CN117925431A - 改进的无甘油的乙醇生产 - Google Patents

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Abstract

改进的无甘油的乙醇生产。本发明涉及一种重组细胞，优选酵母细胞，所述重组细胞包含：a)一种或多种编码甘油脱氢酶活性的异源基因；b)一种或多种编码二羟基丙酮激酶(E.C.2.7.1.28和/或E.C.2.7.1.29)的基因；c)一种或多种编码核酮糖‑1,5‑二磷酸羧化酶加氧酶(EC 4.1.1.39，RuBisCO)的异源基因；和d)一种或多种编码磷酸核酮糖激酶(EC 10 2.7.1.19，PRK)的异源基因；以及任选地e)一种或多种编码甘油转运体的异源基因。该细胞可用于生产乙醇，并且有利地产生很少的甘油或不产生甘油。

Description

改进的无甘油的乙醇生产
本申请是申请号为201780079215.9的名称为“改进的无甘油的乙醇生产”的中国专利申请的分案申请，原申请是申请日为2017年12月18日的国际申请PCT/EP2017/083249的中国国家阶段申请。
技术领域
本发明涉及适用于乙醇生产的重组细胞，该细胞用于制备乙醇和/或琥珀酸的用途，以及使用该重组细胞制备发酵产物的方法。
背景技术
微生物发酵方法被应用于从可再生碳水化合物原料工业生产广泛且快速扩展范围的化学化合物。尤其是在厌氧发酵过程中，辅因子对NADH/NAD+的氧化还原平衡可造成对产物产率的重大约束。该挑战例示为在——例如——通过Saccharomyces cerevisiae进行的燃料乙醇的工业生产中形成甘油作为主要副产物，这是需要对在生物合成反应中形成的NADH进行再氧化的直接结果。通过Saccharomyces cerevisiae进行的乙醇生产是目前工业生物技术中按体积计单一最大的发酵工艺，但目前在工业生物技术工艺中产生了各种其他化合物，包括其他醇类，羧酸，类异戊二烯，氨基酸等。对于(诸如从玉米淀粉和蔗糖进行的)燃料乙醇的常规发酵生产，糖主要作为己糖的二聚体或聚合物出现，该糖在预处理和通过不同形式的葡糖水解酶进行酶促水解后以单糖形式释放时，可被Saccharomycescerevisiae有效、快速地发酵。纤维素或第二代生物乙醇由例如植物生物质的木质纤维素级分产生，该木质纤维素级分被水解成游离单体糖(诸如己糖和戊糖)，以发酵成乙醇。除了在生物质的预处理和水解期间的糖释放之外，还形成了一些有毒副产物，这取决于几个预处理参数(诸如温度、压力和预处理时间)。已经提出了各种方法来通过遗传修饰改善工业生物技术中所使用的生物体的发酵性质。与基于酵母的乙醇生产的化学计量以及其他化合物的化学计量有关的主要挑战是大量的NADH依赖性副产物(特别是甘油)通常作为副产物形成，特别是在厌氧和氧受限条件下或在呼吸以其他方式受到限制或不存在的条件下。据估计，在典型的工业乙醇工艺中，高达约4重量％的糖原料被转换为甘油(Nissen等人，Yeast16(2000)463-474)。在厌氧生长的理想条件下，甘油转换率甚至可以更高，高达约10％。
厌氧条件下的甘油生产主要与氧化还原代谢有关。在S.cerevisiae的厌氧生长期间，经由醇发酵而发生糖异化。在该过程中，在糖酵解甘油醛-3-磷酸脱氢酶反应中形成的NADH通过转换乙醛而被再氧化，该乙醛是经由NAD+依赖性醇脱氢酶将丙酮酸脱羧成乙醇而形成的。当在代谢中的其他地方(例如生物质形成)发生NAD+至NADH的净还原时，该氧化还原-中性异化途径的固定化学计量引起问题。在厌氧条件下，S.cerevisiae中的NADH再氧化严格依赖于将糖还原成甘油。甘油形成通过将糖酵解中间体二羟丙酮磷酸(DHAP)还原成甘油3-磷酸(甘油-3P)而引发，该还原是由NAD+依赖性甘油3-磷酸脱氢酶催化的反应。随后，在该反应中形成的甘油3-磷酸被甘油-3-磷酸酶水解，以得到甘油和无机磷酸盐。因此，甘油是通过S.cerevisiae进行的乙醇厌氧生产期间的主要副产物，这是不期望的，因为其降低了糖朝向乙醇的总转变率。此外，乙醇生产设施的流出物中甘油的存在可能会增加废水处理的成本。
WO2013/89878描述了在功能上表达异源核酸序列的重组细胞，所述核酸序列编码核酮糖-1,5-磷酸羧化酶/加氧酶(EC 4.1.1.39；本文缩写为“RuBisCO”)，和任选的RuBisCO分子伴侣，以及磷酸核酮糖激酶(EC 2.7.1.19；本文缩写为“PRK”)。
WO2015/107496描述了在功能上表达异源核酸序列的重组细胞，所述核酸序列编码RuBisCO单元RbcL、RbcS和RcbX以及Rubisco分子伴侣GroEL和GroES。在示例中，用四环素诱导型启动子Tet07表达PRK。
发明内容
本发明的第一方面提供一种重组酵母细胞，所述重组酵母细胞包含：
a.一种或多种编码由氨基酸序列SEQ ID NO:13表示的甘油脱氢酶的异源基因；
b.一种或多种编码由氨基酸序列SEQ ID NO:14表示的二羟基丙酮激酶的基因；
c.一种或多种编码由氨基酸序列SEQ ID NO:11表示的核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶加氧酶的基因；
d.一种或多种编码由氨基酸序列SEQ ID NO:9表示的groES和由氨基酸序列SEQID NO:10表示的groEL的异源基因；
e.一种或多种编码由氨基酸序列SEQ ID NO:12表示的磷酸核酮糖激酶的异源基因；以及
f.一种或多种编码由氨基酸序列SEQ ID NO:7和/或SEQ ID NO:8表示的甘油转运体的异源基因。
在一些实施方式中，所述细胞包括对编码甘油输出蛋白的一种或多种内源核苷酸序列的缺失或破坏。
在一些实施方式中，所述细胞包含提高二羟基丙酮激酶在所述细胞中的比活性的遗传修饰。
在一些实施方式中，所述细胞包含对编码甘油激酶(EC 2.7.1.30)的一种或多种内源核苷酸序列的缺失或破坏。
在一些实施方式中，所述细胞包含对编码甘油-3-磷酸脱氢酶的一种或多种内源核苷酸序列的缺失或破坏，所述甘油-3-磷酸脱氢酶优选属于EC 1.1.5.3，诸如gut2，或属于EC 1.1.1.8，诸如PDP1/2，所述细胞优选不含编码NADH依赖性甘油3-磷酸脱氢酶的基因。
在一些实施方式中，所述细胞包含对编码甘油-3-磷酸磷酸水解酶(GPP 1/2)的一种或多种内源核苷酸序列的缺失或破坏。
在一些实施方式中，所述细胞是Saccharomyces cerevisiae。
在一些实施方式中，所述PRK处于启动子(“PRK启动子”)的控制下，所述启动子使得能够在厌氧条件下比在需氧条件下实现更高表达，厌氧/需氧PRK表达比为2或更高，3或更高，4或更高，5或更高，6或更高，7或更高，8或更高，9或更高，10或更高，20或更高或50或更高。
本发明的第二方面提供根据本发明第一方面所述的细胞用于制备乙醇和/或琥珀酸的用途。
本发明的第三方面提供一种用于制备发酵产物的方法，所述方法包括从可发酵的碳水化合物制备发酵产物，所述可发酵的碳水化合物特别地选自以下项的组：葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖和甘露糖，所述制备使用根据本发明第一方面所述的细胞在厌氧条件下进行。
在一些实施方式中，所述可发酵的碳水化合物获自淀粉、木质纤维素和/或果胶。
在一些实施方式中，将所述淀粉、木质纤维素和/或果胶与酶组合物接触，其中产生一种或多种糖，并且其中所产生的糖被发酵以产生发酵产物，其中用根据本发明第一方面所述的细胞进行所述发酵。
在一些实施方式中，所述发酵产物是乙醇、丁醇、乳酸、琥珀酸、塑料、有机酸、溶剂、动物饲料补充剂、药物、维生素、氨基酸、酶或化学原料中的一种或多种。
附图说明
图1：利用CRISPR-Cas9整合在基因组基因座INT1处的甘油再摄取途径。该图描绘了通过PCT/EP2016/050136中描述的CRISPR-Cas9方法来辅助基因组位点INT1处的整合。INT1-5’：从CEN.PK113-7D PCR扩增的INT1基因座的500bp 5′整合侧翼；Sc_DAK1：从pDB1333 PCR扩增的表达盒Sc_DAK1；Ec gldA：从pDB1332 PCR扩增的表达盒E.coli gldA；Dr_T3：D.rerio T3甘油转运体表达盒；Zr_T5：从pDB1336 PCR扩增的Z.rouxii T5甘油转运体表达盒；INT1_3’：INT1基因座的500bp下游整合侧翼；(a)(b)(c)(d)：位于不同表达盒侧翼的50bp连接子序列，该连接子序列用于实现所述途径在INT1处的正确组装；GT INT1：Cas9诱导的双链断裂的基因组靶序列。
图2：菌株IME324、IMX774、DS78742、DS78743、DS787444在补充有每升约50g葡萄糖的矿质培养基上的发酵曲线；培养基的初始pH为4.6。在32小时的发酵运行期间每4小时测量残留葡萄糖(g/L；实心方块，黑线)和形成的生物质(g/L；空心菱形，灰线)、甘油(g/L；空心三角形，黑线)、乙酸(g/L；空心方块，灰线)和乙醇(g/L；空心圆圈，黑线)的水平。
具体实施方式
除非另有说明，否则本文中不使用数量词限定被定义为“至少一个(种)”。
当不使用数量词限定名词(例如化合物、添加剂等)时，意味着包括复数。因此，除非另有说明，否则当提及特定部分例如“基因”时，这意味着“至少一个”该基因，例如“至少一个基因”。如本文所用的术语“或”应理解为“和/或”。
当提及存在几种异构体(例如D对映体和L对映体)的化合物时，该化合物原则上包括可用于本发明的特定方法中的该化合物的所有对映异构体、非对映异构体和顺式/反式异构体；特别地当提及诸如化合物时，该化合物包括天然异构体。
术语“发酵”、“发酵性的”等在本文中以经典意义使用，即表示工艺在厌氧条件下进行或已经在厌氧条件下进行。厌氧条件在本文中被定义为没有任何氧的条件或细胞(特别是酵母细胞)基本上不消耗氧的条件，并且往往对应于小于5mmol/l.h-1的氧消耗，特别是小于2.5mmol/l.h1或小于1mmol/l.h-1的氧消耗。更优选地，消耗0mmol/L/h(即，氧消耗为不可检测的)。这往往对应于培养物发酵液中的溶氧浓度小于空气饱和度的5％，特别地溶氧浓度小于空气饱和度的1％或小于空气饱和度的0.2％。
术语“细胞”是指真核生物或原核生物,优选作为单细胞存在。细胞可选自以下组：真菌、酵母、眼虫类(euglenoids)、古细菌和细菌。
细胞可以特别地选自以下组：由酵母组成的属。
术语“酵母”或“酵母细胞”是指一组系统发生上不同的单细胞真菌，其中的大多数为子囊菌门和担子菌门。芽殖酵母(“真酵母”)被分类为Saccharomycetales目，其中Saccharomyces cerevisiae是最众所周知的物种。
如本文所用的术语“重组(细胞)”或“重组微生物”是指含有这样的核酸的菌株(细胞)，所述核酸是使用重组DNA技术和/或另外的诱变技术的一种或多种遗传修饰的结果。具体地，重组细胞可包含不存在于相应野生型细胞中的核酸，该核酸已经使用重组DNA技术引入到该菌株(细胞)中(转基因细胞)，或者不存在于所述野生型中的该核酸是在所述野生型中存在的核酸序列(诸如编码野生型多肽的基因)中——例如使用重组DNA技术或另外的诱变技术(诸如UV辐射)——进行一种或多种突变的结果，或者其中基因的核酸序列已被修饰以使(其编码的)多肽产物靶向另外的细胞区室。此外，术语“重组(细胞)”特别地涉及这样的菌株(细胞)，已经使用重组DNA技术从该菌株(细胞)中去除了DNA序列。
如本文所用的术语“转基因(酵母)细胞”是指这样的菌株(细胞)，其含有不天然存在于该菌株(细胞)中并且已经使用重组DNA技术引入该菌株(细胞)中的核酸，即重组细胞。
本文所用的关于蛋白质或多肽的术语“突变的”是指野生型或天然存在的蛋白质或多肽序列中的至少一个氨基酸已经经由对编码这些氨基酸的核酸进行诱变而被不同的氨基酸取代、插入，或从该序列中缺失。诱变是本领域中众所周知的方法，并且包括例如借助于PCR或经由寡核苷酸介导的诱变进行的定点诱变，如在Sambrook等人，MolecularCloning-ALaboratory Manual，第2版，第1-3卷(1989)中所述。如本文所用的关于基因的术语“突变的”是指该基因的核酸序列或该基因的调控序列中的至少一个核苷酸已经被不同的核苷酸取代，或者已经经由诱变从该序列中缺失，从而导致对具有定性或定量改变的功能的蛋白质序列的转录或对该基因的敲除。
在本发明的上下文中，“改变的基因”具有与突变基因相同的含义。
如本文所用，术语“基因”是指真核生物中含有核酸聚合酶RNA聚合酶II的模板的核酸序列。将基因转录成mRNA，然后将mRNA翻译为蛋白质。
如本文所用的术语“核酸”包括对单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的聚合物(即多核苷酸)的提及，并且除非另有限制，否则涵盖具有天然核苷酸的基本性质的已知类似物，因为所述已知类似物以类似于天然存在的核苷酸(例如肽核酸)的方式与单链核酸杂交。多核苷酸可以是天然或异源的结构或调控基因的全长序列或子序列。除非另有说明，否则该术语包括对指定序列及其互补序列的提及。因此，具有出于稳定性或其他原因而被修饰的骨架的DNA或RNA是“多核苷酸”，如该术语在本文中所用的。此外，仅举两个示例，包含不常见碱基(诸如肌苷)或经修饰的碱基(诸如三苯甲基化(tritylated)碱基)的DNA或RNA是如本文所使用的术语多核苷酸。应当理解，已经对DNA和RNA进行了多种修饰，该多种修饰用于本领域技术人员已知的许多有用目的。本文采用的术语多核苷酸包括这种化学、酶促或代谢修饰形式的多核苷酸，以及病毒和细胞(尤其包括简单细胞和复杂细胞)特有的DNA和RNA的化学形式。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，用于指代氨基酸残基的聚合物。该术语适用于这样的氨基酸聚合物，在所述氨基酸聚合物中，一个或多个氨基酸残基是对应的天然存在的氨基酸的人工化学类似物；以及适用于天然存在的氨基酸聚合物。天然存在的氨基酸的这种类似物的基本性质是，当掺入蛋白质中时，该蛋白质与引发相同蛋白质但完全由天然存在的氨基酸组成的抗体特异性反应。术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”还包含修饰，所述修饰包括但不限于糖基化、脂质附着、硫酸化、谷氨酸残基的γ-羧化、羟基化和ADP核糖基化。
当参考酶分类(EC)提及酶时，该酶分类是这样的分类，其中基于由国际生物化学与分子生物学联合会命名委员会(Nomenclature Committee of the InternationalUnion of Biochemistry and Molecular Biology,NC-IUBMB)提供的酶命名法，酶被分类或可被分类，该命名法可在http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/处找到。还包括没有(尚未)被分类为特定类别但可如此分类的其他合适的酶。
如果在本文中通过引用检索号来提及蛋白质或核酸序列(诸如基因)，则除非另有说明，否则该检索号特别地用于指代具有可经由www.ncbi.nlm.nih.gov/(在2016年6月14日可用)找到的序列的蛋白质或核酸序列(基因)。
通过引用遗传密码子，本文中编码多肽的每个核酸序列还描述了核酸的每种可能的沉默变体。术语“保守修饰的变体”适用于氨基酸和核酸序列两者。关于特定的核酸序列，保守修饰的变体是指由于遗传密码子的简并性而编码氨基酸序列的相同或保守修饰的变体的那些核酸。术语“遗传密码子的简并性”是指大量功能相同的核酸编码任何给定蛋白质的事实。例如，密码子GCA、GCC、GCG和GCU均编码氨基酸丙氨酸。因此，在每个由密码子指定的丙氨酸位置处，可以在不改变编码的多肽的情况下将密码子改变为所述的任何对应密码子。这种核酸变体是“沉默变体”并且代表一种保守修饰的变体。
如本文所用，术语具有特定序列(例如“SEQ ID NO:X”)的多肽的“功能同源物”(或简称“同源物”)是指包含所述特定序列的多肽，前提条件是一个或多个氨基酸被取代、缺失、添加和/或插入，并且该多肽具有(定性地)用于底物转换的相同酶功能。该功能可以通过使用包含重组细胞的测定系统来测试，该重组细胞包含用于在酵母中表达同源物的表达载体，所述表达载体包含可操作地连接到酵母中的功能性启动子的异源核酸序列，并且所述异源核酸序列编码同源多肽，所述同源多肽在细胞中将乙酰辅酶A转换为乙醛的酶促活性有待测试，并评定所述细胞中是否发生所述转换。候选同源物可以通过使用计算机相似度分析来鉴定。在WO2009/013159的实施例2中描述了这种分析的详细示例。技术人员将能够由此推导出如何可以找到合适的候选同源物，并且任选地在密码子(对)优化后，将能够使用如上所述的合适的测定系统来测试此类候选同源物的所需功能。合适的同源物代表与特定多肽具有高于50％，优选60％或更高，特别地至少70％，更特别地至少80％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或至少99％的氨基酸序列相似性并具有所需的酶功能的多肽。关于核酸序列，术语功能同源物意指包括由于遗传密码子的简并性而与另一核酸序列不同但编码相同多肽序列的核酸序列。
序列同一性在本文中定义为两个或更多个氨基酸(多肽或蛋白质)序列或两个或更多个核酸(多核苷酸)序列之间的关系，如通过比较序列所确定的。通常，在所比较的序列的全长上比较序列同一性或相似性。在本领域中，“同一性”还意指氨基酸或核酸序列(视情况而定)之间的序列相关性程度，如通过具有此类序列的链之间的匹配所确定的。
氨基酸或核苷酸序列当表现出一定的相似性水平时，被认为是同源的。两个同源的序列表示共同的进化起源。两个同源序列是密切相关还是更遥远相关分别由高或低的“同一性百分比”或“相似性百分比”表示。尽管存在争议，但为了表示“同一性百分比”或“相似性百分比”，“同源性水平”或“同源性百分比”经常互换使用。可以使用数学算法来完成序列的比较和对两个序列之间的同一性百分比的确定。本领域技术人员将意识到以下事实：几种不同的计算机程序可用于比对两个序列并确定这两个序列之间的同源性(Kruskal,J.B.(1983)An overview of sequence comparison，在D.Sankoff和J.B.Kruskal(编辑)，Time warps,string edits and macromolecules:the theory and practice ofsequence comparison，第1-44页，Addison Wesley中)。两个氨基酸序列之间的同一性百分比可以使用用于比对两个序列的Needleman和Wunsch算法来确定。(Needleman,S.B.和Wunsch,C.D.(1970)J.Mol.Biol.48,443-453)。该算法比对氨基酸序列以及核苷酸序列。Needleman-Wunsch算法已在计算机程序NEEDLE中实现。出于本发明的目的，使用来自EMBOSS包(2.8.0版或更高版本，EMBOSS:The European Molecular Biology OpenSoftware Suite(2000)Rice,P.LongdenJ.和Bleasby,A.Trends in Genetics 16,(6)第276-277页，http://emboss.bioinformatics.nl/)的NEEDLE程序。对于蛋白质序列，使用EBLOSUM 62来用于取代矩阵。对于核苷酸序列，使用EDNAFULL。可以指定其他矩阵。用于比对氨基酸序列的任选参数是空位开放罚分10和空位延伸罚分0.5。技术人员将理解，当使用不同的算法时，所有这些不同的参数将产生略微不同的结果，但是两个序列的总体同一性百分比不会显著改变。
同源性或同一性是在包括任何空位或延伸的整个比对区域上两个完整序列之间相同匹配的百分比。两个比对序列之间的同源性或同一性计算如下：两个序列在比对中显示出相同氨基酸的对应位置的数目除以包括空位的总比对长度。如本文所定义的同一性可以从NEEDLE获得，并在程序的输出中标记为“IDENTITY”。
两个比对序列之间的同源性或同一性计算如下：两个序列在比对中显示出相同氨基酸的对应位置的数目除以减去比对中的空位总数后的总比对长度。如本文所定义的同一性可以通过使用NOBRIEF选项从NEEDLE获得，并在程序的输出中标记为“最长同一性”。
本文所公开的核苷酸或氨基酸序列的变体还可以定义为与本文中(例如，在序列表中)具体公开的核苷酸或氨基酸序列相比具有一个或多个取代、插入和/或缺失的核苷酸或氨基酸序列。
任选地，在确定氨基酸相似性程度时，技术人员还可以考虑所谓的“保守”氨基酸取代，如本领域技术人员所清楚的。保守氨基酸取代是指具有相似侧链的残基的可互换性。例如，一组具有脂族侧链的氨基酸是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；一组具有脂族-羟基侧链的氨基酸是丝氨酸和苏氨酸；一组具有含酰胺侧链的氨基酸是天冬酰胺和谷氨酰胺；一组具有芳族侧链的氨基酸是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；一组具有碱性侧链的氨基酸是赖氨酸、精氨酸和组氨酸；并且一组具有含硫侧链的氨基酸是半胱氨酸和甲硫氨酸。在一个实施方式中，保守氨基酸取代组是：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸，以及天冬酰胺-谷氨酰胺。本文公开的氨基酸序列的取代变体是这样的变体，其中已去除了所公开序列中的至少一个残基并在该至少一个残基的位置插入不同残基。优选地，氨基酸变化是保守的。在一个实施方式中，每种天然存在的氨基酸的保守取代如下：Ala至Ser；Arg至Lys；Asn至Gln或His；Asp至Glu；Cys至Ser或Ala；Gin至Asn；Glu至Asp；Gly至Pro；His至Asn或Gin；Ile至Leu或Val；Leu至Ile或Val；Lys至Arg；Gin或Glu；Met至Leu或Ile；Phe至Met,Leu或Tyr；Ser至Thr；Thr至Ser；Trp至Tyr；Tyr至Trp或Phe；以及Val至Ile或Leu。
本发明的核苷酸序列还可以通过它们分别在中等杂交条件下或优选在严格杂交条件下与本文所公开的特定核苷酸序列的部分杂交的能力来定义。严格杂交条件在本文中被定义为这样的条件，所述条件允许至少约25个核苷酸，优选约50个核苷酸、75或100个核苷酸，最优选约200个或更多个核苷酸的核酸序列在约65℃的温度下在包含约1M盐(优选6×SSC)的溶液或具有相当离子强度的任何其他溶液中进行杂交，并在65℃下在包含约0.1M或更少的盐(优选0.2×SSC)的溶液或具有相当离子强度的任何其他溶液中洗涤。优选地，进行杂交过夜，即至少10小时，并且优选地进行洗涤至少一小时，其中洗涤溶液至少更换两次。这些条件通常允许具有约90％或更高序列同一性的序列的特异性杂交。
中等条件在本文中定义为这样的条件，所述条件允许具有至少50个核苷酸，优选约200个或更多个核苷酸的核酸序列在约45℃的温度下在包含约1M盐(优选6×SSC)的溶液或具有相当离子强度的任何其他溶液中杂交，并在室温下在包含约1M盐(优选6×SSC)或具有相当离子强度的任何其他溶液中洗涤。优选地，进行杂交过夜，即至少10小时，并且优选地进行洗涤至少一小时，其中洗涤溶液至少更换两次。这些条件通常允许具有高达50％序列同一性的序列的特异性杂交。本领域技术人员将能够修改这些杂交条件，以便特异性地鉴定同一性在50％和90％之间变化的序列。
“表达”是指将基因转录成结构RNA(rRNA，tRNA)或信使RNA(mRNA)，随后翻译成蛋白质。
如本文所用，关于核酸或蛋白质的“异源”是源自外来物种的核酸或蛋白质，或者如果源自相同物种，则为通过刻意的人为干预而在其组成和/或基因组基因座方面相对于其天然形式发生实质性改变的。例如，与异源结构基因可操作地连接的启动子来自与该结构基因所来源于的物种不同的物种，或者如果来自相同物种，则它们中的一者或两者为相对于它们的来源形式发生实质性改变的。异源蛋白质可以源自外来物种，或者如果来自相同物种，则为通过刻意的人为干预而相对于其原始形式发生实质性改变的。
术语“异源表达”是指异源核酸在宿主细胞中的表达。异源蛋白质在诸如酵母之类的真核宿主细胞系统中的表达是本领域技术人员熟知的。包含编码具有特定活性的酶的基因的核酸序列的多核苷酸可以在这种真核系统中表达。在一些实施方式中，转化/转染的细胞可以用作用于表达酶的表达系统。异源蛋白质在酵母中的表达是众所周知的。Sherman,F.等人，Methods in Yeast Genetics,Cold Spring Harbor Laboratory(1982)是描述了可用于在酵母中表达蛋白质的各种方法的公知著作。两种被广泛利用的酵母是Saccharomyces cerevisiae和Pichia pastoris。用于在Saccharomyces和Pichia中表达的载体、菌株和方案是本领域中已知的，并且可从商业供应商(例如，Invitrogen)获得。合适的载体通常具有表达控制序列，诸如启动子，根据需要包括3-磷酸甘油酸激酶或醇氧化酶，以及复制起点、终止序列等。
如本文所用，“启动子”是指导(结构)基因转录的DNA序列。通常，启动子位于基因的5′区域中，靠近(结构)基因的转录起始位点。启动子序列可以是组成型的、诱导型的或阻抑型的。在一个实施方式中，不需要(外部)诱导物。
如本文所用的术语“载体”包括对常染色体表达载体和对用于整合到染色体中的整合载体的提及。
术语“表达载体”是指线性或环状的DNA分子，该线性或环状的DNA分子包含编码感兴趣的多肽的区段，该区段在提供用于其转录的附加核酸区段的控制下(即可操作地连接到所述附加核酸区段)。此类附加区段可包括启动子序列和终止子序列，并且可任选地包括一个或多个复制起点、一个或多个选择性标记、增强子、多腺苷酸化信号等。表达载体通常来源于质粒或病毒DNA，或可含有两者的元件。具体地，表达载体包含这样的核酸序列，该核酸序列包含在5′至3′方向上并可操作地连接的以下项：(a)酵母识别的转录和翻译起始区，(b)感兴趣的多肽的编码序列，以及(c)酵母识别的转录和翻译终止区。“质粒”是指自主复制的染色体外DNA，其未整合到微生物的基因组中并且通常实质上是环状的。
“整合载体”是指线性或环状的DNA分子，该线性或环状的DNA分子可以并入到微生物的基因组中并提供编码感兴趣的多肽的基因的稳定遗传。整合载体通常包含这样的一个或多个区段，该一个或多个区段包含编码感兴趣的多肽的基因序列，所述基因序列在提供用于其转录的附加核酸区段的控制下(即可操作地连接到所述附加核酸区段)。此类附加区段可包括启动子序列和终止子序列，以及通常通过同源重组过程来驱动将感兴趣的基因并入到靶细胞基因组中的一个或多个区段。通常，整合载体为可转移到靶细胞中的载体，但该载体具有在该生物体中无功能的复制子。如果在包含感兴趣的基因的区段内包含适当的标记，则可以选择整合该区段。
“宿主细胞”是指含有载体并支持载体的复制和/或表达的细胞。
如本文所用，“转化”是指将外源多核苷酸插入宿主细胞中，而不管用于该插入的方法(例如，直接摄取、转导、f-接合(f-mating)或电穿孔)如何。外源多核苷酸可以保持为非整合载体，例如质粒，或者可以整合到宿主细胞基因组中。
“破坏”是指(或包括)影响对应多肽的翻译或转录和/或影响酶的(特异)活性、酶的底物特异性和/或稳定性的所有核酸修饰，诸如核苷酸缺失或取代、基因敲除(等等)。此类修饰可以靶向编码序列或基因的启动子。
术语“编码”具有与“用于编码”相同的含义。因此，举例来说，“一种或多种编码甘油脱氢酶的异源基因”具有与“一种或多种用于编码甘油脱氢酶的异源基因”相同的含义。就编码酶的基因而言，短语“一种或多种编码X的异源基因”具有与“一种或多种编码具有X活性的酶的异源基因”相同的含义，其中X表示酶。因此，举例来说，“一种或多种编码甘油脱氢酶的异源基因”具有与“一种或多种编码具有甘油脱氢酶活性的酶的异源基因”相同的含义。
在一个方面，本发明提供了重组细胞，优选酵母细胞，其包含：
a)一种或多种编码甘油脱氢酶的异源基因，
b)一种或多种编码二羟基丙酮激酶(E.C.2.7.1.28和/或E.C.2.7.1.29)的基因；
c)一种或多种编码核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶加氧酶(RuBisCO；EC 4.1.1.39)的异源基因；以及
d)一种或多种编码磷酸核酮糖激酶(EC 2.7.1.19,PRK)的异源基因；以及任选地
e)一种或多种编码甘油转运体的异源基因。
在一个实施方式中，甘油脱氢酶优选是NAD+连接的甘油脱氢酶(EC 1.1.1.6)。此类酶可以来自细菌来源或例如来自真菌来源。一个示例是来自E.coli.的gldA。
或者，甘油脱氢酶可以是NADP+连接的甘油脱氢酶(EC 1.1.1.72)。
当细胞用于通常在厌氧条件下进行的乙醇生产时，NAD+连接的甘油脱氢酶为优选的。
在一个实施方式中，细胞包含一种或多种编码由氨基酸序列SEQ ID NO:13或由该氨基酸序列的序列同一性为至少50％，优选至少60％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的功能同源物表示的异源甘油脱氢酶的核酸序列。
在一个实施方式中，二羟基丙酮激酶由内源基因(例如DAK1基因)编码，该内源基因优选置于组成型启动子的控制下。
在一个实施方式中，细胞包含一种或多种编码由根据SEQ ID NO:14的氨基酸序列或由该氨基酸序列的序列同一性为至少50％，优选至少60％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的功能同源物表示的二羟基丙酮激酶的核酸序列，该基因优选置于组成型启动子的控制下。
二羟基丙酮激酶也可具有甘油醛激酶活性。
WO2014/129898公开了一种酵母细胞，其包含一种或多种编码核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶加氧酶(EC 4.1.1.39，RuBisCO)的基因；一种或多种编码磷酸核酮糖激酶(EC2.7.1.19，PRK)的基因。本发明的发明人已发现，通过引入一种或多种编码NAD+连接的甘油脱氢酶(EC 1.1.1.6或EC 1.1.1.72)的基因和一种或多种编码二羟基丙酮激酶(E.C.2.7.1.28或EC 2.7.1.29)的基因；可以提高乙醇产率。可能仍然会产生甘油，但甘油至少部分地转换为乙醇。
本发明的一个优点是甘油产生减少并且/或者乙醇产率提高。不希望受理论束缚，发明人认为这可能是通过使用CO2作为电子受体(通过RuBisCO)来再氧化NADH而不是产生甘油的结果。
在一个实施方式中，细胞包含提高细胞中二羟基丙酮激酶的比活性的遗传修饰。二羟基丙酮激酶在本文中被理解为催化以下化学反应的酶((EC 2.7.1.29)：
ATP+甘油酮ADP+磷酸甘油酮。
其他常用的名称包括甘油酮激酶、ATP:甘油酮磷酸转移酶和(磷酸化)丙酮醇激酶。应当理解，甘油酮和二羟基丙酮是同一分子。优选地，所述遗传修饰引起二羟基丙酮激酶的过表达，例如通过过表达编码二羟基丙酮激酶的核苷酸序列。编码二羟基丙酮激酶的核苷酸序列可以是对于细胞内源的，或者可以是对于细胞异源的二羟基丙酮激酶。可用于在本发明的细胞中过表达二羟基丙酮激酶的核苷酸序列是例如来自S.cerevisiae(DAK1)和(DAK2)的二羟基丙酮激酶基因，如例如Molin等人(2003,J.Biol.Chem.278:1415-1423)所述。在一个优选的实施方式中，过表达编码二羟基丙酮激酶的密码子优化的(参见上文)核苷酸序列，诸如编码SEQ ID NO:14的二羟基丙酮激酶的密码子优化的核苷酸序列。用于过表达二羟基丙酮激酶的优选核苷酸序列是编码这样的二羟基丙酮激酶的核苷酸序列，所述二羟基丙酮激酶包含与SEQ ID NO:14(S.cerevisiae(DAK1))具有至少45％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％的氨基酸序列同一性或与SEQ ID NO:14相比具有一个或几个取代、插入和/或缺失的氨基酸序列。
可用于在本发明的细胞中过表达异源二羟基丙酮激酶的核苷酸序列是例如编码细菌二羟基丙酮激酶的序列，诸如例如由Daniel等人(1995,J.Bacteriol.177:4392-4401)描述的来自Citrobacter freundii的dhaK基因。
为了过表达编码二羟基丙酮激酶的核苷酸序列，将(待过表达的)该核苷酸序列置于表达构建体中，其中该核苷酸序列可操作地连接到合适的表达调控区/序列，以确保在将表达构建体转化到本发明的宿主细胞(参见上文)中后过表达二羟基丙酮激酶。用于(过)表达编码具有二羟基丙酮激酶活性的酶的核苷酸序列的合适启动子包括优选对分解代谢物(葡萄糖)阻遏不敏感的启动子、在厌氧条件下具有活性的启动子和/或优选不需要木糖或阿拉伯糖诱导的启动子。上面给出了此类启动子的示例。与除了引起过表达的基因修饰之外在遗传上相同的菌株相比，待过表达的二羟基丙酮激酶优选过表达至少1.1、1.2、1.5、2、5、10或20倍。优选地，与除了引起过表达的基因修饰之外在遗传上相同的菌株相比，二羟基丙酮激酶在厌氧条件下过表达至少1.1、1.2、1.5、2、5、10或20倍。应理解，这些过表达水平可适用于酶活性(细胞中的比活性)的稳态水平、酶蛋白的稳态水平，并且适用于细胞中编码酶的转录物的稳态水平。宿主细胞中核苷酸序列的过表达产生至少0.002、0.005、0.01、0.02或0.05U min-1(mg蛋白)-1的特异性二羟基丙酮激酶活性，如例如在WO2013/081456的实施例中所述在30℃下在转化的宿主细胞的细胞提取物中测定的。
在一个实施方式中，细胞包含编码二羟基丙酮激酶的异源基因。合适的二羟基丙酮激酶来自Saccharomyces kudriavzevii、Zygosaccharomyces bailii、Kluyveromyceslactis、Candida glabrata、Yarrowia lipolytica、Klebsiella pneumoniae、Enterobacter aerogenes、Escherichia coli、Yarrowia lipolytica、Schizosaccharomyces pombe、Botryotinia fuckeliana，以及Exophiala dermatitidis。
细胞任选地包含一种或多种编码甘油转运体的异源基因。在该实施方式中，可在培养基中外部获得的(例如可从玉米醪液中的回流物(backset)获得的)或在内部细胞合成后分泌的任何甘油都可以运输到细胞中并转换为乙醇。
在一个实施方式中，细胞包含对编码甘油输出蛋白(exporter)(例如FPS1)的一种或多种内源核苷酸序列的缺失或破坏。
在另一个实施方式中，细胞天然缺乏NADH依赖性甘油合成所需的酶促活性，例如属于Brettanomyces intermedius种的酵母细胞。
在一个实施方式中，细胞包含对一种或多种编码甘油-3-磷酸磷酸水解酶和/或编码甘油-3-磷酸脱氢酶的内源核苷酸序列的缺失或破坏。这种缺失或破坏可导致酶促活性的降低或去除。被缺失或破坏的甘油-3-磷酸脱氢酶优选属于EC 1.1.5.3，诸如GUT2，或属于EC 1.1.1.8，诸如PDP1和/或PDP2。
在一个实施方式中，细胞不含编码NADH依赖性甘油-3-磷酸脱氢酶的基因。
在另一个实施方式中，细胞包含对编码甘油激酶(EC 2.7.1.30)的一种或多种内源核苷酸序列的缺失或破坏。这种酶的一个示例是Gutlp。
细胞可以不具有NADH依赖性甘油合成所需的酶促活性，或者与其对应的野生型细胞相比，在用于从碳水化合物合成甘油的NADH依赖性生化途径方面具有降低的酶促活性。
可以通过修饰一种或多种编码NAD依赖性甘油3-磷酸脱氢酶活性(GPD)的基因或一种或多种编码磷酸甘油磷酸酶活性(GPP)的基因来实现降低的酶活性，使得酶表达显著低于野生型中的酶表达，或者使得基因编码活性降低的多肽。此类修饰可以使用通常已知的生物技术进行，并且可以特别包括编码GPD和/或GPP的结构基因的编码区或启动子区的一种或多种敲除突变或定点诱变。或者，可以通过随机诱变然后选择具有降低的GPD和/或GPP活性或没有GPD和/或GPP活性的菌株来获得甘油产生缺陷型菌株。S.cerevisiae中编码GPD活性的基因的示例是GPD1、GPD2，并且GPP活性为GPP1和GPP2。
可以使GPD和/或GPP完全缺失，或者缺失至少一部分，该至少一部分编码对酶活性必不可少的酶部分。具体地，用S.cerevisiae细胞实现了良好的结果，其中GPD1基因和GPD2基因的开放阅读框已经失活。本领域技术人员可以通过合成地合成或以其他方式构建这样的DNA片段来实现结构基因(靶基因)的失活，该DNA片段由侧翼为与宿主细胞基因组的待缺失区域侧翼的序列相同的DNA序列的选择性标记基因组成。具体地，通过对标记基因kanMX和hphMX4的整合，使Saccharomyces cerevisiae中的GPD1和GPD2基因失活，已经获得了良好的结果。随后将该DNA片段转化到宿主细胞中。检查表达显性标记基因的转化细胞中对被设计为要缺失的区域的正确替换，例如通过诊断聚合酶链式反应或Southern杂交。
在一个实施方式中，细胞包含一种或多种编码由氨基酸序列SEQ ID NO:7或由该氨基酸序列的序列同一性为至少50％，优选至少60％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的功能同源物表示的异源甘油转运体的核酸序列。
在一个实施方式中，细胞包含一种或多种编码由氨基酸序列SEQ ID NO:8或由该氨基酸序列的序列同一性为至少50％，优选至少60％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的功能同源物表示的异源甘油转运体的核酸序列。
在一个实施方式中，细胞是酵母细胞。细胞可选自Saccharomycetaceae，特别地选自：Saccharomyces，诸如Saccharomyces cerevisiae；Kluyveromyces，诸如Kluyveromycesmarxianus；Pichia，诸如Pichia stipitis或Pichia angusta；Zygosaccharomyces，诸如Zygosaccharomyces bailii；以及Brettanomyces，诸如Brettanomyces intermedius；Issatchenkia，诸如Issatchenkia orientalis，以及Hansenula。
在另一个实施方式中，细胞是原核细胞，诸如选自由以下项组成的列表：Clostridium、Zymomonas、Thermobacter、Escherichia、Lactobacillus、Geobacillus和Bacillus。
在一个实施方式中，细胞包含一种或多种编码分子伴侣的基因，优选异源基因，所述分子伴侣优选源自原核生物，更优选细菌，甚至更优选E.coli。
分子伴侣——当表达时——优选能够在功能上与微生物中的酶相互作用，特别是与Rubisco和PRK中的至少一种相互作用。分子伴侣是为其他蛋白质的正确折叠提供有利条件，从而防止聚集的蛋白质。新形成的蛋白质通常必须从氨基酸的线性链折叠成三维形式。伴侣蛋白属于一大类帮助蛋白质折叠的分子，被称为分子伴侣。用于折叠蛋白质的能量由三磷酸腺苷(ATP)供应。Yébenes(2001)；“Chaperonins:two rings for folding”；Hugo Yébenes等人，Trends in Biochemical Sciences，2011年8月，第36卷，第8期撰写了一篇对本文有用的关于伴侣蛋白的综述文章。
在一个实施方式中，一种或多种伴侣蛋白来自细菌，更优选来自Escherichia，具体地，来自E.coli的E.coli GroEL和GroES尤其可以在根据本发明的微生物中被编码。其他优选的伴侣蛋白是来自Saccharomyces的伴侣蛋白，特别地Saccharomyces cerevisiaeHsp10和Hsp60。如果伴侣蛋白在诸如线粒体的细胞器中天然表达(示例为Saccharomycescerevisiae的Hsp60和Hsp10)，则可以例如通过修饰伴侣蛋白的天然信号序列来实现向细胞溶质的重定位。
在真核生物中，蛋白质Hsp60和Hsp10在结构上和功能上分别与GroEL和GroES几乎相同。因此，预期来自任何真核细胞的Hsp60和Hsp10可以充当Rubisco的伴侣蛋白。参见Zeilstra-Ryalls J,Fayet O,Georgopoulos C(1991)."The universally conservedGroE(Hsp60)chaperonins".Annu Rev Microbiol.45:301-25.doi:10.1146/annurev.mi.45.100191.001505.PMID 1683763和Horwich AL,Fenton WA,Chapman E,Farr GW(2007)."Two Families of Chaperonin:Physiology and Mechanism".Annu Rev Cell DevBiol.23:115-45.doi:10.1146/annurev.cellbio.23.090506.123555.PMID 17489689。
作为GroEL的替代物，可以存在GroEL的功能同源物，特别是包含与SEQ ID NO:10具有至少70％、75％、80％、85％、90％或95％序列同一性的氨基酸序列的功能同源物。与SEQ ID NO:10同源的合适的天然伴侣蛋白多肽在WO2014/129898的表4中给出。
作为GroES的替代物，可以存在GroES的功能同源物，特别是包含与SEQ ID NO:9具有至少70％、75％、80％、85％、90％或95％序列同一性的氨基酸序列的功能同源物。与SEQID NO:9同源的合适的天然伴侣蛋白多肽在WO2014/129898的表3中给出。
在一个实施方式中，来自WO2014/129898的表3的10kDa伴侣蛋白与相同生物体属或物种的来自WO2014/129898的表4的匹配的60kDa伴侣蛋白组合，以在宿主中表达。例如：>gi|189189366|ref|XP_001931022.1|:71-168 10kDa伴侣蛋白[Pyrenophora tritici-repentis]与匹配的>gi|189190432|ref|XP_001931555.11热休克蛋白60、线粒体前体[Pyrenophora tritici-repentis Pt-1C-BFP]一起表达，
用相同生物来源类似地制备的来自WO2014/129898的表3和表4的所有其他组合也可由技术人员用于表达。
RuBisCO原则上可以选自真核和原核RuBisCO。RuBisCO优选来自非光养生物。具体地，RuBisCO可以来自化能自养微生物。已经使用细菌RuBisCO实现了良好的结果。优选地，细菌RuBisCO源自Thiobacillus，特别地Thiobacillus denitrificans，Thiobacillusdenitrificans为化能自养的。RuBisCO可以是单亚基RuBisCO或具有多于一个亚基的RuBisCO。具体地，已经使用单亚基RuBisCO实现了良好的结果。
具体地，已经使用II型RuBbisCO，更特别地CbbM实现了良好的结果。
SEQ ID NO:11显示了RuBisCO的序列。其由来自Thiobacillus denitrificans的cbbM基因编码。该Rubisco的替代物是该RuBisCO的功能同源物，特别是包含与SEQ ID NO:11具有至少80％、85％、90％或95％序列同一性的氨基酸序列的此类功能同源物。合适的天然RuBisCO多肽在WO2014/129898的表1中给出。
至少在用于制备感兴趣的化合物的工业过程中使用时，RuBisCO优选在细胞中功能性地表达。
在一个实施方式中，功能性表达的RuBisCO具有至少1nmol.min-1.(mg蛋白质)-1的由通过细胞提取物的核酮糖-1,5-二磷酸依赖性14C碳酸氢盐并入的速率定义的活性，特别地至少2nmol.min-1.(mg蛋白质)-1的活性，更特别地至少4nmol.min-1.(mg蛋白质)-1的活性。活性的上限并不重要。在实践中，活性可以是约200nmol.min-1.(mg蛋白质)-1或更低，特别地25nmol.min-1.(mg蛋白质)-1，更特别地15nmol.min-1.(mg蛋白质)-1或更低，例如约10nmol.min-1.(mg蛋白质)-1或更低。用于测定该Rubisco活性的试验条件如WO2014/129898的实施例4中所见。
在一个实施方式中，PRK源自选自以下的植物：Caryophyllales，特别地Amaranthaceae，特别地Spinacia。
在一个实施方式中，细胞包含一种或多种编码用由SEQ ID NO:12表示的氨基酸序列或由该氨基酸序列的序列同一性为至少50％，优选至少60％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的功能同源物表示的PRK的核酸序列。
功能性表达的磷酸核酮糖激酶(PRK，EC 2.7.1.19)能够催化以下化学反应：
ATP+D-核酮糖5-磷酸ADP+D-核酮糖1,5-二磷酸(I)。
因此，该酶的两种底物是ATP和D-核酮糖5-磷酸，而其两种产物是ADP和D-核酮糖1,5-二磷酸。
PRK属于转移酶家族，特别是使用醇基团作为受体来转移含磷基团的那些(磷酸转移酶)。该酶分类的系统名称是ATP:D-核酮糖-5-磷酸1-磷酸转移酶。其他常用的名称包括磷酸戊糖激酶、核酮糖-5-磷酸激酶、磷酸戊糖激酶、磷酸核酮糖激酶(磷酸化)、5-磷酸核酮糖激酶、核酮糖磷酸激酶、PKK、PRuK，以及PRK。该酶参与碳固定。
PRK可以来自原核生物或真核生物。已经使用源自真核生物的PRK取得了良好的结果。优选地，真核PRK源自选自以下的植物：Caryophyllales，特别地Amaranthaceae，更特别地Spinacia。
作为来自Spinacia的PRK的替代物，可以存在来自Spinacia的PRK的功能同源物，特别是包含与来自Spinacia的PRK具有至少70％、75％、80％、85％、90％或95％的序列同一性的序列的功能同源物。
一种或多种PRK基因可以处于启动子(“PRK启动子”)控制下，该启动子使得能够在厌氧条件下比在需氧条件下实现更高的表达。
在一个实施方式中，PRK启动子是ROX1阻抑的。ROX1在本文中是缺氧基因的血红素依赖性阻遏物；介导对缺氧诱导基因如COX5b和CYC7的需氧转录阻抑；通过响应于氧化应激减少启动子占据来调控阻遏物功能；并且含有负责DNA弯曲活性的HMG结构域；参与高渗应激抗性。ROX1由氧调节。
根据Kwast等人(在：Genomic Analysis of Anaerobically induced genes inSaccharomyces cerevisiae:Functional roles of ROX1 and other factors inmediating the anoxic response,2002,Journal of bacteriology第184卷，第1期，第250-265页中)：“虽然Rox1以非O2依赖性方式作用，但其表达是氧(血红素)依赖性的，由血红素依赖性转录因子Hap1激活(Although Rox1functions in an O2-independentmanner,its expression is oxygen(haeme)dependent,activated by the haeme-dependent transcription factor Hap1)[Keng,T.1992.HAP1 and ROX1 form aregulatory pathway in the repression of HEM13 transcription in Saccharomycescerevisiae.Mol.Cell.Biol.12:2616-2623]。因此，当氧水平下降到限制血红素生物合成的水平时(as oxygen levels fall to those that limit haeme biosynthesis)[Labbe-Bois,R.和P.Labbe.1990.Tetrapyrrole and heme biosynthesis in the yeastSaccharomyces cerevisiae，第235-285页，在H.A.Dailey(编辑)，Biosynthesis of hemeand chlorophylls.McGraw-Hill,New York,N.Y中]，ROX1不再被转录(ROX1 is no longertranscribed)[Zitomer，RS和C.V.Lowry.1992.Regulation of gene expression byoxygen in Saccharomyces cerevisiae.Microbiol.Rev.56:1-11]，其蛋白质水平下降(its protein levels fall)[Zitomer,R.S.,P.Carrico和J.Decked.1997.Regulation ofhypoxic gene expression in yeast.Kidney Int.51:507-513]，并且其调控的基因被去阻遏(and the genes it regulates are de-repressed)。”
在一个实施方式中，PRK启动子是ROX1阻抑的。在一个实施方式中，PRK启动子具有一个或多个ROX1结合基序。
在一个实施方式中，PRK启动子在其序列中包含一个或多个根据SEQ ID NO:15的基序。
在一个实施方式中，PRK启动子是选自由以下项组成的列表的基因的天然启动子：FET4、ANB1、YHR048W、DAN1、AAC3、TIR2、DIP5、HEM13、YNR014W、YAR028W、FUN 57、COX5B、OYE2、SUR2、FRDS1、PIS1、LAC1、YGR035C、YAL028W、EUG1、HEM14、ISU2、ERG26、YMR252C和SML1，特别是FET4、ANB1、YHR048W、DAN1、AAC3、TIR2、DIP5和HEM13。
在一个实施方式中，PRK启动子在其序列中包含以下基序中的一个或多个：TCGTTYAG和/或根据SEQ ID NO:16的基序。
具体地，这种PRK启动子是DAN、TIR或PAU基因的天然启动子。在一个实施方式中，PRK启动子是选自由以下项组成的列表的基因的天然启动子：TIR2、DAN1、TIR4、TIR3、PAU7、PAU5、YLL064C、YGR294W、DAN3、YIL176C、YGL261C、YOL161C、PAU1、PAU6、DAN2、YDR542W、YIR041W、YKL224C、PAU3、YLL025W、YOR394W、YHL046C、YMR325W、YAL068C、YPL282C、PAU2、PAU4，具体地，该PRK启动子是选自由以下项组成的列表的基因的天然启动子：TIR2、DAN1、TIR4、TIR3、PAU7、PAU5、YLL064C、YGR294W、DAN3、YIL176C、YGL261C、YOL161C、PAU1、PAU6、DAN2、YDR542W、YIR041W、YKL224C、PAU3、YLL025W。
在一个实施方式中，启动子的厌氧/需氧PRK表达比为2或更高，3或更高，4或更高，5或更高，6或更高，7或更高，8或更高，9或更高，10或更高，20或更高或50或更高。
如本文所用，“启动子”是指导(结构)基因(在本文中特别是一种或多种磷酸核酮糖激酶基因)的转录的DNA序列。启动子使得能够在厌氧条件期间比在需氧条件下实现更高的表达。
在一个实施方式中，PRK启动子可以是合成的寡核苷酸。其可以是人工寡核苷酸合成的产物。人工寡核苷酸合成是合成生物学中用于在实验室中产生人工寡核苷酸(诸如基因)的方法。商业基因合成服务现在可以从世界各地的许多公司获得，这些公司中一些公司已经围绕这项任务建立了他们的商业模式。目前的基因合成方法最常见地基于有机化学和分子生物学技术的组合，并且可在不需要前体模板DNA的情况下“从头”合成整个基因。
在一个实施方式中，启动子位于PRK基因的5′区域。在一个实施方式中，其位于PRK基因的转录起始位点附近。
本发明进一步涉及一种载体(如下文所定义)，该载体包含PRK和使得能够在厌氧条件期间比在需氧条件下实现更高表达的启动子。
PRK启动子的厌氧/需氧PRK表达比可以为2或更高，3或更高，4或更高，5或更高，6或更高，7或更高，8或更高，9或更高，10或更高，20或更高或50或更高。
在一个实施方式中，PRK启动子是合成的寡核苷酸。PRK启动子优选使得能够仅在厌氧条件下实现表达。
合适的PRK启动子是EP16174382.8中提到的ANB1和/或DAN1。
细胞可含有对细胞非天然的戊糖代谢途径的基因和/或允许重组细胞转换戊糖的基因。在一个实施方式中，细胞可包含一种或多种木糖异构酶基因的一个或两个或更多个拷贝和/或一种或多种木糖还原酶和木糖醇脱氢酶基因的一个或两个或更多个拷贝，从而允许重组细胞转换木糖。在其一个实施方式中，这些基因可以整合到重组细胞基因组中。在另一个实施方式中，重组细胞包含基因araA、araB和araD。然后它能够发酵阿拉伯糖。在本发明的一个实施方式中，重组细胞包含xylA基因、XYL1基因和XYL2基因和/或XKS1基因，以允许重组细胞发酵木糖；醛糖还原酶(GRE3)基因的缺失；一种或多种PPP基因(例如TAL1、TAL2、TKL1、TKL2、RPE1和RKI1)的过表达以允许细胞中通过磷酸戊糖途径的通量增加，和/或GAL2的过表达和/或GAL80的缺失。因此，通过包含上述基因，可以在重组细胞中引入合适的戊糖代谢途径或其他代谢途径，该合适的戊糖代谢途径或其他代谢途径在(野生型)重组细胞中是非天然的。
在一个实施方式中，可以通过引入到宿主细胞中来将以下基因引入重组细胞中：
1)由任选地在强组成型启动子的控制下的PPP基因TAL1、TKL1、RPE1和RKI1组成的组；
2)由在强组成型启动子控制下的xylA基因组成的组；
3)包含在强组成型启动子控制下的XKSf基因的组，
4)由在强组成型启动子控制下的细菌基因araA、araB和araD组成的组，
5)醛糖还原酶基因的缺失。
可以使用已知的重组表达技术来构建上述细胞。辅因子修饰可以在上述修饰1-5中的任一者之前、同时或之后进行。
可以对根据本发明的细胞进行进化工程(evolutionary engineering)以改善其性质。进化工程过程是已知的过程。进化工程是这样的过程，其中微生物(本文中的重组细胞)的工业相关表型可以通过合理设置的自然选择过程而与特定生长速率和/或对营养物的亲和力偶联。例如，在Kuijper,M等人，FEMS,Eukaryotic cell Research 5(2005)925-934,W02008041840和W02009112472中详细描述了进化工程。在进化工程后，分离得到的戊糖发酵重组细胞。分离可以以任何已知的方式进行，例如通过从进化工程中使用的重组细胞培养液中分离细胞，例如通过采集细胞样品或通过过滤或离心。
在一个实施方式中，细胞不含标记。如本文所用，术语“标记”是指编码允许选择或筛选含有标记的宿主细胞的性状或表型的基因。不含标记意指重组细胞中基本上不存在标记。当抗生素标记已用于构建重组细胞并随后去除时，不含标记是特别有利的。可以使用任何合适的现有技术(例如分子内重组)来去除标记。
在一个实施方式中，基于抑制剂耐受性宿主细胞来构建细胞，其中构建如下文所述进行。可以通过筛选在含抑制剂的材料上生长的菌株来选择抑制剂耐受性宿主细胞，诸如在Kadar等人，Appl.Biochem.Biotechnol.(2007)，第136-140卷，847-858中所说明的，其中选择了抑制剂耐受性S.cerevisiae菌株ATCC 26602。
为了提高酶活性在细胞中以足够的水平和活性形式表达的可能性，优选地调适编码这些酶以及RuBisCO酶和本公开的其他酶的核苷酸序列，以针对所讨论的细胞的密码子使用来优化它们的密码子使用。
编码酶的核苷酸序列对细胞的密码子使用的适应性可以表示为密码子适应指数(CAI)。密码子适应指数在本文中被定义为基因的密码子使用朝向特定细胞或生物中高表达基因的密码子使用的相对适应性的度量。每个密码子的相对适应性(w)是每个密码子的使用与相同氨基酸的最丰富密码子使用的比率。CAI指数被定义为这些相对适应性值的几何平均值。排除非同义密码子和终止密码子(取决于遗传密码子)。CAI值的范围为0到1，其中越高的值表明最丰富的密码子的比例越高(参见Sharp和Li，1987,Nucleic AcidsResearch 15:1281-1295；还参见：Jansen等人，2003,Nucleic Acids Res.31(8):2242-51)。经调适的核苷酸序列优选具有为至少0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8或0.9的CAI。最优选的是经密码子优化以在所讨论的宿主细胞(例如S.cerevisiae细胞)中表达的序列。
在一个实施方式中，本发明提供了一种重组S.cerevisae细胞，其包含：
a)一种或多种编码甘油脱氢酶的异源基因，
b)一种或多种编码二羟基丙酮激酶(E.C.2.7.1.28和/或E.C.2.7.1.29)的基因；
c)一种或多种编码核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶加氧酶(RuBisCO；EC 4.1.1.39)的异源基因；
d)一种或多种编码磷酸核酮糖激酶(EC 2.7.1.19,PRK)的异源基因；
e)一种或多种编码分子伴侣的异源基因；以及
f)一种或多种编码甘油转运体的异源基因，其中所述细胞包含：
g)对一种或多种编码甘油-3-磷酸脱氢酶的内源核苷酸序列的缺失或破坏。
在另一个实施方式中，本发明包括一种重组S.cerevisae细胞，其包含：
a)一种或多种编码由氨基酸序列SEQ ID NO:13或该氨基酸序列的具有至少50％的序列同一性的功能同源物表示的甘油脱氢酶的异源基因；
b)一种或多种编码由根据SEQ ID NO:14的氨基酸序列或该氨基酸序列的具有至少50％的序列同一性的功能同源物表示的二羟基丙酮激酶的基因，该基因置于组成型启动子的控制下；
c)一种或多种编码由根据SEQ ID NO:11的氨基酸序列或该氨基酸序列的具有至少80％的序列同一性的功能同源物表示的RubisCo的异源基因；以及
d)一种或多种编码由根据SEQ ID NO:9的氨基酸序列或该氨基酸序列的具有至少70％的序列同一性的功能同源物表示的groES和/或由根据SEQ ID NO:10的氨基酸序列或该氨基酸序列的具有至少70％的序列同一性的功能同源物表示的groEL的异源基因；
e)一种或多种编码由SEQ ID NO:12或其具有至少50％的序列同一性的功能同源物表示的PRK的异源基因；以及任选地
f)一种或多种编码由根据SEQ ID NO:7的氨基酸序列或该氨基酸序列的具有至少50％的序列同一性的功能同源物表示的甘油转运体和/或由根据SEQ ID NO:8的氨基酸序列或该氨基酸序列的具有至少50％的序列同一性的功能同源物表示的甘油转运体的异源基因；
其中所述细胞包括：
g)对一种或多种编码甘油-3-磷酸脱氢酶的内源核苷酸序列的缺失或破坏。
本发明还提供了根据本发明的细胞用于制备乙醇的用途。
本发明还提供了根据本发明的细胞用于制备琥珀酸的用途。
本发明还提供了一种用于制备发酵产物的方法，该方法包括从可发酵的碳水化合物制备发酵产物，该可发酵的碳水化合物特别地选自以下项的组：葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖和甘露糖，该制备使用根据本发明的细胞在厌氧条件下进行。
在一个实施方式中，可发酵的碳水化合物获自淀粉、木质纤维素和/或果胶。
可以将淀粉、木质纤维素和/或果胶与酶组合物接触，其中产生一种或多种糖，并且其中产生的糖被发酵以产生发酵产物，其中用本发明的细胞进行发酵。
发酵产物可以是乙醇、丁醇、琥珀酸、乳酸、塑料、有机酸、溶剂、动物饲料补充剂、药物、维生素、氨基酸、酶或化学原料中的一种或多种。
当甘油从外部进给到该过程中(诸如来自基于酯交换的生物柴油生产或回流物的再循环的粗甘油)时，该方法特别有用，甘油随后被所要求保护的细胞摄取并转换为乙醇。
实施例
材料与方法
通用分子生物学技术
除非另有说明，否则使用的方法是标准生化技术。合适的通用方法教科书的示例包括Sambrook等人，Molecular Cloning,a Laboratory Manual(1989)和Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology(1995),John Wiley&Sons,Inc。
质粒、寡核苷酸引物和菌株
实施例中使用的质粒列于表1中。实施例中使用的引物列于表2中。用于进一步菌株工程化的菌株列于表3中。
培养基
在实验中使用的培养基是如实施例中所示的补充有糖的固体YNB培养基(6.7g/l酵母基础氮源、15g/l琼脂)和YEPh培养基(10g/l酵母提取物、20g/l植物蛋白胨)。对于固体YEPh培养基，在灭菌之前将15g/l琼脂加入到液体培养基中。
在微需氧或厌氧培养实验中，使用矿质培养基。Verduyn等人描述了矿质培养基的组成(Yeast，1992，第8卷，第501-517页)。用2.3g/l尿素代替硫酸铵作为氮源。培养基的初始pH为4.6。此外，对于微需氧/厌氧实验，加入麦角甾醇(0.01g/L)、吐温80(0.42g/L)和糖(如实施例中所示)。
微需氧/厌氧培养
使菌株在含有10mL补充有20g/L葡萄糖的YEPh培养基的100mL Erlenmeyer摇瓶中进行半需氧增殖，所述摇瓶不具有挡板并具有泡沫塞。将摇瓶在30℃下以280rpm的摇床转速孵育24小时。将预培养的细胞沉淀，洗涤，并用1培养体积的无菌水重悬。将一定体积的重悬培养物，所述重悬培养物含有足够细胞团块以将主发酵培养基接种至每升75mg酵母(干重)(参见下文)，沉淀并重悬于主发酵培养基中。
为了确定接种物，制作了生物质IMX774菌株与OD600的校准曲线。该校准曲线用于确定待处理成75mg/L酵母(干重)的接种物的重悬细胞培养物的体积。
在醇发酵监测器(Alcoholic Fermentation Monitor；AFM,Applikon,Delft,荷兰)中，使用以含有约50g/L葡萄糖的矿质培养基填充至400ml的500ml瓶子进行发酵实验。将发酵温度保持在32℃并以250rpm搅拌，在发酵过程中不控制pH。除了通过AFM(与乙醇(EtOH)相关)在线记录CO2产生之外，在发酵期间以4小时的间隔采集样品以监测酵母生物质、底物利用和产物形成。总发酵时间为32小时。
通过穿过0.2μm孔径的过滤器将用于HPLC分析的样品与酵母生物质分离。
HPLC分析
HPLC分析如“Determination of sugars,byproducts and degradationproducts in liquid fraction in process sample”；Laboratory AnalyticalProcedure(LAP，发布日期：12/08/2006；A.Sluiter,B.Hames,R.Ruiz,C.Scarlata,J.Sluiter和D.Templeton；Technical Report(NREL/TP-51042623)；2008年1月；NationalRenewable Energy Laboratory中所述进行。
IMX774和IME324的菌株构建
在实施例中产生和培养的菌株是菌株IMX581或IMX774的转化体。IMX581是基于CEN.PK的Cas9表达菌株，其用于后续的CRISPR-Cas9介导的基因组修饰(Mans等人，FEMSYeast Res.2015年3月；15(2).pii:fov004.doi:10.1093/femsyr/fov004)。IMX774是基于CEN.PK的菌株，其表达编码卡尔文循环酶磷酸核酮糖激酶(S.oleacera prk)和核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶的单个亚基(RuBisCO；Thiobacillus denitrificans cbbM)的基因，并表达编码伴侣蛋白(E.coli groEL和groES)的基因，以帮助RuBisCO蛋白在S.cerevisiae的细胞质中的正确折叠。IMX774的菌株构建已在欧洲专利申请EP16174382.8中描述，并且下面也有描述。
表1.实施例中使用的质粒的列表
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根据Mans等人(2015；FEMS Yeast Res.2015年3月；15(2).pii:fov004.doi:10.1093/femsyr/fov004)，使用CRISPR/Cas9基因组编辑在IMX581中进行遗传修饰(产生IMX774)。使用公开可得的列表(DiCarlo等人，Nucleic Acids Res.2013；第1-8页)鉴定靶向SGA1或X-2的独特CRISPR/Cas9序列。对于基因盒的无标记基因组整合，构建表达靶向SGA1基因座或基因间区域X-2的独特gRNA的质粒(Mikkelsen等人，MetabolicEngineering,2012，第14卷；第101-111页)。使用引物组合5792-5980和分别作为模板的质粒pMEL11和pMEL10，通过PCR扩增获得pUDR119和pURD164的质粒骨架。在所有情况下，根据制造商的指南，使用Hot Start II高保真DNA聚合酶(Thermo Scientific,Waltham,MA,USA)来进行PCR扩增(例如用于构建质粒和表达盒)。针对SGA1使用引物组合5979-7023，针对X-2使用引物组合5979-7374，并分别使用质粒pMEL11和pMEL10作为模板，通过PCR扩增获得pUDR119和pUDR164的质粒插入物，其分别含有编码靶向SGA1和X-2的独特20-bp gRNA序列的表达盒。使用Gibson />克隆试剂盒(New England Biolabs,Ipswich,MA,USA)，按照供应商的指南，在体外进行质粒pUDR119和pUDR164的组装。组装通过存在于经PCR扩增的质粒骨架和插入物的5′端和3′端的同源序列来实现。在每种情况下，使用1μl的Gibson组装混合物用于通过在Gene PulserXcell电穿孔系统(Biorad,Hercules,CA,USA)中进行的电穿孔来进行E.coli DH5a转化。通过诊断PCR(/>Thermo Scientific)或限制性消化来确认质粒的正确组装。使用Sigma GenElute质粒试剂盒(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO,USA)从转化的E.coli培养物中分离出构建的质粒pUDR119和pUDR164，并用于S.cerevisiae的转化。
使用作为模板的质粒pBTWW002和引物组合7549-7550，通过PCR扩增获得cbbM的酵母表达盒。按照供应商的方案将所得片段连接到pJET/1.2平端载体(Thermo-Scientific)上并克隆到E.coli中。使用引物组合7074-7075、7548-6285、6280-6273、6281-6270、6282-6271、6284-6272、6283-6275、6287-6276、6288-6277、6289-7075，将得到的质粒用作PCR模板以产生整合cbbM盒。cbbM的表达盒是遗传上相同的，区别为在片段的5′端和3′端存在不同的悬突以允许体内同源重组。分别使用作为模板的质粒pUD232和pUD233以及引物组合7076-7077和7078-7079获得了groEL和groES的酵母表达盒。通过使用IMX585的基因组DNA作为模板，用引物组合7930-7931进行PCR扩增，获得了对应于DAN1启动子(Knijnenburg等人，BMC Genomics.2009；第10卷，第53页)的基因组序列。通过使用引物组合7084-7085和7084-7934，用IMX585的基因组DNA作为模板进行PCR扩增，获得了PGK1终止子。使用引物组合7932-7081和作为模板的质粒pUDE046，通过PCR扩增获得了prk的ORF。该引物组合产生了prk-ORF片段，该prk-ORF片段具有与DAN1启动子序列和PGK1终止子同源的悬突。通过在转化到酵母中后进行体内同源重组来组装完整表达盒(DAN1p-prk-PGK1t)，并通过诊断PCR验证正确的组装。表2中给出了实施例中使用的所有引物的完整列表。
表2.在实施例中使用的具有序列的寡核苷酸引物的列表
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使用乙酸锂转化方案来进行酵母转化(Gietz和Woods，Methods Enzymol.,2002，第87-96页)。在用pUDR164进行转化的情况下，将转化混合物涂布在补充有20g L-1葡萄糖的矿质培养基琼脂平板上(Verduyn等人，Yeast,1992，第8卷，第501-517页)(2％ BactoAgar,BD,Franklin Lakes,NJ,USA)。在用质粒pUDR119进行的转化中，如前所述制备琼脂平板(Solis-Escalante，FEMS Yeast Res.,2013，第13卷，第126-139页)。为了构建菌株IMX765，将尿嘧啶另外补充到琼脂平板(150mg L-1)(Sigma-Aldrich)。通过诊断菌落PCR进行每种情况下期望基因型的确认。按照供应商的指导，使用5-氟-乳清酸(Zymo Research,Irvine,CA,USA)逆选择进行pUDR164的回收。如前所述地进行pUDR119的回收(Solis-Escalante,FEMS Yeast Res.,2013，第13卷，第126-139页)。菌株IMX765通过(在从正确的突变体中回收质粒后)将pUDR119、具有不同连接悬突的9种上述cbbM表达盒以及groEL和groES的表达盒共转化到IMX581中而获得。存在于分子的5′端和3′端处的悬突允许整个构建体(11个片段)的体内组装和在SGA1基因座的整合。通过用表达gRNA、靶向X-2的质粒pUDR164和DAN1p、prk ORF、PGK1t片段转化菌株IMX765来获得菌株IMX774，所述表达gRNA、靶向X-2的质粒pUDR164和DAN1p、prk ORF、PGK1t片段在体内组装成完整构建体并随后整合在X-2基因座。通过用空载体p426-TEF转化IMX581来获得对照菌株IME324。菌株的基因型如表3所示。
表3.在实施例中使用和产生的S.cerevisiae菌株的列表。
实施例1：甘油再摄取表达盒构建
表达盒构建
在DNA 2.0(Menlo Park,CA 94025,USA)合成开放阅读框(ORF)、启动子序列和终止子。如Engler等人(2011)和其中的参考文献所述，通过使用Golden Gate技术来重组启动子、ORF和终止子序列。将表达盒克隆到标准亚克隆载体中。含有编码甘油再摄取途径的组分的表达盒的质粒(列于表1)为：
·带有用于甘油脱氢酶(EC 1.1.1.6)E.coli gldA的表达盒的pDB1332(SEQ IDNO:1)，所述表达盒在S.cerevisiae ENO1启动子和S.cerevisiae CYC1终止子的控制下，
·带有用于二羟基丙酮激酶(EC 2.7.1.29，EC 2.7.1.28)S.cerevisiae DAK1的表达盒的pDB1333(SEQ ID NO:2)，所述表达盒在S.cerevisiae TPI1启动子和S.cerevisiae ENO1终止子的控制下，
·带有用于甘油转运体/水通道蛋白D.rerio aqp9(NP_001171215，此后称为Dr_T3或T3)的表达盒的pDB1334(SEQ ID NO:3)，所述表达盒在S.cerevisiae ADH1启动子和S.cerevisiae TEF2终止子的控制下，
·带有用于甘油转运体Z.rouxii ZYRO0E01210p(此后称为Zr_T5或T5)的表达盒的pDB1336(SEQ ID NO:4)，所述表达盒在S.cerevisiae PRE3启动子和S.cerevisiae TEF2终止子的控制下。
实施例2：DS78742、DS78743和DS78744的菌株构建
方法
在专利申请PCT/EP2013/056623和PCT/EP2016/050136中描述了所遵循的菌株构建方法。PCT/EP2013/056623描述了这样的技术，该技术使得能够从各种感兴趣的基因构建表达盒，使得这些盒组合成通路并在转化酵母后整合到该酵母基因组的特定基因座中。PCT/EP2016/050136描述了CRISPR-Cas9系统用于将表达盒整合到宿主细胞(在这种情况下是S.cerevisiae)的基因组中的用途。在IMX774的构建中，S.pyogenes Cas9表达盒已经整合在CAN1基因座处。在引入体内组装的gRNA表达质粒和修复DNA片段后，进行预期的修饰。首先，选择酵母基因组中的整合位点。使用将连接子引入所产生的PCR产物中的引物，通过PCR来扩增整合基因座的上游部分和下游部分的约500bp的DNA片段。这些连接子(大小为50bp)允许在酵母中转化后途径的正确体内重组。其次，通过PCR扩增感兴趣的基因，从而在每个侧翼处结合不同的连接子(与相邻生物砖(biobrick)上的连接子相容)。在用DNA片段转化酵母细胞后，在所需位置发生体内重组和整合到基因组中。该技术有助于对多种遗传设计进行并行测试，因为来自该途径的一种或多种基因可以被一种或多种其他基因或遗传元件替代，只要允许同源重组的连接子保持不变并与设计中的前面和下面的生物砖相容即可(专利申请PCT/EP2013/056623)。
gRNA表达质粒
整合位点：表达盒靶向于INT1基因座。INT1整合位点是位于S.cerevisiae的染色体XV上的NTR1(YOR071c)与GYP1(YOR070c)之间的非编码区。靶向INT1的指导序列是使用gRNA设计工具(https://www.dna20.com/eCommerce/cas9/input)设计的。
gRNA表达盒(如DiCarlo等人，Nucleic Acids Res.2013；第1-8页所述)是作为合成DNA盒(gBLOCK)在Integrated DNA Technologies(Leuven,Belgium)订购的(INT1gBLOCK；SEQ ID NO:6)。然后通过共转化来源于酵母载体pRN1119的线性片段来完成gRNA表达质粒的体内组装。pRN11119是一种多拷贝酵母穿梭载体，其含有赋予对潮霉素B(HygB)的抗性的功能性hphMX标记盒。该质粒的骨架基于pRS305(Sikorski和Hieter，Genetics1989，第122卷，第19-27页)，包括功能性2微米ORI序列和功能性hphMX标记盒(SEQ ID NO:5，表1)。
用组装后包含甘油再摄取途径设计的指定DNA片段转化IMX774
用以下片段转化菌株IMX774，从而导致如图1所示的甘油再摄取途径的组装：
1)使用菌株CEN.PK113-7D的基因组DNA作为模板，用引物BoZ-783和DBC-18463产生的PCR片段(5′-INT1)；
2)使用pDB1333(SEQ ID NO:1)作为模板，用引物DBC-14041和DBC-14042产生的PCR片段(DAK1)；
3)使用pDB1332(SEQ ID NO:2)作为模板，用引物DBC-14043和DBC-DBC-14044产生的PCR片段(gldA)；
4)使用pDB1334(SEQ ID NO:3)作为模板，用引物DBC-14045和DBC-14048产生的PCR片段(T3)；或使用pDB1336(SEQ ID NO:4)作为模板，用引物DBC-14046和DBC-14048产生的PCR片段(T5)；
5)使用菌株CEN.PK113-7D的基因组DNA作为模板，用引物DBC-18464和BoZ-788产生的PCR片段(3′-INT1)；
6)使用pRN1119(SEQ ID NO:5)作为模板，用引物DBC-13775和DBC-13776产生的PCR片段(BB-1119)；
7)使用INT1 gRNA(SEQ ID NO:6)作为模板，用引物DBC-13773和DBC-13774产生的PCR片段(gRNA-INT1)。
在含有20g/L葡萄糖和200μg HygB/ml的YEPh琼脂平板上选择转化体。进行诊断PCR以确认菌株DS78742和DS78743中使用T5的途径和菌株DS78744中使用T3的途径的正确组装和在INT1基因座处的整合(基因型参见表3)。
实施例3：发酵实验
菌株的增殖
使菌株IME324、IMX774、DS78742、DS784743和DS78744在补充有20g/L葡萄糖且补充有0.05g/L尿嘧啶的矿质培养基中，在半需氧条件下在30℃和280rpm下预生长过夜。
AFM实验的准备
第二天，测定600nm处的光密度，并将细胞通过离心沉淀。将含有约50g/L葡萄糖和0.05g/L尿嘧啶的400ml矿质培养基用一种上述菌株接种至0.075g/L(干重)。以特定的时间间隔采集样品以测量生物质、残余糖、甘油和乙酸，以及乙醇的形成。
发酵实验的结果
菌株IMX774、DS78742、DS78743和DS78744的基于葡萄糖的甘油产率分别为0.036g/g、0.014g/g、0.015g/g和0.021g/g，所述产率分别对应于与参照菌株IME324相比降低35％、75％、73％和62％(表4，图2)。当NAD+至少部分地经由RuBisCO途径再生时，可以预期甘油产生的降低。由于Gpd1/Gpd2/Gpp1/Gpp2途径保持完整而由菌株产生且可能已经由细胞分泌的甘油被T5或T3甘油转运体再次摄取并重新穿梭至糖酵解，并且随后通过gldA和DAK1的协同作用进行乙醇发酵。甘油到乙醇的重新穿梭的代价为1个ATP，并且每摩尔甘油产生一个NADH，该NADH可用于经由Prk-RuBisCO途径进行再氧化，从而进一步增加通过该途径的通量，并有效地减少发酵中产生的净甘油。作为甘油产生减少、经由Prk-RuBisCO途径的CO2固定和生物质产率降低的组合结果，工程化的RuBisCO表达菌株IMX774与参照菌株相比产生多3％的乙醇。更进一步，对于在该实施例中进行的实验中的约50g/L葡萄糖，由菌株DS78742、DS78743和DS78744通过甘油再摄取途径(T5/T3-gldA-DAK1)(表4，图2)对所形成的甘油进行的额外重新穿梭导致与参照菌株相比，乙醇产率分别进一步提高约6％、7％和5％。
表4.菌株IME324、IMX774、DS78742、DS78743和DS78744在补充有约50g/L葡萄糖的矿质培养基上的发酵产率和生长特征。
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Claims (13)

1.一种重组酵母细胞，所述重组酵母细胞包含：
a.一种或多种编码由氨基酸序列SEQ ID NO:13表示的甘油脱氢酶的异源基因；
b.一种或多种编码由氨基酸序列SEQ ID NO:14表示的二羟基丙酮激酶的基因；
c.一种或多种编码由氨基酸序列SEQ ID NO:11表示的核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶加氧酶的基因；
d.一种或多种编码由氨基酸序列SEQ ID NO:9表示的groES和由氨基酸序列SEQ IDNO:10表示的groEL的异源基因；
e.一种或多种编码由氨基酸序列SEQ ID NO:12表示的磷酸核酮糖激酶的异源基因；以及
f.一种或多种编码由氨基酸序列SEQ ID NO:7和/或SEQ ID NO:8表示的甘油转运体的异源基因。
2.根据权利要求1所述的细胞，所述细胞包括对编码甘油输出蛋白的一种或多种内源核苷酸序列的缺失或破坏。
3.根据权利要求1或2所述的细胞，所述细胞包含提高二羟基丙酮激酶在所述细胞中的比活性的遗传修饰。
4.根据前述权利要求中任一项所述的细胞，所述细胞包含对编码甘油激酶(EC2.7.1.30)的一种或多种内源核苷酸序列的缺失或破坏。
5.根据前述权利要求中任一项所述的细胞，所述细胞包含对编码甘油-3-磷酸脱氢酶的一种或多种内源核苷酸序列的缺失或破坏，所述甘油-3-磷酸脱氢酶优选属于EC1.1.5.3，诸如gut2，或属于EC 1.1.1.8，诸如PDP1/2，所述细胞优选不含编码NADH依赖性甘油3-磷酸脱氢酶的基因。
6.根据前述权利要求中任一项所述的细胞，所述细胞包含对编码甘油-3-磷酸磷酸水解酶(GPP 1/2)的一种或多种内源核苷酸序列的缺失或破坏。
7.根据前述权利要求中任一项所述的细胞，所述细胞是Saccharomyces cerevisiae。
8.根据前述权利要求中任一项所述的细胞，其中所述PRK处于启动子(“PRK启动子”)的控制下，所述启动子使得能够在厌氧条件下比在需氧条件下实现更高表达，厌氧/需氧PRK表达比为2或更高，3或更高，4或更高，5或更高，6或更高，7或更高，8或更高，9或更高，10或更高，20或更高或50或更高。
9.根据前述权利要求中任一项所述的细胞用于制备乙醇和/或琥珀酸的用途。
10.一种用于制备发酵产物的方法，所述方法包括从可发酵的碳水化合物制备发酵产物，所述可发酵的碳水化合物特别地选自以下项的组：葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖和甘露糖，所述制备使用根据权利要求1至8中任一项所述的细胞在厌氧条件下进行。
11.根据前述权利要求所述的方法，其中所述可发酵的碳水化合物获自淀粉、木质纤维素和/或果胶。
12.根据前述权利要求所述的方法，其中将所述淀粉、木质纤维素和/或果胶与酶组合物接触，其中产生一种或多种糖，并且其中所产生的糖被发酵以产生发酵产物，其中用根据权利要求1-8中任一项所述的细胞进行所述发酵。
13.根据权利要求10-12中任一项所述的方法，其中所述发酵产物是乙醇、丁醇、乳酸、琥珀酸、塑料、有机酸、溶剂、动物饲料补充剂、药物、维生素、氨基酸、酶或化学原料中的一种或多种。
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