CN102796692B - 一种提高丙酮丁醇梭菌在混合糖发酵中糖利用率的方法 - Google Patents

一种提高丙酮丁醇梭菌在混合糖发酵中糖利用率的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种提高丙酮丁醇梭菌在混合糖发酵中糖利用率的方法。该方法包括步骤：对丙酮丁醇梭菌进行基因工程化改造，以相对于野生型丙酮丁醇梭菌而言：抑制glcG基因表达、提高木糖转运蛋白的表达或活力、提高木糖异构酶的表达或活力、和/或提高木酮糖激酶的表达或活力；并将所得的基因工程化丙酮丁醇梭菌用于糖发酵中。本发明可使得丙酮丁醇梭菌在混合糖发酵中能利用更多的木糖和阿拉伯糖，产生更高浓度的溶剂产物，大幅提高产品得率，具有极佳的工业应用前景。

Description

一种提高丙酮丁醇梭菌在混合糖发酵中糖利用率的方法
技术领域
本发明属于基因工程技术和发酵技术领域。具体而言，本发明涉及一种提高丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)在混合糖发酵中糖利用率(尤其是木糖和阿拉伯糖的利用率)的方法、用于该方法中的菌株、其用途及制备方法。
背景技术
丁醇是具有多种用途的大宗基础原料，在染料、油漆、塑料、树脂、橡胶等化学化工领域中，可用作多种有机化合物合成的前体；为抗生素及合成药生产过程中必不可少的溶媒；同时也是食品、香料工业的食品级抽提剂。另一方面，丁醇尚是一种辛烷值高于汽油的优质燃料和燃料添加剂，其高沸点(118℃)和低蒸汽压有助于汽车的冷启动；并且，由于丁醇的疏水性比乙醇更强，其更易于与汽、柴油烃类燃料相混溶；此外，丁醇的完全燃烧性，可大大降低尾气的CO2排放，且不发生残留烃污染，对净化空气十分有利。显然，上述优点有可能使丁醇成为未来发动机的新型绿色燃料，替代矿化燃料成为可持续发展的再生能源之一，在未来的运输燃料结构中将会占有重要的比重。
我国传统的丁醇发酵生产中采用的生产菌丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)是以粮食原料(如玉米、小麦等)为底物的。较高的粮食价格致使原料费用占溶剂生产总成本的比例偏高(75%以上)，这不仅限制了丁醇产品的市场竞争力，也严重违背了我国的粮食安全战略。因此，就长远而言，以非粮原料，尤其是廉价的木质纤维素资源(如秸秆、稻草等)通过生物转化制造丁醇是今后发展的必然趋势。
丙酮丁醇梭菌除了能够利用葡萄糖、蔗糖、淀粉外，还能利用木糖、乳糖、阿拉伯糖等多种碳源。农林废弃物(秸秆、稻草等)中的纤维素和半纤维素水解后的主要成分是葡萄糖、木糖及阿拉伯糖，丙酮丁醇梭菌宽泛的底物谱使得该菌可以利用纤维素、半纤维素水解液为原料进行生物丁醇的发酵。纤维素和半纤维素在自然界中占到植物界碳素的50%以上，利用纤维素和半纤维素水解液进行生物丁醇发酵，有望大大降低原料成本。
然而，丙酮丁醇梭菌与很多其它细菌一样存在着糖代谢物阻遏效应(carboncatabolite repression，CCR)，即在葡萄糖存在时，几乎不利用木糖和阿拉伯糖。此外，丙酮丁醇梭菌木糖代谢本身也存在瓶颈。鉴于此，提高丙酮丁醇梭菌在混合糖中木糖和阿拉伯糖利用率需要克服两个问题，一是葡萄糖存在时对木糖、阿拉伯糖代谢的阻遏，二是木糖代谢自身存在的瓶颈。
PTS系统(磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶系统，phosphoenolpyruvate-carbohydrate phosphotransferase system)是产溶剂梭菌转运六碳糖的主要系统，它转运碳水化合物进入胞内的同时伴随底物的磷酸化。典型的PTS系统包含磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)、HPr(组氨酸-可磷酸化蛋白，histidine-phosphorylatableprotein)和三个催化实体，分别是酶I、酶II和酶III。酶II组分的Glc(葡萄糖-葡糖苷，glucose-glucoside)蛋白或Man(甘露糖-果糖-山梨糖，mannose-fructose-sorbose)蛋白可调节葡萄糖PTS的活性，在丙酮丁醇梭菌中已证明是Glc家族蛋白对葡萄糖的磷酸化起关键作用，其中的基因glcG已在生物信息学水平被预测。
然而，研究者在针对多种细菌(例如枯草杆菌、大肠杆菌、链霉菌)的研究中发现敲除PTS系统都会导致葡萄糖利用延迟甚至不用，进而降低葡萄糖的生产效率和转化率，因此认为该系统并不适于用作改造靶点(Eiteman,M.A.,S.A.Lee等(2008).J Biol Eng2:3.；Paulsen，I.T.，S.Chauvaux，等(1998).J Bacteriol180(3):498-504.；Perez-Redondo,R.，I.Santamarta等(2010)，Microbiology 156(Pt 5):31527-1537.)。
微生物中经由木糖异构酶催化的木糖代谢主要包括：1)木糖通过转运蛋白(xylT)从胞外向胞内运输；2)胞内木糖通过两步(木糖异构酶(xylA)和木酮糖激酶(xylB))催化反应生成5-磷酸-木酮糖；3)5-磷酸-木酮糖进入磷酸戊糖途径(pentose phosphate pathway)进行代谢，这之中又包括4个关键酶：转醛酶、转酮酶、5-磷酸-核糖异构酶以及5-磷酸-核酮糖差向异构酶，最后的代谢流则进入糖酵解途径(参见图8)。
细菌通常经历如上所述的过程将木糖催化成3-磷酸甘油醛进入中心代谢，催化这些步骤反应的酶分别是xylT、xylA、xylB和PPP途径的Tal、Tkt、Rpe和Rpi。过表达木糖代谢全部基因以提高木糖利用率的策略虽然在其它微生物中有报道(Karhumaa，K.，B.Hahn-Hagerdal，et al.(2005).Yeast 22(5):359-368；Zhang，M.，C.Eddy等(1995).Science 267(5195):240-243.)，但在丙酮丁醇梭菌中同时表达这么多基因目前在技术上是无法实现的，因此必须确认木糖途径中真正的限速基因，减少过表达基因的数量，这项工作具有一定的挑战性(Nakotte,S.，S.Schaffer等(1998).Appl  Microbiol Biotechnol 50(5):564-567；Shao,L.,S.Hu等(2007).Cell Research 17(11):963-965.)。
并且，根据阿拉伯糖的代谢途径(参见图8)，其经阿拉伯糖转运蛋白转运至胞内代谢为5-磷酸-核酮糖可进一步转化为5-磷酸-木酮糖，并由此进入磷酸戊糖途径。虽然我们的研究工作表明xylT(cac1345）是木糖的转运蛋白(Gu,Y.,Y.Ding等(2010).BMC Genomics 11(1):255.)，但也有研究表明它也是阿拉伯糖的转运蛋白(Servinsky,M.D.，J.T.Kiel等(2010).Microbiology 156(Pt 11):3478-3491)。因此，提高木糖的转化利用率可能进一步促进阿拉伯糖的利用率。
综上所述，本领域中迫切需要开发出一种提高丙酮丁醇梭菌在混合糖发酵中的木糖和阿拉伯糖利用率的方法以及可实现该方法的菌株，从而有利于其发酵产物(如丁醇)的工业化生产和应用。
发明内容
本发明的一方面的重要目的是提供一种提高丙酮丁醇梭菌对木糖和/或阿拉伯糖利用率的方法，从而能高效利用原料中的葡萄糖、木糖和/或阿拉伯糖发酵生产丁醇、丙酮和乙醇。本发明的方法，可通过抑制丙酮丁醇梭菌glcG基因表达、增加木糖转运蛋白、木糖异构酶和木酮糖激酶的表达或活力提高木糖和/或阿拉伯糖的利用率。
本发明的另一重要目的在于提供一种具有提高的木糖和/或阿拉伯糖利用率的丙酮丁醇梭菌。本发明的另一目的在于提供本发明方法或菌株在丁醇、丙酮和/或乙醇生产中的用途。本发明的又一目的在于提供一种制备本发明菌株的方法。
在本发明的第一方面中，提供了一种提高丙酮丁醇梭菌对木糖和/或阿拉伯糖的利用率的方法，所述方法包括步骤：
(a)对丙酮丁醇梭菌进行基因工程化改造，以相对于野生型丙酮丁醇梭菌而言：抑制glcG基因表达、提高木糖转运蛋白的表达或活力、提高木糖异构酶的表达或活力、和/或提高木酮糖激酶的表达或活力；
(b)将步骤(a)中所得的基因工程化丙酮丁醇梭菌用于含木糖和/或阿拉伯糖的原料的发酵中。
在本发明的优选例中，与野生型丙酮丁醇梭相比，所述基因工程化丙酮丁醇梭对木糖的利用率至少提高了20%，例如30%，40%，50%，60%，70%，80%，90%，100%，200%，300%，400%，500%或它们之间的任意区间，优选50～500%，优选55～400%，更优选60～300%。
在本发明的优选例中，与野生型丙酮丁醇梭相比，所述基因工程化丙酮丁醇梭发酵生产产物丙酮、丁醇、乙醇的产率至少提高了10%，例如20%，30%，50%，80%，100%，200%，300%，400%，500%或它们之间的任意区间，优选10～500%，优选20～400%，更优选50～400%。
在本发明的一个实施方式中，所述丙酮丁醇梭菌选自：ATCC 824；EA 2018；或其它可产丁醇、丙酮和乙醇的丙酮丁醇梭菌。
在一个优选例中，所述丙酮丁醇梭菌为ATCC 824。
在本发明的另一个实施方式中，所述抑制glcG基因表达是通过选自下组的一种或多种方式实现的：在glcG基因中插入DNA片段、部分或全部敲除glcG基因、引入反义核酸或干扰核酸、引入glcG抑制物；所述提高木糖转运蛋白、木糖异构酶和/或木酮糖激酶的表达或活力是通过选自下组的一种或多种方式实现的：在丙酮丁醇梭菌基因组中导入额外的木糖转运蛋白、木糖异构酶和/或木酮糖激酶基因；引入提高木糖转运蛋白、木糖异构酶和/或木酮糖激酶的表达或活力的突变；或提供瞬时表达木糖转运蛋白、木糖异构酶和/或木酮糖激酶的表达载体。
在一个优选例中，在glcG基因中插入DNA片段是通过二类内含子插入技术在glcG基因内部的任何位点插入DNA(例如glcG-targetron)、或通过同源重组在glcG基因的任意位点插入DNA序列实现的。
在一个实施方式中，所述抑制glcG基因表达是通过以下方式实现的：在glcG基因第1位到第1923位碱基之间插入外源DNA片段。优选地，在glcG基因第1位到第1761位碱基之间，或第1位到1554位碱基之间，或第1位到1248位碱基之间，或第1位到270位之间，或269位到270位之间插入外源DNA片段。
在另一个优选例中，所述基因工程化丙酮丁醇梭菌的glcG基因表达受抑制、木糖转运蛋白过表达、木糖异构酶过表达、和/或木酮糖激酶过表达。
在另一个优选例中，所述glcG基因表达受抑制包括：不表达glcG、glcG表达量下降、无法表达具有完整结构和/或功能的glcG。
在本发明的另一个实施方式中，所述木糖转运蛋白是来自于可利用木糖的生物体的、用于木糖转运的蛋白或其生物活性片段，或是所述蛋白或其生物活性片段经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成仍具有转运木糖功能的氨基酸序列；所述木糖异构酶是来自于可利用木糖的生物体的、用于催化木糖发生异构的酶或其生物活性片段，或是所述蛋白或其生物活性片段经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成仍具有催化木糖发生异构功能的氨基酸序列；所述木酮糖激酶是来自于可利用木糖的生物体的、用于催化木酮糖磷酸化的酶或其生物活性片段，或是所述蛋白或其生物活性片段经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成仍具有催化木酮糖磷酸化功能的氨基酸序列。
在本发明的另一个实施方式中，所述生物体选自：丙酮丁醇梭菌、大肠杆菌、农杆菌、假单胞菌、醋杆菌、葡糖杆菌、根瘤菌、黄单孢菌、克雷白氏杆菌、埃希氏菌、红细菌、黄杆菌或沙门氏菌。
在本发明的另一个实施方式中，所述木糖转运蛋白由xylT基因编码；木糖异构酶由xylA基因编码；木酮糖激酶由xylB基因编码。在一个优选例中，所述xylT基因选自：CA_C1345、CEA_G1359或在严格条件下与所述序列杂交的分子、或与上述分子具有90%以上同源性的分子；所述xylB基因选自：CA_C2612、CEA_G2621或在严格条件下与所述序列杂交的分子、或与上述分子具有90%以上同源性的分子；所述xylA基因选自：CA_C2610、CEA_G2619或在严格条件下与所述序列杂交的分子、或与上述分子具有90%以上同源性的分子。
在另一个优选例中，与野生型丙酮丁醇梭菌比较，基因工程化改造的丙酮丁醇梭菌的glcG基因表达被抑制了20~100%，优选35~100%，优选50~100%，更优选75～100%；糖转运蛋白的表达或活力提高了50~200%，更优选75～150%；木糖异构酶的表达或活力至少提高了20%，例如30%，50%，80%，100%，200%，300%，400%，500%，1000%或它们之间的任意区间，优选20～1000%，优选50～500%，更优选75～500%；和/或木酮糖激酶的表达或活力提高了至少提高了20%，例如30%，50%，80%，100%，200%，300%，400%，500%，1000%或它们之间的任意区间，优选20～1000%，优选50～500%，更优选75～500%。
在本发明的另一个实施方式中，所述基因工程化丙酮丁醇梭菌以选自下组的一种或多种质粒转化：pWJ1-glcG、pIMP1-th1-xylT、pIMP1-th1-xylA、pIMP1-th1-xylB、pIMP1-th1-xylT-th1-xylBA、pIMP1-th1-xylT-th1-xylA、pIMP1-th1-xylT-th1-xylB、pIMP1-th1-xylBA或pIMP1-th1-xylT-th1。在另一优选例中，可采用任何对葡萄糖不敏感的启动子替代上述质粒中的th1启动子来构建质粒，优选ptb、adc启动子。
在一个优选例中，所述基因工程化丙酮丁醇梭菌选自：丙酮丁醇梭菌(pIMP1-thl-xylT)、丙酮丁醇梭菌(pIMP1-thl-xylA)、丙酮丁醇梭菌(pIMP1-thl-xylB)、丙酮丁醇梭菌(pIMP1-thl-xylBA)、和丙酮丁醇梭菌(pIMP1-thl-xylT-thl-xylBA)、丙酮丁醇梭菌glcG、丙酮丁醇梭菌glcG(pIMP1-thl)、丙酮丁醇梭菌glcG(pIMP1-thl-xylT)、丙酮丁醇梭菌glcG(pIMP1-thl-xylA)、丙酮丁醇梭菌glcG(pIMP1-thl-xylB)、和丙酮丁醇梭菌glcG(pIMP1-thl-xylT-thl-xylBA)。在另一优选例中，可采用任何对葡萄糖不敏感的启动子替代上述质粒中的th1启动子来构建质粒，并用该质粒制备基因工程化菌，优选ptb、adc启动子。
在本发明的另一个实施方式中，所述包含木糖和/或阿拉伯糖的原料选自：纤维素或半纤维素的水解液、粮食、棉花等。
在一个优选例中，所述纤维素或半纤维素获自农林废弃物，优选秸秆、稻草等非粮原料。
在另一个优选例中，所述纤维素或半纤维素的水解是通过化学法水解或生物酶水解的方法进行的。
在另一个优选例中，所述原料中还包含葡萄糖，优选包含葡萄糖-木糖-阿拉伯糖、葡萄糖-木糖。
在另一个优选例中，所述原料中还包含葡萄糖，优选包含葡萄糖-木糖-阿拉伯糖、葡萄糖-木糖，其中木糖的含量不低于原料中总糖量的5%（优选6%，8%，10%）
在本发明的第二方面中，提供了一种基因工程化丙酮丁醇梭菌，其与野生型丙酮丁醇梭菌相比，具有选自下组的一种或多种特征：glcG基因表达受抑制或glcG蛋白活力受抑制、木糖转运蛋白过表达或活力提高、木糖异构酶过表达或活力提高、和/或木酮糖激酶过表达或活力提高。
在本发明的一个实施方式中，所述基因工程化丙酮丁醇梭菌通过选自下组的一种或多种的基因工程化处理获得的：在glcG基因中插入DNA片段、部分或全部敲除glcG基因、引入针对glcG基因的反义核酸或干扰核酸、引入glcG抑制物；导入额外的木糖转运蛋白、木糖异构酶和/或木酮糖激酶基因；引入提高木糖转运蛋白、木糖异构酶和/或木酮糖激酶的表达或活力的突变；或提供瞬时表达木糖转运蛋白、木糖异构酶和/或木酮糖激酶的表达载体。
在另一个优选例中，在glcG基因中插入DNA片段是通过二类内含子插入技术在glcG基因内部的任何位点插入DNA、或通过同源重组在glcG基因的任意位点插入DNA序列实现的。
在一个实施方式中，所述抑制glcG基因表达是通过以下方式实现的：在glcG基因第1位到第1923位碱基之间插入外源DNA片段。优选地，在glcG基因第1位到第1761位碱基之间，或第1位到1554位碱基之间，或第1位到1248位碱基之间，或第1位到270位之间，或269位到270位之间插入外源DNA片段。
在本发明的另一个实施方式中，所述基因工程化丙酮丁醇梭菌是基于选自下组的丙酮丁醇梭菌构建的：ATCC 824或EA2018，应理解本领域普通技术人员可采用已知的任何丙酮丁醇梭菌。在一个优选例中，所述丙酮丁醇梭菌为ATCC 824。
在本发明的另一个实施方式中，所述木糖转运蛋白是来自于可利用木糖的生物体的、用于木糖转运的蛋白或其生物活性片段，或是所述蛋白或其生物活性片段经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成仍具有转运木糖功能的氨基酸序列；所述木糖异构酶是来自于可利用木糖的生物体的、用于催化木糖发生异构的酶或其生物活性片段，或是所述蛋白或其生物活性片段经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成仍具有催化木糖发生异构功能的氨基酸序列；所述木酮糖激酶是来自于可利用木糖的生物体的、用于催化木酮糖磷酸化的酶或其生物活性片段，或是所述蛋白或其生物活性片段经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成仍具有催化木酮糖磷酸化功能的氨基酸序列。
在本发明的另一个实施方式中，所述生物体选自：丙酮丁醇梭菌、大肠杆菌、农杆菌、假单胞菌、醋杆菌、葡糖杆菌、根瘤菌、黄单孢菌、克雷白氏杆菌、埃希氏菌、红细菌、黄杆菌或沙门氏菌。
在本发明的另一个实施方式中，所述木糖转运蛋白由xylT基因编码；木糖异构酶由xylA基因编码；木酮糖激酶由xylB基因编码。在一个优选例中，所述xylT基因选自：CA_C1345、CEA_G1359或在严格条件下与所述序列杂交的分子、或与上述分子具有90%以上同源性的分子；所述xylB基因选自：CA_C2612、CEA_G2621或在严格条件下与所述序列杂交的分子、或与上述分子具有90%以上同源性的分子；所述xylA基因选自：CA_C2610、CEA_G2619或在严格条件下与所述序列杂交的分子、或与上述分子具有90%以上同源性的分子。
在另一个优选例中，所述基因工程化丙酮丁醇梭菌以选自下组的一种或多种质粒转化：pWJ1-glcG、pIMP1-th1-xylT、pIMP1-th1-xylA、pIMP1-th1-xylB、pIMP1-th1-xylT-th1-xylBA、pIMP1-th1-xylT-th1-xylA、pIMP1-th1-xylT-th1-xylB、pIMP1-th1-xylBA或pIMP1-th1-xylT-th1。在另一优选例中，可采用任何对葡萄糖不敏感的启动子替代上述质粒中的th1启动子来构建质粒，优选ptb、adc启动子。
在一个优选例中，所述基因工程化丙酮丁醇梭菌选自：丙酮丁醇梭菌(pIMP1-thl-xylT)、丙酮丁醇梭菌(pIMP1-thl-xylA)、丙酮丁醇梭菌(pIMP1-thl-xylB)、丙酮丁醇梭菌(pIMP1-thl-xylBA)、和丙酮丁醇梭菌(pIMP1-thl-xylT-thl-xylBA)、丙酮丁醇梭菌glcG、丙酮丁醇梭菌glcG(pIMP1-thl)、丙酮丁醇梭菌glcG(pIMP1-thl-xylT)、丙酮丁醇梭菌glcG(pIMP1-thl-xylA)、丙酮丁醇梭菌glcG(pIMP1-thl-xylB)、和丙酮丁醇梭菌glcG(pIMP1-thl-xylT-thl-xylBA)。在另一优选例中，可采用任何对葡萄糖不敏感的启动子替代上述质粒中的th1启动子来构建质粒，并用该质粒制备基因工程化菌，优选ptb、adc启动子。
在本发明的第三方面中，提供了本发明的方法、或本发明的基因工程化丙酮丁醇梭菌在丁醇、丙酮和/或乙醇的生产中的用途。
在一个优选例中，所述生产是发酵生产，用于发酵的原料包含葡萄糖、木糖、阿拉伯糖中的一种或多种，优选包含葡萄糖-木糖-阿拉伯糖、葡萄糖-木糖。
在另一个优选例中，用于发酵的原料获自：纤维素或半纤维素的水解液、粮食，优选所述纤维素或半纤维素获自农林废弃物，更优选秸秆、稻草等非粮原料。
在另一个优选例中，所述纤维素或半纤维素的水解是通过化学法水解或生物酶水解的方法进行的。
在本发明的第四方面中，提供了一种制备本发明方法中所用的基因工程化丙酮丁醇梭菌、或本发明上述基因工程化丙酮丁醇梭菌的方法，所述方法包括对丙酮丁醇梭菌进行选自下组的一种或多种基因工程化改造：在glcG基因中插入DNA片段、部分或全部敲除glcG基因、引入针对glcG基因的反义核酸或干扰核酸、引入glcG抑制物；引入提高木糖转运蛋白、木糖异构酶和/或木酮糖激酶的表达或活力的突变；导入额外的木糖转运蛋白、木糖异构酶和/或木酮糖激酶基因；或提供瞬时表达木糖转运蛋白、木糖异构酶和/或木酮糖激酶的表达载体。
在另一个优选例中，在glcG基因中插入DNA片段是通过二类内含子插入技术在glcG基因内部的任何位点插入DNA、或通过同源重组在glcG基因的任意位点插入DNA序列实现的。
在另一个优选例中，所述方法还包括对所得基因工程化丙酮丁醇梭菌进行扩大培养和/或保存。
与采用野生型丙酮丁醇梭菌的常规方法比较，采用本发明的方法或采用本发明所提供的基因工程化丙酮丁醇梭菌，可使得丙酮丁醇梭菌在发酵中对木糖和/或阿拉伯糖利用率提高20～200%，优选25～150%。
与采用野生型丙酮丁醇梭菌的常规方法比较，采用本发明的方法或采用本发明所提供的基因工程化丙酮丁醇梭菌，可使得丙酮丁醇梭菌在含有木糖/阿拉伯糖的物料发酵中生产产物丙酮、丁醇、乙醇的产率至少提高10%，例如20～500%，优选10～500%，优选20～400%，更优选50～400%。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1A所示为4%葡萄糖:2%阿拉伯糖P2发酵0-89hr的丙酮丁醇梭菌ATCC824glcG和丙酮丁醇梭菌ATCC824的残糖含量检测结果；图1B所示为4%葡萄糖:2%木糖P2发酵0-89hr的丙酮丁醇梭菌ATCC824glcG和丙酮丁醇梭菌ATCC824的残糖含量检测结果。
图2所示为glcG中断菌株的菌落PCR鉴定的凝胶电泳检测结果，其中，NC表示未加模板的阴性对照，WT所用的模板为丙酮丁醇梭菌ATCC824基因组，glcG突变体的模板分别为转化子824glcG1-5，分子量标记为1kb DNA梯度。
图3所示为4%葡萄糖：2%木糖P2发酵96hr的丙酮丁醇梭菌ATCC824、824glcG、824glcG-thl、824glcG-xylT、824glcG-xylA、824glcG-xylB和824glcG-TBA葡萄糖、木糖消耗量的检测结果。
图4所示为梭菌质粒PCR鉴定824glcG中导入pIMP 1-thl-xylT-thl-xylBA的检测结果，其中，A、B表示不同位置的两对鉴定引物，“－”表示以水为模板扩增的阴性对照，“＋”表示以构建的质粒为模板扩增的阳性对照，1～6表示不同菌株抽提的质粒，6号为阳性。
图5所示为3.8%葡萄糖:1.4%木糖:0.3%阿拉伯糖发酵824和824glcG-TBA的残糖含量检测结果。
图6所示为3.8%葡萄糖:1.4%木糖:0.3%阿拉伯糖发酵824和824glcG-TBA的丁醇和ABE的检测结果。
图7所示为1.5%阿拉伯糖和1.5%木糖发酵824的残糖含量检测结果。
图8所示为细菌阿拉伯糖和木糖代谢的示意图。
图9所示为4%葡萄糖：2%木糖发酵824和824-xylBA的残糖含量检测结果。
图10所示为4%葡萄糖：2%木糖发酵824和824-xylT的残糖含量检测结果。
图11所示为4%葡萄糖：2%木糖发酵2018、2018glcG和2018glcG-TBA 96hr的葡萄糖、木糖消耗量的检测结果。
图12所示为4%葡萄糖：2%木糖发酵2018、2018glcG和2018glcG-TBA 96hr的溶剂检测结果。
具体实施方式
本发明人经过长期而深入的研究，开发出了一种提高丙酮丁醇梭菌发酵过程中的木糖和/或阿拉伯糖利用率的方法，从而能高效利用原料(如纤维素或半纤维素水解液)中的葡萄糖、木糖和/或阿拉伯糖单独或共发酵生产丁醇、丙酮和乙醇。本发明的方法主要通过抑制丙酮丁醇梭菌glcG基因表达和增加木糖转运蛋白、木糖异构酶和木酮糖激酶的表达实现。例如，在本发明的一个优选实施方式中，通过在丙酮丁醇梭菌glcG基因中插入DNA片段和导入pIMP1-thl-xylT-thl-xylBA可实现本发明。
本发明人还进一步提供了用于上述方法的丙酮丁醇梭菌重组菌株，其中丙酮丁醇梭菌glcG基因表达被抑制、xylT基因过表达、xylA基因过表达和/或xylB基因过表达。例如，在本发明的一个优选实施方式，本发明提供的重组菌株的基因组中的glcG基因已插入DNA片段从而导致其表达被抑制，并且该菌株还过表达的xylT基因、xylA基因和xylB基因。
具体而言，现有技术中在许多微生物(如枯草、大肠、链霉菌)中发现敲除PTS系统都会导致葡萄糖利用延迟甚至不用，故认为该靶点不是理想的改造靶点。然而，发明人在本研究中通过敲除glcG虽然使得发酵前期葡萄糖利用速率有所降低，但是葡萄糖的发酵周期并未延迟(例如参见图1A和1B)，即并不以牺牲葡萄糖的利用来换取木糖、阿拉伯糖等次级碳源的利用。并且，发明人进一步研究发现，葡萄糖利用没有延迟的原因是葡萄糖非PTS系统的激活补偿了葡萄糖转运以及后续磷酸化。发明人在丙酮丁醇梭菌中所发现的这一独特现象使得glcG基因成为消除该微生物葡萄糖抑制效应的重要改造靶点。
并且，细菌将木糖转化成3-磷酸甘油醛进入中心代谢需经过多个步骤、多种酶的催化。虽然过表达木糖途径全部基因以提高木糖利用率的策略在其它微生物中有所报道，但在丙酮丁醇梭菌中同时表达这么多基因目前在技术上是无法实现的，因此必须确认木糖途径中真正的限速基因，减少过表达基因的数量，这项工作具有一定的挑战性。本发明人通过研究发现木糖代谢瓶颈在于xylT、xylA和xylB催化的三步反应。分别过表达和同时过表达这三个基因，确实提高了菌体在混合糖发酵中的木糖利用率。该项研究结果使得在丙酮丁醇梭菌中强化木糖代谢途径的策略成为可能，对工程菌的构建具有重要指导意义。
本发明的方法和菌株可用于高效利用葡萄糖-木糖-阿拉伯糖混合糖发酵生产丁醇、丙酮和乙醇的应用，具有广阔的工业应用和市场前景。
如本文所用，术语“丙酮丁醇梭菌”是指一种革兰染色阳性、细胞呈梭状、且能产生丙酮和丁醇等物质的芽孢杆菌。此类细菌能分解蛋白质和糖类，并在淀粉质及糖质原料发酵中产生大量的丙酮、丁醇和乙醇等溶剂，是重要的工业发酵菌种。本领域中有许多文献对此类细菌的种属和功能有所描述，例如Keis,S.等，Int.J.Syst.Bacteriol.,45,693,1995；Keis,S.等，Int.J.Syst.Evol.Microbiol.,51,2095,2001.等。虽然本申请的实施例部分以ATCC 824和EA2018为例对本发明进行了详细说明，但应理解在本发明中可采用任何符合上述定义的丙酮丁醇梭菌，而不限于实施例。
如本文所用，术语“产率”是指生成物的产量比投入原料量的百分比。在本文中，指乙醇、丁醇和/或丙酮的生成量比原料中投入总糖的量的百分比，其中总糖指原料中包含的所有的糖，包括但不限于原料中的葡萄糖、木糖、和/或阿拉伯糖。
如本文所用，术语“利用率”是指丙酮丁醇梭菌消耗的原料的量比投入原料的量的百分比。
如本文所用，术语“提高产率”，或“提高利用率”是相对野生型菌株而言，具体是指比野生型菌株具有更高的产率或更高的利用率。
glcG基因的表达抑制或蛋白活性的抑制
本发明中所指的“抑制丙酮丁醇梭菌glcG基因表达”，既可以是降低丙酮丁醇梭菌glcG基因表达量，也可以是使丙酮丁醇梭菌glcG基因不表达或不能表达出正确的蛋白质。本领域中已知glcG基因的序列(CA_C(0570))，它编码PTS酶II，含A、B、C三个催化亚基，本发明中也包含了这三个催化亚基中任一缺失或受抑制从而引起的对glcG整体表达和活力的抑制。
实现上述目的的方法在本领域中为一般技术人员所熟知(例如但不限于Shao，L.，S.Hu等(2007).Cell Research 17(11):963-965；Sambrook等人《分子克隆：实验室指南》(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989))，在此不具体描述。例如，根据本发明的一个优选实施例，通过中断丙酮丁醇梭菌glcG基因表达，能提高丙酮丁醇梭菌对木糖和/或阿拉伯糖的利用率。在本发明的另一个优选实施例中，所提供的丙酮丁醇梭菌重组菌株的基因组中glcG基因表达被抑制，不能表达出具有完整结构的glcG蛋白。
根据本发明，丙酮丁醇梭菌glcG基因的中断，可采用二类内含子插入技术在该基因内部的任何位点插入DNA(例如内含子或大小不超过1kb的抗性基因，如pIMP1载体骨架上的红霉素抗性基因)实现；也可通过同源重组中断glcG基因，用于中断glcG基因的插入片段可在glcG基因中的任意位点插入，只需要能使glcG基因表达被中断或抑制即可；还可以通过同源重组敲除glcG部分或全部序列实现，只要能使得glcG基因的表达被中断或被抑制或表达出不完整glcG蛋白即可。上述方法可用于将glcG基因失活。
此外，对于丙酮丁醇梭菌的glcG蛋白结构预测显示，该蛋白质包含A、B、C三个催化亚基，其中第1位到第416位氨基酸(对应第1位到第1248位碱基)是第一个催化亚基C，第417位到518位氨基酸(对应第1249位到第1554位碱基)是第二催化亚基B，第519位到第641位氨基酸(对应第1555位到第1923位碱基)是第三催化亚基C。位于glcG蛋白第二催化亚基的第437位的半胱氨酸和位于glcG蛋白第三催化亚基的第587位的组氨酸是关键的保守位点(Martin Tangney,Wilfrid J.Mitchell.(2007).Appl Microbiol Biotechnol(74):398-405.)。因此，在本发明的优选实施方式中，在glcG基因的第1-1923位碱基插入外源DNA片段。在本发明的另一优选实施方式中，在第1位到第1761位碱基之间插入外源DNA片段，或在第1和第1554位之间插入外源DNA片段，或在第1和第1248位之间插入外源DNA片段，或在第1和第270位之间插入外源DNA片段。在本发明的一个具体实施方式中，在glcG基因的第269/270位之间插入DNA片段。
除此之外，还可以采用反义核酸技术等本领域常规用于抑制特定基因表达的方法来抑制glcG基因的表达，将glcG表达量下调。实现上述目的的方法在本领域中为一般技术人员所熟知(例如但不限于Tummala,S.B.,N.E.Welker等(2003).J Bacteriol 185(6):1923-1934；Sambrook等人《分子克隆：实验室指南》(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989))，因此在此不具体描述。
“重组敲除质粒载体”指的是用于敲除glcG基因的重组质粒载体，该载体应理解为具有与glcG基因的特定序列进行特异配对位点的重组质粒载体，在上述重组质粒载体中包括用于对glcG基因进行特异性敲除的片段。
本发明的优选实施例中，所使用的重组敲除质粒载体pWJ1-glcG指的是：基于大肠杆菌和丙酮丁醇梭菌穿梭质粒pWJ1(其在丙酮丁醇梭菌中表达红霉素抗性基因，序列如SEQ ID NO.：1所示)构建的，用于敲除glcG基因的重组质粒载体。在该载体中，使用的glcG-targetron片段指的是在IBS，EBS2，EBS 1d位点碱基经修改后，用于敲除glcG基因的片段，该片段属于L1.LtrB内含子一部分，所述的L1.LtrB二类内含子为原核二类内含子，其中包含ltrA基因。然而，本领域普通技术人员在实践本发明的方法时，可以选取其它插入位点进行试验，甚至还可以不使用重组质粒载体进行试验，只要能在glcG基因中插入核酸片段以中断glcG基因的表达即可。
应理解，除了可从基因水平对glcG基因的表达进行抑制以外，为了实现本发明的目的，还可对glcG蛋白的活性进行抑制。
xylT、xylA、xylB基因表达或蛋白活力的上调
根据本发明，“提高基因表达”、“基因表达上调”或“过表达”既可以是提高目的基因(即xylT、xylA和/或xylB基因)的表达量，也可以是使目的基因表达出活力提高的目的蛋白。
实现上述目的的方法在本领域中为一般技术人员所熟知(例如但不限于Sillers,R.，M.A.Al-Hinai,et al.(2009).Biotechnology and Bioengineering 102(1):38-49；Sambrook等人《分子克隆：实验室指南》(New York：Cold Spring HarborLaboratory Press，1989))，在此不具体描述。
例如，可在丙酮丁醇梭菌基因组中导入额外的(如一或多个拷贝)木糖转运蛋白、木糖异构酶和/或木酮糖激酶基因；引入提高木糖转运蛋白、木糖异构酶和/或木酮糖激酶的表达或活力的突变；或提供瞬时表达木糖转运蛋白、木糖异构酶和/或木酮糖激酶的表达载体。
如本文所用，术语“木糖转运蛋白”是指来自于可利用木糖的任何生物体(尤其是菌类)中可用于木糖转运的蛋白或其生物活性片段，所述生物体可为例如(但不限于)：丙酮丁醇梭菌、大肠杆菌、农杆菌、假单胞菌、醋杆菌、葡糖杆菌、根瘤菌、黄单孢菌、克雷白氏杆菌、埃希氏菌、红细菌、黄杆菌、沙门氏菌等。关于木糖转运蛋白及其编码序列的描述可参见例如：Jojima,T.等(2010).Appl Microbiol Biotechnol 85(3):471-480；Sumiya,M.等1995.ReceptorsChannels 3:117-28；Henderson,P.J.1990.J Bioenerg Biomembr 22:525-69；Leandro,M.J.等2006.Biochem J 395:543-9；Saloheimo,A.等2007.Appl MicrobiolBiotechnol 74:1041-52；Weierstall,T.等1999.Mol Microbiol 31:871-83；Tarr,P.T.等2009.Biochim Biophys Acta 1791:584-93；Davis,E.O.等1987.J Biol Chem262:13928-32；Schneider,E.2001.Res Microbiol 152:303-10。
如本文所用，术语“木糖异构酶”是指来自于可利用木糖的任何生物体(尤其是菌类)中用于催化木糖发生异构的酶或其生物活性片段，所述生物体可为例如(但不限于)：丙酮丁醇梭菌、大肠杆菌、农杆菌、假单胞菌、醋杆菌、葡糖杆菌、根瘤菌、黄单孢菌、克雷白氏杆菌、埃希氏菌、红细菌、黄杆菌、沙门氏菌等。关于木糖异构酶及其编码序列的描述可参见例如：CN102037120A(尤其是其中的表1)。
如本文所用，术语“木酮糖激酶”是指来自于可利用木糖的任何生物体(尤其是菌类)中用于催化木酮糖磷酸化的酶或其生物活性片段，所述生物体可为例如(但不限于)：丙酮丁醇梭菌、大肠杆菌、农杆菌、假单胞菌、醋杆菌、葡糖杆菌、根瘤菌、黄单孢菌、克雷白氏杆菌、埃希氏菌、红细菌、黄杆菌、沙门氏菌等。关于木糖异构酶及其编码序列的描述可参见例如：CN102037120A(尤其是其中的表2)。
本发明的“木糖转运蛋白”、“木糖异构酶”及“木酮糖激酶”的定义中还包括经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成仍具有其原有功能的氨基酸序列及其生物活性片段，例如将由野生型木糖转运蛋白、木糖异构酶或木酮糖激酶中的氨基酸序列经过1-20个，优选1-10个，更优选1-5个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有原有活性的衍生蛋白。衍生蛋白可包含一部分保守氨基酸的替代序列，所述经氨基酸替换的序列并不影响其活性或保留了其部分的活性。适当替换氨基酸是本领域公知的技术，所述技术可以很容易地被实施，并且确保不改变所得分子的生物活性。这些技术使本领域人员认识到，一般来说，在一种多肽的非必要区域改变单个氨基酸基本上不会改变生物活性。见Watson等，“Molecular Biology of The Gene”(《基因分子生物学》，第四版，1987，本杰明/库明出版公司，The Benjamin/Cummings Pub.Co.P224)。
应理解经保守取代的上文所述的序列也可用于本发明，优选的活性衍生物指与原氨基酸序列相比，有至多5个，较佳地至多3个，更佳地至多2个，最佳地1个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据本领域已知的保守氨基酸替换而产生。
术语“编码序列”是指编码本发明上述蛋白或多肽的序列，其可为本领域中已知的序列(同上文献所述)、在严格条件下与已知序列杂交的分子、或与上述分子高度同源的家族基因分子。
如本文所用，术语“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1%SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50%(v/v)甲酰胺，0.1%小牛血清/0.1%Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在50%，优选55%以上、60%以上、65%以上、70%以上、75%以上、80%以上、85%以上或90%以上，更优选是95%以上时才发生杂交。例如，所述序列可为(a)中所限定序列的互补序列。
本发明的编码序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
应理解，本发明的编码序列优选获自丙酮丁醇梭菌，获自其它菌或生物、与获自丙酮丁醇梭菌的编码序列高度同源(如具有50%以上，优选55%以上、60%以上、65%以上、70%以上、75%以上、80%以上，更优选85%以上如85%、90%、95%、甚至98%序列相同性)的其它编码序列也在本发明优选考虑的等同范围之内。比对序列相同性的方法和工具也是本领域周知的，如BLAST。
根据本发明，“重组质粒载体”指的是用于过表达xylT基因、xylA基因和/或xylB基因的的质粒载体。在本发明的一个优选例中，该载体为含有来源于丙酮丁醇梭菌ATCC824thl基因的启动子和xylT基因、xylA基因和/或xylB基因的重组质粒载体。在本发明的另一优选例中，可采用任何对葡萄糖不敏感的启动子(如th1、ptb、adc启动子)来构建本发明的重组质粒载体。
例如，本发明的具体实例中，使用的重组质粒载体“pIMP1-thl-xylT-thl-xylB”指的是基于大肠杆菌和丙酮丁醇梭菌穿梭质粒pIMP1-thl(其在丙酮丁醇梭菌中表达红霉素抗性基因，序列如SEQ ID NO.：2所示)构建的，用于过表达xylT基因和xylB基因的重组质粒载体，其中，使用的启动子是来源于丙酮丁醇梭菌ATCC824的thl基因。
本发明中可采用类似定义的其它载体，例如但不限于：pIMP1-th1-xylT、pIMP1-th1-xylA、pIMP1-th1-xylB、pIMP1-th1-xylT-th1-xylBA、pIMP1-th1-xylT-th1-xylA、pIMP1-th1-xylT-th1-xylB、pIMP1-th1-xylBA等。
抑制glcG基因的表达或蛋白活性并同时上调xylT、xylA、xylB基因表达或 蛋白活力
在本发明的方法中，更为有利是在抑制glcG基因的表达或蛋白活性的同时，上调xylT、xylA、xylB中一种或多种基因的表达或一种或多种蛋白的活力。
可采用本领域中常规的方法，实现上述优选方案。例如，可同时或先后采用多种质粒对丙酮丁醇梭菌进行转化，例如先采用pWJ1-glcG转化、再采用pIMP1-th1-xylT、pIMP1-th1-xylA、pIMP1-th1-xylB、pIMP1-th1-xylT-th1-xylBA、pIMP1-th1-xylT-th1-xylA、pIMP1-th1-xylT-th1-xylB、pIMP1-th1-xylBA中的一种或多种进行转化。
例如，在本发明中，丙酮丁醇梭菌glcG(pIMP1-th1-xylT)是指用重组敲除质粒载体pWJ1-glcG敲除了glcG基因以抑制该基因表达，并用重组质粒载体pIMP1-thl-xylT转化以实现xylT基因的过表达而构建的重组丙酮丁醇梭菌菌株。
在本发明中可采用类似的方法构建的其它重组菌株，例如但不限于：丙酮丁醇梭菌glcG(pIMP1-thl-xylA)、丙酮丁醇梭菌glcG(pIMP1-thl-xylB)、丙酮丁醇梭菌glcG(pIMP1-thl-xylBA)、丙酮丁醇梭菌glcG(pIMP1-thl-xylT-thl-xylBA)等。
根据本发明的一个优选实施例，在824glcG中单独过表达xylT、xylA、xylB基因和/或共表达xylT、xylA、xylB基因中的两者或三者，能进一步提高丙酮丁醇梭菌混合糖发酵中的木糖和/或阿拉伯糖利用率。
根据本发明，使用的重组菌株，既可以是本发明提供的抑制丙酮丁醇梭菌glcG基因表达和过表达xylT基因、xylA基因和xylB基因的菌株，也可以是根据本发明的教导和现有技术，制备的其它的抑制丙酮丁醇梭菌glcG基因表达和过表达xylT基因、xylA基因和xylB基因的菌株，如采用反义核酸技术降低glcG表达量的菌株。
采用本发明重组菌株的发酵生产
本文中，术语“ABE”为丙酮丁醇梭菌发酵生产的产物丙酮、丁醇、乙醇(Acetone-butanol-ethanol)的简称，术语“ABE浓度”是指所得丙酮、丁醇、乙醇的总浓度。
本发明提供的方法和菌株对发酵原料中的木糖和/或阿拉伯糖的利用率显著提高，同时转化生成的ABE浓度相应提高，因此可用于丙酮、丁醇、乙醇的发酵生产。并且，本发明构建的工程菌株提高了混合糖中木糖和阿拉伯糖的消耗率，能高效利用葡萄糖-木糖-阿拉伯糖进行发酵，因此这些菌株有利用木质纤维素水解液进行丙酮丁醇发酵的潜力。
本文中，术语“发酵”是指采用本发明的重组丙酮丁醇梭菌，由含糖原料通过生物转化生产丙酮、丁醇、乙醇等产物的过程。该过程可采用本领域中常规使用的发酵设备和工艺进行，本领域普通技术人员可根据实际需要和条件对设备和工艺进行选择。
用于本发明发酵生产的原料可为单一糖或混合糖，例如木糖-阿拉伯糖、葡萄糖-木糖-阿拉伯糖。使用的含糖原料既可以是直接使用葡萄糖、木糖和/或阿拉伯糖配制获得的单一糖或混合糖(如葡萄糖-木糖-阿拉伯糖)，也可以是发酵或水解高分子化合物(如水解纤维素或半纤维素等)，获得的混合糖。含糖原料可获自传统的粮食，但更优选地获自非粮原料，例如廉价的木质纤维素资源或农林废弃物，如秸秆、稻草等，根据现有技术文献中的报道在绝大多数的秸秆或稻草中葡萄糖、木糖和阿拉伯糖的比例可为20～60质量%葡萄糖：3～24质量%木糖：0.5～5质量%阿拉伯糖(Aristidou,A.and M.Penttila(2000).Curr OpinBiotechnol 11(2):187-198；Jeewon Lee,Journal of Biotechnology 56(1997)1–24)。在本发明的一些实施方式中，混合糖中各种糖的比例可为2~5%葡萄糖：0.3～2%木糖：0.05%～5%阿拉伯糖，更优选3.9%葡萄糖:1.5%木糖:0.3%阿拉伯糖(所示百分比为w/v)。
应理解，本发明实施例部分虽然仅基于本领域常用的典型模式丙酮丁醇梭菌ATCC 824，本领域普通技术人员在阅读了本发明之后，可在不脱离本发明精神和范围的基础上对其它丙酮丁醇梭菌进行改造以获得所需的提高的糖利用率。
本发明的优点
本发明的主要优点在于：
1.本发明中突破性地发现了在其它菌中被认为是不利于改造的靶点PTS系统可用于丙酮丁醇梭菌的改造，使得glcG基因成为消除该微生物葡萄糖抑制效应的重要改造靶点；
2.明确了木糖途径中真正的限速基因，通过对xylT、xylA和xylB基因的改造，提高了菌体在混合糖发酵中的木糖利用率，对工程菌的构建具有重要指导意义；
3.提供了一种新颖的基因工程化改造的丙酮丁醇梭菌，其可高效利用发酵原料中木糖和/或阿拉伯糖生产丁醇、乙醇和丙酮等重要工业原料；
4.提供了一种采用本发明丙酮丁醇梭菌、高效利用发酵原料中木糖和/或阿拉伯糖生产丁醇、乙醇和丙酮等重要工业原料的方法，该方法扩大了发酵原料的可选范围，降低了生产成本，且具有更高的产率和效率。
实施例
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人《分子克隆：实验室指南》(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。发酵液或糖溶液中糖的百分比为w/v%。
术语说明
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
本发明的下述实施例中，使用的菌株丙酮丁醇梭菌Clostridiumacetobutylicum ATCC 824含有的glcG、xylT、xylB和xylA基因是现有技术已知的，其在NCBI核酸数据库中基因组内的序号分别是：CA_C0570、CA_C1345、CA_C2612和CA_C2610。使用的菌株丙酮丁醇梭菌EA2018含有的glcG、xylT、xylB和xylA基因是现有技术已知的，其在NCBI核酸数据库中基因组内的序号分别是：CEA_G0584、CEA_G1359；CEA_G2621和CEA_G2619，这些序列与ATCC824的相应序列完全相同。
本发明的下述实施例中，“ABE”为丙酮、丁醇、乙醇(Acetone-butanol-ethanol)的简称，ABE浓度指的是溶液中丙酮、丁醇、乙醇的总浓度。
本发明的下述实施例中，“824glcG”是指基于ATCC 824构建的、glcG基因表达受抑制甚至不表达的菌株。
“重组质粒载体pIMP1-thl”是指表达xylT、xylB和xylA基因的重组质粒载体(其序列如SEQ ID NO:2所示)，thl启动子是来源于丙酮丁醇梭菌ATCC 824thl基因的启动子。
“重组敲除质粒载体pWJ1-glcG”是指用于敲除glcG基因的重组质粒载体(其序列如SEQ ID NO:10所示)，其中，使用的glcG-targetron片段指的是在IBS，EBS2，EBS1d位点碱基经修改后，用于敲除glcG基因的片段，该片段属于L1.LtrB内含子一部分，所述的L1.LtrB二类内含子为原核二类内含子，其中包含ltrA基因。
菌株和质粒
本发明使用的菌株和质粒分别为：
质粒pWJ1为大肠杆菌(E.coli)和丙酮丁醇梭菌的穿梭质粒(将来源于丁酸梭菌DSM10702的复制子pCB102替换掉pSY6的复制子pIM13)，在丙酮丁醇梭菌中表达红霉素抗性基因，该质粒的序列见SEQ ID NO.：1。
质粒pIMP1-thl为大肠杆菌和丙酮丁醇梭菌的穿梭质粒(载体骨架基于参考文献Mermelstein，L.D.and E.T.Papoutsakis(1993).Appl Environ Microbiol 59(4):1077-1081.中的pIMP1，区别仅在于引入了thl基因(cac2873)的启动子)，在丙酮丁醇梭菌中表达红霉素抗性基因，该质粒的序列见SEQ ID NO.：2。
质粒pANS1，序列见SEQ ID NO.：3(Mermelstein,L.D和E.T.Papoutsakis(1993).Appl Environ Microbiol 59(4):1077-1081.)，含壮观霉素抗性基因。
菌株大肠杆菌ER2275购自New England Biolabs公司。
菌株丙酮丁醇梭菌ATCC 824购于ATCC公司。菌株丙酮丁醇梭菌EA 2018来自于专利ZL 95111733.5，它和ATCC824的比较基因组组学研究参见文献Hu,S.Y.,H.J.Zheng(2011)."Comparative genomic and transcriptomic analysisrevealed genetic characteristics related to solvent formation and xylose utilizationin Clostridium acetobutylicum EA 2018."BMC Genomics 12.
试剂
本发明中使用的PCR纯化和DNA凝胶回收纯化试剂盒均购自华舜生物制品有限公司，TargetronTM Gene Knockout System(TA0100)Kit购自Sigma-Aldrich公司，基因组抽提试剂盒购自上海生工生物工程有限公司。
在本发明的下述实施例中，使用的培养基和缓冲液如下：
CGM培养基配方如下(Joseph W.Roos等，Biotechnology and Bioengineering,P681-694,Vol 557,1985)：2g(NH4)2SO4，1g K2HPO4·3H2O，0.5g KH2PO4，0.1gMgSO4·7H2O，0.015g FeSO4·7H2O，0.01g CaCl2，0.01g MnSO4·H2O，0.002gCoCl2，0.002g ZnSO4，2g胰蛋白胨，1g酵母提取物(Yeast Extraction)，50g葡萄糖，2%琼脂溶于1L水中。
P2培养基的配制方法如下(F.Monot等，Appl Environ Microbiol,Issue 6,Vol44,1982)：
溶液1：40g D-葡萄糖：20g D-木糖或40g D-葡萄糖：20g L-阿拉伯糖，加H2O定溶至850mL；
溶液2：NH4Ac 2.2g，K2HPO4·3H2O 0.5g，KH2PO40.5g，加H2O定溶至100mL；
溶液3：2.0g MgSO4·7H2O，0.1g MnSO4·H2O，0.1g NaCl，0.1g FeSO4·7H2O；
溶液4：100ml蒸馏水中加入100mg氨基苯甲酸(p-aminobenzoic acid)，100mg维生素B1(thiamine)，1mg生物素(biotin)；
溶液1和溶液2高温湿热灭菌，溶液3和溶液4过滤除菌，溶液1和溶液2冷却后混合均匀，再加入10mL溶液3和1mL溶液4，混匀后分装成95mL/瓶，以过滤除菌，N2排除瓶中的空气。
发酵罐中模仿水解液糖比例5.5%w/v的P2培养基配制方法如下：
溶液1：56.4g D-葡萄糖、21.7g D-木糖和4.3g L-阿拉伯糖，加H2O定溶至1240mL；
溶液2：NH4Ac 3.3g，K2HPO4·3H2O 0.75g，KH2PO40.75g，加H2O定溶至150mL；
溶液3：2.0g MgSO4·7H2O，0.1gMnSO4·H2O，0.1gNaCl，0.1g FeSO4·7H2O；
溶液4：在100ml蒸馏水中加入100mg氨基苯甲酸(p-aminobenzoic acid)，100mg维生素B1(thiamine)，1mg生物素(biotin)；
溶液1和溶液2高温湿热灭菌，溶液3和溶液4过滤除菌，溶液1与发酵罐一起灭菌后，通N2冷却，再和溶液2混合均匀，再加入15mL溶液3和1.5mL溶液4。
ETM缓冲液配方如下：270mM蔗糖，0.6mM Na2HPO4，4.4mM NaH2PO4，10mM MgCl2。
ET缓冲液配方如下：270mM蔗糖，0.6mM Na2HPO4，4.4mM NaH2PO4。
本发明使用的限制性内切酶，Taq DNA聚合酶，T4DNA连接酶和小牛碱性磷酸酶(CIAP)均购自TaKaRa公司，KOD plus DNA聚合酶购自Toyobo公司。
其它常规试剂均为国产或进口分装。
序列表说明
序列表中SEQ ID NOs:1-38分别代表如下序列：
表1.序列表中序列的含义
*up=上游引物            **dn=下游引物
实施例概述
本发明通过PCR扩增用于表达xylT、xylB和xylA基因的片段和中断glcG基因的targetron片断，然后经双酶切、并与经同样酶切的pIMP1-thl或pWJ1载体连接，得到质粒pIMP1-thl-xylT-thl-xylBA和pWJ1-glcG，电转丙酮丁醇梭菌ATCC824glcG和丙酮丁醇梭菌ATCC 824或EA 2018，然后经梭菌质粒PCR鉴定出有外源基因片段的存在和内含子插入到基因组中的重组菌，经发酵验证确定重组菌在混合糖中木糖、阿拉伯糖消耗率提高，具体如下述实施例所示。
实施例1.构建pWJ1-glcG质粒载体
通过PCR扩增glcG targetron片断，然后使用XhoI和BsrG I进行双酶切，并与同样经XhoI和BsrG I酶切的pWJ1载体连接，得到中断质粒pWJ1-glcG，其中，PCR扩增glcG targetron的模板及引物设计方法来源于Sigma-Aldrich公司的TargetronTM Gene Knockout System(TA0100)试剂盒，具体步骤如下：
1.1PCR扩增引物
参考TargetronTM Gene Knockout System(TA0100)试剂盒提供的方法，分别设计引物glcG-IBS(如序列SEQ ID NO.：4所示)、glcG-EBS1d(如序列SEQ IDNO.：5所示)和glcG-EBS2(如序列SEQ ID NO.：6所示)，用于构建pWJ1-glcG质粒载体。
PCR扩增需要的EBS通用引物(EBS universal)由TargetronTM Gene KnockoutSystem(TA0100)试剂盒自带。
1.2PCR扩增
使用Sigma-Aldrich的TargetronTM Gene Knockout System(TA0100)试剂盒进行PCR扩增(PCR反应条件：94℃30s,94℃30s、55℃30s、72℃30s 30个循环，72℃2min，4℃保存)，扩增需要的模板和试剂由试剂盒提供，将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，然后使用华舜公司的胶回收试剂盒纯化回收350bp处的条带。
1.3构建pWJ1-glcG重组质粒载体
使用Xho I及BsrGI分别酶切载体pWJ1和glcG-targetron片段，然后使用华舜公司的胶回收试剂盒纯化回收酶切后产物。
将酶切后的glcG-targetron片段与酶切后的载体片段使用T4DNA连接酶连接，该连接反应在16℃水浴锅中进行10hr，将获得的连接产物以CaCl2热休克法转化大肠杆菌DH5α感受态细胞：42℃热击90sec，然后添加4℃LB液体培养基复苏1hr，然后将细胞以4500rpm离心5min，涂布到含有100μg/mL氨苄青霉素的LB固体培养基平板上培养16-18hr。
对获得的菌落进行菌落PCR(反应试剂由Sigma-Aldrich的TargetronTM GeneKnockout System(TA0100)试剂盒提供、条件：95℃5min,94℃30s、55℃30s、72℃30s 30个循环，72℃2min，4℃保存)，以检测350bp的targetron片段是否连接入pWJ1载体中，PCR扩增引物为IBS和EBS1d。
PCR检测结果显示，菌落PCR可以扩增出350bp特异性条带。随即挑取PCR呈阳性的菌落以LB液体培养基扩培，提取质粒。然后，以dpIMP1-up(SEQ ID NO:7)作为引物，提取的质粒作为模板进行测序，结果如预期：targetron片段确已连接入pWJ1载体)。
实施例2.丙酮丁醇梭菌glcG突变株的构建、检测与敲除质粒的丢失
将pWJ1-glcG质粒经大肠杆菌ER2275/pANS1在Cac8I位点甲基化后，电转丙酮丁醇梭菌ATCC 824，复苏过夜后，取200μl细胞液涂布于加有20μg/mL红霉素的CGM平板上，在厌氧箱内37℃培养48-96小时后，挑取单菌进行菌落PCR验证，具体过程如下：
2.1pWJ1-glcG质粒的甲基化
为防止外源DNA进入丙酮丁醇梭菌后被其限制系统切割降解，需对pWJ1-glcG质粒进行甲基化(Mermelstein,L.D和Papoutsakis,E.T.Appl EnvironMicrobiol.vol 59.issue 4：p1077-81)。
将pANS1质粒以CaCl2热休克法转化入大肠杆菌ER2275，获得菌株大肠杆菌ER2275/pANS1。
将抽提获得的pWJ1-glcG质粒转化入大肠杆菌ER2275/pANS 1感受态细胞，由于pANS1质粒具有壮观霉素抗性，因此涂布于含有100μg/mL氨苄青霉素和50μg/mL壮观霉素的LB培养基平板上培养过夜后，挑取单菌落接至4mL添加有100μg/mL氨苄青霉素和50μg/mL壮观霉素的LB液体培养基中过夜培养，获得含pANS1及pWJ1-glcG的大肠杆菌ER2275，用质粒抽提试剂盒抽提质粒，将抽提获得的质粒使用SatI酶切验证(以未转化入大肠杆菌ER2275/pANS1的pSY6-ccpA为对照；satI为Cac824I的同裂酶，与Cac824I具有相同的识别位点)，酶切结果显示，经上述处理的质粒pWJ1-glcG不能被SatI酶切，而对照可被SatI酶切，根据酶切结果，经上述处理的质粒pWJ1-glcG的Cac824I酶切位点被甲基化而不被丙酮丁醇梭菌的限制系统所识别。
2.2pWJ1-glcG质粒电转入丙酮丁醇梭菌ATCC 824
将丙酮丁醇梭菌ATCC 824于CGM培养基平板上划线培养48hr后，挑取单菌落接入5mL CGM液体培养基中培养16hr，再按1%接种量接入50mL CGM液体培养基中培养，当培养菌体的OD600达到0.6-0.7之间时取出培养菌，用于制备电转感受态细胞。取30mL菌液，于4℃、4500rpm离心10min，弃上清，加入30mL4℃的ETM缓冲液悬浮，再于4℃、4500rpm离心10min，弃上清，加入1mL 4℃的ET缓冲液，获得悬浮菌液。
取上述悬浮菌液190μL，加入10μL(约1~3μg)pWJ1-glcG甲基化质粒(冰上操作)，混匀后转入电转杯中(2mm直径)，使用Bio-Rad MicroPulserTM电转仪电转，电压1.8kV，其余参考使用手册，电击后迅速加入常温的CGM培养基1mL，于37℃培养8hr后，取200μL细胞液涂布于加有20μg/mL红霉素的CGM平板上，于厌氧箱内37℃培养约2～4天。
2.3菌落的PCR验证
pWJ1-glcG质粒转化入丙酮丁醇梭菌ATCC 824中后，可能会将二类内含子的部分序列插入到基因组的glcG基因中，是否有内含子插入可以使用插入位点上下游的引物，通过菌落PCR加以验证(未插入内含子的野生型菌将扩增出400bp的条带，插入有内含子的重组菌株将扩增出的条带为1.3Kb条带)，因此，随机挑取五个转化子进行验证，其中，以丙酮丁醇梭菌ATCC 824基因组为阴性对照，具体过程如下：
PCR反应使用的引物为glcG_126-145和glcG_473-492，其序列分别如SEQID No.：8和SEQ ID No.：9所示；
PCR反应体系：与实施例1相同；
PCR反应条件：95℃5min；95℃30s，55℃30s，72℃1.5min，30个循环；72℃5min。
将PCR反应获得的产物，进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图2所示。
根据图2的结果，得到的五个转化子均为插入了内含子的突变体。
2.4测序验证阳性转化子
随机挑取步骤2.3中对应于图2中标记为4的阳性转化子，以加有20μg/mL红霉素的CGM液体培养基培养后，抽提基因组。以抽提的基因组为模板，以glcG-_126-145和glcG_473-492为引物对进行PCR扩增，回收扩增获得的1.3kb DNA条带并测序，结果如SEQ ID NO.：10所示。测序结果显示，该序列的101-1015位点的DNA为插入的内含子序列，即内含子序列精确地插入到预计的269|270位点之间。
2.5824/pWJ1-glcG敲除质粒的丢失
将10μl生长至对数生长期的转化子分别转接至5ml CGM无抗和含有红霉素(20μg/ml)的试管中，12～15小时转接一次，直至抗性试管不再生长为止，此过程需约2天。将抗性试管不再生长时对应代时的无抗试管菌液涂板，菌落PCR、测序验证(同2.3、2.4)保证内含子的插入，将丢失敲除质粒的突变株824glcG用于后续的代谢工程改造。
实施例3.824glcG突变株的发酵
取步骤2.5中的中断了glcG基因的丙酮丁醇梭菌菌株824glcG在P2培养基中发酵，并检测发酵液，具体过程如下：
从CGM平板上挑取单菌接入5mL CGM液体培养基中，过夜培养，以1%接种量接入50mL CGM培养基中，培养8~10hr，使菌浓OD600达到0.4，以5%接入P2培养基中培养发酵，取发酵液检测残糖含量(使用WATERS公司的sugar-park柱经Agela 1200HPLC测定，结果如图1所示)，并以丙酮丁醇梭菌ATCC 824作为对照，其中，测定发酵液中的残糖含量前需进行如下预处理：发酵液经离心后，分别取上清液，以H2O经20倍稀释后用于残糖测定。
结果显示：glcG基因经插入失活后，在葡萄糖存在下，阿拉伯糖和木糖的最终消耗量分别增加了94%和117%(图1)。该结果证明了glcG经插入失活后显著减弱了葡萄糖抑制效应。图1显示结果表明在40g/L葡萄糖和23g/L阿拉伯糖混糖发酵中，野生型菌株消耗了9.87g/L阿拉伯糖，glcG失活菌株消耗了19.15g/L阿拉伯糖；在41g/L葡萄糖和22g/L木糖混糖发酵中，野生型菌株消耗了5.62g/L木糖，glcG失活菌株消耗了12.17g/L木糖。野生型菌株最终消耗了占总糖量约8.8%的木糖。
本研究中敲除glcG虽然使得发酵前期葡萄糖利用速率有所降低，但是葡萄糖的发酵周期并未延迟(图1A和B)，即并不以牺牲葡萄糖的利用来换取木糖、阿拉伯糖等次级碳源的利用。
实施例4.824glcG以4%w/v葡萄糖为碳源的P2发酵中不同时期葡萄糖激酶活力 的测定
从CGM平板上挑取单菌接入5mL CGM液体培养基中，过夜培养，以1%接种量接入50mL CGM培养基中，培养8~10hr，使菌浓OD600达到0.4，接入950mlP2培养基中培养发酵，并以丙酮丁醇梭菌ATCC 824作为对照，当OD600=1.8和4-4.5时，4℃，5000rpm，10min离心收集250ml菌体并用液氮速冻。将速冻后的细胞重悬在6ml含有10%v/v甘油的Tris-HCl缓冲液(50mM，pH7.4)中，用One Shot细胞破碎仪(Low March,Daventry,Northants,UK)将之破碎(30KPSI，2次)后，4℃，12000rpm，30min离心收集上清用于酶活测定。酶活测定方法参见文献(Seno,E.T.和K.F.Chater(1983).Journal ofGeneral Microbiology 129(May):1403-1413.)中利用酶耦联反应检测NADP减少的方法。
表2所示为824和824glcG在产酸期(OD600=1.8)和产溶剂期(OD600＝4-4.5)在4%葡萄糖P2培养基中葡萄糖激酶的比活力。
表2.824和824glcG的葡萄糖激酶的比活力
该结果显示：824glcG的葡萄糖激酶的活力在产酸期和产溶剂期分别比野生型高出0.9、3.6倍。该结果证实了产溶剂期葡萄糖激酶活力的迅速提高很好的弥补了产酸期葡萄糖利用滞后的表型，也很好解释了突变株用完葡萄糖的时间没有滞后的原因。即，实施例3中葡萄糖利用没有延迟的原因是葡萄糖非PTS系统的激活补偿了突变株824glcG的葡萄糖转运以及后续磷酸化。
上述结果表明：glcG基因可成为消除丙酮丁醇梭菌葡萄糖抑制效应的重要改造靶点。
实施例5.824菌株在1.5%w/v的木糖和阿拉伯糖中的发酵
从CGM平板上挑取单菌接入5mL CGM液体培养基中，过夜培养，以1%接种量接入50mL CGM培养基中，培养8~10hr，使菌浓OD600达到0.4，以5%接入100ml P2培养基中培养发酵，取发酵液检测残糖含量(使用WATERS公司的sugar-park柱经Agela 1200HPLC测定，结果如图7所示)，其中测定发酵液中的残糖含量前需进行如下预处理：发酵液经离心后，分别取上清液，以H2O经20倍稀释后用于残糖测定。
结果显示：824菌株在40小时内就能完全消耗17.16g/L的阿拉伯糖，而这时的木糖利用才刚刚开始，在80小时后仍有1.41g/L木糖的残留。低糖发酵能避免过多的终产物如丁醇等菌体的毒害作用，824菌株在低木糖发酵中仍表现出利用不完全的表型，说明除了CCR效应、产物抑制外，824木糖代谢途径天然存在问题。因此，需要寻求一种可改善该代谢途径的新方法。
实施例6.构建pIMP1-thl-xylT、pIMP1-thl-xylA、pIMP1-thl-xylB、 pIMP1-thl-xylBA、pIMP1-thl-xylT–thl和pIMP1-thl-xylT-thl-xylBA质粒载体
以丙酮丁醇梭菌ATCC 824基因组为模板，设计引物扩增xylT、thl引物、ylB和xylA，酶切处理后与同样酶切处理的载体相连，转化DH5α，菌落PCR验证并抽提质粒测序。其中，PCR、酶切、连接转化、菌落PCR方法同实施例1。具体过程如下：
4.1pIMP1-thl-xylT的构建
以xylT-up和xylT-dn为引物扩增出xylT片段，其序列分别如SEQ ID No.：20和SEQ ID No.：17所示。使用SalI和XbaI分别酶切载体pIMP1-thl和xylT片段，二者连接、转化DH5α后用同样的引物鉴定，将有阳性条带的菌落抽提质粒，测序验证正确后保菌。
4.2pIMP1-thl-xylA的构建
以xylA-up和xylA-dn为引物扩增出xylA片段，其序列分别如SEQ ID No.：21和SEQ ID No.：22所示。使用BamHI及SmaI分别酶切载体pIMP1-thl和xylA片段，二者连接、转化DH5α后用同样的引物鉴定，将有阳性条带的菌落抽提质粒，测序验证正确后保菌。
4.3pIMP1-thl-xylB的构建
以xylB-up和xylB-dn为引物扩增出xylB片段，其序列分别如SEQ ID No.：23和SEQ ID No.：24所示。使用BamHI及EcoRI分别酶切载体pIMP1-thl和xylB片段，二者连接、转化DH5α后用同样的引物鉴定，将有阳性条带的菌落抽提质粒，测序验证正确后保菌。
4.4pIMP1-thl-xylBA的构建
以xylB-up和xylA-dn为引物扩增出xylBA片段，其序列分别如SEQ ID No.：23和SEQ ID No.：22所示。使用BamHI及SmaI分别酶切载体pIMP1-thl和xylBA片段，二者连接、转化DH5α后用同样的引物鉴定，将有阳性条带的菌落抽提质粒，测序验证正确后保菌。
4.5pIMP1-thl-xylT-thl的构建
以Thl2-up和Thl2-dn为引物扩增出thl启动子片段，其序列分别如SEQ IDNo.：25和SEQ ID No.：26所示。使用XbaI及BamHI分别酶切载体pIMP1-thl-xylT和thl启动子片段，二者连接、转化DH5α后用引物dxylT-重叠-up和dpIMP 1-dn鉴定，其序列分别如SEQ ID No.：18和SEQ ID No.：14所示。将有阳性条带的菌落抽提质粒，测序验证正确后保菌。
4.6pIMP 1-thl-xylT-thl-xylBA的构建
以xylBA-up和xylBA-dn为引物扩增出xylBA操纵子，其序列分别如SEQ IDNo.：27和SEQ ID No.：28所示。使用BamHI及SmaI分别酶切载体pIMP1-thl-xylT-thl和xylBA操纵子，二者连接、转化DH5α后用引物dxylT-重叠-up和dxylBA-重叠-dn鉴定，其序列分别如SEQ ID No.：18和SEQ ID No.：19所示。将有阳性条带的菌落抽提质粒，测序验证正确后保菌。
实施例7.丙酮丁醇梭菌824(pIMP1-thl-xylBA)、824(pIMP1-thl-xylT)、 824glcG(pIMP1-thl)、824glcG(pIMP1-thl-xylT)、824glcG(pIMP1-thl-xylA)、 824glcG(pIMP1-thl-xylB)、和824glcG(pIMP1-thl-xylT-thl-xylBA)突变株的构建 与检测
将实施例6中构建正确的pIMP1-thl-xylBA、pIMP1-thl-xylT甲基化后电转进入ATCC824；将pIMP 1-thl和实施例6中构建正确的pIMP1-thl-xylT、pIMP1-thl-xylA、pIMP1-thl-xylB、pIMP1-thl-xylT-thl-xylBA甲基化后电转进入824glcG，具体过程如下：
5.1各质粒的甲基化
方法同2.1
5.2甲基化的各质粒的电转
方法同2.2
5.3各个工程菌的菌落PCR验证
PCR体系、方法、DNA琼脂糖电泳验证同2.3，阳性对照为各自构建正确的质粒，阴性对照为水。
5.3.1丙酮丁醇梭菌824(pIMP1-thl-xylT)的鉴定
引物为dxylT-up和dpIMP1-dn，其序列分别如SEQ ID No.：13和SEQ ID No.：14所示；获得的阳性菌落简称为824-xylT。
5.3.2丙酮丁醇梭菌824(pIMP1-thl-xylBA)的鉴定
引物为dpIMP1-up和dxylB-dn，其序列分别如SEQ ID No.：11和SEQ ID No.：16所示；获得的阳性菌落简称为824-xylBA。
5.3.3丙酮丁醇梭菌824glcG(pIMP1-thl)的鉴定
引物为dpIMP1-up和dthl-dn，其序列分别如SEQ ID No.：11和SEQ ID No.：12所示；获得的阳性菌落简称为824glcG-thl。
5.3.4丙酮丁醇梭菌glcG(pIMP1-thl-xylT)的鉴定
引物为dxylT-up和dpIMP1-dn，其序列分别如SEQ ID No.：13和SEQ ID No.：14所示；获得的阳性菌落简称为824glcG-xylT。
5.3.5丙酮丁醇梭菌glcG(pIMP1-thl-xylA)的鉴定
引物为dxylA-up和dpIMP1-dn，其序列分别如SEQ ID No.：15和SEQ ID No.：14所示；获得的阳性菌落简称为824glcG-xylA。
5.3.6丙酮丁醇梭菌glcG(pIMP1-thl-xylB)的鉴定
引物为dpIMP1-up和dxylB-dn，其序列分别如SEQ ID No.：11和SEQ ID No.：16所示；获得的阳性菌落简称为824glcG-xylB。
5.3.7丙酮丁醇梭菌glcG(pIMP1-thl-xylT-thl-xylBA)的鉴定
第一对鉴定引物为dpIMP1-up和xylT-dn，其序列分别如SEQ ID No.：11和SEQ ID No.：17所示，鉴定结果见图4以A为标记的所有泳道；第二对鉴定引物为dxylT-重叠-up和dxylBA-重叠-dn，其序列分别如SEQ ID No.：18和SEQ IDNo.：19所示，鉴定结果见图4以B为标记的所有泳道。由电泳图谱可见：标记为6号的菌落为阳性。获得的阳性菌落简称为824glcG-TBA。
实施例8.824-xylT在4%w/v葡萄糖和2%w/v木糖为碳源的P2发酵
从CGM平板上挑取单菌接入含有5mL CGM液体培养基中，过夜培养，以1%接种量接入50mL CGM培养基中，培养8~10hr，使菌浓OD600达到0.4，以5%接入100ml P2培养基中培养发酵，取发酵液检测残糖含量(使用WATERS公司的sugar-park柱经Agela 1200HPLC测定，结果如图10所示)，其中测定发酵液中的残糖含量前需进行如下预处理：发酵液经离心后，分别取上清液，以H2O经20倍稀释后用于残糖测定。
结果显示：以葡萄糖不敏感的启动子thl携带xylT在野生型中过表达，能增加混糖中木糖的利用，发酵终点96小时824-xylT能利用43%的木糖，比野生型多用8.02g木糖。
实施例9.824-xylBA在4%w/v葡萄糖和2%w/v木糖为碳源的P2发酵
从CGM平板上挑取单菌接入含有5mL CGM液体培养基中，过夜培养，以1%接种量接入50mL CGM培养基中，培养8~10hr，使菌浓OD600达到0.4，以5%接入100ml P2培养基中培养发酵，取发酵液检测残糖含量(使用WATERS公司的sugar-park柱经Agela 1200 HPLC测定，结果如图9所示)，其中测定发酵液中的残糖含量前需进行如下预处理：发酵液经离心后，分别取上清液，以H2O经20倍稀释后用于残糖测定。
结果显示：以葡萄糖不敏感的启动子thl携带xylBA在野生型中过表达，能增加混糖中木糖的利用，发酵终点96小时824-xylBA能利用38%的木糖，比野生型多用5.2g木糖。
实施例10.定量PCR检测824glcG-thl和824glcG-TBA中xylT、xylA和xylB的转录
从CGM平板上挑取单菌接入含有25μg/ml红霉素的5mLCGM液体培养基中，过夜培养至OD600＝0.8~1.0，以1%接种量接入50mL CGM培养基中，培养8~10hr，使菌浓OD600达到0.4，接入950ml P2(以4%w/v葡萄糖和2%w/v木糖为碳源)培养基中培养发酵，并以824glcG-thl作为对照，当OD600=3.8和7时，4℃，5000rpm，10min离心收集250ml菌体并用液氮速冻。细胞RNA的提取和cDNA的制备同文献(Ren,C.,Y.Gu，等(2010).Metab Eng12(5):446-454.)。
每20μl实时PCR反应体系包括：10μl iQ SYBR Green Supermix(Bio-Rad)，200nM引物，1μlcDNA模板。实时PCR在实时PCR检测仪(Bio-Rad)中进行，PCR程序为：95℃3min；95℃20s，55℃20s，72℃20s，40个循环；65-95°C进行溶解曲线分析。所有样品都进行了三次平行实验，取平均值进行分析。为了计算相对表达水平，cDNA稀释了200倍进行分析，参见文献(Pfaffl,M.W.(2001).Nucleic Acids Res 29(9):e45.)。采用CA_C2679和CA_C3141作为内参基因。实时PCR的引物如SEQ IDNOs:29-38所示。
表3.824glcG-thl和824glcG-TBA在4%葡萄糖:2%木糖在产酸期(OD600=3.8)和产溶剂期(OD600＝7)中xylT、xylA和xylB的转录情况(以824glcG-th1的基因表达为1为基准计)。
结果表明：和对照824glcG-thl相比，xylT、xylA和xylB在824glcG-TBA中产酸期、产溶剂期转录都有明显上调，表达策略成功。
实施例11.工程菌丙酮丁醇梭菌824glcG、824glcG(pIMP1-thl)、 824glcG(pIMP1-thl-xylT)、824glcG(pIMP1-thl-xylA)、824glcG(pIMP1-thl-xylB) 和824glcG(pIMP1-thl-xylT-thl-xylBA)的发酵
发酵方法同实施例3。
从图3中看出：虽然与824glcG相比，空质粒导入824glcG使菌体在混合糖中对木糖的利用降低32%，但xylT、xylA、xylB这三种基因分别或同时导入824glcG使菌体在混合糖中对木糖的利用有不同程度的提高：与对照824glcG-thl菌株相比，它们的木糖利用率分别提高了75%、106%、63%和137%。所有的工程菌中，三个基因同时导入824glcG的工程菌824glcG-TBA具有最高的木糖消耗率，是最有应用前景的工程菌。
该结果证明了过表达xylT、xylA、xylB基因中的一种或多种，可促进丙酮丁醇梭菌对木糖的利用率。
实施例12.工程菌丙酮丁醇梭菌824glcG(pIMP1-thl-xylT-thl-xylBA)在5.5%w/v 仿真料液中的发酵
从CGM平板上挑取单菌接入5mL CGM液体培养基中，过夜培养，以3%接种量接入100mL CGM培养基中，培养4～8hr，菌浓OD600达到0.8～1.0，接入1.4LP2培养基中培养发酵，取发酵液检测残糖含量(使用WATERS公司的sugar-park柱经Agela 1200HPLC测定，结果如图5所示)以及丙酮、丁醇和乙醇含量(使用Agela 7890A气相色谱仪测定，结果如图6所示)，以丙酮丁醇梭菌ATCC 824作为对照，其中，测定发酵液中的残糖含量和丙酮、丁醇和乙醇含量前需进行如下预处理：
发酵液经离心后分别取上清液测定残糖和丙酮、丁醇、乙醇：
上清液以H2O经20倍稀释后用于残糖测定；取400μL上清液与100μL内标混合均匀测定丙酮、丁醇和乙醇(内标配方为：25g异丁醇，5g异丁酸，50mL 37%浓盐酸，加水定容至1L)。
根据图5的结果，工程菌824glcG-TBA在52小时基本用完发酵液中的各种糖，而野生型到发酵终点(71h)还有51%的木糖残留。
根据图6的结果，824glcG-TBA突变菌株发酵液中的丁醇和ABE的终浓度均高于野生菌株。
表4所示为3.8%葡萄糖:1.4%木糖:0.3%阿拉伯糖发酵824和824glcG-TBA的残糖、丙酮、丁醇、乙醇产量和生产率、得率的计算结果。
表4.824和824glcG-TBA菌株的残糖浓度、产物产量以及生产率、得率
根据表4的结果，824glcG-TBA突变菌株的生产率、得率均高于野生菌株。
实施例13.丙酮丁醇梭菌EA2018、2018glcG和2018glcG-TBA的发酵
除了基于EA2018而不是ATCC824菌株，工程菌2018glcG和2018glcG-TBA的构建与检测和824glcG、824glcG-TBA相同。发酵同实施例3。
结果显示：和野生型EA2018相比，2018glcG、2018glcG-TBA在96小时的木糖利用率分别提高了1.1、2.2倍，其提高的趋势类似于ATCC 824中的改造结果(图11)；和野生型相比，2018glcG、2018glcG-TBA在96小时的ABE分别提高了46%、55%(图12)。
综上所述，在本发明提供的方法中，xylT、xylB和xylA基因过量表达、glcG基因经二类内含子插入失活后的菌株利用混合糖中木糖和阿拉伯糖的能力显著提高，同时转化生成的ABE浓度相应提高，因此经工程化的菌株有利用木质纤维素水解液进行丙酮丁醇发酵的潜力。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (19)

1.一种基因工程化丙酮丁醇梭菌，其与野生型丙酮丁醇梭菌相比，glcG基因表达受抑制或glcG蛋白活力受抑制，所述glcG基因的序列为CA_C(0570)。 
2.如权利要求1所述的基因工程化丙酮丁醇梭菌，其还具有选自下组的一种或多种特征：由xylT基因编码的木糖转运蛋白过表达或活力提高、由xylA基因编码的木糖异构酶过表达或活力提高、和/或由xylB基因编码的木酮糖激酶过表达或活力提高，所述xylT基因选自：CA_C1345、CEA_G1359，所述xylB基因选自：CA_C2612、CEA_G2621，所述xylA基因选自：CA_C2610、CEA_G2619。 
3.如权利要求1或2所述的基因工程化丙酮丁醇梭菌，其特征在于，所述基因工程化丙酮丁醇梭菌通过选自下组的一种或多种的基因工程化处理获得的：在glcG基因中插入DNA片段、部分或全部敲除glcG基因、引入针对glcG基因的反义核酸或干扰核酸、引入glcG抑制物。 
4.如权利要求2所述的基因工程化丙酮丁醇梭菌，其特征在于，所述基因工程化处理包括：导入额外的xylT、xylA和/或xylB基因；引入提高xylT、xylA和/或xylB所编码的蛋白的表达或活力的突变；或提供瞬时表达xylT、xylA和/或xylB所编码的蛋白的表达载体。 
5.如权利要求2所述的基因工程化丙酮丁醇梭菌，其特征在于， 
所述木糖转运蛋白是来自于丙酮丁醇梭菌的用于木糖转运的蛋白或其生物活性片段； 
所述木糖异构酶是来自于丙酮丁醇梭菌的用于催化木糖发生异构的酶或其生物活性片段； 
所述木酮糖激酶是来自于丙酮丁醇梭菌的用于催化木酮糖磷酸化的酶或其生物活性片段。 
6.如权利要求1所述的基因工程化丙酮丁醇梭菌，其特征在于，所述基因工程化丙酮丁醇梭菌的母菌选自：ATCC 824、EA 2018。 
7.如权利要求6所述的基因工程化丙酮丁醇梭菌，其特征在于，所述基因工程化丙酮丁醇梭菌还包含选自下组的一种或多种质粒：pIMP1-th1-xylT、pIMP1-th1-xylA、pIMP1-th1-xylB、pIMP1-th1-xylT-th1-xylBA、pIMP1-th1-xylT-th1-xylA、pIMP1-th1-xylT-th1-xylB、pIMP1-th1-xylBA、或是以ptb或adc启动子替代上述质粒中的启动子th1构建各相应质粒。 
8.一种生产丙酮、丁醇和/或乙醇的方法，所述方法包括步骤： 
a)在适当的培养基中培养如权利要求1-7中任一项所述的菌株； 
b)从a)的培养物中分离产物丙酮、丁醇和/或乙醇。 
9.一种提高丙酮丁醇梭菌对木糖和/或阿拉伯糖的利用率的方法，所述方法包括步骤： 
(a)对丙酮丁醇梭菌进行基因工程化改造，以相对于野生型丙酮丁醇梭菌而言抑制glcG基因表达，所述glcG基因的序列为CA_C(0570)； 
(b)将步骤(a)中所得的基因工程化丙酮丁醇梭菌用于含木糖和/或阿拉伯糖的原料的发酵中。 
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，步骤(a)还包括对所述丙酮丁醇梭菌进行基因工程化改造，以相对于野生型丙酮丁醇梭菌而言：提高由xylT编码的木糖转运蛋白的表达或活力、提高由xylA编码的木糖异构酶的表达或活力、和/或提高由xylB编码的木酮糖激酶的表达或活力，所述xylT基因选自：CA_C1345、CEA_G1359，所述xylB基因选自：CA_C2612、CEA_G2621，所述xylA基因选自：CA_C2610、CEA_G2619。 
11.一种提高丙酮丁醇梭菌生产产物丙酮、丁醇和/或乙醇的产率的方法，所述方法包括步骤： 
(a)对丙酮丁醇梭菌进行基因工程化改造，以相对于野生型丙酮丁醇梭菌而言抑制glcG基因表达，所述glcG基因的序列为CA_C(0570)； 
(b)将步骤(a)中所得的基因工程化丙酮丁醇梭菌用于含木糖和/或阿拉伯糖的原料的发酵中。 
12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，步骤(a)还包括对所述丙酮丁醇梭菌进行基因工程化改造，以相对于野生型丙酮丁醇梭菌而言：提高由xylT基因编码的木糖转运蛋白的表达或活力、提高由xylA基因编码的木糖异构酶的表达或活力、和/或提高由xylB基因编码的木酮糖激酶的表达或活力，所述xylT基因选自：CA_C1345、CEA_G1359；所述xylB基因选自：CA_C2612、CEA_G2621；所述xylA基因选自：CA_C2610、CEA_G2619。 
13.如权利要求9-12中任一项所述的方法，其特征在于， 
所述抑制glcG基因表达是通过选自下组的一种或多种方式实现的：在glcG基因中插入DNA片段、部分或全部敲除glcG基因、引入反义核酸或干扰核酸、引入glcG抑制物。 
14.如权利要求10或12所述的方法，其特征在于，所述基因工程化改造包括：导入额外的xylT、xylA和/或xylB基因；引入提高xylT、xylA和/或xylB所编码的蛋白的表达或活力的突变；或提供瞬时表达xylT、xylA和/或xylB所编码的蛋白的表 达载体，所述xylT基因选自：CA_C1345、CEA_G1359；所述xylB基因选自：CA_C2612、CEA_G2621；所述xylA基因选自：CA_C2610、CEA_G2619。 
15.如权利要求10或12所述的方法，其特征在于， 
所述木糖转运蛋白是来自于丙酮丁醇梭菌的用于木糖转运的蛋白或其生物活性片段； 
所述木糖异构酶是来自于丙酮丁醇梭菌的用于催化木糖发生异构的酶或其生物活性片段； 
所述木酮糖激酶是来自于丙酮丁醇梭菌的用于催化木酮糖磷酸化的酶或其生物活性片段。 
16.如权利要求9-12中任一项所述的方法，其特征在于，所述丙酮丁醇梭菌选自：ATCC 824、EA 2018。 
17.如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述基因工程化丙酮丁醇梭菌还以选自下组的一种或多种质粒转化：pIMP1-th1-xylT、pIMP1-th1-xylA、pIMP1-th1-xylB、pIMP1-th1-xylT-th1-xylBA、pIMP1-th1-xylT-th1-xylA、pIMP1-th1-xylT-th1-xylB、pIMP1-th1-xylBA、或是以ptb或adc启动子替代上述质粒中的启动子th1构建各相应质粒。 
18.如权利要求9-12中任一项所述的方法，其特征在于，所述包含木糖和/或阿拉伯糖的原料选自：纤维素或半纤维素的水解液、粮食、棉花。 
19.如权利要求9-18中任一项所述的方法在丁醇、丙酮和/或乙醇的生产中的用途。 
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