KR20100087695A - 이소프로판올을 생산하도록 조작된 미생물 - Google Patents

이소프로판올을 생산하도록 조작된 미생물 Download PDF

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KR20100087695A
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제임스 씨. 리아오
쇼타 아추미
타이조 하나이
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더 리전트 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
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Abstract

생물연료(biofuel)를 생산하는데 유용한 대사-변형 미생물이 본 발명에 개시된다.

Description

이소프로판올을 생산하도록 조작된 미생물{MICROORGANISM ENGINEERED TO PRODUCE ISOPROPANOL}
관련 출원에 대한 교차 참조
본 출원은 2007년 10월 12일 제출된 미국 가출원 60/979,731에 우선권을 주장하고, 상기 출원의 공개는 본 발명에 참조로서 편입된다.
본 발명의 기술 분야
대사 변형(metabolically-modified) 미생물 및 이들 미생물의 생산 방법이 제시된다. 또한, 적절한 기질(substrate)을 대사 변형 미생물과 접촉시켜 생물연료(biofuel)를 생산하고 이들로부터 효소 제조물(enzymatic preparation)을 생산하는 방법이 제시된다.
경제 및 환경에 대한 우려로 인하여, 석유 대체물로서 생물연료에 대한 수요가 증가할 것으로 예상된다. 일반적인 생물연료인 에탄올은 가솔린보다 에너지 밀도(energy density)가 낮고, 수송 연료로서 이용하기 위해서는 제한된 농도 범위에서 가솔린과 혼합되어야 하기 때문에 이상적이지 않다. 에탄올은 또한, 흡습성(hygroscopic)과 부식성(corrosive)이기 때문에, 저장과 유통 시스템에서 문제를 유발한다. 이소프로판올은 에탄올에 비하여 1-부탄올과 동일한 이점을 갖는다; 이소프로판올은 가지형 탄소 사슬로 인하여, 1-부탄올보다 높은 옥탄가(octane number)를 보유하는 추가적인 이점을 갖는다. 1-부탄올은 발효 산물(fermentation product)로서 생산되고 모터 연료(motor fuel)로서 이용되고 있는 반면, 이소프로판올은 재생가능 자원(renewable source)으로부터 높은 수율로 생산된 적이 없고, 엔진 첨가제(engine additive)로서 이용되고 있긴 하지만 가솔린 대체물(gasoline substitute)로서 고려된 바가 없다.
요약
본 발명에서는 이소프로판올과 같은 생물연료를 생산하는데 유용한 재조합 생화학 경로를 포함하는 대사-변형 미생물이 제시된다. 또한, 본 발명에 개시된 미생물을 이용하여 생물연료를 생산하는 방법이 제시된다.
본 발명에서는 적절한 탄소 기질의 발효로부터 이소프로판올을 생산하는 생화학 경로를 포함하는 재조합 미생물을 제시하는데, 상기 생화학 경로는 아세틸-CoA 아세틸전이효소(acetyl-CoA acetyltransferase)를 포함하고, 여기서 상기 미생물은 상응하는 부모 미생물과 비교하여, 최소한 하나의 이질성 폴리펩티드를 포함한다. 한 구체예에서, 상기 미생물은 부모 미생물과 비교하여, 아세틸-CoA 아세틸전이효소 활성을 갖는 폴리펩티드의 상승된 발현을 보유하고, 여기서 상기 재조합 미생물은 아세틸-CoA를 포함하는 기질로부터 아세토아세틸-CoA를 포함하는 대사산물을 생산한다. 한 구체예에서, 아세틸-CoA 아세틸전이효소 활성을 갖는 폴리펩티드는 atoB 유전자 또는 이의 동족체(homolog), 또는 fadA 유전자 또는 이의 동족체에 의해 인코딩된다. 다른 구체예에서, 아세틸-CoA 아세틸전이효소 활성을 갖는 폴리펩티드는 SEQ ID NO:1에 열거된 서열에 최소한 약 50% 동일성(identity)을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된다. atoB 유전자 또는 fadA 유전자는 에스체리키아(Escherichia) 속으로부터 유래될 수 있다. 한 구체예에서, 상기 미생물은 재조합 대장균(E. coli)이다. 다른 구체예에서, 아세틸-CoA 아세틸전이효소 활성을 갖는 폴리펩티드는 thl 유전자 또는 이의 동족체에 의해 인코딩된다. 한 구체예에서, thl 유전자는 클로스트리듐(Clostridium) 속으로부터 유래된다. 또 다른 구체예에서, 상기 미생물은 부모 미생물과 비교하여, 아세토아세틸-CoA 전이효소(acetoacetyl-CoA transferase) 활성을 갖는 폴리펩티드의 상승된 발현을 보유하고, 여기서 상기 재조합 미생물은 아세토아세틸-CoA를 포함하는 기질로부터 아세토아세트산염을 포함하는 대사산물을 생산한다. 다른 구체예에서, 아세토아세틸-CoA 전이효소는 atoAD 유전자 또는 이의 동족체에 의해 인코딩된다(가령, atoD는 SEQ ID NO:3에 열거된 서열을 포함한다). 한 구체예에서, atoD는 SEQ ID NO:3에 최소한 50%, 60% 또는 70% 또는 그 이상 동일한 서열을 포함한다. 다른 구체예에서, atoAD는 대장균(E. coli)으로부터 유래된다. 또 다른 구체예에서, 상기 미생물은 부모 미생물과 비교하여, 아세토아세트산염 탈탄소효소(acetoacetate decarboxylase) 활성을 갖는 폴리펩티드의 상승된 발현을 보유하고, 여기서 상기 재조합 미생물은 아세토아세트산염을 포함하는 기질로부터 아세톤을 포함하는 대사산물을 생산한다. 다른 구체예에서, 상기 미생물은 adc 유전자 또는 이의 동족체에 의해 인코딩된 아세토아세트산염 탈탄소효소를 포함한다. 한 구체예에서, adc 유전자는 클로스트리듐 아세토부틸리쿰(Clostridium acetobutylicum), 부티리비브리오 피브리솔벤스(Butyrivibrio fibrisolvens), 서모언에로박테리움 서모사카롤리티쿰(Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum), 그리고 클로스트리듐 디피실(Clostridium difficile)로부터 유래된다. 특정 구체예에서, 상기 미생물은 클로스트리듐 아세토부틸리쿰(Clostridium acetobutylicum)이다. 또 다른 구체예에서, 아세토아세트산염 탈탄소효소는 SEQ ID NO:5에 최소한 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% 동일한 서열을 포함한다. 다른 구체예에서, 상기 미생물은 부모 미생물과 비교하여, 이차 알코올 탈수소효소 활성(secondary alcohol dehydrogenase activity)을 갖는 폴리펩티드의 상승된 발현을 보유하고, 여기서 상기 재조합 미생물은 아세톤을 포함하는 기질로부터 이소프로판올을 포함하는 대사산물을 생산한다. 한 구체예에서, 이차 알코올 탈수소효소 활성을 갖는 폴리펩티드는 adh 또는 sadh 유전자 또는 이의 동족체에 의해 인코딩된다. 또 다른 구체예에서, adh 유전자는 서모언에어로박터 브록키(T. brockii) 또는 클로스트리듐 베이어린키(C. beijerinckii)로부터 유래된다. 다른 구체예에서, adh 또는 sadh는 SEQ ID NO:7 또는 9에 최소한 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% 동일하고 알코올 탈수소효소 활성을 갖는 서열을 포함한다. 한 구체예에서, 상기 미생물은 아세틸-CoA 아세틸전이효소, 아세토아세틸-CoA 전이효소, 아세토아세트산염 탈탄소효소 및 adh(이차 알코올 탈수소효소)의 발현 또는 증가된 발현을 보유한다.
본 발명에서는 또한, 적절한 탄소 기질의 발효로부터 이소프로판올을 생산하는 재조합 생화학 경로를 포함하는 재조합 미생물을 제시하는데, 여기서 상기 재조합 생화학 경로는 아세틸-CoA 아세틸전이효소, 아세토아세틸-CoA 전이효소, 아세토아세트산염 탈탄소효소 및 adh(이차 알코올 탈수소효소)의 상승된 발현을 보유한다.
본 발명에서는 또한, 적절한 탄소 기질을 이소프로판올로 전환하는 재조합 미생물을 생산하는 방법을 제시하는데, 상기 방법은 아세틸-CoA 아세틸전이효소, 아세토아세틸-CoA 전이효소, 아세토아세트산염 탈탄소효소 및 adh(이차 알코올 탈수소효소) 활성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드로 미생물을 형질전환시키는 단계를 포함한다.
본 발명에서는 이소프로판올을 생산하는 방법을 제시하는데, 상기 방법은 생물체 내에서, thl 또는 atoB 유전자, ctfAB 또는 atoAD 유전자 또는 오페론, adc 유전자, adh(이차 알코올 탈수소효소) 유전자, 또는 이들의 조합의 과다-발현(over-expression)을 유도하는 단계를 포함하고, 여기서 상기 생물체는 적절한 탄소 기질의 존재에서 배양될 때 이소프로판올을 생산한다.
본 발명에서는 이소프로판올이 생산되는 조건 하에 상기 미생물을 배양하는 단계를 포함하는, 이소프로판올을 생산하는 방법을 제시한다.
본 발명에서는 또한, 이소프로판올을 생산하는 방법을 제시하는데, 상기 방법은 (i) 생물체 내에서 thl 또는 atoB 유전자의 과다-발현을 유도하는 단계; (ii) 생물체 내에서 ctfAB 또는 atoAD 유전자의 과다-발현을 유도하는 단계; (iii) 생물체 내에서 adc 유전자의 과다-발현을 유도하는 단계; (iv) 생물체 내에서 adh 유전자의 과다-발현을 유도하는 단계; 또는 (v) (i), (ii), (iii), 그리고 (iv)의 과다-발현을 유도하는 단계를 포함한다.
본 발명에서는 (i) 아세토아세틸-CoA를 포함하는 기질로부터 아세토아세트산염의 전환을 촉진하는 첫 번째 폴리펩티드를 인코딩하는 첫 번째 폴리뉴클레오티드; (ii) 아세토아세트산염을 포함하는 기질로부터 아세톤의 전환을 촉진하는 두 번째 폴리펩티드를 인코딩하는 두 번째 폴리뉴클레오티드; 그리고 (iii) 아세톤을 포함하는 기질로부터 이소프로판올의 전환을 촉진하는 세 번째 폴리펩티드를 인코딩하는 세 번째 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터를 제시한다. 한 구체예에서, 상기 벡터는 플라스미드일 수 있다. 다른 구체예에서, 상기 벡터는 발현 벡터일 수 있다. 더 나아가, 상기 벡터는 숙주 세포(가령, 미생물)를 형질전환(transformation) 또는 형질감염(transfection)시키는데 이용될 수 있다. 이러한 형질감염된 또는 형질전환된 미생물은 이소프로판올을 생산하는데 이용될 수 있다.
본 발명에서는 글루코오스의 이소프로판올로의 전환을 촉진하는 최소한 하나의 이질성 핵산 서열을 포함하는 재조합 미생물을 제시한다.
상세한 설명
본 명세서에서 달리 명시되지 않으면, 이용된 용어는 제약 과학(pharmaceutical science) 분야에 이용되는 표준 용어로서 정의된다. 본 명세서에서 그리고 첨부된 특허청구범위에서, 단수형은 문맥에서 달리 명시되지 않으면 복수의 지시물을 포괄한다. 따라서 예로써, 단수형 "기질"에 대한 언급은 2개 이상의 이와 같은 기질의 혼합물을 포괄한다.
또한, "또는"의 이용은 달리 명시되지 않으면, "및/또는"을 의미한다. 유사하게, "보유한다", "보유하는", "포함한다", 그리고 "포함하는"은 동의어로서 이용되고, 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
다양한 구체예의 설명이 용어 "포함하는"을 이용하는 경우에, 당업자는 일부 특정 사례에서, 구체예가 용어 "본질적으로 구성되는" 또는 "구성되는"에 의해 대안적으로 기술될 수 있음을 인지할 것이다.
달리 정의되지 않으면, 본 명세서에 이용된 모든 기술용어 및 과학용어는 본 발명이 속하는 분야에서 평균적인 지식을 갖는 자에게 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서에 기재된 방법과 시제(reagent)에 유사하거나 동등한 임의의 방법과 시제가 본 발명에 개시된 발명과 조성물을 실시하는데 이용될 수 있긴 하지만, 전형적인 방법과 재료가 본 명세서에서 기술된다.
본 명세서에 언급된 모든 간행물은 이들 간행물에서 기술되고 본 발명과 관련하여 이용될 수도 있는 방법을 기술하고 개시하는 목적으로, 본 발명에 순전히 참조로서 편입된다. 본 명세서 전반에서 언급되는 간행물은 본 출원의 출원일 이전에 이들의 공개 목적으로만 제공된다. 이들 선행 공개는 본 발명보다 앞서는 것으로 간주되지 않는다.
클로스트리듐 아세토부틸리쿰(Clostridium acetobutylicum)과 같은 1-부탄올의 자연 생산자들은 또한, 발효 산물로서 아세톤, 에탄올과 부티르산과 같은 부산물을 생산한다. 수율(yield)과 생산성(productivity)을 최적화하기 위하여 높은 1-부탄올 생산자가 개발되었다. 하지만, 이들 미생물 중에서 대부분은 조작하기가 상당히 어렵다. 이들 생물체에 대한 유전적 조작 툴은 대장균(E. coli)과 같은 이용자 친화적 숙주에서만큼 효율적이지 않으며, 생리학 및 그들의 대사 조절에 관한 이해가 훨씬 불충분하여 고효율 생산을 향한 신속한 진전을 방해한다. 게다가, 소량이 미생물 부산물로서 확인되긴 했지만, 글루코오스로부터 다른 고급 알코올(higher alcohol), 예를 들면, 이소프로판올, 2-메틸 1-부탄올, 3-메틸 1-부탄올, 그리고 2-페닐에탄올을 산업적으로 적절한 양으로 생산하는 것으로 밝혀진 자연 미생물은 없다.
다양한 구체예에서, 본 발명에 개시된 대사 조작된 미생물은 이소프로판올을 비롯한 알코올의 생산을 위한 생화학 경로를 포함한다. 다양한 관점에서, 본 발명에 개시된 재조합 미생물은 부모 미생물과 비교하여, 최소한 하나의 표적 효소의 상승된 발현을 보유한다. 상기 표적 효소는 적절한 생물학적 공급원로부터 유래된 핵산 서열에 의해 인코딩되고, 이로부터 발현된다. 일부 관점에서, 핵산 서열은 세균 또는 효모 공급원으로부터 유래된 유전자이다.
본 명세서에서, 용어 "대사 조작된" 또는 "대사 조작(metabolic engineering)"은 미생물에서 알코올과 같은 원하는 대사산물의 생산을 위하여, 생합성 유전자, 오페론과 연관된 유전자, 그리고 이들 핵산 서열의 제어 요소(control elements)의 합리적 경로 디자인과 어셈블리를 수반한다. "대사 조작된"은 유전자 조작과 적절한 배양 조건을 이용한 전사(transcription), 번역(translation), 단백질 안정성(protein stability)과 단백질 기능성(protein functionality)의 조절과 최적화에 의한 대사 흐름(metabolic flux)의 최적화를 더욱 포함할 수 있다. 생합성 유전자는 숙주에 외래성이거나, 또는 돌연변이유발(mutagenesis), 재조합(recombination) 및/또는 내인성 숙주 세포에서 이종 발현 제어 서열과의 연관에 의해 변형됨으로써, 숙주(가령, 미생물)에 이종성일 수 있다. 적절한 배양 조건은 배양 배지 pH, 이온 강도, 영양 함량 등의 조건; 온도; 산소/이산화탄소/질소 함량; 습도; 그리고 숙주 미생물, 다시 말하면, 상기 미생물의 물질대사 작용에 의한 화합물의 생산을 가능하게 하는 기타 배양 조건이다. 숙주 세포로서 기능할 수 있는 미생물에 적합한 배양 조건은 널리 알려져 있다.
따라서 대사 "조작된" 또는 "변형된" 미생물은 유전 물질을 선택된 숙주 또는 부모 미생물 내로 도입하여 미생물의 세포 생리와 생화학을 변형하거나 변경함으로써 생산된다. 유전 물질의 도입을 통하여, 부모 미생물은 새로운 성질, 예를 들면, 새로운 세포내 대사산물 또는 더욱 많은 양의 세포내 대사산물을 생산하는 능력을 획득한다. 예시적인 구체예에서, 유전 물질의 부모 미생물 내로의 도입은 이소프로판올과 같은 알코올을 생산하는 새롭거나 변형된 능력을 결과한다. 부모 미생물에 도입된 유전 물질은 알코올 생산을 위한 생합성 경로에 관여하는 하나 이상의 효소를 코딩하는 유전자(들) 또는 유전자(들)의 일부를 포함하고, 이들 유전자의 발현 및/또는 발현 조절을 위한 추가 구성요소, 예를 들면, 프로모터 서열을 포함할 수도 있다.
본 발명에 개시된 미생물은 부모 미생물에서는 가능하지 않은 양으로 대사산물을 생산하도록 변형된다. "대사산물(metbolite)"은 대사에 의해 생산되는 임의의 물질, 또는 특정 대사 과정을 위해 필요하거나 이러한 과정에 참여하는 물질을 지칭한다. 대사산물은 대사의 출발 물질(가령, 글루코오스 또는 피루브산염), 대사에서 중간생성물(가령, 아세틸-CoA), 또는 대사의 최종 산물(가령, 이소프로판올)인 유기 화합물일 수 있다. 대사산물은 더욱 복잡한 분자를 구성하는데 이용되거나, 또는 더욱 단순한 분자로 분해될 수 있다. 중간 대사산물은 다른 대사산물로부터 합성되거나, 아마도 더욱 복잡한 물질을 만드는데 이용되거나, 또는 종종 화학 에너지의 방출과 함께 더욱 단순한 화합물로 분해될 수 있다. 대사의 최종 산물은 다른 대사산물의 분해의 최종 결과물이다.
"대사 경로"로 지칭되는 용어 "생합성 경로"는 하나의 화학종을 다른 종으로 전환(transmuting)시키기 위한 일단의 동화(anabolic) 또는 이화(catabolic) 생화학 작용을 지칭한다. 유전자 산물은 병렬로 또는 직렬로 동일 기질에 작용하여 동일 산물을 생산하거나, 또는 동일 기질과 대사 최종 산물 사이의 대사 중간생성물(즉, 대사산물)에 작용하거나 또는 이를 생산하면, 동일한 "대사 경로"에 속한다.
용어 "기질" 또는 "적절한 기질"은 효소의 작용에 의해 다른 화합물로 전환되거나 전환되게 되어있는 임의의 물질 또는 화합물을 지칭한다. 상기 용어는 단일 화합물뿐만 아니라, 용액, 혼합물 및 최소한 하나의 기질을 포함하는 다른 물질과 같은 화합물의 조합, 또는 이들의 유도체를 포괄한다. 게다가, 용어 "기질"은 바이오매스(biomass) 유도된 당과 같은 출발 물질로서 이용하기 적절한 탄소 공급원을 제공하는 화합물뿐만 아니라, 본 발명에 개시된 대사 조작 미생물과 연관된 경로에서 이용되는 중간생성물과 최종 대사산물을 포괄한다. "바이오매스 유도된 당"에는 글루코오스, 만노오스, 크실로오스와 아라비노오스와 같은 분자들이 포함되지만 이들에 한정되지 않는다. 용어 바이오매스 유도된 당은 D 또는 L 형태로 글루코오스, 락토오스, 소르보스, 과당, 이도오스, 갈락토오스와 만노오스를 비롯한 6개 탄소당, 또는 6개 탄소당의 조합, 예를 들면, 글루코오스와 과당 및/또는 2-케토-L-굴론산(gulonic acid), 이돈산(IA), 글루콘산(GA), 6-포스포글루코네이트(phosphogluconate), 2-케토-D-글루콘산(2 KDG), 5-케토-D-글루콘산, 2-케토글루코네이트 인산염, 2,5-디케토-L-굴론산, 2,3-L-디케토굴론산, 데히드로아스코르빈산, 에리소르브산(EA) 및 D-만논산을 비롯한 6개 탄소당 산(carbon sugar acid)과 같은, 미생물에 의해 통상적으로 이용되는 적절한 탄소 기질을 포괄한다.
본 발명에 개시된 재조합 미생물은 적절한 탄소 기질을 이용하여, 이소프로판올의 생산을 위한 경로에 관여하는 복수의 표적 효소를 발현시킬 수 있다.
일련의 미생물은 이소프로판올의 생산에 적절한 재조합 대사 경로를 포함하도록 변형될 수 있다. 다양한 미생물은 본 발명에 개시된 재조합 미생물에 이용하기 적합한 표적 효소를 인코딩하는 유전 물질에 대한 "공급원"으로서 작용할 수 있다. 용어 "미생물"은 고세균(Archaea), 진정세균(Bacteria)과 진핵생물(Eucarya) 영역으로부터 원핵 및 진핵 미생물 종을 포괄하는데, 후자는 효모 및 사상 균류, 단세포동물, 조류, 또는 고등 원생생물(Protista) 등을 포함한다. 용어 "세균 세포" 및 "세균"은 미생물과 동의어로 이용된다.
용어 "원핵 생물"은 핵이나 기타 세포 소기관을 포함하지 않은 세포를 지칭한다. 원핵 생물은 일반적으로, 진정세균과 고세균 영역 중의 하나로 분류된다. 진정세균과 고세균 생물체 사이에 결정적 차이는 16S 리보솜 RNA에서 뉴클레오티드 염기 서열에서 근본적인 차이에 기초한다.
용어 "고세균"은 전형적으로 특별한 환경에서 발견되고 리보솜 단백질의 총수와 세포벽에서 뮤람산(muramic acid)의 결핍을 비롯한 여러 기준에 의해 나머지 원핵 생물로부터 구별되는, 멘도시쿠테스(Mendosicutes) 부문(division)의 생물체 분류를 지칭한다. ssrRNA 분석에 기초하여, 고세균은 계통 발생적으로 상이한 2가지 그룹으로 구성된다: 크렌아키아문(Crenarchaeota)과 유리아키아문(Euryarchaeota). 그들의 생리학에 기초하여, 고세균은 3가지 유형으로 분류될 수 있다: 메탄생성균(methanogen)(메탄을 생산하는 원핵 생물); 극호염균(extreme halophile)(매우 높은 농도의 염(NaCl)에서 생존하는 원핵 생물); 그리고 극(초)호열균(extreme(hyper) thermophilus)(매우 높은 온도에서 생존하는 원핵 생물). 이들을 진정세균으로부터 구별하는 통합 고세균 특징(즉, 세포벽에 뮤레인(murein) 없음, 에스테르-연결된 격막 지질 등) 이외에, 이들 원핵 생물은 특정 서식 환경에 그들을 적응시키는 독특한 구조적 또는 생물화학적 속성(attribute)을 나타낸다. 크렌아키아문은 주로, 초호열성 황-의존성 원핵 생물로 구성되고, 유리아키아문은 메탄생성균과 극호염균을 포함한다.
"세균(bacterial)" 또는 "진정세균(eubacteria)"은 원핵 생물체의 영역을 지칭한다. 세균은 아래와 같은 최소한 11가지 상이한 그룹을 포함한다: (1) 그램 양성(gram+) 세균, 여기에는 2가지 주요 아부문(subdivision)이 존재한다: (1) 높은 G+C 그룹(방선균(Actinomycete), 마이코박테리아(Mycobacteria), 미구균(Micrococcus) 등) (2) 낮은 G+C 그룹 (바실루스(Bacillus), 클로스트리디아(Clostridia), 락토바실루스(Lactobacillus), 스타필로코커스(Staphylococcus), 스트렙토코커스(Streptococcus), 마이코플라즈마(Mycoplasma)); (2) 프로테오박테리아(Proteobacteria), 예를 들면, 자색 광합성 + 비광합성 그램 음성 세균(대부분의 "일반적인" 그램 음성 세균을 포함); (3) 시아노박테리아(Cyanobacteria), 예를 들면, 산소발생성 광합성미생물(oxygenic phototroph); (4) 스피로헤타(Spirochete) 및 관련 종; (5) 플랑크토미세스(Planctomyces); (6) 박테로이데스(Bacteroides), 플라보박테리아(Flavobacteria); (7) 클라미디아(Chlamydia); (8) 녹색 유황 세균(Green sulfur bacteria); (9) 녹색 비유황 세균(Green non-sulfur bacteria)(또한 혐기성 광합성미생물); (10) 방사선 내성 미구균(Radioresistant micrococcus) 및 관련 균들; (11) 서모토가(Thermotoga) 및 써모시포 써모필레스(Thermosipho thermophiles).
"그램 음성 세균"에는 구균(coccus), 비-장 간상균(nonenteric rods), 그리고 장 간상균(enteric rods)이 포함된다. 그램 음성 세균의 속(genus)에는 예로써, 니세리아(Neisseria), 스피릴룸(Spirillum), 파스튜렐라(Pasteurella), 브루셀라(Brucella), 예르시니아(Yersinia), 프란시셀라(Francisella), 헤모필루스(Haemophilus), 보르데텔라(Bordetella), 에스체리키아(Escherichia), 살모넬라(Salmonella), 시겔라(Shigella), 클렙시엘라(Klebsiella), 프로테우스(Proteus), 비브리오(Vibrio), 슈도모나스(Pseudomonas), 박테로이데스(Bacteroides), 아세토박터(Acetobacter), 에어로박터(Aerobacter), 아그로박테리움(Agrobacterium), 아조토박터(Azotobacter), 스피릴라(Spirilla), 세라티아(Serratia), 비브리오(Vibrio), 리조비움(Rhizobium), 클라미디아(Chlamydia), 리케트시아(Rickettsia), 트레포네마(Treponema), 그리고 푸소박테리움(Fusobacterium)이 포함된다.
"그램 양성 세균"에는 구균, 비-포자 형성(nonsporulating) 간상균, 그리고 포자 형성(sporulating) 간상균이 포함된다. 그램 양성 세균의 속에는 예로써, 방선균(Actinomyces), 바실루스(Bacillus), 클로스트리듐(Clostridium), 코리네박테리움(Corynebacterium), 에리시펠로트릭스(Erysipelothrix), 락토바실루스(Lactobacillus), 리스테리아(Listeria), 마이코박테리움(Mycobacterium), 마이소코커스(Myxococcus), 노카르디아(Nocardia), 스타필로코커스(Staphylococcus), 스트렙토코커스(Streptococcus), 그리고 스트렙토미세스(Streptomyces)가 포함된다.
용어 "재조합 미생물" 및 "재조합 숙주 세포"는 본 명세서에서 동의어로 이용되며, 내인성(endogenous) 핵산 서열을 발현하거나 과다 발현하기 위하여, 또는 벡터에 내포된 것들과 같은 비-내인성(non-endogenous) 서열을 발현하기 위하여 유전적으로 변형된 미생물을 지칭한다. 핵산 서열은 일반적으로, 앞서 기술된 바와 같은 원하는 대사산물을 생산하기 위한 대사 경로에 관여하는 표적 효소를 인코딩한다. 따라서 본 발명에 개시된 재조합 미생물은 부모 미생물에 의해 이전에 발현되지 않거나 과다 발현되지 않은 표적 효소들을 발현하거나 과다 발현하도록 유전자 조작되었다. 용어 "재조합 미생물" 및 "재조합 숙주 세포"는 특정 재조합 미생물뿐만 아니라 이런 미생물의 후손 또는 잠재적 후손을 지칭하는 것으로 이해된다.
"부모 미생물(parental microorganism)"은 재조합 미생물을 산출하는데 이용되는 세포를 지칭한다. 용어 "부모 미생물"은 자연에서 발생하는 세포, 다시 말하면, 유전자 조작되지 않은 "야생형(wild-type)" 세포를 지칭한다. 용어 "부모 미생물"은 또한, 유전자 조작되지만 표적 효소, 예를 들면, 이소프로판올과 같은 원하는 대사산물의 생산을 위한 생합성 경로에 관여하는 효소를 발현하지 않거나 과다 발현하지 않는 세포를 지칭한다. 가령, 야생형 미생물은 티올라아제(thiolase)와 같은 1차 표적 효소를 발현하거나 과다 발현하도록 유전자 조작될 수 있다. 상기 미생물은 2차 표적 효소를 발현하거나 과다 발현하도록 변형된 미생물의 생산에서 부모 미생물로 기능할 수 있다. 교대로, 예로써 티올라아제와 2차 효소를 발현하거나 과다 발현하도록 변형된 미생물은 3차 표적 효소 등을 발현하거나 과다 발현하도록 변형될 수 있다. 따라서 부모 미생물은 연속적 유전자 조작 이벤트에 대한 기준 세포(reference cell)로서 기능한다. 각 변형 이벤트는 기준 세포 내로 핵산 분자를 도입함으로써 달성될 수 있다. 이러한 도입은 표적 효소의 발현이나 과다 발현을 촉진한다. 용어 "촉진한다"는 예로써, 부모 미생물에서 프로모터 서열의 유전자 변형을 통하여 표적 효소를 인코딩하는 내인성 핵산 서열의 활성화를 포괄한다. 나아가, 용어 "촉진한다"는 부모 미생물 내로 표적 효소를 인코딩하는 외인성 핵산 서열의 도입을 포괄하는 것으로 간주된다.
다른 구체예에서, 적절한 탄소 기질(substrate)을 이소프로판올로 전환하는 재조합 미생물을 산출하는 방법이 제시된다. 상기 방법은 탄소 공급원의 최종 산물(end product)로의 전환에서 원하는 효소 기능을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 하나 이상의 재조합 핵산 서열로 미생물을 형질전환시키는 단계를 포함한다. 동족체, 변이체, 단편, 관련된 융합 단백질, 또는 이들의 기능적 등가물을 비롯한 대사산물을 생산하는데 유용한 효소들을 인코딩하는 핵산 서열은 세균 또는 효모 세포와 같은 적절한 숙주 세포에서 이들 폴리펩티드의 발현을 주도하는 재조합 핵산 분자들에 이용된다. 비-기능성 또는 비-코딩 서열의 추가와 같은, 핵산 분자의 인코딩된 활성을 변화시키지 않는 서열의 추가는 염기성 핵산의 보존성 변이인 것으로 간주된다. 효소의 "활성"은 대사산물을 결과하는 반응을 촉진하는, 다시 말하면, "기능하는" 능력의 척도이고, 반응의 대사산물이 생산되는 속도로서 표시될 수 있다. 가령, 효소 활성은 시간 단위 당 또는 효소 단위 당 생산된 대사산물의 양(가령, 농도 또는 중량)으로 표시되거나, 또는 친화성(affinity) 또는 해리 상수(dissociation constant)로서 표시될 수 있다.
본 명세서에서 동의어로 이용되는 "단백질"또는 "폴리펩티드"는 펩티드 결합(peptide bond)으로 불리는 화학결합에 의해 서로 연결된 아미노산(amino acid)으로 불리는 화학적 구축 블록(chemical building block)의 하나 이상의 사슬을 포함한다. "효소"는 한 가지 이상의 화학적 또는 생물화학적 반응을 다소간 특이적으로 촉매하거나 촉진하는, 전체적으로 또는 거의 단백질로 구성된 임의의 물질을 의미한다. 용어 "효소"는 또한, 촉매성 폴리뉴클레오티드(가령, RNA 또는 DNA)를 지칭할 수 있다. "고유" 또는 "야생형" 단백질, 효소, 폴리뉴클레오티드, 유전자, 또는 세포는 자연에서 발생하는 단백질, 효소, 폴리뉴클레오티드, 유전자, 또는 세포를 의미한다.
단백질을 인코딩하는 핵산 서열이 두 번째 단백질을 인코딩하는 핵산 서열에 유사한 서열을 보유하는 경우에, 단백질은 두 번째 단백질에 대해 "상동성(homology)"을 갖거나 "상동하다." 대안으로, 이들 2개의 단백질이 "유사한" 아미노산 서열을 보유하는 경우에, 단백질은 두 번째 단백질에 대해 상동성을 갖는다(따라서 용어 "상동성 단백질"은 2개의 단백질이 유사한 아미노산 서열을 보유한다는 것을 의미하는 것으로 정의된다).
본 명세서에서, 2개의 단백질(또는 이들 단백질의 한 영역)은 아미노산 서열이 최소한 대략 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 경우에 실질적으로 상동하다. 두 아미노산 서열, 또는 두 핵산 서열의 동일성 퍼센트를 결정하기 위하여, 이들 서열은 최적 비교 목적으로 정렬된다(가령, 최적 정렬을 위하여, 첫 번째와 두 번째 아미노산이나 핵산 서열의 한쪽 또는 양쪽에 갭(gap)이 도입될 수 있고, 비-상동성 서열은 비교 목적으로 무시될 수 있다). 한 구체예에서, 비교 목적으로 정렬되는 기준 서열(reference sequence)의 길이는 상기 기준 서열 길이의 최소한 30%, 전형적으로 최소한 40%, 더욱 전형적으로 최소한 50%, 이보다 더욱 전형적으로 최소한 60%, 이보다 더욱 전형적으로 최소한 70%, 80%, 90%, 100%이다. 이후, 상응하는 아미노산 위치 또는 뉴클레오티드 위치에서 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드가 비교된다. 첫 번째 서열에서 한 위치가 두 번째 서열에서 상응하는 위치에서와 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드에 의해 점유될 때, 이들 분자는 상기 위치에서 동일하다(본 명세서에서, 아미노산이나 핵산 "동일성"은 아미노산이나 핵산 "상동성"과 동등하다). 두 서열 사이에 동일성 퍼센트는 이들 두 서열의 최적 정렬을 위하여 도입될 필요가 있는 갭의 총수와 각 갭의 길이를 고려한, 이들 서열에 의해 공유되는 동일 위치의 총수의 함수이다.
"상동성"은 단백질이나 펩티드에 관하여 이용되는 경우에, 동일하지 않은 잔기 위치가 종종, 보존성 아미노산 치환에 의해 달라진다고 인식된다. "보존성 아미노산 치환"은 한 아미노산 잔기가 유사한 화학적 특성(가령, 전하 또는 소수성)을 갖는 하나의 측쇄(R 기)를 보유하는 다른 아미노산 잔기에 의해 치환되는 것이다. 일반적으로, 보존성 아미노산 치환은 단백질의 기능적 특성을 실질적으로 변화시키지 않는다. 둘 이상의 아미노산 서열이 보존성 치환에 의해 서로 달라지는 경우에, 서열 동일성 퍼센트 또는 상동성 정도는 이러한 치환의 보존적 성질을 보정하기 위하여 상향 조절될 수도 있다. 이러한 조절을 위한 수단은 당업자들에게 충분히 알려져 있다(참조: Pearson et al., 1994).
아래의 여섯 그룹은 각각, 서로에 대한 보존성 치환인 아미노산을 포함한다. 1) 세린(S), 트레오닌(T); 2) 아스파르트산(D), 글루타민산(E); 3) 아스파라긴(N), 글루타민(Q); 4) 아르기닌(R), 리신(K); 5) 이소류신(I), 류신(L), 메치오닌(M), 알라닌(A), 발린(V); 그리고 6) 페닐알라닌(F), 티로신(Y), 트립토판(W).
서열 동일성 퍼센트로 지칭되는, 폴리펩티드에 대한 서열 상동성은 전형적으로, 서열 분석 소프트웨어를 이용하여 측정된다. 가령, 미국 위스콘신 주, 메디슨, 유니버시티 애비뉴 910번지(910 University Avenue, Madison, Wis. 53705) 소재 위스콘신대학교 생물기술센터(University of Wisconsin Biotechnology Center) 유전학 컴퓨터 그룹(Genetics Computer Group, GCG)의 서열 분석 소프트웨어 패키지(Sequence Analysis Software Package)를 참조한다. 단백질 분석 소프트웨어는 보존성 아미노산 치환을 비롯한 다양한 치환, 결실 및 기타 변형에 부여된 상동성 척도를 이용하여 유사한 서열을 매치시킨다. 가령, GCG는 다른 생물체 종으로부터 상동성 폴리펩티드와 같은 밀접하게 연관된 폴리펩티드 사이에, 또는 야생형(wild type) 단백질과 이의 뮤테인(mutein) 사이에 서열 상동성 또는 서열 동일성을 측정하기 위하여, 디폴트 파라미터(default parameter)와 함께 이용될 수 있는 "Gap"과 "Bestfit"과 같은 프로그램을 포함한다. 가령, GCG 버전 6.1을 참조한다.
상이한 생물체로부터 다수의 서열을 포함하고 있는 데이터베이스에 저해 분자 서열을 비교하는데 이용되는 전형적인 알고리즘은 컴퓨터 프로그램 BLAST(Altschul, 1990; Gish, 1993; Madden, 1996; Altschul, 1997; Zhang, 1997), 특히, blastp 또는 tblastn(Altschul, 1997)이다. 전형적인 BLASTp 파라미터는 아래와 같다: 기대치: 10(디폴트); 필터: seg(디폴트); 갭 개방 비용: 11(디폴트); 갭 확대 비용: 1(디폴트); 최대 정렬: 100(디폴트); 단어 크기: 11(디폴트); 설명 번호: 100(디폴트); 페널티 매트릭스(Penalty Matrix): BLOWSUM62.
다수의 상이한 생물체로부터 서열을 포함하고 있는 데이터베이스를 검색할 때, 아미노산 서열을 비교하는 것이 일반적이다. 아미노산 서열을 이용한 데이터베이스 검색은 당분야에 알려진 blastp 이외의 알고리즘에 의해 측정될 수 있다. 가령, GCG 버전 6.1에 들어있는 프로그램인 FASTA를 이용하여 폴리펩티드 서열을 비교할 수 있다. FASTA는 조회 서열(query sequence)및 검색 서열(search sequence) 사이에 최적 오버랩 영역의 정렬과 서열 동일성 퍼센트를 제공한다(Pearson, 1990). 가령, 아미노산 서열 사이에 서열 동일성 퍼센트는 GCG 버전 6.1에 제공되는 바와 같이, 디폴트 파라미터(단어 크기 2 및 PAM250 스코어링 매트릭스)를 갖는 FASTA를 이용하여 측정될 수 있다.
앞서 기술된 핵산 서열은 "유전자"를 포함하며, 앞서 기술된 핵산 분자는 "벡터" 또는 "플라스미드"를 포함하는 것으로 간주된다. 가령, 케토 티올라아제를 인코딩하는 핵산 서열은 atoB 유전자 또는 이의 동족체, 또는 fadA 유전자 또는 이의 동족체에 의해 인코딩될 수 있다. 따라서 "구조적 유전자(structural gene)"라고도 불리는 용어 "유전자"는 한 가지 이상의 단백질이나 효소의 전체 또는 일부를 포함하는 아미노산의 특정 서열을 코딩하고, 예로써 유전자가 발현되는 조건을 결정하는 조절(전사되지 않는) DNA 서열, 예를 들면, 프로모터 서열을 포함할 수 있는 핵산 서열을 지칭한다. 유전자의 전사된 영역은 코딩 서열뿐만 아니라 인트론(intron), 5'-UTR(untranslated region), 그리고 3'-UTR을 비롯한 비-번역 영역을 포함할 수도 있다. 용어 "핵산" 또는 "재조합 핵산"은 데옥시리보핵산(DNA), 그리고 적절한 경우에, 리보핵산(RNA)과 같은 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 유전자 서열에 관하여 용어 "발현"은 유전자의 전사, 그리고 적절한 경우에, 생성된 mRNA 전사체의 단백질로의 번역을 지칭한다. 이와 같이, 문맥에서 명백한 바와 같이, 단백질의 발현은 개방 해독 프레임(open reading frame) 서열의 전사 및 번역으로부터 발생한다.
용어 "오페론(operon)"은 통상적인 프로모터(promoter)로부터 단일 전사 단위로서 전사되는 2개 이상의 유전자를 지칭한다. 일부 구체예에서, 오페론을 구성하는 유전자들은 인접 유전자들이다. 전체 오페론의 전사(transcription)는 통상적인 프로모터의 변형에 의해 변화(즉, 증가, 감소, 또는 소멸)될 수 있는 것으로 알려져 있다. 대안으로, 인코딩된 폴리펩티드의 기능이나 활성을 변경하기 위하여 오페론 내에서 한 유전자 또는 유전자의 조합이 변형될 수 있다. 이러한 변형은 인코딩된 폴리펩티드에서 활성의 증가를 결과할 수 있다. 나아가, 이러한 변형은 인코딩된 폴리펩티드에 새로운 활성을 부여할 수 있다. 전형적인 새로운 활성에는 대체 기질의 이용 및/또는 대체 환경 조건에서 기능을 발휘하는 능력이 포함된다.
"벡터"는 핵산이 생물체, 세포, 또는 세포 구성요소 사이에서 증식되고 및/또는 이전될 수 있는 임의의 수단이다. 벡터에는 자발적으로 복제되거나 숙주 세포의 염색체 내로 통합될 수 있는 "에피솜(episome)"인 바이러스(virus), 세균분해 바이러스(bacteriophage), 프로-바이러스(pro-virus), 플라스미드(plasmid), 파지미드(phagemid), 트랜스포손(transposon), 그리고 YAC(효모 인공 염색체), BAC(세균 인공 염색체)와 PLAC(식물 인공 염색체)와 같은 인공 염색체(artificial chromosome) 등이 포함된다. 벡터는 또한, 자연적으로 에피솜이 아닌 나신 RNA 폴리뉴클레오티드, 나신 DNA 폴리뉴클레오티드, 동일한 가닥 내에서 DNA와 RNA 둘 모두로 구성된 폴리뉴클레오티드, 폴리리신(polylysine)-접합된 DNA 또는 RNA, 펩티드-접합된 DNA 또는 RNA, 리포좀-접합된 DNA 등이거나, 또는 아그로박테리움(agrobacterium) 또는 세균과 같은 하나 이상의 상기 폴리뉴클레오티드 구조체를 포함하는 생물체일 수 있다.
"형질전환"은 벡터가 숙주 세포 내로 도입되는 과정을 지칭한다. 형질전환(transformation)(또는 형질도입(transduction), 또는 형질감염(transfection))은 전기천공(electroporation), 극미 주입(microinjection), 유전자총(biolistics)(또는 입자 폭격 매개된 전달), 또는 아그로박테리움 매개된 형질전환 등을 비롯한 다수의 수단 중에서 하나에 의해 달성될 수 있다.
당업자들은 유전자 코드의 축중성(degenerate nature)으로 인하여, 뉴클레오티드 서열에서 상이한 다양한 DNA 화합물이 본 발명의 소정의 아미노산 서열을 인코딩하는데 이용될 수 있음을 인식할 것이다. 앞서 기술된 생합성 효소를 인코딩하는 고유 DNA 서열은 본 발명의 구체예를 단순히 예시하기 위하여 본 명세서에서 언급되고, 본 발명은 본 발명의 방법에 활용되는 효소의 폴리펩티드 및 단백질의 아미노산 서열을 인코딩하는 임의의 서열의 DNA 화합물을 포함한다. 유사한 방식으로, 폴리펩티드는 전형적으로, 원하는 활성의 손실이나 중대한 손실 없이, 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산 치환, 결실 및 삽입을 허용할 수 있다. 본 발명은 대체 아미노산 서열을 보유하는 폴리펩티드를 포함하고, 본 명세서에 제시된 이들 DNA 서열에 의해 인코딩된 아미노산 서열은 단지 본 발명의 구체예를 예시한다.
본 발명은 아래에 더욱 상세히 기술된 바와 같이, 하나 이상의 표적 효소를 인코딩하는 재조합 DNA 발현 벡터 또는 플라스미드의 형태로 핵산 분자를 제공한다. 일반적으로, 이들 벡터는 숙주 미생물의 세포질 내에서 복제되거나, 또는 숙주 미생물의 염색체 DNA 내로 통합될 수 있다. 어느 경우든, 벡터는 안정된 벡터(즉, 이러한 벡터는 선택적 압력(selective pressure)만으로도, 다수의 세포 분열에서 존재하게 된다) 또는 일시적 벡터(가령, 이러한 벡터는 세포 분열의 횟수가 증가함에 따라서 숙주 미생물에 의해 점차로 소실된다)일 수 있다. 본 발명은 분리된(즉, 순수하진 않지만 자연에서 관찰되지 않는 존재비(abundance) 및/또는 농도로 제조물 내에 존재하는) 및 정제된(즉, 오염 물질이 실질적으로 없거나, 또는 자연에서 상응하는 DNA와 함께 관찰되는 물질이 실질적으로 없는) 형태로 DNA 분자를 제시한다.
본 발명의 범위에는 이들 핵산을 포함하는 재조합 발현 벡터가 포함된다. 용어 "발현 벡터"는 숙주 미생물, 또는 세포-없는 전사 및 번역 시스템 내로 도입될 수 있는 핵산을 지칭한다. 발현 벡터는 미생물 또는 임의의 세포 구획(cellular compartment) 내에서 염색체 또는 기타 DNA의 일부로서, 예를 들면, 세포질 내에서 복제 벡터로서, 미생물 내에서 영구적으로 또는 일시적으로 유지될 수 있다. 발현 벡터는 또한, RNA의 발현을 주도하는 프로모터를 포함하는데, 이는 전형적으로, 미생물 또는 세포 추출물 내에서 폴리펩티드로 번역된다. RNA의 단백질로의 효율적인 변역을 위하여, 발현 벡터는 또한, 발현되는 유전자의 코딩 서열에 대한 시작 코돈(start codon)의 상류에 위치한 리보좀-결합 부위 서열을 전형적으로 포함한다. 인핸서(enhancer), 분비 신호 서열(secretion signal sequence), 전사 종결 서열(transcription termination sequence), 그리고 벡터를 포함하는 숙주 미생물이 확인되고 및/또는 선택될 수 있는 하나 이상의 표지 유전자(marker gene)와 같은 기타 요소 역시 발현 벡터 내에 존재할 수 있다. 선택가능 표지, 다시 말하면, 항생제 내성이나 민감성을 공여하는 유전자가 이용되고, 세포가 적절한 선택 배지에서 성장될 때 형질전환된 세포에 선택가능 표현형을 공여한다.
발현 벡터의 다양한 구성 요소는 벡터의 이용 의도 및 이러한 벡터가 복제하거나 발현을 주도하는 숙주 세포에 따라, 폭넓게 변할 수 있다. 대장균(E. coli), 효모, 스트렙토미세스, 그리고 다른 통상적으로 이용되는 세포에서 유전자의 발현과 벡터의 유지에 적절한 발현 벡터 성분은 널리 알려져 있고, 상업적으로 이용 가능하다. 가령, 본 발명의 발현 벡터에 포함하기 적절한 프로모터에는 원핵이나 진핵 숙주 미생물에서 기능을 발휘하는 것들이 포함된다. 프로모터는 숙주 미생물의 성장과 관련하여 발현의 조절을 가능하게 하거나, 또는 유전자의 발현이 화학적 또는 물리적 자극에 응답하여 켜지거나 꺼지도록 하는 조절 서열을 포함할 수 있다. 대장균과 특정의 다른 세균 숙주 세포들에 대하여, 생합성 효소, 항생제-내성 공여 효소, 그리고 파지 단백질(phage protein)에 대한 유전자로부터 유래된 프로모터가 이용될 수 있는데, 예로써 갈락토오스, 락토오스(lac), 말토오스, 트립토판(trp), 베타-락타마제(bla), 세균파지(세균분해 바이러스) 람다 PL, 그리고 T5 프로모터 등이 포함된다. 이에 더하여, tac 프로모터(미국 특허번호 4,551,433)와 같은 합성 프로모터 역시 이용될 수 있다. 대장균 발현 벡터의 경우에, 예로써 pUC, p1P, p1, 그리고 pBR로부터 대장균 복제 기점(origin of replication)을 포함하는 것이 유용하다.
따라서 재조합 발현 벡터는 최소한 한 가지 발현 시스템을 포함하며, 이는 차례로, 프로모터에 작동가능하게 연결된 PKS 및/또는 다른 생합성 유전자 코딩 서열의 최소한 일부분, 그리고 선택적으로, 적절한 숙주 세포 내에서 상기 코딩 서열의 발현을 구동하는 종결 서열로 구성된다. 이들 숙주 세포는 염색체외 요소(extrachromosomal element)로서 또는 염색체 내로 통합되는 발현 시스템 서열을 포함하기 위하여, 본 발명의 재조합 DNA 발현 벡터에 의한 형질전환으로 변형된다.
앞서 언급된 바와 같이, 용어 "숙주 세포"는 "재조합 미생물"과 동의어로서 이용되고, 이소프로판올을 생산하는데 적합하고 벡터 또는 플라스미드와 같은 핵산 구조체에 의한 형질전환에 민감한 임의의 세포형(cell type)을 포괄한다.
당업자들에 의해 이해되는 바와 같이, 특정 숙주에서 발현(expression)을 강화시키기 위하여 코딩 서열(coding sequence)을 변경하는 것이 유리할 수 있다. 유전자 코드는 64가지 가능 코돈들에 의해 중복되지만, 대부분의 생물체는 전형적으로, 이들 코돈의 부분 집합을 이용한다. 한 종에서 가장 빈번하게 이용되는 코돈은 최적 코돈으로 불리고, 그다지 빈번하게 이용되지 않는 코돈은 희귀 또는 저-이용 빈도 코돈으로 분류된다. 숙주의 선호적인 코돈 이용 빈도(codon usage)를 반영하기 위하여 코돈이 치환될 수 있는데, 이러한 과정은 때때로, "코돈 최적화(codon optimization)" 또는 "종 코돈 편향에 대한 조절"로 불린다.
특정 원핵 또는 진핵 숙주에 의해 선호되는 코돈을 포함하는 최적화된 코딩 서열(참조: Murray et al., (1989) Nucl. Acids Res. 17:477-508)은 예로써, 비-최적화된 서열로부터 생산된 전사체(transcript)와 비교하여, 바람직한 특성, 예를 들면, 더욱 긴 반감기를 갖는 재조합 RNA 전사체의 번역 속도를 증가시키거나 이들 전사체를 생산하기 위하여 만들어질 수 있다. 번역 종결 코돈(stop codon) 역시 숙주 선호를 반영하기 위하여 변형될 수 있다. 가령, 사카로미세스 세레비시아(S. cerevisiae) 및 포유동물에 대한 전형적인 종결 코돈은 각각, UAA 및 UGA이다. 외떡잎(monocotyledonous) 식물에 대한 전형적인 종결 코돈은 UGA이고, 반면에 곤충과 대장균(E. coli)은 통상적으로, UAA를 종결 코돈으로 이용한다(Dalphin et al., (1996) Nucl. Acids Res. 24: 216-218). 식물에서 발현을 위한 뉴클레오티드 서열을 최적화하는 방법은 예로써, 미국 특허 번호 6,015,891 및 여기에 인용된 참고문헌에서 제공된다.
본 발명의 핵산은 표준 PCR 증폭 기술 및 아래 실시예 섹션에 기술된 절차에 따라, 주형(template)으로서 cDNA, mRNA 또는 대안으로, 게놈 DNA와 적절한 올리고뉴클레오티드 프라이머를 이용하여 증폭될 수 있다. 이렇게 증폭된 핵산은 적합한 벡터 내로 클로닝될 수 있고, DNA 서열 분석에 의해서 특성화될 수 있다. 나아가, 뉴클레오티드 서열에 상응하는 올리고뉴클레오티드는 예로써, 자동화 DNA 합성장치를 이용한 표준 합성 기술에 의해 제조될 수 있다.
또한, 하나 이상의 아미노산 치환, 추가, 또는 결실이 인코딩된 단백질 내로 도입되도록 하기 위하여, 특정 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 내로 하나 이상의 뉴클레오티드 치환, 추가, 또는 결실을 도입함으로써 본 발명에 개시된 효소들과 상동한 폴리펩티드를 인코딩하는 분리된 핵산 분자가 산출될 수 있는 것으로 알려져 있다. 특정 부위 돌연변이유발(site-directed mutagenesis) 및 PCR-매개된 돌연변이유발과 같은, 표준 기술에 의해 핵산 서열 내로 돌연변이를 도입할 수 있다. 비-보존성 아미노산 치환을 하는 것이 바람직한 위치(상기 참조)에 대조적으로, 일부 위치에서는 보존성 아미노산 치환을 하는 것이 바람직하다. "보존성 아미노산 치환"은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 가진 아미노산 잔기로 교체되는 치환이다. 유사한 측쇄를 가진 아미노산 잔기 집단은 당분야에 규정되어 있다. 이들 집단에는 염기성 측쇄(가령, 리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄(가령, 아스파르트산, 글루타민산), 전하를 띄지 않은 극성 측쇄(가령, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인), 비극성 측쇄(가령, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 베타-가지형 측쇄(가령, 트레오닌, 발린, 이소류신), 그리고 방향족 측쇄(가령, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘) 등을 가진 아미노산이 포함된다.
다른 구체예에서, 이소프로판올을 생산하는 방법이 제시된다. 상기 방법은 적절한 기질의 존재에서, 그리고 상기 기질의 이소프로판올로의 전환에 적합한 조건 하에, 본 발명에 개시된 바와 같은 재조합 미생물을 배양하는 단계를 포함한다. 본 발명에 개시된 미생물에 의해 생산된 알코올은 당업자에게 공지된 임의의 방법에 의해 검출될 수 있다. 이들 방법에는 질량 분석법(mass spectrometry)이 포함된다. 본 발명에 개시된 재조합 미생물의 성장과 유지에 적합한 배양 조건은 하기 실시예에서 기술된다. 당업자는 이들 조건이 각 미생물의 요구에 맞게 변경될 수 있음을 인지할 것이다.
앞서 논의된 바와 같이, 벡터와 프로모터의 이용법과 다른 유관한 주제를 비롯하여, 본 발명에서 유용한 분자생물학적 기법을 서술하는 일반 텍스트에는 Berger와 Kimmel이 발표한 '분자 클론 기법 안내'(Guide to Molecular Cloning Techniques)(Methods in Enzymology Volumne 152, Academic Press, Inc., San Diego, Calif.)(이하 "Berger"라고 칭함); Sambrook 등이 발표한 '분자 클론-실험실 매뉴얼(Molecular Cloning--A Laboratory Manual)'(2d edl, vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989(이하 "Sambrook"이라고 칭함); 그리고 F.M. Ausubel 등 편저 '분자 생물학의 최신 프로토콜'(Current Protocols in Molecular Biology), Current Protocols (Greene Publishing Associates, Inc.와 John Wiley & Sons, Inc. 합작) 1999년 증보판(이하 "Ausubel"이라고 칭함)이 포함된다. 당업자가 예로써, 본 발명의 상동성 핵산의 대량 생산을 위하여, 중합효소 연쇄반응(PCR), 리가아제 연쇄반응(LCR), Q-복제효소 증폭 및 기타 RNA 중합효소 매개된 기술(가령, NASBA)을 비롯한 시험관내 증폭 방법을 실시할 수 있도록 하는데 충분한 프로토콜의 실례는 상기 Berger, Sambrook 및 Ausubel에서 발견할 수 있고, 또한 Mullis 등(1987)(미국 특허 번호 4,683,202); Innis 등(편)(1990)의 'PCR 프로토콜: 방법 및 응용 안내(PCR protocols: A Guide to Methods and Applications)'(Academic Press, Inc., San Diego, Calif.) (이하 "Innis"라고 칭함); Arnheim & Levinson (Oct.1, 1990), C&EN 36-47; The Journal Of NIH Research(1991) 3: 81-94; Kwoh 등(1989) (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 1173); Guatelli 등(1990) (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874); Lomell 등(1989) (J. Clin. Chem 35: 1826); Landergren 등(1988) (Science 241: 1077-1080); Van Brunt(1990) (Biotechnology 8: 291-294); Wu와 Wallace(1989) (Gene 4:560); Barringer 등(1990) (Gene 89:117); 그리고 Sooknanan과 Malek(1995) (Biotechnology 13: 563-564)에서도 발견된다. 시험관내 증폭된 핵산을 클로닝하기 위한 향상된 방법은 Wallace 등(미국 특허 번호 5,426,039)에서 기술된다. PCR로 대형 핵산을 증폭하기 위한 향상된 방법은 Cheng 등(1994) (Nature 369: 684-685) 및 여기에 인용된 참고문헌에서 요약되는데, 이들 방법에서 최대 40kb 크기의 PCR 앰플리콘이 산출된다. 당업자가 인지하는 바와 같이, 본질적으로 임의의 RNA가 역전사효소 및 중합효소를 이용하여, 제한효소 절단, PCR 증폭 및 염기서열분석에 적합한 이중가닥 DNA로 전환될 수 있다. 상기 Ausubel, Sambrook와 Berger를 참조한다.
따라서 본 발명에서는 이소프로판올을 생산하고, 부모 미생물과 비교하여 아세틸-coA 아세틸 전이효소(가령, atoB), 아세토아세틸-coA 티올라아제(가령, thl), 아세토아세틸-CoA 전이효소(가령, atoAD), 보조-효소 A 전이효소(가령, ctfAB), 아세토아세트산염 탈탄소효소(가령, adc)와 이차 알코올 탈수소효소(가령, sadh), 또는 이들의 조합과 같은 표적 효소의 발현 또는 상승된 발현을 보유하는 재조합 미생물을 제시한다. 이에 더하여, 상기 미생물은 부모 미생물과 비교하여, 아세틸-coA를 기질로서 우선적으로 이용하는 알코올/아세토알데히드 탈수소효소(가령, adhE 유전자)의 발현의 파괴(disruption), 결실(deletion) 또는 적중(knockout)을 보유할 수 있다. 다른 파괴, 결실 또는 적중에는 (i) 피루브산염의 D-젖산염으로의 NADH-의존성 전환을 촉진하는 효소; (ii) 푸마르산염과 숙신산염 상호전환(interconversion)의 촉매현상을 촉진하는 효소; (iii) 산소 전사 조절인자(oxygen transcription regulator); (iv) 아세틸-coA의 아세틸-인산염으로의 전환을 촉진하는 효소; 그리고 (v) 피루브산염의 아세틸-coA와 포름산염으로의 전환을 촉진하는 효소로 구성된 군에서 선택되는 폴리펩티드 또는 단백질을 인코딩하는 하나 이상의 유전자가 포함될 수 있다. 한 관점에서, 상기 미생물은 알코올/아세토알데히드 탈수소효소 및 (v)를 제외하고 상기 (i)-(iv) 중에서 하나 이상의 조합의 파괴, 결실 또는 적중을 포함한다.
도 1에 도시된 바와 같이, 아세토아세틸-CoA는 티올라아제 또는 아세틸-CoA 아세틸전이효소를 발현 또는 과다-발현하도록 대사 조작된 재조합 미생물에 의해 생산될 수 있다.
따라서 본 발명에 개시된 재조합 미생물은 최소한 하나의 표적 효소, 예를 들면, 케토 티올라아제의 상승된 발현을 보유한다. 다른 관점에서, 재조합 미생물은 적절한 탄소 기질의 발효로부터 이소프로판올을 생산하는 경로에 관여하는 복수의 표적 효소를 발현할 수 있다. 복수의 효소에는 케토 티올라아제, 아세틸-CoA 아세틸전이효소, 아세토아세틸-CoA 전이효소, 보조-효소 A 전이효소, 아세토아세트산염 탈탄소효소 및 이차 알코올 탈수소효소, 또는 이들의 조합이 포함될 수 있다.
앞서 언급된 바와 같이, 본 명세서 전반에서 기술된 표적 효소는 일반적으로, 대사산물을 생산한다. 가령, 케토 티올라아제는 아세틸-CoA를 포함하는 기질로부터 아세토아세틸-CoA를 생산한다. 이에 더하여, 본 명세서 전반에 기술된 표적 효소는 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된다. 가령, 케토 티올라아제는 atoB 유전자, 폴리뉴클레오티드 또는 이의 동족체, 또는 fadA 유전자, 폴리뉴클레오티드 또는 이의 동족체에 의해 인코딩될 수 있다. atoB 유전자 또는 fadA 유전자는 적절한 효소를 인코딩하는 적절한 핵산 서열을 제공하는 임의의 생물학적 공급원으로부터 유래될 수 있다. 가령, atoB 유전자 또는 fadA 유전자는 대장균(E. coli) 또는 클로스트리듐 아세토부틸리쿰(C. acetobutylicum)으로부터 유래될 수 있다.
다른 관점에서, 본 발명에 개시된 재조합 미생물은 부모 미생물과 비교하여, 아세틸-CoA 아세틸전이효소의 상승된 발현을 보유한다. 상기 미생물은 아세틸-CoA를 포함하는 기질로부터 아세토아세틸-CoA를 포함하는 대사산물을 생산한다. 아세틸-CoA 아세틸전이효소는 thlA 유전자, 폴리뉴클레오티드 또는 이의 동족체에 의해 인코딩될 수 있다. thlA 유전자 또는 폴리뉴클레오티드는 클로스트리듐(Clostridium) 속으로부터 유래될 수 있다.
다른 관점에서, 본 발명에 개시된 재조합 미생물은 부모 미생물과 비교하여, 아세토아세틸-CoA 전이효소의 상승된 발현을 보유한다. 상기 미생물은 아세토아세틸-CoA를 포함하는 기질로부터 아세토아세트산염을 포함하는 대사산물을 생산한다. 아세토아세틸 CoA 전이효소는 atoAD 유전자, 폴리뉴클레오티드 또는 이의 동족체에 의해 인코딩될 수 있다. atoAD는 대장균(E. coli)으로부터 유래될 수 있다.
다른 구체예에서, 본 발명에 개시된 재조합 미생물은 부모 미생물과 비교하여, 보조-효소 A 전이효소의 상승된 발현을 보유한다. 상기 미생물은 아세토아세틸-CoA를 포함하는 기질로부터 아세토아세트산염을 포함하는 대사산물을 생산한다. co-A 전이효소는 ctfAB 유전자, 폴리뉴클레오티드 또는 이의 동족체에 의해 인코딩될 수 있다. ctfAB는 클로스트리듐(Clostridium)으로부터 유래될 수 있다.
다른 구체예에서, 본 발명에 개시된 재조합 미생물은 부모 미생물과 비교하여, 아세토아세트산염 탈탄소효소의 상승된 발현을 보유한다. 상기 미생물은 아세토아세트산염을 포함하는 기질로부터 아세톤을 포함하는 대사산물을 생산한다. 아세토아세트산염 탈탄소효소는 adc 유전자, 폴리뉴클레오티드 또는 이의 동족체에 의해 인코딩될 수 있다. 아세토아세트산염 탈탄소효소는 클로스트리듐(Clostridium)으로부터 유래될 수 있다.
다른 구체예에서, 본 발명에 개시된 재조합 미생물은 부모 미생물과 비교하여, 이차 알코올 탈수소효소의 상승된 발현을 보유한다. 상기 미생물은 아세톤을 포함하는 기질로부터 이소프로판올을 포함하는 대사산물을 생산한다. 이차 알코올 탈수소효소는 sadh 유전자, 폴리뉴클레오티드 또는 이의 동족체에 의해 인코딩될 수 있다. 이차 알코올 탈수소효소는 클로스트리듐(Clostridium) 또는 서모언에어로비움(Thermoanaerobium)으로부터 유래될 수 있다.
본 발명은 본 발명에 개시된 방법, 조성물과 생물체에 유용한 특정 유전자를 확인한다; 하지만, 이들 유전자에 대한 절대적 실체 확인은 불필요한 것으로 인정될 것이다. 가령, 폴리펩티드 또는 효소를 인코딩하는 서열을 포함하는 특정 유전자 또는 폴리뉴클레오티드에서 변화가 수행되고 활성에 대하여 조사될 수 있다. 전형적으로, 이들 변화는 보존성 돌연변이(conservative mutation)와 침묵 돌연변이(silent mutation)를 포함한다. 이와 같은 변형되거나 돌연변이된 폴리뉴클레오티드와 폴리펩티드는 당분야에 공지된 방법을 이용하여 기능 효소 활성의 발현에 대하여 조사될 수 있다.
아래의 표와 설명은 당업자에게 이용 가능한 폴리뉴클레오티드와 폴리펩티드 서열을 보유하는 유전자와 이들 각 유전자에 대한 동족체의 무-제한적 실례를 제공한다.
효소 예시적인
유전자 		이소프로판올 예시적인
생물체
아세틸-coA
아세틸전이효소		 atoB + 대장균(E. Coli),
클로스트리듐 아세토부틸리쿰(C. acetobutylicum)
아세토아세틸-coA
티올라아제		 thl, thlA, thlB + 대장균(E.coli), 클로스트리듐 아세토부틸리쿰(C. acetobutylicum)
보조-효소 A
전이효소		 ctf, ctfA, ctfB + 클로스트리듐 아세토부틸리쿰(C. acetobutylicum)
아세토아세틸-coA
전이효소		 ato, atoA, atoD + 대장균(E. coli)
아세토아세트산염
탈탄소효소		 adc + 클로스트리듐 아세토부틸리쿰(C. acetobutylicum)
이차 알코올
탈수소효소		 adh(sadh) + 클로스트리듐 아세토부틸리쿰(C. acetobutylicum), 서모언에어로박터 브록키(T. brockii)
클로스트리듐 아세토부틸리쿰(C. acetobutylicum) thl(아세틸-CoA 아세틸전이효소), 대장균(E. coli) atoAD(아세토아세틸-CoA 전이효소), 클로스트리듐 아세토부틸리쿰(C. acetobutylicum) adc(아세토아세트산염 탈탄소효소)와 클로스트리듐 베이어린키(C. beijerinckii) adh(이차 알코올 탈수소효소)의 조합의 과다발현을 보유하는 대장균(E. coli)에 대한 예시적인 수율 데이터는 생산 단계에서 43.5%(mol/mol)의 수율로, 교반 플라스크에서 81.6 mM 이소프로판올을 산출하였다.
본 발명에서는 야생형 미생물보다 큰 수율을 제공하는 생합성 경로를 포함하는 재조합 미생물을 제시한다. 한 구체예에서, 부모 미생물은 이소프로판올을 생산하지 않는다. 가령, 야생형 대장균(E. coli)은 미량의 이소프로판올을 생산하지 않는다. 또 다른 구체예에서, 부모 미생물은 단지 미량의 이소프로판올을 생산한다. 특정 구체예에서, 상기 미생물은 대장균(E. coli)이다. 다른 관점에서, 배양액은 실질적으로 상동한(가령, 약 70-100% 상동한) 미생물 개체군을 포함한다. 다른 관점에서, 배양액은 이소프로판올의 생산에서 배양 중인 최소한 다른 미생물에 의해 이용될 수 있는 대사산물을 생산하는 별개의 생합성 경로를 보유하는 각 미생물의 조합을 포함할 수 있다.
본 발명은 본 발명에 개시된 재조합 미생물의 생산에 유용한 다양한 유전자, 동족체와 변이체에 대한 수탁 번호를 제공한다. 본 발명에 개시된 동족체와 변이체는 전형적이지만 제한하는 것이 아니라는 것을 알아두어야 한다. 추가 동족체, 변이체와 서열은 예로써, 인터넷에서 접근 가능한 미국의 국립생물기술정보센터(National Center for Biotechnology Information, NCBI)를 비롯한 다양한 데이트베이스를 이용하여 당업자들에게 이용 가능하다.
에탄올 탈수소효소(일명, 알데히드-알코올 탈수소효소)는 대장균(E. coli)에서 adhE에 의해 인코딩된다. adhE는 3가지 활성을 나타낸다: 알코올 탈수소효소(ADH); 아세트알데히드/아세틸-CoA 탈수소효소(ACDH); 피루브산염-포름산염-리아제 디악티바제(PFL deactivase)이다; PFL 디악티바제 활성은 철, NAD, 그리고 CoA 의존성 반응에서 피루브산염-포름산염-리아제 촉매의 진정(quenching)을 촉진한다. 당분야에는 동족체들이 알려져 있다(가령, 알데히드-알코올 탈수소효소(폴리토멜라 종 프링스하임 198.80) gi|40644910|emb|CAD42653.2|(40644910);
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알데히드-알코올 탈수소효소(시네코코커스 종 JA-3-3Ab) gi|86553733|gb|ABC98691.1|(86553733);
알데히드-알코올 탈수소효소(쉬와넬라 오네이덴시스 MR-1) gi|24348056|gb|AAN55183.1|AE015655_9(24348056);
알데히드-알코올 탈수소효소(엔테로코커스 파이칼리스 V583) gi|29342944|gb|AAO80708.1|(29342944);
알데히드-알코올 탈수소효소(리스테리아 모노사이토진스 균주 4b F2365) gi|46881133|gb|AAT04430.1|(46881133);
알데히드-알코올 탈수소효소(리스테리아 모노사이토진스 균주 1/2a F6854) gi|47097587|ref|ZP_00235115.1|(47097587);
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아세트알데히드 탈수소효소(아세틸화)(대장균 CFT073) gi|26247570|ref|NP_753610.1|(26247570);
알데히드-알코올 탈수소효소(알코올 탈수소효소, 아세트알데히드 탈수소효소(아세틸화)(EC 1.2.1.10)(acdh), 피루브산염-포름산염-리아제 디악티바제(pfl 디악티바제) 포함)(클로스트리듐 보툴리눔 A 균주 ATCC 3502) gi|148287832|emb|CAL81898.1|(148287832);
알데히드-알코올 탈수소효소(알코올 탈수소효소(ADH), 아세트알데히드 탈수소효소(아세틸화)(ACDH), 피루브산염-포름산염-리아제 디악티바제(PFL 디악티바제) 포함) gi|71152980|sp|P0A9Q7.2|ADHE_ECOLI(71152980);
알데히드-알코올 탈수소효소(알코올 탈수소효소와 아세트알데히드 탈수소효소, 그리고 피루브산염-포름산염-리아제 디악티바제 포함)(에르위니아 카로토보라 아종 아트로셉티카 SCRI1043) gi|50121254|ref|YP_050421.1|(50121254);
알데히드-알코올 탈수소효소(알코올 탈수소효소와 아세트알데히드 탈수소효소, 그리고 피루브산염-포름산염-리아제 디악티바제 포함)(에르위니아 카로토보라 아종 아트로셉티카 SCRI1043) gi|49611780|emb|CAG75229.1|(49611780);
알데히드-알코올 탈수소효소(알코올 탈수소효소(ADH), 아세트알데히드 탈수소효소(아세틸화)(ACDH) 포함) gi|19858620|sp|P33744.3|ADHE_CLOAB(19858620);
알데히드-알코올 탈수소효소(알코올 탈수소효소(ADH), 아세트알데히드 탈수소효소(아세틸화)(ACDH), 피루브산염-포름산염-리아제 디악티바제(PFL 디악티바제) 포함) gi|71152683|sp|P0A9Q8.2|ADHE_ECO57(71152683);
알데히드-알코올 탈수소효소(알코올 탈수소효소, 아세트알데히드 탈수소효소(아세틸화), 피루브산염-포름산염-리아제 디악티바제 포함)(클로스트리듐 디피실 630) gi|126697906|ref|YP_001086803.1|(126697906);
알데히드-알코올 탈수소효소(알코올 탈수소효소, 아세트알데히드 탈수소효소(아세틸화), 피루브산염-포름산염-리아제 디악티바제 포함)(클로스트리듐 디피실 630) gi|115249343|emb|CAJ67156.1|(115249343);
알데히드-알코올 탈수소효소(알코올 탈수소효소(ADH)와 아세트알데히드 탈수소효소(아세틸화)(ACDH), 그리고 피루브산염-포름산염-리아제 디악티바제(PFL 디악티바제) 포함)(포토르하브더스 루미네센 아종 로몬디 TTO1) gi|37526388|ref|NP_929732.1|(37526388);
알데히드-알코올 탈수소효소 2(알코올 탈수소효소, 아세트알데히드 탈수소효소 포함)(스트렙토코커스 파이오진스 균주 Manfredo) gi|134271169|emb|CAM29381.1|(134271169);
알데히드-알코올 탈수소효소(알코올 탈수소효소(ADH)와 아세트알데히드 탈수소효소(아세틸화)(ACDH), 그리고 피루브산염-포름산염-리아제 디악티바제(PFL 디악티바제) 포함)(포토르하브더스 루미네센 아종 로몬디 TTO1) gi|36785819|emb|CAE14870.1|(36785819);
알데히드-알코올 탈수소효소(알코올 탈수소효소 및 피루브산염-포름산염-리아제 디악티바제 포함)(클로스트리듐 디피실 630) gi|126700586|ref|YP_001089483.1|(126700586);
알데히드-알코올 탈수소효소(알코올 탈수소효소 및 피루브산염-포름산염-리아제 디악티바제 포함)(클로스트리듐 디피실 630) gi|115252023|emb|CAJ69859.1|(115252023);
알데히드-알코올 탈수소효소 2(스트렙토코커스 파이오진스 균주 Manfredo) gi|139472923|ref|YP_001127638.1|(139472923);
알데히드-알코올 탈수소효소 E(클로스트리듐 퍼프링겐스 균주 13) gi|18311513|ref|NP_563447.1|(18311513);
알데히드-알코올 탈수소효소 E(클로스트리듐 퍼프링겐스 균주 13) gi|18146197|dbj|BAB82237.1|(18146197);
알데히드-알코올 탈수소효소, ADHE1(클로스트리듐 아세토부틸리쿰 ATCC 824) gi|15004739|ref|NP_149199.1|(15004739);
알데히드-알코올 탈수소효소, ADHE1(클로스트리듐 아세토부틸리쿰 ATCC 824) gi|14994351|gb|AAK76781.1|AE001438_34(14994351);
알데히드-알코올 탈수소효소 2(알코올 탈수소효소(ADH), 아세트알데히드/아세틸-CoA 탈수소효소(ACDH) 포함) gi|2492737|sp|Q24803.1|ADH2_ENTHI(2492737);
알코올 탈수소효소(살모넬라 엔테리카 아종 엔테리카 혈청형 타이피 균주. CT18) gi|16760134|ref|NP_455751.1|(16760134);
그리고 알코올 탈수소효소(살모넬라 엔테리카 아종 엔테리카 혈청형 타이피) gi|16502428|emb|CAD08384.1|(16502428)), 수탁 번호와 관련된 각 서열은 본 명세서에서 순전히 참조로서 편입된다).
아세토아세틸-coA 티올라아제(일명, 아세틸-coA 아세틸전이효소)는 2개의 아세틸-coA 분자로부터 아세토아세틸-coA의 생산을 촉진한다. 이용된 생물체에 따라서, 이질성 아세토아세틸-coA 티올라아제(아세틸-coA 아세틸전이효소)는 생물체 내에서 발현을 위하여 조작될 수 있다. 대안으로, 고유 아세토아세틸-coA 티올라아제(아세틸-coA 아세틸전이효소)가 과다발현될 수 있다. 아세토아세틸-coA 티올라아제는 대장균(E. coli)에서 thl에 의해 인코딩된다. 아세틸-coA 아세틸전이효소는 클로스트리듐 아세토부틸리쿰(C. acetobutylicum)에서 atoB에 의해 인코딩된다. THL과 AtoB 동족체와 변이체는 공지되어 있다. 가령, 이런 동족체와 변이체에는 예로써, 아세틸-coa 아세틸전이효소(티올라아제)(스트렙토미세스 코엘리칼라 A3(2)) gi|21224359|ref|NP_630138.1|(21224359);
아세틸-coa 아세틸전이효소(티올라아제)(스트렙토미세스 코엘리칼라 A3(2)) gi|3169041|emb|CAA19239.1|(3169041);
아세틸 CoA 아세틸전이효소(티올라아제)(알카니보락스 보르쿠멘시스 SK2) gi|110834428|ref|YP_693287.1|(110834428);
아세틸 CoA 아세틸전이효소(티올라아제)(알카니보락스 보르쿠멘시스 SK2) gi|110647539|emb|CAL17015.1|(110647539);
아세틸 CoA 아세틸전이효소(티올라아제)(사카로폴리스포라 에리쓰레아 NRRL 2338) gi|133915420|emb|CAM05533.1|(133915420);
아세틸-coa 아세틸전이효소(티올라아제)(사카로폴리스포라 에리쓰레아 NRRL 2338) gi|134098403|ref|YP_001104064.1|(134098403);
아세틸-coa 아세틸전이효소(티올라아제)(사카로폴리스포라 에리쓰레아 NRRL 2338) gi|133911026|emb|CAM01139.1|(133911026);
아세틸-CoA 아세틸전이효소(티올라아제)(클로스트리듐 보툴리늄 A 균주 ATCC 3502) gi|148290632|emb|CAL84761.1|(148290632);
아세틸-CoA 아세틸전이효소(티올라아제)(슈도모나스 에루지노사 UCBPP-PA14) gi|115586808|gb|ABJ12823.1|(115586808);
아세틸-CoA 아세틸전이효소(티올라아제)(랄스토니아 메탈리두란스 CH34) gi|93358270|gb|ABF12358.1|(93358270);
아세틸-CoA 아세틸전이효소(티올라아제)(랄스토니아 메탈리두란스 CH34) gi|93357190|gb|ABF11278.1|(93357190);
아세틸-CoA 아세틸전이효소(티올라아제)(랄스토니아 메탈리두란스 CH34) gi|93356587|gb|ABF10675.1|(93356587);
아세틸-CoA 아세틸전이효소(티올라아제)(랄스토니아 유트로파 JMP134) gi|72121949|gb|AAZ64135.1|(72121949);
아세틸-CoA 아세틸전이효소(티올라아제)(랄스토니아 유트로파 JMP134)gi|72121729|gb|AAZ63915.1|(72121729);
아세틸-CoA 아세틸전이효소(티올라아제)(랄스토니아 유트로파 JMP134) gi|72121320|gb|AAZ63506.1|(72121320);
아세틸-CoA 아세틸전이효소(티올라아제)(랄스토니아 유트로파 JMP134) gi|72121001|gb|AAZ63187.1|(72121001);
아세틸-CoA 아세틸전이효소(티올라아제)(대장균) gi|2764832|emb|CAA66099.1|(2764832)이 포함되고, 수탁 번호와 관련된 각 서열은 본 명세서에서 순전히 참조로서 편입된다.
보조-효소 A 전이효소는 아세토아세틸-coA로부터 아세토아세트산염의 생산을 촉진한다. 이용된 생물체에 따라서, 이질성 보조-효소 A 전이효소는 생물체 내에서 발현을 위하여 조작될 수 있다. 대안으로, 고유 보조-효소 A 전이효소가 과다발현될 수 있다. 보조-효소 A 전이효소는 클로스트리듐 아세토부틸리쿰(C. acetobutylicum)에서 ctfAB에 의해 인코딩되고, ctfAB 동족체와 변이체는 공지되어 있다. 가령, 이런 동족체와 변이체에는 예로써, 보조-효소 A 전이효소(클로스트리듐 아세토부틸리쿰(C. acetobutylicum) adhE, ctfA와 ctfB 유전자) gi|298080|emb|X72831.1|(298080); 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 ATCC 824 메가플라스미드 pSOL1 gi|14994317|gb|AE001438.3| (14994317)이 포함되고, 수탁 번호와 관련된 각 서열은 본 명세서에서 순전히 참조로서 편입된다.
아세토아세틸 coA 전이효소는 아세토아세틸-coA로부터 아세토아세트산염의 생산을 촉진한다. 이용된 생물체에 따라서, 이질성 아세토아세틸 coA 전이효소는 생물체 내에서 발현을 위하여 조작될 수 있다. 대안으로, 고유 아세토아세틸 coA 전이효소가 과다발현될 수 있다. 아세토아세틸 coA 전이효소는 대장균(E. coli)에서 atoAB에 의해 인코딩된다. AtoAB 동족체와 변이체는 공지되어 있다. 가령, 이런 동족체와 변이체에는 예로써, NC_010468 대장균 ATCC 8739, gi|170018061|ref|NC_010468.1|(170018061);
NC_009654 마리노모나스 종 MWYL1 gi|152994043|ref|NC_009654.1|(152994043); NC_009454;
펠로토마쿨룸 서모프로피오니쿰 SI, 완전 게놈 gi|147676335|ref|NC_009454.1|(147676335);
대장균 APEC O1, 완전 게놈 gi|117622295|ref|NC_008563.1|(117622295);
대장균 536, 완전 게놈 gi|110640213|ref|NC_008253.1|(110640213);
대장균 UTI89, 완전 게놈 gi|91209055|ref|NC_007946.1|(91209055);
대장균 HS, 완전 게놈 gi|157159467|ref|NC_009800.1|(157159467);
클로스트리듐 베이어린키 NCIMB 8052, 완전 게놈 gi|150014892|ref|NC_009617.1|(150014892);
쉬겔라 소니 Ss046, 완전 게놈 gi|74310614|ref|NC_007384.1|(74310614);
시트로박터 코세리 ATCC BAA-895, 완전 게놈 gi|157144296|ref|NC_009792.1|(157144296);
로도스피릴리움 루브룸 ATCC 11170, 완전 게놈 gi|83591340|ref|NC_007643.1|(83591340);
대장균 CFT073, 완전 게놈 gi|26245917|ref|NC_004431.1|(26245917);
살모넬라 티피뮤리움 LT2, 완전 게놈 gi|16763390|ref|NC_003197.1|(16763390);
대장균 ATCC 8739, 완전 게놈 gi|169752989|gb|CP000946.1|(169752989);
대장균 균주 K-12 아균주 MG1655, 완전 게놈 gi|49175990|ref|NC_000913.2|(49175990);
대장균 균주 K-12 아균주 MG1655, 완전 게놈 gi|48994873|gb|U00096.2|(48994873);
마리노모나스 종 MWYL1, 완전 게놈 gi|150834967|gb|CP000749.1|(150834967);
클로스트리듐 베이어린키 NCIMB 8052, 완전 게놈 gi|149901357|gb|CP000721.1|(149901357)이 포함되고(또는 이들의 게놈 서열에서 발견될 수 있고), 수탁 번호와 관련된 각 서열은 본 명세서에서 순전히 참조로서 편입된다.
아세토아세트산염 탈탄소효소는 아세토아세트산염의 탈카르복실화(decarboxylation)를 촉진하고 아세톤과 탄소 이산화물을 형성한다. 이용된 생물체에 따라서, 이질성 아세토아세트산염 탈탄소효소는 생물체 내에서 발현을 위하여 조작될 수 있다. 대안으로, 고유 아세토아세트산염 탈탄소효소가 과다발현될 수 있다. 아세토아세트산염 탈탄소효소는 클로스트리듐 아세토부틸리쿰(Clostridium acetobutylicum)에서 acd에 의해 인코딩된다. ACD 동족체와 변이체는 공지되어 있다. acd에 대한 서열은 gi|15004705|ref|NC_001988.2|(15004705) 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 ATCC 824 플라스미드 pSOL1에 열거되는데, 수탁 번호와 관련된 각 서열은 본 명세서에서 순전히 참조로서 편입된다.
이차 알코올 탈수소효소는 NADH의 존재에서, 메틸 케톤의 상응하는 2-알코올로의 환원(reduction)을 촉진한다. 이용된 생물체에 따라서, 이질성 이차 알코올 탈수소효소는 생물체 내에서 발현을 위하여 조작될 수 있다. 대안으로, 고유 이차 알코올 탈수소효소가 과다발현될 수 있다. 본 발명의 방법과 조성물에 유용한 이차 알코올 탈수소효소는 클로스트리듐 아세토부틸리쿰(Clostridium acetobutylicum) 또는 대장균(E. coli)에서 adh(sadh)에 의해 인코딩된다. SADH 동족체와 변이체는 공지되어 있다. 가령, 로도콕쿠스 루베르, sadh 유전자와 sudh 유전자는 수탁 번호 gi|21615551|emb|AJ491307.1|(21615551)에 열거되고; 이차 알코올 탈수소효소에 대한 칸디다 메타프실로시스 부분 sadh 유전자는 균주 타입 96144 gi|47826366|emb|AJ698115.1|(47826366)에 열거되고; 그리고 SADH에 대한 칸디다 파라프실로시스 유전자는 완전 cds gi|2815408|dbj|AB010636.1|(2815408)에 열거되고, 수탁 번호와 관련된 각 서열은 본 명세서에서 순전히 참조로서 편입된다.
본 발명에 개시된 재조합 미생물의 성장과 유지에 적절한 배양 조건은 하기 실시예에서 기술된다. 당업자는 이들 조건이 각 미생물의 요구에 맞게 변경될 수 있음을 인지할 것이다. 이소프로판올 산물을 생산하는데 적합한 배양 조건은 배양 배지 pH, 이온 강도, 영양 함량 등의 조건; 온도; 산소/이산화탄소/질소 함량; 습도; 그리고 숙주 미생물, 다시 말하면, 상기 미생물의 물질대사 작용에 의한 화합물의 생산을 가능하게 하는 기타 배양 조건을 포함한다. 숙주 세포로서 기능할 수 있는 미생물에 적합한 배양 조건은 널리 알려져 있다.
한 구체예에서, 본 발명의 미생물은 rrnBT14DlacZWJ16 hsdR514 DaraBADAH33 DrhaBADLD78(lacIq를 제공하기 위하여 XL-1 블루로부터 F' 형질도입됨), (atoB-ctfAB-adc), pTA30(atoB-atoAD-adc), pTA39(thl-atoAD-adc), 그리고 pTA41(thl-ctfAB-adc)을 포함하는 대장균(E. coli)으로 특징될 수 있다.
본 발명의 하나 이상의 구체예에 관한 상세는 첨부 도면 및 하기 상세한 설명에 열거된다. 다른 특징, 목적과 이점은 상세한 설명과 도면, 그리고 특허청구범위로부터 명백할 것이다.
도면의 간단한 설명
도 1에서는 이소프로판올 생산을 위한 대사 경로를 도시한다.
도 2에서는 경로 유전자의 각 조합에 의한 최대 이소프로판올 생산의 비교를 도시한다.
도 3에서는 TA11(pTA39/pTA36: thl-atoAD-adc-adh(cb))에 의한 이소프로판올 생산의 시간 과정을 도시한다.
도 4에서는 본 발명의 방법과 조성물에 유용한 adh 폴리뉴클레오티드의 서열(SEQ ID NO: 7과 9)을 도시한다.
실시예
클로스트리듐 베이어린키(C. beijerinckii)의 52개 균주를 비롯한 클로스트리듐(Clostridium)의 여러 종이 이소프로판올 생산에 대하여 평가되었다. 이들 균주로부터 이소프로판올의 최대 생산은 30 mM이었다. 이들 균주의 대사 조절에 관한 한정된 지식과 유전자 조작의 어려움은 이소프로판올 생산에서 추가적인 개선을 지체시켰다. 다른 한편, 대장균(E. coli)은 대사 조작을 위한 가장 많이 연구되고 쉽게 조작되는 생물체 중의 하나이다. 상기 세균은 에탄올과 많은 다른 생화학물질을 높은 역가(titer)로 생산하는 것으로 이미 밝혀졌다.
Bermejo 등(Appl. Environ. Microbiol. 64:1079-1085, 1998)은 클로스트리듐 아세토부틸리쿰(C. acetobutylicum)로부터 thl 프로모터의 통제 하에, 클로스트리듐 아세토부틸리쿰(C. acetobutylicum) ATCC824로부터 3개의 유전자(각각, 아세틸-CoA 아세틸전이효소, 아세토아세틸-CoA-전이효소와 아세토아세트산염 탈탄소효소를 코딩하는 thl, ctfAB와 adc)를 도입함으로써 대장균(E. coli)에서 아세톤을 생산하였다. 이러한 조작된 대장균(E. coli) 균주는 클로스트리듐 아세토부틸리쿰(C. acetobutylicum) ATCC 824에서와 거의 동일한 수준으로 아세톤을 생산하였다. 하지만, 대장균(E .coli)에서 이소프로판올 생산은 보고된 바가 없다. 본 발명에서는 대장균(E. coli)을 비롯한 미생물에서 이소프로판올의 생산을 위한 조작된 합성 경로를 제시한다.
이소프로판올의 생합성을 위한 전략은 아세톤을 통하여 아세틸-보조효소 A(아세틸-CoA)로부터 이소프로판올을 생산하는 클로스트리듐 베이어린키(C. beijerinckii)를 모방하는 경로를 이용한다(도 1). 첫 번째, 아세틸-CoA 아세틸전이효소는 아세틸-CoA의 2 분자를 아세토아세틸-CoA의 1 분자로 응축한다. 그 다음, 아세토아세틸-CoA 전이효소는 아세토아세틸-CoA로부터 CoA를 아세트산염 또는 부티르산염으로 이전하여 아세토아세트산염을 형성하고, 이는 이후, 아세토아세트산염 탈탄소효소에 의해 아세톤과 CO2로 전환된다. 일차-이차 알코올 탈수소효소(이후, 이차 알코올 탈수소효소, SADH로 지칭됨)는 NADPH-의존성 반응에서 아세톤을 이소프로판올로 전환시킨다. 이러한 경로를 최적화시키기 위하여, 아세톤 생산의 최초 단계를 수행하는 동안, 고유 대장균(E. coli) 아세틸-CoA 아세틸전이효소(atoB에 의해 인코딩됨)와 아세토아세틸-CoA 전이효소(atoAD에 의해 인코딩됨)를 조사하였다. 더 나아가, 이소프로판올 생산의 최종 단계를 수행하는 동안, 클로스트리듐 베이어린키(C. beijerinckii) NRRL B593과 서모언에어로박터 브록키(T. brockii) HTD4로부터 Sadh(adh에 의해 인코딩됨)의 활성을 비교하였다. 이들 2개의 SADH는 이전과 같이, 대장균(E. coli)에서 발현되고 특성화되었다.
표 1에서는 본 연구에 이용된 균주와 플라스미드를 보여준다. P1 형질도입에 의해 대장균(E. coli) DH5αZ1로부터 lacI q 가 도입된 대장균(E. coli) B 균주(ATCC 11303)는 숙주 균주(host strain)로서 이용되고 TA11로 명명되었다. 아세톤 경로 유전자 thl, ctfAB, atoB, atoAD와 adc의 다중 조합이 P LlacO1 프로모터의 통제 하에 ColE1-유래된 플라스미드(pSA40) 내로 클로닝하였다. 생성된 플라스미드는 pTA29(atoB-ctfAB-adc), pTA30(atoB-atoAD-adc), pTA39(thl-atoAD-adc), 그리고 pTA41(thl-ctfAB-adc)로 명명되었다(상세한 내용은 표 1을 참조한다). 클로스트리듐 베이어린키(C. beijerinckii) 또는 서모언에어로박터 브록키(T. brockii)로부터 adh 유전자는 각각, 플라스미드 pTA36과 pTA18을 산출하기 위하여 P LlacO1의 통제 하에 p15A-유래된 벡터(pZA31-luc) 내로 클로닝하였다. 평가를 위하여, 아세톤 경로 유전자와 이소프로판올-생산 유전자의 각 조합을 TA11 내로 도입하였다.
상기 발현 구조체의 RBS를 이용하여 P LlacO1 프로모터의 하류에 클로닝된 atoB와 thl 유전자를 제외하고, 이소프로판올 생산 경로의 모든 유전자에 동일한 리보좀 결합 부위(ribosome binding site, RBS)(GAAGGAGATATACAT(SEQ ID NO:11)가 이용되었다. 이용된 RBS의 출처는 pET-31b(+) 플라스미드(Invitrogen, Carlsbad, CA)이다. 2개의 adh 유전자를 제외한 모든 유전자는 염색체 DNA로부터 PCR-증폭하고 서열 확인하였다. 이들 2개의 adh 유전자는 대장균(E. coli)에 대한 코돈 최적화(codon optimization) 이후에 Epoch Biolabs(Houston, TX)에 의해 합성되었다. 최적화를 위하여 아래의 조건이 이용되었다. 코돈 효율(codon efficiency)에 대하여 15% 컷오프(cut off)가 이용되었다: 15% 미만인 코돈은 강한 2차 구조를 갖는 위치를 제외하고 제거되었다(이 경우에, 상기한 문제점을 완화시키기 위하여 더욱 낮은 빈도의 코돈이 이용되었다). 2차 구조는 빌드-인(build-in) M-폴드(fold) 모듈(module)을 이용하여 조사하였다. 스템 루프(stem loop)와 슈도 샤인-달가노(pseudo Shine-Dalgarno) 서열은 피하였다. 이러한 최적화에 의한 변화된 염기쌍(base pair)의 총수는 클로스트리듐 베이어린키(C. beijerinckii)의 경우에 약 290개이고, 서모언에어로박터 브록키(T. brockii)의 경우에 240개이다. 제한 효소(restriction enzyme), 인산염(New England Biolabs, Ipswich, MA), 리가아제(ligase)(신속 DNA 결찰 키트; Roche, Manheim, Germany), 그리고 DNA 중합효소(KOD DNA polymerase, EMD Chemicals, San Diego, CA)가 클로닝에 이용되었다. 올리고뉴클레오티드는 Invitrogen(Carlsbad, CA)에 의해 합성되었다.
pTA29(P LlacO1:: atoB-ctfAB-adc)- pZE21-MCS1의 P LtetO1을 P LlacO1로 대체하기 위하여, pZE12-luc를 AatII와 Acc65I로 절단하였다. 더욱 짧은 단편은 정제하고, 동일한 효소로 절단된 플라스미드 pZE21-MCS1 내로 클로닝하여 pSA40을 산출하였다. atoB, ctfAB와 adc를 클로닝하기 위하여, pSA40에서 Acc65I-SalI(atoB), SalI-XmaI(ctfAB)과 XmaI-BamHI(adc) 인식 부위가 이용되었다. 카나마이신 내성(kanamycin resistance) 유전자를 암피실린 내성(ampicillin resistance) 유전자로 대체하기 위하여, AatII와 AvrII 인식 부위가 이용되었다. atoB를 클로닝하기 위하여, 프라이머 쌍 TA15F(5' CGCGGTACCATGAAAAATTGTGTCATCGTCAGTG 3'(SEQ ID NO:12))와 TA16R(5' CCGCGTCGACTTAATTCAACCGTTCAATCACCATC 3'(SEQ ID NO:13))과 함께, 대장균(E. coli) K-12 MG1655의 게놈 DNA가 주형(template)으로서 이용되고, PCR 산물은 Acc65I와 SalI로 절단되었다. ctfAB를 클로닝하기 위하여, 프라이머 쌍 TA19F(5' CCGCGTCGACGAAGGAGATATACATATGAACTCTAAAATAATTAGATTTG 3'(SEQ ID NO:14))와 TA4R(5' CGCCCCGGGCTAAACAGCCATGGGTCTAAGTTCA 3'(SEQ ID NO:15))과 함께, 클로스트리듐 아세토부틸리쿰(C. acetobutylicum) ATCC824(ATCC)의 게놈 DNA가 주형으로서 이용되고, PCR 산물은 SalI과 XmaI로 절단되었다. adc를 클로닝하기 위하여, 프라이머 쌍 TA20F(5' CGCCCCGGGGAAGGAGATATACATATGTTAAAGGATGAAGTAATTAAAC 3'(SEQ ID NO:16))와 TA6R(5' CGCGGATCCTTACTTAAGATAATCATATATAACT 3'(SEQ ID NO:17))과 함께, 클로스트리듐 아세토부틸리쿰(C. acetobutylicum) ATCC824의 게놈 DNA가 주형으로서 이용되고, PCR 산물은 XmaI과 BamHI로 절단되었다.
pTA30(P LlacO1:: atoB-atoAD-adc)- atoAD를 클로닝하기 위하여, 프라이머 쌍 TA21F(5' CCGCGTCGACGAAGGAGATATACATATGAAAACAAAATTGATGACATTAC 3'(SEQ ID NO:18))와 TA18R(5' CGCCCCGGGTCATAAATCACCCCGTTGCGTATTC 3'(SEQ ID NO:19))과 함께, 대장균(E. coli) K-12 MG1655의 게놈 DNA가 주형으로서 이용되었다. PCR 산물은 SalI과 XmaI로 절단하고, 동일한 효소로 절단된 플라스미드 pTA29 내로 클로닝하였다.
pTA39(P LlacO1:: thl-atoAD-adc) - thl를 클로닝하기 위하여, 프라이머 쌍 TA13F(5' CGCGGTACCATGAAAGAAGTTGTAATAGCTAGTG 3'(SEQ ID NO:20))와 TA14R(5' CCGCGTCGACCTAGCACTTTTCTAGCAATATTGC 3'(SEQ ID NO:21))과 함께, 클로스트리듐 아세토부틸리쿰(C. acetobutylicum) ATCC824의 게놈 DNA가 주형으로서 이용되었다. PCR 산물은 Acc65I과 SalI로 절단하고, 동일한 효소로 절단된 플라스미드 pTA30 내로 클로닝하였다.
pTA41(P LlacO1:: thl-ctfAB-adc) - thl을 클로닝하기 위하여, 프라이머 쌍 TA13F와 TA14R과 함께, 클로스트리듐 아세토부틸리쿰(C. acetobutylicum) ATCC824의 게놈 DNA가 주형으로서 이용되었다. PCR 산물은 Acc65I과 SalI로 절단하고, 동일한 효소로 절단된 플라스미드 pTA29 내로 클로닝하였다.
pTA18(P LlacO1:: adh(서모언에어로박터 브록키(T. brockii)) - adh(서모언에어로박터 브록키(T. brockii))를 클로닝하기 위하여, 프라이머 쌍 TA7F(5' CGCGGTACCATGAAAGGTTTTGCAATGCTGTCCA 3'(SEQ ID NO:22))와 TA8R(5' CGCTCTAGACTATGCTAAAATCACCACTGGTTTAATT 3'(SEQ ID NO:23))과 함께, 서모언에어로박터 브록키(T. brockii) HTD4의 합성된 DNA(Epoch Biolabs)가 주형으로서 이용되었다. PCR 산물은 Acc65I과 XbaI로 절단하고, 동일한 효소로 절단된 플라스미드 pZE12-luc 내로 클로닝하여 pTA8을 산출하였다. 복제 기점(replication origin)과 암피실린 내성 유전자를 p15A와 카나마이신 내성 유전자로 대체하기 위하여, pZA31-luc를 AatII와 AvrII로 절단하였다. 더욱 짧은 단편은 정제하고 동일한 효소로 절단된 pTA8 내로 클로닝하여 pTA18을 산출하였다. 이러한 합성된 DNA의 코돈 이용 빈도는 대장균(E. coli)에서 발현을 위하여 최적화시키고, 스템 루프 구조는 2차 구조 예측 프로그램으로 조사함으로써 회피하였다. 이러한 서열은 보충 자료(supplemental material)에 도시된다.
pTA36(P LlacO1:: adh(클로스트리듐 베이어린키(C. beijerinckii)) - adh(클로스트리듐 베이어린키(C. beijerinckii))를 클로닝하기 위하여, 클로스트리듐 베이어린키(C. beijerinckii) NRRL B593(Epoch Biolabs)의 합성된 DNA를 포함하는 플라스미드는 Acc65I과 SalI로 절단하고, 동일한 효소로 절단된 플라스미드 pZE12-luc 내로 클로닝하여 pTA34를 산출하였다. 복제 기점과 암피실린 내성 유전자를 p15A와 카나마이신 내성 유전자로 대체하기 위하여, pZA31-luc를 AatII와 AvrII로 절단하였다. 더욱 짧은 단편은 정제하고, 동일한 효소로 절단된 플라스미드 내로 클로닝하여 pTA36을 산출하였다. 이러한 합성된 DNA의 코돈 이용 빈도는 서모언에어로박터 브록키(T. brockii)로부터 adh 유전자에서와 동일한 방식으로 최적화시켰다(예로써, 도 4 참조).
전배양 배지(preculture medium)로서, 2% 글루코오스를 포함하는 SD-7(NH4Cl, 7.0 g/ℓ; KH2PO4, 1.5 g/ℓ; Na2HPO4, 1.5 g/ℓ; K2SO4, 0.35 g/ℓ; MgSO4ㆍ7H2O, 0.17 g/ℓ, 미량 원소, 0.8 ㎖/ℓ; 효모 추출물; 5 g/ℓ)을 제조하였다(13). 발효(fermentation)를 위하여, 2% 글루코오스를 포함하는 SD-8(NH4Cl, 7.0 g/ℓ; KH2PO4, 7.5 g/ℓ; Na2HPO4, 7.5 g/ℓ; K2SO4, 0.85, MgSO4ㆍ7H2O, 0.17 g/ℓ, 미량 원소, 0.8 ㎖/ℓ; 효모 추출물; 10 g/ℓ)(13) 배지가 이용되었다. 미량 원소 용액은 아래의 성분을 포함하였다(5 M HCl(g/ℓ)에서): FeSO4ㆍ7H2O, 40.0; MnSO4ㆍH2O, 10.0; Al2(SO4)3, 28.3; CoCl2ㆍ6H2O, 4.0; ZnSO4ㆍ7H2O, 2.0; Na2MoO4ㆍ2H2O; CuCl2ㆍ2H2O, 1.0; 그리고 H3BO4, 0.5. 적절한 경우에 항생제를 첨가하였다; 암피실린 100 ㎍/㎖와 클로람페니콜 40 ㎍/㎖.
회전 교반기(rotary shaker)(250 rpm)에서 37℃에서 하룻밤(17시간) 동안, 검사 튜브 내에서 5 ㎖의 SD-7 배지를 포함하는 전배양을 수행하였다. 250 ㎕의 하룻밤 배양액을 배플(baffle)이 구비된 250 ㎖ 플라스크에서 25 ㎖의 SD-8 배지 내로 접종(inoculation)하였다. OD600이 ~1.0일 때(3시간), 유도를 위하여 0.1 mM IPTG를 첨가하였다. 회전 교반기(250 rpm)에서 37℃에서 30.5시간 동안 세포를 성장시키고, 0, 3, 6.5, 9.5, 12, 24, 28.5와 30.5 시간 시점에 수확하였다.
글루코오스 분석 시제(Sigma Aldrich)를 이용하여 글루코오스를 측정하였다. 불꽃 이온화 검출기(flame ionization detector)를 이용한 가스 크로마토그래피(gas chromatography)로 다양한 알코올을 정량하였다. 상기 시스템은 모형 5890A 가스 크로마토그래프(gas chromatograph)(Hewlett Packard, Avondale, PA), 모형 7673A 자동 주입기(automatic injector), 시료 채취 장치(sampler)와 제어기(controller)(Hewlett Packard)로 구성되었다. 알코올 화합물의 분리는 A DB-WAX 모세관 칼럼(capillary column)(30 m, 0.32 ㎜-i.d., 0.50 ㎛-필름 두께(film thickness); Agilent Technologies)로 수행하였다. GC 오븐 온도(oven temperature)는 초기에, 40℃에서 5분 동안 유지시키고, 120℃까지 15℃/min의 기울기(gradient), 그 이후에 230℃까지 50℃/min의 기울기로 상승시키고, 4분 동안 유지시켰다. 9.3 psi 선단 압력(inlet pressure)에서 헬륨(helium)을 운반 가스(carrier gas)로서 이용하였다. 주입기와 검출기는 225℃에 유지시켰다. 배양액(culture broth)의 0.5 ㎕ 상층액을 분할 주입 양식(split injection mode)(1:15 분할 비율(split ratio))으로 주입하였다. 1-프로판올을 내부 기준(internal standard)으로 이용하였다.
다른 분비된 대사산물의 경우에, 자동시료주입기(auto-sampler)(Agilent Technologies)와 BioRad(Biorad Laboratories, Hercules, CA) Aminex HPX87 칼럼(5mM H2SO4, 0.6㎖/min, 칼럼 온도 65℃)이 구비된 Agilent 1100 HPLC에, 여과된 상층액을 적용하였다(20 ㎕). 210 nm에서 광다이오드 어레이 검출기(photodiode array detector)를 이용하여, 유기산(푸마르산염, 젖산염, 구연산염, 피루브산염, 포름산염, 말산염, 아세트산염, 그리고 숙신산염)을 검출하였다.
유도후 4시간 시점에 수확된 세포는 원심분리후, 효소 분석(enzyme assay)에 이용하였다. 혐기성 조건(anaerobic condition) 하에 0.1 ㎜ 유리 구슬(glass bead)과 Mini Bead Beater 8(Biospec Product, OK)로, 50 mM Tris 염화물(pH8)에서 가공되지 않은 추출물을 준비하였다. Ar 하에 25℃에서 NADPH로 아세톤(6.7 mM)의 환원을 추적함으로써 SADH 활성을 측정하였다. 분석 혼합물은 50 mM Tris-Cl 완충액(pH 7.5), 1 mM 디티오트레이톨(dithiothreitol), 그리고 0.2 mM NADPH를 포함하였다. 1 단위(unit)의 활성은 분당 1 μmol NADPH의 산화(oxidation)이다.
이소프로판올 생산을 위한 5가지 상이한 유전자 조합(도 2)이 이용되었다. 모든 합성 경로는 호기성 조건 하에, 111 mM(20 g/ℓ)의 최초 글루코오스 농도로부터 이소프로판올을 생산하였다. 모든 조합에서, 글루코오스는 접종후 12시간(IPTG로 유도후 9시간 시점) 이내에 고갈되었다. 도 2에 도시된 바와 같이, pTA39/pTA36을 포함하는 TA11은 최대량의 이소프로판올을 생산하였다. 모든 균주에 의해 생산되는 에탄올 양은 이소프로판올 생산에 비하여 매우 적었다(10 mM 미만).
도 3에서는 TA11(pTA39/pTA36)을 이용한 발효의 시간 과정을 도시한다. 이소프로판올 농도는 글루코오스의 고갈(12시간) 이후에 감소하였다. 24시간 시점에 배양액에 글루코오스(111 mM)의 첨가는 이소프로판올 생산을 첫 번째 생산 단계에서와 동일한 속도로 복원시켰는데, 이는 상기 경로 활성이 14시간 결핍(starvation) 이후에도 안정하다는 것을 암시하였다. 글루코오스가 고갈될 때(30.5시간), 달성된 이소프로판올의 최종 농도는 81.6 mM이었다. 아세톤 농도는 최초 글루코오스의 고갈후 증가하기 시작하고, 글루코오스의 첨가로 급격하게 감소하였다(도 3). IPTG로 유도 이후에 푸마르산(최대 농도: 386 ㅅM)을 제외한 어떤 유기산도 유의하게 축적되지 않았다. 글루코오스 결핍 동안, 이소프로판올 농도는 감소하는 반면, 아세톤 농도는 증가하였다.
pTA36 또는 pTA18을 포함하는 균주로부터 이소프로판올 생산을 비교하였다. 클로스트리듐 베이어린키(C. beijerinckii)로부터 SADH의 아미노산 서열은 서모언에어로박터 브록키(T. brockii)로부터 SADH의 아미노산 서열과 76% 동일성 및 86% 유사성을 갖는다. 하지만, TA11(pTA39/pTA18)은 클로스트리듐 베이어린키(C. beijerinckii)(pTA39/pTA36)로부터 adh를 포함하는 균주보다 더욱 낮은 농도의 이소프로판올 및 훨씬 높은 농도의 아세톤을 생산하였다. 더욱 조사하기 위하여, 이들 2가지 알코올 탈수소효소(pTA18 또는 pTA36)를 포함하는 배양액으로부터 가공되지 않은 추출물에서 효소 활성을 측정하였다. 클로스트리듐 베이어린키(C. beijerinckii)(pTA39/pTA36)로부터 알코올 탈수소효소의 활성(3.08±0.36 단위/단백질 ㎎)은 서모언에어로박터 브록키(T. brockii) (pTA39/pTA18)로부터 알코올 탈수소효소의 활성(0.24±0.08 단위/단백질 ㎎)보다 훨씬 높은데, 이는 더욱 높은 이소프로판올 생산과 일치한다.
adh-포함 플라스미드가 상기 균주에서 누락될 때, 상기 숙주는 pTA39만을 포함하는 TA11에 의해 아세톤을 생산하였다. 24시간 시점에, 글루코오스를 111 mM로 첨가하는데, 상기 균주는 거의 동일한 생산 속도로 아세톤을 지속적으로 생산하였다. 세포 성장과 에탄올 농도는 이소프로판올 생산 실험 동안 관찰되는 것과 유사한 경향을 보였다. 글루코오스가 고갈될 때(30.5시간), 아세톤의 최종 농도는 148.3 mM인 것으로 측정되었다. 이소프로판올 생산에서처럼, IPTG로 유도 이후에 푸마르산(최대 농도: 292 ㅅM)을 제외한 어떤 유기산도 유의하게 축적되지 않았다.
본 발명에서는 대장균(E. coli)에서 이소프로판올 생산을 증명한다. 교반 플라스크 배양액에서, pTA39/pTA36을 포함하는 균주 TA11은 3 내지 9.5시간 사이에 6.9 mM/h(0.41 g/ℓ/h)의 최대 생산력(maximum productivity)으로, 30.5시간 시점에 81.6 mM 이소프로판올을 생산하였다. 이러한 조작된 대장균(E. coli)은 ~3 mM/h (~0.18 g/ℓ/h)의 최대 생산력으로 ~30 mM의 이소프로판올을 생산하는 현재까지 보고된 가장 우수한 균주인 클로스트리듐 베이어린키(C. beijerinckii) NRRL B593(4)을 능가하였다. 접종후 9.5시간 시점에 이소프로판올 수율은 43.5%(이소프로판올 mol/글루코오스 mol)이었다. 이러한 수율은 3 내지 9.5시간 사이에, 생산된 이소프로판올(44.8 mM)과 소비된 글루코오스(103.0 mM)로부터 계산된다: 몰 수율 = 44.8/103.0 = 0.435. 이러한 수율은 매우 고무적인데, 그 이유는 상기 생산 경로를 이용한 글루코오스로부터 최대 이론적 수율이 1(이소프로판올 mol/글루코오스 mol)이기 때문이다. 이소프로판올 생산의 이러한 이론적 수율은 도 1에 도시된 경로에 기초하여 계산된다. 1 mole의 글루코오스가 2 mole의 아세틸-CoA와 2 mole의 CO2로 전환된다. 이후, 이들 2개의 아세틸-CoA는 응축되어 1 mole의 이소프로판올을 형성하고, 1 mole의 CO2를 추가로 상실한다.
이들 결과는 atoAD를 포함하는 대장균(E. coli)이 클로스트리듐 베이어린키(C. beijerinckii) ctfAB를 포함하는 균주와 비교하여 이소프로판올을 더욱 높은 농도로 생산한다는 것을 증명한다. CtfAB의 아세트산염에 대한 Km(1200 mM)은 AtoAD의 아세트산염에 대한 Km(53.1 mM)보다 훨씬 높다. 아세트산염 친화성(acetate affinity)에서 이러한 차이는 AtoAD가 이소프로판올 생산을 위한 더욱 우수한 효소인 이유를 설명할 것이다. 이소프로판올 생산은 클로스트리듐 베이어린키(C. beijerinckii)로부터 SADH의 아세톤에서 이소프로판올로의 전환 비율(conversion rate)이 서모언에어로박터 브록키(T. brockii)로부터 SADH의 아세톤에서 이소프로판올로의 전환 비율보다 훨씬 높다는 것을 증명하였다. 실제로, 가공되지 않은 추출물을 이용한 알코올 탈수소효소 분석에서, 클로스트리듐 베이어린키(C. beijerinckii)로부터 SADH는 서모언에어로박터 브록키(T. brockii)로부터 SADH보다 아세톤으로부터 이소프로판올 형성에 더욱 높은 활성을 갖는 것으로 증명되었다. 발현 수준에서 차이를 배제할 순 없지만, 클로스트리듐 베이어린키(C. beijerinckii)로부터 SADH는 이들 조건 하에 이소프로판올 생산을 위한 더욱 우수한 선택이다. 코돈 최적화는 발현을 변화시킬 수 있다. 일반적으로, 유전자의 GC 함량은 발현 효율에 영향을 주는 것으로 알려져 있다. 클로스트리듐 베이어린키(C. beijerinckii)와 서모언에어로박터 브록키(T. brockii)에서 SADH의 GC 함량은 각각, 38과 44%이다. 이들 수치는 대장균(E. coli) K-12 MG1655의 평균 GC 함량과 상이하다.
Bermejo 등(supra)은 클로스트리듐 아세토부틸리쿰(C. acetobutylicum)으로부터 재조합 아세톤 경로(thl, ctfAB, adc)를 이용하여, 대장균(E. coli)에서 아세톤 생산을 위한 교반 플라스크를 이용한 배치 배양(batch culture)과 글루코오스 공급 배치 배양을 설명하였다. 상기 균주는 배치 배양에서 접종후 24시간 시점에 약 40 mM 아세톤을 생산하고, 글루코오스 공급 배치 배양에서 93 mM 아세톤을 생산하였다. 동일한 배지, 동일한 글루코오스 농도, 그리고 변형된 이형의 대장균(E. coli) B 균주가 이용되었다. 그럼에도 불구하고, 동일한 유전자 구조(pTA41)를 이용한 배치 생산은 12시간 시점에 60.3 mM의 아세톤을 달성하였다. 교반 플라스크에서, pTA39를 포함하는 균주 TA11은 12.1 mM/h(0.70 g/ℓ/h)의 최대 생산력(3 - 9.5시간)으로, 약 30시간 시점에 148.3 mM의 최대 농도를 달성하였다. 이러한 아세톤 역가는 또한, 야생형 클로스트리듐 아세토부틸리쿰(C. acetobutylicum)에 의해 생산된 아세톤 역가(90 mM)를 초과하였다. 상기 균주와 발현 조건의 추가적인 최적화 없이, 접종후 12시간 시점에 아세톤 수율은 이론적 최대의 73.5%(mol/mol)이었다. 이러한 높은 수율은 이소프로판올의 산업적 생산에서 대사 조작된 대장균(E. coli)을 이용하는 중대한 잠재력을 암시한다.
본 발명에 따른 다수의 구체예가 기술되었다. 그럼에도 불구하고, 본 발명의 기술적 사상과 범위를 이탈하지 않는 범위에서 다양한 개변이 가능함을 알 수 있을 것이다. 따라서 다른 구체예가 하기의 특허청구범위의 범위에 포함된다.
SEQUENCE LISTING <110> The Regents of the University of California Liao, James C Atsumi, Shota Hanai, Taizo <120> MICROORGANISM ENGINEERED TO PRODUCED ISOPROPANOL <130> 00011-009WO1 <140> Not yet known <141> 2008-10-11 <150> US 60/979,731 <151> 2007-10-12 <160> 23 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1185 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> CDS <222> (1)..(1185) <400> 1 atg aaa aat tgt gtc atc gtc agt gcg gta cgt act gct atc ggt agt 48 Met Lys Asn Cys Val Ile Val Ser Ala Val Arg Thr Ala Ile Gly Ser 1 5 10 15 ttt aac ggt tca ctc gct tcc acc agc gcc atc gac ctg ggg gcg aca 96 Phe Asn Gly Ser Leu Ala Ser Thr Ser Ala Ile Asp Leu Gly Ala Thr 20 25 30 gta att aaa gcc gcc att gaa cgt gca aaa atc gat tca caa cac gtt 144 Val Ile Lys Ala Ala Ile Glu Arg Ala Lys Ile Asp Ser Gln His Val 35 40 45 gat gaa gtg att atg ggt aac gtg tta caa gcc ggg ctg ggg caa aat 192 Asp Glu Val Ile Met Gly Asn Val Leu Gln Ala Gly Leu Gly Gln Asn 50 55 60 ccg gcg cgt cag gca ctg tta aaa agc ggg ctg gca gaa acg gtg tgc 240 Pro Ala Arg Gln Ala Leu Leu Lys Ser Gly Leu Ala Glu Thr Val Cys 65 70 75 80 gga ttc acg gtc aat aaa gta tgt ggt tcg ggt ctt aaa agt gtg gcg 288 Gly Phe Thr Val Asn Lys Val Cys Gly Ser Gly Leu Lys Ser Val Ala 85 90 95 ctt gcc gcc cag gcc att cag gca ggt cag gcg cag agc att gtg gcg 336 Leu Ala Ala Gln Ala Ile Gln Ala Gly Gln Ala Gln Ser Ile Val Ala 100 105 110 ggg ggt atg gaa aat atg agt tta gcc ccc tac tta ctc gat gca aaa 384 Gly Gly Met Glu Asn Met Ser Leu Ala Pro Tyr Leu Leu Asp Ala Lys 115 120 125 gca cgc tct ggt tat cgt ctt gga gac gga cag gtt tat gac gta atc 432 Ala Arg Ser Gly Tyr Arg Leu Gly Asp Gly Gln Val Tyr Asp Val Ile 130 135 140 ctg cgc gat ggc ctg atg tgc gcc acc cat ggt tat cat atg ggg att 480 Leu Arg Asp Gly Leu Met Cys Ala Thr His Gly Tyr His Met Gly Ile 145 150 155 160 acc gcc gaa aac gtg gct aaa gag tac gga att acc cgt gaa atg cag 528 Thr Ala Glu Asn Val Ala Lys Glu Tyr Gly Ile Thr Arg Glu Met Gln 165 170 175 gat gaa ctg gcg cta cat tca cag cgt aaa gcg gca gcc gca att gag 576 Asp Glu Leu Ala Leu His Ser Gln Arg Lys Ala Ala Ala Ala Ile Glu 180 185 190 tcc ggt gct ttt aca gcc gaa atc gtc ccg gta aat gtt gtc act cgg 624 Ser Gly Ala Phe Thr Ala Glu Ile Val Pro Val Asn Val Val Thr Arg 195 200 205 aag aaa acc ttc gtc ttc agt caa gac gaa ttc ccg aaa gcg aat tca 672 Lys Lys Thr Phe Val Phe Ser Gln Asp Glu Phe Pro Lys Ala Asn Ser 210 215 220 acg gct gaa gcg tta ggt gca ttg cgc ccg gcc ttc gat aaa gca gga 720 Thr Ala Glu Ala Leu Gly Ala Leu Arg Pro Ala Phe Asp Lys Ala Gly 225 230 235 240 aca gtc acc gct ggg aac gcg tct ggt att aac gac ggt gct gcc gct 768 Thr Val Thr Ala Gly Asn Ala Ser Gly Ile Asn Asp Gly Ala Ala Ala 245 250 255 ctg gtg att atg gaa gaa tct gcg gcg ctg gca gca ggc ctt acc ccc 816 Leu Val Ile Met Glu Glu Ser Ala Ala Leu Ala Ala Gly Leu Thr Pro 260 265 270 ctg gct cgc att aaa agt tat gcc agc ggt ggc gtg ccc ccc gca ttg 864 Leu Ala Arg Ile Lys Ser Tyr Ala Ser Gly Gly Val Pro Pro Ala Leu 275 280 285 atg ggt atg ggg cca gta cct gcc acg caa aaa gcg tta caa ctg gcg 912 Met Gly Met Gly Pro Val Pro Ala Thr Gln Lys Ala Leu Gln Leu Ala 290 295 300 ggg ctg caa ctg gcg gat att gat ctc att gag gct aat gaa gca ttt 960 Gly Leu Gln Leu Ala Asp Ile Asp Leu Ile Glu Ala Asn Glu Ala Phe 305 310 315 320 gct gca cag ttc ctt gcc gtt ggg aaa acc ctg ggc ttt gat tct gag 1008 Ala Ala Gln Phe Leu Ala Val Gly Lys Thr Leu Gly Phe Asp Ser Glu 325 330 335 aaa gtg aat gtc aac ggc ggg gcc atc gcg ctc ggg cat cct atc ggt 1056 Lys Val Asn Val Asn Gly Gly Ala Ile Ala Leu Gly His Pro Ile Gly 340 345 350 gcc agt ggt gct cgt att ctg gtc aca cta tta cat gcc atg cag gca 1104 Ala Ser Gly Ala Arg Ile Leu Val Thr Leu Leu His Ala Met Gln Ala 355 360 365 cgc gat aaa acg ctg ggg ctg gca aca ctg tgc att ggc ggc ggc cag 1152 Arg Asp Lys Thr Leu Gly Leu Ala Thr Leu Cys Ile Gly Gly Gly Gln 370 375 380 gga att gcg atg gtg att gaa cgg ttg aat taa 1185 Gly Ile Ala Met Val Ile Glu Arg Leu Asn 385 390 <210> 2 <211> 394 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 2 Met 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Ser Gln Asp Glu Phe Pro Lys Ala Asn Ser 210 215 220 Thr Ala Glu Ala Leu Gly Ala Leu Arg Pro Ala Phe Asp Lys Ala Gly 225 230 235 240 Thr Val Thr Ala Gly Asn Ala Ser Gly Ile Asn Asp Gly Ala Ala Ala 245 250 255 Leu Val Ile Met Glu Glu Ser Ala Ala Leu Ala Ala Gly Leu Thr Pro 260 265 270 Leu Ala Arg Ile Lys Ser Tyr Ala Ser Gly Gly Val Pro Pro Ala Leu 275 280 285 Met Gly Met Gly Pro Val Pro Ala Thr Gln Lys Ala Leu Gln Leu Ala 290 295 300 Gly Leu Gln Leu Ala Asp Ile Asp Leu Ile Glu Ala Asn Glu Ala Phe 305 310 315 320 Ala Ala Gln Phe Leu Ala Val Gly Lys Thr Leu Gly Phe Asp Ser Glu 325 330 335 Lys Val Asn Val Asn Gly Gly Ala Ile Ala Leu Gly His Pro Ile Gly 340 345 350 Ala Ser Gly Ala Arg Ile Leu Val Thr Leu Leu His Ala Met Gln Ala 355 360 365 Arg Asp Lys Thr Leu Gly Leu Ala Thr Leu Cys Ile Gly Gly Gly Gln 370 375 380 Gly Ile Ala Met Val Ile Glu Arg Leu Asn 385 390 <210> 3 <211> 663 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> CDS <222> (1)..(663) <400> 3 atg aaa aca aaa ttg atg aca tta caa gac gcc acc ggc ttc ttt cgt 48 Met Lys Thr Lys Leu Met Thr Leu Gln Asp Ala Thr Gly Phe Phe Arg 1 5 10 15 gac ggc atg acc atc atg gtg ggc gga ttt atg ggg att ggc act cca 96 Asp Gly Met Thr Ile Met Val Gly Gly Phe Met Gly Ile Gly Thr Pro 20 25 30 tcc cgc ctg gtt gaa gca tta ctg gaa tct ggt gtt cgc gac ctg aca 144 Ser Arg Leu Val Glu Ala Leu Leu Glu Ser Gly Val Arg Asp Leu Thr 35 40 45 ttg ata gcc aat gat acc gcg ttt gtt gat acc ggc atc ggt ccg ctc 192 Leu Ile Ala Asn Asp Thr Ala Phe Val Asp Thr Gly Ile Gly Pro Leu 50 55 60 atc gtc aat ggt cga gtc cgc aaa gtg att gct tca cat atc ggc acc 240 Ile Val Asn Gly Arg Val Arg Lys Val Ile Ala Ser His Ile Gly Thr 65 70 75 80 aac ccg gaa aca ggt cgg cgc atg ata tct ggt gag atg gac gtc gtt 288 Asn Pro Glu Thr Gly Arg Arg Met Ile Ser Gly Glu Met Asp Val Val 85 90 95 ctg gtg ccg caa ggt acg cta atc gag caa att cgc tgt ggt gga gct 336 Leu Val Pro Gln Gly Thr Leu Ile Glu Gln Ile Arg Cys Gly Gly Ala 100 105 110 gga ctt ggt ggt ttt ctc acc cca acg ggt gtc ggc acc gtc gta gag 384 Gly Leu Gly Gly Phe Leu Thr Pro Thr Gly Val Gly Thr Val Val Glu 115 120 125 gaa ggc aaa cag aca ctg aca ctc gac ggt aaa acc tgg ctg ctc gaa 432 Glu Gly Lys Gln Thr Leu Thr Leu Asp Gly Lys Thr Trp Leu Leu Glu 130 135 140 cgc cca ctg cgc gcc gac ctg gcg cta att cgc gct cat cgt tgc gac 480 Arg Pro Leu Arg Ala Asp Leu Ala Leu Ile Arg Ala His Arg Cys Asp 145 150 155 160 aca ctt ggc aac ctg acc tat caa ctt agc gcc cgc aac ttt aac ccc 528 Thr Leu Gly Asn Leu Thr Tyr Gln Leu Ser Ala Arg Asn Phe Asn Pro 165 170 175 ctg ata gcc ctt gcg gct gat atc acg ctg gta gag cca gat gaa ctg 576 Leu Ile Ala Leu Ala Ala Asp Ile Thr Leu Val Glu Pro Asp Glu Leu 180 185 190 gtc gaa acc ggc gag ctg caa cct gac cat att gtc acc cct ggt gcc 624 Val Glu Thr Gly Glu Leu Gln Pro Asp His Ile Val Thr Pro Gly Ala 195 200 205 gtt atc gac cac atc atc gtt tca cag gag agc aaa taa 663 Val Ile Asp His Ile Ile Val Ser Gln Glu Ser Lys 210 215 220 <210> 4 <211> 220 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 4 Met Lys Thr Lys Leu Met Thr Leu Gln Asp Ala Thr Gly Phe Phe Arg 1 5 10 15 Asp Gly Met Thr Ile Met Val Gly Gly Phe Met Gly Ile Gly Thr Pro 20 25 30 Ser Arg Leu Val Glu Ala Leu Leu Glu Ser Gly Val Arg Asp Leu Thr 35 40 45 Leu Ile Ala Asn Asp Thr Ala Phe Val Asp Thr Gly Ile Gly Pro Leu 50 55 60 Ile Val Asn Gly Arg Val Arg Lys Val Ile Ala Ser His Ile Gly Thr 65 70 75 80 Asn Pro Glu Thr Gly Arg Arg Met Ile Ser Gly Glu Met Asp Val Val 85 90 95 Leu Val Pro Gln Gly Thr Leu Ile Glu Gln Ile Arg Cys Gly Gly Ala 100 105 110 Gly Leu Gly Gly Phe Leu Thr Pro Thr Gly Val Gly Thr Val Val Glu 115 120 125 Glu Gly Lys Gln Thr Leu Thr Leu Asp Gly Lys Thr Trp Leu Leu Glu 130 135 140 Arg Pro Leu Arg Ala Asp Leu Ala Leu Ile Arg Ala His Arg Cys Asp 145 150 155 160 Thr Leu Gly Asn Leu Thr Tyr Gln Leu Ser Ala Arg Asn Phe Asn Pro 165 170 175 Leu Ile Ala Leu Ala Ala Asp Ile Thr Leu Val Glu Pro Asp Glu Leu 180 185 190 Val Glu Thr Gly Glu Leu Gln Pro Asp His Ile Val Thr Pro Gly Ala 195 200 205 Val Ile Asp His Ile Ile Val Ser Gln Glu Ser Lys 210 215 220 <210> 5 <211> 735 <212> DNA <213> Clostridium acetobutylicum <220> <221> CDS <222> (1)..(735) <400> 5 atg tta aag gat gaa gta att aaa caa att agc acg cca tta act tcg 48 Met Leu Lys Asp Glu Val Ile Lys Gln Ile Ser Thr Pro Leu Thr Ser 1 5 10 15 cct gca ttt cct aga gga ccc tat aaa ttt cat aat cgt gag tat ttt 96 Pro Ala Phe Pro Arg Gly Pro Tyr Lys Phe His Asn Arg Glu Tyr Phe 20 25 30 aac att gta tat cgt aca gat atg gat gca ctt cgt aaa gtt gtg cca 144 Asn Ile Val Tyr Arg Thr Asp Met Asp Ala Leu Arg Lys Val Val Pro 35 40 45 gag cct tta gaa att gat gag ccc tta gtc agg ttt gaa att atg gca 192 Glu Pro Leu Glu Ile Asp Glu Pro Leu Val Arg Phe Glu Ile Met Ala 50 55 60 atg cat gat acg agt gga ctt ggt tgt tat aca gaa agc gga cag gct 240 Met His Asp Thr Ser Gly Leu Gly Cys Tyr Thr Glu Ser Gly Gln Ala 65 70 75 80 att ccc gta agc ttt aat gga gtt aag gga gat tat ctt cat atg atg 288 Ile Pro Val Ser Phe Asn Gly Val Lys Gly Asp Tyr Leu His Met Met 85 90 95 tat tta gat aat gag cct gca att gca gta gga agg gaa tta agt gca 336 Tyr Leu Asp Asn Glu Pro Ala Ile Ala Val Gly Arg Glu Leu Ser Ala 100 105 110 tat cct aaa aag ctc ggg tat cca aag ctt ttt gtg gat tca gat act 384 Tyr Pro Lys Lys Leu Gly Tyr Pro Lys Leu Phe Val Asp Ser Asp Thr 115 120 125 tta gta gga act tta gac tat gga aaa ctt aga gtt gcg aca gct aca 432 Leu Val Gly Thr Leu Asp Tyr Gly Lys Leu Arg Val Ala Thr Ala Thr 130 135 140 atg ggg tac aaa cat aaa gcc tta gat gct aat gaa gca aag gat caa 480 Met Gly Tyr Lys His Lys Ala Leu Asp Ala Asn Glu Ala Lys Asp Gln 145 150 155 160 att tgt cgc cct aat tat atg ttg aaa ata ata ccc aat tat gat gga 528 Ile Cys Arg Pro Asn Tyr Met Leu Lys Ile Ile Pro Asn Tyr Asp Gly 165 170 175 agc cct aga ata tgt gag ctt ata aat gcg aaa atc aca gat gtt acc 576 Ser Pro Arg Ile Cys Glu Leu Ile Asn Ala Lys Ile Thr Asp Val Thr 180 185 190 gta cat gaa gct tgg aca gga cca act cga ctg cag tta ttt gat cac 624 Val His Glu Ala Trp Thr Gly Pro Thr Arg Leu Gln Leu Phe Asp His 195 200 205 gct atg gcg cca ctt aat gat ttg cca gta aaa gag att gtt tct agc 672 Ala Met Ala Pro Leu Asn Asp Leu Pro Val Lys Glu Ile Val Ser Ser 210 215 220 tct cac att ctt gca gat ata ata ttg cct aga gct gaa gtt ata tat 720 Ser His Ile Leu Ala Asp Ile Ile Leu Pro Arg Ala Glu Val Ile Tyr 225 230 235 240 gat tat ctt aag taa 735 Asp Tyr Leu Lys <210> 6 <211> 244 <212> PRT <213> Clostridium acetobutylicum <400> 6 Met Leu Lys Asp Glu Val Ile Lys Gln Ile Ser Thr Pro Leu Thr Ser 1 5 10 15 Pro Ala Phe Pro Arg Gly Pro Tyr Lys Phe His Asn Arg Glu Tyr Phe 20 25 30 Asn Ile Val Tyr Arg Thr Asp Met Asp Ala Leu Arg Lys Val Val Pro 35 40 45 Glu Pro Leu Glu Ile Asp Glu Pro Leu Val Arg Phe Glu Ile Met Ala 50 55 60 Met His Asp Thr Ser Gly Leu Gly Cys Tyr Thr Glu Ser Gly Gln Ala 65 70 75 80 Ile Pro Val Ser Phe Asn Gly Val Lys Gly Asp Tyr Leu His Met Met 85 90 95 Tyr Leu Asp Asn Glu Pro Ala Ile Ala Val Gly Arg Glu Leu Ser Ala 100 105 110 Tyr Pro Lys Lys Leu Gly Tyr Pro Lys Leu Phe Val Asp Ser Asp Thr 115 120 125 Leu Val Gly Thr Leu Asp Tyr Gly Lys Leu Arg Val Ala Thr Ala Thr 130 135 140 Met Gly Tyr Lys His Lys Ala Leu Asp Ala Asn Glu Ala Lys Asp Gln 145 150 155 160 Ile Cys Arg Pro Asn Tyr Met Leu Lys Ile Ile Pro Asn Tyr Asp Gly 165 170 175 Ser Pro Arg Ile Cys Glu Leu Ile Asn Ala Lys Ile Thr Asp Val Thr 180 185 190 Val His Glu Ala Trp Thr Gly Pro Thr Arg Leu Gln Leu Phe Asp His 195 200 205 Ala Met Ala Pro Leu Asn Asp Leu Pro Val Lys Glu Ile Val Ser Ser 210 215 220 Ser His Ile Leu Ala Asp Ile Ile Leu Pro Arg Ala Glu Val Ile Tyr 225 230 235 240 Asp Tyr Leu Lys <210> 7 <211> 1059 <212> DNA <213> Thermoanaerobacter brockii <220> <221> CDS <222> (1)..(1059) <400> 7 atg aaa ggt ttt gca atg ctg tcc atc ggg aaa gtc ggc tgg att gaa 48 Met Lys Gly Phe Ala Met Leu Ser Ile Gly Lys Val Gly Trp Ile Glu 1 5 10 15 aaa gag aaa cct gcg cca ggt cca ttc gat gca atc gtt cgc ccg ctg 96 Lys Glu Lys Pro Ala Pro Gly Pro Phe Asp Ala Ile Val Arg Pro Leu 20 25 30 gcg gtt gcg cct tgc act tca gat atc cat acc gtg ttt gaa ggc gct 144 Ala Val Ala Pro Cys Thr Ser Asp Ile His Thr Val Phe Glu Gly Ala 35 40 45 atc ggc gag cgt cac aac atg att ctg ggc cac gaa gcc gtg ggc gaa 192 Ile Gly Glu Arg His Asn Met Ile Leu Gly His Glu Ala Val Gly Glu 50 55 60 gta gta gaa gtc ggc tct gaa gtg aag gat ttt aag cct ggt gat cgg 240 Val Val Glu Val Gly Ser Glu Val Lys Asp Phe Lys Pro Gly Asp Arg 65 70 75 80 gtt gtg gtg ccg gca att acg ccg gat tgg cgg acc tct gag gtg caa 288 Val Val Val Pro Ala Ile Thr Pro Asp Trp Arg Thr Ser Glu Val Gln 85 90 95 cgt ggc tat cat cag cat agc ggt ggt atg ctg gct ggc tgg aaa ttt 336 Arg Gly Tyr His Gln His Ser Gly Gly Met Leu Ala Gly Trp Lys Phe 100 105 110 agc aac gtc aag gat ggt gtg ttt ggc gag ttt ttt cat gtc aat gac 384 Ser Asn Val Lys Asp Gly Val Phe Gly Glu Phe Phe His Val Asn Asp 115 120 125 gcg gac atg aat ctg gca cac ctg ccg aaa gaa att ccg tta gaa gcg 432 Ala Asp Met Asn Leu Ala His Leu Pro Lys Glu Ile Pro Leu Glu Ala 130 135 140 gcc gtt atg att cct gac atg atg act acg ggc ttt cat ggc gcg gaa 480 Ala Val Met Ile Pro Asp Met Met Thr Thr Gly Phe His Gly Ala Glu 145 150 155 160 tta gcg gac att gaa ctg ggc gct acg gtt gcc gtt ctg ggt atc ggt 528 Leu Ala Asp Ile Glu Leu Gly Ala Thr Val Ala Val Leu Gly Ile Gly 165 170 175 ccg gtg ggc ctg atg gct gta gcc ggt gcc aag ctg cgt ggt gcg ggt 576 Pro Val Gly Leu Met Ala Val Ala Gly Ala Lys Leu Arg Gly Ala Gly 180 185 190 cgc atc att gcg gta ggt tcc cgt cca gtt tgt gtt gat gcc gcg aaa 624 Arg Ile Ile Ala Val Gly Ser Arg Pro Val Cys Val Asp Ala Ala Lys 195 200 205 tac tat ggt gct acc gac atc gta aac tat aaa gac ggt ccg att gaa 672 Tyr Tyr Gly Ala Thr Asp Ile Val Asn Tyr Lys Asp Gly Pro Ile Glu 210 215 220 agt cag att atg aac ctg aca gaa ggc aaa ggc gtt gat gcc gca atc 720 Ser Gln Ile Met Asn Leu Thr Glu Gly Lys Gly Val Asp Ala Ala Ile 225 230 235 240 att gcc ggc ggc aat gca gac atc atg gct aca gcc gta aag atc gtc 768 Ile Ala Gly Gly Asn Ala Asp Ile Met Ala Thr Ala Val Lys Ile Val 245 250 255 aaa cca ggc ggg acc atc gca aac gtc aat tac ttc ggg gag ggt gaa 816 Lys Pro Gly Gly Thr Ile Ala Asn Val Asn Tyr Phe Gly Glu Gly Glu 260 265 270 gtg ctg ccg gtg ccg cgt ctg gaa tgg ggg tgt ggt atg gcg cac aag 864 Val Leu Pro Val Pro Arg Leu Glu Trp Gly Cys Gly Met Ala His Lys 275 280 285 acc atc aaa ggg ggt ctg tgc ccg ggg ggg cgt ctg cgc atg gag cgc 912 Thr Ile Lys Gly Gly Leu Cys Pro Gly Gly Arg Leu Arg Met Glu Arg 290 295 300 ctg att gat ctg gtc ttc tat aaa cgc gtt gat ccg agt aaa tta gtt 960 Leu Ile Asp Leu Val Phe Tyr Lys Arg Val Asp Pro Ser Lys Leu Val 305 310 315 320 acc cat gtg ttc cgc ggg ttc gat aat att gag aaa gct ttc atg tta 1008 Thr His Val Phe Arg Gly Phe Asp Asn Ile Glu Lys Ala Phe Met Leu 325 330 335 atg aaa gat aaa ccg aaa gat tta att aaa cca gtg gtg att tta gca 1056 Met Lys Asp Lys Pro Lys Asp Leu Ile Lys Pro Val Val Ile Leu Ala 340 345 350 tag 1059 <210> 8 <211> 352 <212> PRT <213> Thermoanaerobacter brockii <400> 8 Met Lys Gly Phe Ala Met Leu Ser Ile Gly Lys Val Gly Trp Ile Glu 1 5 10 15 Lys Glu Lys Pro Ala Pro Gly Pro Phe Asp Ala Ile Val Arg Pro Leu 20 25 30 Ala Val Ala Pro Cys Thr Ser Asp Ile His Thr Val Phe Glu Gly Ala 35 40 45 Ile Gly Glu Arg His Asn Met Ile Leu Gly His Glu Ala Val Gly Glu 50 55 60 Val Val Glu Val Gly Ser Glu Val Lys Asp Phe Lys Pro Gly Asp Arg 65 70 75 80 Val Val Val Pro Ala Ile Thr Pro Asp Trp Arg Thr Ser Glu Val Gln 85 90 95 Arg Gly Tyr His Gln His Ser Gly Gly Met Leu Ala Gly Trp Lys Phe 100 105 110 Ser Asn Val Lys Asp Gly Val Phe Gly Glu Phe Phe His Val Asn Asp 115 120 125 Ala Asp Met Asn Leu Ala His Leu Pro Lys Glu Ile Pro Leu Glu Ala 130 135 140 Ala Val Met Ile Pro Asp Met Met Thr Thr Gly Phe His Gly Ala Glu 145 150 155 160 Leu Ala Asp Ile Glu Leu Gly Ala Thr Val Ala Val Leu Gly Ile Gly 165 170 175 Pro Val Gly Leu Met Ala Val Ala Gly Ala Lys Leu Arg Gly Ala Gly 180 185 190 Arg Ile Ile Ala Val Gly Ser Arg Pro Val Cys Val Asp Ala Ala Lys 195 200 205 Tyr Tyr Gly Ala Thr Asp Ile Val Asn Tyr Lys Asp Gly Pro Ile Glu 210 215 220 Ser Gln Ile Met Asn Leu Thr Glu Gly Lys Gly Val Asp Ala Ala Ile 225 230 235 240 Ile Ala Gly Gly Asn Ala Asp Ile Met Ala Thr Ala Val Lys Ile Val 245 250 255 Lys Pro Gly Gly Thr Ile Ala Asn Val Asn Tyr Phe Gly Glu Gly Glu 260 265 270 Val Leu Pro Val Pro Arg Leu Glu Trp Gly Cys Gly Met Ala His Lys 275 280 285 Thr Ile Lys Gly Gly Leu Cys Pro Gly Gly Arg Leu Arg Met Glu Arg 290 295 300 Leu Ile Asp Leu Val Phe Tyr Lys Arg Val Asp Pro Ser Lys Leu Val 305 310 315 320 Thr His Val Phe Arg Gly Phe Asp Asn Ile Glu Lys Ala Phe Met Leu 325 330 335 Met Lys Asp Lys Pro Lys Asp Leu Ile Lys Pro Val Val Ile Leu Ala 340 345 350 <210> 9 <211> 1056 <212> DNA <213> Clostridium beijerinckii <220> <221> CDS <222> (1)..(1056) <400> 9 atg aaa ggg ttt gcc atg tta ggt atc aat aaa ctg ggc tgg att gaa 48 Met Lys Gly Phe Ala Met Leu Gly Ile Asn Lys Leu Gly Trp Ile Glu 1 5 10 15 aaa gag cgc ccg gtg gcg ggt tca tac gat gca att gtt cgt ccg ctg 96 Lys Glu Arg Pro Val Ala Gly Ser Tyr Asp Ala Ile Val Arg Pro Leu 20 25 30 gcc gtc agt ccg tgc acc agc gac atc cat aca gtc ttc gaa ggt gca 144 Ala Val Ser Pro Cys Thr Ser Asp Ile His Thr Val Phe Glu Gly Ala 35 40 45 ctg ggt gat cgg aaa aac atg att ctg ggc cat gaa gcc gta ggc gaa 192 Leu Gly Asp Arg Lys Asn Met Ile Leu Gly His Glu Ala Val Gly Glu 50 55 60 gta gtg gaa gtg ggc agc gag gta aag gat ttc aaa ccg ggc gat cgc 240 Val Val Glu Val Gly Ser Glu Val Lys Asp Phe Lys Pro Gly Asp Arg 65 70 75 80 gta att gtt cct tgc acg acc cca gat tgg cgc tca ctg gaa gtt cag 288 Val Ile Val Pro Cys Thr Thr Pro Asp Trp Arg Ser Leu Glu Val Gln 85 90 95 gct ggt ttt cag cag cat agt aac ggt atg tta gca ggc tgg aag ttt 336 Ala Gly Phe Gln Gln His Ser Asn Gly Met Leu Ala Gly Trp Lys Phe 100 105 110 agc aat ttt aaa gac ggg gtg ttc ggg gag tat ttt cat gtc aac gat 384 Ser Asn Phe Lys Asp Gly Val Phe Gly Glu Tyr Phe His Val Asn Asp 115 120 125 gcg gac atg aat ctg gct att tta cct aaa gat atg ccg ctg gag aac 432 Ala Asp Met Asn Leu Ala Ile Leu Pro Lys Asp Met Pro Leu Glu Asn 130 135 140 gca gtg atg att acc gac atg atg acg aca ggc ttt cac ggt gcc gaa 480 Ala Val Met Ile Thr Asp Met Met Thr Thr Gly Phe His Gly Ala Glu 145 150 155 160 ctg gct gac atc caa atg ggc tcc agt gtg gtg gtt atc ggt att ggt 528 Leu Ala Asp Ile Gln Met Gly Ser Ser Val Val Val Ile Gly Ile Gly 165 170 175 gcg gtc ggg ctg atg ggt atc gcg ggc gcg aaa tta cgg ggc gct ggt 576 Ala Val Gly Leu Met Gly Ile Ala Gly Ala Lys Leu Arg Gly Ala Gly 180 185 190 cgc atc atc ggt gtc ggc agc cgt cca att tgc gtt gaa gca gct aaa 624 Arg Ile Ile Gly Val Gly Ser Arg Pro Ile Cys Val Glu Ala Ala Lys 195 200 205 ttc tat ggt gcc acg gac att ctg aac tat aaa aat ggt cac atc gtc 672 Phe Tyr Gly Ala Thr Asp Ile Leu Asn Tyr Lys Asn Gly His Ile Val 210 215 220 gat cag gtg atg aaa ctg acc aat ggc aaa ggt gtg gac cgc gtg atc 720 Asp Gln Val Met Lys Leu Thr Asn Gly Lys Gly Val Asp Arg Val Ile 225 230 235 240 atg gcg ggc ggc ggc tca gag act tta tct caa gcg gtg tct atg gtt 768 Met Ala Gly Gly Gly Ser Glu Thr Leu Ser Gln Ala Val Ser Met Val 245 250 255 aaa cct ggg ggc atc att tct 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Ala Gly Ser Tyr Asp Ala Ile Val Arg Pro Leu 20 25 30 Ala Val Ser Pro Cys Thr Ser Asp Ile His Thr Val Phe Glu Gly Ala 35 40 45 Leu Gly Asp Arg Lys Asn Met Ile Leu Gly His Glu Ala Val Gly Glu 50 55 60 Val Val Glu Val Gly Ser Glu Val Lys Asp Phe Lys Pro Gly Asp Arg 65 70 75 80 Val Ile Val Pro Cys Thr Thr Pro Asp Trp Arg Ser Leu Glu Val Gln 85 90 95 Ala Gly Phe Gln Gln His Ser Asn Gly Met Leu Ala Gly Trp Lys Phe 100 105 110 Ser Asn Phe Lys Asp Gly Val Phe Gly Glu Tyr Phe His Val Asn Asp 115 120 125 Ala Asp Met Asn Leu Ala Ile Leu Pro Lys Asp Met Pro Leu Glu Asn 130 135 140 Ala Val Met Ile Thr Asp Met Met Thr Thr Gly Phe His Gly Ala Glu 145 150 155 160 Leu Ala Asp Ile Gln Met Gly Ser Ser Val Val Val Ile Gly Ile Gly 165 170 175 Ala Val Gly Leu Met Gly Ile Ala Gly Ala Lys Leu Arg Gly Ala Gly 180 185 190 Arg Ile Ile Gly Val Gly Ser Arg Pro Ile Cys Val Glu Ala Ala Lys 195 200 205 Phe Tyr Gly Ala Thr Asp Ile Leu Asn Tyr Lys Asn Gly His Ile Val 210 215 220 Asp Gln Val Met Lys Leu Thr Asn Gly Lys Gly Val Asp Arg Val Ile 225 230 235 240 Met Ala Gly Gly Gly Ser Glu Thr Leu Ser Gln Ala Val Ser Met Val 245 250 255 Lys Pro Gly Gly Ile Ile Ser Asn Ile Asn Tyr His Gly Ser Gly Asp 260 265 270 Ala Leu Leu Ile Pro Arg Val Glu Trp Gly Cys Gly Met Ala His Lys 275 280 285 Thr Ile Lys Gly Gly Leu Cys Pro Gly Gly Arg Leu Arg Ala Glu Met 290 295 300 Leu Arg Asp Met Val Val Tyr Asn Arg Val Asp Leu Ser Lys Leu Val 305 310 315 320 Thr His Val Tyr His Gly Phe Asp His Ile Glu Glu Ala Leu Leu Leu 325 330 335 Met Lys Asp Lys Pro Lys Asp Leu Ile Lys Ala Val Val Ile Leu 340 345 350 <210> 11 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Ribosome binding site <400> 11 gaaggagata tacat 15 <210> 12 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 12 cgcggtacca tgaaaaattg tgtcatcgtc agtg 34 <210> 13 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 13 ccgcgtcgac ttaattcaac cgttcaatca ccatc 35 <210> 14 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 14 ccgcgtcgac gaaggagata tacatatgaa ctctaaaata attagatttg 50 <210> 15 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 15 cgccccgggc taaacagcca tgggtctaag ttca 34 <210> 16 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 16 cgccccgggg aaggagatat acatatgtta aaggatgaag taattaaac 49 <210> 17 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 17 cgcggatcct tacttaagat aatcatatat aact 34 <210> 18 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 18 ccgcgtcgac gaaggagata tacatatgaa aacaaaattg atgacattac 50 <210> 19 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 19 cgccccgggt cataaatcac cccgttgcgt attc 34 <210> 20 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 20 cgcggtacca tgaaagaagt tgtaatagct agtg 34 <210> 21 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 21 ccgcgtcgac ctagcacttt tctagcaata ttgc 34 <210> 22 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 22 cgcggtacca tgaaaggttt tgcaatgctg tcca 34 <210> 23 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 23 cgctctagac tatgctaaaa tcaccactgg tttaatt 37

Claims (45)

  1. 적절한 탄소 기질의 발효로부터 이소프로판올을 생산하는 생화학 경로를 포함하는 재조합 미생물에 있어서, 상기 생화학 경로는 아세틸-CoA 아세틸전이효소(acetyl-CoA acetyltransferase)를 포함하고, 여기서 상기 미생물은 상응하는 부모 미생물과 비교하여 최소한 하나의 이질성 폴리펩티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  2. 청구항 1에 있어서, 재조합 미생물은 부모 미생물과 비교하여, 아세틸-CoA 아세틸전이효소 활성을 갖는 폴리펩티드의 상승된 발현을 보유하고, 여기서 상기 재조합 미생물은 아세틸-CoA를 포함하는 기질로부터 아세토아세틸-CoA를 포함하는 대사산물을 생산하는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  3. 청구항 2에 있어서, 아세틸-CoA 아세틸전이효소 활성을 갖는 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 30, 66, 68, 또는 66과 68에 열거된 서열에 최소한 약 50% 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩되는 특징으로 하는 재조합 미생물.
  4. 청구항 2에 있어서, 아세틸-CoA 아세틸전이효소 활성을 갖는 폴리펩티드는 atoB 유전자 또는 이의 동족체(homolog), 또는 fadA 유전자 또는 이의 동족체에 의해 인코딩되는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  5. 청구항 4에 있어서, atoB 유전자 또는 fadA 유전자는 에스체리키아(Escherichia) 속으로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  6. 청구항 5에 있어서, 에스체리키아(Escherichia)는 대장균(E. coli)인 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  7. 청구항 1에 있어서, 재조합 대장균(E. coli)인 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  8. 청구항 7에 있어서, 아세틸-CoA 아세틸전이효소 활성을 갖는 폴리펩티드는 SEQ ID NO:32에 열거된 서열에 최소한 약 50% 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩되는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  9. 청구항 7에 있어서, 아세틸-CoA 아세틸전이효소 활성을 갖는 폴리펩티드는 thl 유전자 또는 이의 동족체에 의해 인코딩되는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  10. 청구항 9에 있어서, thl 유전자는 클로스트리듐(Clostridium) 속으로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  11. 청구항 10에 있어서, 클로스트리듐(Clostridium)은 클로스트리듐 아세토부틸리쿰(C. acetobutylicum)인 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  12. 청구항 1에 있어서, 재조합 미생물은 부모 미생물과 비교하여, 아세토아세틸-CoA 전이효소(acetoacetyl-CoA transferase) 활성을 갖는 폴리펩티드의 상승된 발현을 보유하고, 여기서 상기 재조합 미생물은 아세토아세틸-CoA를 포함하는 기질로부터 아세토아세트산염을 포함하는 대사산물을 생산하는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  13. 청구항 12에 있어서, 아세토아세틸-CoA 전이효소는 atoAD 유전자 또는 이의 동족체에 의해 인코딩되는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  14. 청구항 13에 있어서, atoAD는 대장균(E. coli)으로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  15. 청구항 1에 있어서, 재조합 미생물은 부모 미생물과 비교하여, 아세토아세트산염 탈탄소효소(acetoacetate decarboxylase) 활성을 갖는 폴리펩티드의 상승된 발현을 보유하고, 여기서 상기 재조합 미생물은 아세토아세트산염을 포함하는 기질로부터 아세톤을 포함하는 대사산물을 생산하는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  16. 청구항 15에 있어서, 아세토아세트산염 탈탄소효소는 adc 유전자 또는 이의 동족체에 의해 인코딩되는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  17. 청구항 16에 있어서, adc 유전자는 클로스트리듐 아세토부틸리쿰(Clostridium acetobutylicum), 부티리비브리오 피브리솔벤스(Butyrivibrio fibrisolvens), 서모언에로박테리움 서모사카롤리티쿰(Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum), 그리고 클로스트리듐 디피실(Clostridium difficile)로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  18. 청구항 17에 있어서, 클로스트리듐 아세토부틸리쿰(Clostridium acetobutylicum)인 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  19. 청구항 1에 있어서, 재조합 미생물은 부모 미생물과 비교하여, 이차 알코올 탈수소효소 활성(secondary alcohol dehydrogenase activity)을 갖는 폴리펩티드의 상승된 발현을 보유하고, 여기서 상기 재조합 미생물은 아세톤을 포함하는 기질로부터 이소프로판올을 포함하는 대사산물을 생산하는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  20. 청구항 19에 있어서, 이차 알코올 탈수소효소 활성을 갖는 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 7 또는 9 중에서 하나에 열거된 서열에 최소한 약 50% 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩되는 특징으로 하는 재조합 미생물.
  21. 청구항 19에 있어서, 이차 알코올 탈수소효소 활성을 갖는 폴리펩티드는 adh 또는 sadh 유전자 또는 이의 동족체에 의해 인코딩되는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  22. 청구항 21에 있어서, adh 유전자는 서모언에어로박터 브록키(T. brockii) 또는 클로스트리듐 베이어린키(C. beijerinckii)로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  23. 청구항 1에 있어서, 적절한 탄소 기질은 글루코오스를 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  24. 청구항 1에 있어서, 아세틸-coA의 에탄올로의 전환, 피루브산염의 젖산염으로의 전환, 아세틸-coA와 인산염의 coA와 아세틸 인산염으로의 전환, 아세틸-coA와 포름산염의 coA와 피루브산염으로의 전환, 또는 3-메틸-2-옥소부타노에이트(2-옥소이소발레레이트)로 아세틸-CoA의 아세틸 기의 응축을 촉진하는 효소를 인코딩하는 유전자 내에 하나 이상의 결실(deletion) 또는 적중(knockout)을 보유하는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  25. 청구항 1에 있어서, 감소된 에탄올 탈수소효소 활성, 젖산염 탈수소효소 활성, 인산염 아세틸전이효소 활성, 또는 이들의 조합을 더욱 보유하는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  26. 청구항 25에 있어서, 적중 또는 파괴는 adhE, ldhA, 이들의 조합, 이들의 임의의 동족체 또는 자연 발생 변이체로 구성된 군에서 선택되는 결실 또는 파괴를 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  27. 청구항 1에 있어서, 아세틸-CoA 아세틸전이효소, 아세토아세틸-CoA 전이효소, 아세토아세트산염 탈탄소효소 및 adh(이차 알코올 탈수소효소)의 발현 또는 증가된 발현을 보유하는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  28. 적절한 탄소 기질의 발효로부터 이소프로판올을 생산하는 재조합 생화학 경로를 포함하는 재조합 미생물에 있어서, 상기 재조합 생화학 경로는 아세틸-CoA 아세틸전이효소, 아세토아세틸-CoA 전이효소, 아세토아세트산염 탈탄소효소 및 adh(이차 알코올 탈수소효소)의 상승된 발현을 보유하는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  29. 청구항 28에 있어서, 적절한 탄소 기질은 글루코오스를 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  30. 적절한 탄소 기질을 이소프로판올로 전환하는 재조합 미생물을 생산하는 방법에 있어서, 아세틸-CoA 아세틸전이효소, 아세토아세틸-CoA 전이효소, 아세토아세트산염 탈탄소효소 및 adh(이차 알코올 탈수소효소) 활성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드로 미생물을 형질전환시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 재조합 미생물의 생산 방법.
  31. 청구항 30에 있어서, 적절한 탄소 기질은 글루코오스를 포함하는 것을 특징으로 하는, 재조합 미생물의 생산 방법.
  32. 이소프로판올을 생산하는 방법에 있어서, 생물체 내에서, thl 또는 atoB 유전자, ctfAB 또는 atoAD 유전자 또는 오페론, adc 유전자, adh(이차 알코올 탈수소효소) 유전자, 또는 이들의 조합의 과다-발현(over-expression)을 유도하는 단계를 포함하고, 여기서 상기 생물체는 적절한 탄소 기질의 존재에서 배양될 때 이소프로판올을 생산하는 것을 특징으로 하는, 이소프로판올의 생산 방법.
  33. 이소프로판올을 생산하는 방법에 있어서,
    (i) 생물체 내에서 thl 또는 atoB 유전자의 과다-발현을 유도하는 단계;
    (ii) 생물체 내에서 ctfAB 또는 atoAD 유전자의 과다-발현을 유도하는 단계;
    (iii) 생물체 내에서 adc 유전자의 과다-발현을 유도하는 단계;
    (iv) 생물체 내에서 adh 유전자의 과다-발현을 유도하는 단계; 또는
    (v) (i), (ii), (iii), 그리고 (iv)의 과다-발현을 유도하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 이소프로판올의 생산 방법.
  34. 청구항 32 또는 33에 있어서, 적절한 탄소 기질은 글루코오스를 포함하는 것을 특징으로 하는, 이소프로판올의 생산 방법.
  35. (i) 아세토아세틸-CoA를 포함하는 기질로부터 아세토아세트산염의 전환을 촉진하는 첫 번째 폴리펩티드를 인코딩하는 첫 번째 폴리뉴클레오티드;
    (ii) 아세토아세트산염을 포함하는 기질로부터 아세톤의 전환을 촉진하는 두 번째 폴리펩티드를 인코딩하는 두 번째 폴리뉴클레오티드; 그리고
    (iii) 아세톤을 포함하는 기질로부터 이소프로판올의 전환을 촉진하는 세 번째 폴리펩티드를 인코딩하는 세 번째 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터.
  36. 청구항 35에 있어서, 첫 번째 폴리뉴클레오티드는 아세틸-CoA 아세틸 전이효소 또는 아세토아세틸-CoA 전이효소를 인코딩하는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
  37. 청구항 35에 있어서, 두 번째 폴리뉴클레오티드는 아세토아세트산염 탈탄소효소를 인코딩하는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
  38. 청구항 35에 있어서, 세 번째 폴리뉴클레오티드는 이차 알코올 탈수소효소를 인코딩하는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
  39. 청구항 35에 있어서, 벡터는 클로스트리듐 아세토부틸리쿰(C. acetobutylicum) thl(아세틸-CoA 아세틸전이효소), 대장균(E. coli) atoAD(아세토아세틸-CoA 전이효소), 클로스트리듐 아세토부틸리쿰(C. acetobutylicum) adc(아세토아세트산염 탈탄소효소)과 클로스트리듐 베이어린키(C. beijerinckii) adh(이차 알코올 탈수소효소) 유전자 또는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
  40. 청구항 35, 36, 37, 38 또는 39중 어느 한 항에 있어서, 대장균(E. coli) 내로 형질감염되는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
  41. 청구항 35에 있어서, 벡터는 플라스미드인 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
  42. 청구항 35에 있어서, 벡터는 발현 벡터인 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
  43. 청구항 42의 발현 벡터를 포함하는 재조합 숙주 세포.
  44. 청구항 43에 있어서, 이소프로판올을 생산하는 것을 특징으로 하는 재조합 숙주 세포.
  45. 글루코오스의 이소프로판올로의 전환을 촉진하는 최소한 하나의 이질성 핵산 서열을 포함하는 재조합 미생물.












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