante la noche. A continuación, se aplicó parte de este líquido de cultivo a una placa de agar LB que contenía 10 μg/ml de kanamicina y cloranfenicol, como resultado de lo cual se obtuvieron colonias que crecieron a 42 °C. Las colonias obtenidas se cultivaron a 30 °C durante 24 horas en un medio líquido 50 LB, y se aplicaron a una placa de agar LB, como resultado de lo cual se obtuvieron colonias que crecieron a 42 °C.
De las colonias que aparecieron, se seleccionaron aleatoriamente 100 colonias, y cada una creció individualmente en una placa de agar LB y una placa de agar LB que contenía 10 μg/ml de cloranfenicol, y se seleccionaron clones sensibles al cloranfenicol. Además, los ADN cromosómicos de estos clones diana se amplificaron mediante PCR, y 55 se seleccionó una variante a partir de la cual se pudo amplificar un fragmento de aproximadamente 2,0 kpb que indica la deleción del gen gntR. La variante obtenida se denominó variante B::atoDABΔgndΔgntR.
[Ejemplo 19]
60
<Preparación de la variante pIa/B::atoDABΔgndΔgntR>
Las células competentes de la variante de Escherichia coli B::atoDABΔgndΔgntR preparada en el Ejemplo 18 se transformaron con el plásmido pIa preparado en el Ejemplo 2, y se cultivaron a 37 °C durante la noche en un caldo LB, placa de agar Miller que contenía 50 μg/ml de ampicilina, como resultado de lo cual se obtuvo la variante de 65 Escherichia coli pIa/B::atoDABΔgndΔgntR.
[Ejemplo 20]
<Preparación de la variante pIaz/B::atoDABΔgndΔgntR>
Las células competentes de la variante de Escherichia coli B::atoDABΔgndΔgntR preparada en el Ejemplo 18 se 5 transformaron con el plásmido pIaz preparado en el Ejemplo 2, y se cultivaron a 37 °C durante la noche en un caldo LB, placa de agar Miller que contenía 50 μg/ml de ampicilina, como resultado de lo cual se obtuvo la variante de Escherichia coli pIaz/B::atoDABΔgndΔgntR.
[Ejemplo 21] 10
<Preparación de la variante B::atoDABΔpgiΔgndΔgntR>
Las células competentes de la variante de Escherichia coli B::atoDABΔpgiΔgnd preparada en el Ejemplo 15 se transformaron con el plásmido pTH18cs1-gntR preparado en el Ejemplo 6, y se cultivaron a 30 °C durante la noche 15 en una placa de agar LB que contenía 10 μg/ml de cloranfenicol, como resultado de lo cual se obtuvieron transformantes. Los transformantes obtenidos se inocularon en un medio líquido LB que contenía 10 μg/ml de cloranfenicol y se cultivaron a 30 °C durante la noche. A continuación, se aplicó parte de este líquido de cultivo a una placa de agar LB que contenía 10 μg/ml de kanamicina y cloranfenicol, como resultado de lo cual se obtuvieron colonias que crecieron a 42 °C. Las colonias obtenidas se cultivaron a 30 °C durante 24 horas en un medio líquido 20 LB, y se aplicaron a una placa de agar LB, como resultado de lo cual se obtuvieron colonias que crecieron a 42 °C.
De las colonias que aparecieron, se seleccionaron aleatoriamente 100 colonias, y cada una creció individualmente en una placa de agar LB y una placa de agar LB que contenía 10 μg/ml de cloranfenicol, y se seleccionaron clones sensibles al cloranfenicol. Además, los ADN cromosómicos de estos clones diana se amplificaron mediante PCR, y 25 se seleccionó una variante a partir de la cual se pudo amplificar un fragmento de aproximadamente 2,0 kpb que indica la deleción del gen gntR. La variante obtenida se denominó variante B::atoDABΔpgiΔgndΔgntR.
[Ejemplo 22]
30
<Preparación de la variante pIa/B::atoDABΔpgiΔgndΔgntR>
Las células competentes de la variante de Escherichia coli B::atoDABΔpgiΔgndΔgntR preparada en el Ejemplo 21 se transformaron con el plásmido pIa preparado en el Ejemplo 2, y se cultivaron a 37 °C durante una noche en un caldo LB, placa de agar Miller que contenía 50 μg/ml de ampicilina, como resultado de lo cual se obtuvo la variante de 35 Escherichia coli pIa/B::atoDABΔpgiΔgndΔgntR.
[Ejemplo 23]
<Preparación de la variante pIaz/B::atoDABΔpgiΔgndΔgntR> 40
Las células competentes de la variante de Escherichia coli B::atoDABΔpgiΔgndΔgntR preparada en el Ejemplo 21 se transformaron con el plásmido pIaz preparado en el Ejemplo 2, y se cultivaron a 37 °C durante la noche en un caldo LB, placa de agar Miller que contenía 50 μg/ml de ampicilina, como resultado de lo cual se obtuvo la variante de Escherichia coli pIaz/B::atoDABΔpgiΔgndΔgntR. 45
[Ejemplo 24]
<Preparación de la variante pIa/B::atoDAB>
50
Las células competentes de la variante de Escherichia coli B::atoDAB preparada en el Ejemplo 1 se transformaron con el plásmido pIa preparado en el Ejemplo 2, y se cultivaron a 37 °C durante la noche en un caldo LB, placa de agar Miller que contenía 50 μg/ml de ampicilina, como resultado de lo cual se obtuvo la variante de Escherichia coli pIa/B::atoDAB.
55
[Ejemplo 25]
<Preparación de la variante pIaz/B::atoDABΔpgi>
Las células competentes de la variante de Escherichia coli B::atoDABΔpgi preparada en el Ejemplo 5 se 60 transformaron con el plásmido pIaz preparado en el Ejemplo 2, y se cultivaron a 37 °C durante la noche en un caldo LB, placa de agar Miller que contenía 50 μg/ml de ampicilina, como resultado de lo cual se obtuvo la variante de Escherichia coli pIaz/B::atoDABΔpgi.
65
[Ejemplo de prueba 1]
(Producción de alcohol isopropílico)
En este ejemplo, se produjo alcohol isopropílico usando un aparato de producción mostrado en la Fig. 1 del 5 documento WO 2009/008377. El tanque de cultivo utilizado era un tanque que tenía una capacidad de 3 l y era de vidrio, y los tanques trampa utilizados eran tanques con una capacidad de 10 l y eran de polipropileno. En los tanques trampa, se inyectó agua como solución trampa (agua trampa) en una cantidad de 9 l por tanque, y los dos tanques trampa se conectaron para su uso. El tanque de cultivo estaba equipado con un tubo de drenaje, y el líquido de cultivo se incrementó mediante la alimentación de azúcar y se descargó un neutralizador fuera del tanque de 10 cultivo, según correspondiera.
Una lista de variantes utilizadas en la evaluación de la producción de alcohol isopropílico se muestra en la Tabla 3.
Tabla 3 15
Nombre de la variante
Característica Descripción referenciada
pIa/B::atoDAB
Contiene sistema de producción de AIP Ejemplo 24
pIaz/B::atoDAB
Contiene sistema de producción de AIP, alta expresión de zwf Ejemplo 2
pIaaa/BΔpgi
Contiene sistema de producción de AIP, Δpgi Ejemplo 4
pIaz/B::atoDABΔpgi
Contiene sistema de producción de AIP, alta expresión de zwf, Δpgi Ejemplo 25
pIa/B::atoDABΔgntR
Contiene sistema de producción de AIP, ΔgntR Ejemplo 7
pIaz/B::atoDABΔgntR
Contiene sistema de producción de AIP, alta expresión de zwf, ΔgntR Ejemplo 8
pIa/B::atoDABΔpgiΔgntR
Contiene sistema de producción de AIP, Δpgi, ΔgntR Ejemplo 10
pIaz/B::atoDABΔpgiΔgntR
Contiene sistema de producción de AIP, alta expresión de zwf, Δpgi, ΔgntR Ejemplo 11
pIa/B::atoDABΔpgiΔgnd
Contiene sistema de producción de AIP, Δpgi, Δgnd Ejemplo 16
pIa/B::atoDABΔgndΔgntR
Contiene sistema de producción de AIP, Δgnd, ΔgntR Ejemplo 19
pIaz/B::atoDABΔgndΔgntR
Contiene sistema de producción de AIP, alta expresión de zwf, Δgnd, ΔgntR Ejemplo 20
pIa/B::atoDABΔpgiΔgndΔgntR
Contiene sistema de producción de AIP, Δpgi, Δgnd, ΔgntR Ejemplo 22
pIaz/B::atoDABΔpgiΔgndΔgntR
Contiene sistema de producción de AIP, alta expresión de zwf, Δpgi, Δgnd, ΔgntR Ejemplo 23
AIP se refiere a alcohol isopropílico
Como precultivo, cada una de las variantes a evaluar se inoculó individualmente en un matraz Erlenmeyer que tiene una capacidad de 500 ml y contiene 50 ml de un caldo LB, líquido de cultivo Miller (Difco 244620) que contiene 50 μg/ml de ampicilina y se cultivó durante la noche a una temperatura de cultivo de 30 °C mientras se agita a 120 rpm. Se transfirieron 45 ml del precultivo a un tanque de cultivo (dispositivo de cultivo BMS-PI fabricado por ABLE 20 Corporation) que tenía una capacidad de 3 l y que contenía 855 g de un medio de cultivo que tenía la siguiente composición, y se cultivó. El cultivo se llevó a cabo a un volumen de aireación de 0,9 l/min, una velocidad de agitación de 550 rpm, una temperatura de cultivo de 30 °C y un pH de 7,0 (ajustado con solución acuosa de NH3) a presión atmosférica. Se añadió una solución acuosa de glucosa 50 % p/p con un caudal de 10 g/l/hora durante el período desde el inicio del cultivo hasta 8 horas después del inicio del cultivo y, a partir de entonces, se añadió una 25 solución acuosa de glucosa 50 % p/p a un caudal de 20 g/l/hora, según fuera apropiado, de modo que se minimizara la cantidad de glucosa que quedaba en el tanque de cultivo. El líquido de cultivo bacteriano se muestreó varias veces durante el período desde el inicio del cultivo hasta 72 horas después del inicio del cultivo y, después de que las células bacterianas se eliminaron por operación centrífuga, las cantidades de alcohol isopropílico y acetona se acumularon en los sobrenadantes del cultivo y las aguas trampa obtenidas se midieron por HPLC de acuerdo con un 30 método ordinario. Cada uno de los valores de medición es una suma de las cantidades en el líquido de cultivo y los dos tanques trampa después del cultivo. Los resultados se muestran en la Tabla 4.
<Composición del medio de cultivo>
35
Licor de maceración de maíz (fabricado por Nihon Shokuhin Kako Co., Ltd.): 20 g/l
Fe2SO4·7H2O: 0,1 g/l
K2HPO4: 2 g/l
KH2PO4: 2 g/l
MgSO4·7H2O: 2 g/l
(NH4)2SO4: 2 g/l
ADEKA NOL LG126 (ADEKA Corporation) 0,1 g/l
(Equilibrio: agua)
5
Tabla 4
Nombre de la variante
Cantidad de producción de AIP (g/l/72 h) Cantidad de producción de acetona (g/l/72 h)
pIa/B::atoDAB (control negativo)
48,7 27,6
pIaz/B::atoDAB
39,4 20,2
pIaaa/BΔpgi
0,0 0,0
pIaz/B::atoDABΔpgi
41,1 3,0
pIa/B::atoDABΔgntR
57,3 23,7
pIaz/B::atoDABΔgntR
33,3 25,0
pIa/B::atoDABΔpgiΔgntR
9,6 0,8
pIaz/B::atoDABΔpgiΔgntR
70,2 10,6
pIa/B::atoDABΔpgiΔgnd
2,6 0,2
pIa/B::atoDABΔgndΔgntR
28,6 28,4
pIaz/B::atoDABΔgndΔgntR
33,9 25,3
pIa/B::atoDABΔpgiΔgndΔgntR
0,8 0,0
pIaz/B::atoDABΔpgiΔgndΔgntR
75,6 14,1
Como resultado de la evaluación, la cantidad producida de alcohol isopropílico por un control negativo (pla/B::atoDAB) fue 48,7 g/l/72 h, y la cantidad producida por un alterador de gntR (pla/B::atoDABΔgntR) fue 57,3 g/l/72 h. A partir de este resultado, se encontró que la alteración de gntR proporciona una productividad 10 incrementada que es aproximadamente 1,2 veces mayor que la del control negativo.
Además, la cantidad de producción lograda por una variante en la que gntR y pgi fueron alterados y en la que aumentó la expresión de zwf (pIaz/B::atoDABΔpgiΔgntR) fue de 70,2 g/l/72 h, lo que indica una productividad que es de aproximadamente 1,4 veces la del control negativo. A partir de este resultado, se observó que la alteración tanto 15 de gntR como de pgi en combinación con la mejora de la expresión de zwf mejora adicionalmente la productividad en comparación con el caso de la alteración de gntR solo.
En el caso de la alteración de pgi solo (pIaaa/BΔpgi), no se produjo alcohol isopropílico en absoluto. En el caso del aumento de zwf solo (pIaz/B::atoDAB), la cantidad de producción fue de 39,4 g/l/72 h, y la productividad disminuyó 20 en lugar de aumentar.
Las cantidades de producción en el caso de la alteración de gntR en combinación con una alta expresión de zwf (pIaz/B::atoDABΔgntR), en el caso de la alteración de pgi en combinación con una alta expresión de zwf (pIaz/B::atoDABΔpgi), y en el caso de la alteración de pgi y gntR (pIa/B::atoDABΔpgiΔgntR) fueron 33,3 g/l/72 h, 25 41,1 g/l/72 h, y 9,6 g/l/72 h, respectivamente, y la eficiencia de la producción de alcohol isopropílico disminuyó en lugar de aumentar.
Por lo tanto, en un caso en el que se lleva a cabo la alteración o la alta expresión de otros factores además de la alteración de gntR, se considera que el efecto en términos de mejora de la productividad lograda por la variante 30 pIaz/B::atoDABΔpgiΔgntR se obtiene cuando ambos gntR y pgi están alterados y zwf se expresa en altos niveles.
Además, en un caso en el que gnd se altera adicionalmente en la variante pIaz/B::atoDABΔpgiΔgntR que exhibe una productividad incrementada, es decir, en un caso en el que pgi, gntR y gnd están alterados y zwf se expresa en altos niveles (pIaz/B::atoDABΔpgiΔgndΔgntR), la cantidad de alcohol isopropílico producida fue de 75,6 g/l/72 h, lo que 35 indica una alta productividad que es mayor que la alcanzada por la variante pIaz/B::atoDABΔpgiΔgntR.
En el caso de la alteración de gnd solo, la cantidad de alcohol isopropílico producida fue de 45,5 g/l/72 h, que es inferior a la conseguida por el control negativo. Es decir, la alteración de gnd solo no mostró un efecto en términos de mejora de la eficacia de la producción de alcohol isopropílico. Las cantidades de producción en el caso de la 40 alteración de gntR y gnd (pIa/B::atoDABΔgndΔgntR), en el caso de la alteración de pgi y gnd (pIa/B::atoDABΔpgiΔgnd) y en el caso de la alteración de pgi, gntR y gnd (pIa/B::atoDABΔpgiΔgndΔgntR) fueron 28,6 g/l/72 h, 2,6 g/l/72 h, y 0,8 g/l/72 h, respectivamente, lo que indica que estas variantes exhibieron una disminución de la eficacia de producción de alcohol isopropílico en lugar de un aumento de la eficiencia de producción de alcohol isopropílico. La eficiencia de la producción de alcohol isopropílico disminuyó en lugar de 45 aumentar también en un caso en el que gnd se alteró y zwf se expresó a altos niveles (pIaz/B::atoDABΔgnd), en un caso en el que gntR y gnd se alteraron y zwf se expresó a altos niveles (pIaz/B::atoDABΔgndΔgntR), y en un caso en el que pgi y gnd se alteraron y zwf se expresó a altos niveles (pIaz/B::atoDABΔpgiΔgnd) y las productividades en tales casos fueron 40,7 g/l/72 h, 33,9 g/l/72 h y 34,9 g/l/72 h, respectivamente.
50
Por lo tanto, se considera que el efecto en términos de mejora de la productividad lograda por la variante pIaz/B::atoDABΔpgiΔgndΔgntR se obtiene solo en un caso en el que gntR, pgi y gnd se alteran simultáneamente y en los que zwf se expresa fuertemente.
Además, la acetona obtenida se puede usar como materia prima para la producción de alcohol isopropílico, después 5 de la purificación de la misma.
(Fabricación de acetona)
[Ejemplo 26] 10
<Recuperación de alcohol isopropílico y acetona>
El agua de trampa obtenida cuando se realizó la evaluación del cultivo de la variante pIaz/B::atoDABΔpgiΔgndΔgntR (Ejemplo 23) se analizó mediante cromatografía de gases (GC) y, como resultado, se determinó que contenía 1,2 g/l 15 de acetona y 4.3 g/l de alcohol isopropílico. A partir de la solución acuosa que contenía alcohol isopropílico y acetona (agua de trampa muestreada 72 horas después del inicio del cultivo), se recuperaron alcohol isopropílico y acetona a concentraciones más altas por destilación.
Específicamente, 2 l de la solución acuosa descrita anteriormente se pasó primero a través de una columna rellena 20 con 250 ml de resina de intercambio catiónico (AMBERLYST 31 WET fabricada por Organo Corporation) a un caudal de 500 ml/h, eliminándose amoníaco residual etc. La solución resultante se destiló a presión normal. Una fracción obtenida en puntos de ebullición de 53 a 81,6 °C fue muestreada, y analizada por GC, y se determinó que contenía 18,7 % en masa de acetona, 62,6 % en masa de alcohol isopropílico, 0,2 % en masa de componentes no identificados y el resto agua. La fracción se usó como materia prima para la siguiente reacción de deshidrogenación. 25
<Preparación del catalizador de deshidrogenación ZnO:ZrO2 (94:6)>
Se añadieron 15,94 g (0,15 mol) de carbonato de sodio y 130 ml de agua a un matraz de fondo redondo de 500 ml equipado con paletas de agitación, para formar una solución. A la solución acuosa resultante, se añadió gota a gota 30 durante una hora y media una solución acuosa obtenida disolviendo 34,36 g (0,11 mol) de nitrato de zinc hexahidratado y 1,30 g (0,05 mol) de óxido de dinitrato de zirconio dihidratado en 150 ml de agua. El resultante se dejó reposar durante 5 días, luego se filtró y se lavó bien con agua. La materia blanca resultante se secó a 120 °C durante 2 horas, y a 400 °C durante 1 hora, y, finalmente, se calcinó a 600 °C durante 2 horas. Se obtuvo como polvo blanco 9,50 g de un catalizador de óxido complejo, ZnO:ZrO2 (94:6). 35
<Producción de acetona>
Se añadió 1,0 g del catalizador de óxido complejo ZnO:ZrO2 (94:6) (moldeado por compresión a 20 MPa y cuyo tamaño determinado posteriormente fue de 250 a 500 μm) se añadió a un reactor de SUS con un diámetro de 1 cm y 40 una longitud de 40 cm, y el destilado obtenido anteriormente (acetona: 18,7 % en masa, alcohol isopropílico: 62,6 % en masa, componentes no identificados: 0,2 % en masa, el resto: agua) se dejó fluir a través del reactor a 350 °C a una velocidad de 1,50 g/hora bajo una corriente de nitrógeno de 10 ml/min. Se enfrió un puerto de salida del reactor, atrapando así la solución de reacción y el gas de reacción. La muestra de producto obtenida a las 5 horas después del inicio de la reacción se analizó mediante cromatografía de gases y, como resultado, se determinó que la acetona 45 se producía a alta concentración como se muestra en la Tabla 5. En la Tabla 5, “IPA” representa alcohol isopropílico (lo mismo se aplicará a partir de ahora).
[Ejemplo 27]
50
Se llevaron a cabo los mismos procedimientos que en el Ejemplo 26, excepto que la temperatura de reacción se ajustó a 400 °C. Los resultados se muestran en la Tabla 5. Como se muestra en la Tabla 5, se produjo acetona a alta concentración.
[Ejemplo 28] 55
<Preparación del catalizador de deshidrogenación ZnO:ZrO2 (88:12)>
Se añadieron 15,94 g (0,15 mol) de carbonato de sodio y 130 ml de agua a un matraz de fondo redondo de 500 ml equipado con paletas de agitación, para formar una solución. A la solución acuosa resultante, se añadió gota a gota 60 durante una hora y media una solución acuosa obtenida disolviendo 32,86 g (0,11 moles) de nitrato de zinc hexahidratado y 2,66 g (0,10 mol) de óxido de dinitrato de zirconio dihidratado en 150 ml de agua. El resultante se dejó reposar durante 5 días, luego se filtró y se lavó bien con agua. La materia blanca resultante se secó a 120 °C durante 2 horas, y a 400 °C durante 1 hora, y, finalmente, se calcinó a 600 °C durante 2 horas. Se obtuvo como polvo blanco 9,94 g de un catalizador de óxido complejo, ZnO:ZrO2 (88:12). 65
<Producción de acetona>
Se añadió 1,0 g del catalizador de óxido complejo ZnO:ZrO2 (88:12) (moldeado por compresión a 20 MPa y cuyo tamaño determinado posteriormente fue de 250 a 500 μm) se añadió a un reactor de SUS con un diámetro de 1 cm y una longitud de 40 cm, y el destilado obtenido anteriormente (acetona: 18,7 % en masa, alcohol isopropílico: 62,6 % 5 en masa, componentes no identificados: 0,2 % en masa, el resto: agua) se dejó fluir a través del reactor a 350 °C a una velocidad de 1,50 g/h bajo una corriente de nitrógeno de 10 ml/min. Se enfrió un puerto de salida del reactor, atrapando así la solución de reacción y el gas de reacción. Se obtuvo una muestra del producto a las 5 horas después del inicio de la reacción y se analizó mediante cromatografía de gases y, como resultado, se descubrió que se producía acetona a alta concentración como se muestra en la Tabla 5. 10
[Ejemplo 29]
Se llevaron a cabo los mismos procedimientos que en el Ejemplo 28, excepto que la temperatura de reacción se ajustó a 400 °C. Los resultados se muestran en la Tabla 5. Como se muestra en la Tabla 5, se produjo acetona a 15 alta concentración.
Tabla 5
Catalizador Temperatura de reacción Relación de conversión de AIP (%) Composición de productos distintos del AIP (en términos de % en moles/alcohol isopropílico)
Acetona
Propileno Óxido de mesitilo Metil isobutil cetona Otros
Ejemplo 26
ZnO : ZrO2 (94:6) 350 °C 97,8 78,3 8,4 3,9 0,2 9,2
Ejemplo 27
ZnO : ZrO2 (94:6) 400 °C 99,6 71,9 6,1 4,6 0,3 17,1
Ejemplo 28
ZnO : ZrO2 (88:12) 350 °C 83,5 89,8 1,0 2,4 0,1 6,7
Ejemplo 29
ZnO : ZrO2 (88:12) 400 °C 99,0 80,0 1,3 3,5 0,1 15,1
(Modificación del codón del gen contenido en la Escherichia coli productora de alcohol isopropílico) 20
Las secuencias de codones del gen de la alcohol isopropílico deshidrogenasa y el gen de la acetoacetato deshidrogenasa contenidas en la Escherichia coli productora de alcohol isopropílico de acuerdo con la invención se modificaron, y se verificó la eficacia en la producción de alcohol isopropílico y acetona como se describe a continuación. 25
[Ejemplo 30]
<Preparación del plásmido pI*a*z>
30
Un gen de la acetoacetato descarboxilasa (adc) de la bacteria Clostridium está descrito con el número de acceso GenBank M55392, y un gen de la alcohol isopropílico deshidrogenasa (IPAdh) está descrito con el número de acceso GenBank AF157307.
La secuencia promotora de la gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa (en lo sucesivo denominada en ocasiones 35 “GAPDH”) de Escherichia coli, que se describe en 397 a 440 en la información de la secuencia de bases con un número de acceso de GenBank X02662, puede usarse como la secuencia de bases de un promotor necesario para expresar el grupo de genes mencionado anteriormente.
Con el fin de obtener el promotor GAPDH, se llevó a cabo la amplificación por un método de PCR usando el ADN 40 genómico de la cepa de Escherichia coli MG1655 como molde y usando cgagctacatatgcaatgattgacacgattccg (SEQ ID NO: 38) y cgcgcgcatgctatttgttagtgaataaaagg (SEQ ID NO: 39),y el fragmento de ADN obtenido se digirió con las enzimas de restricción NdeI y SphI, como resultado de lo cual se obtuvo un fragmento de ADN de aproximadamente 110 pb correspondiente al promotor GAPDH. El fragmento de ADN obtenido se mezcló con un fragmento obtenido digiriendo el plásmido pBR322 (número de acceso de GenBank J01749) con las enzimas de restricción NdeI y SphI, 45 y los fragmentos mezclados se ligaron usando una ligasa. A continuación, células competentes de la cepa de Escherichia coli DH5α (Toyobo Co., Ltd. DNA-903) se transformaron con el producto de ligación, y se obtuvieron transformantes que crecieron en una placa de agar LB que contenía 50 μg/ml de ampicilina. Las colonias obtenidas se cultivaron a 37 °C durante la noche en un medio líquido LB que contenía 50 μg/ml de ampicilina y el plásmido pBRgapP se recuperó de las células bacterianas obtenidas. 50
Con el fin de obtener un gen de la alcohol isopropílico deshidrogenasa con modificación de codones (IPAdh*), se diseñó un gen de la alcohol isopropílico deshidrogenasa con modificación de codones basado en la secuencia de aminoácidos del gen de la alcohol isopropílico deshidrogenasa de Clostridium beijerinckii NRRL B-593 y se preparó el siguiente fragmento de ADN (SEQ ID NO: 40) por síntesis de ADN. La secuencia del mismo se muestra a continuación. 5
10
La amplificación mediante un método de PCR se llevó a cabo usando el fragmento de ADN preparado como molde y usando acatgcatgcatgaaaggttttgcaatgctg (SEQ ID NO: 41) y acgcgtcgacttataatataactactgctttaa (SEQ ID NO: 42), y el fragmento de ADN obtenido se digirió con las enzimas de restricción SphI y SalI, como resultado de lo cual se obtuvo un fragmento de la alcohol isopropílico deshidrogenasa con modificación de codones de aproximadamente 1,1 kpb. El fragmento de ADN obtenido se mezcló con un fragmento obtenido digiriendo el plásmido pUC 119 con 15 las enzimas de restricción SphI y SalI, y los fragmentos mezclados se ligaron usando una ligasa. A continuación, células competentes de la cepa de Escherichia coli DH5α (Toyobo Co., Ltd. DNA-903) se transformó con el producto de ligación, y se obtuvieron transformantes que crecieron en una placa de agar LB que contenía 50 μg/ml de ampicilina. Las colonias obtenidas se cultivaron a 37 °C durante la noche en un medio líquido LB que contenía 50 μg/ml de ampicilina, y se recuperaron plásmidos de las células bacterianas obtenidas, y se confirmó que se había 20 insertado correctamente IPAdh* con modificación de codones. El plásmido obtenido se denominó pUC-I*.
Un fragmento que contiene IPAdh* obtenido digiriendo el plásmido pUC-I* con las enzimas de restricción SphI y EcoRI se mezcló con un fragmento obtenido digiriendo el plásmido pBRgapP con las enzimas de restricción SphI y EcoRI, y los fragmentos mezclados se ligaron usando una ligasa. A continuación, las células competentes de la cepa 25 de Escherichia coli DH5α (Toyobo Co., Ltd. DNA-903) se transformaron con el producto de ligación, y se obtuvieron transformantes que crecieron en una placa de agar LB que contenía 50 μg/ml de ampicilina. Las colonias obtenidas se cultivaron a 37 °C durante la noche en un medio líquido LB que contenía 50 μg/ml de ampicilina, y se recuperaron plásmidos de las células bacterianas obtenidas, y se confirmó que IPAdh* con modificación de codones se había insertado correctamente. El plásmido obtenido se denominó pGAP-I*. 30
Con el fin de obtener un gen de la acetoacetato descarboxilasa con modificación de codones (adc*), se diseñó un gen de la acetoacetato descarboxilasa con modificación de codones basado en la secuencia de aminoácidos del gen de la acetoacetato descarboxilasa de Clostridium acetobutylicum ATCC824, y el siguiente fragmento de ADN (SEQ ID NO: 43) se preparó por síntesis de ADN. La secuencia del mismo se muestra a continuación.
5
La amplificación mediante un método de PCR se llevó a cabo usando el fragmento de ADN preparado como molde y usando acgcgtcgacgctggttggtggaacatatgctgaaagatgaagtgatta (SEQ ID NO: 44) and gctctagattacttgagataatcgtatatga (SEQ ID NO: 45), y el fragmento de ADN obtenido se digirió con las enzimas de restricción SalI y XbaI, como 10 resultado de lo cual se obtuvo un fragmento de acetoacetato descarboxilasa con modificación de codones de aproximadamente 700 pb. El fragmento de ADN obtenido se mezcló con un fragmento obtenido digiriendo el plásmido pGAP-I* preparado anteriormente con las enzimas de restricción SalI y XbaI, y los fragmentos mezclados se ligaron usando una ligasa. A continuación, las células competentes de la cepa de Escherichia coli DH5α (Toyobo Co., Ltd. DNA-903) se transformaron con el producto de ligación, y se obtuvieron transformantes que crecieron en 15 una placa de agar LB que contenía 50 μg/ml de ampicilina. Las colonias obtenidas se cultivaron a 37 °C durante la noche en un medio líquido LB que contenía 50 μg/ml de ampicilina, y se recuperaron plásmidos de las células bacterianas obtenidas, y se confirmó que adc* se había insertado adecuadamente. El plásmido obtenido se denominó pI*a*.
20
Con el fin de obtener el gen de la glucosa-6-fosfato-1-deshidrogenasa (zwf), se llevó a cabo la amplificación por un método de PCR utilizando el ADN genómico de la cepa de Escherichia coli B (número de acceso GenBank CP000819) como molde y usando gctctagacggagaaagtcttatggcggtaacgcaaacagcccagg (SEQ ID NO: 46) y cgggatccttactcaaactcattccaggaacgac (SEQ ID NO: 47), y el fragmento de ADN obtenido se digirió con las enzimas de restricción BamHI y XbaI, como resultado de lo cual se obtuvo un fragmento de la glucosa-6-fosfato-1-25 deshidrogenasa de aproximadamente 1500 pb. El fragmento de ADN obtenido se mezcló con un fragmento obtenido digiriendo el plásmido pI*a* preparado anteriormente con las enzimas de restricción XbaI y BamHI, y los fragmentos mezclados se ligaron usando una ligasa. A continuación, las células competentes de la cepa de Escherichia coli DH5α (Toyobo Co., Ltd. DNA-903) se transformaron con el producto de ligación, y se obtuvieron transformantes que crecieron en una placa de agar LB que contenía 50 μg/ml de ampicilina. Las colonias obtenidas se cultivaron a 37 °C 30 durante la noche en un medio líquido LB que contenía 50 μg/ml de ampicilina, y el plásmido pI*a*z se recuperó de las células bacterianas obtenidas.
[Ejemplo 31]
35
<Preparación de la variante pI*a*/B::atoDABΔgntR>
Las células competentes de la variante de Escherichia coli B::atoDABΔgntR preparada en el Ejemplo 6 se transformaron con el plásmido pI*a* preparado en el Ejemplo 30, y se cultivaron a 37 °C durante la noche en un
caldo LB, placa de agar Miller que contenía ampicilina 50 μg/ml, como resultado de lo cual se obtuvo la variante de Escherichia coli pI*a*/B::atoDABΔgntR.
[Ejemplo 32]
5
<Preparación de la variante pI*a*z/B::atoDABΔpgiΔgntR>
Las células competentes de la variante de Escherichia coli B::atoDABΔpgiΔgntR preparada en el Ejemplo 9 se transformaron con el plásmido pIa* preparado en el Ejemplo 30, y se cultivaron a 37 °C durante la noche en un caldo LB, placa de agar Miller que contenía 50 μg/ml de ampicilina, como resultado de lo cual se obtuvo Escherichia coli 10 pI*a*z/B::atoDABΔpgiΔgntR.
[Ejemplo 33]
<Preparación de la variante pI*a*z/B::atoDABΔpgiΔgndΔgntR> 15
Las células competentes de la variante de Escherichia coli B::atoDABΔpgiΔgndΔgntR preparada en el Ejemplo 21 se transformaron con el plásmido pI*a*z preparado en el Ejemplo 30, y se cultivaron a 37 °C durante una noche en un caldo LB, placa de agar Miller que contenía 50 μg/ml de ampicilina, como resultado de lo cual se obtuvo la variante de Escherichia coli pI*a*z/B::atoDABΔpgiΔgndΔgntR. 20
[Ejemplo 34]
<Preparación de la variante pI*a*/B::atoDAB>
25
Las células competentes de la variante de Escherichia coli B::atoDAB preparada en el Ejemplo 1 se transformaron con el plásmido pl*a* preparado en el Ejemplo 30 y se cultivaron a 37 °C durante la noche en un caldo LB, placa de agar Miller que contenía ampicilina 50 μg/ml, como resultado de lo cual se obtuvo la variante de Escherichia coli pI*a*/B::atoDAB.
30
[Ejemplo de prueba 2]
(Producción de alcohol isopropílico)
La evaluación de la producción de alcohol isopropílico se llevó a cabo de la misma manera que en el [Ejemplo de 35 Prueba 1] descrito anteriormente. En la Tabla 6 se muestra una lista de las variantes utilizadas en la evaluación. Además, los resultados de la evaluación se muestran en la Tabla 7.
Tabla 6
Nombre de la variante
Características Descripción referenciada
pI*a*/B::atoDAB
Contiene sistema de producción de AIP (los codones de IPAdh y adc se ha modificado) Ejemplo 34
pI*a*/B::atoDABΔgntR
Contiene sistema de producción de AIP (los codones de IPAdh y adc se ha modificado), ΔgntR Ejemplo 31
pI*a*z/B::atoDABΔpgiΔgntR
Contiene sistema de producción de AIP (os codones de IPAdh y adc se ha modificado), altos niveles de expresión de zwf, Δpgi, ΔgntR Ejemplo 32
pI*a*z/B::atoDABΔpgiΔgndΔgntR
Contiene sistema de producción de AIP (os codones de IPAdh y adc se ha modificado), altos niveles de expresión de zwf, Δpgi, Δgnd, ΔgntR Ejemplo 33
AIP se refiere a alcohol isopropílico
40
Tabla 7
Nombre de la variante
Cantidad de producción de AIP (g/l/72 h) Cantidad de producción de acetona (g/l/72 h)
pI*a*/B::atoDAB
64,1 36,3
pI*a*/B::atoDABΔgntR
75,5 31,2
pI*a*z/B::atoDABΔpgiΔgntR
92,5 14,0
pI*a*z/B::atoDABΔpgiΔgndΔgntR
99,7 18,6
La comparación de los resultados mostrados en la Tabla 7 con los resultados mostrados en la Tabla 4 demuestra que la modificación de los codones del gen de la alcohol isopropílico deshidrogenasa y del gen de acetoacetato deshidrogenasa mejora significativamente la eficacia de la producción de alcohol isopropílico. 45
[Ejemplo 35]
(Producción de alcohol isopropílico a partir de sacarosa)
Se introdujo adicionalmente un gen de la invertasa (cscA), que es una enzima que degrada la sacarosa, en la 5 variante pI*a*z/B::atoDABΔpgiΔgndΔgntR y se llevó a cabo la producción fermentativa de alcohol isopropílico a partir de sacarosa. Además, se produjo acetona o propileno a partir del líquido de fermentación resultante.
<Preparación de la variante pI*a*z-cscA/B::atoDABΔpgiΔgndΔgntR>
10
Se conoce la secuencia completa de bases del ADN genómico de la cepa de Escherichia coli O157 (número de acceso en GenBank AE005174), y también está descrita la secuencia de bases de un gen que codifica la invertasa (en lo sucesivo denominado en ocasiones como “cscA”) de la cepa de Escherichia coli O157. Es decir, cscA se describe en 3274383 a 3275816 de la secuencia genómica de la cepa de Escherichia coli O15 , que se describe con el número de acceso en GenBank AE005174. 15
Con el fin de obtener la cscA, se llevó a cabo la amplificación por un método de PCR usando el ADN genómico de la cepa de Escherichia coli O157 como molde y usando gctggtggaacatatgacgcaatctcgattgcatg (SEQ ID NO: 48) y ttaacccagttgccagagtgc (SEQ ID NO: 49), y los extremos del fragmento de ADN resultante se fosforilaron utilizando la polinucleótido quinasa de T4, como resultado de lo cual se obtuvo un fragmento de cscA de aproximadamente 1470 20 pb. Este fragmento de ADN se mezcló con un fragmento obtenido digiriendo pI*a*z preparado en el Ejemplo 30 con una enzima de restricción BamHI, generando extremos romos usando la ADN polimerasa de T4 y desfosforilando los extremos usando fosfatasa alcalina, y los fragmentos mezclados se ligaron usando un ligasa. A continuación, las células competentes de la cepa de Escherichia coli DH5α (Toyobo Co., Ltd. DNA-903) se transformaron con el producto de ligación, y se obtuvieron transformantes que crecieron en una placa de agar LB que contenía 50 μg/ml 25 de ampicilina a 30ºC. Se recuperaron plásmidos de las células bacterianas obtenidas, y un plásmido que se confirmó que tenía una inserción adecuada de la cscA por unión entre el lado 3' terminal del gen de la glucosa-6-fosfato-1-deshidrogenasa (zwf) y el lado 5' terminal de la cscA se denominó pI*a*-z-cscA.
Aquí, el genoma de Escherichia coli O157 está disponible en el Instituto de Materiales y Medidas de Referencia 30 (Institute for Reference Materials and Measurements).
Las células competentes de la variante de Escherichia coli B::atoDABΔpgiΔgndΔgntR preparada en el Ejemplo 21 se transformaron con el plásmido pI*a*z-cscA preparado anteriormente, y se cultivaron a 37 °C durante la noche en un caldo LB, placa de agar Miller que contenía 50 μg/ml de ampicilina, como resultado de lo cual se obtuvo la variante 35 de Escherichia coli pI*a*z-cscA/B::atoDABΔpgiΔgndΔgntR.
[Ejemplo de prueba 3]
(Producción de alcohol isopropílico y acetona) 40
La producción de alcohol isopropílico y acetona se llevó a cabo de la misma manera que en el [Ejemplo de Ensayo 1] descrito anteriormente, excepto que se utilizó la variante de Escherichia coli pI*a*z-cscA/B::atoDABΔpgiΔgndΔgntR y se usó una solución acuosa de sacarosa 40 % p/p como medio de cultivo en lugar de la solución acuosa de glucosa 50 % p/p. Como resultado, se observó la producción de 82,0 g/l de alcohol 45 isopropílico y 23,7 g/l de acetona 72 horas después del inicio del cultivo. El análisis por HPLC del agua de trampa del primer tanque reveló que contenía 0,14 % en masa de acetona y 0,55 % en masa de alcohol isopropílico.
(Recuperación de alcohol isopropílico y acetona)
50
Del agua de la trampa que contiene alcohol isopropílico y acetona, se recuperaron alcohol isopropílico y acetona a altas concentraciones por destilación.
Específicamente, se pasaron primero 9 l de la solución acuosa descrita anteriormente a través de una columna rellena con 250 ml de resina de intercambio catiónico (AMBERLYST 31 WET fabricada por Organo Corporation) a 55 un caudal de 500 ml/h, eliminándose amoníaco residual etc. La solución resultante se destiló a presión normal. Se recogió una muestra de una fracción obtenida en puntos de ebullición de 53 a 81,6 °C y se analizó por GC, y se encontró que contenía 19,1 % en masa de acetona, 60,5 % en masa de alcohol isopropílico, 0,5 % en masa de componentes no identificados y el resto agua. La fracción se usó como materia prima para las reacciones de deshidrogenación en los siguientes Ejemplos 36 a 39, y para la producción de propileno en el Ejemplo 40. 60
[Ejemplo 36]
(Fabricación de acetona)
65
<Preparación del catalizador de deshidrogenación ZnO:ZrO2 (94:6)>
Se añadieron 15,94 g (0,15 mol) de carbonato de sodio y 130 ml de agua a un matraz de fondo redondo de 500 ml equipado con paletas de agitación, para formar una solución. A la solución acuosa resultante, se añadió gota a gota durante una hora y media una solución acuosa obtenida disolviendo 34,36 g (0,11 mol) de nitrato de zinc 5 hexahidratado y 1,30 g (0,05 mol) de óxido de dinitrato de zirconio dihidratado en 150 ml de agua. El resultante se dejó reposar durante 5 días, luego se filtró y se lavó bien con agua. La materia blanca resultante se secó a 120 °C durante 2 horas, y a 400 °C durante 1 hora, y, finalmente, se calcinó a 600 °C durante 2 horas. Se obtuvo como polvo blanco 9,50 g de un catalizador de óxido complejo, ZnO:ZrO2 (94:6).
10
<Producción de acetona>
Se añadió 1,0 g del catalizador de óxido complejo ZnO:ZrO2 (94:6) (moldeado por compresión a 20 MPa y cuyo tamaño determinado posteriormente fue de 250 a 500 μm) a un reactor de SUS con un diámetro de 1 cm y una longitud de 40 cm, y el destilado obtenido anteriormente (acetona: 19,1 % en masa, alcohol isopropílico: 60,5 % en 15 masa, componentes no identificados: 0,5 % en masa, el resto: agua) se dejó fluir a través del reactor a 350 °C a una velocidad de 1,50 g/hora bajo una corriente de nitrógeno de 10 ml/min. Se enfrió un puerto de salida del reactor, atrapando así la solución de reacción y el gas de reacción. La muestra de producto obtenida a las 5 horas después del inicio de la reacción se analizó mediante cromatografía de gases y, como resultado, se determinó que la acetona se producía a alta concentración como se muestra en la Tabla 8 incluso cuando se usaba una gran cantidad de agua 20 y las impurezas de los organismos que contenían acetona y alcohol isopropílico. En la Tabla 8, “AIP” representa alcohol isopropílico (lo mismo se aplicará a continuación).
[Ejemplo 37]
25
Se llevaron a cabo los mismos procedimientos que en el Ejemplo 36, excepto que la temperatura de reacción se ajustó a 400 °C. Los resultados se muestran en la Tabla 8. Como se muestra en la Tabla 8, se produjo acetona a alta concentración.
[Ejemplo 38] 30
<Preparación del catalizador de deshidrogenación ZnO:ZrO2 (88:12)>
Se añadieron 15,94 g (0,15 mol) de carbonato de sodio y 130 ml de agua a un matraz de fondo redondo de 500 ml equipado con paletas de agitación, para formar una solución. A la solución acuosa resultante, se añadió gota a gota 35 durante una hora y media una solución acuosa obtenida disolviendo 32,86 g (0,11 mol) de nitrato de zinc hexahidratado y 2,66 g (0,10 mol) de óxido de dinitrato de zirconio dihidratado en 150 ml de agua. El resultante se dejó reposar durante 5 días, luego se filtró y se lavó bien con agua. La materia blanca resultante se secó a 120 °C durante 2 horas, y a 400 °C durante 1 hora, y, finalmente, se calcinó a 600 °C durante 2 horas. Se obtuvo como polvo blanco 9,94 g de un catalizador de óxido complejo, ZnO:ZrO2 (88:12). 40
<Producción de acetona>
Se añadió 1,0 g del catalizador de óxido complejo ZnO:ZrO2 (88:12) (moldeado por compresión a 20 MPa y cuyo tamaño determinado posteriormente fue de 250 a 500 μm) a un reactor de SUS con un diámetro de 1 cm y una 45 longitud de 40 cm, y el destilado obtenido anteriormente (acetona: 19,1 % en masa, alcohol isopropílico: 60,5 % en masa, componentes no identificados: 0,5 % en masa, el resto: agua) se dejó fluir a través del reactor a 350 °C a una velocidad de 1,50 g/h bajo una corriente de nitrógeno de 10 ml/min. Se enfrió un puerto de salida del reactor, atrapando así la solución de reacción y el gas de reacción. La muestra de producto obtenida a las 5 horas después del inicio de la reacción se analizó mediante cromatografía de gases y, como resultado, se encontró que la acetona 50 se producía a alta concentración como se muestra en la Tabla 8.
[Ejemplo 39]
Se llevaron a cabo los mismos procedimientos que en el Ejemplo 38, excepto que la temperatura de reacción se 55 ajustó a 400 °C. Los resultados se muestran en la Tabla 8. Como se muestra en la Tabla 8, se produjo acetona a alta concentración

Claims (12)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Una Escherichia coli productora de alcohol isopropílico que comprende un sistema de producción de alcohol isopropílico, en el que se inactiva una actividad del represor transcripcional GntR para mejorar la eficacia de la producción de alcohol isopropílico y la Escherichia coli productora de alcohol isopropílico comprende un grupo de 5 enzimas auxiliares que tienen un patrón de expresión de la actividad enzimática con el que se mantiene o aumenta la capacidad de producción de alcohol isopropílico conseguida mediante la inactivación de la actividad GntR, en el que el patrón de expresión de la actividad enzimática del grupo de enzimas auxiliares se selecciona del grupo que consiste en:
    10
    (1) mantenimiento de las actividades de tipo silvestre de la actividad glucosa-6-fosfato isomerasa (Pgi), la actividad glucosa-6-fosfato-1-deshidrogenasa (Zwf) y la actividad fosfogluconato deshidrogenasa (Gnd);
    (2) inactivación de la actividad glucosa-6-fosfato isomerasa (Pgi) y aumento de la actividad glucosa-6-fosfato-1-deshidrogenasa (Zwf); e
    (3) inactivación de la actividad glucosa-6-fosfato isomerasa (Pgi), aumento de la actividad glucosa-6-fosfato-1-15 deshidrogenasa (Zwf) e inactivación de la actividad fosfogluconato deshidrogenasa (Gnd), y
    en la que el sistema de producción de alcohol isopropílico está constituido por genes de las enzimas acetoacetato descarboxilasa, alcohol isopropílico deshidrogenasa, CoA transferasa y tiolasa.
    20
  2. 2. La Escherichia coli productora de alcohol isopropílico de acuerdo con la reivindicación 1, en la que la actividad glucosa-6-fosfato-1-deshidrogenasa (Zwf) es una actividad de la glucosa-6-fosfato-1-deshidrogenasa codificada por un gen de la glucosa-6-fosfato-1-deshidrogenasa de una bacteria del género Escherichia.
  3. 3. La Escherichia coli productora de alcohol isopropílico de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en la que: 25
    (a) el gen de la enzima acetoacetato descarboxilasa es un gen de la acetoacetato descarboxilasa de un procariota seleccionado del grupo que consiste en una bacteria del género Clostridium, una bacteria del género Bacillus y una bacteria del género Escherichia,
    (b) el gen de la enzima alcohol isopropílico deshidrogenasa es un gen de la alcohol isopropílico deshidrogenasa 30 de un procariota seleccionado del grupo que consiste en una bacteria del género Clostridium, una bacteria del género Bacillus y una bacteria del género Escherichia,
    (c) el gen de la enzima de la CoA transferasa es un gen de la CoA transferasa de un procariota seleccionado del grupo que consiste en una bacteria del género Clostridium, una bacteria del género Bacillus y una bacteria del género Escherichia, y 35
    (d) el gen de la enzima tiolasa es un gen de la tiolasa de un procariota seleccionado del grupo que consiste en una bacteria del género Clostridium, una bacteria del género Bacillus y una bacteria del género Escherichia.
  4. 4. La Escherichia coli productora de alcohol isopropílico de acuerdo con la reivindicación 1 o 3, en la que:
    40
    (a) la actividad acetoacetato descarboxilasa es una actividad de acetoacetato descarboxilasa codificada por un gen que codifica la acetoacetato descarboxilasa de Clostridium acetobutylicum,
    (b) la actividad alcohol isopropílico deshidrogenasa es una actividad de alcohol isopropílico deshidrogenasa codificada por un gen que codifica la alcohol isopropílico deshidrogenasa de Clostridium beijerinckii,
    (c) la actividad CoA transferasa es una actividad de CoA transferasa codificada por un gen que codifica la CoA 45 transferasa de Escherichia coli, y
    (d) la actividad tiolasa es una actividad de tiolasa codificada por un gen que codifica la tiolasa de Escherichia coli.
  5. 5. La Escherichia coli productora de alcohol isopropílico de acuerdo con la reivindicación 1, en la que:
    50
    (a) la actividad alcohol isopropílico deshidrogenasa es una actividad de alcohol isopropílico deshidrogenasa codificada por un gen que codifica la alcohol isopropílico deshidrogenasa introducido como un gen modificado, y/o
    (b) la actividad acetoacetato descarboxilasa es una actividad de acetoacetato descarboxilasa codificada por un gen que codifica la acetoacetato descarboxilasa introducido como un gen modificado. 55
  6. 6. La Escherichia coli productora de alcohol isopropílico de acuerdo con la reivindicación 5, en la que el gen modificado de la alcohol isopropílico deshidrogenasa tiene una secuencia de bases de SEQ ID NO: 40, y el gen modificado de la acetoacetato descarboxilasa tiene una secuencia de bases de SEQ ID NO: 43.
    60
  7. 7. La Escherichia coli productora de alcohol isopropílico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 3 a 6, que comprende además al menos un gen de sacarosa hidrolasa de entre genes de sacarosa no PTS.
  8. 8. Un método de producción de alcohol isopropílico, que comprende la producción de alcohol isopropílico a partir de una materia prima procedente de plantas utilizando la Escherichia coli productora de alcohol isopropílico de una 65 cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.
  9. 9. Un método para producir acetona, que comprende:
    obtener alcohol isopropílico a partir de una materia prima procedente de plantas utilizando la Escherichia coli productora de alcohol isopropílico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7; y
    poner en contacto el alcohol isopropílico obtenido con un óxido complejo como catalizador que incluye óxido de 5 zinc y al menos un óxido que contiene un elemento del Grupo 4, y que se prepara por coprecipitación.
  10. 10. Un método para producir propileno, que comprende:
    obtener alcohol isopropílico que contiene acetona a partir de una materia prima procedente de plantas utilizando 10 la Escherichia coli productora de alcohol isopropílico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, y
    poner en contacto el alcohol isopropílico con una sustancia ácida sólida y un catalizador de hidrogenación que contiene Cu como catalizadores, a una temperatura de reacción dentro de un intervalo de 50 a 300 °C.
  11. 11. El método para producir propileno de acuerdo con la reivindicación 10, en el que el catalizador de hidrogenación 15 que contiene Cu es un catalizador que incluye además al menos un elemento seleccionado del grupo que consiste en elementos del Grupo 6, Grupo 12 y Grupo 13.
  12. 12. El método para producir propileno de acuerdo con la reivindicación 10 u 11, en el que la sustancia ácida sólida es zeolita. 20
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Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8647642B2 (en) 2008-09-18 2014-02-11 Aviex Technologies, Llc Live bacterial vaccines resistant to carbon dioxide (CO2), acidic PH and/or osmolarity for viral infection prophylaxis or treatment
CA2844529C (en) 2011-08-11 2016-10-04 Mitsui Chemicals, Inc. Method for producing isopropyl alcohol by continuous culture
JP6175500B2 (ja) * 2013-07-23 2017-08-02 旭化成株式会社 銅及び／又は銅酸化物分散体、並びに該分散体を用いて形成された導電膜
KR101734957B1 (ko) * 2014-02-18 2017-05-15 부산대학교 산학협력단 수소 및 에탄올의 동시 생산을 위한 고효율 유전자 재조합 대장균 균주 및 포도당을 이용한 수소 및 에탄올의 고효율 동시 생산 방법
CN105734002B (zh) * 2014-12-10 2019-06-25 中粮集团有限公司 一种重组谷氨酸生产菌株及其制备方法与应用
JPWO2016093294A1 (ja) * 2014-12-11 2017-09-14 東レ株式会社 アルコールの製造方法
CN106059066A (zh) * 2016-05-16 2016-10-26 蒋志波 一种电力网络监测系统
US11180535B1 (en) 2016-12-07 2021-11-23 David Gordon Bermudes Saccharide binding, tumor penetration, and cytotoxic antitumor chimeric peptides from therapeutic bacteria
US11129906B1 (en) 2016-12-07 2021-09-28 David Gordon Bermudes Chimeric protein toxins for expression by therapeutic bacteria
CN109295016B (zh) * 2017-07-24 2021-11-02 清华大学 与耐受高浓度甲醇相关的蛋白质
CN110747156B (zh) * 2019-11-16 2021-03-30 湖北大学 敲除解淀粉芽胞杆菌nanR基因在提高1-脱氧野尻霉素产量中的应用

Family Cites Families (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DD84378A (es)
DE84378C (es)
GB665376A (en) 1948-08-23 1952-01-23 Standard Oil Dev Co Catalytic dehydrogenation of alcohols
JP2774607B2 (ja) 1988-09-30 1998-07-09 三井化学株式会社 フェノールの製造方法およびその製造時の副生アセトンからプロピレンを得る方法
JP2786272B2 (ja) 1989-10-24 1998-08-13 三井化学株式会社 イソプロパノールの製造方法
EP0501765A1 (en) 1991-03-01 1992-09-02 Takeda Chemical Industries, Ltd. Method of producing D-ribose
JPH0753433A (ja) 1993-08-20 1995-02-28 Showa Denko Kk ケトン類の製造方法
JPH1135497A (ja) * 1997-07-15 1999-02-09 Mitsui Chem Inc クメンの製造方法
JPH1135498A (ja) * 1997-07-22 1999-02-09 Mitsui Chem Inc クメンの製造方法
JPH11335315A (ja) 1998-05-26 1999-12-07 Nippon Shokubai Co Ltd ケトンの製造方法とこの方法に使用する触媒
JP5156017B2 (ja) 2007-07-11 2013-03-06 三井化学株式会社 イソプロピルアルコール生産細菌及びこれを用いたイソプロピルアルコール生産方法
FR2920119B1 (fr) 2007-08-23 2010-02-26 Faurecia Interieur Ind Panneau de garnissage souple de vehicule automobile comprenant un pictogramme retroeclaire
US8426172B2 (en) 2007-08-29 2013-04-23 Research Institute of Innovation Technology for the Earth Transformant capable of producing isopropanol
KR20100087695A (ko) 2007-10-12 2010-08-05 더 리전트 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아 이소프로판올을 생산하도록 조작된 미생물
US20090246842A1 (en) 2008-02-15 2009-10-01 Gevo, Inc. Engineered microorganisms for producing propanol
WO2009103026A1 (en) * 2008-02-15 2009-08-20 Gevo, Inc. Engineered microorganisms for producing isopropanol
JP2009247217A (ja) 2008-04-01 2009-10-29 Kyushu Univ 好気性組み換え微生物を用いる２−プロパノールの製造方法
JP5395063B2 (ja) * 2008-04-25 2014-01-22 公益財団法人地球環境産業技術研究機構 イソプロパノール生産能を有するコリネ型細菌の形質転換体
CA2744991C (en) 2008-12-01 2013-07-16 Mitsui Chemicals, Inc. Olefin production process
JP5777848B2 (ja) 2009-02-03 2015-09-09 栗田工業株式会社 溶解物濃度の測定方法及び測定装置
JP4988902B2 (ja) 2009-07-31 2012-08-01 株式会社日立国際電気 半導体デバイスの製造方法及び基板処理装置

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Publication number Publication date
JP5674789B2 (ja) 2015-02-25
BR112013003336A2 (pt) 2016-07-12
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US9267156B2 (en) 2016-02-23
US20130211170A1 (en) 2013-08-15
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TWI531649B (zh) 2016-05-01
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WO2012020833A9 (ja) 2013-01-03
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